WO1994018338A1 - Enzymatisches verfahren zur herstellung von dihydroxyacetonphosphat aus glycerinphosphat und seine verwendung in enzymatischen aldoladditionen - Google Patents

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WO1994018338A1
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Wolf-Dieter Fessner
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Boehringer Mannheim Gmbh
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P9/00—Preparation of organic compounds containing a metal or atom other than H, N, C, O, S or halogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/02—Monosaccharides

Definitions

  • the invention relates to a process for the preparation of dihydroxyacetone phosphate (DHAP) by enzymatic oxidation of glycerol phosphate and its use in situ by reaction in a coupled enzymatic aldol addition.
  • DHAP dihydroxyacetone phosphate
  • DHAP or direct acetal precursors are not suitable as starting materials for technical syntheses for economic reasons.
  • free DHAP is relatively unstable and breaks down into methylglyoxal, which irreversibly deactivates enzymes, and inorganic phosphate, which inhibits aldolases.
  • the diethyl acetal of di erene can be chemically phosphorylated in three ways using considerable time and effort (3-5 synthesis steps), for example with diphenyl chlorophosphate (RL Colbran et al., Carbohydr. Res. 1967, 4, 355), phosphorus oxychloride (F. Effenberger and Straub, Tetrahedron Lett. 1987, 28, 1641) or dibenzyl-N, N-diethylphosphoramidite (RL Pederson et al. Tetrahedron, 1991, 47, 2643).
  • DHAP which is generated from this precursor by acid hydrolysis, is by approx. 20% inorganic phosphate is contaminated and is only obtained in a total yield of 50%.
  • Enzymatic phosphorylation of dihydroxyacetone by glycerol kinase ATP (DC Crans and GM Whitesides, J. Am. Chem. Soc. 1985, 107, 7019) provides a DHAP quality which is characterized by severe contamination with acetate and phosphate, since this is for cofactor regeneration
  • Acetyl phosphate used is hydrolytically unstable.
  • the enzyme is irreversibly inactivated to a considerable extent by the strongly electrophilic DHAP and can only be stabilized to a limited extent by immobilization.
  • fructose 1,6-bisphosphate with fructose 1,6-bisphosphate aldolase uses a comparatively complex starting material, provides only a low equilibrium concentration of DHAP and is subject to the restriction to synthesis reactions with the same aldolase (0. Meyerhof and K Lohmann, Biochem. Z. 1934, 271, 89; W.-D. Fessner and C. Walter, Angew. Chem. 1992, 104, 643).
  • the object of the invention is therefore to produce dihydroxyacetone phosphate from easily accessible starting materials in high chemical purity and yield, and at the same time to work by enzyme catalysis under such mild reaction conditions that the labile product is reacted as possible in situ in a coupled reaction by all types of DHAP aldolases can be.
  • the object is achieved by a process for the preparation of DHAP, characterized in that glycerol monophosphate with a glycerol phosphate oxidase (GPO) [EC 1.1.3.21] in the presence of oxygen, air or hydrogen peroxide and excess amounts of an H 2 O2-decomposing enzyme such as for example catalase [EC 1.11.1.6] is oxidized.
  • GPO glycerol monophosphate with a glycerol phosphate oxidase
  • an H 2 O2-decomposing enzyme such as for example catalase [EC 1.11.1.6]
  • the enzymes are preferably used in the following concentration ranges: GPO 1 - 1000 U / ml and catalase 5 - 1 000 000 U / ml, whereby the catalase activity is one - should reach up to a thousand times the GPO activity.
  • Soluble enzymes are particularly preferably used with 1 to 10 U / ml GPO and 5 to 100 times more catalase activity. For corresponding modifications (for example when using enzyme membrane reactors or enzyme immobilizates), deviations from this may be necessary, but these can be found for the person skilled in the art on the basis of the teaching given here by means of common tests.
  • Next is preferably under an oxygen atmosphere and elevated pressure (1-5 at) worked.
  • the reaction temperature can be varied between -10.degree. C. and 60.degree. C., preferably between 0.degree. C. and 40.degree. C., and it is very particularly preferred to work at 20.degree. To 25.degree. C. with sufficient oxygen solubility.
  • the required oxygen can also be generated by metering in an aqueous solution of hydrogen peroxide (H2O2) as shown in Figure 1.
