WO1991018101A1 - Procede de production d'une proteine - Google Patents

Description

明 TO 蛋 白 質 の 製 造 法

[発明 の背景 ]

産業上の利用分野

本発明 は、 い わ ゆ る シ グナルぺプチ ドを コ 一 ドす る

D N A配列お よ びそ れを利用 し た蛋 白質の遺伝子工学的 な製造法に関す る 。 よ り 詳細 に は、 バチ ルス · ブ レ ビス ( Baci l lus brevis) を宿主 と し て用 い る 蛋 白 質の製造 法お よ びそれに必要な D N A配列 に関す る 。

従来の技術 と そ の課題

組換え D N A技術を用 い て異種蛋 白質を微生物等で生 産 さ せ る 方法 は、 現在医薬品な どの製造で多 く 用 い ら れ て い る 手法であ る 。

大腸菌 は こ の様な方法に宿主 と し て最 も 一般的 に用 い ら れて い る も のであ る が、 大腸菌な どで は通常、 産生 さ れた異種蛋 白質 は細胞内 に留 る 。 従 っ て異種蛋 白質の精 製の た め に は、 菌体を破壊 し 多 く の大腸菌由来の 蛋 白質 等を取 り 除 く 必要があ る 。 ま た 、 限 ら れた細胞内で多量 に産生 さ れた異種蛋 白質は多 く の場合封入体を形成 し て し ま い 、 こ の異種蛋 白 質. 活性を再生 さ せ る た め に は し ば し ば多 く の労力 を必要 と す る 。

他方、 枯草菌、 酵母な どを宿主 と し て用 い た系で は、 産生 さ れた異種蛋 白質が一般 に宿主細胞外へ分泌 さ れて そ の 回収が容易であ る と い う 利点があ る 。 枯草菌な ど力く 宿主 と し て こ の よ う な利点を有す る の は、 宿主菌の遺伝 子が特定の遺伝情報を持 っ て いて 目 的 と す る 蛋白質をい わ ゆ る シ グ ナ ルぺプチ ド と 呼ばれ る ベプチ ド鎮の結合 し た前駆体 と し ていつ たん産生 し 、 こ れが細胞膜を通過 し て細胞外 ま た はペ リ ブ ラ ズム に 分泌 さ れ、 そ の 際 に シ グ ナ ルぺプチ ド鎖が切断 さ れて成熟蛋白質 と な る と い う 機 構 に よ る と さ れ る 。

バ チ ル ス属細菌を用 い た系の例 と し て は、 最適培養条 件下で 1 2 g/ 1 も の蛋 白質を培地中 に分泌す る バチ ルス * ブ レ ビス 4 7 ( S . Udaka. (1976 ) Agric. Biol . Chera . 40,523 -528 ; S. Miyashiro, H . Enei , K. Takinaini . Y . Hi rose , T . Tsuchida and S . Udaka( 1980 ) Agric. Biol Chem . 44 , 2297 -2308 ) を宿主 と し、 こ の菌株カ 分泌、す る 蛋 白 質の ひ と つ であ る M W P を コ ー ドす る 遺伝子の プ 口 モ ー タ ー お よ び シ グナ ルぺ プチ ド を コ一 ドす る D N A を、 ヒ ト 上皮成長因子な ど の外来性遺伝子 と連結 し 、 バ チ ノレ ス ♦ ブ レ ビ ス 4 7 に導入す る こ と に よ り 、 培地中 に 多量の外来遺伝子産物を分泌 さ せ る こ と に成功 し た例が 報告 さ れて い る （ H. Yamagata. et . al . ( 1989 ) Proc . Nat】 . Acad . Sci . USA 86,3589-3593) ₀

し 力、 し な 力《 ら 、 こ の ノ< チ ル ス ♦ ブ レ ビ ス 4 7 は、 少量 な が ら 蛋 白質分解酵素を菌体外 に分泌す る た め、 産生 さ れた外来性遺伝子産物が、 培地中で分解 さ れて し ま う と い う 可能性が存在 し た。

[発明 の概要 ]

本発明 は、 上記問題点を解.決す る こ と を 目 的 と し 、 蛋 白質分解酵素があ ま り 分泌 さ れてい な い培養初期 に分泌 さ れ る 蛋 白質 B B R P 4 2 を見出 だ し 、 こ の 蛋 白質を コ 一 ドす る 遺伝子の制御部位を利用 し た発現系を構築す る こ と に よ り 、 こ の 目 的を達成 し ょ う と す る も の であ る 。 壁 _

即 ち 、 本発明 は ま ず、 シ グナ ルペ プチ ドを コ ー ドす る D N A に関す る も のであ っ て、 下記の配列 （ I ) で実質 的 に表 さ れ る シ グナルべ プチ ドを コ 一 ドす る 塩基配列か ら な る も の 、 であ る 。

Met— Phe— Ser— Lys— Thr—し ys— Met— Gl y— Met—し eu—

Met— Gl y— Thr— Met— Al a— Val—Val—Leu— Ser— Leu— ( I )

