FI108612B - Menetelmä endotoksiinin uuttamiseksi - Google Patents

Description

108612

Menetelmä endotoksiinin uuttamiseksi

Keksinnön tausta Tämän keksinnön kohteena on menetelmä kiinteän ai-5 neen pinnalle kiinnittyneen tai absorboituneen endotoksiinin uuttamiseksi. Keksinnön kohteena on myös vähintään yhtä albumiinia tai globuliinia sisältävän liuoksen käyttö.

Endotoksiinit ovat lipopolysakkarideja, joita esiintyy pääosin gram-negatiivisten bakteerien soluseinis-10 sä ja ne ovat tunnettuja pyrogeeneinä. Täten endotoksiini-pitoisuuden määrittäminen näytteestä on tärkeä määritys lääketieteen, farmakologian ja mikrobiologian aloilla.

Mitä tulee lääketieteellisiin laitteisiin, kuten ruiskuihin ja katetreihin, jotta estettäisiin pyrogeenien 15 pääsy ihmiskehoihin, on tarpeellista kontrolloida hyvin tarkasti endotoksiineista aiheutuvaa kontaminaatiota. Monet lääketieteelliset laitteet valmistetaan erilaisista synteettisistä hartseista, lasista, metalleista ja luonnonkuiduista. Näistä materiaaleista tiedetään joidenkin 20 adsorboivan endotoksiinia. Jotta pystyttäisiin mittaamaan , näiden aineiden endotoksiinikontaminaatioaste, nämä aineet ;··’ huuhdellaan tavallisesti vedellä tai fysiologisella suola- « > · ’· " liuoksella pinnalle kiinnittyneen endotoksiinin uuttami- V.’ seksi. Sitten uutteessa oleva endotoksiinimäärä mitataan.

;,· · 25 Edellä mainitun menetelmän mukaisesti on olemassa pelko : siitä, että kiinteiden aineiden pintoihin adsorboitunutta :*·*; tai kiinnittynyttä endotoksiinia ei saada kokonaan uutet tua, mikä johtaa endotoksiinin, joka ei ole uuttunut ve-teen tai fysiologiseen suolaliuokseen, uuttumiseen vereen ... 30 ja lääkkeisiin joutuessaan kosketukseen niiden kanssa.

*!* Täten on erittäin haluttua aikaansaada menetelmä endotoksiinin uuttamiseksi tehokkaasti kiinteiden aineiden *:·: pinnoilta ja menetelmä tällaisten materiaalien tarkan en- j dotoksiinikontaminaatioasteen määrittämiseksi. Samanaikai- I : : ' 35 sesti on myös hyvin haluttua aikaansaada menetelmä, joka 2 108612 tehokkaasti puhdistaa säiliöt ja laitteistot, jotka ovat kontaminoituneet endotoksiinilla.

Keksinnön yhteenveto Tämän keksinnön kohteena on menetelmä kiinteän ai-5 neen pinnalle kiinnittyneen tai absorboituneen endotoksii-nin uuttamiseksi. Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista se, että saatetaan kiinteä aine kosketukseen liuoksen kanssa, joka sisältää ainakin yhtä albumiinia ja globuliinia, kiinteän aineen pinnan puhdistamiseksi sekä 10 se, että saatetaan kiinteä aine kosketukseen liuoksen kanssa, joka sisältää vähintään yhtä albumiinia ja globuliinia kiinteän aineen pinnan kontaminaatioasteen määrittämiseksi. Keksinnön kohteena on myös vähintään yhtä albumiinia tai globuliinia sisältävän liuoksen käyttö.

15 Lisäksi tässä kuvataan puhdistusmenetelmä, joka käsittää säiliön tai laitteiston, jotka ovat kontaminoituneet endotoksiinilla, puhdistamisen käyttäen liuosta, jossa on vähintään yhtä albumiinia tai globuliinia.

Tässä kuvataan myös uuttoliuos endotoksiinin, joka 20 on kiinnittynyt tai adsorboitunut kiinteän aineen pinnalle, uuttamiseksi, joka liuos sisältää ainakin yhtä albu-miinia tai globuliinia.

*. Tässä kuvataan myös puhdistusaine säiliön tai ·,·,· laitteen puhdistamiseksi, joka puhdistusaine sisältää vä- jtj j 25 hintään yhtä albumiinia tai globuliinia.

:*·,· Lyhyt kuvaus piirroksista

Liitetty piirros on kaavio, jossa esitetään endo- toksiinimäärän muutos esimerkistä 1 saadussa suodoksessa.

,,,,: Edullisten suoritusmuotojen kuvaus • * ... 30 Tämän hakijat ovat tehokkaasti tutkineet, miten ;* uutetaan tehokkaasti endotoksiini, joka on kiinnittynyt :/.· tai adsorboitunut kiinteän aineen pinnalle, ja havainneet, ·;·*: että kun käytetään liuosta, joka sisältää albumiinia ja/ tai globuliinia, erityisesti liuosta, joka sisältää albu-35 miinia, kiinteän aineen pinnalle kiinnittynyt tai adsor- i 108612 3 hoitunut endotoksiini, jota ei ole saatu uutetuksi vedellä tai fysiologisella suolaliuoksella, voidaan uuttaa hyvin suurella tehokkuudella. Täten on tämä keksintö aikaansaatu.

5 Uuttoliuoksena, joka sisältää vähintään yhtä albu miinia tai globuliinia, voidaan myös käyttää vesipitoista liuosta tai puskuriliuosta, joka sisältää ainakin yhtä albumiinia tai globuliinia; veriplasmaa ja seerumia, joka sisältää proteiinipääaineosina albumiinia ja globuliinia. 10 Veriplasmana tai seerumina voidaan käyttää selkä rankaisista eläimistä jne. saatua veriplasmaa tai seerumia.