  • H2O2 hydrogen peroxide
  • DHAP acts as a competitive inhibitor on glycerol phosphate oxidase, so that the reaction is terminated between 60 and 95% conversion, but on the shelf at approximately 90%. This means that the product produced by this process can contain between 40 and 5% glycerol phosphate, depending on the reaction.
  • the DHAP can be frozen in the form of the product solution at - 80 ° C or converted to a storage-stable form.
  • the precipitation as barium salt (DC Crans and GM Whitesides, J. Am. Chem. Soc. 1985, 107, 7019) or the complete concentration of the solution under mild conditions (reduced pressure, cold), followed by the product as a solid salt is obtained.
  • the desired salt form of the DHAP can already be predetermined by selecting the cation introduced with the glycerol phosphate (e.g. alkali metal ions).
  • aldolases are, for example, fructose-1,6-biphosphataldolase [EC 4.1.2.13], tagatose-1,6-biphosphataldolase [EC 4.1.2.-], fuculose-1-phosphataldolase [EC 4.1.2.17] or rhamnulose-1 -phosphataldolase [EC 4.1.2.19].
  • the coupled reactions are carried out in an aqueous environment at a weakly acidic pH (approx. 5.5 - 8.0, preferably 6.5 - 7.0). This ensures sufficient stability of the DHAP reaction component and a high enzymatically catalyzed reaction rate.
  • the aldol adducts can also be obtained advantageously by concentrating the solution in a very high yield in pure form as crystalline salts, the countercation being in the form of the glycerol phosphate salt is selectable.
  • the aqueous medium can optionally contain up to 50% by volume of organic cosolvent, such as, for example, lower aliphatic alcohols (methanol, ethanol, n- or i-propanol), dimethyl sulfoxide, dimethylformamide or acetonitrile.
  • organic cosolvent such as, for example, lower aliphatic alcohols (methanol, ethanol, n- or i-propanol), dimethyl sulfoxide, dimethylformamide or acetonitrile.
  • organic cosolvent such as, for example, lower aliphatic alcohols (methanol, ethanol, n- or i-propanol), dimethyl sulfoxide, dimethylformamide or acetonitrile.
  • the process according to the invention can also be used advantageously in particular for the production of isotope-labeled sugars and their derivatives, since the valuable labeled glycerol precursors have almost no loss of substance in the form of labeled DHAPs or the labeled D-glyceryl aldehyde which can be produced by isomerization with triose phosphate isomerase [EC 5.3.1.1] 3-phosphate can be converted into the corresponding aldol products.
  • 2 H, 3 H, 12 C, 13 C, 170 and 32 P come into consideration for such a specific labeling.
  • soluble enzymes facilitates the metering and determination of the residual activities, but immobilization on solid supports, for example on Eupergit ® C, can also advantageously increase the stability of the enzymes.
  • mixtures containing this substance as a component such as racemic DL-glycerol phosphate or mixtures of glycerol-1 (2) monophosphates, can also be used without there is a noticeable loss in sales speed. This is surprising for the person skilled in the art, since the enzymes are often inhibited by isomers which are not specific for the corresponding enzymes.
  • the phosphate ester hydrolysis (e.g. by phosphatases) can be used to easily separate the glycerol resulting from the unreacted glycerol phosphate isomers by transferring it to the volatile acetone acetal and heating under vacuum.
  • glycerol phosphate oxidases from various organisms are suitable for the process according to the invention (Boehringer Mannheim GmbH; Sigma Chemie GmbH, specific activity from GPO to 200 U / mg).
  • an enzyme preparation from microorganisms was used in particular.
  • Either the enzymes sold by the companies mentioned or the enzymes isolated by known processes from the bacterial strains mentioned in DE 41 11 971 can likewise be used as aldolases.
  • L-glycerol-3-phosphate Processes for the preparation of the starting compounds, such as L-glycerol-3-phosphate, are known. For example, this can be done by enzymatic phosphorylation of glycerol (DC Crans and GM Whitesides, J. Am. Chem. Soc. 1985, 107, 7019). Commercial forms of isotope-labeled glycerin can also be phosphorylated using this technique.
  • Other possible starting materials for the process according to the invention, such as glycerol monophosphates different levels of the L-enantiomer and in the form of differently formulated salts are commercially available.
  • Figure 1 Reaction scheme for the enzymatic oxidation of L-glycerol-3-phosphate to DHAP and use in coupled aldol additions.