Gl y - Ser - l i e - Gl y - Gly - Al a - Met - A

ま た本発明 は、 発現べ ク タ 一 に関す る も の で あ り 、 前 記の シ グナルぺプチ ドを コ 一 ドす る D N A と 、 そ の下流 側末端 に連結 さ れた所望の異種蛋 白質を コ ー ドす る

D N A と を組込み、 かつ、 こ れ ら外来性遺伝子の発現 に 必要な D N A を持たせた も のであ る こ と を特徴 と す る も の 、 で あ る 。

さ ら に本発明 は、 所望の 蛋 白質の製造法 に 関す る も の であ っ て、 本発明 に よ る ベ ク タ ー で宿主細胞を形質転換 し 、 該形質転換体を培養す る こ と に よ り 所望の蛋 白質を 培地中 に分泌 さ せ る こ と を特徵 と す る も の 、 であ る 。 発明 に よ る シ ダナルぺプチ ドを コ ー ドす る D N A と 所望の異種蛋 白質を コ ー ドす る D N A と を連結 さ せて 発現 さ せ る こ と に よ り 、 こ の所望の異種蛋白質を宿主細 胞外 に分泌生産 さ せ る こ と 力 で さ る

特に 、 宿主 と し てパ'チ ルス属細菌を用 い た場合、 バチ ル ス 属 由来の蛋 白質分解酵素よ り も先に所望の異種蛋 白 質が培地中 に産生 さ れ る た め、 高収率で均質な蛋 白質の 生産が可能 と な る o

[図面の簡単な説明 ]

丄 図 は、 実験例 1 で得た、 培養初期 に培地中 に分泌 さ れた蛋 白質 につ いて行 っ た S D S — ポ リ ア ク リ ルア ミ ドゲル電気泳動の結果を示す図であ る 。

第 2 図 は、 B B R P 4 2 を コ 一 ドす る 遺伝子を含む D N A 断片の制限酵素地図を示す図であ る 。

第 3 図 は実施例 3 で作成 し た " レ ー シ ョ ン ミ ユ ー タ ン 卜 の 一つであ る ρ B R E — 1 の E c o R I 力、 ら H i n d m ま での塩基配列及び B B R P 4 2 の ァ ミ ノ 酸配列を示 す図でめ る o こ こ で、 1 力、 ら 1 3塩基対お よ び 1 7 9 1 カヽ ら 1 7 9 6 塩基対ま では、 べ ク タ ー 由来の ク ロ ー ニ ン グサ イ ドを表わす。

个 1 は転写開始点を示す。 † ₂ は分泌 シ グ ナ ル （翻訳開始点） の起点であ る 。 † ₃ は B B R P 4 2 の起点であ る 。

第 4 図 は 、 発現単位ベ ク タ ー の作成の過程を示す図で め る 。

第 5 図 は 、 B. 1 icheni forniis な 一 ァ ミ ラ ー ゼ発現べ ク タ ー の構築の過程を示す図であ o

第 6 図 は、 ヒ ト 上皮成長因子発現ベ ク タ ー の構築の過 程を示す図で あ る 。

第 7 図 は 、 p A M Y — 3 に よ つ て形質転換 さ れたバチ ノレ ス · ブ レ ビ ス 4 7 が分泌す る α — ア ミ ラ ー ゼ活性の培 養時間 に よ る 変化を示す グラ フ であ る 。 図中で ー 秦 一 は

1 0 μ g / ml の エ リ ス ロ マ イ シ ン を含む Τ 2 培地、 — ▲ 一 は 2 0 〇 〃 g Z ml の エ リ ス 口 マ イ シ ン を含む Τ 2 培地 — 騸 — は 2 〇 0 ^ g Z ml の エ リ ス ロ マ イ シ ン を含む L S 培地、 — + — は 2 ◦ 0 g Z ml の エ リ ス ロ マ イ シ ン と 1 % の グノレ コ ー ス を含む L S 培地で培養 し た時の培地中 の ア ミ ラ ー ゼ活性を それぞれ示す 0

第 8 図 は、 p E G F — 2 に よ つ て形質転換 さ れたバチ ル ス ♦ ブ レ ビ ス 4 7 が分泌す る h — E G F の培養時間 に よ る 変化を示す グラ フ であ る 。

第 9 図 は、 サ ノレ の プ ロ イ ン シ ュ リ ン誘導体の ア ミ ノ 酸 配列お よ びそ の塩基配列を示す図で あ る 。

第 1 0 図 は、 p I N T 9 0 d 2 に よ っ て形質転換 さ れ た パ チ ル ス ♦ ブ レ ビ ス 4 7 力、 ら 分泌 さ れた 蛋 白質を ゥ ェ ス タ ン プテ ィ ン グに よ っ て解析 し た結果を示す図であ る レ 一 ン 1 は大腸菌で発現 さ れた サ ルの プ ロ イ ン シ ュ リ. ン誘導体、 レ ー ン 2 はバチ ノレ ス · ブ レ ビス 4 7 力、 ら 分泌 さ れた も の を調べた も のであ る 。 矢印 は プ ロ イ ン シ ユ リ ン誘導体を示す。

[発明 の具体的説明 ]