Albumiinina ja/tai globuliinina voidaan käyttää niitä, jotka on saatu puhdistamalla tai osittain puhdista-15 maila proteiiniaineosat, joita on veriplasmassa tai seerumissa.

Uuttoliuoksena, joka sisältää albumiinia ja/tai globuliinia, käytettynä tässä keksinnössä (ja johon viitataan tämän jälkeen "uuttoliuoksena"), voidaan käyttää ei 20 ainoastaan erityisesti valmistettuja vaan myös kaupallisesti saatavissa olevia, kuten tuoretta plasmaa ja tuoret-. ta jäädytettyä ihmisen veriplasmaa, jota on kaupallisesti : saatavissa Japanese Red Cross Societystä; terapeuttista ihmisen plasmaproteiinijaetta ja ihmisen seerumialbumii- • 25 nia, joita on kaupallisesti saatavissa kohteista Nihon T Pharmaceutical Co., Ltd., Rorer Group Inc., Armour Bio-

Chemicals Co., Cutter Biological Co., Baxter Travenol • Laboratories, Inc., The Green Cross Corp. ja Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute; ihmisen immunoglobuliinia, • 30 jota on kaupallisesti saatavissa kohteista Takeda Chemical

Industries, Ltd., Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd., The ; Green Cross Corp., Hoechst AG, Japanese Red Cross Society ^ ja Fujirebio Inc.; naudan sikiöseerumia, jota on kaupalli- > t sesti saatavissa kohteista Whittaker Corp., Hyclone Labor- 4 108612 atories, Inc., Gibco Laboratories, Life Technologies, Inc., ja Boehringer Mannheim GmbH; ja vastaavia.

Näistä liuoksista, jotka sisältävät albumiinia ja/tai globuliinia, edullisin on vesipitoinen liuos, joka 5 sisältää ihmisen seerumialbumiinia (ja joihin viitataan tämän jälkeen "HSA-liuoksena").

Tämän keksinnön mukaisesti uutettu endotoksiini-määrä kiinteän aineen pinnalta, johon endotoksiini on kiinnittynyt tai johon endotoksiini on adsorboitunut, voi-10 daan määrittää tavallisilla menetelmillä, esimerkiksi Li-mulus-koemenetelmällä, käyttäen äyriäisen (horseshoe crab) punasolulysaattia (johon viitataan tämän jälkeen "AL- liuoksena"). Täten säiliöiden ja laitteiden jne. kontaminoi-tumisaste voidaan määrittää tarkasti.

15 On tarpeetonta todeta, että liuoksen, joka sisäl tää albumiinia ja/tai globuliinia, ei tulisi sisältää en-dotoksiinia määrinä, jotka vaikuttavat tulosten määrittämiseen .

Tämän saavuttamiseksi on tarpeellista käyttää al-20 bumiinin ja/tai globuliinin liuosta, joka on valittu eristä, jotka eivät sisällä endotoksiinia määränä, joka häi-ritsee mittauksia. Kun käytetään albumiinin ja/tai globu- ·. ·: liinin liuosta, joka sisältää endotoksiinia, on tarpeen • · poistaa endotoksiini käyttäen endotoksiiniadsorbenttia tai : * * : : : 25 autoklaavia ennen määrittämistä.

IM · ;*·,· Tavallisesti käytetyt autoklaavin käyttöolosuhteet ovat esimerkiksi 121 °C:n lämpötila n. 15 - 120 minuuttia.

Endotoksiiniadsorbenttina voidaan käyttää kantoai-( . netta kiinnittyneenä polymyksiini B:n kanssa, kantoainet- ... 30 ta, joka on kiinnittynyt histidiiniin jne. Kaupallisesti ·;* saatavissa olevia adsorbentte j ä ovat Detoxi-Gel (valmistaja Pierce), Affi-Prep Polymyxin (valmistaja Bio- ·;··· Rad Laboratories, Inc.), Pyrosep (valmistaja Tanabe Seiya- ku Co., Ltd.) jne.

'*, 35 Albumiinin ja/tai globuliinin pitoisuus uuttoliu- oksessa vaihtelee hiukan riippuen käytetyistä liuoksista, 5 i 108612 erien erilaisuudesta tai endotoksiinin kiinnittymis- tai adsorbtioasteesta säiliöissä, laitteissa ja vastaavissa, mutta on tavallisesti proteiinipitoisuutena 0,0001 mg/ml tai enemmän. Tapauksessa, jossa määritetään endotoksiini-5 määrä, joka on kiinnittynyt tai adsorboitunut kiinteiden aineiden, kuten säiliöiden, laitteiden jne. pinnoille, uuttamisen jälkeen, pitoisuus on edullisesti n. 0,0001 -6,00 mg/ml, edullisemmin n. 0,02 - 3,0 mg/ml proteiinipitoisuuksina. Esimerkiksi tapauksessa, jossa käytetään ih-10 misen seerumialbumiiniliuosta uuttavana liuoksena, pitoisuus on tavallisesti 0,0001 % paino/tilavuus, tai enemmän, edullisesti n. 0,0001 - 0,5 % paino/tilav. (proteiinipitoisuus: n. 0,001 - 6,00 mg/ml) erityisesti tapauksessa, jossa määritetään endotoksiinimäärä uuttamisen jälkeen, 15 edullisemmin n. 0,002 - 0,25 % paino/tilav. (proteiinisi-sältö: n. 0,02 - 3,00 mg/ml). Tapauksessa, jossa käytetään ihmisen plasmaliuosta uuttoliuoksena, pitoisuus on proteiinipitoisuutena 0,0001 mg/ml tai enemmän, edullisesti n. 0,0001 - 1,0 mg/ml, erityisesti tapauksessa, jossa mää-20 ritetään endotoksiinimäärä uuttamisen jälkeen, edullisemmin n. 0,1 - 0,5 mg/ml.

