JPH08506020A - グリセロリン酸からのジヒドロキシアセトンリン酸の酵素的製造方法及び酵素的アルドール付加でのその使用 - Google Patents
グリセロリン酸からのジヒドロキシアセトンリン酸の酵素的製造方法及び酵素的アルドール付加でのその使用Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、グリセロリン酸オキシダーゼおよびカタラーゼのようなH2O2分解酵素の存在下でグリセロリン酸を酵素的に酸化することによるジヒドロキシアセトンリン酸（DHAP）の製造方法に関し、そしてin situで連結した酵素的アルドール付加により炭水化物または対応する誘導体を製造する、生成したDHAPの変換にも関する。
Description
【発明の詳細な説明】
グリセロリン酸からのジヒドロキシアセトンリン酸の
酵素的製造方法及び酵素的アルドール付加でのその使用
本発明は、グリセロリン酸の酵素的酸化よるジヒドロキシアセトンリン酸（DH
AP）の製造方法、並びに連結した酵素的アルドール付加で変換することによるin
situでのその使用に関する。
ポリヒドロキシル化合物の立体選択不斉合成は、これらの化合物が抗生物質ま
たはグリコシダーゼ阻害剤のような活性な医薬品の成分または前駆物質として重
要であるので、現在注目されている。酵素的アルドール付加は、これらを使用し
て全ての可能な４種のジアステレオマーケトース及びある種の誘導体を、穏やか
な反応条件下で高度にジアステレオ選択的である方法により、それ故化学的、光
学的に高純度で合成できる（独国特許第41 11 971号）ため、重要な方法である
。対応する酵素であるDHAPアルドラーゼは、求電子成分として種々のアルデヒド
を受け入れるが、これらの酵素は、必須のアルドール供与体基質としてジシドロ
キシアセトンリン酸（DHAP）を付加的に必要とする。
市販のDHAPまたは直接のアセタール前駆物質は、経済的理由から工業的合成の
出発原料として考えられない。さらに、遊離のDHAPは比較的不安定で、酵素を不
可逆的に不活性化するメチルグリオキサールとアルドラーゼを阻害する無機リン
酸塩とに分解する。DHAPの化学的または酵素的合成には種々の方法が知られてい
るが、それぞれが煩雑性および生成物の品質に関して重大な欠点を有す
る。
‐ アセトニトリル／ピリジン中での塩化ホスホリルによるジヒドロキシアセト
ンの化学的リン酸化は低収率（60%、いくつかの報告によると再現性はない）で
生成物は無機リン酸塩がひどく混入している（C.-H．Wong and G.M．Whitesides
，J．Org．Chem．1983，48，3199）。
‐ ジメトキシアセタールから酸加水分解によりDHAPが放出されるが、3-クロロ
-1,2-プロパンジオールから長時間を要する合成が必要である（合成に８工程、
総収率 約17%；C.E．Ballou and H.O.L．Fischer，J．Am．Chem．Soc．1956，7
8，1659）。
‐ 二量体のジエチルアセタールは例えば、ジフェニルクロロリン酸（R.L．Col
bran et al.，Carbohydr．Res．1967，4，355）、塩化ホスホリル（F．Effenber
ger and Straub，Tetrahedron Lett．1987，28，1641）またはジベンジル-N,N-
ジエチルホスホルアミダイト（diethylphosphoramidite）（R.L．Pederson et a
l．Tetrahedron，1991，47，2643）を用いる３種の変法により、材料と時間をか
なり費やして（合成に３-５工程）化学的にリン酸化できる。酸加水分解により
この前駆物質から製造するDHAPは、約20%の無機リン酸塩が混入しており、総収
率50%でしか得られない。
‐ グリセロキナーゼ-ATPによるジヒドロキシアセトンの酵素的リン酸化（D.C
．Crans and G.M．Whitesides，J．Am．Chem．Soc．1985，107，7019）では、補
助因子再生のために使用するリン酸アセチルが加水分解に不安定であるので、酢
酸塩およびリン酸塩の高度の混入を特徴とする品質のDHAPが生成される。酵素は
強い求電子DHAPによりかなりの程度不可逆的に不活性化され、そして
固定化によってさえも、限られた程度に安定化できるだけである。
‐ フルクトース-1,6-二リン酸-アルドラーゼによるフルクトース-1,6-二リン