シ グナルぺ プチ ド

本発明 に よ る D N A は、 ア ミ ノ 酸配列が前記配列

( I ) で実質的 に表さ れ る シ グナルペプチ ドを コ ー ドす る 塩基配列を有す る も のであ る 。

こ の よ う に本発明 に よ る D N A は、 こ れ力く コ ー ドす る ァ ミ ノ 酸配列を有す る ぺプチ ドに よ っ て特定 さ れてい る こ のペプチ ド は、 細胞内で産生さ れた生体産物を細胞外 へ分泌 さ せ る 作用 を有 し てい る いわ ゆ る シ グナ ルぺプチ ドであ っ て、 そ の ア ミ ノ 酸配列が実質的 に前記配列

( I ) で表 さ れ る も のであ る 。 こ こ で、 「ア ミ ノ 酸配列 が実質的 に前記配列 （ I ) で表 さ れ る も の 」 と は、 こ の ぺプチ ドがい わ ゆ る シ グナルぺプチ ド と し ての作用 を有 す る 限 り ア ミ ノ 酸の 1 〜 3 個 につ い て欠失、 置換、 付加 な ど力く あ っ て も よ い こ と を意味す る 。

こ の配列 （ I ) で表 さ れる ア ミ ノ 酸配列は、 バ チ ルス ♦ ブ レ ビス 4 7 を培養 し た 際 に、 そ の培養初期 に培地に 分泌 さ れ る 蛋 白質であ る B B R P 4 2 を コ ー ドす る 遣 伝子の解析に基づ き 完成 さ れた も のであ る 。 B B R P 4 2 は、 下記の性状を有す る 新規蛋 白質であ る

① S D S — P A G E に よ っ て約 4 2 0 0 0 の分子量を 示す。

② N 末端の 4 番 目 か ら 2 0 番 目 ま での ァ ミ ノ 酸配列が 下記の通 り であ る 。

A l a—Lys—Pro—Thr—Ser—Leu—Ans—Lys-Pro—Val—G l u—Val— し ys— Phe—し ys— Thr— G 1 y

③バチ ルス · ブ レ ビス 4 7 由来の蛋 白質であ る M W P よ り も 培養初期 に培地中 に分泌 さ れ る 。

シ グナルぺプチ ドを コ一 ドす る D N A

本発明 に よ る シ グナルぺ プチ ドを コ 一 ドす る D N A は、 前記配列 （ I ) を コ ー ドす る 塩基配列を有す る も の 、 並びに前記の よ う な シ グナルぺ プチ ド と し て の作用 を有 す る ぺプチ ドの ァ ミ ノ 酸配列の変化 に対応す る 塩基配列 を有す る も のであ る 。 本発明 に よ る D N A の典型的 な 配列 は、 下記の配列 （ Π ) の も のであ る 。

ATG-TTT-AGC-AAA-ACA-AAA-ATG-GGA-ATG-CTG-

ATG-GGA-ACG-ATG-GCA-GTA -GTT-TTG-AGT-CTG- ( Π )

GGT-AGC-ATA-GGC-GGA-GCJ-ATG-GCR

( こ こ で、 J は A 又 は C を表わ し 、 K は A 又 は G を表わ す）

ぺ プチ ド の ァ ミ ノ 酸配列が与え ら れれば、 そ れを コ ー ドす る 塩基配列 は い わ ゆ る 遺伝暗号表を参照 し て容易 に 定 ま り 、 ま た前記 し た ア ミ ノ 酸配列を コ ー ドす る 種々 の 塩基配列を適宜選択す る こ と がで き る 。 従 っ て、 本発明. に よ る シ グナ ルぺプチ ドを コ 一 ドす る D N A と は、 そ の 塩基配列が前記配列 （ Π ) で あ る も の並びに そ の縮重異 性体であ る 。 こ こ で、 「縮重異性体」 と は、 縮重関係 に あ る コ ド ン が使用 さ れてい る 点以外 は塩基配列が同一で 同一のぺプチ ドを コ 一 ドす る D N A を意味す る も の と す る o

シ グナルぺプチ ドを コ - ドす る D N A の取得

本発明 に よ る D N A は、 そ の塩基配列が定ま つ てい る こ と か ら 、 そ の D N A を取得す る ひ と つ の手段は、 核酸 合成の方法 に し たが っ て製造す る こ と であ る 。

ま た本発明 に よ る D N A は、 ノ 'チ ノレス ， ブ レ ビス の遣 伝子か ら 切 り 出す方法 も 利用可能であ る 。 そ の よ う な方 法の具体例 と し て は、 バチ ルス · ブ レ ビス 4 7 由来の ゲ ノ ム ラ イ ブラ リ 一 か ら 、 遺伝子工学の分野で憤用 さ れて い る 方法、 例え ば適当 な プ ロ ー ブに よ る ハ イ プ リ ダイ セ ィ ゼイ シ ヨ ン法、 に よ り 取得す る こ と も 可能であ る 。 そ の よ う な方法の具体例 につ い て は後記実験例を参照 さ れ た い。