  • the solution was filtered through activated carbon, neutralized with 1 M lithium hydroxide and evaporated rapidly to dryness on a rotary evaporator (cold trap with dry ice / acetonitrile) at a temperature below 20 ° C. in vacuo.
  • the product was obtained as a colorless, solid Li salt of high purity (approx. 90%; 10% glycerol phosphate; ⁇ 5% inorganic phosphate).
  • L-glycerol-3-phosphate was reacted as the potassium or sodium salt, the corresponding DHAP salts being obtained.
  • the product solutions were adjusted to pH 3-4 using a Dowex ® AG50W-X8 cation exchanger (H + form; Bio-Rad) and frozen at -78 ° C.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Dihydroxyacetonphosphat (DHAP) durch enzymatische Oxidation von Glycerinphosphat in Gegenwart einer Glycerinphosphatoxidase und eines H2O2-zersetzenden Enzyms, wie beispielsweise Katalase sowie die Umsetzung des in situ gebildeten DHAP in einer gekoppelten enzymatischen Aldoladdition zur Herstellung von Kohlenhydraten bzw. entsprechenden Derivaten.

Description

Enzymatisches Verfahren zur Herstellung von Dihydroxyacetonphosphat aus Glycerinphosphat und seine Verwendung in enzymatischen Aldoladditionen
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Dihydroxyacetonphosphat (DHAP) durch enzymatische Oxidation von Glycerinphosphat sowie dessen Verwendung in situ durch Umsetzung in einer gekoppelten enzymatischen Aldoladdition.
Die stereoselektive asymmetrische Synthese polyhydroxylierter Verbindungen ist von aktuellem Interesse wegen deren Bedeutung als Komponenten oder Vorstufen pharmazeutischer Wirkstoffe wie Antibiotika oder Glykosidase-Inhibitoren. Eine wertvolle Methodik stellen enzymatische Aldoladditionen dar, da sich damit unter milden Reaktionsbedingungen alle vier möglichen diastereo eren Ketosen und bestimmte Derivate hoch diastereoselektiv und damit in hoher chemischer und optischer Reinheit herstellen lassen (DE 41 11 971 ) . Während die entsprechenden Enzyme, die DHAP-Aldolasen, eine Vielfalt von Aldehyden als elektrophile Komponente akzeptieren, benötigen diese Enzyme darüber hinaus Dihydroxyacetonphosphat (DHAP) als essentielles Aldoldonor-Substrat. Kommerzielles DHAP oder direkte Acetalvorstufen kommen als Edukt für technische Synthesen aus wirtschaftlichen Gründen nicht in Betracht. Zudem ist freies DHAP relativ instabil und zerfällt in Methylglyoxal, das Enzyme irreversibel desaktiviert, und in anorganisches Phosphat, das die Aldolasen inhibiert. Obwohl verschiedene Verfahren zur chemischen oder enzymatischen Synthese von DHAP bekannt sind, weist jedes einzelne nach Aufwand und Produktqualität gravierende Nachteile auf:
Die chemische Phosphorylierung von Dihydroxyaceton mit Phosphoroxychlorid in Acetonitril/Pyridin liefert in schlechter Ausbeute (60%, nach mehreren Berichten nicht reproduzierbar) ein Produkt, das stark mit anorganischem Phosphat verunreinigt ist (C.-H. Wong und G.M. Whitesides, J. Org. Chem. 1983, 48, 3199).
Das Dimethoxyacetal, aus dem DHAP durch saure Hydrolyse freigesetzt wird, erfordert eine aufwendige Herstellung aus 3-Chlor-l,2-propandiol (8 Synthesestufen, Gesamtausbeute ca. 17%; C.E. Ballou und H.O.L Fischer, J. Am. Chem. Soc. 1956, 78, 1659) .
Das Diethylacetal des Di eren kann unter erheblichem Sach- und Zeitaufwand (3-5 Synthesestufen) nach drei Varianten chemisch phosphoryliert werden z.B. mit Diphenylchlorphosphat (R.L. Colbran et al., Carbohydr. Res. 1967, 4, 355), Phosphoroxychlorid (F. Effenberger und Straub, Tetrahedron Lett. 1987, 28, 1641) oder Dibenzyl-N,N-diethylphosphoramidit (R.L. Pederson et al. Tetrahedron, 1991, 47, 2643). DHAP, das durch saure Hydrolyse aus dieser Vorstufe erzeugt wird, ist durch ca. 20% anorganisches Phosphat verunreinigt und wird lediglich in einer Gesamtausbeute von 50 % erhalten.