酸の酵素的開裂には比較的複雑な出発物質を使用し、低い平衡濃度のDHAPしか生
成せず、そして同一のアルドラーゼを用いた合成反応に限られる（O．Meyerhof
and K．Lohmann，Biochem．Z．1934，271，89；W.-D．Fessner and C．Walter，
Angew．Chem．1992，104，643）。
‐ グリセロキナーゼおよびグリセロリン酸オキシダーゼによるグリセロールの
酵素的変換では、ナノモルからマイクロモルのスケールという単離不可能な量の
DHAPしか導けない（日本特許第03/228 699号、仏国特許第2 620 732号、米国特
許第4.784.945号、独国特許第3 731 876号、欧州特許第0 255 334号、欧州特許
第0 354 551号）。
従って、本発明の目的は、直ちに利用できる出発材料から化学的に高純度のジ
ヒドロキシアセトンリン酸を高収率で製造することである。そして、それを行う
際に、不安定な生成物を、連結反応において、できれば全ての型のDHAPアルドラ
ーゼにin situで変換できるという、酵素的触媒による非常に穏やかな反応条件
のもとで実施することである。
本目的は、グリセロールモノリン酸が、酸素、空気または過酸化水素および過
剰量のカタラーゼ［EC 1.11.1.6］のようなH2O2分解酵素の存在下でグリセロリ
ン酸オキシダーゼ（GPO）［EC 1.1.3.21］により酸化されることを特徴とするDH
APの製造方法により達成される。各場合に使用される酵素調製物の酵素比活性に
依存し、
そして酵素の溶解度に限界があるため、好ましくは、酵素を以下の濃度範囲で使
用する：GPO 1〜1000U/mlおよびカタラーゼ5〜1,000,000U/ml）そしてカタラー
ゼ活性はGPO活性の1〜1000倍でなければならない。可溶酵素の場合は、GPO 1−1
0U/mlおよび5〜100倍量のカタラーゼ活性が好ましく使用される。特定の修飾（
例えば、酵素膜反応物または酵素固定化剤（immobilistate）を使用する場合）
については、これからの逸脱を必要としてもよいが、しかしながら、当業者はこ
こに示した教示に基づく慣用実験により決定できる。さらに、酸素雰囲気下及び
高圧下（１〜５atm）で実施することが好ましい。反応温度は10℃〜60℃、好ま
しくは0℃〜40℃の間で変化でき、酸素溶解度が十分であれば20℃〜25℃の間で
実施することがさらに特に好ましい。これとは別に、必要とする酸素は、図１に
示すように、過酸化水素（H2O2）の水溶液を添加することにより発生させること
もできる。意外にもこの方法により、他の成分から遊離しているDHAP生成物が得
られる。
高濃度のDHAPはグリセロリン酸オキシダーゼの競合阻害剤として作用するので
、反応は60〜95%の間の変換で終了するが、一般に約90%となる。このことは、こ
の方法で製造した生成物は反応手順によっては40〜5%の間のグリセロリン酸を含
み得ることを意味する。
保存のためにDHAPを生成物溶液の形態で−80℃で凍結でき、または保存するの
に安定な形態に変換できる。例えば、バリウム塩として沈殿をこのために使用で
き（D.C．Crans and G.M．Whitesides，J．Am．Chem．Soc．1985，107，7019）
、または生成物を固体塩として得るまで穏やかな条件下（減圧、冷却）で溶液を
完全
に濃縮できる。後者の場合は、DHAPの望ましい塩の形態を、グリセロリン酸に導
入する陽イオン（例えば、アルカリ金属イオン）を選択することにより事前に決
定できる。
本発明のDHAPの酸化的製造方法は、任意のアルデヒドの添加により容易に酵素
的アルドール付加に連結できる（図１）。過酸化水素の濃度が最大に達してもDH
APアルドラーゼの不活性化を誘導しないということが期待できなかったので、こ
の結果も意外である。酸素飽和溶液を使用し、５atm重圧まで増加する酸素分圧
下の場合でさえ、酵素安定性に対する悪影響は見いだされなかった。副産物遊離
のDHAP生成とDHAP消費反応との連結の可能性により、グリセロリン酸オキシダー
ゼの生産物阻害を避け、それ故L-グリセロール-3-リン酸の大量変換を可能にす
るのみならず、DHAPが蓄積し得ないので不安定なDHAPの分解をほとんど完全に抑
制もする。フルクトース-1,6-二リン酸アルドラーゼ［EC 4.1.2.13］、タガトー
ス-1,6-二リン酸アルドラーゼ［EC 4.1.2.-］、フクロース（fuculose）-1-リン
