WO1992008709A1 - Meta-substituierte phenylalanin-derivate - Google Patents

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WO1992008709A1
WO1992008709A1 PCT/CH1991/000235 CH9100235W WO9208709A1 WO 1992008709 A1 WO1992008709 A1 WO 1992008709A1 CH 9100235 W CH9100235 W CH 9100235W WO 9208709 A1 WO9208709 A1 WO 9208709A1
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naphthylsulfonyl
phenylalanyl
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Jörg STÜRZEBECHER
Helmut Vieweg
Peter Wikstroem
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Pentapharm Ag
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Definitions

  • non-selective inhibitors of thrombin and the plasma coagulation factors X and XII and kallikreinen, enzymatic complement factors and trypsin are the methanesulfonic acid salt of the 4- (6-guanidino-hexanoyloxy) -benzoic acid ethyl ester (M. Muramatu et al., Biochim. Biophys. Acta 268, 221-224, 1972) and that Dimethanesulfonic acid salt of 6-amidino-2-naphthyl-p-guanidinobenzoic acid (see US Pat. No. 4,454,338).
  • Direct inhibitors of this type are therefore suitable for use as anticoagulants in a variety of types of application.
  • the present invention relates to novel proteinase-inhibiting D, L, L and D-phenylalanine derivatives of the formula
  • R 4 is an aryl radical, for example phenyl, methylphenyl, ⁇ - or ⁇ -naphthyl or 5- (dimethylamino) -naphthyl, or one
  • R 9 is a straight-chain or branched alkoxy or Benzyloxy group
  • R 9 is a straight-chain or branched alkoxy or Benzyloxy group
  • n and R 2 to R 4 correspond to those of the general formula I, alk represents lower alkyl, preferably - CH 3 , and X represents halogen, generally iodine.
  • n and R 2 to R 4 correspond to those of the general formula I
  • alk represents lower alkyl, preferably -CH 3 or -C 2 H 5
  • X represents halogen, generally chlorine.
  • R 1 represents the oxamidino group (c).
  • IV intravenous
  • SC subcutaneous
  • PO oral
  • the oily tosylates were dissolved in water, made alkaline with 0.5 N NaOH and the bases released were extracted with ethyl acetate. After the ethyl acetate solutions had been dried over Na 2 SO 4 , the solvent was distilled off to a residue of about 5 ml, acidified with 2 N ethyl acetate / HCl and the compounds 7-11 were precipitated by adding ether.
  • Method A 10 mmol of the corresponding piperidine carboxylic acid ester (AV, Table 6) were dissolved in 10 ml of DMF, mixed with 11 mmol of HOBT and cooled to 0 °. A solution of 9 mmol of compound 3 in 20 ml of THF and 11 mmol of DCC were added and the mixture was stirred overnight. The urea derivative formed was filtered off and the solvent was distilled off. The residue was dissolved in ethyl acetate, the solution was washed with water, 10% citric acid, saturated NaHCO 3 solution and saturated NaCl solution and then dried over MgSO 4 . After the solvent had been distilled off, the crude products were purified by recrystallization or column chromatography.
  • thioimidate ester hydroiodides 72-82 were dissolved in 10 ml each of methanol, the solutions were mixed with the 1.5 molar amount of ammonium acetate and the batches were heated at 60 ° C. in a water bath for 3 hours. The mixture was then kept in the refrigerator for 24 hours, the crystallized betaines 83-93 were suction filtered, washed with methanol and ether and dried.
  • Plasma binding R 1 R 2 R 4 n thrombin trypsin plasmin Xa Xlla tPA Kaliikrein
  • Table 27 shows the mouse toxicity values of representative compounds according to the invention and, for comparison, NAPAP and TAPAM.
  • LD50 10 - 50 mg / kg after IV application Compared to previously tested derivatives of benzamidine-containing amino acids (LD50 10 - 50 mg / kg after IV application), the toxicity is significantly lower for a number of compounds according to the invention, i.e. values for the LD50 after IV administration of> 50 mg / kg were found. This becomes particularly clear when comparing NAPAP with those compounds that also show improved pharmacokinetic data (123, 83, 186 and 190).
  • Table 28-30 shows the results of studies on the pharmacokinetics of representative compounds according to the invention and, for comparison, the values with NAPAP.
  • the compounds to be tested were administered intravenously (Table 28), subcutaneously (Table 29) or orally (Table 30) to rats. After the administration, the test animals were at intervals of Blood samples are taken from 2 to a maximum of 360 minutes, in which the blood level of the compounds to be tested was determined by means of HPLC.
  • the tested derivatives show improved pharmacokinetic behavior compared to NAPAP.
  • the compounds are eliminated after intravenous administration at a comparable rate (Fig. 1), relatively high, long-lasting blood levels are found after subcutaneous administration (Fig. 2).
  • Fig. 2 After oral administration, NAPAP cannot be detected in plasma, while some of the compounds tested according to the invention reach relatively high concentrations (Fig. 3).
  • a number of representative compounds according to the invention are anticoagulant in vitro. In all cases, the thrombin time (TT) was most effectively prolonged. This corresponds to the selectivity of these inhibitors, which inhibit thrombin most strongly among the coagulation factors.
  • the anticoagulant effect of the compounds can also be demonstrated in vivo. After i.v., s.c and p.o. administration of the compounds to be tested, the anticoagulant effect was determined in the plasma of the test animals. This is shown as an example for connection 123 in Fig. 5. The antithrombin effect in the coagulation test must be demonstrated in accordance with the concentration curve in plasma determined by HPLC.
  • phenylalanine derivatives prepared by one of the processes according to the invention are expediently suitable as such or as salts with a physiologically tolerable inorganic or organic acid using suitable pharmaceutical auxiliaries Application forms transferred.
  • these are, in particular, transdermal therapy systems such as plasters, but also tablets, dragées, capsules, suppositories, solutions, etc.
  • the dosage depends on the antithrombin activity, the toxicity, the possible blood level values, the bioavailability and the type of application of the compound according to the invention used, and in general on the blood values, the weight and the general condition of the patient, so that the dosage must ultimately be determined by the practicing doctor .
  • the dosage corresponds to that of known thrombin-inhibiting compounds and is between approximately 0.2 mg / kg and approximately 20 mg / kg body weight, with higher doses possibly also being administered.
  • daily doses of a compound according to the invention of about 50 mg to about 1600 mg or more are thus obtained.
  • 1 tablet contains 50 mg active ingredient, 40 mg lactose, 30 mg
  • Corn starch 4 mg PVP and 1 mg magnesium stearate.
  • the active ingredient mixed with lactose and corn starch is moistened uniformly with a 20% ethanolic solution of polyvinylpyrrolidone, through a sieve
  • 1 dragee contains 25 mg of active ingredient, 20 mg of lactose and 15 mg of corn starch.
  • the active ingredient mixed with lactose and corn starch is granulated in the manner described in Example 1 and compressed into oval tablet cores, which are then coated.
  • a sugar mixture consisting of 36.09% powdered sugar, 13.54% gum arabic, 36.09% wheat starch and 3.00% magnesium stearate as well as a binder 11.28% of a mixture of equal parts of mucilage gum arabic and Water used.
  • 1 capsule contains 50 mg of active ingredient and 100 mg of lactose.
  • the finely powdered active ingredient is partly triturated with lactose and the mixture is introduced into the capsules in starch capsules, which are cylinders that can be pushed into one another and sealed on one side, in the dosage indicated.
  • 1 suppository contains 50 mg of active ingredient and 0.95 g of cetyl phthalate as the basis.
  • the finely powdered active ingredient is triturated with twice the amount of the liquefied base.
  • the trituration is partially mixed with the rest of the liquefied base and processed until it is uniform.
  • the mixture is close to the limit of pourability poured into a suitable mold and. left to cool.

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Abstract

D,L-, L- und D-Phenylalanin-Derivate der im Patentanspruch 1 definierten Formel (I), in denen R1 für eine Amidino-, Guanidino-, Oxamidino-, Aminomethyl- oder Aminogruppe steht, wurden gefunden, die blutgerinnungshemmend resp. antithrombotisch wirksam sind. Die antithrombotisch wirksamen Verbindungen weisen eine geringe Toxizität auf und können peroral, subkutan oder intravenös verabreicht werden.

Description

Meta-substituierte Phenylalanin-Derivate
Die vorliegende Erfindung betrifft neue ProteinasenInhibitoren, die ein am Phenylrest substituiertes Phenylalanin enthalten. Insbesondere durch Variation des Substituenten am Phenylrest und Einführung von hydrophob substituierten sekundären Aminosäuren wurden Inhibitoren mit verbesserter Bioverfügbarkeit gefunden.
Proteinase-Inhibitoren sind potentielle Arzneimittel, die zur Steuerung physiologischer Prozesse, welche durch Proteinasen ausgelöst und unterhalten werden, verwendet werden können. Für zahlreiche endogene bzw. natürlich vorkommende Hemmstoffe ist gezeigt worden, dass sie in vivo die Aktivität von Proteinasen beeinflussen und hyperproteolytische Zustände dämpfen können [Siehe Hörl, W.H. In: Design of Enzyme Inhibitors as Drugs, S. 573-581, (Sandler, M. and Smith, H.J., Eds.) Oxford, New York, Tokyo: Oxford University Press, 1989]. Der therapeutische Einsatz dieser relativ hochmolekularen Hemmstoffe ist allerdings wegen ihrer besonderen Proteinstruktur begrenzt. Da diese Hemmstoffe einerseits nach oraler Verabreichung im Darm nicht resorbierbar sind und andererseits eine antigene Aktivität ausüben, wurde nach synthetischen kleinmolekularen EnzymInhibitoren Ausschau gehalten. Die vier Klassen von Enzymen, die für Proteinase-abhängige Prozesse verantwortlich sind, umfassen die Serin-, Thiol-, Metallo-, und Aspartat-Proteinasen. Serin-Proteinasen sind proteolytische Enzyme, die einen reaktiven Serin-Rest im aktiven Zentrum besitzen. Zur Trypsin-Familie der Serin-Proteinasen gehören Enzyme, die wie Trypsin als solches C-terminale Peptidbindungen der basischen Aminosäuren Arginin und Lysin spalten. In dieser Gruppe sind diejenigen Enzyme von besonderer physiologischer Bedeutung, welche an den Abwehrsystemen des Blutes beteiligt sind. Das sind insbesondere die Enzyme des Gerinnungssystems, daneben aber auch solche, die die Fibrinolyse auslösen, Kinin freisetzen und die Komplement-Aktivierung bewirken oder solche, die selber Komponenten der genannten Enzymsysteme sind.
Die Blutgerinnung wird über zwei unterschiedliche Wege durch Zymogen-Aktivierung ausgelöst. Der erste, endogene
Weg, führt über eine durch Blutkomponenten vermittelte
Reaktionskette zur Blutgerinnung. Der zweite, exogene Weg führt über eine kürzere, auf einer Wechselwirkung zwischen
Blut- und Gewebekomponenten beruhenden Reaktionskette zur
Gerinnung. Beide Wege bewirken die Aktivierung des Zymogens
Faktor X zur Serin-Proteinase Faktor Xa, welche ihrerseits die Aktivierung des Prothrombins zur Fibrinogen-koagulierenden Serin-Proteinase Thrombin katalysiert. Als gemeinsames Produkt sowohl des endogenen als auch des exogenen Aktivierungsablaufs erscheint Faktor Xa als ein bevorzugtes Zielenzym für hemmende Eingriffe in den Blutgerinnungsvorgang.
Zur Entwicklung von synthetischen Inhibitoren für trypsinähnliche Serin-Proteinasen sind Derivate des Benzamidins vielfach untersucht worden (J. Stürzebecher et al., Acta Biol. Med. Germ. 3j5, 1665-1676, 1976). Dabei haben sich Aminosäure-Derivate mit Benzamidin-Struktur als besonders günstige Grundstrukturen erwiesen (G. Wagner et al., Pharmazie 36, 597 - 603, 1981 und J. Stürzebecher et al., ibid, 639-641; UK Patent Application 2 007 663 A). Unter diesen Verbindungen sind Derivate des Phenylalanins mit meta-ständiger Amidinogruppe selektive Faktor X -Inhibitoren, während analoge Verbindungen mit para-ständiger Amidinogruppe Grundstrukturen für die Entwicklung von selektiven Thrombin-Inhibitoren sind.
Als selektiv Faktor Xa-hemmendes Aminosäure-Derivat mit Benzamidinstruktur und meta-ständiger Amidinogruppe wurde Nα-Tosylglycyl-3-amidinophenylalanin-methylester (TAPAM; K.= 8,4 × 10 mol/l) vorgeschlagen (J. Stürzebecher et al., Thromb. Res. 54, 245 - 252, 1989). Der wirksamste Thrombin-Hemmstoff ist das Phenylalanin-Derivat
Nα-(2-Naphthyl-sulfonyl)-glycyl-4-amidinophenylalanin-piperidid (K.= 6 × 10 -9 mol/l) mit para-standiger Amidinogruppe, das als NAPAP bezeichnet wird (J. Stürzebecher et al., Thromb. Res. 29., 635-642, 1983).
Es sind noch weitere Typen von Inhibitoren bekannt, die Faktor X bezw. Thrombin ebenfalls selektiv hemmen:
a
Eine erste Gruppe beinhaltet Peptidyl-arginin-chlormethylketone, z.B. Ile-Glu-Gly-Arg-CH2Cl, welches Faktor Xa hemmt
(C. Kettner et al., Thromb. Res. 22 , 645-652, 1981) bezw.
H-D-Phe-Pro-Arg-CH2Cl, welches Thrombin selektiv hemmt (C.
Kettner et al., Thromb. Res. 14, 969-973, 1979). Eine zweite Gruppe beinhaltet Peptidylargininaldehyde, z.B.
Ile-Glu-Gly-Arg-H (S. Bajusz, Folia Haematol. 109. 16-21,
1982) und H-D-Phe-Pro-Arg-H (S. Bajusz, Int. J. Peptide
Protein Res. 12, 217-221, 1978), welche Faktor Xa bzw.
Thrombin hemmen. Diese Inhibitoren sind jedoch relativ instabil und können wegen ihrer Reaktionsfähigkeit unerwünschte Nebenreaktionen verursachen. Als weitere selektive Thrombininhibitoren sind (2R, 4R)-4-Methyl-1-[Nα-(3-methyl-1,2,3,5-tetrahydro-8-chinolinsulfonyl)-L-arginin]-2-pipecolin-carbonsäure (R. Kikumoto et al., Biochemistry 23, 85-90, 1984) und das Boronsäurederivat BOC-D-Phe-Pro-Boro-Arg-C10H16 (s. Europ. Patentanmeldung No. 0 293 881) beschrieben worden.
Als therapeutisch verwendbare, nicht-selektive Inhibitoren von Thrombin und der Plasmagerinnungsfaktoren X und XII sowie von Kallikreinen, enzymatischen Komplementfaktoren und Trypsin sind das Methansulfonsäuresalz des 4-(6-Guanidino-hexanoyloxy)-benzoesäure-ethylesters (M. Muramatu et al., Biochim. Biophys. Acta 268, 221-224, 1972) und das Dimethansulfonsäuresalz der 6-Amidino-2 -naphthyl-p-guanidinobenzoesäure (s. US Patent Nr. 4 454 338) beschrieben.
Die gerinnungshemmende und antithrombotische Wirksamkeit ist in vivo für alle der genannten Inhibitoren gezeigt worden. Dagegen wurde eine Resorbierbarkeit nach oraler Verabreichung bisher nur für den Aldehyd N-Methyl-D-PhePro-Arg-H (Bagdy et al., Thromb. Haemostas. 62, 535, 1989) und das Boronsäurederivat BOC-D-Phe-Pro-Boro-Arg-C10H16 (s. Europ. Patentanmeldung No. 0 293 881) beobachtet.