Enzymatische Phosphorylierung von Dihydroxyaceton durch Glycerinkinaεe-ATP (D.C. Crans und G.M. Whitesides, J. Am. Chem. Soc. 1985, 107, 7019) liefert eine DHAP- Qualität, die durch starke Verunreinigung mit Acetat und Phosphat gekennzeichnet ist, da das zur Cofaktorregenerierung verwendete Acetylphosphat hydrolytisch instabil ist. Das Enzym wird durch das stark elektrophile DHAP in beträchtlichem Ausmaß irreversibel inaktiviert und kann auch durch Immobilisierung nur begrenzt stabilisiert werden.
Die enzymatische Spaltung von Fructose-1,6-bisphosphat mit Fructose-1,6-bisphosphat-Aldolase verwendet ein vergleichsweise aufwendiges Auc angsmaterial, liefert nur eine niedrige Gleichgewichtskonzentration an DHAP und unterliegt der Beschränkung auf Synthesereaktionen mit derselben Aldolase (0. Meyerhof und K. Lohmann, Biochem. Z. 1934, 271, 89; W.-D. Fessner und C. Walter, Angew. Chem. 1992, 104, 643).
Die enzymatische Umsetzung von Glycerin mittels Glycerinkinase und Glycerinphosphatoxidase führt lediglich zu DHAP in nicht-isolierbaren Mengen in nano- bis mikromolarem Maßstab (JP 03/228 699, FR 2 620 732, US 4.784.945, DE 3 731 876, EP 0 255 334, EP 0 354 551 ) .
Aufgabe der Erfindung ist daher Dihydroxyacetonphosphat aus leicht zugänglichen Ausgangssto fen in hoher chemischer Reinheit und Ausbeute herzustellen, und dabei gleichzeitig durch Enzymkatalyse unter so milden Reaktionsbedingungen zu arbeiten, daß das labile Produkt möglichst in situ in einer gekoppelten Reaktion durch alle Arten von DHAP-Aldolasen umgesetzt werden kann.
Die Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung von DHAP, dadurch gekennzeichnet, daß Glycerin-monophosphat mit einer Glycerinphosphatoxidase (GPO) [EC 1.1.3.21] in Gegenwart von Sauerstoff, Luft oder Wasserstoffperoxid und überschüssigen Mengen eines H2O2- zersetzenden Enzyms wie beispielsweise Katalase [EC 1.11.1.6] oxidiert wird. In Abhängigkeit von der spezifischen Enzymaktivität der jeweils verwendeten Enzympräparation und bedingt durch die Grenzen der Enzymlöslichkeiten, werden die Enzyme vorzugsweise in folgenden Konzentrationsbereichen verwendet: GPO 1 - 1000 U/ml und Katalase 5 - 1 000 000 U/ml, wobei die Katalaseaktivität das ein- bis tausendfache der GPO-Aktivität erreichen sollte. Mit löslichen Enzymen wird besonders bevorzugt mit 1 - 10 U/ml GPO und dem 5 - lOOfachen an Katalaseaktivität gearbeitet. Für entsprechende Abwandlungen (z.B. bei Anwendung von Enzym-Membranreaktoren oder Enzym-Immobilisaten) können Abweichungen hiervon erforderlich werden, die sich jedoch für den Fachmann auf der Basis der hier gegebenen Lehre durch gängige Versuche finden lassen. Weiter wird vorzugsweise unter Sauerstoffatmosphäre und erhöhtem Druck (1-5 at ) gearbeitet. Die Reaktionstemperatur kann zwischen -10°C und 60°C, bevorzugt zwischen 0°C und 40°C variiert werden, und ganz besonders bevorzugt wird bei hinreichender Sauerstofflöslichkeit bei 20° bis 25°C gearbeitet. Alternativ kann der benötigte Sauerstoff auch durch Zudosieren einer wässrigen Lösung von Wasserstoffperoxid (H2O2) nach Abbildung 1 erzeugt werden. Dadurch wird überraschenderweise ein von weiteren Komponenten freies DHAP-Produkt erhalten.
