WO1993013418A1 - Fluorescent immunity measuring instrument - Google Patents

Fluorescent immunity measuring instrument Download PDF

Info

Publication number
WO1993013418A1
WO1993013418A1 PCT/JP1992/001652 JP9201652W WO9313418A1 WO 1993013418 A1 WO1993013418 A1 WO 1993013418A1 JP 9201652 W JP9201652 W JP 9201652W WO 9313418 A1 WO9313418 A1 WO 9313418A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
excitation light
optical fiber
face
antibody
fluorescence
Prior art date
Application number
PCT/JP1992/001652
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Takeshi Kobayashi
Shinji Iijima
Yasunori Sakai
Ken-Ichi Shimada
Original Assignee
Ibiden Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ibiden Co., Ltd. filed Critical Ibiden Co., Ltd.
Priority to US08/098,394 priority Critical patent/US5449625A/en
Publication of WO1993013418A1 publication Critical patent/WO1993013418A1/ja

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5302—Apparatus specially adapted for immunological test procedures
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/968—High energy substrates, e.g. fluorescent, chemiluminescent, radioactive
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/969—Multiple layering of reactants
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/80—Fluorescent dyes, e.g. rhodamine
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/807—Apparatus included in process claim, e.g. physical support structures

Definitions

  • the present invention relates to an immunoassay apparatus using a fluorescence immunoreaction, and more particularly to a fluorescence immunoassay apparatus using an optical fiber and a sensing chip for fluorescence immunoassay used for the immunoassay apparatus.
  • the method of measuring the concentration of antigens and antibodies has been to label antigens and antibodies with radioisotope and enzymes.However, these methods have problems in sensitivity, safety, etc.
  • Various methods have been studied for labeling the antigen-antibody with a fluorescent dye instead of using it, and using this to measure the concentration of the antigen-antibody.
  • antigens and antibodies are bound to one side of an optical fiber and labeled with a fluorescent dye.
  • the antibodies and antigens are immunoreacted on the surface of the optical fiber, and the excitation light is guided to the optical fiber to excite the fluorescent dye on the optical fiber, and the fluorescence is emitted from the emission end face of the optical fiber.
  • a method is described in which the fluorescence and the remaining excitation light are extracted from the incident end face of the optical fiber, and then separated by relaxing the beam splitter to measure only the fluorescence. See Fig. 4).
  • the inventors of the present invention have conducted intensive studies and as a result, in order to solve the above-mentioned problems, an antigen or an antibody is coupled to an excitation light emitting end face of an optical fiber, excitation light and fluorescence are separated by a spectroscope, and it is considered that the conventional method is necessary.
  • the inventors have found that the above problem can be solved by transmitting the excitation light by reversing the reflection at the end face of the optical fiber detection section and completing the present invention.
  • the present invention relates to a fluorescence immunoassay device provided with an excitation light source, a fluorescence detector, an optical fiber to which an antigen or an antibody is bound, and a spectroscope, wherein the antigen or antibody is bound to the excitation light emitting end face of the optical fiber
  • the spectroscope guides the excitation light emitted from the excitation light source to the excitation light incidence end face of the optical fiber, and the fluorescence emitted from the fluorescently labeled antibody or the antigen forming an immune complex with the antigen or the antibody.
  • FIG. 1 (a) and 1 (b) are diagrams showing a schematic configuration of a fluorescence immunoassay apparatus of the present invention.
  • FIG. 2 is a diagram showing a schematic configuration of a detection unit of the device of the present invention.
  • FIG. 3 is a diagram showing a schematic configuration of the spectroscope.
  • FIG. 4 is a diagram showing a schematic configuration of a conventional device. The symbols in each figure are described below.
  • the excitation light source in the present invention is usually a semiconductor laser, an LED, a Xe lamp, a gas laser, and the like, and is not particularly limited. Among them, a semiconductor laser and an LED are preferable because they are easily reduced in size and cost. used.
  • the fluorescence detector in the present invention generally includes a photomultiplier tube, a photo diode, and the like, and is not particularly limited. Among them, the photo diode is easy to be miniaturized, has high strength, and is practical. It is preferably used for this reason.
  • the optical fiber to which the antigen or the antibody is bound in the present invention can be made of various materials such as glass and resin, but is preferably made of resin from the viewpoint of price. Various known methods can be used to bind the antigen and the antibody to the optical fiber.
  • the surface of a glass optical fiber is reacted with a silyl compound such as 3,4-aminotrimethylmethoxysilane to introduce amino groups to the surface of the optical fiber, and the carboxyls of antigens and antibodies are added to this. Groups can be linked.
  • the optical fiber When an antigen or an antibody is bound to the resin optical fiber, the optical fiber preferably has an ester structure such as acrylate polymer, and the ester group has a> CH—CHO structure.
  • the compound is reacted to introduce a formyl group, and an amino group such as an antigen or an antibody is bound to the formyl group.
  • the site where the antigen or antibody is bound to the optical fiber be bonded to the excitation light emitting end face of the optical fiber because the excitation efficiency is increased.
  • the antibody may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody.
  • the spectroscope according to the present invention is directed to a fluorescent-labeled antibody that guides light emitted from a light source to an excitation light incident end face of an optical fiber in which an antigen or an antibody is combined, and forms an immune complex with the antigen or the antibody.
  • it must be configured to guide the fluorescence emitted from the antigen to the fluorescence detector.
  • the reason for this is that the provision of the spectroscope allows the single optical system to realize the input and output to and from the optical fiber, which is the detection unit, and is suitable for miniaturization.
  • the spectroscope in the present invention is not particularly limited as long as it has such an action. For example, a combination of a pair of prisms. In this case, Fig.
  • a film layer 19 that totally reflects the excitation light and totally transmits the fluorescent light and a fluorescent antireflection film layer 21 can be provided between the pair of prisms, as shown in FIG. This is because it is not necessary to provide an excitation light removal filter in front of the detector 2.
  • Film is had to totally transmits fluorescence antireflection film fluorescence can be prepared using Mg F 2, Mg O, Z n O, a S i 0 2, C a F 2.
  • a known method for forming a film a known method such as a vapor deposition method can be used.
  • a mirror having the property of reflecting all the fluorescence may be appropriately prepared and used.
  • Such mirrors are not particularly limited, but include, for example, dielectric multilayer mirrors.
  • Mg F 2 and S i 0 2 are provided on both sides of a glass substrate. Can be easily obtained by alternately stacking a plurality of layers by vapor deposition.
  • the prism and the mirror are a so-called prism having wavelength selectivity and a spectroscope using a dielectric multilayer mirror having wavelength selectivity utilizing a wavelength difference between excitation light and fluorescence.
  • a spectroscope using a dielectric multilayer mirror having a so-called polarization plane selectivity can also be used.
  • the spectroscope using the dielectric multilayer mirror having the polarization plane selectivity will be described in detail.
  • FIG. 1 (a) all light having a specific polarization plane is reflected,
  • FIG. 1 (b) a spectroscope using a dielectric material having the property of transmitting all light having a specific polarization plane but reflecting light other than the specific polarization plane is shown.
  • This is a spectrometer using a dielectric multilayer film having a property of transmitting all excitation light having a single polarization plane such as a semiconductor laser and reflecting fluorescence other than a specific polarization plane.
  • the optical connection between the excitation light source and the spectroscope, and the optical connection between the spectrometer and the fluorescence detector can be performed by an optical fiber.
  • the optical fiber when using a dielectric multilayer mirror having wavelength selectivity may be any, but when using a dielectric multilayer mirror having polarization plane selectivity. Is required to be a polarization maintaining fiber in order to maintain the polarization plane.
  • a method may be used in which the light from the light source is directly radiated to the spectroscope without passing through the optical fiber, and the generated fluorescence is directly radiated to the fluorescence detector. This method is desirable from the viewpoint of miniaturization.
  • an optical system such as a lens
  • a lens since high-sensitivity measurement is possible, a lens In this way, the destination of the excitation light can be omitted, and the optical axis alignment process for condensing, which was conventionally required, is not required, and the apparatus is simple.
  • the excitation light emitting end face of the optical fiber to which the antigen or the antibody is bound is transparent to the excitation light from the excitation light source. It is necessary. The reason for this is that by transmitting the excitation light, reflection of the excitation light as seen in the prior art can be prevented, and the background can be reduced even if the output of the excitation light source is increased, and This is because sensitivity can be increased.
  • the expression that the excitation light emission end face has transparency with respect to the excitation light from the excitation light source means that the excitation light of the excitation light emission facet does not substantially affect the fluorescence detection.