Kun uuttomenetelmällä saatu uute altistetaan nk. Limulus-kokeelle käyttäen AL-liuosta endotoksiinipitoisuu-den määrittämiseksi, on suotavaa saada tarkka määritysarvo ; 25 ilman mitään ongelmia.

' ; Uuttoliuoksena voidaan käyttää myös ihmisen seeru- mialbumiini (HSA) -liuosta, ihmisen plasmaliuosta, ihmisen ’ seerumiliuosta, naudan sikiöseerumiliuosta, naudan seeru- mialbumiini (BSA) -liuosta, globuliiniliuosta jne. Kun 30 proteiinipitoisuus näissä uuttoliuoksissa muodostuu kor-keaksi, tapahtuu inhibitio endotoksiinin määrityksessä Limulus-kokeella uuttamisen jälkeen, mikä antaa alhaisempia arvoja kuin oikeat arvot. Täten, määritettäessä endo- j : . toksiinimäärä, joka on kiinnittynyt tai adsorboitunut 35 kiinteiden aineiden, kuten säiliöiden ja laitteiden pin- 6 108612 noille, liuoksen käyttö, jolla on korkea proteiinipitoisuus, ei ole suotavaa. Edellä mainittu edullinen pitoi-suusalue albumiini- ja/tai globuliiniliuokselle, erityisesti yläraja, määritetään ottaen huomioon edellä mainittu 5 tosiasia. Kun albumiini- ja/tai globuliiniliuosta käytetään pelkästään puhdistamiseen tai uuttamiseen, ei esiinny lainkaan ongelmia käytettäessä liuosta, jolla on korkea proteiinipitoisuus. Uuttoliuoksen pitoisuus, joka aiheuttaa häiriöitä määrityksessä Limulus-kokeella, vaihtelee 10 huomattavasti, riippuen käytetyistä uuttoliuoksista. HSA-liuoksen tapauksessa tällainen häiriö tapahtuu proteiinipitoisuuksilla n. 6,0 mg/ml. Ihmisen plasman tapauksessa | tällainen häiriö tapahtuu proteiinipitoisuuksilla n. 1 ' mg/ml.

15 AL-liuoksena, jota käytetään endotoksiinimäärän määrittämisessä Limulus-kokeella uutetussa liuoksessa, joka on saatu tämän keksinnön uuttomenetelmällä, voidaan käyttää niitä, jotka on uutettu äyriäisen punasoluista, jotka kuuluvat Limulus-sukuun, Tachypleus-sukuun tai Car-20 cinoscorpius-sukuun ja jotka reagoivat endotoksiinin tai β-l,3-glukaanin kanssa läpikäyden koagulaatioreaktion. On tietenkin mahdollista käyttää AL-liuosta, joka on valmis-ν'; tettu AL-liuosten kylmäkuivatuista tuotteista, joita on *, ·, · kaupallisesti saatavissa esimerkiksi kohteista Associates ; 25 of Cape Cod Inc. (ACC) , Whittaker Bioproducts, Inc., En- dosafe Inc., Seikagaku Corp., Wako Pure Chemical Indust- t t ries, Ltd. jne.

t t i r t

Limulus-kokeena endotoksiinimäärän määrittämiseksi . uutteessa, joka on saatu tämän keksinnön uuttomenetelmäl- tilli ' -> f \ 30 lä, voidaan käyttää tavallisesti käytettyjä menetelmiä, esimerkiksi geeli-hyytymämenetelmää, väriä muodostavaa me-! ’.! netelmää, kineettisyys-sameusmenetelmää jne., joita on ku- *:· · vattu esim. julkaisussa FDA Guide Line [suuntaviiva Limu- lus amebalysaatti -kokeen arvioimiseksi lopputuote-35 endotoksiinikokeena ihmisen ja eläimen ruoansulatuskanavan

I i t I I

I 7 108612 ulkopuolisille lääkkeille, biologisille tuotteille ja lääketieteellisille laitteille, Food ja Drug Adm. (1987)].

Kun käytetään tässä kuvattua uuttoliuosta, kiinte-älle pinnalle adsorboitunut tai kiinnittynyt endotoksiini 5 voidaan uuttaa tehokkaasti. Täten tässä kuvattua uuttoliuosta voidaan käyttää puhdistusaineena säiliöiden ja laitteiden jne. puhdistamiseksi, jotka ovat kontaminoituneet endotoksiinilla.

Säiliöinä ja laitteina jne. puhdistettavaksi käyt-10 täen uuttoliuosta, on olemassa monia lääketieteellisiä i ; laitteita, kuten kertakäyttöneuloja, kertakäyttöruiskuja, kertakäyttöverenantopakkauksia, kertakäyttöinfuusiopakka-uksia, kertakäyttöisiä verta kerääviä laitteistoja, happi-pumppukertakäyttölaitteistoja, keinotekoisia verisuonia 15 lääketieteellistä käyttöä varten, keinotekoisia sydämen tahdistimia, dialysaattoreita, kuten myös kokeellisia ker-takäyttölaitteistoja, joita käytetään endotoksiinin määrittämisessä (steriloidut pipetit, steriilit koeputket jne.).

20 Tätä keksintöä kuvataan yksityiskohtaisesti viita ten seuraaviin esimerkkeihin, joissa kaikki prosentit ovat M·’ painon mukaan, jollei toisin ilmoiteta.

V': Esimerkki 1

Reagenssit : : : 25 (1) Endotoksiiniliuos E. coli -referenssi endotoksiini (standardi endo- 1 toksiini, joka on eritelty japanilaisessa farmakopeassa, lipopolysakkaridi, joka on johdettu E. coli UKT-B . kannasta, joka sisältää endotoksiinia, joka vastaa 16 000 ... 30 EU/ampulli) valinnaisesti laimennettuna vedellä injektiota ·;·’ varten.