DHAP wirkt in höheren Konzentrationen als kompetitiver Inhibitor auf die Glycerinphosphatoxidase, so daß die Reaktion zwischen 60 und 95 % Umsatz, in der Regal jedoch bei ungefähr 90 % beendet wird. Dies bedeutet, daß das nach diesem Verfahren erzeugte Produkt je nach Reaktionsführung zwischen 40 und 5 % Glycerinphosphat enthalten kann.
Zur Lagerung kann das DHAP in Form der Produktlösung bei - 80°C eingefroren werden oder in eine lagerstabile Form überführt werden. Hierzu dient beispielsweise die Fällung als Bariumsalz (D.C. Crans und G.M. Whitesides, J. Am. Chem. Soc. 1985, 107, 7019) oder das vollständige Konzentrieren der Lösung unter schonenden Bedingungen (verminderter Druck, Kälte) , worauf das Produkt als festes Salz erhalten wird. In letzerem Fall kann durch Wahl des mit dem Glycerinphosphat eingebrachten Kations (z.B. Alkalimetallionen) bereits'die gewünschte Salzform des DHAP vorbestimmt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur oxidativen DHAP- Herstellung läßt sich problemlos unter Zugabe eines beliebigen Aldehyds mit einer enzymatischen Aldoladdition koppeln (Abbildung 1) . Dieser Befund ist ebenso überraschend, da nicht zu erwarten war, daß die maximal erreichte Konzentration an Wasserstoffperoxid nicht zur Desaktivierung der DHAP-Aldolasen führt. Selbst bei der Verwendung von sauerstoffgesättigten Lösungen und unter erhöhtem Sauerstoffpartialdruck bis zu 5 atm Überdruck wurden keine nachteiligen Einflüsse auf die Enzymstabilitäten festgestellt. Die Möglichkeit zur Kopplung der nebenproduktfrei DHAP-produzierenden und einer DHAP-verbrauchenden Reaktion vermeidet nicht nur die Produktinhibition der Glycerinphosphatoxidase und ermöglicht damit einen quantitativen Umsatz von L-Glycerin-3-phosphat, sondern unterdrückt auch nahezu völlig die Zersetzung des labilen DHAP, da dieses nicht akkumulieren kann. Als mögliche Aldolasen kommen beispielsweise Fructose-1,6-biphosphataldolase [EC 4.1.2.13], Tagatose-1,6-biphosphataldolase [EC 4.1.2.-], Fuculose-1-phosphataldolase [EC 4.1.2.17] oder Rhamnulose- 1-phosphataldolase [EC 4.1.2.19] in betracht. Die gekoppelten Reaktionen werden in wässrigem Milieu bei schwach saurem pH-Wert (ca. 5.5 - 8.0, vorzugsweise 6.5 - 7.0) durchgeführt. Dadurch ist eine ausreichende Stabilität der Reaktionskomponente DHAP und eine hohe enzymatisch katalysierte Reaktionsgeschwindigkeit gewährleistet.
Die Aldoladdukte sind ebenfalls vorteilhaft durch Konzentrieren der Lösung in sehr hoher Ausbeute in reiner Form als kristalline Salze erhältlich, wobei das Gegenkation mit der Form des Glycerinphosphatsalzes wählbar ist. Das wäßrige Milieu kann dabei gegebenenfalls zur Verbesserung der Löslichkeit lipophiler Substrate bis zu 50 Vol-% organisches Cosolvens wie zum Beispiel niedere aliphatische Alkohole (Methanol, Ethanol, n- oder i- Propanol) , Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid oder Acetonitril enthalten. Zu berücksichtigen ist hierbei jedoch, daß die Enzymaktivitäten durch die Anwesenheit organischer Lösungsmittel vermindert werden können, daher wird vorzugsweise ohne bzw. mit maximal 30 Vol-% Cosolvens gearbeitet.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist insbesondere auch für die Herstellung isotopenmarkierter Zucker und ihrer Derivate in vorteilhafter Weise anwendbar, da die wertvollen markierten Glycerinvorstufen nahezu ohne Substanzverlust in Form markierten DHAPs oder des durch Isomerisierung mit Triosephosphatisomerase [EC 5.3.1.1] erzeugbaren, markierten D-Glycerinaldehyd-3-phosphats in die entsprechenden Aldolprodukte überführbar sind. Beispielsweise kommen 2H, 3H, 12C, 13C, 170 und 32P für eine solche spezifische Markierung in betracht.