  • the property of preventing reflection and transmitting excitation light That is, specifically, the exit end face of the pumping light of the optical fiber 1 has a surface roughness such that the Rmax is usually 5 am or less, since the pumping light has transparency without being substantially reflected. It is processed and preferably has a Rmax of 0.05 to 5 / m, more preferably 0.01 to 0.5; m.
  • Rmax indicating the surface roughness is based on JIS (Japanese Industrial Standards) BO601.
  • Rmax is one of the indices indicating the surface roughness, and represents the maximum height.
  • This is the part extracted by the reference length (the length of the part obtained by extracting a certain length of the cross-sectional curve) from the cross-sectional curve that is the outline that appears when the measured surface is cut at a plane perpendicular to the measured surface. (Hereinafter referred to as “extracted portion”) When the extracted portion is sandwiched between two straight lines parallel to the average line, the interval between these two straight lines is measured in the direction of the longitudinal magnification of the sectional curve. This value is expressed in; ct m.
  • the method for processing the emission end face of the optical fiber so as to have the above-described surface roughness is not particularly limited, and can be easily performed by a conventional method.
  • an optical fiber is introduced and fixed in the V-groove part of a V-groove processed jig, and water-resistant abrasive paper of various roughnesses (for example, 800, 1500, 2000) And the like, and successive polishing using a wrapping film can adjust the desired surface roughness.
  • the surface roughness can be measured by a stylus type surface roughness meter (manufactured by Tokyo Seimitsu Co., Ltd.) with the optical fiber fixed to the jig.
  • the exit end face of the excitation light has an angle with respect to the light propagation direction.
  • the desired angle is preferably as small as possible because 0 increases the surface area of the outgoing end face at one end of the optical fiber, so that the amount of antigens and antibodies that can be bound to the optical fiber can be increased. If the size is too small, the excitation light will be reflected and chewed, and the background will be undesirably large. Therefore, it is preferable that the angle 0 of the exit end face of the excitation light with respect to the light propagation direction satisfies at least the following equation (1).
  • 0 represents the angle between the light-emitting end face and the light propagation direction
  • nl represents the refractive index of the core of the optical fiber
  • n2 represents the refractive index of the medium in contact with the optical fiber.
  • the immune complex in the present invention is a product in which an antibody or an antigen, which is a measurement sample, is bound in a sandwich manner by an antigen or antibody bound to the excitation light emission end face of an optical fiber and an antigen or antibody labeled with a fluorescent dye.
  • the antibody or antigen that is the measurement sample competes with the antibody or antigen labeled with a fluorescent dye to obtain an optical fiber. It refers to an antigen-antibody complex bound to an antigen or antibody bound to the excitation light emission end face of the bar, and may be any of them.
  • the fluorescent dye used for the fluorescent label is not particularly limited, and for example, a cyanine dye, fluorescein, or the like is used.
  • a fluorescent dye via chitosan-biotin-avidin A fluorescent label prepared by a known method (WO91013209), for example, a product obtained by binding of (antibody-chitosan-pyotin-avidin-fluorescent dye) may be used.
  • the optical fiber for introducing the excitation light and the optical fiber to which the antigen and the antibody serving as the detection unit are separated can be separated.
  • the optical fiber to which the antigen or antibody, which is usually the detection part, is disposable is disposable, so that a new detection part can be easily replaced after the measurement is completed.
  • a fluorescent immunoassay sensing chip in which an antigen or an antibody is bound to the excitation light emitting end face of the optical fiber.
  • the excitation light emitting end face has transparency to the excitation light from the excitation light source.
  • the transmittance with respect to the excitation light has the same meaning as described above, and the excitation light emission end face of the optical fiber has a surface roughness of R max of 5 / zm or less, and light propagation.
  • ⁇ has an angle 0 with respect to the direction expressed by the above equation (1).
  • the filter is installed because the mixing of the excitation light is extremely small or not at all. What Is more preferable because the loss of fluorescence in the filter can be improved.
  • the fluorescence immunoassay device of the present invention comprises an excitation light source, a fluorescence detector, an optical fiber to which an antigen or an antibody is bound, and a spectroscope.
  • the optical fiber to which the antigen or the antibody is bound is a detection unit.
  • An immunoreaction is performed by the so-called Sandwich method or competitive method together with the antigen / antibody solution to be measured and the solution of the antigen / antibody labeled with a fluorescent dye, and the antigen, antibody, and fluorescence on the optical fiber.
  • After forming an immune complex consisting of a label (dye) it is excited by an excitation light source, and the emitted fluorescence is measured by a fluorescence detector. Since the fluorescence immunoassay device of the present invention prevents the excitation light from being reflected at the detection unit, the fluorescence does not contain the excitation light and the sensitivity can be increased.
  • n 1 in the above formula (1) is 1.495
  • n 2 is 1.330.
  • the substrate was immersed in a 20 mM hydrochloric acid solution for 5 to 10 minutes, washed with water, and a formyl group was introduced on the surface of the core portion of the resin optical fiber.
  • the IgG (antibody 8) was immobilized and used as detector 6 (sensing chip) (see Fig. 2).
  • connection guide 5 was attached to one end face of the optical fiber 4 having the same diameter.
  • the excitation light emitted from the light source unit 1 is guided by the spectroscope 7 to the optical fiber 4 via the optical fiber connector 3, and is easily transmitted to the optical fiber 14 by the optical fiber connection guide 5.
  • This fluorescence is guided to the spectrometer unit via the detection unit 6, the optical fiber 14 and the optical fiber connector 3, and the fluorescence is introduced into the detector 2 by the spectroscope 7, and the fluorescence intensity is measured. Is done.
  • the excitation light that has excited the fluorescent substance 12 does not return to the detection unit 6, but the fluorescence emitted by the fluorescent substance 12 has no direction and is guided to the detection unit 6. For this reason, the background due to the excitation light is reduced even without a filter.
  • the detection unit 6 is immersed in a solution containing a Bacillus-derived heat-resistant ⁇ ⁇ ⁇ amylase as a sample sample (solution of antigen 9), washed with a saline solution, and immersed in the solution of (11). After crushing, the cells were immersed in the solution of (12), and the fluorescently labeled secondary antibody 10 was bound to the antigen 9.
  • the detection unit 6 was attached to the connection guide 5, and excited by a 3 mW 65 O.nm semiconductor laser, and the fluorescence was measured.
  • the detection sensitivity was 1.2 X 10 " 4 (mg / m 1).
  • the detection sensitivity was 0.2 ⁇ 10 4 (mg / m 1), indicating an improvement.
  • Fluorescence was measured in the same manner as in Example 1 except that the surface roughness of the emission end face of the excitation light of the optical fiber was adjusted so that Rmax was 0.4 im.
  • the detection sensitivity was 0.3 ⁇ 10 4 (mg gm 1), and good results were obtained.
  • Example 2 a dielectric material having wavelength selectivity in which three layers of MgF 2 and SiO 2 were alternately laminated on a glass substrate by vapor deposition was used.
  • antibody 8 that binds to the output end face of the optical fiber is mouse I • gG, a monoclonal antibody against bovine serum albumin (BSA), and antibody 10 is a polyclonal antibody against BSA.
  • BSA bovine serum albumin
  • fluorescence was measured in the same manner as in Example 1 except that antigen 9 was used as a BSA solution.
  • the detection sensitivity was 1.0 ⁇ 10 5 (mgZm 1), and good results were obtained.
  • Example 3 instead of using a dielectric multilayer film mirror having wavelength selectivity as the spectroscope 7 in Example 3, the plane of polarization selectivity laminated by evaporation five layers alternately MgF 2 and S i 0 2 on a glass substrate The fluorescence was measured in the same manner as in Example 3 except that a dielectric multilayer mirror having the following characteristics was used. Detection sensitivity is 0. 5 X 1 0 _ 4 ( m gZm 1), good good results were obtained.
  • Example 1 the surface roughness of the exit end face of the excitation light of the optical fiber was set to R
  • the fluorescence was measured in the same manner as in Example 1 except that the max was adjusted to 7 / m. The measurement was impossible due to the effects of scattering, reflection, and detection loss of the fluorescence at the emission end face of the excitation light.
  • the max was adjusted to 7 / m. The measurement was impossible due to the effects of scattering, reflection, and detection loss of the fluorescence at the emission end face of the excitation light.
  • the measurement was performed using the apparatus shown in FIG.
  • the optical fiber used was made of NIPPON, and the surface was hydrolyzed with hydrochloric acid to form amino groups on the surface of the optical fiber, and the amino groups were used in the same manner as in Example 1.
  • Antibody 8 was bound.
  • a mirror 13 was formed by injecting silver in a spatula.
  • a half mirror 14 was provided as a spectroscope. The substance to be measured and the measurement method are the same as in Example 1.
  • the fluorescence immunoassay of the present invention prevents the excitation light from being reflected at the detection section, it is necessary to form a reflector at the tip of the optical fiber 1 of the detection section as in the conventional technique. There is no reflection of the excitation light, and no excitation light is mixed into the fluorescent light. Since the load on the filter to be removed can be reduced, and the filter can be omitted, the loss of fluorescence in the filter can be reduced and the sensitivity can be increased. Further, in the present invention, it is not necessary to remove the excitation light or to collect the data of the detector, so that the entire device can be downsized.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)