Alle bisher geprüften Thrombin-Hemmstoffe vom Benzamidin-Typ besitzen für eine therapeutische Anwendung ungünstige pharmakodynamische und pharmakokinetische Eigenschaften. Mit einer LD zwischen 10 - 50 mg/kg ist ihre Toxizität relativ hoch (B. Kaiser et al., Pharmazie
42, 119 - 121, 1987). Die Verbindungen werden schneller aus der Zirkulation eliminiert als z. B. das Argininderivat ( 2R, 4R) -4-Methyl-1-[Nα-(3-methyl-1,2,3,5-tetrahydro-8-chinolinsulfonyl)-L-arginin]-2-pipecolin-carbonsäure bzw. das Boronsäurederivat BOC-D-Phe-Pro-Boro-Arg-C10H16 (J. Hauptmann et al., Pharmazie 46, 57-58, 1991). Bei oraler Applikation werden sie nicht im Darm resorbiert (B. Kaiser et al., Biomed. Biochim. Acta 44, 1201-1210, 1985). Verantwortlich für die unzureichenden pharmakologisehen Eigenschaften ist wahrscheinlich die durch die stark basische Amidinofunktion herabgesetzte Hydrophobizitat (B. Kaiser et al., Pharmazie 42, 119-121, 1987). Versuche, die stark basische Amidinofunktion in hochwirksamen Inhibitoren durch schwächer basische Gruppen zu ersetzen, schlugen fehl; solche Veränderungen hatten einen bedeutenden Verlust an Wirkungsstärke zur Folge (J. Stürzebecher et al., Pharmazie
43, 782-783, 1988). Es wurde versucht, therapeutisch verwendbare Inhibitoren von Gerinnungsfaktoren mit guten pharmakologischen Eigenschaften zu konzipieren. Dazu wurde von Phenylalaninderivaten mit meta-ständiger Amidinogruppe ausgegangen, die sich als selektive Faktor Xa-Inhibitoren erwiesen hatten
(J. Stürzebecher et al., Thromb. Res. 54, 245 - 252, 1989).
Ausgehend von der Erkenntnis, dass eine Erhöhung der
Hydrophobizitat eine Veränderung der pharmakologischen
Eigenschaften bewirken könnte, sollten bei Erhalt der
Anti-Faktor Xa-Aktivität neue Inhibitor-Grundstrukturen gefunden werden. Dazu wurden die basische Amidino-Gruppe verändert bzw. hydrophob substituierte sekundäre Aminosäuren eingeführt. In diesem Rahmen wurde beispielsweise die Verbindung Nα-2-Naphthylsulfonyl-3-amidinophenylalanyl-prolin hergestellt. Es wurde nun gefunden, dass diese Verbindung nicht wie erwartet Faktor X selektiv hemmt, sondern überraschenderweise Thrombin. Es wurde ferner festgestellt, dass diese Verbindung ausgezeichnete pharmakokinetische Eigenschaften besitzt. Nach subkutaner Applikation an Ratten wird ein relativ hoher Blutspiegel erhalten, der über einen längeren Zeitraum in wirksamer, blutgerinnungshemmender Konzentration verfügbar bleibt. Nach peroraler Verabreichung an Ratten wird die Verbindung durch den Darm resorbiert. Dies trifft auch für analoge Verbindungen zu, in denen die Amidino-Gruppe verändert wurde, beispielsweise bei Derivaten mit einer Oxamidino-Gruppe. Die neuen Derivate zeichnen sich auch durch eine verminderte Toxizität aus.
Damit sind derartige direkt wirksame Inhibitoren geeignet, als Antikoagulantien bei verschiedenartiger Applikationsart eingesetzt zu werden. Die vorliegende Erfindung betrifft neue Proteinasenhemmende D,L-, L- und D-Phenylalanin-Derivate der Formel
Figure imgf000008_0001
in welcher
R1 eine basische Gruppe der Formel
Figure imgf000008_0002
Figure imgf000008_0003
Figure imgf000008_0004
(d) - CH2 - NH2 oder (e) - NH2
Aminomethyl Amino darstellt, wobei R 5 und R6 in den Formeln (a) und (b) je Wasserstoff oder einen geradkettigen oder verzweigten niedrigen Alkylrest bezeichnen,
R2 (f) OH, O-Alkyl, O-Cycloalkyl, O-Aralkyl, n=0 sein kann,
(g) eine Gruppe der Formel
Figure imgf000008_0005
darstellt, in welcher R Wasserstoff oder einen geradkettigen oder verzweigten niedrigen Alkylrest und R8 einen geradkettigen oder verzweigten niedrigen Alkylrest, einen 1- oder 2-Hydroxyethylrest, einen Methylmercaptoethylrest, einen Aminobutylrest, einen Guanidinopropylrest, einen Carboxy(niedrigen) alkylrest, einen Carboxamido(niedrigen)alkylrest, einen Phenyl(niedrigen)alkylrest, dessen Ring gegebenenfalls mit OH, Halogen, niedrig-Alkyl oder Methoxy substituiert ist, einen Cyclohexyl- oder Cyclohexylmethylrest, dessen Ring gegebenenfalls mit OH, Halogen, niedrig-Alkyl oder Methoxy substituiert ist, oder einen N-Heteroaryl(niedrigen)alkylrest mit 3 bis 8 Kohlenstoffatomen im Heteroaryl, z.B. Imidazolylmethyl oder Indolylmethyl, bezeichnen, wobei die Gruppe (e) racemisch oder D- bzw. L-konfiguriert sein kann,
(h) eine Gruppe der Formel
Figure imgf000009_0001
darstellt, in welcher m die Zahl 1 oder 2 bezeichnet, und in welcher eine der Methylengruppen gegebenenfalls mit einem Hydroxyl-, Carboxyl-, niederen Alkyl- oder
Aralkyl-rest substituiert ist, wobei die Gruppe (h) racemisch oder D- bzw. L-konfiguriert sein kann,
(i) eine Gruppe der Formel
-
Figure imgf000009_0002
darstellt, in welcher p = r = 1, p = 1 und r = 2 oder p = 2 und r = 1 sind und in welcher eine der Methylengruppen gegebenenfalls mit einem Hydroxyl-, Carboxyl-, niederen Alkyl- oder Aralkyl-rest substituiert ist,
(k) eine Piperidylgruppe darstellt, die gegebenenfalls in einer der Stellungen 2, 3 und 4 mit einem niederen Alkyl- oder Hydroxyl-rest substituiert ist,
wobei an die heterocycloaliphatischen Ringe der Formeln (h), (i), (k) ein weiterer aromatischer oder cycloaliphatischer Ring, vorzugsweise Phenyl oder Cyclohexyl, in 2,3 oder 3,4 Stellung, bezogen auf das Heteroatom, ankondensiert sein kann, (1) eine Piperazylgruppe, die gegebenenfalls in p-Stellung mit einem niederen Alkylrest, einem Arylrest oder einem Alkoxycarbonylrest substituiert ist, (m) eine Gruppe der Formel
Figure imgf000010_0002
darstellt, in welcher n' die Zahlen 1 bis 6 und R10
Wasserstoff oder den Methyl- oder Cyclohexylrest bezeichnen,
(n) eine Gruppe der Formel
Figure imgf000010_0001
darstellt, wobei R9 in den Formeln (g), (h), (i), (1),
(m) und (n) eine Hydroxyl-, geradkettige oder verzweigte niedrige Alkoxy- oder eine Benzyloxy-Gruppe bezeichnet,
oder
(o) eine Kombination von 2 bis 20, vorzugsweise 2 bis 5 , insbesondere 2 oder 3, der von den unter (g), (h),
(i), (k), (l), (m) und (n) definierten Gruppen abgeleiteten, durch Amidbindungen verknüpften Resten (R9 =
Einfachbindung) darstellt, wobei der C-terminale Rest gegebenenfalls mit einem Rest R9 verknüpft ist,
R3 Wasserstoff oder einen geradkettigen oder verzweigten niedrigen Alkyl- oder einen 1- oder 2-Hydroxyethyl-Rest darstellt, wobei n die Zahl 0 oder 1 bezeichnet,
und
R4 einen Arylrest, z.B. Phenyl, Methylphenyl, α- oder ß-Naphthyl oder 5-(Dimethylamino)-naphthyl, oder einen
Heteroarylrest, z.B. Chinolyl, darstellt,
wobei niedrig 1-4 Kohlenstoffatome bedeutet,
und deren Salze mit Mineralsäuren oder organischen Säuren.
Von den in den allgemeinen Ansprüchen definierten
Phenylalanin-Derivaten sind Verbindungen, bei denen
R1 eine basische Gruppe der Formel (a) = Amidino, (b) =
Guanidino, (c) = Oxamidino, (d) = Aminomethyl oder (e) = Amino darstellt,
R 2 O-Alkyl, O-Cycloalkyl oder Aralkyl und n=0 sein kann, einen heterocycloaliphatischen Rest, der in den
Formeln (h), (i), (k) und (1) näher erläutert ist und bei dem R9 in den Formeln (h) und (i) eine Hydroxyl-, geradkettige oder verzweigte niedrige Alkoxy-, Cyclo- alkoxy- oder Aralkoxy-Gruppe sein kann, darstellt, R4 einen Aryl- oder Heteroarylrest, vorzugsweise ß- Naphthyl, bezeichnet und
n die Zahl 0 darstellt,
on besonderer Bedeutung.
Die Verbindungen der allgemeinen Formel I mit R1 = Amidino (a) können nach den nachfolgend beschriebenen, an sich bekannten Methoden hergestellt werden.
3-Cyanbenzyl-acylamino-malonsäurediester der allgemeinen Formel II,
Figure imgf000012_0001
in welcher Alk vorzugsweise - CH3 oder - C2H5 bedeutet, werden in einer Mischung von 3 N HCl und Eisessig durch rückfliessendes Erhitzen zu 3-Cyanphenylalanin III
Figure imgf000012_0002
umgesetzt.
Durch Sulfonylierung der Verbindungen III mit einem Aryl- bzw. Heteroarylsulfonylchlorid oder Acylierung mit einem sulfonylierten Aminosaurehalogenid in Gegenwart einer Base werden die Verbindungen der allgemeinen Formel IV,
Figure imgf000012_0003
in welcher n = 0 oder 1 ist und R 3 und R4 die in der allgemeinen Formel I beschriebenen Bedeutungen besitzen, erhalten.
Die Verbindungen der allgemeinen Formel V,
Figure imgf000012_0004
in welcher R die in der allgemeinen Formel I unter (g),
(h), (i), (k), (l), (m), (n) und (o) sowie R 3 und R 4 die in dieser Formel genannten Bedeutungen besitzen und R 9 eine geradkettige oder verzweigte Alkoxy- bzw. Benzyloxy-Gruppe darstellt, werden gemäss einer ersten Methodenvariante durch Umsetzung der Verbindungen IV mit einem entsprechenden Aminosäureester nach dem Mischanhydridverfahren dargestellt, indem die Verbindungen der Struktur IV mit vorzugsweise Chlorameisensäureisobutylester in Gegenwart einer geeigneten tertiären Base, z.B. 4-Methylmorpholin, bei -15° bis -20°C in einem aprotischen Lösungsmittel zur Reaktion gebracht und anschliessend mit einem Aminosäureester oder Amin umgesetzt werden.
Gemäss einer zweiten Methodenvariante werden die Verbindungen der allgemeinen Formel IV nach dem DCC-Verfahren mit entsprechenden Aminosäureestern umgesetzt, indem die Verbindungen IV in einem geeigneten aprotischen Lösungsmittel mit Dicyclohexylcarbodiimid in Gegenwart von 1-Hydroxybenzotriazol zur Reaktion gebracht und mit den genannten Aminosäureestern oder Aminen zu V umgesetzt werden.
Gemäss einer dritten Methodenvariante werden die Verbindungen der Struktur IV nach Überführung in aktive Ester mit beispielsweise N-Hydroxysuccinimid, 2,3,4,5,6,-Pentafluorphenol oder p-Nitrophenol in Gegenwart von Dicyclohexylcarbodiimid isoliert bzw. ohne zwischenzeitliche Isolierung mit entsprechenden Aminosäureestern oder Aminen zu Verbindungen der allgemeinen Formel V umgesetzt.
Gemäss einer vierten Methodenvariante werden Verbindungen der Struktur IV, bei denen n = 0 ist, mit beispielsweise Thionylchlorid in Säurechloride übergeführt, die anschliessend mit entsprechenden Aminosäureestern oder Aminen zu Verbindungen der allgemeinen Formel V umgesetzt werden.
Durch milde alkalische oder saure Hydrolyse mit beispielsweise verdünnter NaOH oder Trifluoressigsaure von
Verbindungen der Struktur V werden die Verbindungen mit Carbonsäurestruktur der allgemeinen Formel V, wobei R 2, R3 und R4 die in der allgemeinen Formel I genannten Bedeutungen besitzen und das in R 2 definierte R9 = OH ist. Ausgehend von den Verbindungen mit Carbonsäurestruktur V können nach den vorher beschriebenen Verfahren weitere Aminosäuren gekoppelt werden.
Durch Addition von H-S an V mit Carbonsäure- oder CarbonsäureesterStruktur in Pyridin in Gegenwart von Triethylamin werden die Thioamide der allgemeinen Formel VI
Figure imgf000014_0001
erhalten, wobei die Bedeutungen der Substituenten R 2, R3 und R4 denen der allgemeinen Formel I entsprechen.
Durch Umsetzung der Verbindungen VI mit einem Alkylhalogenid, vorzugsweise Methyliodid, werden die Thioimidsäureesterhalogenide VII
Figure imgf000014_0002
erhalten. Die Bedeutungen von n und R 2 bis R4 entspricht denen der allgemeinen Formel I, Alk stellt niedrig Alkyl, vorzugsweise - CH3, dar und X bedeutet Halogen, im allgemeinen lod.
Ausserdem können die Verbindungen V mit einem niederen Alkohol, gegebenenfalls in Anwesenheit eines Lösungsmittels wie beispielsweise Dioxan oder Chloroform, in Gegenwart von wasserfreiem Halogenwasserstoff in Imidsaureesterhalogenide VIII
Figure imgf000015_0001
übergeführt werden, wobei Verbindungen mit freier -COOH-
Gruppe gleichzeitig mit dem verwendeten Alkohol verestert werden. Die Bedeutungen von n und R 2 bis R4 entsprechen denen der allgemeinen Formel I, Alk stellt niedrig Alkyl, vorzugsweise -CH3 oder -C2H5, dar und X bedeutet Halogen, im allgemeinen Chlor.
Zur Darstellung der Zielverbindungen IX,
Figure imgf000015_0002
mit n = 0 oder 1 und den Bedeutungen der Substituenten R1 bis R6 analog denen der allgemeinen Formel I und X = Halogen, werden die Thioimidsäureestersalze VII in alkoholischer Lösung mit Ammoniumacetat bzw. einem Alkylammoniumacetat oder die Imidsäureestersalze VIII in alkoholischer Ammoniaklösung zu IX umgesetzt.
Verbindungen IX mit einem t-Butoxy-Rest ( R9) im Substituenten R2 können anschliessend durch Hydrolyse mit
Trifluoressigsaure in Verbindungen IX mit CarbonsäureStruktur ( R9 = OH) übergeführt werden.
Verbindungen IX mit einer OH-Gruppe (R 2 oder R9) können anschliessend mit vorzugsweise niederen aliphatischen (C1-C8), cycloaliphatischen oder araliphatischen
Alkoholen, in Gegenwart von Chlorwasserstoff oder p-To-luolsulfonsäure in Verbindungen IX mit Carbonsäureesterstruktur (R 2, R9 = O-Alkyl, O-Cycloalkyl, O-Aralkyl) übergeführt werden.
Die Verbindungen der allgemeinen Formel I mit R4 Oxamidino (c) werden auf dem gleichen Syntheseweg wie die Verbindungen mit R1 = Amidino (a), über die Zwischenprodukte der Formeln II bis VII, dargestellt. Im letzten Syntheseschritt werden die Thioimidsäureestersalze VII mit
Hydroxylammoniumacetat zu Verbindungen der allgemeinen
Formel I umgesetzt, wobei R1 die Oxamidino-Gruppe (c) darstellt.
Die Verbindungen der allgemeinen Formel I mit R1 =
Aminomethyl (d) werden ebenfalls auf diese Weise über die
Zwischenprodukte der Formeln II bis V dargestellt. Um zu den Zielverbindungen der allgemeinen Formel I mit R1 =
CH2 - NH2 zu gelangen, werden die Cyanverbindungen V katalytisch, beispielsweise mit Raney-Nickel/Wasserstoff in alkoholischer Lösung in Gegenwart von Ammoniak, zu den
Aminomethylverbindungen reduziert. Die erhaltenen freien
Basen werden in geeigneter Weise in Salze, vorzugsweise
Hydrochloride, übergeführt.
Die Verbindungen der allgemeinen Formel I mit R1 Guanidino (b) können prinzipiell nach dem gleichen Syntheseschema wie die mit Amidinostruktur (a) dargestellt werden.