酸アルドラーゼ［EC 4.1.2.17］またはラムニュロース（rhamnulose）-1-リン酸
アルドラーゼ［EC 4.1.2.19］が、例えば、可能なアルドラーゼとして考慮され
る。連結反応は、弱酸性pH値（約5.5-8.0、好ましくは6.5-7.0）での水性溶媒中
で実施する。これにより反応成分DHAPの十分な安定性と速い酵素触媒反応速度を
保証する。
アルドール付加生成物もまた、溶液を濃縮することにより結晶塩として非常
に高収率で純粋な形態で有利に得られ、ここで対陽イオンはグリセロリン酸塩の
形態により選択できる。この水性溶媒は、例えば、低級脂肪族アルコール（メタ
ノール、エタノー
ル、n-プロパノール若しくはi-プロパノール）、ジメチルスルホキシド、ジメチ
ルフォルムアミド、または親油性の物質の溶解度を改善する必要がある場合はア
セトニトリルのような有機補助溶剤を50体積%まで含有できる。しかしながら、
この場合は酵素活性が有機溶媒の存在により減少され得ることを考慮しなければ
ならず、従って、補助溶剤を使用しないかまたは最大30体積%の補助溶剤の使用
が好ましい。
本発明法は特に、アイソトープで標識した糖およびその誘導体の製造にも有利
に使用できる。というのは、重要な標識グリセロール前駆体を標識DHAPまたは標
識D-グリセルアルデヒド-3-リン酸の形態に変換でき、それはトリオースリン酸
イソメラーゼ［EC5.3.1.1.］を用いた異性化によりほとんど物質を損失せずに相
当するアルドール生成物に製造できるからである。例えば、2H,3H,12C,13C,17O,
および32Pがこのような特異的な標識のために考慮される。
可溶酵素を使用すると投与と残留活性の測定が容易となるが、しかしながら、
例えば、ユウペルギット（Eupergit）（登録商標）Cのような固体支持体上に固
定化しても、酵素の安定性を有利に高めることができる。
鏡像異性体的に純粋なL-グリセロール-3-リン酸の代わりに、本発明方法の範
囲内で、ラセミDL-グリセロリン酸のような成分としてこれを含有する混合物、
またはグリセロール-1（2）-モノリン酸の混合物の形態で、反応速度の有意な損
失を招くことなく、この物質を使用することも可能である。酵素はしばしば対応
する酵素に特異的ではない異性体により阻害されるので、これは当業
者には意外である。
連結する合成からアルドール生成物を精製するために、非変換グリセロリン酸
異性体から生じるグリセロールを、（例えば、ホスファターゼにより）リン酸エ
ステル加水分解後、揮発性のアセトン-アセタールに変換し、真空で加熱するこ
とにより容易に分離できる。
市販の種々の生物からのグリセロリン酸オキシダーゼ（Boehrin ger Mannheim
GmbH；Sigma Chemie GmbH；200U/mgまでのGPOの比活性）が本発明の方法に適す
る。特に微生物の酵素調製物（東洋紡）を本発明の範囲内で使用した。
使用できるアルドラーゼは同様に、前記の会社が販売している酵素、あるいは
独国特許第41 11 971号に記載されている細菌系から既知の方法により単離した
酵素のいずれかである。
L-グリセロール-3-リン酸のような出発化合物の製造方法は既知である。これ
は例えば、グリセロールの酵素的リン酸化により達成できる（D.C．Crans and G
.M．Whitesides，J．Am．Chem．Soc．1985，107，7019）。アイソトープで標識
した市販の形態のグリセロールもこの技術を使用してリン酸化できる。種々の含
有量のL-鏡像異性体を含み、種々の方法で処方された塩の形態のグリセロールモ
ノリン酸のような、本発明法のための他の可能な出発原料が市販で入手できる。図１：
L-グリセロール-3-リン酸からDHAPへの酵素的酸化、及び連結するアルド
ール付加でのDHAPの使用の反応略図である。
以下の実施例は本発明をさらに詳細に説明するものであるが制限するものでは
ない。実施例１：ジヒドロキシアセトンリン酸の合成
蒸留水500ml中のL-グリセロール-3-リン酸17.2g（100mmol）の溶液を水酸化リ
チウムでpH 6.8に調整し、1000mlに希釈した。酸素を飽和するまで通し（15分）
、その後L-グリセロール-3-リン酸オキシダーゼ（GPO）1000Uとカタラーゼ（50,
000U/mlまでの比活性；Sigma社）5000Uを添加し、そして溶液を約２atmの酸素圧
下で20℃で機械で攪拌した。変換を、形成したDHAPの酵素的分析並びに1H及び31