Description

明 細 書 蛍光免疫測定装置 技術分野
本発明は、 蛍光免疫反応を用いた免疫測定装置であって、 特に光 フアイバーを用いる蛍光免疫測定装置、 およびそれに用いる蛍光免 疫測定用センシングチップに関する。 背景技術
従来、 抗原、 抗体の濃度の測定方法としてはラジオァイソ トープ や酵素で抗原抗体を標識する方法が用いられてきたが、 これらの方 法は感度、 安全性などの面で問題があり、 これらの方法に代わって 蛍光色素で抗原抗体を標識し、 これを用いて抗原抗体の濃度を測定 する方法が種々研究されている。
例えば、 特開昭 5 9 - 5 0 1 8 7 3号 （米国特許番.号 4 8 5 2 8 0 9号） などでは、 光ファイバ一の側面に抗原、 抗体を結合させ、 蛍光色素で標識した抗体、 抗原をこの光ファイバ一表面で免疫反応 させるとともに、 この光ファイバ一に励起光を導波することにより 、 光ファイバ一上の蛍光色素を励起させ、 この蛍光を光ファイバ一 の出射端面で反射させ、 光ファイバ—の入射端面から蛍光と残余の 励起光を取り出し、 これをビームスプリ ッ夕ーを緩由することによ り分光させ、 蛍光のみを測定する方法が記載されている （第 4図参 照） 。
しかしながら、 上述した技術では実用化のために小型化、 低廉化 、 高感度化しようとすると、. 次に示す問題が発生した。 . _ 即ち、 1 . 反射機能を備えるため、 光ファイバ一の先端に反射体 を形成するための加工が必要であり、 コストがかかること、 2 . 反 射機能を備えるため励起光が蛍光に混入し、 励起光をカツ トするた めのカッ トフィルターが必要であること、 3 . 高感度化のために光 源の出力を上げた場合、 カッ トフィルターで除去できない励起光が バックグラウンドとなること、 4 . 光学系が複雑で光軸調整が困難 で小型化しにくレ、、 などの問題である。
このように、 従来技術で.は安全で、 実用化に不可欠な小型、 低廉 、 高感度化が可能な免疫分析装置がなかった。 発明の開示
本発明者らは鋭意研究した結果、 上記課題を解決するために、 抗 原あるいは抗体を光ファイバ一の励起光出射端面に結合し、 励起光 と蛍光を分光器で分光するとともに、 従来必要とされてきた光ファ ィバー検出部端面での反射を逆になく して、 励起光を透過させるこ とにより、 前記課題を解決できることを見出し、 本発明を完成する に至った。
本発明は励起光源、 蛍光検出器、 抗原あるいは抗体が結合した光 ファイバ一、 および分光器を備えた蛍光免疫測定装置であって、 該 抗原あるいは抗体が光ファイバ一の励起光出射端面に結合し、 該分 光器が該励起光源から発せられた励起光を該光フアイバーの励起光 入射端面に導く と共に、 該抗原あるいは抗体と免疫複合体を形成す る蛍光標識された抗体あるいは抗原から発する蛍光を該蛍光検出器 へ導くよう構成され、 該光ファイバ一の励起光出射端面が該励起光 源からの励起光に対して透過性を有するものである蛍光免疫測定装 置、 およびそれに用いる蛍光免疫測定.用センシング-チ プ.に鬨する ものである。 図面の簡単な説明
第 1図 （ a ) 、 ( b ) は本発明の蛍光免疫測定装置の概略構成を 示す図である。 第 2図は本発明の装置の検出部の概略構成を示す図 である。 第 3図は分光器の概略構成を示す図である。 第 4図は従来 技術の装置の概略構成を示す図である。 各図の符号を以下に説明す Ο
1 ： 光源、 2 ： 検出器、 3 ： 光ファイバ一コネクター、 4 ： 光フ アイバー、 5 ： 接続ガイ ド、 6 ： 検出部 （センシングチップ） 、 7 ： 分光器、 8 ： 1 次抗体、 9 ： 抗原、 1 0 ： 蛍光標識 2次抗体、 1 1 ： 分光ュニッ ト、 1 2 : 蛍光物質、 1 3 ： ミ ラ一、 1 4 ： ノヽーフ ミ ラー、 1 5 ： プリズム、 1 6 ： 参照光検出器、 1 7 ： 比率増幅計 、 1 8 ： 記録計、 1 9 ： 励起光を全反射し蛍光を全透過する膜、 2 0 ： 光学接着剤、 2 1 ： 蛍光の反射防止膜、 2 2 ： 励起光、 2 3 ： 蛍光 発明を実施するための最良の形態
本発明における励起光源は、 通常、 半導体レーザ、 L E D、 X e ランプ、 気体レーザ等が挙げられ特に限定されるものではないが、 中でも半導体レーザ、 L E Dが小型化、 低廉化しやすいことから好 ましく使用される。
本発明における蛍光検出器は、 通常、 光電子増倍管、 フォ トダイ オー ド等が挙げられ、 特に限定されるものではないが、 中でもフ ォ トダイォー ドが小型化しやすく強度が大き く実用的であることから 好ま しく使用される。 本発明における抗原あるいは抗体が結合した光ファイバ一は、 光 ファイバ一としてガラス製、 樹脂製など種々の材質を使用できるが 、 特に価格の観点から樹脂製が望ましい。 光ファイバ一に抗原、 抗 体を結合させる方法としては、 公知の方法を種々利用できる。 例え ば、 ガラス製の光ファイバ一の表面に 3 , 4 —アミ ノブ口ピルト リ メ トキシシラーネなどのシリル化合物を反応させ、 光ファイバ一の 表面にアミノ基を導入し、 これに抗原、 抗体のカルボキシル基を結 合させることができる。
また、 樹脂製光ファイバ一に抗原、 抗体を結合させる場合は、 光 ファイノ 一として、 アク リル酸エステルボリマーなどのエステル構 造を持つものが好ましく、 このエステル基に > C H— C H O構造を もつ化合物を反応させ、 ホルミル基を導入し、 このホルミル基に抗 原あるいは抗体などのァミ ノ基を結合させる。
抗原あるいは抗体を光フアイバーに結合させる部位は、 光フアイ バーの励起光出射端面に結合させることが励起効率が高くなるので 望ましい。 抗体を結合させる場合、 抗体としては、 モノ クローナル 抗体であつてもポリ クローナル抗体であつてもよい。
本発明における分光器は、 光源から発せられた光を抗原あるいは 抗体が锆合した光ファイバ一の励起光入射端面に導く と共に、 該抗 原あるいは抗体と免疫複合体を形成する蛍光標識された抗体あるい は抗原から発する蛍光を蛍光検出器へ導く よう構成されていること が必要である。 この理由は、 分光器を備えることにより、 検出部で ある光ファイバ一への入出射を単一の光学系で実現でき、 小型化に 適するからである。 本発明における分光器は、 このような作用を有 するものであれば特に限定されるものではない。 例えば、 1対のプ リズムを組み合わせたものが挙げられる。 こ'の場合、 第 1図 （ a ) において、 第 3図に示すように 1対のプリズムの間に、 励起光を全 反射し、 蛍光を全透過する膜層 1 9および蛍光の反射防止膜層 2 1 を付けることができ、 これにより検出器 2の前に励起光除去フィル ターを付ける必要がなくなるからである。 蛍光を全透過する膜ある いは蛍光の反射防止膜は、 Mg F2 、 Mg O、 Z n O、 S i 02 、 C a F 2 を用いて調製することができる。 膜の形成方法としては、 蒸着法等の公知の方法を使用することができる。