シ グナル _ぺプ _ドを コ 一 ドす る D N A の用途

本発明 に よ る D N A は、 シ グナルぺプチ ドを コ 一 ドす る D N A であ り 、 従 っ て こ の D N A と 、 こ の D N A の下 流側末端に連結 さ れた所望の 蛋白質を コ ー ドす る D N A と を宿主細胞内で複製可能かつ両遺伝情報が発現可能な 状態で含む D N A 、 特に発現ベ ク タ ー 、 の形態 と し て宿- 主細胞の形質転換を行え ば、 宿主細胞外 に産生蛋 白質を 得 る こ と 力くで き る 。

特 に本発明 に よ る D N A をバチ ル ス 属を宿主 と す る 宿 主 一 べ ク タ ー系 に お い て使用すべ き べ ク タ ー と し て構築 し 、 こ れに よ り バチ ノレ ス属細菌、 特 にノく チ ル ス · ブ レ ビ ス 、 を形質転換 し て利用す る の に適 し て い る 。 即 ち 、 本 発明 に よ る D N A は、 バチ ルス 属钿菌由来の蛋 白質分解 酵素が培地 に分泌 さ れ る よ り 先に、 異種蛋 白質を培地に 産生 さ せ る こ と 力 で き る 力、 ら であ る 。

本発明 に よ る 発現ベ ク タ ー

従 っ て、 本発明 に よ る 発現ベ ク タ ー は、 前記の.シ グナ ルぺプチ ドを コ 一 ドす る D N A と 、 そ の下流側末端に結 合 さ れた所望の外来性蛋 白質を コ ー ドす る D N A と を組 込み、 かつ 、 こ れ ら 外来性遺伝子の発現 に必要な D N A を持 たせた も のであ る こ と を特徵 と す る も の、 で.あ る 。

特に本発明 に よ る 発現ベ ク タ ー は、 前記 し た理由 に よ り 、 バ チ ル ス 属細菌を宿主 と す る 宿主 — ベ ク タ 一系 に お い て使用すべ き 発現べ ク タ ー と し て構築 さ れ る こ と が好 ま し い。

本発明 に よ る べ ク タ ー構築 の た め の手順な い し方法 は、 分子生物学、 生物工学な い し遺伝子工学の分野 に お い て 慣用 さ れて い る も の を用 いればよ い。 例え ば、 本発明 に よ る シ グナ ノレぺ プチ ドを コ 一 ドす る

D N A と し て、 前記 し た 蛋 白質 B B R P 4 2 由来の D N A を そ の ま ま 利用 し ょ う と す る 場合、 次の よ う な操 作に よ り 、 本発明 に よ る ベ ク タ ー を得 る こ と 力《で き る 。 即 ち 、 前述 し た B B R P 4 2 の遺伝子ラ イ ブラ リ 一 力ヽ ら ス ク リ ーニ ン グに よ り 得 ら れた D N A を、 大腸菌な どで 複製可能な ベ ク タ ー に組込み ク ロ 一ニ ン グ し、 铳い て、 得 ら れた D N A を、 そ の下流側末端 に所望の異種蛋 白質 を コ ー ドす る D N A を連結 し た形で、 予定の宿主で複製 可能な ベ ク タ ー に組込む こ と に よ り 、 本発明 に よ る べ ク タ ー を得 る こ と がで き る 。

バ チ ル ス属細菌を宿主 と し て用 い た場合のバチ ルス属 細菌で複製可能なベ ク タ 一 と し て は、 p T A 1 0 6 0、 p U B 1 1 0 、 p E 1 9 4 、 p C 1 9 4 な どの プラ ス ミ' ドお よ び こ れ ら 由来の D N A 力く挙げ ら れ る 。

さ ら に 、 ベ ク タ 一 と し て、 遺伝子 ラ イ ブラ リ 一 力、 ら 得 ら れた シ グナルぺプチ ドを コ一 ドす る D N A の ク ロ ー二 ン グの 際用 い る 微生物、 例え ば大腸菌、 と 蛋 白質産生の 際宿主 と し て用 い る 微生物、 例え ばバチ ルス属細菌、 の いずれで も 複製可能な ベ ク タ ー 、 すな わ ち シ ャ ト ルべ ク タ ー 、 を用 い る こ と も 、 D N A フ ラ グ メ ン ト を移す操作 を省略で き る 点で好ま し い。 大腸菌 と バ チ ル ス 属細菌の シ ャ ト ノレ べ ク タ 一 と し て は 、 例え ば、 p H P 1 3

( P. Haima.S.Bron.G.V enema. Mol . Gen . Genet .209.335 - 3 4 2 , 1 9 8 7 ) 、 な ど の プ ラ ス ミ ド を用 い る こ の 力 で き る 。 ま た 、 こ れ ら の プ ラ ス ミ ド は、 選択マ ー カ を含むのが 必要であ り 、 それ ら の選択マ ー カ 一 の 例 と し て は ク ロ ラ ム フ エ ニ コ ー ノレ耐性、 エ リ ス ロ マ イ シ ン耐性、 ネ オ マ イ シ ン耐性、 テ ト ラ サ イ ク リ ン耐性、 ス ト レ プ ト マ イ シ ン 耐性な どが挙げ ら れ る 。