> * β 108612 (2) AL-liuos

Limulus ES -koe Wako (valmistaja Wako Pure Chemical

Industries, Ltd.) (3) HSA-liuos 5 25-%:inen HSA-liuos (valmistaja Cutter Biological, injektiota varten) laimennettiin vedellä injektiota varten l-%:iseksi ja pidettiin autoklaavissa 121 °C:ssa 20 minuuttia. Varmistettiin, että liuos ei sisältänyt mitään havaittavaa endotoksiinia ennen käyttöä.

10 Menetelmät Käyttäen Minisarts NML (valmistaja Sartrius), joka on suodatusyksikkö injektioruiskulle selluloosa-asetaat-tisuodattimella, suodatettiin 10 ml vettä injektiota varten. Sitten suodatettiin 10 ml l-%:ista HSA-liuosta, minkä 15 jälkeen suodatettiin 10 ml vettä injektiota varten HSA:n huuhtomiseksi suodattimesta. Saadut suodokset jaettiin 2 ml:n määriksi, vastaavasti. Käyttäen Minisartsia esi-puhdistuksen jälkeen 5 ml endotoksiiniliuosta (1,0 EU/ml) suodatettiin endotoksiinin adsorboimiseksi suodattimelle. 20 Tämän jälkeen 50 ml vettä injektiota varten ja 25 ml l-%:ista HSA-liuosta suodatettiin, tässä järjestyksessä.

. ; : Suodokset jaettiin 5 ml:n määriksi, vastaavasti. Endotok- : siinipitoisuus jaetuissa suodoksissa määritettiin käyttäen

Toxinometer ET-201 (valmistaja Wako Pure Chemical Indus-; 25 tries, Ltd.). Määritysmenetelmät olivat seuraavat.

0,1 ml:aan AL-liuosta lisättiin 0,1 ml näytettä ja sekoitettiin. Sitten määritettiin aika, joka tarvittiin '·’ transmitanssin vähentämiseksi edellä kuvatulle liuokselle 5-%:iseksi (tämän jälkeen "Tg") 37 °C:ssa. Toisaalta endo-'"· 30 toksiiniliuokset, joilla oli eri pitoisuuksia, valmistet- ‘iti: tiin käyttäen vettä injektiota varten ja endotoksiiniliuos : näytteinä altistettiin samalle määritykselle, kuten edellä ! on mainittu, antamaan kalibrointikäyrä, josta nähdään en- . dotoksiinipitoisuuden ja Tg:n välinen suhde.

35 Perustuen kalibrointikäyrään laskettiin endotoksiini nipitoisuus näytteessä.

9 108612

Tulokset

Tulokset on esitetty kaaviossa 1, josta nähdään endotoksiinimäärien muutos suodoksissa.

Kaaviossa 1 WFI tarkoittaa vettä injektiota varten, 5 HSA tarkoittaa l-%:ista ihmisen seerumialbumiiniliuosta ja RSE on endotoksiiniliuos (1,0 EU/ml).

Suodatettaessa vettä injektiota varten havaittiin pieni määrä endotoksiinia alkuvaiheen suodoksessa. Jatkettaessa tislatun veden suodattamista injektiota varten ei 10 havaittu mitään endotoksiinia suodoksessa. Kun l-%:inen HSA-liuos suodatettiin tässä tilassa, endotoksiinia havaittiin suodoksessa. Tulokset osoittavat, että endotoksiini alunperin kiinnittyy tai adsorboituu Minisartseihin, mainittua endotoksiinia ei saatu uutettua vedellä injek-15 tiota varten, mutta saatiin uutettua l-%:isella HSA-liuok-sella.

Tämän jälkeen, kun taas suodatettiin vesi injektiota varten, endotoksiinia havaittiin jälleen suodoksessa. Vaikuttaa siltä, että endotoksiini, joka on kiinnittynyt 20 tai adsorboitunut Minisarts-suodattimeen ja on liukenematon veteen injektiota varten, muuttuu liukoiseksi HSA-. : : liuoksen ansiosta ja vapautuu suodattimen pinnasta veteen :*·.· injektiota varten.

*.. Sitten endotoksiiniliuos suodatettiin ja tämän jäl- ; 25 keen suodatettiin vesi injektiota varten. Sen jälkeen kun havaittava endotoksiini oli hävinnyt suodoksesta, l-%:inen HSA-liuos suodatettiin, jolloin havaittiin suuri määrä en-’ dotoksiinia. Nämä tulokset osoittavat, että kun endotoksiiniliuos suodatettiin Minisartseilla, osa endotoksiinis- 30 ta kiinnittyi tai adsorboitui suodattimeen eikä sitä saatu uutettua riittävästi vedellä injektiota varten, mutta voi-; daan uuttaa l-%:isella HSA-liuoksella.

Kuten edeltävistä tuloksista on selvää, endotoksii- i i ni, joka kiinnittyy tai adsorboituu kiinteän aineen pin- 108612 : ίο nalle ja jota ei voi uuttaa tislatulla vedellä injektiota varten, voidaan uuttaa l-%:isella HSA-liuoksella.

Esimerkki 2 Reagenssit 5 (1) Endotoksiiniliuos

Sama, jota käytettiin esimerkissä 1.

(2) AL-liuos

Sama, jota käytettiin esimerkissä 1.

(3) HSA-liuos 10 Sama, jota käytettiin esimerkissä 1.

(4) NaCl-liuos

Fysiologinen suolaliuos injektiota varten (valmistaja Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) (5) Plasxnanaattiliuos 15 Plasmanaatti (valmistaja Cutter Biological, tera peuttinen ihmisen plasma) laimennettiin vedellä injektiota varten 10-kertaisesti ja pidettiin autoklaavissa 121 °C:ssa 20 minuuttia.

(6) NatriumdeoksIkolaatti (DOC) -liuos 20 DOC (valmistaja Wako Pure Chemical Industries, . Ltd., biokemiaa varten) laimennettiin vedellä injektiota ’···’ varten l-%:isen liuoksen valmistamiseksi. l-%:ista liuosta • · • » « pidettiin autoklaavissa 121 °C:ssa 20 minuuttia, mitä seu- • t ·,·.· rasi laimentaminen 0,01-% : iseksi .