また、 このようなプリズムの代わりに、 励起光を全て反射させる が、 蛍光は全て透過させる性質を有する ミ ラーや、 第 1図 （b) に おいて示すように励起光を全て透過させるが、 蛍光は全て反射させ る性質を有する ミ ラーを適宜調製して用いてもよい。 このようなミ ラーとしては、 特に限定されるものではないが、 例えば誘電体多層 膜ミ ラーが挙げられ、 これを調製するには、 例えば、 ガラス基板の 両面に Mg F2 と S i 02 を蒸着法により交互に多層に積層するこ とにより容易に得ることができる。
前記プリズムおよびミラーは、 励起光と蛍光の波長差を利用する 、 いわゆる波長選択性を有するプリズム、 波長選択性を有する誘電 体多層膜ミラーを用いた分光器であるが、 励起光源に半導体レーザ 一のような単一偏光面を有するレーザーを用いる場合には、 いわゆ る偏光面選択性を有する誘電体多層膜ミ ラーを用いた分光器を用い ることもできる。
この偏光面選択性を有する誘電体多層膜ミ ラーを用いた分光器を 詳レく説明.すると、 第 1図 （a) においては、 ある特定の偏光面を 有する光は全て反射するが、 特定の偏光面以外の光は透過させる性 質を有する誘電体多層膜を用いた分光器であって、 半導体レーザー のような単一偏光面を有する励起光を全て反射させ、 特定の偏光面 以外の蛍光を透過させる性質を有する誘電体多層膜を用いた分光器 である。
第 1図 （b ) においては、 ある特定の偏光面を有する光は全て透 過するが、 特定の偏光面以外の光は反射させる性質を有する誘電体 多曆嫫を用いた分光器であって、 半導体レーザ ©ような単一偏光面 を有する励起光を全て透過させ、 特定の偏光面以外の蛍光を反射さ せる性質を有する誘電体多層膜を用いた分光器である。
これを調製するには、 例えば、 ガラス基板の両面に M g F 2 と S i 0 2 を蒸着法により交互に多層に積層することにより容易に得る ことができる。
本発明においては、 励起光源と分光器の光学的接続、 分光器と蛍 光検出器の光学的接続は、 光ファイバ一にて行うことができる。 こ の場合、 波長選択性を有する誘電体多曆膜ミラーを用いる際の光フ アイバーは、 いかなるものであってもよいが、 偏光面選択性を有す る誘電体多層膜ミラーを用いる場合には、 偏光面保持のために、 偏 波面保持ファイバーであることが必要である。 また、 光ファイバ一 を介さず、 直接光源からの光を分光器に照射、 発生した蛍光を直接 蛍光検出器に照射する方法であってもよく、 小型化の観点からはこ の方法が望ましい。
励起光源からの励起光を抗原あるいは抗体が結合した光フアイバ 一に導入する場合は、 レンズなどの光学系を使用することができる が、 本発明では、 高感度の測定が可能であるため、 レンズ等で励起 光の集先を省略でき、 従来必要であった集光のための光軸合わせの 工程が不要で装置が簡便なものとなる。
本発明においては、 抗原あるいは抗体が結合した光ファイバ一の 励起光出射端面は、 励起光源からの励起光に対して透過性を有する ことが必要である。 この理由は、 励起光を透過させることにより、 従来技術で見られるような励起光の反射を防止でき、 また、 励起光 源の出力を大きく してもバックグラウン ドを低くすることができ、 高感度化が可能なためである。
本発明において、 励起光出射端面が励起光源からの励起光に対し て透過性を有するとは、 出射端面で生じ得る反射光が蛍光検出にお いて実質的に影響を与えない程度に励起光の反射を防止し、 励起光 を透過させる性質をいう。 即ち、 具体的には光ファイバ一の励起光 の出射端面は、 励起光が実質的に反射することなく透過性をもたせ るため、 通常 Rm a Xが 5 am以下の面粗度となるように加工され 、 好ましく は Rm a xが 0. 0 0 5〜5 /m、 さらに好ま しく は 0 . 0 1〜 0. 5 ; mである。 この理由は、 Rm a xが 5〃 mを超え る場合は、 蛍光の検出損失が大き くなつたり、 励起光が出射端面で 乱反射を起こして反射光が蛍光検出器に混入しやすくなったり、 出 射端面から透過して出射される光の出射率が低下する。 また Rm a Xが 0. 0 0 5 /zmより低面粗度の場合は、 加工に手間がかかり、 また表面積が小さ くなるため、 結合できる抗原や抗体の量が減少す るため感度が低下するからである。 本発明において面粗度を表示す る Rm a xは、 J I S (Japanese Industrial Standards) B O 6 0 1 に準拠したものである。
即ち、 Rm a xとは表面粗さを表示する指標の一つであり、 最大 高さを表わす。 これは被測定面に直角な平面で被測定面を切断した とき、 その切り口に現れる輪郭である断面曲線から基準長さ （断面 曲線の一定長さを抜き取った部分の長さ） だけ抜き取った部分 （以 下、 抜取り部分という） の平均線に平行な 2直線で抜取り部分を挟 んだとき、 この 2直線の間隔を断面曲線の縦倍率の方向に測定して 、 この値を; ct mで表したものをいう。
光フアイバーの出射端面を上記のような面粗度となるよう加工す る方法としては、 特に限定されるものではなく、 常法により容易に 行うことができる。 例えば、 V溝加工した治具の V溝部分に光ファ ィバーを導入して固定し、 各種の粗さの耐水研磨紙 （例えば、 8 0 0番、 1 5 0 0番、 2 0 0 0番など） 及びラッ ピングフィルムを用 いて順次研磨することにより所望の面粗度に調整することができる 。 面粗度の測定は、 光ファイバ一を前記の治具に固定した状態で触 針式表面粗さ計 （東京精密社製） により測定することができる。
さらに、 励起光の出射端面は、 光の伝搬方向に対して角度 を有 してなることが望ましい。 所望の角度としては、 0が出来るだけ小 さい方が光ファイバ一先端の出射端面の表面積が大きくなるため、 光ファイバ一へ結合できる抗原、 抗体の量を増やすことができるた め好ましいが、 反面小さくなり過ぎると励起光が反射しゃすくなり 、 バックグラウンドが大きくなつてしまうので好ましくない。 従つ て、 前記励起光の出射端面の光の伝搬方向に対する角度 0は、 少な く とも下記の数式 （ 1 ) を潢たすことが望ましい。
Θ > Z 2 ) - s i n " 1 ( n 2 / n 1 ) · ■ · ( 1 )
(式中、 0は出射端面と光の伝搬方向のなす角度を、 n l は光ファ ィバーのコア部の屈折率を、 n 2は光ファイバ一に接している媒質 の屈折率を表わす。 ）