Dazu werden 3-Nitrobenzyl-acylamino-malonsäurediester der allgemeinen Formel X,
in welcher Alk vorzugsweise - CH3 oder - C2H5 bedeutet, durch rückfliessendes Erhitzen in einer Mischung von 3 N HCl und Eisessig zu 3-Nitrophenylalanin XI
Figure imgf000016_0002
umgesetzt.
Die Verbindungen XII und XIII
Figure imgf000017_0001
werden auf die gleiche Weise erhalten wie die entsprechenden Cyanverbindungen IV und V, wobei auch die Bedeutungen von n, R 2 , R3 und R4 entsprechend sind.
Durch katalytische Hydrierung mittels beispielsweise
Raney-Nickel/Wasserstoff in einem geeigneten Lösungsmittel werden aus XIII die Aminoverbindungen der allgemeinen
Formel XIV
Figure imgf000017_0002
erhalten, die mittels eines geeigneten Guanylierungsreagenses, beispielsweise 1-Amidino-3,5-dimethyl-pyrazol-nitrat, zu den Guanidinoverbindungen der allgemeinen Formel I mit R1 = Guanidino (b) umgesetzt werden.
Verbindungen mit der allgemeinen Formel I mit R1 =
Guanidino (b), Oxamidino (c), Aminomethyl (d) bzw. Amino
(e) und einem t-Butoxy-Rest (R 9) im Substituenten R2 können durch Hydrolyse mit Trifluoressigsaure in Verbindungen mit
Carbonsäurestruktur ( R9 = OH) übergeführt werden, die anschliessend durch Veresterung mit niederen Alkoholen, vorzugsweise Methanol, in Gegenwart von Chlorwasserstoff oder p-Toluolsulfonsäure zu Verbindungen mit Carbonsäureesterstruktur ( R9 = Alkoxy) umgesetzt werden können. Die biologische Aktivität der erfindungsgemässen Verbindungen wurde sowohl in vitro als auch in vivo bestimmt. Zur Charakterisierung der Inhibitoraktivität in vitro wurden die Dissoziationskonstanten Ki für die Hemmung von Trypsin bzw. der verwandten Enzyme Thrombin, Plasmin,
Faktor Xa, tPA, glanduläres Kallikrein, Faktor XIIa und
Plasmakallikrein nach der Formel
[E].• [I]
Ki. =
[EI] in welcher [E] die Konzentration an freiem Enzym, [I] die Konzentration an freiem Inhibitor und [EI] die Konzentration an Enzym-Inhibitor-Komplex bezeichnen, gemessen (Dixon, Biochem. J. 55, 170-173, 1953). Je kleiner der Ki-Wert für ein geprüftes Enzym ist, desto grösser ist die Affinität des Inhibitors für das Enzym und desto kleiner ist die zur Hemmung des Enzyms, z.B. Thrombin, benötigte Menge Inhibitor.
In vitro wurden verschiedene Gerinnungstests benutzt, um die Wirksamkeit der Hemmstoffe gegenüber der durch Thrombin ausgelösten Gerinnung seines natürlichen Substrates Fibrinogen zu bestimmen. Dazu wurde in Human-Plasma die Thrombinzeit (TT), die aktivierte partielle Thromboplastinzeit (aPTT) und die Prothrombinzeit (PT, Quickwert) bestimmt.
Die Toxizität der erfindungsgemässen Verbindungen wurde durch Bestimmung der LD50 (= Dosis, die bei 50% der Versuchstiere während einer Beobachtungsdauer von einer Woche zum Tode führt) an der Maus nach intravenöser bzw. peroraler Verabreichung ermittelt.
Zur pharmakokinetischen Charakterisierung wurde die Plasmakonzentration ausgewählter Derivate nach intravenöser (i.v.), subkutaner (s.c.) und peroraler (p.o.) Applikation an Ratten nach folgendem dreistufigem Verfahren bestimmt:
1. Eine Lösung der zu prüfenden Substanz in physiolo gischer Kochsalzlösung wurde der Flüssigkeits-Hochdruckchromatographie (HPLC = high pressure liquid chromatography) unterworfen, um den für die zu prüfende Substanz charakteristischen Peak bei der unter den gewählten Versuchsbedingungen substanzspezifischen Retentionszeit zu ermitteln.
2. Die zu prüfende Substanz wurde in vitro in Rattenplasma gelöst. Diese Lösung wurde ebenfalls der HPLC unterworfen, um festzustellen, ob der für die Substanz charakteristische Peak bei der substanzspezifischen Retentionszeit erneut erscheinen würde.
3. Die zu prüfende Substanz wurde in physiologischer Kochsalzlösung gelöst und in einer Dosis von 1, 5 bzw. 100 mg pro kg Körpergewicht i.v., s.c. bzw. p.o. an Ratten verabreicht. In Zeitintervallen von 15 Minuten wurden Blutproben entnommen, aus denen durch Zentrifugation Plasmaproben hergestellt wurden, welche ihrerseits der HPLC unterworfen wurden, um festzustellen, ob der für die Substanz charakteristische Peak bei der substanzspezifischen Retentionszeit wiederum in Erscheinung treten würde.
Zum Nachweis der pharmakologischen Wirksamkeit wurde die zu prüfende Substanz in physiologischer Kochsalzlösung gelöst und in einer Dosis von 1, 5 bzw. 100 mg pro kg Körpergewicht i.v., s.c. bzw. p.o. an Ratten verabreicht. In Zeitintervallen von 15 Minuten wurden Blutproben entnommen, aus denen durch Zentrifugation Plasmaproben hergestellt und im Gerinnungstest (Thrombin-induzierte PlasmaGerinnung) geprüft wurden.
Als Beispiele der allgemeinen Formel I mit metaständiger basischer Gruppierung sind zu nennen: Verbindungen mit R1 = Amidino (a):
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-amidino-(D,L)-phenylalanin-n-hexyl-, -cyclohexyl- und -n-octyl-ester
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-amidino-(D,L)-phenylalanin-4-hydroxypiperidid
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-amidino-(D)-phenylalanyl-(D)-prolin und -methylester
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-amidino-(L)-phenylalanyl-(L)-prolin und -methylester
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-amidino-(D)-phenylalanyl- (L)-prolin und -methylester
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-amidino-(D,L)-phenylalanyl- (D,L)-prolin und -methylester
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-amidino-(D,L)-phenylalanyl- (L)-4-hydroxyρrolin und -methylester
N-α-(2-Naρhthylsulfonyl)-3-amidino-(D,L)-phenylalanyl- (D,L)-prolyl-4-aminobuttersäure und -methylester
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-amidino-(L)-phenylalanyl- (L)-pipecolinsäuremethylester
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-amidino-(L)-phenylalanyl- (D)-pipecolinsäuremethylester N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-amidino-(D,L)-phenylalanyl- (D,L)-pipecolinsäureethyl-, -n-butyl-, -n-hexyl- und -cyclohexyl-ester
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-amidino-(D,L)-phenylalanyl- (D,L)-pipecolyl-4-aminobuttersäure
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-amidino-(D,L)-phenylalanyl- (D,L)-pipecolyl-6-aminocapronsäure
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-amidino-(D,L)-phenylalanyl- (D,L)-pipecolyl-glycyl-glycin
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-amidino-(D,L)-phenylalanyl- (D,L)-pipecolyl-glycyl- (D, L) -pipecolinsäure
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-amidino-(D,L)-phenylalanyl- (D,L)-pipecolyl-glycyl-glycyl-(D,L)-pipecolinsäure
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-amidino-(D,L)-phenylalanyl- (D,L)-pipecolyl-6-aminocaproyl-(D,L)-pipecolinsäure
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-amidino-(D,L)-phenylalanyl-nipecotinsäureethyl-, -n-butyl-, -n-hexyl- und -cyclohexyl-ester
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-amidino-(D,L)-phenylalanyl-isonipecotinsäureethyl-, -n-butyl-, -n-hexyl- und -cyclohexyl-ester
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-amidino-(D,L)-phenylalanyl-4-aminobuttersäure und -methylester
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-amidino-(D,L)-phenylalanyl-6-aminocapronsäure und -methylester N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-amidino-(D,L)-phenylalanyl-cyclohexyl-ß-alanin und -methylester
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-amidino-(D,L)-phenylalanyl-4-aminomethyl-cyclohexancarbonsäure und -methylester
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-amidino-(D,L)-phenylalanyl-3-carboxy-(D,L)-phenylalanin
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-amidino-(D,L)-phenylalanyl-3-methoxycarbonyl-(D,L)-phenylalaninmethylester
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-amidino-(D,L)-phenylalanyl-(D,L)-homophenylalanin und -methylester
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-amidino-(D,L)-phenylalanyl-4-aminobutyryl-glycin und -methylester
Verbindungen mit R1 = Guanidino (b)
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-guanidino-(D,L)-phenylalanin-methyl-, -n-butyl-, -n-hexyl- und -cyclohexyl-ester
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-guanidino-(D,L)-phenylalanin-4-methylpiperidid
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-guanidino-(D,L)-phenylalanin-N-methylpiperazid
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-guanidino-(D,L)-phenylalanin-N-phenylpiperazid
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-guanidino-(D,L)-phenylalanin-N-ethoxycarbonylpiperazid N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-guanidino-(D,L)-phenylalanyl- (D,L)-prolin und -methylester
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-guanidino-(D,L)-phenylalanyl- (D,L)-pipecolinsäure, - methyl- und -n-butyl-ester
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-guanidino-(D,L)-phenylalanyl- isonipecotinsäure, - methyl- und -n-butyl-ester
N-α- (2-Naphthylsulfonyl)-3-guanidino- (D,L)-phenylalanyl- 4-methyl-(D,L)-pipecolinsäure, - methyl- und -n-butyl-ester
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-guanidino-(D,L)-phenylalanyl- 2-methyl-nipecotinsäure, - methyl- und -n-butyl-ester
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-guanidino-(D,L)-phenylalanyl- 1,2,3,4-tetrahydroisochinolin-3-carbonsäure und -methylester
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-guanidino-(D,L)-phenylalanyl-decahydrochinolin-4-carbonsäure und -methylester
Verbindungen mit R1 = Oxamidino (c)
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-oxamidino-(D,L)-phenylalanin-methyl-, -n-butyl-, -n-hexyl- und -cyclohexyl-ester
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-oxamidino-(D,L)-phenylalanin-N-methylpiperazid
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-oxamidino-(D,L)-phenylalanin-N-phenylpiperazid
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-oxamidino-(D,L)-phenylalanin-N-ethoxycarbonylpiperazid N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-oxamidino-(D,L)-phenylalanyl-(D,L)-prolin und -methylester
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-oxamidino-(D,L)-phenylalanyl-(D,L)-pipecolinsäuremethyl- und -n-butyl-ester
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-oxamidino-(D,L)-phenylalanyl-isonipecotinsäuremethyl- und -n-butyl-ester
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-oxamidino-(D,L)-phenylalanyl-4-methyl-(D,L)-pipecolinsäure, - methyl- und -n-butyl-ester
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-oxamidino-(D,L)-phenylalanyl-2-methyl-nipecotinsäure, - methyl- und -n-butyl-ester
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-oxamidino-(D,L)-phenylalanyl-1,2,3,4-tetrahydroisochinolin-3-carbonsäuremethylester
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-oxamidino-(D,L)-phenylalanyl-decahydrochinolin-4-carbonsäure und -methylester
Verbindungen mit R1 = Aminomethyl (d)
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-aminomethyl-(D,L)-phenylalanin-methyl-, -n-butyl-, -n-hexyl- und -cyclohexyl-ester
N-α- (2-Naphthylsulfonyl)-3-aminomethyl-(D,L)-phenylalanin- N-methylpiperazid
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-aminomethyl-(D,L)-phenylalanin-N-phenylpiperazid
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-aminomethyl-(D,L)-phenylalanin-N-ethoxycarbonylpiperazid N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-aminomethyl-(D,L)-phenylalanyl- (D,L)-prolin und -methylester
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-aminomethyl-(D,L)-phenylalanyl- (D,L)-pipecolinsäure-n-butyl-ester
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-aminomethyl-(D,L)-phenylalanyl- isonipecotinsäure-n-butyl-ester
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-aminomethyl-(D,L)-phenylalanyl- 4-methyl-(D,L)-pipecolinsäure, - methyl- und -n-butyl-ester
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-aminomethyl-(D,L)-phenylalanyl- 2-methyl-nipecotinsäure, - methyl- und -n-butyl-ester
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-aminomethyl-(D,L)-phenylalanyl- 1,2,3,4-tetrahydroisochinolin-3-carbonsäure und -methylester
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-aminomethyl-(D,L)-phenylalanyl-decahydrochinolin-4-carbonsäure und -methylester
Verbindungen mit R1 = Amino (e)
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-amino-(D,L)-phenylalanin-methyl-, -n-butyl-, -n-hexyl- und -cyclohexyl-ester
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-amino-(D,L)-phenylalanin-N-methylpiperazid
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-amino-(D,L)-phenylalanin-N-phenylpiperazid
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-amino-(D,L)-phenylalanin-N-ethoxycarbonylpiperazid N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-amino-(D,L)-phenylalanyl-(D,L)-prolin und -methylester
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-amino-(D,L)-phenylalanyl-(D,L)-pipecolinsäuremethyl- und -n-butyl-ester
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-amino-(D,L)-phenylalanyl-isonipecotinsäuremethyl- und -n-butyl-ester
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-amino-(D,L)-phenylalanyl-4-methyl-(D,L)-pipecolinsäure, - methyl- und -n-butyl-ester
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-amino-(D,L)-phenylalanyl-2-methyl-nipecotinsäure, - methyl- und -n-butyl-ester
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-amino-(D,L)-phenylalanyl-1,2,3,4-tetrahydroisochinolin-3-carbonsäuremethylester
N-α- (2-Naphthylsulfonyl)-3-amino-(D,L)-phenylalanyl-decahydrochinolin-4-carbonsäure und -methylester
Die als Racemate angegebenen Verbindungen können gegebenenfalls nach entsprechender Trennung als reine Enantiomere bzw. Diastereomere vorliegen.
In den folgenden Beispielen wird die Erfindung näher erläutert. Zum besseren Verständnis der Beispiele wird auf die nachstehende Legende verwiesen.
LEGENDE ZU TABELLEN 1 - 18 UND ZUSAMMENSTELLUNG
NR - Nummer der Verbindung
AV - Ausgangsverbindung
R 1, R2, R4, - Substituenten in Formel I
n - n in Formel I
AB(%) - Ausbeute in %
Smp. (°C) - Schmelzpunkt in °C
Z. - Zersetzung
Rg - Reinigungsoperation, entweder durch
Umkristallisation (UK)
oder Säulenchromatographie (SC)
HX - Salzform, entweder Hydrochlorid (HCl) oder
Hydroiodid (HI)
V - Verfahren, entweder A oder B
DC - Dünnschichtchromatographie
LS - Lösungsmittelsystem (siehe unten)
Rf - Retentionsfaktor, bei Angabe von 2
Rf-Werten, Doppelfleckbildung durch
Isomerie
Zur Durchführung der dunnschichtchromatographischen Untersuchungen wurden MERCK-Dünnschicht-Fertigplatten mit Kieselgel 60, F 254, als Beschichtung und die folgenden Lösungsmittelsysteme (LS) verwendet:
LS 1: organische Phase von Ethylacetat/Essigsäure/Wasser
(4/1/2)
LS 2: Chloroform/Methanol (19/1)
LS 3: Chloroform/Methanol/Essigsäure (40/4/1)
LS 4: Toluol/Aceton/Methanol (7/2/1)
Sprühreagenzien: Ninhydrin - für primäre und sekundäre
aliphatische Aminogruppen 4-Dimethylaminobenzaldehyd - für primäre aromatische Aminogruppen
Sakaguchi - für Guanidinogruppen Zur Durchführung der Säulenchromatographie zwecks Reinigung der Rohprodukte wurde Kieselgel 60 mit einer Korngrösse von 0,035 - 0,070 mm verwendet.