• · 25 (7) Natriumdodekyylisulfaatti (SDS) -liuos : ·.: SDS (valmistaja Wako Pure Chemical Industries, • ·

Ltd., biokemiaa varten) liuotettiin veteen injektiota var- ten l-%:isen liuoksen valmistamiseksi. l-%:ista liuosta >>>; pidettiin autoklaavissa 121 °C:ssa 20 minuuttia, mitä seu- • » ... 30 rasi laimentaminen 0,01-% : iseksi .

» | 'C Reagensseja (3) - (7) käytettiin, kun oli varmis- • t’·! tettu, ettei esiintynyt havaittavia määriä endotoksiinia.

Menetelmät

Sen jälkeen kun Minisarts NML oli puhdistettu 2 35 ml :11a l-%:ista HSA-liuosta ja 20 ml :11a vettä injektiota i 11 108612 varten, 5 ml endotoksiiniliuosta (1,0 EU/ml) suodatettiin. Sitten, käyttäen vettä injektiota varten, suodattaminen toteutettiin, kunnes suodoksessa ei enää havaittu endotok-siinia. Sitten, käyttäen 3 ml kutakin HSA-liuosta, NaCl-5 liuosta, plasmanaattiliuosta, DOC-liuosta tai SDS-liuosta uuttavana liuoksena, suodattaminen toteutettiin. Endotok-siinipitoisuus kussakin uuttoliuoksen suodoksessa määritettiin samalla tavalla kuin esimerkissä 1 on kuvattu.

Tulokset 10 Endotoksiinin määrä kussakin uuttoliuoksen suodok sessa on esitetty taulukossa 1. Kuten selvästi nähdään taulukosta 1, endotoksiinia havaitaan kaikissa uuttoliuos-ten suodoksissa, mutta havaittu määrä endotoksiinia on erityisen suuri HSA-liuoksessa ja plasmanaattiliuoksessa.

15 Edellä mainituista tuloksista on selvää, että tämän keksinnön HSA-liuos ja plasmanaattiliuos ovat erityisen erinomaisia uutto-ominaisuuksiltaan verrattuna muihin en-dotoksiiniuuttoliuoksiin.

20 Taulukko 1

Uuttoliuos Endotoksiinipitoisuus (%)* , HSA-liuos 68,7 y. NaCl-liuos 16,8 : 25 plasmanaattiliuos 39,5 ; DOC-liuos 11,1 SDS-liuos 18,4

Huomautus) * Määrä endotoksiinia, kiinnittyneenä tai adsorboituneena suodattimeen (määrä, joka on saatu vähentä- 30 mällä endotoksiinimäärä endotoksiiniliuoksessa suodattami-sen jälkeen endotoksiinimäärästä endotoksiiniliuoksessa ennen suodattamista), otettiin 100 %:ksi.

12 108612

Esimerkki 3

Reagenssit (1) Endotoksiiniliuos ! Sama, jota käytettiin esimerkissä 1.

5 (2) AL-liuos

Sama, jota käytettiin esimerkissä 1.

(3) HSA-liuos 2-%:inen HSA-liuos valmistettiin samalla tavalla kuin esimerkissä 1 on kuvattu.

10 Menetelmät 10 polypropyleenistä valmistettua steriiliä seeru-miputkea (valmistaja Corning Glass Works, 2 ml:n tilavuus) ! panostettiin 1,0 ml:11a vettä injektiota varten, vastaa vasti. Sekoittamisen jälkeen otettiin ulos 0,2 ml liuosta 15 käytettäväksi uuttonäytteenä käyttäen vettä injektiota varten uuttoliuoksena. Jokaiseen seerumiputkeen lisättiin 0,8 ml 2-%:ista HSA-liuosta ja ravisteltiin antamaan uut-tonäyte käyttäen l-%:sta HSA-liuosta. Endotoksiinipitoi-suus kussakin uuttonäytteessä määritettiin samalla tavalla 20 kuin esimerkissä 1 on kuvattu.

Tulokset , : : Endotoksiinimäärä kussakin uuttonäytteessä on esi- j tetty taulukossa 2.

! 1 · V. Kuten selvästi nähdään taulukosta 2, endotoksiinia j : ,·, 25 ei ole saatu uutettua vedellä injektiota varten, tai mikä- ; ; li on saatu, pieninä määrinä, mutta kun HSA-liuosta käy- tettiin, endotoksiini saatiin uutettua huomattavasti suurempina määrinä.

i > i 1 · t » i i 108612 13

Taulukko 2

Uutettu näyte

Seerumi- ! ! .

., . __ Vesi injektiota varten HSA-liuos piitKi niro . .

5 ___(EU/ml)__(EU/ml)_ 1 Ei havaittu Ei havaittu_ 2 Ei havaittu 0,015 _3__0,004__0,013_ _4__Ei havaittu_ I_0,005_ 10 _5__u___0,003_ _6__"__Ei havaittu_ _7__0,010__0,027_ _8__0,006__0,073_ 15 9 Ei havaittu__0,004_ 10 Ei havaittu Ei havaittu

Esimerkki 4 Reagenssit 20 (1) Endotoksiiniliuos

Sama, jota käytettiin esimerkissä 1.

(2) AL-liuos t * · ,·. : Sama, jota käytettiin esimerkissä 1.

(3) HSA-liuos ; ! 25 Sama, jota käytettiin esimerkissä 2.

i : : .*

Menetelmät ; / Lasiseen koeputkeen, jossa oli kuusi kertakäyttö neulaa (valmistaja Japan Medical Supply Co., koko 22 G) ja 10 ml endotoksiiniliuosta (0,1 EU/ml) ja 10 ml l-%:ista ! 30 HSA-liuosta, jossa oli 0,1 EU/ml ja lisättiin endotoksii- nia ja sekoitettiin endotoksiinimäärien määrittämiseksi yksittäisissä liuoksissa samalla tavalla kuin esimerkissä ! 1 on kuvattu.