Der Einsatz löslicher Enzyme erleichtert die Dosierung und Bestimmung der Restaktivitäten, jedoch kann eine Immobilisierung an feste Träger, z.B. an Eupergit® C, die Stabilität der Enzyme ebenfalls vorteilhaft erhöhen.
Im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens können anstelle von enantiomerenreinem L-Glycerin-3-phosphat auch diese Substanz als Komponente enthaltende Gemische wie racemisches DL-Glycerinphosphat oder Gemische der Glycerin-1(2)-monophosphate eingesetzt werden, ohne daß eine merkliche Einbuße der Umsatzgeschwindigkeit auftritt. Dies ist für den Fachmann überraschend, da durch für die entsprechenden Enzyme nicht spezifischen Isomeren die Enzyme oft inhibiert werden.
Zur Reinigung der Aldolprodukte aus den gekoppelten Synthesen kann nach Phosphatesterhydrolyse (z.B. durch Phosphatasen) das aus den nicht umgesetzten Glycerinphosphat-Isomeren resultierende Glycerin leicht durch Überführung in das fluchtige Acetonacetal und Erwarmen unter Vakuum abgetrennt werden.
Für das erfindungsgemaße Verfahren sind kommerziell erhaltliche Glycerinphosphatoxidasen aus verschiedenen Organismen geeignet (Boehringer Mannheim GmbH; Sigma Chemie GmbH, spez. Aktivität von GPO bis 200 U/mg). Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde insbesondere ein Enzympraparat aus Mikroorganismen (Toyobo) verwendet.
Als Aldolasen können ebenfalls entweder die von den genannten Firmen vertrieben Enzyme oder die nach bekannten Verfahren aus den in der DE 41 11 971 genannten Bakterienstam en isolierten Enzyme verwendet werden.
Verfahren zur Herstellung der Ausgangsverbindungen, wie L- Glycerin-3-phosphat sind bekannt. Beispielsweise kann dies durch enzymatische Phosphorylierung von Glycerin erfolgen (D.C. Crans und G.M. Whitesides, J. Am. Chem. Soc. 1985, 107, 7019). Handelsübliche Formen von isotopenmarkiertem Glycerin lassen sich ebenfalls mit dieser Technik phosphorylieren. Andere mögliche Ausgangsstoffe für das erfindungsgemaße Verfahren wie Glycerinmonophosphate mit unterschiedlichem Gehalt am L-Enantiomeren und in Form verschieden formulierter Salze sind kom enziell erhältlich.
Abbildung 1: Reaktionsschema für die enzymatische Oxidation von L-Glycerin-3-phosphat zu DHAP und Verwendung in gekoppelten Aldoladditionen.
Nachfolgende Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, ohne diese zu beschränken.
Beispiel 1: Synthese von Dihydroxyacetonphosphat
Eine Lösung von 17.2 g (100 mmol) L-Glycerin-3- phosphorsäure in 500 ml dest. Wasser wurde mit Lithiumhydrόxid auf pH 6.8 eingestellt und auf 1000 ml verdünnt. Nach Durchleiten von Sauerstoff (15 min) zur Sättigung wurden 1000 U L-Glycerin-3-phosphatoxidase (GPO) und 5000 U Katalase (spez. Aktivität bis 50 000 U/mg; Sig a) zugegeben und die Lösung bei 20°C unter einem Sauerstoffdruck von ca. 2 atm mechanisch gerührt. Der Umsatz wurde durch enzymatischen Assay auf gebildetes DHAP sowie durch -^H- und 31P-NMR-Spektroskopie kontrolliert. Nach beendeter Reaktion (ca. 90% Umsatz) wurde die Lösung über Aktivkohle filtriert, mit 1 M Lithiumhydroxid neutralisiert und am Rotationsverdampfer (Kühlfalle mit Trockeneis/Acetonitril) bei einer Temperatur unter 20 °C im Vakuum zügig bis zur Trockne eingeengt. Das Produkt fiel dabei als farbloses, festes Li-salz von hoher Reinheit an (ca. 90%; 10% Glycerinphosphat; <5% anorganisches Phosphat) . Alternativ wurde L-Glycerin-3-phosphat als Kalium- bzw. Natrium-Salz umgesetzt, wobei die entsprechenden DHAP- Salze erhalten wurden. In diesen Fällen wurden die Produktlösungen mit Kationenaustauscher Dowex® AG50W-X8 (H+-Form; Bio-Rad) auf pH 3-4 eingestellt und bei -78°C eingefroren.