本発明における免疫複合体とは、 測定試料である抗体あるいは抗 原を光フアイバーの励起光出射端面に結合した抗原あるいは抗体と 蛍光色素により標識された抗原あるいは抗体とによりサン ドイッチ 状に結合したもの、 あるいは測定試料である抗体あるいは抗原と蛍 光色素により標識された抗体あるいは抗原とを競合させて光フアイ バーの励起光出射端面に結合した抗原あるいは抗体と結合させた抗 原抗体複合体をさし、 いずれであってもよい。
また、 蛍光標識に用いる蛍光色素としては、 特に限定されるもの ではなく例えばシァニン系色素、 フルォレセイン等が使用される。 また、 蛍光色素量を増加させる目的で、 例えば抗体にピオチンーァ ビジンを介して蛍光色素を結合させたもの （抗体一ピオチン一アビ ジン一蛍光色素） 、 キ トサン一ピオチン一アビジンを介して蛍光色 素を結合させたもの （抗体一キトサン一ピオチンーァビジン一蛍光 色素） 等の公知の方法 （W O 9 0 1 3 0 2 9号公報） により調製 された蛍光標識体を用いてもよい。
本発明においては、 励起光を導入する光フアイバーと検出部であ る抗原、 抗体が結合した光ファイバ一が分離可能であることが望ま しい。 この理由は、 通常検出部である抗原、 抗体が結合した光ファ ィバーは使い捨てであるため、 測定終了後、 新しい検出部を付け替 えることがたやすくできるからである。
即ち、 本発明により、 抗原あるいは抗体が光ファイバ一の励起光 出射端面に結合した蛍光免疫測定用センシングチップが提供される 。 この蛍光免疫測定用センシングチップにおいて、 励起光出射端面 は励起光源からの励起光に対して透過性を有するものである。 ここ でいう励起光に対しての透過性は前記と同様の意味であり、 光ファ ィバーの励起光出射端面は、 R m a Xが 5 /z m以下の面粗度を有し 、 また光の伝搬方向に対して前記の数式 （ 1 ) で表される角度 0を 有するも φである。
本発明においては、 検出器の前に励起光を除去するフィルターを 設置することが可能であるが、 従来技術の装置と異なり励起光の混 入が極めて少なく、 あるいは全くないため、 フィルターを設置しな い方がフィルターでの蛍光の損失を改善できるため好ましい。
本癸明の蛍光免疫測定装置は、 励起光源、 蛍光検出器、 抗原ある いは抗体が結合した光ファイバ一および分光器を備えてなるもので あり、 抗原あるいは抗体が結合した光フアイバーは検出部として作 用し、 測定試料である抗原、 抗体溶液と蛍光色素で標識された抗原 や抗体の溶液と共に、 いわゆるサン ドィツチ法や競合法により免疫 反応を行い、 光ファイバ一上に抗原、 抗体、 蛍光標識 （色素） から なる免疫複合体を形成した後、 これを励起光源で励起し、 発した蛍 光を蛍光検出器で測定するものである。 本発明の蛍光免疫蒯定装置 は、 検出部での励起光の反射を防止しているため、 蛍光に励起光の 混入がなく、 高感度化が可能である。
以下、 実施例および比較例により本発明をさらに詳しく説明する が、 本発明はこれらの実施例等によりなんら限定されるものではな い。
実施例 1
( 1 ) ポリ メタク リル酸メチルを主成分とする直径 1 mmの樹脂製 光フアイバー （三菱レイョン製、 商品名 ： エス力） の先端を酢酸ェ チルに浸して拭きとり、 クラッ ド層を 1 c m剝離し、 水洗した。 さ らにその端面を光の伝搬方向に対して 3 0 の角度になるように力 ッティ ングし、 そのカッテイ ング面を研磨紙でボリ ッシングし、 面 粗度を Rm a Xが 0. 1 0 mになるように調整した。 なお、 本実 施例で用いる光フアイバーについて、 前記の数式 （ 1 ) における n 1は 1. 4 9 5であり、 n 2は 1. 3 3 0である。
(2) 0. 5m lの水に 1 0mgの N i S 04 を溶解させ、 次いで エタノール 2. 5m lを加えた。 この時、 白色沈澱が生ずるため、 これを 3 0 0 0 r pmで遠心分離して上澄液を採取し、 これを N i 一エタノール溶液とした。
5 0 mM水酸化力 リ ウムーェタノール溶液 0. 4 m 1 に N i —ェ 夕ノール溶液 0. 1 m l を加えさらに 5 0 %グルタルアルデヒ ドを 5 0 ^ 1添加し反応溶液とした。
( 3 ) 前記 （ 2 ) で調製した反応溶液に前記 （ 1 ) の樹脂製光ファ ィバーを 4 5 °Cで、 1 0分間浸潰した後水洗した。
( 4 ) ついで 2 0 mMの塩酸溶液に 5〜 1 0分浸潰した後、 水で洗 浄し、 樹脂製光フアイバーのコア部分の表面にホルミル基を導入し た。
( 5 ) バチルス由来の耐熱性なーァミ ラーゼに対するモノ クローナ ル抗体であるマウス I g G (抗体 8 ) を常法により調製し、 1 mg をりん酸緩衝生理食塩水 （p H= 7. 5 ) に溶かした。 この溶液に 樹脂製光ファイバ一を 4でで 1 2時間浸潰した。
( 6 ) 樹脂製光ファイバ一を溶液から取り出し、 水で洗净した後、 1 %Na B H 4 水溶液に 1 5分間浸漬した後、 水で洗浄してマウス
I g G (抗体 8 ) を固定化し、 検出部 6 (センシングチップ） とし た （第 2図参照） 0
( 7 ) ついで同径の光ファィバー 4の一方の端面に接続ガイ ド 5を 装着した。
( 8 ) 1対の石英製 4 5 ° プリズムを用い、 励起光源 1側のプリズ ムの斜面には励起光を全反射し、 Mg F2 のような蛍光を全透過す る膜を蒸着法により形成し、 検出器 2側のプリズムの斜面には、 S i 02 のような蛍光の反射防止膜を蒸着法により形成した後、 この 1対のプリズムを光学接着剤で一体型として分光器 7を作成した （ 第 3図参照） 0
( 9) 前記 （ 8 ) で作成した分光器 7のプリズムに励起光源である 6 5 0 n mの半導体レーザ 1 のレーザ発振面、 検出器 2、 および光 フアイバー 4の接鐃ガイ ド 5が装着されていない端面を近接させ、 分光ュニッ ト 1 1 に固定して蛍光免疫測定装置とした （第 1図参照
) o
この測定装置は、 光源ュニッ ト 1 より発する励起光を分光器 7に より光ファイバ一コネクター 3を介して光フアイバー 4 に導かれ、 光ファイバ一接続ガイ ド 5 により光ファイバ一 4 と容易に光軸調整 された検出部 6に導かれ、 第 2図に示された蛍光標識 2次抗体 1 0 の蛍光物質 1 2を励起し、 それにより蛍光物質 1 2は蛍光を発振す る。
この蛍光は検出部 6、 光ファイバ一 4および光ファイバ一コネク ター 3を介して分光ュニッ トに導かれ、 この蛍光は分光器 7によつ て、 検出器 2に導入され、 蛍光強度を測定される。