ABKÜRZUNGEN in Beispielen 1 - 18
TEA - Triethylamin
HOBT - 1-Hydroxybenzotriazol
DCC - Dicyclohexylcarbodiimid
IBCF - Isobutylchloroformat
NMM - 4-Methylmorpholin
DMF - Dimethylformamid
THF - Tetrahydrofuran
TFA - Trifluoressigsaure
Pd/C - Palladium auf Aktivkohle
de - dünnschichtchromatographisch
Beispiel 1
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-amidino-(D,L)-phenylalanin und -ester (6-11, Tabelle 1)
(3-Cyanbenzyl)-acetamino-malonsäure-diethylester (1)
10,0 g 3-Cyanbenzylbromid und 11,0 g Acetamino-malonsäurediethylester wurden in 100 ml abs. Dioxan gelöst. Zu dieser Lösung wurde unter Rühren eine Lösung von 1,15 g Natrium in 50 ml abs. Ethanol gegeben. Der Ansatz wurde 5 Stunden auf dem siedenden Wasserbad erhitzt. Anschliessend wurde das Lösungsmittel im Vakuum weitestgehend abdestilliert, worauf der Rückstand in Chloroform aufgenommen und die Lösung mit verdünnter NaOH, HCl und anschliessend mit Wasser gewaschen wurde. Die organische Phase wurde über MgSO4 getrocknet. Das Lösungsmittel wurde abdestilliert und der Rückstand aus Methanol/Wasser umkristallisiert. Ausbeute: 80%, Smp. 143-145°C.
3-Cyan-(D,L) -phenylalanin (2)
12,0 g der Verbindung 1 wurden in einer Mischung aus 32 ml Eisessig und 64 ml 3 N HCl 6 Stunden unter Rückfluss erhitzt. Anschliessend wurde das Lösungsmittel im Vakuum abdestilliert und der Rückstand getrocknet. Das erhaltene Produkt wurde in 80 ml 20%igem Methanol gelöst. Das pH der Lösung wurde durch Zugabe von 1 N NaOH auf 6,8 bis 7,0 eingestellt, wobei Verbindung 1 auskristallisierte. Ausbeute: 55%, Smp. 220-235°C.
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-cyan-(D,L)-phenylalanin ( 3 )
19,0 g der Verbindung 2 wurden in 230 ml 1 N KOH gelöst. Eine Lösung von 25,0 g 2-Naphthylsulfonylchlorid in 200 ml Ether wurde zugegeben und die Mischung 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, wobei nach etwa 1 ½ Stunden das Kaliumsalz des gewünschten Produktes auszukristallisieren begann. Anschliessend wurde der Niederschlag abgesaugt, mit Ether gewaschen, unter Erwärmen in Wasser gelöst und mit 3 N HCl angesäuert, wobei die Verbindung 3 auskristallisierte. Es wurde abgesaugt und aus Essigsäure/Wasser umkristallisiert. Ausbeute: 58%, Smp. 101-103°C.
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-thiocarboxamido-(D,L)-phenylalanin (4)
1,5 g der Verbindung 3 wurden in 20 ml Pyridin und 1,5 ml TEA gelöst, in die Lösung 10 Minuten H2S eingeleitet und der Ansatz 20 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Anschliessend wurde das Lösungsmittel abdestilliert, der Rückstand in Ethylacetat aufgenommen und mit 1 N HCl ausgeschüttelt. Die organische Phase wurde 1X mit Wasser gewaschen, über MgSO4 getrocknet und das Lösungsmittel abdestilliert. Gelbes, amorphes Produkt. Ausbeute: 92%.
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-S-methyliminothiocarbonyl- (D,L)-phenylalanin-hydroiodid (5)
1,5 g der Verbindung 4 wurden in 25 ml Aceton gelöst, die Lösung mit 2,5 g Methyliodid versetzt und der Ansatz 15 Minuten im Wasserbad unter Rückfluss erhitzt. Nach dem Erkalten wurde Verbindung 5 durch Zusatz von Ether ausgefällt. Gelbliches, amorphes Pulver. Ausbeute: 93%.
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-amidino-(D,L)-phenylalanin (6)
1,86 g der Verbindung 5 wurden in 25 ml Methanol gelöst, die Lösung mit 0,4 g Ammoniumacetat versetzt und der Ansatz 3 Stunden bei 60°C im Wasserbad erwärmt, wobei die Verbindung 6 (Betain) bereits auszukristallisieren begann. Nach 24-stündigem Stehen wurde abgesaugt, mit Methanol gewaschen und getrocknet. Ausbeute: 71%, Smp. 274-275°C. Zur Überführung in das Hydrochlorid wurden 0,5 g Betain in 5 ml Methanol suspendiert, die Suspension tropfenweise mit 2 N Ethylacetat/HCl bis zur klaren Losung versetzt und das gebildete Hydrochlorid mit Ether ausgefällt. Ausbeute: 92%, amorphes Produkt.
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-amidino-(D,L)-phenylalaninester- hydrochloride (7-11, Tabelle 1)
Jeweils 0,5 g des Betains 6 wurden in 5 ml des entsprechenden Alkohols suspendiert, die Suspensionen mit 0,36 g p-Toluolsulfonsäure versetzt und die erhaltenen Lösungen bis zur vollständigen Veresterung (de Kontrolle) im siedenden Wasserbad erhitzt. Nach dem Erkalten wurden die Tosylate der gebildeten Ester durch Zugabe von Ether vollständig ausgefällt.
Zur Überführung in die Hydrochloride wurden die öligen Tosylate in Wasser gelöst, mit 0,5 N NaOH alkalisiert und die freigesetzten Basen mit Ethylacetat extrahiert. Nach Trocknen der Ethylacetatlösungen über Na2SO4 wurde das Lösungsmittel bis zu einem Rest von etwa 5 ml abdestilliert, mit 2 N Ethylacetat/HCl angesäuert und die Verbindungen 7-11 durch Zugabe von Ether ausgefällt.
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Beispiel 2
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-amidino-(D,L)-phenylalanin- piperidid- bzw. piperazidsalze (32-38, Tabelle 5)
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-cyan-(D,L)-phenylalanin-piperidide bzw. -piperazide (12-18, Tabelle 2)
Jeweils 5,5 mmol 2-, 3- und 4-Methylpiperidin sowie N-Methyl-, N-Phenyl-, N-Ethoxycarbonyl- und N-t-Butoxycarbonylpiperazin (AV, Tabelle 2) wurden in 5 ml abs. Dioxan gelöst. Nach Zugabe von 5 mmol NMM wurde eine Lösung des aus Verbindung 3 und Thionylchlorid erhaltenen Säurechlorids in 10 ml abs. Dioxan zugetropft und der Ansatz 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, wobei die Verbindungen 14 und 15 bereits zum Teil auskristallisierten. Anschliessend wurde das Lösungsmittel abdestilliert und nach Zugabe von 25 ml Methanol zur Kristallisation stehengelassen. Die erhaltenen Produkte wurden abgesaugt und zur Reinigung umkristallisiert.
Thioamide (19-24, Tabelle 3)
1,0 g der Verbindungen 12-14 und 16-18 wurden in je 20 ml Pyridin und 1 , 5 ml TEA gelöst, in die Lösungen 10 Minuten H2S eingeleitet und die Ansätze 20 Stunden bei Raumtemperatur aufbewahrt. Nach Abdestillieren des Lösungsmittels wurde der Rückstand in Ethylaeetat aufgenommen, mit 1 N HCl ausgeschüttelt, die organische Phase 1X mit Wasser gewaschen und das Lösungsmittel abdestilliert. Die Verbindungen 21 und 22 kristallisierten beim Anreiben mit Methanol.
Thioimid- bzw. Imidsäureestersalze (25-31, Tabelle 4) Thioimidsäuremethylester-hydroiodide ( 25-27 , 30 , 31 ,
Tabelle 4 )
0,7 g der Verbindungen 19-21 sowie 23 und 24 wurden in jeweils 20 ml Aceton und 5 ml Methanol gelöst, die Lösungen mit der 5-molaren Menge Methyliodid versetzt und die Ansätze 15 Minuten im Wasserbad unter Rückfluss erhitzt. Anschliessend wurde das Lösungsmittel abdestilliert und mit Ethanol angerieben, wobei die Verbindungen 25-27 und 30 kristallisierten. Verbindung 31 konnte nach Auflösen des Rückstandes in wenig abs. Ethanol mit Ether ausgefällt werden.
Imidsäuremethylesterhydrochloride (28, 29, Tabelle 4)
Jeweils 1,0 g der Verbindungen 15 und 16 wurden in einer Mischung aus 10 ml abs. Dioxan und 10 ml abs. Methanol suspendiert, in die Suspensionen 4 g getrocknetes HCl-Gas eingeleitet und die erhaltenen Lösungen 5 Tage im Kühlschrank aufbewahrt, wobei die Verbindungen 28 und 29 auskristallisierten. Die ausgefallenen Produkte wurden abgesaugt, mit Ether gewaschen und im Vakuum-Exsikkator (KOH/H2SO4) getrocknet.
N-α- (2-Naphthylsulfonyl)-3-amidino-(D,L)-phenylalanin- piperidid- bzw. -piperazid-salze (32-38, Tabelle 5)
Verbindungen 32-34, 37, 38
0,6 g der Thioimidsäuremethylester-hydroiodide 25-27 sowie 30 und 31 wurden in 15 ml Methanol gelöst bzw. suspendiert, die Ansätze mit der 1,5-molaren Menge Ammoniumacetat versetzt und 3 Stunden bei 60°C im Wasserbad erwärmt. Anschliessend wurde die Hälfte des Lösungsmittels abdestilliert und die Amidinhydroiodide 32-34, 37 und 38 durch Zugabe von Ether ausgefällt. Verbindungen 35 und 36
0,5 g der Imidsäuremethylester-hydrochloride 28 und 29 wurden in je 10 ml abs. Ethanol suspendiert, die Suspensionen mit ethanolischer NH3-Lösung versetzt, bis der Geruch nach NH3 deutlich wahrnehmbar blieb und die Ansätze 3 Stunden im Wasserbad bei 60°C erwärmt, wobei schon nach kurzer Zeit klare Lösungen erhalten wurden. Anschliessend wurde filtriert und die Verbindungen 35 und 36 durch Zusatz von Ether ausgefällt.
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Beispiel 3
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-amidino-(D,L)-phenylalanyl-(D,L)-piperidin-carbonsäuren (83-93, Tabelle 10)
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-cyan-(D,L)-phenylalanyl-(D,L)-piperidincarbonsäureester (39-49, Tabelle 6)
Die Darstellung der Verbindungen erfolgte nach Verfahren A und B.
Verfahren A: 10 mmol des entsprechenden Piperidincarbonsäureesters (AV, Tabelle 6) wurden in 10 ml DMF gelöst, mit 11 mmol HOBT versetzt und auf 0° abgekühlt. Eine Lösung von 9 mmol der Verbindung 3 in 20 ml THF und 11 mmol DCC wurden zugegeben und über Nacht gerührt. Man filtrierte das gebildete Harnstoffderivat ab und destillierte das Lösungsmittel ab. Der Rückstand wurde in Ethylaeetat gelöst, die Lösung mit Wasser, 10%iger Zitronensäure, gesättigter NaHCO3-Lösung und gesättigter NaCl-Lösung gewaschen und anschliessend über MgSO4 getrocknet. Nach Abdestillieren des Lösungsmittels wurden die Rohprodukte durch Umkristallisation bzw. Säulenchromatographie gereinigt.
Verfahren B: 5,5 mmol des entsprechenden Piperidincarbonsäureesters (AV, Tabelle 6) und 5 mmol NMM wurden in 10 ml Ethylaeetat gelöst, eine Lösung von 5 mmol des aus Verbindung 3 und Thionylchlorid erhaltenen Säurechlorids in 20 ml Ethylaeetat zugetropft und der Ansatz 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschliessend wurde das Lösungsmittel abdestilliert, der Rückstand in Ethylaeetat aufgenommen, mit 1 N HCl, 10%iger Na2CO3-Lösung und Wasser ausgeschüttelt, die organische Phase über MgSO4 getrocknet und das Lösungsmittel abdestilliert. Nach Zugabe von 20 ml Methanol wurde zur Kristallisation stehengelassen. Die Reinigung erfolgte durch Umkristallisation aus Methanol/Wasser bzw. säulenchromatographisch. N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-cyan-(D,L)-phenylalanyl-(D,L)- piperidincarbonsäuren (50-60, Tabelle 7)
2 mmol der Verbindungen 39-49 wurden in 20 ml Methanol gelöst bzw. suspendiert, 10 ml 1 N NaOH zugefügt und die erhaltenen Lösungen bei Raumtemperatur gerührt bis vollständige Verseifung erfolgt war (de Kontrolle). Danach wurden 100 ml Wasser zugesetzt, mit 1 N HCl angesäuert, die ausgefallenen Produkte isoliert und gegebenenfalls durch Umkristallisation oder säulenchromatographisch gereinigt.
Thioamide (61-71, Tabelle 8)
Je 1,0 g der Verbindungen 50-60 wurden in 20 ml Pyridin und 1,5 ml TEA gelöst, in die Lösungen 10 Minuten H2S eingeleitet und die Ansätze 20 Stunden bei Raumtemperatur aufbewahrt. Anschliessend wurde das Lösungsmittel abdestilliert, die Rückstände in Ethylaeetat aufgenommen und mit 1 N HCl ausgeschüttelt. Die organische Phase wurde 1X mit Wasser gewaschen, über MgSO. getrocknet und das Lösungsmittel abdestilliert. Die Verbindungen 61-71 wurden in der erhaltenen Form weiterverarbeitet.
Thioimidsäureesterhydroiodide (72-82, Tabelle 9)
Je 1,0 g der Thioamide 61-71 wurden in 25 ml Aceton gelöst, die Lösungen mit der 15-molaren Menge Methyliodid versetzt und die Ansätze 20 Stunden bei Raumtemperatur unter Lichtschutz aufbewahrt. Anschliessend wurden die Verbindungen 72-82 mit Ether ausgefällt und in der erhaltenen Form umgesetzt. N-α- ( 2-Naphthylsulfonyl ) -3-amidino- (D ,L ) -phenylalanyl-( D , L ) -piperidincarbonsäure-hydrochloride ( 83-93 , Tabelle
10)
0,5 g der Thioimidsaureesterhydroiodide 72-82 wurden in jeweils 10 ml Methanol gelöst, die Lösungen mit der 1,5-molaren Menge Ammoniumacetat versetzt und die Ansätze 3 Stunden bei 60°C im Wasserbad erwärmt. Anschliessend wurde noch 24 Stunden im Kühlschrank aufbewahrt, die auskristallisierten Betaine 83-93 abgesaugt, mit Methanol und Ether gewaschen und getrocknet.
Zur Überführung in die entsprechenden Hydrochloride wurden jeweils 0,2 g Betain in 3 ml Methanol suspendiert, die Suspension tropfenweise mit 2 N Ethylacetat/HCl bis zur klaren Lösung versetzt und die gebildete Salze mit Ether vollständig ausgefällt.
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Beispiel 4
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-amidino-(D,L)-phenylalanyl-(D,L)-piperidincarbonsäuremethylester-hydrochloride (94-101, Tabelle 11)
0,2 g der Betaine 83-87, 89, 90 und 92 wurden in jeweils 5 ml abs. Methanol suspendiert, die Suspension mit 1-2 ml 2 M Ethylacetat/HCl versetzt und die dabei erhaltenen Lösungen bis zur vollständigen Veresterung (de Kontrolle) bei Raumtemperatur stehengelassen. Anschliessend wurden die Hydrochloride 94-101 (Tabelle 11) durch Zugabe von Ether ausgefällt.
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Beispiel 5
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-amidino-(D,L)-phenylalanyl- isonipecotyl-4-aminobuttersäure und - 6-aminocapronsäure (110, 111, Tabelle 12)
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-cyan-(D,L)-phenylalanyl-iso- nipecotyl-4-aminobuttersäureethylester und - 6-aminocapronsäuremethylester (102, 103, Tabelle 12)
Je 9 mmol der Verbindung 52 (Beispiel 3) und 10 mmol 4-Aminobuttersäureethylester sowie 6-Aminocapronsäuremethylester wurden analog Verfahren A (Beispiel 3) umgesetzt und aufgearbeitet. Die Reinigung erfolgte saulenchromatographisch über Kieselgel 60 mit Chloroform (für 102) und Chloroform/Methanol 98:2 (für 103) als Eluierungsmittel.
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-cyan-(D,L)-phenylalanyl-iso-nipecotyl-4-aminobuttersäure und - 6-aminocapronsäure (104, 105, Tabelle 12)
2 mmol der Verbindungen 102 und 103 wurden nach der in Beispiel 3 (50-60) angegebenen Vorschrift verseift. Verbindung 104 wurde aus Ethylaeetat umkristallisiert. Die Reinigung von 105 erfolgte saulenchromatographisch über Kieselgel 60 mit Chloroform/Methanol 95:5 als Eluierungsmittel.