Beispiel 2: Synthese von T2.5-13C2l-D-Fructose-l.6- biphosphat
Eine Lösung von [2-13C]-L-Glycerin-3-phosphat (Biscyclohexylammoniumsalz; 370 mg, 1.0 mmol) in 10 ml Wasser wurde bei pH 6.8 mit 50 U GPO, 1000 U Katalase, 50 U Fructose-1,6-bisphosphataldolase (aus E. coli, [EC 4.1.2.13]) und 50 U Triosephosphatisomerase ([EC 5.3.1.1]) versetzt und bei 25°C unter Sauerstoffatmosphäre mechanisch gerührt bis die DC-Kontrolle quantitativen Umsatz zeigte. Nach Neutralisieren mit Cyclohexylamin, Konzentrieren auf ca. 3 ml und Verdünnen mit Ethanol . kristallisierte reines [2,5-13C2]-D-Fructose-l,6- bisphosphat als Tetra(cyclohexylammonium)salz. Ausbeute 350 mg (95% d.Th. ) .
Beispiel 3: Synthese von D-Xylulose-1-phosphat
Eine Lösung von L-Glycerin-3-phosphat (Kaliumsalz; 1.0 mmol) in 10 ml Wasser wurde bei pH 6.8 mit 70 U GPO und 1000 U Katalase versetzt und bei 25°C im offenen Erlenmeyerkolben bei 100 Upm geschwenkt. Bei ca. 60 % Umsatz laut enzymatischem Assay auf DHAP wurden eine Lösung von Glykolaldehyd (72 mg, 1.2 mmol) in 1.0 ml Wasser und 50 U Fructose-1, 6-bisphosphataldolase (aus Kaninchenmuskel, [EC 4.1.2.13]) zugegeben und die Reaktionslö—sung weiter geschwenkt. Nach vollständigem Umsatz von Glycerinphosphat bzw. DHAP (DC-, -^-H-NMR- Kontrolle) wurde das Produkt mittels
Ionenaustauschchromatographie an Anionenaustauscher AG1- X8 , (HCθ3~-Form, 4 ml) durch Elution mit Triethylammoniumhydrogencarbonat isoliert. Nach Überführung in das Cyclohexylammoniumsalz erhielt man D- Xylulose-1-phosphat als farblosen Feststoff. Chemische Ausbeute 410 mg (96 % d.Th.) .
Beispiel 4: Synthese von D-Ribulose-1-phosphat
Eine Lösung von L-Glycerin-3-phosphat
(Biscyclohexylammoniumsalz ; 370 mg, 1.0 mmol) in 10 ml Sauerstoffgesättigtem Wasser wurde bei pH 6.8 mit 70 U GPO und 1000 U Katalase versetzt und im 50 ml Hydrierkolben unter positivem Sauerstoffdruck bei 100 Upm geschwenkt. Analog zu Beispiel 2 wurden Glykolaldehyd und 50 U Fuculose-1-phosphataldolase (aus E. coli, [EC 4.1.2.17]) zugegeben und nach beendeter Reaktion das D-Ribulose-1- phosphat als festes, farbloses Cyclohexylammoniumsalz isoliert. Chemische Ausbeute: 396 mg (93 % d.Th.) . Beispiel 5: Synthese von L-Fructose 1-phosphat
Eine Lösung von L-Glycerin-3-phosphat (Biscyclohexylammoniumsalz ; 370 mg, 1.0 mmol) und L- Glycerinaldehyd (110 mg, 1.2 mmol) in 10 ml Sauerstoffgesättigtem Wasser wurde bei pH 6.8 mit 70 U GPO, 1000 U Katalase und 50 U Rhamnulose-l- phosphataldolase (aus E. coli, [EC 4.1.2.19]) versetzt und bis zum vollständigen Umsatz unter Sauerstoffatmosphäre bei 100 Up geschwenkt. Nach Filtrieren über Aktivkohle wurde mit 1.0 M ethanolischer Cyclohexylaminlösung auf pH 7.5 eingestellt und am Rotationsverdampfer zur Trockene eingeengt. Der feste Rückstand wurde in 0.5 ml Wasser aufgenommen, filtriert und mit 2.5 ml trockenem Ethanol und soviel trockenem Aceton versetzt, bis eine leichte Trübung bestehen blieb. Kristallisation bei 4°C ergab L- Fructose-1-phosphat als Cyclohexylammoniumsalz in Form farbloser Nadeln. Chemische Ausbeute 370 mg (85 % d.Th.) .
