WO1992006382A1 - Method of assaying endotoxin - Google Patents

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WO1992006382A1
WO1992006382A1 PCT/JP1991/001309 JP9101309W WO9206382A1 WO 1992006382 A1 WO1992006382 A1 WO 1992006382A1 JP 9101309 W JP9101309 W JP 9101309W WO 9206382 A1 WO9206382 A1 WO 9206382A1
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endotoxin
polyoxyethylene
aqueous solution
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mol
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PCT/JP1991/001309
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Inventor
Shigenori Tanaka
Hiroshi Tamura
Original Assignee
Seikagaku Kogyo Kabushiki Kaisha
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/579—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving limulus lysate

Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring endotoxin in plasma or serum, and particularly to a pretreatment for measuring endotoxin with high accuracy.
  • Horseshoe crab ⁇ A method for measuring endotoxin (bacteria endotoxin) using amebosite lysate components (hereinafter referred to as limulustest) has been known for a long time. It is widely used in various fields such as inspection. Rimurusutesu DOO one said suitable trace detection of high detection sensitivity for biological samples E down de toxin Rere o sigma
  • the present invention provides a method for efficiently, simply, and rapidly measuring endotoxin in plasma and serum with an extremely high detection rate.
  • the present invention relates to a method for measuring endotoxin in plasma or serum using a horseshoe crab 'amebosite' lysate component, comprising: a) polyoxyethylene ethers, polyoxyethylene sorbitan, n-alkyl A surfactant selected from the group consisting of glucoviranosides and dodecyl sulfate;
  • the polyoxyethylene ethers include polyoxyethylene-1p—yi-sharyo-octyl (or iso-octyl) phenyl (1-8% by weight). ), Polyoxyethylene 14-octyl (or isooctyl) cyclohexyl ether (degree of polymerization 8 to 40), polyoxyethylene 1-p-nonylphenyl ether (degree of polymerization 9 To 15), polyoxyethylene heptamethylhexyl ether (degree of polymerization: 10 to 20), polyoxyethylene dodecyl ether (degree of polymerization: 10 to 29), and the like.
  • n-alkylglucoviranosides examples include n- (heptic, octyl, nonyl, decyl, or dodecyl) (hi- or / 3-) D-glucoviranoside.
  • polyoxyethylene examples include polyoxyethylene sorbitan (having a weight of about 20) monolaurate, monopalmitate, monostearate, monooleate, and trioleate.
  • alkyl sulfates include sodium dodecyl sulfate, lithium dodecyl sulfate, and calcium dodecyl sulfate.
  • Examples of the compound having an imidazolyl group or an amino group include histamine dihydrochloride, L-histidine dihydrochloride, and poly-L-histidine hydrochloride (molecular weight: 15,500- 50,000), poly-L-lysine hydrochloride (molecular weight 2,000-70,000), poly-l-arginine hydrochloride (molecular weight 5,000-150) , 000), polyethyleneimine (molecular weight 1, 000-70, 000), adenine hydrochloride, cytosine hydrochloride and the like.
  • the amount of the surfactant added in a) differs depending on the type of the surfactant. It is preferable to use the surfactant in the range of 0.04 to 0.40% (weight / volume), and b) the imidazolyl group or The compound having an amino group varies depending on the type, but is preferably used in the range of 0.03 to 0.3% (by weight), and the alkaline earth metal salt is preferably used. It is preferable that the metal hydroxide and the alkali metal hydroxide be in the mixed aqueous solution at 0.05 to 0.05 mol / 0 and 0.05 to 0.5 mol 5, respectively.
  • ⁇ , ⁇ -bis (2-hydroxyhydricyl) glycine is added to the mixed aqueous solution in an amount of 0.005 to 0.05 mol ⁇ , preferably 0.02 to 0.02 mol.
  • Processing temperature when processing plasma or serum using the mixed aqueous solution The temperature is preferably in the range of 25 to 70 ° C, particularly 37 to 56 ° C, and the processing time is preferably in the range of 5 to 30 minutes, particularly 5 to 20 minutes.
  • a test solution obtained by treating plasma or serum with the mixed aqueous solution comprising a) to c) of the present invention can be reacted with a lysate component of A. aeruginosa lysate to measure endotoxin. You. Best form to carry out the invention
  • PRP multiplatelet platelet plasma
  • Triton X 100 (polyoxyethylene 1 p — urea, aryloctyl ether, Aqueous solution containing Rohm & Haas Co.) and polyethylenimine (ethyleneimine polymer, 0.016-0.80% by weight).
  • EIP average molecular weight
  • the endotoxin present in the test solution was measured using 0.1 mol Z tris-HCl buffer (pH 8.0) 4.4 at ⁇ , horseshoe crab 'amebosite' ⁇ Reaction to glucan from lysate extract Endospeciose (registered trademark, manufactured and sold by Seikagaku Corporation), which is a preparation from which enzymes that have been removed, is dissolved and used, and Endospeciose 100 ⁇ is added to the test solution 25 ⁇ .
  • Endospeciose registered trademark, manufactured and sold by Seikagaku Corporation
  • Table 1 shows the measurement results of this example when the EIP concentration was variously changed, together with the measurement results of the comparative example in which endotoxin was not added.
  • the EIP concentration (%) indicates the concentration at the time of treatment, and the measurement results indicate the absorbance measured at a wavelength of 550-630 nm for the comparative example in which endotoxin was not added.
  • the measured value of the control example in which physiological saline for injection was used instead of the PRP sample and distilled water for injection was used instead of the pretreatment solution was set to 100.
  • the detection rate (%) in each case is shown. 1
  • the concentration of EIP exceeds 0.32%, the endotoxin detection rate decreases.
  • the concentration of EIP used in the treatment is about 0.032 to 0.240%, It is possible to detect the true value of endotoxin in PRP accurately, with high reliability and with good reproducibility under the same conditions as when false positive factors and inhibitors are completely eliminated. ⁇ T> 0
  • Example 2 The measurement results when the concentration of Triton X-100 was varied in Example 2 were compared with those of Example 1 in which the endotoxin was not added and physiological saline was used instead of the PRP sample, as in Example 1.
  • Table 2 shows a control example using distilled water for injection instead of the pretreatment solution.
  • Example 1 the measurement results show the absorbance measured at a wavelength of 550-630 nm for the comparative example in which endotoxin was not added, and the control example for the example in which endotoxin was added.
  • the detection rate (%) when the measured value is 100 is shown.
  • Triton X-100 force 0, that is, the endotoxin detection rate is very low when Triton X-100 is not added.
  • the endotoxin addition detection rate was 100%.
  • a surfactant Triton X—100 having a predetermined appropriate concentration and 0.08 mol KOH-0.056% EIP-0.008 mol / C a C
  • Example 3 endotoxin was measured from the above test solution by the same means as in Example 1. -Measured results for each heating time in Example 3 were the same as in Example 1.Comparative examples in which endotoxin was not added, and physiological saline was used instead of the PRP sample, and the pretreatment solution was used instead. Table 3 shows a control example using distilled water for injection. Table 3 Test solution Heating time Absorbance Endotoxin
  • the detection rate of endotoxin is very low when the heating time is 0, that is, when the test solution is used immediately after the treatment with the pretreatment mixture, the endotoxin detection rate is very low.
  • the true value of endotoxin in PRP can be accurately and high under conditions where false positive factors and inhibitors are completely denatured. It is clear that detection can be performed with good reproducibility with reliability.
  • Example 4 The measurement results for each heating temperature in Example 4 were obtained in the same manner as in Example 1 except that endotoxin was not added, and a physiological saline solution was used instead of the PRP sample, and the pretreatment solution was used instead.