Negatiivisina kontrolleina ne koeputket, jotka ei-35 vät sisältäneet kertakäyttöneuloja, määritettiin, vastaa- 108612 14 ! vasti. Pitäen saatua arvoa 100-%:isena, määritettiin endo-toksiinin talteenotto kertakäyttöneulojen tapauksessa. Tulokset

Endotoksiinin talteenotto kussakin liuoksessa on 5 esitetty taulukossa 3. Kun HSA-liuosta ei ollut läsnä, endotoksiinin talteenotto aleni niin paljon kuin 10 %:ksi kertakäyttöneulojen läsnä ollessa. Mutta kun HSA-liuosta oli läsnä, miltei mitään kertakäytöneulojen aiheuttamaa vaikutusta ei havaittu.

10 Kuten edeltävistä tuloksista on ilmeistä, HSA-liuos on tehokas endotoksiinin uuttamiseksi kertakäyttöneuloista.

Taulukko 3 15 Näyte Endotoksiinin talteenotto | (%) HSA-liuos, joka sisältää endotoksiinia 86 endotoksiinin vesipitoinen liuos 10 20

Esimerkki 5 Reagenssit (1) Endotoksiiniliuos

Sama, jota käytettiin esimerkissä 1.

,·, 25 (2) AL-liuos . ! Limulus ameebalysaatti (valmistaja Wako Pure Chemi- ! cal Industries, Ltd., merkitty herkkyys: 0,25 EU/ml, 5 ml:lie) muodostettiin uudestaan 5 ml:11a puskuriliuosta Limulus ES Test Wako uudelleenmuodostamiseksi (valmistaja 30 Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) ja käytettiin AL-liuoksena.

(3) Globuliiniliuos ; Ihmisen immunoglobuliini-injektiota varten (gamma- globuliini-Nichiyaku, Co., sisältäen 15 % IgG) laimennet-• 35 tiin 0,5-%:iseksi ja kuumennettiin 65 °C:ssa 20 minuuttia.

15 108612

Immunoglobuliini-injektiota varten valittiin erästä, joka oli vapaa havaittavasta endotoksiinista.

Menetelmät

Endotoksiini kiinnitettiin tai adsorboitiin Mini-5 sarts NML:lie samalla tavalla kuin esimerkissä 1 on kuvattu. Sen jälkeen kun vettä injektiota varten oli suodatettu, kunnes ei havaittu mitään endotoksiinia saadussa suo-doksessa, 5 ml 0,5-%:ista globuliiniliuosta suodatettiin. Endotoksiinimäärä suodoksessa määritettiin käyttäen Toxi-10 nometer ET-201 (valmistaja Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) samalla tavalla kuin esimerkissä 1 on kuvattu. Tulokset

Endotoksiinipitoisuudet globuliinisuodoksissa on esitetty taulukossa 4.

15 Kuten taulukosta 4 selvästi nähdään, joitakin endo- toksiineja, jotka ovat kiinnittyneet tai adsorboituneet Minisartsiin, ei saada uutettua vedellä injektiota varten, mutta saadaan uutettua globuliiniliuoksella. Täten globu-liiniliuos on tehokas endotoksiinin uuttamiseksi.

20

Taulukko 4 , : : Minisarts nro Endotoksiinipitoisuus :' -, · globuliinisuodoksessa V. (EU/ml) 25 1 0,12 : 2 0,09 3 0,10 > * »

Esimerkki 6 > ♦ » 30 Reagenssit ’ (1) Endotoksiiniliuos : Sama, jota käytettiin esimerkissä 1 (2) AL-liuos » . Limulus ameebalysaatti (valmistaja Wako Pure Chemi- . 35 cal Industries, Ltd., geeliytymisherkkyys: 0,06 EU/ml), 108612 I 16 muodostettiin uudestaan 2,0 ml :11a vettä ja käytetiin AL-liuoksena.

(3) HSA-liuos ; 25-%:inen HSA-liuos (valmistaja Cutter Biological, j 5 injektiota varten) laimennettiin vedellä injektiota varten l-%:iseksi ja pidettiin autoklaavissa 121 °C:ssa 20 minuuttia. Varmistettiin, ettei liuos sisältänyt mitään havaittavia määriä endotoksiinia ennen käyttöä.

(4) Naudan sikiöseerumi 10 Naudan sikiöseerumia (valmistaja Whittaker Biopro- duct, Inc.) 50 ml: n määränä laimennettiin vedellä 10-kertaisesti ja kuumennettiin 100 °C:ssa 10 minuuttia vesi-hauteessa .

(5) Ihmisplasma 15 Yhdistetyt ihmisplasmat laimennettiin vedellä in- ; jektiota varten 10-kertaisesti ja kuumennettiin 100 °C:ssa 10 minuuttia vesihauteessa.

(6) Globuliiniliuos

Gammaglubuliini (naudan Cohn-jae 11,111) 5 g:n 20 määränä säädettiin 0,2-%:iseksi, pidettiin autoklaavissa . 120 °C:ssa 20 minuuttia ja laimennettiin endotoksiiniva- • · · ! I”. paalia vedellä 0,l-%:iseksi.

» a · ·'· Menetelmät » · « i '*.* Kuhunkin kertakäyttöiseen steriiliin polypropylee- • · i.i S 25 niputkeen (Fakon 2059) lisättiin 2,0 μΐ endotoksiiniliuos- ta (25 EU/ml, joka sisälsi 6,25 % etanolia) ja kuivattiin : : .* yön yli (15 tuntia) huoneenlämpötilassa. Putkia käytettiin endotoksiinin määritysputkina.