Thioamide (106. 107, Tabelle 12)
Jeweils 1,0 g der Verbindungen 104 und 105 wurden analog Beispiel 3 (61-71) umgesetzt und aufgearbeitet. Thioimidsäuremethylester-hydroiodide (108, 109; Tabelle 12)
0,7 g der Verbindungen 106 und 107 wurden in jeweils 20 ml Aceton gelöst, die Lösungen mit der 5-molaren Menge Methyliodid versetzt und die Ansätze 15 Minuten im Wasserbad unter Rückfluss erhitzt. Anschliessend wurde das Lösungsmittel abdestilliert, die Rückstände mit 2 ml abs. Ethanol versetzt und zur Kristallisation stehengelassen. Die kristallinen Produkte 108 und 109 wurden abgesaugt, mit Ether gewaschen und getrocknet.
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-amidino-(D,L)-phenylalanyl-isonipecotyl-4-aminobuttersäure und - 6-aminocapronsäure-hydroiodid (110, 111; Tabelle 12)
0,5 g der Thioimidsäuremethylester-hydroiodide 108 und 109 wurden in je 10ml Methanol gelöst, die Lösungen mit der 1,5-molaren Menge Ammoniumacetat versetzt und die Ansätze 3 Stunden bei 60°C im Wasserbad erwärmt. Nach dem Erkalten wurden die Verbindungen 110 und 111 durch Zugabe von Ether ausgefällt. Zur Reinigung wurde aus Ethanol/Ether umgefällt.
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Beispiel 6
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-amidino-(D,L)-phenylalanyl-(D,L)-pipecolyl-glycin und -methylester (116, 117)
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-cyan-(D,L)-phenylalanyl-(D,L)-pipecolyl-glycin-t-butylester (112)
9 mmol der Verbindung 50 und 10 mmol Glycin-t-butylester wurden analog Verfahren A (Beispiel 3) umgesetzt und aufgearbeitet. Die Reinigung von 112 erfolgte saulenchromatographisch über Kieselgel 60 mit Chloroform
als Eluierungsmittel. Ausbeute: 70%, Smp. 121-125°C.
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-thiocarboxamido-(D,L)-phenyl¬alanyl-(D,L)-pipecolyl-glycin-t-butylester (113)
1,3 g der Verbindung 112 wurden analog Beispiel 3 (61-71) umgesetzt. Amorphes Produkt. Ausbeute: 95%.
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-S-methyliminothiocarbonyl- (D,L)-phenylalanyl-(D,L)-pipecolyl-glycin-t-butylester-hydroiodid (114)
1,3 g der Verbindung 113 wurden in 35 ml Aceton gelöst, die Lösung mit 4,3 g Methyliodid versetzt und der Ansatz 20 Stunden bei Raumtemperatur unter Lichtschutz aufbewahrt. Verbindung 104 wurde anschliessend durch Zugabe von Ether ausgefällt. Amorphes Produkt. Ausbeute: 76%.
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-amidino-(D,L)-phenylalanyl- (D,L)-pipecolyl-glycin-t-butylester-hydroiodid (115)
1,2 g der Verbindung 114 wurden analog Beispiel 2 (32-34) umgesetzt und aufgearbeitet. Ausbeute: 96%, Smp. ab 90°C. N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-amidino-(D,L)-phenylalanyl- (D,L)-pipecolyl-glycin-hydrochlorid (116)
0,95 g der Verbindung 115 wurden in die freie Base übergeführt, indem die Substanz in 250 ml Ethylaeetat suspendiert und mit 30 ml 0 , 2 N NaOH ausgeschüttelt wurde . Die organische Phase wurde mit Wasser gewaschen, über MgSO4 getrocknet und das Lösungsmittel abdestilliert. Der Rückstand (0,77 g) wurde in 6 ml TFA gelöst, die Lösung 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und danach das Lösungsmittel abdestilliert. Der Rückstand wurde in 8 ml Methanol gelöst, die Lösung mit 2 ml 2 N Ethylacetat/HCl versetzt und 116 mit Ether ausgefällt. Ausbeute: 68%, Smp. ab 155°C.
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-amidino-(D,L)-phenylalanyl- (D,L)-pipecolyl-glycin-methylester-hydrochlorid (117)
0,2 g der Verbindung 116 wurden analog Beispiel 4 umgesetzt. Ausbeute: 86%, Smp. ab 145°C.
Beispiel 7
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-amidino-(L)-phenylalanyl-(D)-prolin- und -methylester (123, 124)
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-cyan-(D)-phenylalanyl-(D)-prolin-t-butylester und N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-cyan-(L)-phenylalanyl-(D)-prolin-t-butylester (118, 119)
11 mmol der Verbindung 3 und 12 mmol (D)-Prolin-t-butyl-ester wurden analog Verfahren A (Beispiel 3) umgesetzt. Es wurden 4,9 g eines Gemisches der Verbindungen 118 und 119 erhalten. Durch säulenchromatographische Trennung über Kieselgel 60 mit Chloroform als Eluierungsmittel wurden erhalten:
einerseits N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-cyan-(D)-phenylalanyl-(D)-prolin-t-butylester (118). Ausbeute: 28%, amorph, [α]D 20
+39° (1% in Methanol),
und andererseits
farblose Kristalle von N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-cyan- (L)-phenylalanyl-(D)-prolin-t-butylester (119). Ausbeute:
33%, Smp. 139-141°C; [α]D 20 +35° (1% in Methanol).
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-thiocarboxamido-(L)-phenylalanyl-(D)-prolin-t-butylester (120)
1,0 g der Verbindung 119 wurde analog Beispiel 3 (61-71) umgesetzt und aufgearbeitet. Amorphes Produkt. Ausbeute: 92%.
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-S-methyliminothiocarbonyl-(D-phenylalanyl-(D)-prolin-t-butylester-hydroiodid (121 )
0,95 g der Verbindung 120 wurden in 30 ml Aceton, analog Beispiel 2 (25-31) umgesetzt und aufgearbeitet, wobei man ein kristallines Produkt erhielt. Ausbeute: 92%, Smp. ab 160°C.
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-amidino-(L)-phenylalanyl-(D)-prolin-t-butylester-hydroiodid (122)
1,0 g des Thioimidsäuremethylester-hydroiodids (121) wurde in 10 ml Methanol analog Beispiel 2 (32-34) umgesetzt und aufgearbeitet. Ausbeute: 96%, Smp. ab 130°C.
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-amidino-(L)-phenylalanyl-(D)- prolin-hydrochlorid (123)
0,75 g der Verbindung 122 wurden in einer Mischung aus 5 ml TFA und 5 ml Isopropanol gelöst. Durch HPLC-Kontrolle wurde auf Vollständigkeit der Esterhydrolyse geprüft. Anschliessend wurde das Lösungsmittel abdestilliert. Man löste den öligen Rückstand in 10 ml Methanol und setzte der Lösung unter pH-Kontrolle ethanolische Ammoniaklösung zu, bis der pH-Wert 7,4 erreicht war. Das ausgefallene Betain wurde nach 2 Stunden abgesaugt und getrocknet. Ausbeute: 56%, Smp. 215-223°C.
Zur Überführung in das Hydrochlorid löste man das erhaltene Betain in methanolischer Salzsäure und gab der Lösung Ether zu. Das ausgefallene Hydrochlorid wurde abgesaugt, mit Ether gewaschen und getrocknet. Ausbeute: 85%, Smp. ab 145°C.
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-amidino-(L)-phenylalanyl-(D)- prolin-methylester-hydrochlorid (124)
0,22 g Betain 123 wurden analog Beispiel 4 umgesetzt und aufgearbeitet. Ausbeute: 74%, Smp. ab 150°C.
Zum Strukturbeweis wurde darüber hinaus ausgehend von 3-Cyan-(D,L)-phenylalaninmethylester durch Chymotrypsinspaltung 3-Cyan-(L)-phenylalanin (125) dargestellt, das mit 2-Naphthylsulfonylchlorid in Nα-(2-Naphthylsulfonyl)-3-cyan-(L)-phenylalanin (126) übergeführt wurde. Die Umsetzung von 126 mit (D)-Prolin-t-butylester nach dem DCC-Verfahren führte zu Nα-(2-Naphthylsulfonyl)-3-cyan-(L)-phenylalanyl-(D)-prolin-t-butylester (127), aus dem nach dem für die Verbindungen 120-123 beschriebenen Verfahren Nα-(2-Naphthylsulfonyl)-3-amidino-(L)-phenyl¬alanyl-(D)-prolin gewonnen wurde. Die dabei erhaltenen Zwischenprodukte sowie das Endprodukt waren dünnschicht- chromatographisch mit den Verbindungen 120-123 identisch. Die ermittelten Schmelzpunkte, Drehwerte sowie die Ki-Werte stimmten überein. 3-Cyan-(L)-phenylalanin-hydrochlorid (125)
4,8 g des aus Verbindung 2 durch Veresterung mit Methanol in Gegenwart von p-Toluolsulfonsäure erhaltenen 3-Cyan-(D,L)-phenylalaninmethylesters wurden in 25 ml Toluol gelöst, eine Lösung von 0,2 g Chymotrypsin in 25 ml Wasser zugegeben und die Mischung 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt, wobei ein Niederschlag ausfiel, der abgesaugt, mit Wasser gewaschen und getrocknet wurde. Man suspendierte das trockene Produkt in 10 ml Methanol und säuerte die Suspension mit 2 N Ethylacetat/HCl an. Nach Filtration und Versetzen des Filtrats mit reichlich Ether konnten 0,55 g 125 erhalten werden. Das als Filtrat zurückbleibende Reaktionssystem Toluol/Wasser wurde 3X mit Ethylaeetat ausgeschüttelt. Nach Phasentrennung wurde die wässrige Phase im Vakuum zur Trockne gebracht und der Rückstand in der oben beschriebenen Weise behandelt. Es wurden zusätzlich 1,8 g 125 erhalten. Gesamtausbeute: 88%, Smp. 211-212°C. [α]D 20 -10.3° (3% in Methanol).
Aus der nach Extraktion des Reaktionssystems Toluol/Wasser erhaltenen Ethylacetatlösung konnte 3-Cyan-(D)-phenylalaninmethylester in öliger Form gewonnen werden, dessen saure Hydrolyse (25 ml 0,5 N HCl, 6 Stunden Rückfluss) zu 3-Cyan-(D)-phenylalanin-hydrochlorid führte. Ausbeute: 72%, Smp. 210-212°C, [α]D 20 +10.0° (3% in Methanol).
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-cyan-(L)-phenylalanin (126)
2,2 g der Verbindung 125 wurden in einer Mischung aus 10,4 ml 1 N KOH und 1,0 g NaHCO3 in 12 ml Wasser gelöst, eine Lösung von 2,64 g 2-Naρhthylsulfonylchlorid in 30 ml Ether zugefügt und 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschliessend wurde das ausgefallene Kaliumsalz von 126 abgesaugt und mit Ether gewaschen. Zur Überführung in die freie Säure wurde das Kaliumsalz in 50 ml Wasser suspendiert, die Suspension mit 1 N HCl angesäuert und mit Ethylaeetat ausgeschüttelt. Die organische Phase wurde 1X mit Wasser gewaschen, über MgSO4 getrocknet und das Lösungsmittel abdestilliert. Amorphes Produkt. Ausbeute: 62%. [α]D 20 +8.2° (5% in Methanol).
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-cyan-(L)-phenylalanyl-(D)- prolin-t-butylester (127)
0,5 g der Verbindung 126 wurden in der für die Verbindungen 118,119 beschriebenen Weise (Verfahren A, Beispiel 3) mit (D)-prolin-t-butylester umgesetzt und aufgearbeitet. Nach säulenchromatographischer Reinigung über Kieselgel 60 mit Chloroform als Eluierungsmittel wurden farblose Kristalle der Verbindung 127 erhalten. Ausbeute: 80%, Smp. 139-141°C,
[α]D 20 +35° (1% in Methanol)
Beispiel 8
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-amidino-(D,L)-phenylalanyl-1,2,¬3,4-tetrahydroisochinolin-3-carbonsäure und -methylester (134,135)
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-cyan-(D,L)-phenylalanyl-1,2,3,4-tetrahydroisochinolin-3-carbonsäuremethylester (128,
Tabelle 13)
11 mmol 1,2,3, 4-Tetrahydroisochinolin-3-carbonsäuremethylester und 10 mmol des aus Verbindung 3 und Thionylchlorid erhaltenen Säurechlorids wurden analog Verfahren B (Beispiel 3) umgesetzt und aufgearbeitet. Die Reinigung erfolgte durch Umkristallisation aus Methanol.
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-cyan-(D,L)-phenylalanyl-1,2,3,4-tetrahydroisochinolin-3-carbonsäure (129, Tabelle 13)
2 mmol der Verbindung 128 wurden nach der in Beispiel 3 (50-60) angegebenen Vorschrift verseift. 129 wurde in der erhaltenen Form weiterverarbeitet.
Thioamide (130. 131, Tabelle 13)
Je 1,0 g der Verbindungen 128 und 129 wurden analog Beispiel 3 (61-71) umgesetzt und aufgearbeitet.
Thioimidsäuremethylester-hydroiodide (132, 133, Tabelle 13)
Je 1,0 g der Verbindungen 130 und 131 wurden analog Beispiel 3 (72-82) umgesetzt und aufgearbeitet.
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-amidino-(D,L)-phenylalanyl-1,2,-3,4-tetrahydroisochinolin-3-carbonsäure und -methyl- ester-hydroiodide (134, 135, Tabelle 13)
Je 0,5 g der Thioimidsäuremethylester-hydroiodide 132 und 133 wurden analog Beispiel 2 (32-34) umgesetzt und aufgearbeitet.
Figure imgf000065_0001
Beispiel 9
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-amidino-(D,L)-phenylalanylsarcosin und -methylester (140, 141)
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-cyan-(D,L)-phenylalanylsarcosin-t-butylester (136)
9 mmol der Verbindung 3 und 10 mmol Sarcosin-t-butylester wurden analog Verfahren A (Beispiel 3) umgesetzt und aufgearbeitet. Die Reinigung erfolgte saulenchromatographisch über Kieselgel 60 mit Chloroform als Eluierungsmittel. Ausbeute: 82%; Smp. 141-142°C.
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-thiocarboxamido-(D,L)-phenylalanyl-sarcosin-t-butylester (137)
2,0 g der Verbindung 136 wurden analog Beispiel 3 (61-71) umgesetzt und aufgearbeitet. Ausbeute: 89%, Smp. 162-164°C.
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-S-methyliminothiocarbonyl- (D,L)-phenylalanyl-sarcosin-t-butylester (138)
1,8 g der Verbindung 137 wurden in 40 ml Aceton analog Beispiel 3 (72-82) umgesetzt und aufgearbeitet. Ausbeute: 92%, Smp. ab 105°C.
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-amidino-(D,L)-phenylalanylsarcosin-t-butylester-hydroiodid (139)
2,0 g der Verbindung 138 wurden in 20 ml Methanol analog Beispiel 2 (32-34) umgesetzt und aufgearbeitet. Ausbeute: 74%, Smp. ab 103°C. N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-amidino-(D,L)-phenylalanylsarcosin-hydrochlorid (140)
0,57 g der Base von 139, die man wie in Beispiel 6 (116) beschrieben erhielt, wurden in 7 ml TFA gelöst, die Lösung 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und danach das Lösungsmittel abdestilliert. Der Rückstand wurde in 5 ml Methanol gelöst, die Lösung mit 2 ml 2 N Ethylacetat/HCl versetzt und Verbindung 140 mit Ether ausgefällt. Ausbeute: 70%, Smp. ab 130°C.
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-amidino-(D,L)-phenylalanylsarcosin-methylester-hydrochlorid (141 )
0,2 g der Verbindung 140 wurden analog Beispiel 4 umgesetzt. Ausbeute: 75%, Smp. 125-135°C.
Beispiel 10
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-amidino-(D,L)-phenylalanyl-decahydrochinolin-4-carbonsäure (146)
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-cyan-(D,L)-phenylalanyl-decahydrochinolin-4-carbonsäuremethylester (142)
5,5 mmol Decahydrochinolin-4-carbonsäuremethylester und 5 mmol des aus Verbindung 3 und Thionylchlorid erhaltenen Säurechlorids wurden analog Verfahren B (Beispiel 3) umgesetzt und aufgearbeitet. Die Reinigung erfolgte saulenchromatographisch über Kieselgel 60 mit Chloroform als Eluierungsmittel. Ausbeute: 28%, Smp. 193-195°C.