Beispiel 6: Synthese von L-Fructose
Eine sauerstoffgesättigte Lösung von DL-glycerin-1- phosphat (Natriumsalz, Hexahydrat; 1.62 g, 5.0 mmol) in 25 ml Wasser wurde mit 200 U GPO und 1000 U Katalase versetzt und unter einem Sauerstoffdruck von 2 atm mechanisch gerührt bis die Reaktionslosung ca. 2 mmol DHAP enthielt. Dann wurden L-Glycerinaldehyd (270 mg, 3.0 mmol) sowie 50 U Rhamnulose-l-phosphataldolase (aus E. coli, [EC 4.1.2.19]) zugegeben und die Reaktionslosung bis zum vollständigen Umsatz gerührt. Nach Filtrieren über Aktivkohle wurde mit Ionenaustauscher (AG50W-X8, H+-Form) auf pH 5 eingestellt und mit 100 U saurer Phosphatase versetzt. Nach vollständiger Hydrolyse der Phosphatester (DC-Kontrolle) wurde die Lösung durch Filtrieren über 20 ml Kationenaustauscher (AG50W-X8, H+-Form) , dann 20 ml Anionenaustauscher (AG1-X8, HCθ3 ~-Form) entsalzt und im Vakuum konzentriert. Zur Abtrennung des Glycerins wurde der Rückstand in Aceton aufgenommen, mit einer katalytischen Menge an p-Toluolsulfonsäure versetzt und nach vollständigem Umsatz im Hochvakuum bei ca. 50°C von Lösungsmittel und 1,2-Isopropylidenglycerin befreit. Nach Aufnahme des festen Rückstands in Wasser und vollständiger Hydrolyse der Zuckeracetale wurde die L-Fructose aus 80 % wässrigem Ethanol kristallisiert. Chemische Ausbeute 360 mg (80% d.Th.) .
Ein analoges Experiment ausgehend von einem Gemisch der Glycerin-1(2) -monophosphate (Natriumsalz, Pentahydrat, enthielt ca. 50% DL-1-Phosphat und ca. 50% 2-Phosphat; 3.06 g, 10 mmol) lieferte nach entsprechender Aufarbeitung L-Fructose in gleicher Ausbeute.

Claims

P A T E N T A N S P R Ü C H E
Verfahren zur enzymatischen Herstellung von Dihydroxyacetonphosphat aus Glycerinmonophosphat, dadurch gekennzeichnet, daß man in Gegenwart von molekularem Sauerstoff, Luft oder Waserstoffperoxid eine Glycerinphosphatoxidase und ein ^(^-zersetzendes Enzym verwendet.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Glycerinphosphatoxidase und das ein- bis tausendfache der GPO-Aktivität an Aktivität für das H2θ2~zersetzende Enzym verwendet.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man 1 bis 1000 U/ml Glycerinphosphatoxidase und 5 bis 106 U/ml des H2O2- zersetzenden Enzyms verwendet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß unter Sauerstoffatmosphäre bei einem Druck von 1-5 atm, einem pH-Wert von 5,5 - 8,0 und einer Temperatur von 0° bis 40° C in Gegenwart von 0-50 % (v/v) eines organischen Lösungsmittels gearbeitet wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß man als H2θ2-zersetzendes Enzym Katalase verwendet.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß man spezifisch markiertes Glycerinphosphat verwendet.
Verfahren zur Herstellung von Kohlenhydraten oder deren Derivate aus Glycerinmonophosphat, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren nach einem der Ansprüche 1-6 in Gegenwart einer Aldolase und eines Aldehyds durchgeführt wird.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Fructose-1,6-biphosphataldolase, Tagatose-1,6- biphosphataldolase, Fuculose-1-phosphataldolase oder Rhamnulose-l-phosphataldolase verwendet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1-8, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eines der Enzyme in immobilisierter Form vorliegt.
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