P-NMR分光分析によりモニターした。反応完了後（約90%変換）、溶液を活性炭で
濾過し、1Mの水酸化リチウムで中和し、ロータリーエバポレータによる真空で、
20℃以下の温度で乾燥するまで急速に濃縮した（ドライアイス/アセトニトリル
を含む冷却トラップ）。この過程で生成物が高純度の無色固体Li塩として沈殿し
た（約90%；10%グリセロリン酸；＜5%無機リン酸塩）。
これとは別に、L-グリセロール-3-リン酸をカリウムまたはナトリウム塩とし
て変換し、その場合それぞれのDHAP塩を得た。これらの場合、生成物溶液を陽イ
オン交換体Dowex（登録商標）AG50W-X8（H+形；Bio-Rad）でpH3〜4に調整し、−
78℃で凍結した。実施例２：［2,5-13C2］-D-フルクトース1,6-二リン酸の合成
水10ml中の［2-13C］-L-グリセロール-3-リン酸（ビスシクロヘキシルアンモ
ニウム塩；370mg，1.0mmol）の溶液を、pH6.8でGPO 50U、カタラーゼ1000U、フ
ルクトース-1,6-二リン酸アルドラーゼ（大腸菌由来、［EC 4.1.2.13］）50Uお
よびトリオースリン酸イソメラーゼ（［EC 5.3.1.1］）50Uと混合し、TL
Cモニターで多量に変換が示されるまで、酸素雰囲気中、25℃で機械により攪拌
した。シクロヘキシルアミンで中和後、約３mlに濃縮し、そしてエタノールで希
釈し、純粋な［2,5-13C2］-D-フルクトース-1,6-二リン酸がテトラ（シクロヘキ
シル-アンモニウム）塩として結晶化した。収率350mg（理論値の95%）。実施例３：D-キシルロース-1-リン酸の合成
水10ml中のL-グリセロール-3-リン酸（カリウム塩；1.0mol）の溶液を、pH6.8
でGPO 70U及びカタラーゼ1000Uとともに混合し、開口三角フラスコ中、25℃、10
0rpmで回転攪拌した。DHAPの酵素検定により約60%の変換において、水1.0ml中の
グリコールアルデヒド（72mg、1.2mmol）の溶液と、フルクトース-1,6-二リン酸
アルドラーゼ（ウサギ筋肉由来、［EC 4.1.2.13］）50Uを添加し、そして反応溶
液をさらに回転撹拌した。グリセロリン酸またはDHAPが完全に変換した後（TLC
および1H-NMRでモミターした）、生成物を陰イオン交換体AGI-X8（HCO3 -形、4ml
）のイオン交換クロマトグラフィーにかけて、炭酸水素トリエチルアンモニウム
で溶出することにより単離した。シクロヘキシルアンモニウム塩に変換後、無色
固体としてD-キシルロース-1-リン酸を得た。化学的収率410mg（理論値の96%）
。実施例４：D-リブロース-1-リン酸の合成
水10ml中のL-グリセロール-3-リン酸（ビスシクロヘキシルアンモニウム塩；3
70mg、1.0mmol）の酸素飽和溶液をpH6.8で、GPO 70Uおよびカタラーゼ1000Uと混
合し、そして正の酸素圧下、50mlの水素化フラスコ中で100rpmで回転攪拌した。
実施例２と同様に、グリコールアルデヒドとフルクトース-1-リン
酸アルドラーゼ（大腸菌由来、［EC 4.1.2.17］）50Uを添加し、そして反応完了
後、固体無色シクロヘキシルアンモニウム塩としてD-リブロース-1-リン酸を単
離した。化学的収率：396mg（理論値の93%）。実施例５：L-フルクトース-1-リン酸の合成
水10ml中のL-グリセロール-3-リン酸（ビスシクロヘキシルアンモニウム塩；3
70mg、1.0mmol）およびL-グリセルアルデヒド（110mg、1.2mmol）の酸素飽和溶
液を、pH6.8でGPO 7OU、カタラーゼ1000Uおよびラムニュロース（rhamnulose）-
1-リン酸アルドラーゼ（大腸菌由来、［EC 4.1.2.19］）50Uと混合し、酸素雰囲
気下で完全に変換するまで100rpmで回転攪拌した。活性炭で濾過後、1.0Mのエタ
ノールシクロヘキシルアミン溶液でpH7.5に調整し、そしてロータリーエバポレ
ータで乾燥するまで濃縮した。固体残留物を水0.5mlに取り、濾過し、そして乾
燥エタノール2.5mlと、わずかに濁りを生じるのに必要な乾燥アセトンとを混合
した。４℃で結晶化すると、無色針状の形態のシクロヘキシルアンモニウム塩と
してL-フルクトース-1-リン酸を生じた。化学的収率370mg（理論値の85%）。実施例６： L-フルクトースの合成
水25ml中のDL-グリセロール-1-リン酸（ナトリウム塩、六水和物；1.62g、5.0
mmol）の酸素飽和溶液を、GPO 200U及びカタラーゼ1000Uとともに混合し、反応