本発明 に よ る 発現ベ ク タ ー は、 こ れを実際 に宿主細胞 に導入 し て所望の異種蛋 白質を分泌発現 さ せ る た め に は . シ グ ナ ルべ プチ ドを コ 一 ドす る D N A お よ び異種蛋 白質 を コ 一 ドす る D N A か ら な る 外来性遺伝子の発現 に必要 な D N A 、 即 ち プ ロ モ ー タ ー 、 転写開始信号、 リ ボ ゾ一 ム 結合部位、 翻訳停止 シ グナル、 転写終結信号な どの転 写調節信号や翻訳調節信号な ど、 を有 し てい な ければな ら な い。

こ れ ら の 各因子は、 既に起源ベ ク タ ー に 含 ま れて い る 場合があ り 、 こ の場合 に は こ の起源ベ ク タ ー の調節因子 を そ の ま ま 用 い る こ と 力《で き る 。 ま た前記 し た よ う に 蛋 白 質 B B R P 4 2 力、 ら そ の ま ま シ グナ ノレぺ プチ ドを コ 一 ドす る D N A を利用 す る 場合、 シ グナ ルぺ プチ ドを コ 一 ドす る D N A の み な ら ず、 プ ロ モ ー タ ー な どの制御領域 も ク ロ ー ニ ン グ し て利用す る のが有利で あ る 。

宿主 と し てバチ ルス属.細菌を用 い た場合、 培養初期 に こ れ ら 外来性遺伝子を発現 さ せ る プ ロ モ ー タ ー が組込 ま れて な る こ と が特 に好適であ る 。 好ま し い プ ロ モ ー タ ー ― i 2 ― の具体例 と し て は、 下記の塩基配列 （ m ) の少な く と も 3 〇 塩基対以上を有 し てな る も の が挙げ ら れ る 。

TACGATTTTCCCTCAAGTTTTCCTTTTTTCTCAAA ( ΙΠ )

CGGGAATCTAAAAATACCCATGTACACTTGGTCTT

ま た、 こ の外来性遺伝子の発現に必要な D N A と し て 転写開始点 と 翻訳開始点 と の 間 に、 下記の塩基配列

(IV ) で表 さ れ る 翻訳調節信号を含んでな る こ と が好適 であ る 。

TAACAAAGAACAAGCACACTACACGAGCATAGACG AAAGGGTTGAGTGTAT ( IV ) 本発明 に お い て産生 し う る 異種蛋 白質は、 特に制限 さ れな い。 具体例 と し て は、 バチ ノレス · ブ レ ビス 4 7 を用 い て外来性蛋 白質を産生 し た前記文献記載の h ― E G F の他、 イ ン タ ー フ ェ ロ ン 、 各種イ ン タ ー ロ イ キ ン 、 イ ン ス リ ン 、 N G F 、 T N F、 G M — C S F 、 血液凝固因子 第 VI因子、 各種疾患の特異的な抗原蛋 白質な どが挙げ ら れ る 。

所望の 蛋 白質の製造法

本発明 に よ る 所望の 蛋白質の製造法は、 前記 し た本発 明 に よ る 発現ベ ク タ ーで宿主微生物を形質転換 し 、 該形 質転換体を培養す る こ と に よ り 所望の 蛋 白質を培地中 に 分泌 さ せ る こ と を特徵 と す る も のであ る こ と は、 前記 し た通 り であ る 。

宿主微生物 と し て は細菌、 特にバチ ル ス属細菌、 が用 い ら れ る 。 好 ま し いバチ ルス 属細菌 の例 と し て は、 バ チ ル ス · ブ レ ビ ス カ <挙げ ら れ る 。 バ チ ノレ ス · ブ レ ビ ス の 具. 体例 と し て は 、 チ ノレ ス ♦ ブ レ ビ ス 4 7 ( F E R P - 7 2 2 4 ) 、 同 4 8 1 、 同 1 4 4 、 同 8 9 9 な どが挙 げ ら れ る 。

形質転換の方法は、 こ の分野で慣用 さ れて い る も の を 用 いれば よ い 0

上記の よ う に し て得 ら れ る 形質転換体を培養すれば微 生物の細胞外 （即 ち 培養液中） に、 所望の外来性蛋 白質 を産生蓄積す る 。

形質転換体の培養な い し培養条件は、 使用宿主微生物 に対す る そ れ と 本質的 に変わ ら な い。 ま た、 培養液か ら の所望の蛋 白質の 回収、 精製 も 常法 に従 っ て行な う こ と 力く で き る 。

[実 験 例 ]

実験例 1 . バ チ ル ス · ブ レ ビ ス 4 7 の培養初期上清中 の蛋 白質の検索

< チ ノレ ス ♦ プ レ ビ ス 4 7 を Tlura 培地 （ 〇 ， 3 %

K ₂ H P 0 ₄ 0 . 2 % ( N H ₄ ) ₂ S 0 ₄

〇 . 0 2 5 % M g S O _/1 · 7 H _o 0 . 0 . 3 %ペ プ ト ン 、 〇 . 2 %肉エ キ ス 、 2 % グノレ コ ー ス 、 0 . 2 %尿素及び