  • Table 4 shows a control example using distilled water for injection.
  • Test solution treatment temperature Absorbance end photo,,,,
  • Plasma samples were collected from a healthy individual by adding 5 units of parin per blood, and the blood was centrifuged at 1,000 xg for 10 minutes to obtain platelet poor plasma (PPP).
  • PPP platelet poor plasma
  • Example 5 The measurement results for each concentration of Tween 20 in Example 5 were compared with those in Example 1 except that endotoxin was not added.In addition, physiological saline was used instead of the PPP sample, and the pretreatment solution was used instead. Table 5 shows the control examples using distilled water for injection. Table 5 Test solution Tween 20 Absorbance endotoxin
  • an endotoxin preparation E. coli 0111 aqueous solution 10 / ⁇ containing 40 pg of endotoxin to PPP sample 190 ⁇ prepared in the same manner as in Example 5, the resulting 5 0.1 M KOH-0.05 containing a predetermined amount of sodium dodecyl sulfate (SDS) selected within the range of 0 to 1.0% (weight Z volume) for the 96 F % (Weight / volume) ⁇ -Poly L-Lysine hydrochloride (Molecular weight 2, 000-4, 000, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)-0.01 Molha Ca C £ 2 aqueous solution 20 ⁇ of the mixture was added, and the mixture was kept at 37 for 10 minutes to obtain a test solution.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • Example 6 The measurement results for each concentration of SDS in Example 6 were used, as in Example 1.Comparative examples in which endotoxin was not added, and physiological saline was used instead of the PPP sample, and instead of the pretreatment solution. Table 6 shows a control example using distilled water for injection. Table 6 Test liquid SDS concentration Absorbance endotoxin
  • Blood collected from a healthy individual without an anticoagulant was allowed to stand at 4 ⁇ at 4 for 1 hour, and then centrifuged at 1,00 ⁇ g for 10 minutes to obtain serum.
  • E. coli 0111 aqueous solution 10 // ⁇ containing B4 to this serum sample 190 /, 5 5 ⁇ of the solution was added to a toxic plate 96F.
  • a toxic plate 96F Contains 0.1-mol / ⁇ KOH-0.07% EIP- containing a predetermined amount of n-octyl-3-D-glucoviranoside selected within the range of 0-1.0% (weight Z volume). 0 1 mole Z ⁇ C a C 2 aqueous mixture 20 was added, and held for 10 minutes to 3 7 ° C, and with a test liquid.
  • Example 7 The measurement results for each concentration of n-octylglucoside in Example 7 were compared with those of Example 1 in the same manner as in Example 1 except that endotoxin was not added, and that the physiological saline was used instead of the serum sample. The results are shown in Table 7 together with the control using distilled water for injection instead.
  • Example 1 Same as Example 1 from various experimental animals [mouse (ICR, male), rat (Wistar, male), guinea pig (Hartley, male). ⁇ egret (JW, male), dog (Beagle, male)] Add the anticoagulant (heparin) to the blood and collect blood to obtain PRP.
  • ICR immuneCR
  • rat Wistar, male
  • guinea pig Hartley, male
  • ⁇ egret JW, male
  • Dog Beagle, male
  • Example 8 Absorbance detection rate of test solution
  • Triton X—100, K ⁇ H, EIP, and Ca C ⁇ 2 were 0.1%, 0.1 mol £, 0.07%, and 0.01 mol aqueous solution, respectively.
  • a predetermined amount of N, N-bis (2-hydroxyxethyl) glycine (bicin) selected within the range of 0 to 06 mol ⁇ , a trade name of one of the doughite reagents; Wako Pure Chemical Industries ) was prepared.
  • the above mixed water solution was kept under ice cooling for a predetermined time.
  • Table 9 shows the observation results of this example when the concentration of vidin was variously changed, together with the observation results of the comparative example in which no bicine was added.
  • E. coli 0111 an aqueous solution 10 ⁇ containing 40 pg of endotoxin preparation to 190 pounds of a PRP sample prepared in the same manner as in Example 1, 5 g_g of the solution was added.
  • Toxipet plate 0.1% Triton X—10 0—0.1 mol / K ⁇ H—0.03 mol Z bicine—0.07% EIP—0 0 1 mol / £ C a C 2 aqueous solution mixture (premixed and left for 2 hours under ice cooling) 20 was added, and 37. C was kept for 10 minutes to obtain a test solution.
  • E.coli 01 1 1 After adding 40 pg of endotoxin preparation E.coli 01 1 1: an aqueous solution 10 containing B4 to 190 ⁇ £ of a PRP sample prepared in the same manner as in Example 1, the solution was added to the solution. Take ⁇ as the value for the toxin plate — 96 F, and add 0.1% triton X—100—0.1 mol / sodium hydroxide (Na aH) —0.0 3 mol Z bicine mono-0.07% EIP-0.01 mol ZC a C 2 Aqueous solution mixture and premixed, add 20 ⁇ of each mixture left standing for 2 hours under ice cooling, It was kept at 37 ° C for 10 minutes to obtain a test solution.
  • Triton X—100—0.1 mol / sodium hydroxide (Na aH) —0.0 3 mol Z bicine mono-0.07% EIP-0.01 mol ZC a C 2 Aqueous solution mixture and premixed, add 20 ⁇ of each mixture
  • Example 1 The measurement results are shown in the same manner as in Example 1 together with the comparative example in which endotoxin was not added and the control example in which physiological saline was used instead of the PRP sample and distilled water for injection was used instead of the pretreatment solution. 11 Table 1 shows. 1 1 Table Test solution Leaving time Absorbance
  • E. coli 0111 an aqueous solution containing 10 ⁇ ⁇ to 40 pg of a PRP sample 190__ prepared by the same method as in Example 1, 5 ⁇ ⁇ was added thereto.
  • Toxipet Plate 0.1% Triton X—100—0.1 Morno K 0 H—0.03 mol Bicine—0.07% EIP—0.02 mol for 96 F / H
  • Magnesium chloride (MgC ⁇ 2 ) aqueous solution mixture and mixed in advance, add each 20 ⁇ of the mixed solution left for 2 hours under ice-cooling, and add to 37 ° C for 10 minutes This was retained and used as a test solution.
  • Example 1 As in Example 1, the measurement results were the same as those in Comparative Example 1 in which endotoxin was not added and in Control Example 1 in which physiological saline was used in place of the PRP sample and distilled water for injection was used in place of the pretreatment solution. It is shown in the table.
  • the subjects were 30 healthy volunteers and 10 patients with liver and biliary tract diseases associated with severe blood diseases such as leukemia suspected of being septic due to gram-negative bacteria, and infection, each of which was aseptically treated with the addition of parin.
  • PRP was obtained by centrifugation at 150 ° C for 4 minutes at 4 ° C.
  • Table 13 shows the results of this example as the E. coli 0111: B4 endotoxin conversion amount from a calibration curve prepared separately.
  • endotoxin adsorbed on proteins, lipids, glycoproteins, glycolipids, platelets, and the like is efficiently released, and endotoxin in plasma and serum is released.
  • Dotoxin can be measured efficiently with an extremely high detection rate.