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-cyan-(D,L)-phenylalanyl-decahydrochinolin-4-carbonsäure (143)
1,0 g der Verbindung 142 wurde analog Beispiel 3 (50-60) verseift. Die Reinigung erfolgte saulenchromatographisch über Kieselgel 60 mit Chloroform als Eluierungsmittel. Ausbeute: 83%, Smp. 263-266°C.
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-thiocarboxamido-(D,L)-phenylalanyl-decahydrochinolin-4-carbonsäure (144)
0,95 g der Verbindung 143 wurden analog Beispiel 3 (61-71) umgesetzt und aufgearbeitet. Amorphes Produkt. Ausbeute: 87%.
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-S-methyliminothiocarbonyl-(D,L)-phenylalanyl-decahydrochinolin-4-carbonsäurehydroiodid (145)
0,87 g der Verbindung 144 wurden in 20 ml Aceton gelöst, die Lösung mit 3 g Methyliodid versetzt und der Ansatz 20 Stunden bei Raumtemperatur aufbewahrt, wobei Verbindung 145 auskristallisierte. Der Niederschlag wurde abgesaugt, mit Aceton/Ether 1:1 gewaschen und getrocknet. Ausbeute: 65%, Smp. 153-157°C.
N-α-(2-Naρhthylsulfonyl)-3-amidino-(D,L)-phenylalanyl-decahydrochinolin-4-carbonsäure-hydroiodid ( 146 )
0,68 g der Verbindung 145 wurden analog Beispiel 3 (83-93) umgesetzt, wobei das Amidin-hydroiodid 146 auskristallisierte. Ausbeute: 54%, Smp. 188-192°C.
Beispiel 11
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-amidino-(D,L)-phenylalanyl-decahydroisochinolin-3-carbonsäure (151)
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-cyan-(D,L)-phenylalanyl-decahydroisochinolin-3-carbonsäuremethylester (147) 10 mmol Decahydroisochinolin-3-carbonsäuremethylester und 9 mmol der Verbindung 3 wurden analog Verfahren A (Beispiel 3) umgesetzt und aufgearbeitet. Die Reinigung erfolgte saulenchromatographisch über Kieselgel 60 mit Chloroform als Eluierungsmittel. Amorphes Produkt. Ausbeute: 29%.
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-cvan-(D,L)-phenylalanyl-decahydroisochinolin-3-carbonsäure (148)
0,77 g der Verbindung 147 wurden nach der in Beispiel 3 (50-60) angegebenen Vorschrift verseift. Die Reinigung erfolgte über Kieselgel 60 mit Chloroform/Methanol 90:10 als Eluierungsmittel. Ausbeute: 83%, Smp. ab 145°C.
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-thiocarboxamido-(D,L)-phenylalanyl-decahydroisochinolin-3-carbonsäure (149)
0,52 g der Verbindung 148 wurden analog Beispiel 2 (19-24) umgesetzt und aufgearbeitet. Amorphes Produkt. Ausbeute: 91%.
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-S-methyliminothiocarbonyl- (D,L)-phenylalanyl-decahydroisochinolin-3-carbonsäure (150)
0,5 g der Verbindung 149 wurden in 20 ml Aceton gelöst, die Lösung mit 2,0 g Methyliodid versetzt und der Ansatz 20 Stunden bei Raumtemperatur unter Lichtschutz aufbewahrt. Anschliessend wurde die Verbindung 150 mit Ether ausgefällt. Amorphes Produkt. Ausbeute: 69%.
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-amidino-(D,L)-phenylalanyl-decahydroisochinolin-3-carbonsäure-hydrochlorid (151)
0,4 g Thioimidsäuremethylester-hydroiodid 150 wurden analog Beispiel 3 (83-93) umgesetzt, wobei das entsprechende Betain erhalten wurde. Ausbeute: 64%, Smp. 214-218°C.
Zur Überführung in das Hydrochlorid wurde in der dort beschriebenen Weise verfahren. Ausbeute: 92%, Smp. ab 168°C.
Beispiel 12
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-glycyl-3-amidino-(D,L)-phenylalanin-4-methylpiperidid (156)
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-glycyl-3-cyan-(D,L)-phenylalanin (152)
20 mmol der Verbindung 3 wurden in 42 ml 1 N NaOH gelöst, eine Lösung von 22 mmol 2-Naphthylsulfonyl-glycylchlorid in 60 ml Ethylaeetat zugegeben und der Ansatz 16 Stunden gerührt. Anschliessend wurde eine geringe Menge schwerlösliches Nebenprodukt abgesaugt, die wässrige Phase abgetrennt, mit 1 N HCl angesäuert und mit Ethylaeetat ausgeschüttelt. Die organische Phase wurde 1X mit Wasser gewaschen, über MgSO4 getrocknet und das Lösungsmittel abdestilliert. Der amorphe Rückstand kristallisierte beim Durcharbeiten mit Ether. Zur Reinigung wurde aus verdünnter Essigsäure umkristallisiert. Ausbeute: 72%, Smp. 157-158°C.
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-glycyl-3-cyan-(D,L)-phenylalanin-4-methyl-piperidid (153)
10 mmol der Verbindung 152 und 12 mmol 4-Methylpiperidin wurden nach Vefahren A (Beispiel 3) umgesetzt und aufgearbeitet. Die Reinigung erfolgte saulenchromatographisch über Kieselgel 60 mit Choroform/Methanol 90:10 als Eluierungsmittel. Ausbeute: 94%, Smp. 170-172°C.
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-glvcyl-3-thiocarboxamido-(D,L)-phenylalanin-4-methylpiperidid (154)
2,6 g der Verbindung 153 wurden in 25 ml Pyridin und 1,5 ml TEA analog Beispiel 2 (19-24) umgesetzt. Nach Abdestil lieren des Lösungsmittels wurde der feste Rückstand mit 60 ml Methanol und 10 ml 1 N HCl durchgearbeitet, abgesaugt, mit Methanol gewaschen und getrocknet. Ausbeute: 96%, Smp. 190-192°C.
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-glycyl-3-S-methyliminothiocarbonyl-(D,L)-phenylalanin-4-methylpiperidid-hydroiodid (155)
1,0 g der Verbindung 154 wurde unter Erwärmen in 2 ml DMF gelöst, die Lösung mit 40 ml Aceton und 3,5 g Methyliodid versetzt und 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, wobei die Verbindung 155 auskristallisierte. Anschliessend wurde abgesaugt, mit Ether gewaschen und getrocknet. Ausbeute: 83%, Smp. 185-188°C (Z.).
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-glycyl-3-amidino-(D,L)-phenylalanin-4-methylpiperidid-hydroiodid (156)
0,8 g des Thioimidsäuremethylester-hydroiodids 155 wurden in einer Mischung aus 18 ml DMF und 9 ml Methanol gelöst, die Lösung mit 0,2 g Ammoniumacetat versetzt und der Ansatz 3 Stunden bei 60°C im Wasserbad erwärmt. Anschliessend wurde das Lösungsmittel abdestilliert, der Rückstand in Ethanol gelöst und Verbindung 156 mit Ether ausgefällt. Ausbeute: 78%, Smp. ab 125°C.
Beispiel 13
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-glycyl-3-amidino-(D,L)-phenylalanyl-piperidincarbonsäuren (165,166, Tabelle 14)
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-glycyl-3-cyan-(D,L)-phenylalanyl-piperidincarbonsäureethylester (157,158, Tabelle 14)
Je 10 mmol der Verbindung 152 und 15 mmol des entsprechenden Piperidincarbonsäureethylesters wurden analog Verfahren A (Beispiel 3) umgesetzt und aufgearbeitet. Die Reinigung erfolgte saulenchromatographisch über Kieselgel 60 mit Chloroform als Eluierungsmittel.
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-glycyl-3-cyan-(D,L)-phenylalanyl-piperidincarbonsäuren (159,160, Tabelle 14)
Je 4 mmol der Verbindungen 157 und 158 wurden nach der im Beispiel 3 (50-60) angegebenen Vorschrift verseift. Die Reinigung erfolgte saulenchromatographisch über Kieselgel 60 mit Chloroform/Methanol 90:10 als Eluierungsmittel.
Thioamide (161, 162, Tabelle 14)
Jeweils 0,8 g der Verbindungen 159 und 160 wurden analog Beispiel 2 (19-24) in die Thioamide 161 und 162 übergeführt.
Thioimidsäuremethylester-hydroiodide (163, 164, Tabelle 14)
Je 0,7 g der Thioamide 161 und 162 wurden analog Beispiel 3 (72-82) zu den Verbindungen 163 und 164 umgesetzt.
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-glycyl-3-amidino-(D,L)-phenylalanyl-piperidincarbonsäure-hydroiodide (165,166, Tabelle 14)
Je 0,6 g der Thioimidsäuremethylester-hydroiodide 163 und 164 wurden analog Beispiel 2 (32-34) in die Amidin-hydroiodide 165 und 166 übergeführt.
Figure imgf000073_0001
Beispiel 1 4
N-α-(8-Chinolylsulfonyl)-3-amidino-(D,L)-phenylalanin-4-methylpiperidid (171)
N-α-(8-Chinolylsulfonyl)-3-cyan-(D,L)-phenylalanin (167)
10 mmol der Verbindung 3 wurden in 22 ml 1 N KOH gelöst, eine Lösung von 11 mmol Chinolyl-8-sulfochlorid in einer Mischung aus 27 ml Ether/DMF 2:1 zugefügt und 16 Stunden gerührt. Anschliessend wurde die Wasserphase abgetrennt, mit 10%iger Zitronensäurelösung angesäuert und mit Ethylaeetat ausgeschüttelt. Die organische Phase wurde 1X mit Wasser gewaschen, über MgSO4 getrocknet und das Lösungsmittel abdestilliert. Der Rückstand wurde aus Ethylaeetat umkristallisiert. Ausbeute: 53%, Smp. 187-189°C.
N-α-(8-Chinolylsulfonyl)-3-cyan-(D,L)-phenylalanin-4-methylpiperidid (168)
5 mmol der Verbindung 167 und 7,5 mmol 4-Methylpiperidin wurden analog Verfahren A (Beispiel 3) umgesetzt und aufgearbeitet. Die Reinigung erfolgte saulenchromatographisch über Kieselgel 60 mit Chloroform als Eluierungsmittel. Amorphes Produkt. Ausbeute: 61%.
N-α-(8-Chinolylsulfonyl)-3-thiocarboxamido-(D,L)-phenylalanin-4-methylpiperidid (169)
1,4 g der Verbindung 168 wurden analog Beispiel 3 (61-71) umgesetzt. Anstelle von 1 N HCl wurde bei der Aufarbeitung 10%ige Zitronensäurelösung verwendet. Amorphes Produkt. Ausbeute: 62%. N-α-(8-Chinolylsulfonyl)-3-S-methyliminothiocarbonyl- (D,L)-phenylalanin-4-methylpiperidid (170)
0,9 g des Thioamids 169 wurden in 20 ml Aceton gelöst, die Lösung mit 1,3 g Methyliodid versetzt und der Ansatz 15 Minuten im Wasserbad unter Rückfluss erhitzt. Anschliessend wurde Verbindung 170 mit Ether ausgefällt. Amorphes Produkt. Ausbeute: 81%. N-α-(8-Chinolylsulfonyl)-3-amidino-(D,L)-phenylalanin-4- methylpiperidid-hydroiodid (171)
0,9 g des Thioimidsäuremethylesters 170 wurden analog Beispiel 2 (32-34) umgesetzt und aufgearbeitet. Ausbeute: 81%, Smp. ab 135°C.
Beispiel 15
N-α-(8-Chinolylsulfonyl)-3-amidino-(D,L)-phenylalanyl-piperidin-carbonsäuren (180, 181, Tabelle 15)
N-α-(8-Chinolylsulfonyl)-3-cyan-(D,L)-phenylalanyl-piperidin-carbonsäureethylester (172, 173, Tabelle 15)
Jeweils 5 mmol der Verbindung 167 und 7,5 mmol des entsprechenden Piperidincarbonsäureesters wurden analog Verfahren A (Beispiel 3) umgesetzt und aufgearbeitet. Die Reinigung der Verbindungen 172 und 173 erfolgte saulenchromatographisch auf Kieselgel 60 mit Chloroform als Eluierungsmittel.
N-α-(8-Chinolylsulfonyl)-3-cyan-(D,L)-phenylalanyl-piperidin-carbonsäuren (174, 175, Tabelle 15)
Je 4 mmol der Carbonsäureester 172 und 173 wurden nach der im Beispiel 3 (50-60) angegebenen Vorschrift verseift. Zur Aufarbeitung wurden die Ansätze mit 10%iger Zitronensäure lösung auf pH4 gebracht, einige Stunden im Kühlschrank aufbewahrt und die gebildeten Niederschläge abgesaugt. Die Reinigung der Carbonsäuren 174 und 175 erfolgte saulenchromatographisch über Kieselgel 60 mit Chloroform/
Methanol 90:10 als Eluierungsmittel.
Thioamide (176,177, Tabelle 15)
Je 1,0 g der Verbindungen 174 und 175 wurden analog Beispiel 2 (19-24) umgesetzt und aufgearbeitet.
Thioimidsäuremethylester-hydroiodide (178, 179 , Tabelle 15)
Zur Darstellung der Verbindungen 178 und 179 wurden jeweils 0,8 g der Thioamide 176 und 177 analog Beispiel 3 (72-82) umgesetzt und aufgearbeitet.
N-α-(8-Chinolylsulfonyl)-3-amidino-(D,L)-phenylalanyl- piperidin-carbonsäure-hydroiodide (180, 181, Tabelle 15)
Je 0,5 g der Thioimidsäuremethylester-hydroiodide 178 und 179 wurden analog Beispiel 2 (32-34) umgesetzt und aufgearbeitet.
Figure imgf000077_0001
Beispiel 16
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-aminomethyl-(D,L)-phenylalanyl-4-methylpiperidid (182),
(D,L)-pipecolinsäure (185) und - ethylester (183),
isonipecotinsäure (186) und - ethylester (184) (Tabelle 16)
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-aminomethyl-(D,L)-phenylalanyl-4-methylpiperidid, - (D,L)-pipecolinsäure - und - isonipe- cotinsäureethylester als Hydrochloride (182-184, Tabelle 16)
2,0 g der Verbindungen 14, 39 und 41 wurden in jeweils 40 ml einer Mischung Dioxan/Methanol 1:1 unter Erwärmen gelöst, die Lösungen mit 5 g Raney-Nickel-Katalysator und 10 ml 1 N ethanolischer Ammoniaklösung versetzt und unter Normalbedingungen hydriert, wobei die berechnete Wasserstoffmenge nach etwa 45 Minuten aufgenommen war. Anschliessend wurde vom Katalysator abfiltriert, mit 100 ml Methanol gewaschen und das Lösungsmittel abdestilliert. Die öligen Rückstände wurden in 5 ml Methanol gelöst, mit 2 N Ethylacetat/HCl angesäuert und die Hydrochloride 182, 183 und 184 mit Ether ausgefällt.
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-aminomethyl-(D,L)-phenylalanyl- (D,L)-pipecolinsäure - und - isonipecotinsäure -hydrochlorid (185, 186, Tabelle 16)
0,8 g der Carbonsäureethylester-hydrochloride 183 und 184 wurden in je 20 ml 0,36 N methanolischer Kalilauge gelöst und die Lösungen bis zur vollständigen Verseifung (dc Kontrolle) bei Raumtemperatur gerührt. Anschliessend wurde mit 2 N Ethylacetat/HCl angesäuert, 20 ml Ether zugefügt und ausgefallenes Kaliumchlorid abfiltriert. Die Verbindungen 185 und 186 wurden aus den Filtraten durch Zugabe von reichlich Ether ausgefällt.
Figure imgf000079_0001
Beispiel 17
Verbindungen mit Oxamidinstruktur (187-190, Tabelle 17)
1,0 g der Verbindungen 27, 72, 74 und 132 wurden in jeweils 20 ml Methanol gelöst bzw. suspendiert, die Ansätze mit der 1,3-molaren Menge Hydroxylammoniumacetat versetzt und 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschliessend wurde filtriert, das Lösungsmittel abdestilliert, die Rückstände in 3-4 ml abs. Ethanol gelöst und die Oxamidin-hydroiodide 187-190 mit Ether ausgefällt.