〇 . 〇 70 ゥ ラ シ ル） 中で一夜培養 し た。 菌液を同 じ

Tlura 培地で 1 ◦ 0 倍 に稀釈 し 、 6 6 0 nmに於 け る 吸光 度を測定 し な が ら 3 7 °Cで振 と う 培養を お こ な っ た 。 2 〜 1 0 時間後の培養液か ら 菌体を遠心分離 に よ り 除 き 、 そ の上清 に 9 0 %飽和 と な る よ う に硫安を力!]え 4 °Cで静. 置 し た。 そ の後遠心分離を行い、 こ れに よ つ て回収 さ れ た沈澱の う ち 、 吸光度力 0 . 0 1 の培養液 1 ml に相当す る 量 に つ い て Laemm 1 i の方法 （Nature, 1970 , 227: 680 - 685)に従 っ て S D S ポ リ ァ ク リ ルァ ミ ドケ ル電気泳動を 行 っ た。 ゲノレを ク ー マ シ ブ リ リ ア ン ブル一 で染色 し た と こ ろ 、 すでに報告の あ る M W P 、 0 W P (H. Yam ad a et . el , (1981) J , Bacteriolog 148 , 322 - 332 )以外 に、 分子 量約 4 2 0 0 0 の蛋 白質のバ ン ドが培養初期の上清 に見 つ 力、 り （第 1 図参照） 、 こ の蛋 白質を B B R P 4 2 と名 付けた。

実験例 2 . B B R P 4 2 の精製 と N端末の ァ ミ ノ 酸配 列の決定

(1) B B R P 4 2 の精製

バチ ルス · ブ レ ビス 4 7 を T 1 u r a 培地中で一夜培養 し た菌液を実験例 1 と 同 じ Tlura 培地で 1 0 0 倍に稀釈 し 6 6 ◦ nraに お け る 吸光度力く 0 . 7 〖こ達す る ま で 3 7 °Cで 振 と う 培養を行 っ た。 氷冷 し た菌液に最終濃度 1 mMに な る よ う に PMSF(phenylmethanesul fonyl f luoride)を力 αえ 遠心分離 に よ っ て菌体を除い た。 こ の上清 1 リ ッ ト ルに 対 し て 4 7 4 g の硫安を加え 4 。Cで静置 し た後、 遠心分 離に よ り 沈澱を除 い た。 こ の上清.1 リ ッ ト ゾレに対 し て さ ら に 1 5 3 g の硫安を加え 4 °C で静置 し 、 遠心分離に よ り 沈澱を回収 し た。 沈澱を 5 0 mM T r i s - H C 1

( p H 7 . 〇 ） 、 l 〇 0 raM N a C l 溶液 に溶解 し 、 Sep-pak カ ー ト リ ッ ジ （waters 社） に通 し 、 蛋 白質を吸 着 さ せ、 同バ ッ フ ァ ー で洗浄 し た後、 4 ◦ % の ァ セ ト ニ ト リ ルで溶出 し てか ら 凍結乾燥を行 っ た。 こ の試料 は、 ま だ相 当量の培地成分を含んでい た の で B i 0- G e 1 p60

(バイ オ ラ ッ ド社） を充填 し た カ ラ ム を用 い てゲル ろ 過 を行い B B R P 4 2 を含む分画を集め、 0 . 1 M の炭酸 水素ア ン 乇 ニ ゥ ム に対 し て透析 し 、 凍結乾燥を行い ア ミ ノ 酸配列決定の試料 と し た。

(2) ア ミ ノ 酸配列の決定

(1) で得 ら れた蛋 白質 4 0 g を、 ア プラ イ ドバイ オ シ ス テ ム社の ァ ミ ノ 酸配列分析装置 4 7 7 A を用 い て、 N端末か ら 2 0 残基を分析 し た。 そ の結果 N'端末の 4審 目 力、 ら 2 0 番 目 ま での ァ ミ ノ 酸配列が、 Ala- Lys-Pro - Thr— Ser し en— Ans— Lys— Pro— Val— Glu— Val—し ys— Phe し ys—