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Description

明 細 書 エ ン ド ト キ シ ン の 測 定 法 技 術 分 野
本発明は、 血漿又は血清中のエン ドトキシンの測定法に関す るものであり、 殊にェン ド トキシンを高い精度で測定するため の前処理に関するものである。 背 景 技 術
カブトガニ ■ ァメボサイ ト · ライセ一 ト成分を用いてェン ド トキシ ン （細菌内毒素） を測定する方法 （以下リ ムルステス ト という） が従来から知られており、 医薬品、 水などの汚染試験、 臨床検査など多方面に汎用されている。 リムルステス トはェン ド トキシンの検出感度が高いため生体試料中の微量検出に適し 一し レヽ o σ
ところで、 生体試料のリ厶ルステス トにおいては、 蛋白等に 吸着されたェン ド トキシンが含まれ、 これらからェン ド トキシ ンを効率よく遊離させるための前処理が必要である。 特に血漿、 血清のような蛋白細胞顆粒を含む生体試料については、 従来 25 °Cにおける pKa が 3以下の酸を用いて P H 3以下の条件下で処理 した後に、 変性析出物を遠心分離しで除去し、 その上澄液を採 取し、 アルカ リで中和したものを被検液とする方法 （特公昭 63 - 5 5 6 7 1 号公報） が知られているが、 その分離操作が煩雑 で全操作行程も長く、 汚染の危険性があるなどの問題があった。 発 明 の 開 示
本発明は、 血漿及び血清中のェン ド トキシンを極めて高い検 出率で、 効率よ く 簡便、 迅速に測定する方法を提供するもので あ O o
本発明は、 力ブ トガニ ' ァメボサイ ト ' ライセー ト成分を使 用する血漿又は血清中のェン ド トキシンの測定法において、 a ) ポリオキシエチレ ンエーテル類、 ポリ オキシエチレ ンソ ルビタ ン類、 n —アルキルグルコ ビラノ シ ド類及び ドデシル硫 酸塩からなる群から選択された界面活性剤、
b ) イ ミ ダゾリ ル基又はァ ミ ノ基を有する化合物、 及び c ) アルカ リ土類金属塩とアルカ リ金属水酸化物
の混合水溶液を血漿又は血清に添加して被検液とするこ とを特 徵とするエン ド トキシンの測定法である。
本発明に用いるこ とができる界面活性剤のうち、 ポリ オキシ エチレ ンエーテル類としては、 ポリ オキジエチレ ン一 p —夕一 シャ リ 一ォクチル （又はイ ソォクチル） フヱニルェ一テ儿 （重 合度 8〜 4 0 ) 、 ポリオキシエチレ ン一 4 一夕一シャ リ 一ォク チル （又はイ ソォクチル） シクロへキシルエーテル.（重合度 8 〜 4 0 ) 、 ポリオキシエチレ ン一 p —ノニルフ エニルエーテル (重合度 9〜 1 5 ) 、 ポリオキシエチレ ンヘプタ メチルへキシ ルエーテル （重合度 1 0〜 2 0 ) 、 ポリオキシエチレ ン ドデシ ルエーテル （重合度 1 0〜 2 9 ) などが挙げられる。 また、 n —アルキルグルコ ビラノ シ ド類としては、 n— (ヘプチ儿、 ォ クチル、 ノニル、 デシル又は ドデシル） （ひ一又は / 3— ) D - グ儿コ ビラノ シ ドなどが挙げられる。 更に、 ポリオキシェチレ ンソルビタ ン類と しては、 ポリ オキシエチレ ンソルビタ ン （重 合度約 2 0 ) のモノ ラウ レー ト、 モノパル ミ テー ト、 モノ ステ ア レー ト、 モノォレエー ト又は ト リオレエ一トなどが挙げられ る。 またアルキル硫酸塩と しては、 ドデシル硫酸ナ ト リ ウム、 ドデシル硫酸リ チウム、 ドデシル硫酸カルシウムなどが挙げら 才 1 O o
イ ミ ダゾリ ル基又はア ミ ノ基を有する化合物と しては、 ヒス 夕 ミ ン二塩酸塩、 L— ヒスチジン二塩酸塩、 ポリ 一 L— ヒスチ ジン塩酸塩 （分子量 1 5， 0 0 0〜 5 0 , 0 0 0 ) 、 ポリ 一 L — リ ジン塩酸塩 （分子量 2 , 0 0 0〜 7 0 , 0 0 0 ) 、 ポリ 一 L—アルギニン塩酸塩 （分子量 5， 0 0 0〜 1 5 0， 0 0 0 ) 、 ポリエチレンィ ミ ン （分子量 1 , 0 0 0〜 7 0， 0 0 0 ) 、 ァ デニン塩酸塩、 シ ト シン塩酸塩などが挙げられる。
a ) の界面活性剤の添加量はその種類により異なる力 <、 0.04 〜0. 4 0 % (重量ノ容量） の範囲で使用するこ とが好ま し く 、 b ) のイ ミ ダゾリ ル基又はア ミ ノ基を有する化合物は、 その種 類によ り異なるが、 0. 0 3〜 0· 3 % (重量ノ容量） の範囲で使 用するこ とが好ま しく、 アルカ リ土類金属塩及びアル力 リ金属 水酸化物は混合水溶液中それぞれ 0. 0 0 5〜0. 0 5 モ儿 / ^及 び 0. 0 5〜 0. 5 モル Ζ であるこ とが好ま しい。
また、 混合水溶液に Ν, Ν—ビス （ 2 — ヒ ドロキシェチル） グリ シンを、 0. 0 0 5〜 0. 0 5 モル Ζ 好ま し く は 0. 0 2〜
0. 0 5 モル/ " ^を添加するこ とにより、 その濁りの生成が押え られ、 透明な溶液が得られる。
上記混合水溶液を用いて血漿又は血清を処理する際の処理温 度は 2 5〜 7 0 °C、 とく に 3 7〜 5 6 °Cの範囲が好ましく、 処 理時間は 5〜 3 0分、 とく に 5〜 2 0分の範囲が好ましい。
このような本発明の a ) 〜 c ) からなる混合水溶液で血漿又 は血清を処理した被検液は、 力ブトガニ · ァメボサイ ト ' ライ セー ト成分と反応させ、 エン ドトキシンを測定することができ る。 発 明 を 実施 す る た め の 最 良 の 形 態
以下に実施例を挙げ、 本発明をさらに具体的に説明するが、 本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例 1
健常人より血液 1 m£当たりへパリ ンを 5ュニッ ト添加して採 血した血液 2 を、 1 5 0 X g、 1 0分間遠心分離して、 多血 小板血漿 （ P R P) を得た。
この P R P試料 1 9 0 / ^に Salmonella abortus equi 由来 のェン ド トキシン調製品（ェン ド トキシンスタ ンダー ド N P 1 水溶液 （ 2 ng/m6) を 1 0 ^加え、 よ く混合した後、 その 5 〃 をエン ドトキシンフ リーのマイクロプレー ト （ トキシぺ ッ トプレー ト 9 6 F、 生化学工業販売、 商品名） にとり、 0. 1 モル Z ^水酸化力 リ ウム （K 0 H) - 0. 0 1 モル Z ^塩化カル シゥ厶 （ C a C 2) — 0. 1 % (重量 Z容量） ト リ ト ン X— 100 (ポリ オキシエチレ ン一 p —夕ーシ、ャ リ ーォクチルフ エ二ル エーテル、 Rohm & Haas Co. 販売の商品名） を含有する水溶液 ならびに、 それにさらに 0. 0 1 6〜 0. 8 0 0 % (重量ノ容量） になるようにポリエチレ ンィ ミ ン （エチレ ンイ ミ ンポリマー、 E I P、 平均分子量 ： 7 0 , 0 0 0 ) を添加した水溶液の混 液 （ 2 0 u £ ) を加え、 3 7 °Cに 1 0分間保持する。 これを被 検液とした。
被検液に存在するエン ド トキシンの測定は、 0. 1 モル Z の ト リスー塩酸緩衝液 （pH 8. 0 ) 4. 4 τη にカブトガニ ' ァメボサ ィ ト ■ ライセ一 ト抽出成分からグルカンに反応する酵素を除去 した調製品であるエン ドスぺシ一 （登録商標、 生化学工業株式 会社製造販売） を溶解して使用し、 被検液 2 5 ^ にエン ドス ぺシー 1 0 0 〃 を加え、 3 7 °Cに 3 0分間加温し、 次いで 0. 0 4 % (重量 容量） の亜硝酸ナ ト リ ウム （ 1 モル Z ^ の塩 酸溶液） 5 0 ^ 、 0. 3 % (重量 _ 容量） スルファ ミ ン酸アン モニゥ厶 5 0 〃 _ίならびに 0. 0 7 % (重量 Ζ容量） Ν— 1 —ナ フチルエチレンジア ミ ンニ塩酸塩 （ 1 4 ? (容量/容量:） Ν - メチル— 2—ピロ リ ドン溶液） 5 0 〃 ^を順次加えてジァゾ力 ップリ ングし、 この吸光度をマイ クロプレー ト リーダ一により 波長 6 3 0 nmを対照として波長 5 5 0 nmで測定した。