Figure imgf000080_0001
Auf diese Weise wurden dargestellt:
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-oxamidino-(D,L)-phenylalanin-4- methylpiperidid-hydroiodid (187),
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-oxamidino-(D,L)-phenylalanyl- (D,L)-pipecolinsäure-hydroiodid (188),
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-oxamidino-(D,L)-phenylalanyl- isonipecotinsäure-hydroiodid (189),
N-α-( 2-Naphthylsulfonyl)-3-oxamidino-(D,L)-phenylalanyl- 1,2,3,4-tetrahydroisochinolin-3-carbonsäure-hydroiodid (190).
Beispiel 18
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-amino-(D,L)-phenylalanyl-piperidid (202), -4-methylpiperid (203),
-(D,L)-pipecolinsäure (204), -isonipecotinsäure (205) und -1,2,3,4-tetrahydroisochinolin -3-carbonsäure (206)
(3-Nitrobenzyl)-acetamino-malonsäure-diethylester (191)
11,0 g 3-Nitrobenzylbromid und 11,0 g Acetaminomalonsäurediethylester wurden in 80 ml abs. Dioxan gelöst. Zu dieser Lösung wurde unter Rühren eine Lösung von 1,15 g Natrium in 20 ml abs. Ethanol gegeben. Das Gemisch wurde 4 Stunden auf dem siedenden Wasserbad erhitzt, nach dem Erkalten 500 ml Wasser zugesetzt, der gebildete Niederschlag abgesaugt, mit Wasser gewaschen und aus Methanol/Wasser umkristallisiert. Ausbeute: 80%, Smp. 153-154°C. 3-Nitro-(D,L)-phenylalanin-hydrochlorid (192)
14 g der Verbindung 191 wurden in einer Mischung aus 26 ml Eisessig und 26 ml 6 N HCl 4 Stunden unter Rückfluss erhitzt. Beim Erkalten kristallisierte der grösste Teil der Verbindung 192 aus. Die Kristalle wurden abfiltriert und getrocknet. Das Filtrat wurde im Vakuum eingeengt, wobei eine zusätzliche Menge der Verbindung 192 anfiel. Man löste die beiden erhaltenen Fraktionen in Methanol und fällte die Verbindung 192 mit Ether aus. Der gebildete Niederschlag wurde abgesaugt, mit Ether gewaschen und getrocknet. Ausbeute: 75%, Smp. 247-248°C.
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-nitro-(D,L)-phenylalanin (193)
19,8 g der Verbindung 192 wurden in 252 ml 1 N KOH gelöst und mit einer Lösung von 20 g 2-Naphthylsulfonylchlorid in 240 ml Ether analog Beispiel 1 (3) umgesetzt und aufgearbeitet. Die Umkristallisation erfolgte aus Methanol/Wasser. Ausbeute: 71%, Smp. 173-174°C.
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-nitro-(D,L)-phenylalanyl-verbindungen (194-201)
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-nitro-(D,L)-phenylalanin-piperidide (194, 195)
7,5 mmol Piperidin bzw. 4-Methylpiperidin und 5 mmol NMM wurden in 10 ml abs. Dioxan gelöst, eine Lösung von 5 mmol des aus Verbindung 193 und Thionylchlorid erhaltenen Säurechlorids in 10 ml abs. Dioxan zugetropft und der Ansatz 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, wobei die Verbindungen 194 und 195 ausfielen. Anschliessend wurde abgesaugt, mit 50%igem Methanol gewaschen und getrocknet. N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-nitro-(D,L)-phenylalanyl-carbonsäureester (196-198)
Je 5 mmol der Verbindung 193 und 6 mmol (D,L)-Pipecolinsäureethylester, Isonipecotinsäureethylester sowie 1,2,3,4 -Tetrahydroisochinolin-3 -carbonsäuremethylester wurden analog Verfahren A (Beispiel 3) umgesetzt und aufgearbeitet. Die Reinigung erfolgte saulenchromatographisch über Kieselgel 60 mit Chloroform als Eluierungsmittel.
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-nitro-(D,L)-phenylalanyl-carbonsäuren (199-201)
5 mmol der Verbindungen 196-198 wurden analog Beispiel 3 (50-60) verseift. Die isolierten Produkte wurden in der erhaltenen Form zur Reduktion eingesetzt.
Aminoverbindungen (202-206)
Je 3 mmol der Nitroverbindungen 194, 195, 199-201 wurden in der zum Lösen notwendigen Menge DMF gelöst, die Lösungen mit einer Suspension von 0,4 g Pd/C (10%) in 10 ml Ethanol und 0,5 ml Essigsäure versetzt und unter Normalbedingungen hydriert, bis die berechnete Wasserstoffmenge aufgenommen war. Anschliessend wurde der Katalysator abfiltriert, das Lösungsmittel abdestilliert und die erhaltenen Rohprodukte saulenchromatographisch über Kieselgel 60 mit Chloroform/ Methanol 90:10 als Eluierungsmittel gereinigt.
Die zu stärkerer Verfärbung neigenden Aminoverbindungen 204 und 205 wurden in der unter Beispiel 3 (83-93) beschriebenen Weise in Hydrochloride übergeführt.
Figure imgf000084_0001
Figure imgf000085_0001
Beispiel 19
Verbindungen mit Guanidinstruktur (207, 208)
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-guanidino-(D,L)-phenylalanin¬piperidid-hydrochlorid (207)
Eine Lösung von 1,09 g der Verbindung 202, 0,83 ml NMM und 0,51 g 1-Amidino-3, 5-dimethyl-pyrazol-nitrat in 20 ml THF wurde 30 Stunden unter Rückfluss erhitzt. Nach Abdestil- lieren des Lösungsmittels wurde das erhaltene Rohprodukt saulenchromatographisch über Kieselgel 60 mit Chloroform/ Methanol 95:5 als Eluierungsmittel gereinigt. Ausbeute: 28%, Smp. ab 122°C.
Zur Überführung in das Hydrochlorid wurde in der im Beispiel 3 (83-93) angegebenen Weise verfahren. Ausbeute: 83%, Smp. ab 110°C.
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-guanidino-(D,L)-phenylalanin- (D,L)-pipecolinsäure-hydrochlorid (208)
0,69 g der freien Aminoverbindung 204 wurden in 12 ml THF gelöst, die Lösung mit 0,47 ml NMM und 0,44 g 1 -Amidino- 3,5-dimethyl-pyrazol-nitrat versetzt und der Ansatz 50 Stunden unter Rückfluss erhitzt. Nach Abdestillieren des Lösungsmittels wurde das erhaltene Rohprodukt saulenchromatographisch über Kieselgel 60 mit Chloroform/Methanol 75:25 gereinigt. Die isolierte Guanidinverbindung wurde analog Beispiel 3 (83-93) in das Hydrochlorid 208 übergeführt. Ausbeute: 40%, Smp. ab 100°C.
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Im folgenden sind die biologischen Eigenschaften von repräsentativen erf indungsgemässen Verbindungen aufgeführt :
In Tabelle 19 - 25 ist die Hemmung der Gerinnungsenzyme Thrombin und Faktor X anhand der Dissoziationskonstante Ki (ausgedrückt in μmol/1) durch die genannten Verbindungen angegeben. Alle untersuchten Verbindungen hemmen die durch beide Enzyme bewirkte Substratspaltung kompetitiv. Unter den in Tabelle 19 aufgeführten Derivaten des 3-Amidinophenylalanins finden sich eine Reihe von Verbindungen mit hoher Antithrombinaktivität, d. h. mit Ki-Werten unter 1 μmol/l. Die Thrombinhemmung ist vergleichsweise stärker als die Hemmung von Faktor Xa. Die Ki-Werte für die Hemmung von Faktor X liegen gewöhnlich 2 Grössenordnungen höher als die für die Thrombinhemmung.
Die Verbindungen, die sich vom 3-Guanidinophenylalanin (Tabelle 20), 3-Oxamidinophenylalanin (Tabelle 21), 3-Aminophenylalanin (Tabelle 22) und 3-Aminomethylphenylalanin (Tabelle 23) ableiten, bewirken geringere AntithrombinAktivität, einige von ihnen haben aber brauchbare K. -Werte für die Thrombin-Hemmung im micromolaren Bereich.
Auch bei Austausch der 2-Naphthylsulfonyl-Schutzgruppe durch einen Chinolylsulfonyl-Rest (Tabelle 24) bzw. einen 2-Naphthylsulfonyl-Glycyl-Rest (Tabelle 25) werden Verbindungen mit einer Antithrombin-Aktivität im mikromolaren Bereich gefunden.
Tabelle 1 9
Hemmung von Thrombin und Faktor X durch Derivate des
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-amidinophenylalanins
R1 = Amidino, n = 0, R4 = 2-Naphthyl
Ki in μmol/l
Verbindung R2 Thrombin Faktor Xa
NAPAP 0,006 7,9
TAPAM 66 0,84
7 OMe 0,28 2,5
123 Pro-OH 0,68 220
124 Pro-OMe 0,27 104
83 Pip-OH 0,26 38
94 Pip-OMe 0,07 46
116 Pip-Gly-OH 1,3 110
117 Pip-Gly-OMe 0,88 38
84 Nip-OH 1,1 44
95 Nip-OMe 0,15 18
85 iNip-OH 0,57 43
96 iNip-OMe 0,017 43
32 Ppd(2-Me) 0,13 74
33 Ppd(3-Me) 0,13 32
34 Ppd(4-Me) 0,0086 41
86 Pip(4-Me)-OH 0,12 96
97 Pip(4-Me)-OMe 0,096 58
35 Pzd(4-Me) 0,036 30
134 THICH-3-COOH 0,018 42
151 DHICH-3-COOH 0,12 54
Pro-OH = Prolin, Pip-OH - Pipecolinsäure, Nip-OH = Nipecotinsäure, iNip-OH = Isonipecotinsäure, Ppd = Piperidid, Pzd = Piperazid, Gly = Glycin, OMe = Methylester, THICH-3-COOH = Tetrahydroisochinolin-3-carbonsäure, DHICH-3-COOH = Decahydroisochinolin-3-carbonsäure Tabelle 20
Hemmung von Thrombin und Faktor X durch Derivate des
N-α-(2-Naρhthylsulfonyl)-3-guanidinophenylalanins
R 1 = Guanidino, n = 0, R4 = 2-Naphthyl
Ki in μmol/l
Verbindung R2 Thrombin Faktor Xa
208 Pip-OH 29 82 207 Ppd 0,40 107
Tabelle 21
Hemmung von Thrombin und Faktor X, durch Derivate des
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-oxamidinophenylalanins
R 1 = Oxamidino, n = 0, R4 = 2-Naphthyl
Ki in μmol/l
Verbindung R2 Thrombin Faktor Xa
188 Pip-OH 330 410
189 iNip-OH 270 670
187 Ppd(4-Me) 2,8 >1000
190 THICH-3-COOH 2,4 130 Tabelle 22
Hemmung von Thrombin und Faktor X durch Derivate des N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-aminophenylalanins
R1 = Amino, n = 0, R4 = 2-Naphthyl
Ki in μmol/l Verbindung R2 Thrombin Faktor Xa
204 Pip-OH 130 450
205 iNip-OH 720 720 203 Ppd(4-Me) 8,9 210
Tabelle 23
Hemmung von Thrombin und Faktor X durch Derivate des
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-3-aminomethylphenylalanins
R 1 = Aminomethyl, n = 0, R4 = 2-Naphthyl
Ki in μmol/l
Verbindung R2 Thrombin Faktor Xa
185 Pip-OH 50 140 186 iNip-OH 0,5 230 182 Ppd(4-Me) 1,9 500 Tabelle 24
Hemmung von Thrombin und Faktor X durch Derivate des
N-α-(8-Chinolylsulfonyl)-3-amidinophenylalanins
R 1 = Amidino, n = 0, R4 = 8-Chinolyl
Ki in μmol/l Verbindung R2 Thrombin Faktor Xa
180 Pip-OH 16 380
181 iNip-OH 127 260
171 Ppd(4-Me) 0,34 180
Tabelle 25
Hemmung von Thrombin und Faktor X durch Derivate des N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-glycyl-3-amidinophenylalanins R1 = Amidino, n = 1, R3 = H, R4 = 2-Naphthyl
Ki in μmol/l
Verbindung R2 Thrombin Faktor Xa
165 Pip-OH 61 48 166 iNip-OH 46 97 156 Ppd(4-Me) 3, ,6 25 In Tabelle 26 sind für einige repräsentative, erfin- dungsgemässe Verbindungen auch ihre Hemmwirkung gegenüber Trypsin, Plasmin, Faktor XIIa, Plasmakallikrein, tPA und glandularem Kallikrein dargestellt. Gewöhnlich wird Trypsin schwächer gehemmt, die Ki-Werte sind eine Grössenordnung höher. Wesentlich schwächer wirksam sind die Verbindungen gegenüber Plasmin, Plasmakallikrein und Faktor Xa (Ki 2 Grössenordnungen grösser). Praktisch unwirksam sind die Derivate gegenüber Faktor XIIa, tPA und glandularem Kallikrein. Für die Mehrzahl der Verbindungen kann man daher von selektiven Thrombinhemmstoffen sprechen.
Zum Vergleich dazu werden die entsprechenden Werte für die zum Stand der Technik gehörenden NAPAP und TAPAM dagegengehalten.
Tabelle 26
Hemmung von Thrombin, Trypsin, Plasmin, Faktor Xa, Faktor Xlla, tPA, glandularem und Plasmakallikrein durch ausgewählte, erfindungsgemässe Derivate (K. in μmol/1)
VerFaktor Faktor gland. Plasma bindung R1 R2 R4 n Thrombin Trypsin Plasmin Xa Xlla tPA Kaliikrein
NAPAP 0,006 0,69 30 7,9 500 70 93 5,6
TAPAM 66 16 160 0,84 180 27 890 15
7 Am OMe Na 0 0,28 2,5 5,2 2,5 190 120 210 18
123 Am Pro-OH Na 0 0,68 0,96 95 220 > 1000 300 > 1000 59
124 Am Pro-OMe Na 0 0,27 3,4 11 104 600 225 > 1000 29
83 Am Pip-OH Na 0 0,26 0,63 34 38 > 1000 205 * 1000 32
94 Am Pip-OMe Na 0 0,07 1,9 10,5 46 500 220 > 1000 35
34 Am Ppd(4-Me) Na 0 0,0086 0,14 4,0 41 > 1000 460 > 1000 16
86 Am Pip(4-Me)- OH Na 0 0,12 1,2 42 96 > 1000 470 > 1000 84 35 Am Pzd(4-Me) Na 0 0,036 1,3 31 30 > 1000 430 > 1000 85
134 Am THICH-3-COOH Na 0 0,018 0,13 0,67 42 > 1000 > 1000 390 1,5
207 Gu Ppd Na 0 0,40 4,1 17 107 > 1000 > 1000 > 1000 > 1000
190 Ox THICH-3-COOH Na 0 2,4 27 120 130 460 > 1000 > 1000 > 1000
203 A Ppd(4-Me) Na 0 8,9 >1000 >1000 210 270 > 1000 > 1000 > 1000
182 AMe Ppd(4-Me) Na 0 1,9 3,4 27 500 < 1000 > 1000 76 > 1000
171 Am Ppd(4-Me) Ch 0 0,34 3,6 100 180 780 > 1000 260 > 1000
156 Am Ppd(4-Me) Na 1 3,6 46 46 25 350 340 > 1000 68
Am = Amidino, Gu = Guanidino, Ox = Oxamidino, A = Amino, AMe = Aminomethyl , Na = 2-Naphthyl , Ch = 8-Chinolyl
In Tabelle 27 sind die an der Maus bestimmten Toxizitätswerte von repräsentativen erfindungsgemässen Verbindungen und zum Vergleich NAPAP und TAPAM zusammengestellt.
Tabelle 27
Approximative LD50 an der Maus
LD50 p.o. LD50 i.V.