蛍光物質 1 2を励起した励起光は検出部 6に戻ることはないが、 蛍光物質 1 2が発する蛍光は方向性がないので、 検出部 6に導かれ る。 このため、 励起光によるバックグラウン ドはフィルターがなく ても低くなる。
( 1 0 ) 1 0 0 ^ 1 の水に 3 m gの N a 2 C O 3 と 4 m gのビォチ ンを溶かした。 ついで、 1 . 8 Μのキトサン溶液の 2 m 1 に前記 溶液を添加した。 水 1 0 0 ^ 1 を添加した後、 5 0 m gの Ν—シク 口へキジルー N ' — （ 2—モルフオ リノエチル） カルポジイ ミ ド メ トー p— トルエンスルホン酸塩 （C H M C ) を添加した。 さらに 攪拌しながら、 5時間^ 晚室温で反応させた。 酢酸を 3滴滴下し て、 反応を停止させた。 ついで、 N a 2 C 0 3 0 . 3 g / m 1及び N a C 1 0 . 3 g Zm 1 の混合液 4 m 1を加えて、 ピオチン化キ ト サンを沈澱させた。 遠心分離器で沈澱を回収した後、 0 . 3 g /m 1の Na C l と 0. l gZm〗 Na 2 C 03 緩衝液で沈澱を洗浄し た。 沈澱を 1 0m lの 1 O mMのカ リウム一リ ン酸緩衝液 （ρ Η- 7) で一晚 4 で透析してピオチン化キ トサンの懸濁液を得た。 ( 1 1 ) 前記ピオチン化キ トサンの懸濁液に別途常法により調製し たバチルス由来の耐熱性ひーァミ ラーゼに対するポリ クローナル抗 体 （抗体 1 0) 溶液と、 CHMCを添加して、 4 °Cで 1夜反応させ た。 反応終了後、 1 2時間透析を行い、 さらに、 陰イオン交換カラ ムを用いて未反応物を除去し、 抗体が結合したピオチン化キトサン を得た。
( 1 2) 了ビジン l mg及びト リェチルァミ ン 0. 2m lを l m l のエタノールに溶解させた。 次いで、 蛍光色素として 2 m gのシァ ニン系色素 NK 1 1 6 0 (日本感光色素研究所製） を加えて充分に 溶解させ、 溶液を作成した。 さらに前記溶液にジシクロへキシルカ ルボジイ ミ ド （DC C) 1 4 mg加えて、 室温で 4時間反応させた 。 反応終了後、 エバポレー夕でエタノールと ト リエチルアミ ンを減 圧除去した。 残留物を、 0. 0 1 M酢酸緩衝液 （p H= 6. 5 ) 2 m lに懸濁した後、 遠心分離器を用いて 5 0 0 0 r p mで 1 0分間 分離を行って、 上澄みを採取し、 再度遠心分離にかけて NK 1 1 6 0で修飾されたァビジンの溶液を得た。
( 1 3) 検体試料 （抗原 9の溶液） としてバチルス由来の耐熱性な ーァミラーゼを含有する溶液の中に検出部 6を浸潰し、 生理食塩水 の溶液で洗浄、 （ 1 1 ) の溶液に浸潰したのち、 （ 1 2 ) の溶液に 浸漬して抗原 9に蛍光標識 2次抗体 1 0を結合させた。
て 1 4 ) ついで、 検出部 6を接続ガイ ド 5に装着し、 3 mWの 6 5 O.nmの半導体レーザで励起し、 蛍光を測定した。 検出感度は、 1 . 2 X 1 0 "4 (mg/m 1 ) であった。 半導体レーザの出力を高く し、 3 0 mWとしたが、 検出感度は 0. 2 X 1 0 _4 (m g/m 1 ) であり、 向上が見られた。
実施例 2
実施例 1において光フアイバーの励起光の出射端面の面粗度を R ma xが 0. 4 i mになるように調整する以外は、 実施例 1 と同様 にして蛍光を測定した。 検出感度は、 0. 3 X 1 0 _4 (m gZm 1 ) であり、 良好な結果が得られた。
実施例 3
実施例 1において分光器 7として一対のプリズムを接着したもの を使用した代わりに、 ガラス基板上に Mg F 2 と S i 02 を交互に 3層ずつ蒸着法により積層した波長選択性を有する誘電体多層膜ミ ラーを用い、 光フアイバーの出射端面に結合させる抗体 8を牛血清 アルブミ ン （B SA) に対するモノクローナル抗体であるマウス I • gGに、 抗体 1 0を B SAに対するボリ クローナル抗体に、 そして 抗原 9を B S A溶液とする以外は、 実施例 1 と同様にして蛍光を測 定した。 検出感度は、 1. 0 X 1 0 _5 (mgZm 1 ) であり、 良好 な結果が得られた。
実施例 4
実施例 3において分光器 7として波長選択性を有する誘電体多層 膜ミラーを使用した代わりに、 ガラス基板上に MgF2 と S i 02 を交互に 5層ずつ蒸着法により積層した偏光面選択性を有する誘電 体多層膜ミ ラーを用いたこと以外は、 実施例 3と同様にして蛍光を 測定した。 検出感度は、 0. 5 X 1 0 _4 (m gZm 1 ) であり、 良 好な結果が得られた。
比較例 1
実施例 1において光フアイバーの励起光の出射端面の面粗度を R m a xが 7 / mになるように調整する以外は、 実施例 1 と同様にし て蛍光を測定したところ、 励起光の出射端面での散乱、 反射および 蛍光の検出損失などの影響により測定不能であった。
比較例 2
実施例 1 において光フアイバーの励起光の出射端面の角度 0を 1 5 ° に調整する以外は、 実施例 1 と同様にして蛍光を測定した。 検 出感度は、 0. 7 X 1 0 -4 (m gZm 1 ) であり、 励起光の反射に よるバッ クグラン ドの影響が見られた。
比較例 3
第 4図に示される装置を用いて測定を行った。 光ファイバ一は、 ナイ口ン製の物を使用し、 表面を塩酸で加水分解してァミ ノ基を光 ファイバーの表面に生成させ、 このアミ ノ基に実施例 1 で用いたの と同様の抗体 8を結合させた。 また、 光ファイバ一の先端にはスパ ッ夕で銀を打ち込みミ ラー 1 3を形成した。 また分光器として、 ハ 一フ ミ ラー 1 4を設けた。 被測定物質、 測定方法は実施例 1 と同様 である。
3 mWの 6 5 0 n mの半導体レーザで励起し、 蛍光を測定した結 果、 検出感度は、 2. 1 X 1 0 -4 (m g/m 1 ) であった。 また、 半導体レーザの出力を高く し、 3 0 mWとしたが、 バッ クグラウン ドの妨害により Λ定不能であった。 産業上の利用可能性
このように本発明の蛍光免疫測定装置は、 検出部での励起光の反 射を防止しているため、 従来の技術のように検出部の光ファイバ一 .の先端に反射体を形成する必要もなく、 また励起光の反射がないた め蛍光に励起光の混入がなく、 光源を高出力化する場合、 励起光を 除去するフィルターにがかる負担を柽減でき、 またフィルターを省 く こともできるため、 フィルターでの蛍光の損失を低減でき高感度 化が可能である。 また、 本発明では励起光を除去したり、 検出器の データを捕正する必要がないため、 装置全体の小型化が可能である o