第 1 表に E I P濃度を種々変化させた場合の本実施例による 測定結果をェン ド トキシンが無添加である比較例の測定結果と ともに示す。
なお、 第 1表中、 E I P濃度 （％) は処理時の濃度を示し、 測定結果はェン ド トキシンを加えない比較例については波長 5 5 0 - 6 3 0 nmで測定した吸光度を示し、 エン ド トキシンを 添加した実施例については対照例 （ P R P試料の代わりに注射 用生理食塩水を用い、 前処理液の代わりに注射用蒸留水を使用 したもの） の測定値を 1 0 0 とした場合の検出率（％) を示した。 1 表 被 検 液 E I P濃度 吸 光 度 ェンドトキシン
(¾) (；ェンド卜キシン te添 ¾0 添加検出率（¾
0.000 0.027 52
0.016 0.028 55
0.032 0.028 91
PRP 0.048 0.029 100
(+ェンドトキシン） 0.064 0.029 100
C
+ ト リ トン X— 1 0 0 0.080 0.029 100
+ E I P 0.160 0.029 100
+ KOH 0.240 0.028 92
+ C a C ' 0.320 0.028 83
0.400 0.027 70
0.600 0.028 70
0.800 0.026 65 対 照 例 0.000 0.025 100
第 1 表によれば、 ト リ ト ン X— 1 0 0 と E I Pとを含まない 0. 0 8モルノ£ K〇 H— 0. 0 0 8モル ^ C a C _^ 2 のみ による処理では、 エン ドトキシンの検出率が非常に悪く （ 5 2 %) 、 0.08% ト リ ト ン X— 1 0 0存在下で E I Pの濃度を増や して行く と検出率が増加することが判る。
また、 E I Pの濃度が 0. 3 2 %を超えるとェン ド トキシンの 検出率が低下するが、 例えば処理に使用する E I P として 0.032 〜0. 2 4 0 %程度の濃度のものを使用すれば、 リムルステス 卜 偽陽性因子ならびに阻害因子も完全になく した場合と同等な条 件下で P R P中のエン ド トキシンの真の値を正確且つ高い信頼 度を以て再現性よ く検出することが可能であるこ とが明らかで あ <t> 0
即ち、 エン ド トキシンを添加しない比較例の吸光度が対照例 のそれと同値であるという こ とは、 P R P中のリムルステス ト 偽陽性因子が完全に変性されたこ とを示すものであり、 また、 ェン ド トキシンを添加して測定した実施例におけるェン ド トキ シンの検出率が 1 0 0 %であるとレ、う ことは P R P中のリ厶ル ステス ト反応阻害因子 （偽陰性因子） が完全に変性されている ことを意味しているのであり、 これらの妨害因子を同時に変性 することができる条件、 つま り、 比較例の測定値が対照例とほ ぼ同値で且つ実施例の測定値がほぼ 1 0 0 % (すなわち、 実施 例において添加したェン ドトキシンの量がほとんど全て検出回 収することができるこ とを意味している） となる条件が理想的 であり、 第 1 表で示すように 0. 0 8 % ト リ ト ン X— 1 0 0存在 下で、 0. 0 3 2〜 0. 2 4 0 %の濃度の E I Pを用いたときがこ れに当たる。
実施例 2
実施例 1 と同様の手段により調製した P R P試料 1 9 0 ^ に 4 0 pgのェン ド トキシン調製品 E. co l i 0111： B4を含有する 水溶液 1 0 〃 ^を添加した後、 その 5 Z をトキシペッ トプレ ー ト 9 6 Fにとり、 0〜0. 5 %の範囲内で選択された所定量の ト リ ト ン X— 1 0 0を含有する 0. 1 モル £ K 0 H - 0. 0 7 % E I P— 0. 0 1 モル Z ^ C a C ^ 2 水溶液の混液 2 0 〃 ^ を加え、 3 7でに 1 0分間保持した。 これを被検液とした。
そして、 上記被検液を実施例 1 の場合と同様の手段によりェ ン ドトキシンを測定した。
実施例 2において ト リ トン X— 1 0 0の濃度を種々変化させ た場合の測定結果を、 実施例 1 の場合と同様にエン ドトキシン を添加しない比較例ならびに P R P試料の代わりに生理食塩水 を用い、 前処理液の代りに注射用蒸留水を使用した対照例とと もに第 2表に示す。
なお、 測定結果は実施例 1 と同様にエン ド トキシンを加えな い比較例については波長 5 5 0 - 6 3 0 nmで測定した吸光度を 示し、 エン ドトキシンを添加した実施例については対照例の測 定値を 1 0 0 とした場合の検出率 （％) を示した。
第 2 表
Figure imgf000011_0001
J
傲 卜* l卜干 -t.ノノ
(¾) (ェンドトキシン無添加） 添加検出率 (.%)
0.00 0.025 19
0.04 0.026 85
PR P 0.06 0.028 100
(+ェン ドトキシン） 0.08 0.029 100
+ ト リ 卜ン X— 1 0 0 0.10 0.028 100
+ E I P 0.12 0.029 100
O
+ KOH 0.16 0.026 64
+ C a C 0.24 0.026 41
0.32 0.026 25
0.40 0.025 8 対 照 例 0.00 0.025 100
'第 2表によれば、 ト リ トン X— 1 0 0力 0、 即ち ト リ トン X - 1 0 0を加えない場合はェン ドトキシン検出率が非常に低い c これに対して例えば 0. 0 6〜0. 1 2 %程度の濃度を有する ト リ ト ン X— 1 0 0を含む混液を用いて P R P試料を処理したもの はエン ドトキシン添加検出率も 1 0 0 %であった。
従って、 予め定めた適正な濃度を有する界面活性剤 （ ト リ ト ン X— 1 0 0 ) と 0. 0 8モル K O H - 0. 0 5 6 % E I P 一 0. 0 0 8モル/ C a C ^ 2 水溶液の混液 （ P R P処理時 の濃度） を用いるこ とによって、 リムルステス ト偽陽性因子な らびに測定阻害因子が完全に変性された条件下で、 P R P試料 中のエン ドトキシンの真の値を正確且つ高い信頼性を以て検出 測定することが可能であることが判る。
実施例 3
実施例 1 と同様の手段により調製した P R P試料 1 9 0 / ^ に 1 O pgのエン ドトキシン調製品 E. coli UKT- B を含有する水 溶液 1 0 / を添加した後、 その 5 ^をトキシぺッ トプレー ト 9 6 Fにとり、 0. 1 % ト リ ト ン X— 1 0 0 — 0. 1 モル/ ^ K O H- 0. 0 7 M E I P - 0. 0 1 モル Z C a C 2 混液 20 〃 を加え、 3 7 °Cにおいて所定の時間だけ保持し、 被検液と した。
そして、 上記被検液を実施例 1 の場合と同様の手段によりェ ン ドトキシンを測定した。 - 実施例 3の各加温時間についての測定結果を実施例 1 の場合 と同様にェン ド トキシンを添加しない比較例ならびに P R P試 料の代わりに生理食塩水を用い、 前処理液の代わりに注射用蒸 留水を使用した対照例とともに第 3表に示す。 第 3 表 被 検 液 加温時間 吸 光 度 エン ドトキシン
(分） (ェンドトキシン無添加） 添加検出率 (％)
PRP 0 0.025 12
(十ェン ドトキシン） 5 0.026 94
+ ト リ トン X— 1 0 0 10 0.028 100
+ E I P 15 0.029 100
+ KOH 20 0.028 100
+ C a C 2 30 0.029 71 対 照 例 0.025 100