Koenäytteet (HSA-liuos, naudan sikiöseerumiliuos, /*’. 30 ihmisen plasmaliuos, globuliiniliuos) laimennettiin sopi- » viksi pitoisuuksiksi ja lisättiin endotoksiinin määritys- I » putkiin määränä 1 ml kutakin liuosten uuttamiseksi 1 tun- nin aikana jatkuvasti sekoittaen. Endotoksiinipitoisuus ,··, kussakin uuttoliuoksessa määritettiin samalla tavalla kuin t · 35 esimerkissä 1 on kuvattu.

j i7 1 0861 2 f

Tulokset

Endotoksiinin talteenotto kussakin liuoksessa on esitetty taulukossa 5.

Kuten selvästi nähdään taulukosta 5, kun proteiini-5 pitoisuus on tehty samaksi (1,20 mg/ml), endotoksiinin talteenotto (%) on 109 %, 71 % ja 57 %, vastaavasti, tapauksessa, jossa käytettiin 0,l-%:ista HSA-liuosta, 32,5-kertaisesti laimennettua naudan sikiöseerumialbumiinia ja 60,8-kertaisesti laimennettua ihmisen plasmaa, tässä jär-10 jestyksessä. Tämä osoittaa, että 0,l-%:inen HSA-liuos on tehokkain endotoksiinin uuttamiseksi tässä proteiinipitoisuudessa. Lisäksi tapauksessa, jossa albumiinipitoisuus ! tehdään samaksi (1,20 mg/ml), 0,l-%:inen HSA-liuos, 22,8- kertaisesti laimennettu naudan sikiöseerumialbumiini ja 15 42,6-kertaisesti laimennettu ihmisen veriplasma, antoivat endotoksiinin talteenoton, joka oli 109 %, 59 % ja 54 %, \ vastaavasti. Tämä tarkoittaa, että naudan seerumi ja ihmi sen veriplasma osoittivat alhaisempia arvoja kuin HSA-liuos tässä albumiinipitoisuudessa. Lisäksi tapauksessa, 20 jossa vertaillaan HSA-liuosta globuliiniliuokseen, endotoksiinin talteenotto oli 106 %, kun käytettiin 0,0096-%:ista HSA-liuosta (proteiinipitoisuus: 0,115 mg/ ml), kun taas endotoksiinin talteenotto oli 51 %, kun käy-:; tettiin 0,1-%:ista globuliiniliuosta (proteiinipitoisuus: : 25 0,115 mg/ml). Tämä osoittaa myös sen, että HSA-liuos on , ,: tehokkaampi kuin globuliiniliuos tällä proteiinipitoisuu della.

* * ie 10861 2

Taulukko 5

Uuttoliuos Proteiini- Albumiini- Endotoksiinin pitoisuus pitoisuus talteenotto (%) (mg/ml) (mg/ml) (viiden toiston 5 keskiarvo) endotoks i ini- vapaa vesi - - 34 0,0096-%:inen HSA-liuos 0,115 0,115 106 10 0,l-%:inen HSA-liuos 1,20 1,20 109 i 22,8 kertai sesti laimen- I nettu naudan f j 15 sikiöseerumi 1,71 1,20 59 32,5 kertaisesti laimen- ' nettu naudan sikiöseerumi 1,20 0,84 71 20 42,6 kertai sesti laimen-. i : nettu ihmisen • ·,* veriplasma 1,71 1,20 54 60,8 kertai- ; 25 sesti laimen-

* * I

( ; nettu ihmisen veriplasma 1,20 0,84 57 0,l-%:inen glo- buliiniliuos 0,115 - 51 30

Esimerkki 7 HSA-liuosten pitoisuudet Reagenssit (1) Endotoksiiniliuos 35 Sama, jota käytettiin esimerkissä 1.

108612 (2) AL-liuos

Sama, jota käytettiin esimerkissä 6.

(3) HSA-liuos 25-%:inen HSA-liuos (valmistaja Cutter Biological, 5 injektiota varten) laimennettiin tislatulla vedellä injektiota varten l-%:iseksi ja pidettiin autoklaavissa 121 °C:ssa 20 minuuttia. Varmistettiin, että liuos ei sisältänyt mitään havaittavia määriä endotoksiinia ennen käyttöä. Sitten saatu liuos laimennettiin endotoksiiniva-! 10 paalia vedellä.

Menetelmät

Samat kuin esimerkissä 6.

Tulokset

Taulukosta 6 nähdään endotoksiinin talteenotto HSA-15 liuoksilla, joilla on vaihtelevia pitoisuuksia.

Kuten selvästi nähdään taulukosta 6, HSA-liuos on tehokas endotoksiinin uuttamiseksi jopa niinkin alhaisissa pitoisuuksissa kuin 0,0001 %. Toisaalta, kun HSA pitoisuutta nostetaan, endotoksiinin talteenotto näyttää alene-20 van ensisilmäyksellä, mutta tämä johtuu edellä mainitusta HSA-liuoksen, jolla on korkeampi proteiinipitoisuus, inhi- . ;(i bitiosta määritettäessä endotoksiini Limulus-kokeella.

•' ,I Tämä ei tarkoita, että uuttokyky olisi alentunut.

i i t t t i · * II» I > < »Il » ' » » • » » i I 20 10861 2 j

Taulukko 6

Endotoksiinin

Uuttoliuos Proteiini talteenotto (%) i (mg/ml) (viiden toiston 5 talteenotto)

Endotoksiinivapaa vesi - _47_ 0,0001% HSA-liuos__0,0012__60_ 0,001% HSA-liuos__0,012__70_ 10 0,002% HSA-liuos__0,024__85_ 0,0039% HSA-liuos__0,047__108_ 0,0078% HSA-liuos__0,094__105_ 0,0156% HSA-liuos__0,187__107_ 0,0313% HSA-liuos__0,374__105_ 15 0,0625% HSA-liuos__0,749__97_ 0,125% HSA-liuos__1,50__99_ 0,25% HSA-liuos__3,00__84_ 0,5% HSA-liuos' _6,00_ 7 2 20 1,0% HSA-liuos_ 12,00 _54_

Esimerkki 8

Ihmisen plasmaliuoksen pitoisuus Reagenssit » · : 25 (1) Endotoksiiniliuos » · :/·· Sama, jota on käytetty esimerkissä 1.