Thr-Gl であ る こ と が分 っ た。

実験例 3 . B B R P 4 2 を コ ー ドす る 遺伝子の ク ロ 一 ニ ン グお よ び塩基配列の決定

(1) ノく チ ル ス · ブ レ ビ ス 4 7 の ゲ ノ ム ラ イ ブ ラ リ ー の 作成

実験例 1 に お い て遠心.分離 し た菌体を 5 0 mM T r i s - H C 1 ( p H 8. 0 ) 、 5 0 mME D T A、 1 5 % Sucrose に懸濁 し 、 最終濃度 5 mg / mlに な る よ う に リ ゾ チ ー ム を加え 、 3 7 °C で 1 5 分間イ ン キ ュ ベー ト し た。 そ の後、 S D S お よ びプ ロ ナ ー ゼ K を そ れぞれ最終濃度- 0 . 5 % s 5 0 μβ· Z ml に な る よ う に加え、 5 5 °Cで一夜 ィ ン キ ュ ベ一 卜 し た。 フ ヱ ノ ー ル抽 出 を数回繰 り 返 し 、 最後 に ク ロ ロ ホ ノレム で一度抽 出 し 、 2 倍量の エ タ ノ ー ル に よ っ て D N A を沈澱 さ せた。 こ の D N A を Maniatisら の方 i¾ (Molecular cloning 1982, Cold S ring Harbor Laboratory) に従い、 S a u 3 A 1 で部分消化 し、 ァ ガ ロ ー ス ゲル電気泳動を お こ な っ た。 約 2 O kbの D N A断 片を含むゲルを切出 し T A E フ ァ ー （ 4 0 mM Tris- acetate , 2 raM E D T A ) と 共に透析チ ュ ー ブに入れ、 電気泳動に よ り D N A をゲルか ら溶出 さ せた。 こ の溶液 を フ ユ ノ ー ル抽 出 し た後、 エ タ ノ ー ノレ に よ り D N A を沈 澱 さ せた。 染色体 D N A l ^ g と B a m H I で切断 し た Λ gt 1 0 D N A ( ス ト ラ タ ジ ー ン社） 2 g をエ タ ノ ー ルで沈澱 さ せ 1 0 β 1 の ラ イ ゲ一 シ ョ ンバ ッ フ ァ 一

( 6 6 mM T r i s — H C 1 ( H 7 . 6 ) 、 6 , 6 πιΜ M g C l つ 、 l O mM D T T 、 〇 . l mM A T P ) に溶 解 し 、 T 4 リ ガー ゼを加えて 1 6 °Cで一晚ィ ン キ ュベー 卜 し た。 こ の う ち の 5 1 を D N A イ ン ビ ト ッ ケ イ ジ ン グキ ッ ト 、 ギガパ ッ ク ゴ一 ノレ ド （ス ト ラ タ ジ一 ン 社製） を用 い てパ ッ ケ イ ジ ン グを行 つ た。

(2) B B R P 4 2 を コ ー ド と す る 遺伝子を持つ組換え フ ァ ー ジ の ス ク リ ー ニ ン グ 前記 （1) で得 ら れた フ ァ ー ジ の う ち 、 約 5 0 0 0 個を 大腸菌 C 6 0 0 株の培養液 と 共に寒天培地 に ま き 、

Maniatisら の方法 (Molecular cloning 1982, Cold

Spring Harbor 1 abo 1 at o ry ) 従 つ て プラ 一 ク ブ リ 夕' ィ ゼ一 シ ヨ ン を行 っ た。 ブ ロ ー プは、 実験例 2 で得 ら れ た第 4 番 目 か ら第 2 ◦ 番 目 の ァ ミ ノ 酸配列か ら 予測 さ れ る 遺伝子の D N A 配列の う ち 、 すで に ク ロ ー ニ ン グ さ れ てい る バチ ノレ ス · ブ レ ビ ス 4 7 由来の蛋 白質であ る

M W P 及び O W P を コ ー ドす る 遺伝子 （Tsuboi et. al .，

( 1988 ) , J. Bacteriol .170.935 )の コ ド ン使用頻度を 参考に し て、 G C T A A A C C A A C T T C T C T G A A C A A A C C A G T T G A A G T T A A A T T C A A A A C T G G の配列力、 ら な る 5 0 塩基の D N A を合成 し .

C r ³² P 3 A T P 及び T 4 ポ リ ヌ レ ク オ チ ドキナ ー ゼに よ り 標識 し た も の を用 い た。 そ の後、 プ ロ ー ブ と イ ブ リ ダィ ズす る 1 5 個の ク ー ロ ン力く得 ら れた。