第 3表によると、 加温時間 0即ち、 該前処理用混液で処理し た後、 直ちに被検液とした場合にはエン ドトキシンの検出率は 非常に低い。 これに対して例えば 5分以上の加温時間を経たも のを使用すればリムルステス ト偽陽性因子ならびに阻害因子も 完全に変性した条件下で P R P中のェン ドトキシンの真の値を 正確且つ高い信頼度を以て再現性よく検出することが可能であ ることが明らかである。
実施例 4
実施例 1 と同様の手段により調製した P R P試料 1 9 0 PL £ に 4 0 pgのエン ド トキシン調製品 E. coli 0111: B4を含有する 水溶液 1 0 ^を添加した後、 その 5 をトキシペッ トプレ ー ト 9 6 Fにとり、 0. 1 %ト リ ト ン X— 1 0 0— 0. 1モル KOH- 0.0 7 %E I P - 0.0 1モル/^ C a C 2 水溶液 の混液 2 0 ^を加え、 所定の温度において 1 0分間保持し、 被検液とした。
そして、 上記被検液を実施例 1 の場合と同様の手段によりェ ン ドトキシンを測定した。
実施例 4の各加温温度についての測定結果を実施例 1 の場合 と同様にェン ドトキシンを無添加とした比較例ならびに PR P 試料の代わりに生理食塩水を用い、 前処理液の代わりに注射用 蒸留水を使用した対照例とともに第 4表に示す。 第 4 表 被 検 液 処理温度 吸 光 度 ェンドトキ、 、 ,
(で） (ェンドトキシン無添加） 添加検出率 (％)
PRP 4 0.026 22
(+ェン ドトキシン） 20 0, 029 85
+ 卜リ 卜ン X— 1 0 0 25 0.029 91
C
+ E I P 37 0.030 100
+ KOH 45 0.031 100
+ C a C 2 56 0.031 100
70 0.027 82 対 照 例 0.025 100
第 4表によれば、 処理温度が 4 °Cの場合にはェン ドトキシン の検出率が低かったが、 3 7 °C以上になるとリムルステス ト偽 陽性因子ならびに反応阻害因子も完全に変性した条件下で P R P中のェン'ドトキシンの真の値を正確且つ高い信頼度を以て再 現性よく検出することが可能であることが明らかである。
実施例 5
健常人より血液 1 当たりへパリ ンを 5ュニッ ト添加して採 血した血液 を 1 , 0 0 0 x g、 1 0分間遠心分離して、 貧 血小板血漿 （ P P P ) を得た。
この P P P試料 1 9 0 ^に 4 0 pgの E. co l i 01 1 1 : B4ェン ドトキシンを含有する水溶液 10〃 を添加した後、 その 5 ^ を トキシペッ トプレー ト 9 6 Fにとり、 0〜1. 0 % (重量/容 量） の範囲内で選択された所定量のポリオキシエチレンソルビ タンモノラウレー トからなるツイ ーン 2 0 (商品名、 和光純薬 工業株式会社販売） を含有する 0· 1 モル K 0 H - 0. 1 %
(重量ノ容量） ヒスタ ミ ン二塩酸塩— 0. 0 1 モル Z _β CaC 2 水溶液の混液 2 0 ^を加え、 3 7 に 1 0分間保持し、 被検 液とした。
そして、 実施例 1 の場合と同様の手段によりエン ドトキシン を測定した。
実施例 5 におけるツイ一ン 2 0 の各濃度についての測定結果 を実施例 1 の場合と同様にェン ドトキシンを添加しない比較例 ならびに P P P試料の代わりに生理食塩水を用い、 前処理液の 代わりに注射用蒸留水を使用した対照例とともに第 5表に示す, 第 5 表 被 検 液 ツイ一ン 2 0 吸 光 度 エン ドトキシン
濃度 （%) (ェンドトキシン無添加） 添加検出率 (％)
P P P 0.00 0.025 19
(+ェン ドトキシン） 0.08 0.026 57
+ツイーン 2 0 0.16 0.028 84
+ヒスタミンニ塩酸塩 0.24 0.029 95
CJ1
+ KOH 0.32 0.028 100
+ C a C 0.40 0.029 100
0.60 0.026 55
0.80 0.026 0 対 照 例 0.00 0.025 100
第 5表によれば、 予め定めた適正な濃度を有する界面活性剤 (ツイ 一ン 2 0 ) を用いるこ とによって、 リ ムルステス ト偽陽 性因子ならびに反応阻害因子が完全に変性した条件下で、 PPP 試料中のェン ドトキシンの真の値を正確且つ高い信頼性を以て 検出測定することが可能であることが判る。 一方、 ツイーン 20 を全く添加しない 0. 0 8モル/^ K〇 H— 0. 0 8 %ヒスタ ミ ンニ塩酸塩— 0. 0 0 8モル C a C £ 2 混液による処理を 行なつただけのものは明らかにェン ドトキシンの検出率が低い ことが判る。
実施例 6
実施例 5 と同様の手段により調製した P P P試料 1 9 0 ^ に 4 0 pgのェン ドトキシン調製品 E. coli 0111: B4を含有する 水溶液 1 0 / ^を添加した後、 その 5 をトキシペッ トプレ ー ト 9 6 Fにとり、 0〜1. 0 % (重量 Z容量） の範囲内で選択 された所定量の ドデシル硫酸ナ ト リ ウム （ S D S ) を含有する 0. 1 モル K O H - 0. 0 5 % (重量/容量） ε —ポリ 一 L — リ ジン塩酸塩 （分子量 2， 0 0 0〜4 , 0 0 0、 和光純薬ェ 業㈱販売） - 0. 0 1 モルハ C a C £ 2 水溶液の混液 2 0 〃 を加え、 3 7でに 1 0分間保持し、 被検液とした。
そして、 実施例 1 の場合と同様の手段によりエン ドトキシン を測定した。
実施例 6における S D Sの各濃度に、ついての測定結果を実施 例 1 の場合と同様にェン ドトキシンを添加しない比較例ならび に P P P試料の代わりに生理食塩水を用い、 前処理液の代わり に注射用蒸留水を使用した対照例とともに第 6表に示す。 第 6 表 被 検 液 SDS濃度 吸 光 度 エン ドトキシン
(%) (ェンドトキシン無添加） 添加検出率 (%)
0.00 0.025 20
PP P 0.08 0.025 45
(+エン ドトキシン） 0.16 0.027 87
+ SDS 0.24 0.030 100
+ポリ— L—リジン塩酸塩 0.32 0.030 100
+ KOH 0.40 0.030 90
+ C a C 0.60 0.027 22
0.80 0.026 0 対 照 例 0.00 0.025 100
第 6表によれば、 予め定めた適正な濃度を有する界面活性剤 ( S D S ) を用いることによって、 リムルステス ト偽陽性因子 ならびに反応阻害因子が完全に変性した条件下で、 P P P試料 中のエン ドトキシンの真の値を正確且つ高い信頼性を以て検出 測定することが可能であることが判る。
実施例 7
健常人より抗凝固剤を入れないで採血した血液 3 τηβを 4でに 1 時間静置した後、 1， 0 0 0 x g、 1 0分間遠心分離して血 清を得た。
この血清試料 1 9 0 / に 4 0 pgのェン ドトキシン調製品 E. coli 0111： B4 を含有する水溶液 1 0 // ^を添加した後、 その 5 〃 ^を トキシペッ トプレー ト 9 6 Fにとり、 0〜1. 0 % (重 量 Z容量） の範囲内で選択された所定量の n—ォクチル— 3— D—グルコビラノ シドを含有する 0. 1 モル/^ K O H-0.07 % E I P— 0. 0 1 モル Z ^ C a C 2 水溶液の混液 20 を 加え、 3 7 °Cに 1 0分間保持し、 被検液とした。
そして、 実施例 1 の場合と同様の手段によりエン ド トキシン を測定した。
実施例 7における n—ォクチルグルコシドの各濃度について の測定結果を実施例 1 の場合と同様にェン ドトキシンを添加し ない比較例ならびに血清試料の代わりに生理食塩水を用い、 前 処理液の代わりに注射用蒸留水を使用した対照例とともに第 7 表に示す。
被 検 液 n—ォクチルグルコシド 吸 光 度 エンドトキシン
濃度 ) (ェンドトキシン無添加） 添加検出率 (%)
0.00 0.026 20