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 励起光源、 蛍光検出器、 抗原あるいは抗体が結合した光フ アイバー、 および分光器を備えた蛍光免疫測定装置であって、 該抗 原あるいは抗体が光ファイバ一の励起光出射端面に結合し、 該分光 器が該励起光源から発せられた励起光を該光フアイバーの励起光入 射端面に導く と共に、 該抗原あるいは抗体と免疫複合体を形成する 蛍光標識された抗体あるいは抗原から発する蛍光を該蛍光検出器へ 導く よう構成され、 該光フアイバーの励起光出射端面が該励起光源 からの励起光に対して透過性を有するものである蛍光免疫測定装置
0
2 . 励起光源が半導体レーザーである請求の範囲第 1項記載の 蛍光免疫測定装置。
3 . 光ファイバ一が樹脂製光ファイバ一である請求の範囲第. 1 項記載の蛍光免疫測定装置。
4 . 分光器がプリズム又は誘電体多層膜ミ ラーである請求の範 囲第 1項記載の蛍光免疫測定装置。
5 . 誘電体多層膜ミ ラーが波長選択性を有する誘電体多層膜ミ ラ一又は偏光面選択性を有する誘電体多層膜ミ ラーである請求の範 囲第 4項記載の蛍光免疫測定装置。
6 . 光ファイバ一の励起光出射端面が、 R m a Xが 5 z m以下 の面粗度を有する請求の範囲第 1項記載の蛍光免疫測定装置。
7 光ファイバ一の励起光出射端面が、 光の伝搬方向に対して 数式 （ 1 ) で表される角度 0を有する請求の範囲第 1項記載の蛍光 免疫測定装置。
Θ > ίπ/ 2 ) - s i η-1 (η 2 /η 1 ) · · · ( 1 )
(式中、 0は出射端面と光の伝搬方向のなす角度を、 n lは光ファ ィバーのコア部の屈折率を、 n 2は光フアイバーに接している媒質 の屈折率を表わす。 ）
8. 抗原あるいは抗体が光フアイパーの励起光出射端面に結合 した蛍光免疫測定用センシングチップであって、 該励起光出射端面 が励起光源からの励起光に対して透過性を宵するものである蛍光免 疫測定用センシングチップ。
9. 光ファイバ一が樹脂製光ファイバ一である請求の範囲第 8 項記載の蛍光免疫測定用センシングチップ。
10. 光ファイバ一の励起光出射端面が、 Rm a xが 5 ιη以下 の面粗度を有する請求の範囲第 8項記載の蛍光免疫測定用センシン グチップ。
U. 光ファイバ一の励起光出射端面が、 光の伝搬方向に対して 数式 （ 1 ) で表される角度 0を有する請求の範囲第 8項記載の蛍光 免疫澌定用センシングチッブ。
θ > ( 7Γ Ζ 2 ) - s i η -1 (η 2 /η 1 ) · ■ · ( 1 )
(.式中、 0は出射端面と光の伝搬方向のなす角度を、 n lは光ファ ィバーのコア部の屈折率を、 n 2は光フアイバーに接している媒質 の屈折率を表わす。 ）
PCT/JP1992/001652 1991-12-20 1992-12-17 Fluorescent immunity measuring instrument WO1993013418A1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/098,394 US5449625A (en) 1991-12-20 1992-12-17 Optical fiber based fluorescent immunoassay apparatus