溶液がDHAP約２mmolを含有するまで酸素圧２atmで機械により攪拌した。その後
、L-グリセルアルデヒド（270mg、3.0mmol）およびラムニュロース-1-リン酸ア
ルドラーゼ（大腸菌由来、［EC 4.1.2.19］）50U
を添加し、そして完全に変換するまで反応溶液を攪拌した。活性炭で濾過後、イ
オン交換体（AG50W-X8、H+形）でpH５に調整し、そして酸性ホスファターゼ100U
と混合した。リン酸エステルを完全に加水分解後（TLCでモニターした）、溶液
を陽イオン交換体（AG50W-X8、H+形）20mlで濾過して脱塩し、その後陰イオン交
換体（AGl-X8、HCO3 -形）20mlにかけ、そして真空で濃縮した。グリセロールを
分離するために、残留物をアセトンに取り、触媒量のp-トルエンスルホン酸と混
合しそして完全に変換後、溶媒及び1,2-イソプロピリデングリセロールを約50℃
で高度の真空で除去した。固体残留物を水に取り、糖アセタールを完全に加水分
解後、L-フルクトースを80%水性エタノールから結晶化した。化学的収率360mg（
理論値の80%）。
グリセロール-1（2）-モノリン酸（ナトリウム塩、五水和物、約50％のDL-1-
リン酸及び約50％の2-リン酸を含む；3.06g、10mmol）の混合物から出発した同
様の実験により、適切に処理後、同様の収率でL-フルクトースを生成した。
【手続補正書】
【提出日】１９９５年１１月１０日
【補正内容】
（1）明細書第２頁第19行目に「総収率50%でしか得られない。」とあるのを以下
の通り補正する。
「総収率50％でしか得られない。従って、このように生成されたDHAPは、適当
なアルデロース（aldeloses）の存在下でDHAPを用いたアルデヒドの酵素的転換
によるケトースの生成のような種々の連続した工程について欠点を有する。」
（2）明細書第３頁第７行目の「Biochem．Z．1934，271，89；W.-D．Fressner」
を、「Biochem．Z．1934，271，89；米国特許第4.440.854号；W.-D．Fressner」
と補正する。
（3）明細書第４頁第９〜10行目の「高圧下（１〜５atm）で実施する」を、「高
圧下（１〜５bar（１〜５atm））で実施する」と補正する。
（4）明細書第５頁第８行目の「使用し、５atm重圧まで増加」を、「使用し、５
bar（約５atm）重圧まで増加」と補正する。
（5）明細書第８頁第６〜７行目の「溶液を約２atmの酸素圧下で」を、「溶液を
約２bar（約２atm）の酸素圧下で」と補正する。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １． グリセロールモノリン酸からジヒドロキシアセトンリン酸を酵素的に製造 する方法であって、グリセロリン酸オキシダーゼおよびH2O2分解酵素を、分子酸 素、空気または過酸化水素の存在下で使用する方法。 ２． グリセロリン酸オキシダーゼおよびH2O2分解酵素のための活性としてGPO 活性の1〜1,000倍のものを使用する、請求項１に記載の方法。 ３． 1-1000U/mlのグリセロリン酸オキシダーゼおよび5-106U/mlのH2O2分解酵 素を使用する、請求項１または２のいずれか一項に記載の方法。 ４． １〜５気圧の酸素雰囲気中、pH値5.5〜8.0及び温度0〜40℃で、0〜50%（v /v）の有機溶媒存在下で実施する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。 ５． カタラーゼをH2O2分解酵素として使用する、請求項１〜４のいずれか一項 に記載の方法。 ６． 特異的に標識したグリセロリン酸を使用する、請求項１〜５のいずれか一 項に記載の方法。 ７． アルドラーゼおよびアルデヒドの存在下で請求項１〜６のいずれか一項に 記載の通りに実施する、グリセロールリン酸から炭水化物またはその誘導体を製 造する方法。 ８． フルクトース-1,6-二リン酸アルドラーゼ、タガトース-1,6-二リン酸アル ドラーゼ、フクロース（fuculose）-1-リン酸アルドラーゼまたはラムニュロー ス（rhamnulose）-1-リン酸アルドラーゼを使用する、請求項７記載の方法。 ９． 少なくとも１種の酵素が固定化形態で存在する、請求項１〜８のいずれか 一項に記載の方法。
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