血清 0.08 0.026 65
(+エンドトキシン） 0.16 0.029 82
+ η—ォクチルグルコシド 0.24 0.029 100
CO
+ Ε I Ρ 0.32 0.029 100
+ ΚΟΗ 0.40 0.029 84
+ C a C 0.60 0.026 36
0.80 0.026 2 対 照 例 0.00 0.025 100
第 7表によれば、 予め定めた適正な濃度を有する界面活性剤 ( n—ォクチルグルコシ ド） を用いることによって、 リ ムルス テス ト偽陽性因子ならびに反応阻害因子が完全に変性した条件 下で、 血清試料中のェン ドトキシンの真の値を正確且つ高い信 頼性を以て検出測定することが可能であることが判る。
実施例 8
種々 の実験動物 [マウス （ICR, male), ラ ッ ト （Wistar, male) 、 モルモッ ト （Hartley, male). ゥサギ （JW， male) 、 ィ ヌ （Beagle, male) ] より実施例 1 と同様に抗凝固剤 （へパ リ ン） を添加して採血して得た PR Pを試料とする。
この P R P試料 1 9 0 / に 4 0 pgのェン ドトキシン調製品 E. coli 0111: B4を含有する水溶液 1 0 を添加した後、 そ の 5 ^を トキシぺッ トプレー ト 9 6 Fにとり、 0. 1 %ト リ ト ン X— 1 0 0— 0. 1モル Z £ KOH- 0.0 7 %E I P -0.01 モル/^ C a C ^ 2 水溶液の混液 2 0 _gを加え、 3 7でに 1 0分間保持し、 被検液とした。
そして、 実施例 1の場合と同様の手段によりエン ド トキシン を測定した。
測定結果を実施例 1の場合と同様にェン ドトキシンを添加し ない比較例ならびに P R P試料の代わりに生理食塩水を用い、 前処理液の代わりに注射用蒸留水を使用した対照例とともに第 8表に示す。 第 8 表 被 検 液 吸 光 度 検 出 率 )
(PRP) (ェンドトキシン無添加） (ェンドトキシン添加）
PRP マウス 0.029 100
(+ェン ドトキシン） ラッ 卜 0.028 99
+ トリ トン X— 1 0 0 モルモッ ト 0.029 100
+ Ε I Ρ ゥサギ 0.031 99
+ ΚΟΗ ィヌ 0.031 99
+ C a C 対 照 例 - 0.025 100
第 8表によれば、 いずれの動物もほぼ 1 0 0 %の検出率を示 した。
このように検体量に制限のある各種小動物を含めた実験動物 においても良好な成績が得られたことは迅速性、 簡便性に加え て検体処理の特殊性においても顕著な改善点であることが理解 できる。
実施例 9
ト リ ト ン X— 1 0 0、 K〇 H、 E I P及び C a C ^ 2 をそれ ぞれ 0. 1 %、 0. 1 モル £、 0. 0 7 %、 0. 0 1 モル の水溶 液となるように混合した。 また、 0〜 0 6モル ^の範囲内 で選択された所定量の N， N—ビス （ 2 —ヒ ドロキシェチル） グリ シン （ビシン ； ド—タイ ト試薬の 1種の商品名 ； 和光純薬 工業販売） をも含有する混合水溶液を調製した。 以上の混合水 溶液を氷冷下に所定時間保持した。 第 9表にビジンの濃度を種 々変化させた場合の本実施例による観察結果をビシンが無添加 である比較例の観察結果とともに示す。
第 9 表 被 検 液 ビシン濃度 2時間後の濁りの有無
(モル z^)
+ 卜リ 卜ン X— 1 0 0 0.000 + +
+ E I P 0.005 + CO
+ KOH 0.010 + GO
+ C a C 0.020
+ビシン 0.048 変化なし + ：やや白濁 + + ：白濁
第 9表によれば、 ト リ ト ン X— 1 0 0、 K〇 H、 E I Pおよ び C a C _g 2 を所定量混合した水溶液を氷冷下で 2時間放置し ておく と、 ビシンの添加なしでは白濁して均一な採取が不可能 となる。 これに対してビシンを添加しておく とその濁りの生成 が抑えられるようになり、 特に 0. 0 2 モル/ 以上では 2時間 後でも透明なままであり、 均一な採取が可能であることが判る c 実施例 1 0
実施例 1 と同様の手段により調製した P R P試料 1 9 0 £ に 4 0 pgのェン ドトキシン調製品 E. co l i 0111： B4を含有する 水溶液 1 0 ^ を添加した後、 その 5 〃 _gをトキシペッ トプレ — ト 9 6 Fにと り、 0. 1 % ト リ ト ン X— 1 0 0— 0. 1 モル/ K〇 H — 0. 0 3 モル Z ビシン一 0. 0 7 % E I P — 0. 0 1 モル / £ C a C 2 水溶液の混液 （あらかじめ混合し、 氷冷下に 2時間放置しておいたもの） 2 0 を加え、 3 7。Cに 1 0分 間保持し、 被検液とした。
そして、 実施例 1 の場合と同様の手段によりエン ドトキシン を測定した。
測定結果を実施例 1 の場合と同様にェン ドトキシ ンを添加し ない比較例ならびに P R P試料の代わりに生理食塩水を用い、 前処理液の代わりに注射用蒸留水を使用した対照例とともに第 1 0表に示す。 第 1 0 表 被 検 液 放置時間 吸 光 度 ェンドトキシン
(時） (ェンドトキシン無添加） 添加検出率 (％)
PRP 0 0.029 100
(+エン ドトキシン） 2 0.029 100
+ ト リ トン X— 1 0 0
CJ1
+ Ε I Ρ
+ ΚΟΗ
+ C a C
+ビシン ' 対 照 例 0.025 100
第 1 0表によれば、 ト リ トン X— 1 0 0、 K 0 H、 E I P、 C a C 2 およびビシ ンを所定量混合した水溶液を直ちに使用 した場合でも、 氷冷下に 2時間放置後使用した場合でも、 ほぼ 1 0 0 %のエン ドトキシ ンの検出率を示した。 したがって、 ビ シンの適当量の添加は処理液の濁りを抑え、 安定性を高めるこ とが判る。
実施例 1 1
実施例 1 と同様の手段により調製した P R P試料 1 9 0 u £ に 4 0 pgのェン ドトキシ ン調製品 E. co l i 01 1 1： B4を含有する 水溶液 1 0 を添加した後、 その 5 ^を トキシぺッ トプレ — ト 9 6 Fにと り、 0. 1 % ト リ ト ン X— 1 0 0 — 0. 1 モル/ 水酸化ナ ト リ ウム （ N a 〇 H ) — 0. 0 3 モル Z ビシン 一 0. 0 7 % E I P - 0. 0 1 モル Z C a C 2 水溶液の混液お よびあらかじめ混合し、 氷冷下に 2時間放置しておいた混液の 各 2 0 ^を加え、 3 7 °Cに 1 0分間保持し、 被検液とした。
そして、 実施例 1 の場合と同様の手段によ りェン ドトキシン を測定した。
測定結果を実施例 1 の場合と同様にェン ド トキシンを添加し ない比較例ならびに P R P試料の代わりに生理食塩水を用い、 前処理液の代わりに注射用蒸留水を使用した対照例とともに第 1 1表に示す。 1 1 表 被 検 液 放置時間 吸 光 度 ェンド卜キ 'ソ、ノ
(時） (ェン ドトキシン無添加） 添加検出率 (％)
PRP 0 0.028 92
(+エン ドトキシン） 0.028 91
+トリ 卜ン X— 1 0 0
+ E I P
+ N a OH
+ C a C 2
+ビシン ' 対 照 例 0.025 100
実施例 1 2
実施例 1 と同様の手段により調製した P R P試料 1 9 0 _ί に 4 0 pgのェン ドトキシン調製品 E. coli 0111： B4を含有する 水溶液 1 0 〃 ^を添加した後、 その 5 〃 ^をトキシペッ トプレ — ト 9 6 Fにとり、 0. 1 % ト リ ト ン X— 1 0 0 — 0. 1 モルノ K 0 H - 0. 0 3モル ビシン 一 0. 0 7 % E I P - 0. 0 2モル / H 塩化マグネシウム （M g C ^ 2 ) 水溶液の混液およびあ らかじめ混合し、 氷冷下に 2時間放置しておいた混液の各 2 0 ^を加え、 3 7 °Cに 1 0分間保持し、 被検液とした。