Verbindung R1 R2 mg/kg KG mg/kg KG
NAPAP > 800 54
TAPAM > 1000 103
123 Am Pro-OH > 3000 188
124 Am Pro-OMe > 3000 80
83 Am Pip-OH > 3000 272
85 Am iNip-OH > 3000 43
134 Am THICH-3-COOH > 3000 29
190 Ox THICH-3-COOH > 3000 > 150
208 Gu Pip-OH > 1000 > 50
186 AMe iNip-OH > 3000 100
Im Vergleich zu früher geprüften Derivaten von Benzamidin-enthaltenden Aminosäuren (LD50 10 - 50 mg/kg nach i .v. -Applikation) ist die Toxizität bei einer Reihe von erfindungsmässigen Verbindungen deutlich geringer, d.h. es werden Werte für die LD50 nach i.v.-Gabe von > 50 mg/kg gefunden. Das wird besonders deutlich bei dem Vergleich von NAPAP mit solchen Verbindungen, die auch verbesserte pharmakokinetische Daten zeigen (123, 83, 186 und 190).
In Tabelle 28 - 30 sind die Ergebnisse von Untersuchungen zur Pharmakokinetik von repräsentativen, erfindungsgemässen Verbindungen und als Vergleich dazu die Werte mit NAPAP zusammengestellt. Die zu prüfenden Verbindungen wurden intravenös (Tabelle 28), subcutan (Tabelle 29) bzw. peroral (Tabelle 30) an Ratten verabreicht. Nach der Verabreichung wurde den Versuchstieren in Zeitabständen von 2 bis maximal 360 Minuten Blutproben entnommen, in welchen der Blutspiegel der zu prüfenden Verbindungen mittels HPLC bestimmt wurde.
Tabelle 28
Konzentration (ng/ml) ausgewählter Verbindungen im Plasma von Ratten nach intravenöser Verabreichung von 1 mg/kg
Verbindung
Zeit
(min) NAPAP 123 83 85 134 190 186
2 4028 2330 1903 2348 4441 3262 1840
5 2111 1180 928 1238 1680 1606 1256
10 1307 660 496 526 775 806 653
15 933 440 243 334 621 496 426
30 413 260 150 240 79 477 225
45 106 185 115 176 78 134 205
60 78 160 85 99 10 0 193
90 - 68 45 52 0 - 53
120 0 32 0 28 - - 228
180 - 22 0 - - - -
240 - 0 0 14 - - -
Tabelle 29
Konzentration (ng/ml) ausgewählter Verbindungen im Plasma von Ratten nach subkutaner Verabreichung von 5 mg/kg
Verbindung
Zeit
(min) NAPAP 123 83 85 134 190 186
15 294 792 402 1330 0 340 251
30 375 1340 620 1027 35 330 368
45 324 1381 626 860 72 374 444
60 361 - 568 834 79 492 558
90 330 1781 467 913 92 354 629
120 327 1603 415 977 145 270 534
180 230 1135 314 815 285 165 533
240 173 927 297 676 268 152 669
300 - - - 550 248 138 455
360 - - - - - 126 340
Tabelle 30
Konzentration (ng/ml) ausgewählter Verbindungen im Plasma von Ratten nach oraler Verabreichung von 100 mg/kg
Verbindung
Zeit
(min) NAPAP 123 83 85 134 190 186
15 0 230 133 870 188 481 996
30 0 170 79 541 260 1113 800
45 0 - - 345 297 796 769
60 0 100 50 120 260 574 1246
90 0 133 37 - - - 877
120 0 - 38 103 234 542 619
180 0 96 25 104 236 217 357
240 - 67 23 0 210 113 328
300 - - - - 157 50 370
360 - - - 86 - 326 Im Vergleich zu NAPAP zeigen die geprüften Derivate ein verbessertes pharmakokinetisches Verhalten. Zwar werden die Verbindungen nach intravenöser Gabe mit vergleichbarer Geschwindigkeit eliminiert (Abb. 1), nach subkutaner Verabreichung werden aber relativ hohe, lang andauernde Blutspiegel gefunden (Abb. 2). Nach oraler Gabe kann NAPAP nicht im Plasma nachgewiesen werden, während einige der beispielhaft geprüften erfindungsmässigen Verbindungen verhältnismässig hohe Konzentrationen erreichen (Abb. 3). In vitro sind eine Reihe von repräsentativen erfindungsgemässen Verbindungen gerinnungshemmend wirksam. In allen Fällen wurde die Thrombinzeit (TT) am effektivsten verlängert. Dies entspricht der Selektivität dieser Inhibitoren, die unter den Gerinnungsfaktoren Thrombin am stärksten hemmen. Eine Verlängerung der aktivierten partiellen Thromboplastinzeit (aPTT), bei der neben Thrombin auch die an der Frühphase der Gerinnung beteiligten Enzyme zum Tragen kommen, wird durch höhere Konzentrationen der Inhibitoren erreicht. Das gilt auch für die Beeinflussung der Prothrombinzeit (PT), die den extrinsischen Gerinnungsweg repräsentiert. Beispielhaft ist das für Verbindung 34 in Abb. 4 gezeigt.
Der gerinnungshemmende Effekt der Verbindungen lässt sich auch in vivo nachweisen. Nach i.v.-, s.c- und p.o.Verabreichung der zu prüfenden Verbindungen wurde im Plasma der Versuchstiere der gerinnungshemmende Effekt bestimmt. Beispielhaft ist das für die Verbindung 123 in Abb. 5 gezeigt. Ganz entsprechend dem mittels HPLC bestimmten Konzentrationsverlauf im Plasma ist die Antithrombinwirkung im Gerinnungstest nachzuweisen.
Zweckmässig werden die nach einer der erfindungsgemässen Verfahren hergestellten Phenylalanin-Derivate als solche oder als Salze mit einer physiologisch verträglichen anorganischen oder organischen Säure unter Verwendung geeigneter pharmazeutischer Hilfstoffe in geeignete Applikationsformen überführt. Entsprechend dem pharmakokinetischen Verhalten sind das insbesondere transdermale Therapie-Systeme wie Pflaster, aber auch Tabletten, Dragees, Kapseln, Suppositorien, Lösungen usf.
Die Dosierung hängt ab von der Antithrombinaktivität, der Toxizität, den möglichen Blutspiegelwerten, der Bioverfügbarkeit und der Applikationsart der verwendeten erfindungsgemässen Verbindung sowie ganz allgemein von den Blutwerten, dem Gewicht und dem Allgemeinzustand des Patienten, so dass die Dosierung letztlich vom praktizierenden Arzt bestimmt werden muss. Im Prinzip entspricht die Dosierung derjenigen bekannter thrombinhemmender Verbindungen und liegt zwischen ungefähr 0, 2 mg/kg und ungefähr 20 mg/kg Körpergewicht, wobei gegebenenfalls auch höhere Dosen verabreicht werden können. Bei einem erwachsenen Patienten ergeben sich somit tägliche Dosierungen einer erfindungsgemässen Verbindung von ungefähr 50 mg bis ungefähr 1600 mg oder mehr.
Anhand von Verbindung 186 soll beispielhaft die Überführung in 5 pharmazeutische Darreichungsformen gezeigt werden.
Beispiel 1
Tabletten mit 50 mg der Verbindung 186 als Wirkstoff
Zusammensetzung:
1 Tablette enthält 50 mg Wirkstoff, 40 mg Lactose, 30 mg
Maisstärke, 4 mg PVP und 1 mg Magnesiumstearat.
Herstellunqsverfahren
Der mit Lactose und Maisstärke vermischte Wirkstoff wird mit einer 20%igen ethanolischen Lösung von Polyvinylpyrrolidon gleichmässig durchfeuchtet, durch ein Sieb der
Maschenweite 1,5 mm gedrückt und bei 40°C getrocknet. Das so erhaltene Granulat wird mit Magnesiumstearat vermischt und zu Tabletten verpresst. Beispiel 2
Dragees mit 25 mg der Verbindung 186 als Wirkstoff
Zusammensetzung:
1 Dragee enthält 25 mg Wirkstoff, 20 mg Lactose und 15 mg Maisstärke.
Herstellungsverfahren
Der mit Lactose und Maisstärke vermischte Wirkstoff wird in der unter Beispiel 1 beschriebenen Weise granuliert und zu ovalen Tablettenkernen yerpresst, die anschliessend dragiert werden. Für den Dragiervorgang wird eine Zuckermischung, bestehend aus 36,09 % Puderzucker, 13,54 % Gummi arabicum, 36,09 % Weizenstärke und 3,00% g Magnesiumstearat sowie als Bindemittel 11,28 % einer Mischung aus gleichen Teilen Mucilago Gummi arabici und Wasser verwendet.
Beispiel 3
Kapseln mit 50 mg der Verbindung 186 als Wirkstoff
Zusammensetzung:
1 Kapsel enthält 50 mg Wirkstoff und 100 mg Lactose.
Herstellungsverfahren
Der fein gepulverte Wirkstoff wird anteilweise mit Lactose verrieben und die Mischung in Stärkekapseln, die paarweise ineinanderschiebbare, einseitig verschlossene Zylinder darstellen, in der angegebenen Dosierung eingebracht.
Beispiel 4
Suppositorien (Zäpfchen) mit 50 mg der Verbindung 186 als Wirkstoff
Zusammensetzung:
1 Zäpfchen enthält 50 mg Wirkstoff und 0,95 g Cetylphthalat als Grundlage.
Herstellungsverfahren
Der feinst gepulverte Wirkstoff wird mit der doppelten Menge der verflüssigten Grundlage verrieben. Die Verreibung wird mit dem Rest der verflüssigten Grundlage anteilweise gemischt und bis zur gleichmässigen Beschaffenheit bearbeitet. Nahe der Grenze der Giessbarkeit wird die Mischung in eine geeignete Form gegossen und. bis zum Erkalten stehengelassen.
Beispiel 5
Injektions- bzw. Infusionslösung mit 5 mg/ml der Verbindung
186 als Wirkstoff
Herstellungsverfahren
Der Wirkstoff wird in 100 ml Aqua ad injectionem gelöst, die Lösung filtriert und gegebenenfalls in Ampullen zu je 2 ml abgefüllt. Die mit der Wirkstofflösung gefüllten und verschlossenen Gefässe (Infusionsflaschen, Ampullen) werden der DampfSterilisation bei 121 bis 124°C unterzogen.

Claims

Patentansprüche
D,L-, L- und D-Phenylalanin-Derivate der Formel
Figure imgf000109_0001
in welcher
R1 eine basische Gruppe der Formel
Figure imgf000109_0002
Figure imgf000109_0003
Figure imgf000109_0004
(d) - CH2 - NH2 oder (e) - NH2
Aminomethyl Amino darstellt, wobei R5 und R6 in den Formeln (a) und (b) je Wasserstoff oder einen geradkettigen oder verzweigten niedrigen Alkylrest bezeichnen,
(f) OH, O-Alkyl, O-Cycloalkyl oder O-Aralkyl darstellt, wobei n=0 ist,
(g) eine Gruppe der Formel
- N - CH - CO - R9
R7 R8
darstellt, in welcher R7 Wasserstoff oder einen geradkettigen oder verzweigten niedrigen Alkylrest und
R 8 einen geradkettigen oder verzweigten niedrigen Alkylrest, einen 1- oder 2-Hydroxyethylrest, einen Methylmercaptoethylrest, einen Aminobutylrest, einen Guanidinopropylrest, einen Carbpxy(niedrigen)alkylrest, einen Carboxamido(niedrigen)alkylrest, einen Phenyl (niedrigen)alkylrest, dessen Ring gegebenenfalls mit OH, Halogen, niedrig-Alkyl oder Methoxy substituiert ist, einen Cyclohexyl- oder Cyclohexylmethylrest, dessen Ring gegebenenfalls mit OH, Halogen, niedrig-Alkyl oder Methoxy substituiert ist, oder einen N-Heteroaryl(niedrigen)alkylrest mit 3 bis 8 Kohlenstoffatomen im Heteroaryl, z.B. Imidazolylmethyl oder Indolylmethyl, bezeichnen, wobei die Gruppe (g) racemisch oder D- bzw. L-konfiguriert sein kann,
(h) eine Gruppe der Formel
Figure imgf000110_0001
darstellt, in welcher m die Zahl 1 oder 2 bezeichnet, und in welcher eine der Methylengruppen gegebenenfalls mit einem Hydroxyl-, Carboxyl-, niederen Alkyl- oder Aralkyl-rest substituiert ist, wobei die Gruppe (h) racemisch oder D- bzw. L-konfiguriert sein kann,
(i) eine Gruppe der Formel
Figure imgf000110_0002
darstellt, in welcher p = r = 1, p = 1 und r = 2 oder p = 2 und r = 1 sind und in welcher eine der Methylengruppen gegebenenfalls mit einem Hydroxyl-, Carboxyl-, niederen Alkyl- oder Aralkyl-rest substituiert ist,
(k) eine Piperidylgruppe darstellt, die gegebenenfalls in einer der Stellungen 2, 3 und 4 mit einem niederen Alkyl- oder Hydroxyl-rest substituiert ist,
wobei an die heterocycloaliphatischen Ringe der Formeln (h), (i), (k) gegebenenfalls ein weiterer aromatischer oder cycloaliphatischer Ring, vorzugsweise Phenyl oder Cyclohexyl, in 2,3 oder 3,4 Stellung, bezogen auf das Heteroatom, änkondensiert ist,
(1) eine Piperazylgruppe, die gegebenenfalls in p-Stellung mit einem niederen Alkylrest, einem Arylrest oder einem Alkoxycarbonylrest substituiert ist, (m) eine Gruppe der Formel
Figure imgf000111_0002
darstellt, in welcher n' die Zahlen 1 bis 6 und R10
Wasserstoff oder den Methyl- oder Cyclohexylrest bezeichnen,
(n) eine Gruppe der Formel
Figure imgf000111_0001
darstellt, wobei R9 in den Formeln (g), (h), (i), (1), (m) und (n) eine Hydroxyl-, geradkettige oder verzweigte niedrige Alkoxy- oder eine Benzyloxy-Gruppe bezeichnet,
oder
(o) eine Kombination von 2 bis 20, vorzugsweise 2 bis 5, insbesondere 2 oder 3, der von den unter (g), (h), (i), (k), (1), (m) und (n) definierten Gruppen abgeleiteten, durch Amidbindungen verknüpften Resten (R9 = Einfachbindung) darstellt, wobei der C-terminale Rest gegebenenfalls mit einem Rest R9 verknüpft ist,
R3 Wasserstoff oder einen geradkettigen oder verzweigten niedrigen Alkyl- oder einen 1- oder 2-Hydroxyethyl-Rest darstellt, wobei n die Zahl 0 oder 1 bezeichnet,
und
R^ einen Arylrest, z.B. Phenyl, Methylphenyl, α- oder ß-Naphthyl oder 5-(Dimethylamino)-naphthyl, oder einen Heteroarylrest, z.B. Chinolyl, darstellt,
wobei niedrig 1-4 Kohlenstoffatome bedeutet,
und deren Salze mit Mineralsäuren oder organischen Säuren.
2. Phenylalanin-Derivate nach Patentanspruch 1, in welchen R1 eine basische Gruppe der Formel (a) = Amidino, (b) = Guanidino, (c) = Oxamidino, (d) = Aminomethyl oder (e) = Amino,
R2 O-Alkyl, O-Cycloalkyl oder Aralkyl oder einen heterocycloaliphatischen Rest der Formeln (h), (i), (k) und (1), wobei R9 in den Formeln (h) und (i) eine Hydroxyl-, geradkettige oder verzweigte niedrige Alkoxy-, Cycloalkoxy- oder Aralkoxy-Gruppe sein kann,
R4 einen Aryl- oder Heteroarylrest, vorzugsweise ß- Naphthyl, und
n die Zahl 0 darstellt.
3. Verwendung der Phenylalanin-Derivate nach Patentanspruch 1 oder 2 zur Herstellung von oral, subkutan, oder intravenös verabreichbaren antithrombotisch wirksamen Arzneimitteln.
4. Oral, subkutan oder intravenös verabreichbares anti-thrombotisches Arzneimittel, gekennzeichnet durch eine wirksame Menge mindestens eines Phenylalanin-Derivates nach Patentanspruch 1 oder 2 und geeignete pharmazeutische Hilfsstoffe.
5. Antithrombotisch wirksames Arzneimittel nach Patentanspruch 4, in Form von Tabletten, Dragees, Kapseln, Pellets, Suppositorien, Lösungen oder transdermalen Systemen, wie Pflaster.
6. Verfahren zur Blutgerinnungs- resp. Thrombinhemmung bei Lebewesen, insbesondere bei Menschen, durch Verabreichung einer wirksamen Menge mindestens einer Verbindung nach einem der Patentansprüche 1 oder 2 resp. eines Arzneimittels nach einem der Patentansprüche 4 oder 5.
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