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP3/356001 1991-12-20
JP35600191 1991-12-20
JP4/160234 1992-05-26
JP04160234A JP3107649B2 (ja) 1991-12-20 1992-05-26 蛍光免疫測定装置

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO1993013418A1 true WO1993013418A1 (en) 1993-07-08

Family

ID=26486794

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP1992/001652 WO1993013418A1 (en) 1991-12-20 1992-12-17 Fluorescent immunity measuring instrument

Country Status (4)

Country Link
US (1) US5449625A (ja)
JP (1) JP3107649B2 (ja)
DE (1) DE4294539T1 (ja)
WO (1) WO1993013418A1 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5354574A (en) * 1992-06-23 1994-10-11 Ibiden Co., Ltd. Method for producing optical fiber having formyl groups on core surface thereof
CN102341696A (zh) * 2009-03-03 2012-02-01 万迈医疗仪器有限公司 用于高灵敏度荧光分析的检测系统和方法

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH07110330A (ja) * 1993-09-01 1995-04-25 Bio Sensor Kenkyusho:Kk 光学センサー
US5814565A (en) * 1995-02-23 1998-09-29 University Of Utah Research Foundation Integrated optic waveguide immunosensor
US5690894A (en) * 1995-05-23 1997-11-25 The Regents Of The University Of California High density array fabrication and readout method for a fiber optic biosensor
US5837196A (en) * 1996-01-26 1998-11-17 The Regents Of The University Of California High density array fabrication and readout method for a fiber optic biosensor
US5938595A (en) * 1996-05-24 1999-08-17 The Regents Of The University Of California Fiber optic D dimer biosensor
US5859937A (en) * 1997-04-04 1999-01-12 Neomecs Incorporated Minimally invasive sensor
US5929453A (en) * 1997-06-03 1999-07-27 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Underwater spectroscopic detector
EP0898162A1 (en) * 1997-08-20 1999-02-24 Suzuki Motor Corporation Immunoassay apparatus
US6222619B1 (en) 1997-09-18 2001-04-24 University Of Utah Research Foundation Diagnostic device and method
DE19747572C1 (de) * 1997-10-28 1999-04-08 Inst Chemo Biosensorik Vorrichtung und Verfahren zur Durchführung von Fluoreszenzimmuntests
US6289229B1 (en) 1998-01-20 2001-09-11 Scimed Life Systems, Inc. Readable probe array for in vivo use
US7167615B1 (en) 1999-11-05 2007-01-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Resonant waveguide-grating filters and sensors and methods for making and using same
US7496392B2 (en) * 2003-11-26 2009-02-24 Becton, Dickinson And Company Fiber optic device for sensing analytes
FR2891366B1 (fr) * 2005-09-29 2007-11-30 Univ Nice Sophia Antipolis Eta Dispositif pour l'analyse par spectrofluorimetrie d'un materiel biologique
JP4986137B2 (ja) * 2006-12-13 2012-07-25 独立行政法人産業技術総合研究所 ナノ構造体を有する光学素子用又はナノ構造体用成形型の製造方法
EP2699906B1 (en) 2011-04-20 2017-11-29 Access Medical Systems, Ltd. Luminescent polymer cyclic amplification
US9568431B2 (en) 2012-04-16 2017-02-14 Access Medical Systems, Ltd. Luminescent immunoassays for quantitating analytes having a wide concentration range
JP6291278B2 (ja) * 2014-02-19 2018-03-14 株式会社エンプラス 検出装置
CN113063759B (zh) * 2021-03-15 2023-05-05 国科大杭州高等研究院 基于半球空间类复眼结构的体细胞激光诱导荧光探测方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS61271458A (ja) * 1985-05-28 1986-12-01 Olympus Optical Co Ltd 免疫学的分析方法
JPS62501102A (ja) * 1984-11-06 1987-04-30 プルーテック　リミティド 溶液中の種を光学的に測定するための分折装置
JPH0346564A (ja) * 1989-07-14 1991-02-27 Matsushita Electric Ind Co Ltd 免疫測定方法および免疫センサー

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4582809A (en) * 1982-06-14 1986-04-15 Myron J. Block Apparatus including optical fiber for fluorescence immunoassay
US4558014A (en) * 1983-06-13 1985-12-10 Myron J. Block Assay apparatus and methods
US4666862A (en) * 1984-08-14 1987-05-19 Ortho Diagnostic Systems Inc. Fluorescent energy transfer with phycobiliproteins
DE3481644D1 (de) * 1984-12-10 1990-04-19 Prutec Ltd Verfahren zum optischen nachweis von parametern von substanzen in einem fluessigen analyt.
DE3617763A1 (de) * 1985-05-28 1986-12-04 Olympus Optical Co., Ltd., Tokio/Tokyo Verfahren zur durchfuehrung immunologischer bestimmungen und dafuer geeignete vorrichtung
US4716121A (en) * 1985-09-09 1987-12-29 Ord, Inc. Fluorescent assays, including immunoassays, with feature of flowing sample
US5019350A (en) * 1986-02-13 1991-05-28 Pfizer Hospital Products, Inc. Fluorescent polymers
US4925268A (en) * 1988-07-25 1990-05-15 Abbott Laboratories Fiber-optic physiological probes
EP0357354B1 (en) * 1988-08-29 1994-10-26 Mitsubishi Rayon Co., Ltd. Polymer composition and optical fiber having cladding composed of that composition

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS62501102A (ja) * 1984-11-06 1987-04-30 プルーテック　リミティド 溶液中の種を光学的に測定するための分折装置
JPS61271458A (ja) * 1985-05-28 1986-12-01 Olympus Optical Co Ltd 免疫学的分析方法
JPH0346564A (ja) * 1989-07-14 1991-02-27 Matsushita Electric Ind Co Ltd 免疫測定方法および免疫センサー

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5354574A (en) * 1992-06-23 1994-10-11 Ibiden Co., Ltd. Method for producing optical fiber having formyl groups on core surface thereof
CN102341696A (zh) * 2009-03-03 2012-02-01 万迈医疗仪器有限公司 用于高灵敏度荧光分析的检测系统和方法

Also Published As

Publication number Publication date
DE4294539T1 (de) 1994-01-13
JP3107649B2 (ja) 2000-11-13
US5449625A (en) 1995-09-12
JPH05223818A (ja) 1993-09-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO1993013418A1 (en) Fluorescent immunity measuring instrument
US5478755A (en) Long range surface plasma resonance immunoassay
JP3645907B2 (ja) 漸減励起された発光を検出する方法
US5166515A (en) Method of optical analysis of a fluid including an optical waveguide
US5830766A (en) Enhanced signal-to-noise ratio and sensitivity optical immunoassay
EP1903330B1 (en) Surface plasmon enhanced fluorescence sensor and fluorescence detecting method
Attridge et al. Sensitivity enhancement of optical immunosensors by the use of a surface plasmon resonance fluoroimmunoassay
US4582809A (en) Apparatus including optical fiber for fluorescence immunoassay
US20090116020A1 (en) Biosensor, method for producing the same and sensor measurement system
EP1085315A1 (en) Integrated-optical sensor
JP2010008263A (ja) 検出方法、検出用試料セルおよび検出用キット
JP2002527771A (ja) 誘電体積層膜を備えた光センサ
JP2969177B2 (ja) 分析方法
JP2009236709A (ja) 表面プラズモンセンシング方法および表面プラズモンセンシング装置
EP2063256A1 (en) Fluorescence detecting method
JP3283065B2 (ja) 癌の免疫検査法とそれに使用される検査用内視鏡
JP3025078B2 (ja) 蛍光分析法
Kooyman et al. A fiber-optic fluorescence immunosensor
JPH0688785A (ja) 発光免疫測定装置
Yoshida et al. Development of fiber optic fluoroimmunoassay: proximal vs. distal end collection geometries of a fiber sensor
JPH0763756A (ja) 蛍光免疫測定装置
JP3129482B2 (ja) リン脂質抗体の測定法、測定用チップ及び試薬
JPH06117997A (ja) 光学的測定装置

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): DE US

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 08098394

Country of ref document: US

RET De translation (de og part 6b)

Ref document number: 4294539

Country of ref document: DE

Date of ref document: 19940113

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 4294539

Country of ref document: DE