そして、 実施例 1 の場合と同様の手段によりエン ドトキシン を測定した。
測定結果を実施例 1 の場合と同様にエン ドトキシンを添加し ない比較例ならびに P R P試料の代わりに生理食塩水を用い、 前処理液の代わりに注射用蒸留水を使用した対照例とともに第 1 2表に示す。
1 2 表 被 検 液 放置時間 吸 光 度 ェンド卜キシン
(時） (ェン ドトキシン無添加） 添加検出率（％)
PRP 0 0.027 90
(+ェン ドトキシン） 2 0.027 91
+ 卜リ トン X— 1 0 0
CO
+ E I P
+ KOH
+MgC i 2
+ビシン ' 対 照 例 0.025 100
実施例 1 3
血漿検体の測定
対象は、 健常人 3 0例およびグラム陰性菌による敗血症を疑 つた白血病等の重症血液疾患および感染を合併した肝、 胆道疾 患を有する患者の 1 0例で、 それぞれへパリ ン添加で無菌的に 採血した血液を試料として、 4でで 1 5 0 £、 1 0分間遠心 して P R Pを得た。 その 5 / / ^をトキシペッ トプレー ト 9 6 F にと り、 0. 1 % ト リ ト ン X— 1 0 0 — 0. 1 モル Z K 0 H - 0.03モルノ ^ ビシン 一 0.07% E I P— 0.01モル C a C £ 2 水溶液混液 2 0 2 を加え、 3 7 °Cに 1 0分間保持し、 被検液 とした。
そして、 実施例 1 の場合と同様の手段によりエン ドトキシン を測定した。
第 1 3表に本実施例の結果を、 別に作成した検量線より E. col i 0111: B4 ェン ドトキシン換算量として表わした。
第 1 3表
Figure imgf000033_0001
第 1 3表の患者 1 〜 1 0 は、 血培、 白血球数その他の検査成 績および発熱等の臨床症状からグラム陰性菌敗血症の疑いあり と診断された症例であり、 本発明方法においては、 全例高濃度 のェン ド トキシンが検出された （健常人 3 0例 ： 2. 2 ± 1. 6 p g / ηβ ) 。 従って、 本発明方法は通常の検査法では確定診断がき わめて困難なグラム陰性菌敗血症の迅速診断法としてきわめて 有力な手法として評価されるものであるこ とが理解できょう。 産 業 上 の 利 用 可 能 性
本発明の混合水溶液で血漿又は血清を処理するこ とによ り、 蛋白、 脂質、 糖蛋白、 糖脂質、 血小板等に吸着したエン ド トキ シンが効率よく遊離され、 血漿および血清中のェン ド トキシン をきわめて高い検出率で効率よく測定するこ とができる。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . カブトガニ · ァメボサイ ト · ライセ一 ト成分を使用する血 漿又は血清中のェン ドトキシンの測定法において、
a ) ポリオキシエチレンエーテル類、 ポリオキシエチレンソ ルビタン類、 n—アルキルグルコビラノ シ ド類及びドデシル硫 酸塩からなる群から選択された界面活性剤、
b ) イ ミ ダゾリル基又はァ ミ ノ基を有する化合物、 及び c ) アルカ リ土類金属塩とアルカ リ金属水酸化物
の混合水溶液を血漿又は血清に添加して被検液とするこ とを特 徵とするエン ドトキシンの測定法。
2 . アルカ リ土類金属塩が、 アルカ リ土類金属と無機酸又は有 機酸との水溶性塩である請求項 1記載の測定法。
3 . アルカ リ土類金属が、 カルシウム、 マグネシウム及びス ト ロンチウムからなる群から選択された金属である請求項 2記載 の測定法。
4 . 無機酸又は有機酸が、 塩酸、 硝酸、 硫酸、 酢酸及びクェン 酸からなる群から選択された酸である請求項 2記載の測定法。
5 . 混合水溶液が N， N—ビス （ 2—ヒ ドロキシェチル） グリ シンを含有する請求項 1記載の灘定法。
6 . 前記ポリオキシエチレンエーテル類は、 ポリオキシェチレ ン一 p —夕一シャ リ一ォクチル （又はイソォクチル） フヱニル エーテル （重合度 8〜4 0 ) 、 ポリオキシエチレ ン一 4 —夕一 シャ リ ーォクチル （又はイソォクチル） シクロへキシルエーテ ル （重合度 8〜4 0 ) 、 ポリオキシエチレ ン一 p —ノニルフ エ ニルエーテル （重合度 9〜 1 5 ) 、 ポリオキシエチレンヘプ夕 メチルへキシルエーテル （重合度 1 0〜 2 0 ) 、 およびポリ オ キシエチレ ン ドデシルエーテル （重合度 1 0〜 2 9 ) からなる 群から選択され、 前記 n —アルキルグルコ ビラノ シ ド類は、 n 一 （ヘプチル、 ォクチル、 ノニル、 デシル及び ドデシ几） a - D—グルコ ビラノ シ ド及び n — (ヘプチル、 ォクチル、 ノニル、 デシル及び ドデシル） /3 _ D—グルコ ピラノ シ ドからなる群か ら選択され、 前記ポリオキシエチレンソルビタ ン類は、 ポリ オ キシエチレンソルビ夕 ン （重合度約 2 0 ) のモノ ラウ レー ト、 モノパルミ テー ト、 モノ ステアレー ト、 モノォレエー ト及び ト リオレエー トからなる群から選択され、 前記 ドデシル硫酸塩は、 ドデシル硫酸ナ ト リ ウム、 ドデシル硫酸リ チウム、 及び ドデシ ル硫酸力ルシゥ厶からなる群から選択され、 前記イ ミ ダゾリ ル 基又はアミ ノ基を有する化合物は、 ヒスタ ミ ン二塩酸塩、 L— ヒスチジン二塩酸塩、 ポ リ 一 L 一 ヒスチジン塩酸塩 （分子量 1 5 , 0 0 0〜 5 0， 0 0 0 ) 、 ポリ — L— リ ジン塩酸塩 （分 子量 2， 0 0 0〜 7 0 , 0 0 0 ) 、 ポリ 一 L—ァルギニン塩酸 塩 （分子量 5， 0 0 0〜 1 5 0 , 0 0 0 ) 、 ポリエチレ ン イ ミ ン （分子量 1， 0 0 0〜 7 0， 0 0 0 ) 、 アデニン塩酸塩、 及 びシ ト シン塩酸塩からなる群から選択されるこ とを特徴とする 請求項 1 記載の測定法。
7. 前記混合水溶液は、 前記界面活性.剤が、 0. 0 4〜 0. 4 0 % (重量 Z容量） 、 前記ィ ミ ダゾリ ル基又はァ ミ ノ基を有す る化合物が、 0. 0 3〜 0. 3 % (重量 Z容量） 、 アルカ リ土 類金属塩が 0. 0 0 5〜 0. 0 5 モル リ ッ トル及びアルカ リ 金属水酸化物が 0. 0 5〜 0. 5 モル Zリ ッ トルであるこ とを 特徴とする請求項 1記載の測定法。
8 . 前記 N , N - ビス （ 2 — ヒ ドロキシェチル） グリ シンは、 前記混合水溶液に 0 . 0 0 5〜 0 . 0 5 モル Zリ ッ トル添加さ れるこ とを特徴とする請求項 5記載の測定法。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0569033A2 (en) * 1992-05-08 1993-11-10 Seikagaku Kogyo Kabushiki Kaisha (Seikagaku Corporation) Pretreating reagent, method and kit and method of diagnosing infectious diseases
US6103377A (en) * 1996-06-27 2000-08-15 Clausi; Robert N. Method of molding powdered plant fiber into high density materials

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2737514B2 (ja) * 1992-01-24 1998-04-08 和光純薬工業株式会社 エンドトキシン測定用試料の前処理方法
JP3242733B2 (ja) * 1993-02-26 2001-12-25 生化学工業株式会社 エンドトキシン特異的測定剤
JP3429036B2 (ja) * 1993-09-30 2003-07-22 生化学工業株式会社 エンドトキシンの特異的測定剤