(2) AL-liuos

Sama, jota on käytetty esimerkissä 6.

(3) Ihmisen plasmaliuos ,···, 30 Ihmisen plasma laimennettiin endotoksiinivapaalla vedellä 10 kertaisesti, kuumennettiin 100 °C:ssa 10 mi-nuuttia vesihauteessa ja laimennettiin endotoksiinivapaal- la vedellä.

Menetelmät 35 Samat kuin esimerkissä 6.

i 2i 1 0861 2

Tulokset

Taulukosta 7 nähdään endotoksilnin talteenotto Ihmisen plasmaliuoksista, joilla on monia pitoisuuksia. Kuten selvästi nähdään taulukosta 7, ihmisen plasmaliuos on 5 mitä tehokkain uuttamaan endotoksiini pitoisuudella, joka saadaan 320-kertaisella laimennuksella. Alentamalla pitoisuutta endotoksiinin uuttokyky alenee asteittain. Koska inhibitiota tapahtuu myös ihmisen plasmaliuoksen tapauksessa, jolla on korkeampi proteiinipitoisuus, endotoksii-10 nin määrittämisessä uutteessa, talteenottoarvo alenee, kuten taulukosta 7 nähdään, mutta tämä ei tarkoita endotoksiinin uuttokyvyn alenemista.

Taulukko 7 15 ____

Endotoksiinin

Uuttoliuos Proteiini talteenotto (%) (mg/ml) (neljän toiston keskiarvo).

Endotoksiinivapaa vesi — 39 20 Ihmisen plasmaliuos 0^008 70 (laimennus) 10240 rkertainen_ [__ ,,V 5960 -kertainen 0 f 015 70 2560 -kertainen I 0,031 1_74_ ••V 25 1280 -kertainen 0,062 _82_ : 640 -kertainen 1 0,123 1_87_ '* "· 320 -kertainen _0,247__94_ : 160 -kertainen 0,493 81_ 80 -kertainen_ 0,988 62 30 40 -kertainen _1,975__50_ 20 -kertainen___3,95__42_ ·,'* 10 -kertainen 7,90__30_ „ 108612 22

Kuten edellä on mainittu, tämän keksinnön mukaisesti endotoksiini, joka on kiinnittynyt tai adsorboitunut kiinteiden aineiden, kuten säiliöiden, laitteiden jne. pinnoille, voidaan tehokkaasti uuttaa. Lisäksi tämän kek-5 sinnön mukaisesti endotoksiini, joka on vaikeasti tai tuskin ollenkaan uutettavissa tavallisilla uuttomenetelmillä, voidaan helposti ja tehokkaasti uuttaa.

I t

Claims (15)

23 1 0861 2 !

1. Menetelmä kiinteän aineen pinnalle kiinnitty- 1 neen tai absorboituneen endotoksiinin uuttamiseksi, tun- 5 nettu siitä, että saatetaan kiinteä aine kosketukseen liuoksen kanssa, joka sisältää ainakin yhtä albumiinia ja globuliinia, kiinteän aineen pinnan puhdistamiseksi.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että liuos sisältää ainakin yhtä al- 10 bumiinia ja globuliinia proteiinipitoisuutena 0,0001 mg/ml tai enemmän.

3. Minkä tahansa edellisistä patenttivaatimuksista mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että liuoksena oleva endotoksiini on poistettu autoklavoimalla tai käyt- ! 15 täen endotoksiiniadsorbenttiä ennen käyttöä.

4. Menetelmä kiinteän aineen pinnalle kiinnittyneen tai adsorboituneen endotoksiinin uuttamiseksi, tunnettu siitä, että saatetaan kiinteä aine kosketukseen liuoksen kanssa, joka sisältää vähintään yhtä albu-20 miinia ja globuliinia kiinteän aineen pinnan kontaminaa-. tioasteen määrittämiseksi.

5. Minkä tahansa edeltävän patenttivaatimuksen mu-'· kainen menetelmä, tunnettu siitä, että liuos sisältää albumiinia. ·,· · 25

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, :_*.: tunnettu siitä, että albumiini on ihmisen seerumialbu- miini.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ihmisen seerumialmbumiinia on * * • ..§ 30 määränä 0, 0001 - 0,5 % paino/tilav.

" 8. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, :,'*j tunnettu siitä, että liuos, joka sisältää albumiinia, on plasmaliuos tai seerumiliuos.

>··, 9. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-8 mukai- ", 35 nen menetelmä, jossa pinta on säiliö tai laite, joka on 108612 kontaminoitunut endotoksiinilla, tunnettu siitä, että huuhdellaan säiliöt tai laitteet liuoksella.

10. Vähintään yhtä albumiinia tai globuliinia sisältävän liuoksen käyttö endotoksiinin uuttamiseksi kiin- 5 teältä pinnalta.

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että liuos sisältää albumiinia.

12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että albumiini on ihmisen seerumialbumiini.

13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen käyttö, tun nettu siitä, että ihmisen seerumialbumiinia on määränä 0,0001 - 0,5 % paino/tilav.

14. Patenttivaatimuksen 11 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että liuos, joka sisältää albumiinia, on 15 plasmaliuos tai seerumiliuos.

15. Minkä tahansa edeltävän patenttivaatimuksen 10 - 14 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että käyttö on käyttö puhdistusaineena endotoksiinilla kontaminoituneiden laitteiden puhdistamiseksi. * » * 108612