WO1995014932A1 (fr) * 1993-11-22 1995-06-01 Seikagaku Corporation Procede de dosage d'une substance reagissant avec un reactif de limulus
US5648230A (en) * 1994-06-30 1997-07-15 Seikagaku Kogyo Kabushiki Kaisha (Seikagaku Corporation) Endotoxin stabilizing agent, endotoxin composition and method for assaying endotoxin
DE69734046T2 (de) * 1996-10-21 2006-06-14 Seikagaku Kogyo Co Ltd Verfahren zur Bestimmung von Endotoxin
WO2005024050A1 (en) * 2003-09-10 2005-03-17 Antibodyshop A/S Analytical methods for determination of proteolytic cleavage at specific sites
US7638340B2 (en) 2005-06-22 2009-12-29 Seikagu Corporation Method of eliminating reactivity of lipoarabinomannan and application of the same
EP2940468B1 (en) * 2012-12-28 2019-04-17 Seikagaku Corporation Pre-treatment agent and pre-treatment method for antithrombin iii to be subjected to limulus test
TR201816369T4 (tr) * 2015-07-28 2018-11-21 Forschungszentrum Borstel Leibniz Lungenzentrum Endotoksin tayinine yönelik iyileştirilmiş bakteriyel endotoksin testi.
CN112462076B (zh) * 2020-11-12 2022-10-18 天津华龛生物科技有限公司 应用于微载体的内毒素含量的检测方法
CN112462015B (zh) * 2020-11-18 2022-07-12 海南倍特药业有限公司 一种氢溴酸瑞马唑仑细菌内毒素的检测方法
CN113607525B (zh) * 2021-08-09 2024-06-14 安徽信灵检验医学科技股份有限公司 一种用于血液消解的真空采血管添加剂及其制备方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5551340A (en) * 1978-10-06 1980-04-15 Baxter Travenol Lab Method of measuring concentration of endotoxin by comparison of turbidity
JPS5742851A (en) * 1980-06-27 1982-03-10 Mallinckrodt Chemical Works Production of dissolvent for deformed cell of horseshoe crab

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4096091A (en) * 1974-07-17 1978-06-20 Baxter Travenol Laboratories, Inc. Limulus lysate having improved capacity to precipitate in the presence of low endotoxin concentrations, and reconstituting solutions therefor
US4276050A (en) * 1980-01-10 1981-06-30 Abbott Laboratories Method for systemic endotoxin detection
US4322217A (en) * 1980-06-27 1982-03-30 Mallinckrodt, Inc. Process for preparing Limulus lysate
US4406832A (en) * 1981-09-03 1983-09-27 Mallinckrodt, Inc. Peptide-type substrates useful in the quantitative determination of endotoxin
JPS5885162A (ja) * 1981-11-16 1983-05-21 Seikagaku Kogyo Co Ltd エンドトキシン測定法
US4808314A (en) * 1987-09-18 1989-02-28 Scripps Clinic And Research Foundation Method for reducing bacterial endotoxin contamination in solutions of macromolecules

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5551340A (en) * 1978-10-06 1980-04-15 Baxter Travenol Lab Method of measuring concentration of endotoxin by comparison of turbidity
JPS5742851A (en) * 1980-06-27 1982-03-10 Mallinckrodt Chemical Works Production of dissolvent for deformed cell of horseshoe crab

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP0513361A4 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0569033A2 (en) * 1992-05-08 1993-11-10 Seikagaku Kogyo Kabushiki Kaisha (Seikagaku Corporation) Pretreating reagent, method and kit and method of diagnosing infectious diseases
EP0569033A3 (ja) * 1992-05-08 1994-04-06 Seikagaku Kogyo Co Ltd
US5389547A (en) * 1992-05-08 1995-02-14 Seikagaku Kogyo Kabushiki Kaisha (Seikagaku Corporation) Pretreating reagent, pretreatment method, assay with pretreated samples, assay kit and method of diagnosing infectious diseases
US6103377A (en) * 1996-06-27 2000-08-15 Clausi; Robert N. Method of molding powdered plant fiber into high density materials

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Publication number Publication date
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