(3) B B R P 4 2 を コ ー ドす る 遺伝子の塩基配列の決 定

前記 （ 2 ) で得 ら れた フ ァ ー ジ D N A に つ い て、

E c o R I で切断後サザ ン ブ ロ ッ イ ブ リ ダィ ゼー シ ヨ ン を行 っ た と こ ろ 、 前述の プ ロ ー ブは 6 . 6 kbの断片 に ハ イ ブ リ ダィ ズ し た。 そ こ で 1 つ の ク ロ ー ン につ い て、 そ の E c o R I 断片を p U C 1 8 (宝酒造社製） の E c o R I サ イ 卜 に挿入 し て D N A を調整 し 、 制限酵素 地図を作成 し た （第 2 図） 。 さ ま ざ ま な制限酵素に よ つ て切断 し た D N A につ い て前述の プ ロ ー ブを用 い てサ ザ. ン ノヽ イ ブ リ ダィ ゼー シ ヨ ン を行 っ た と こ ろ 、 1 . 7 kbの S a c I — P s t I 断片 にノヽ イ ブ リ ダィ ズ し た。 こ の領 域を含む 3 . 7 kbの S a 1 1 - S p h I 断片を p H S G 3 9 9 (宝酒造社製） の S a l 1 と S p h l サ イ ト の 間 に揷入 し 、 得 ら れた プラ ス ミ ド D N A を S a 1 1 と K p η I で切断後、 ェ ク ソ ヌ ク レ ア ー ゼ ΠΤ と マ ン グ ビ ー ン ヌ ク レ ア ー ゼで D N A を段階的 に消化 し てデ レ ー シ ョ ン ミ ユ ー タ ン 卜 を作成 し た （Heinkoff ( 1984) - Gene. 28 , 351 -)。 各デ レ ー ン ヨ ン ミ ュ ー タ ン ト の D N A を単離 し て 7-deaza Sequenase kit (United States Biochemical Corporation)を用 い て塩基配列の決定を行 っ た。 第 3 図 に 、 デ レ ー シ ヨ ン ミ ュ ー タ ン ト の 1 つであ る p B R E — 1 の E c o R I サ イ ト カ、 ら H i n d ffl サ イ 卜 ま で の塩基 配列を示す。 塩基配列 デー タ を解析 し た と こ ろ 、 第 3 図 に示す よ う に、 2 3 7 塩基対力、 ら 1 6 0 7 塩基対にか け て、 4 5 7 個の コ ド ン 力、 ら 成 る オ ー プ ン リ ー デ ィ ン グフ レ ー ム が見つ か っ た。 実験例 2 で得 ら れた 1 7 個の ア ミ ノ 酸配列 は、 こ のオ ー プ ン リ ー デ ィ ン グフ レ ー ム 力、 ら翻 訳 し た ァ ミ ノ 酸配列の 3 2 残基か ら 4 8 残基に見つ か つ た。 培地中 に見つ 力、 る B B R P 4 2 は、 2 9 残基 目 の ァ ラ ニ ン の N端末側で切断 さ れてお り 、 こ こ よ り N 端末側 が分泌 シ グ ナ ル と し て働い てい る と 考え ら れ る 。 1 番か ら 2 8番の ア ミ ノ 酸中 に は、 翻訳開始の M e t に な り 得 る 部分が、 6 ケ 所あ る 。 1 香の Met を翻訳開始部位 と し た. 時の構造は、 すで に調べ ら れて い る バチ ルス 属分泌 シ グ ナ ル に共通な N端末側か ら 順に 、 親水性部位 一 疎水性部 位 — 切断部位か ら な る 構造 と よ く 一致す る 。

(4) 転写開始点の決定

B B R P 4 2 を'コ一 ド と す る 遺伝子の転写開始点を決 定す る た め第 3 図の 2 2 5 塩基対か ら 2 4 4 塩基対 ま で の配列 に相補的な 2 0 塩基の D N A を合成 し 、 プラ イ マ 一ェ ク ス テ ン シ ョ ン をお こ な っ た （Jones, K. A. ( 1985 ) Cal l 42,559 -572 )。 M . Z . G i 1 in anら の方法 （Ce 11 , 35.285 - 293)に従 っ て分離 し たバチ ノレ ス · ブ レ ビ ス 4 7 の R N A と 、 〔 ァ ³²P 〕 A T P お よ び Τ 4 ポ リ ヌ ク レオ チ ドキナ ー ゼで標識 し た上記 プラ イ マ ー を ァニ ー ル さ せ逆転写酵 素を用 い て相補鎖を合成 し た。 こ の産物を 7 M尿素 Z 1 〇 ％ ァ ク リ ルア ミ ドゲルゲルでマ 一 カ ー と 共に電気泳 動 し 、 そ の長 さ を測定 し た。 オ ー ト ラ ジオ グ ラ フ ィ 一 の 結果、 6 0 塩基 と 6 1 塩基のバ ン ドが確認で き 、 こ の こ と 力、 ら B B R P 4 2 を コ ー ド と す る 遺伝子の転写開始点 は、 第 3 図 の 1 8 5 塩基 目 の G と 1 8 4 塩基 目 の Tであ る と 結論 し た。 1 8 5 番 目 の Gがメ ジ ャ ー で あ り 、 1 8 4 番 目 の T は マ イ ナ ーで あ る 。 実験例 4 . 発現単位ベ ク タ ー の構築

実験例 3 で得 ら れた デ レ ー シ ョ ン ミ ユ ー タ ン 卜 の う ち 第 3 図 に示す D N A 断片を持つ プラ ス ミ ド p B R E — l 力ヽ ら 、 E c o R I と P s t I に よ っ て、 プ ロ モ ー タ ー、 シ グナ ルぺ プチ ド、 お よ び B B R P 4 2 の N末端領域を 含む D N A 断片を切出 し 、 プラ ス ミ ドベ ク タ ー の p U C 1 8 の E c o R I と P s t I の 間 に挿入 し て p B R E — 2 を作成 し た。 こ の p B R E — 2 の う ち 、 B s m l サイ ト と P s t I サ イ 卜 の 間の D N A を、

5'

GATGGGAACGATGGCAGTAGTTTTGAGTCTGGGTAGCATAGG

3'

3'

CGGAGCCATGGCGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCA GCCTCGGTACCGCCTAGGAGATCTCAGCTGG

5' か ら 成 る一対の合成 D N A でお き 変え る こ と に よ り 、 p B R E — 3 を作成 し た。 こ の プラ ス ミ ド は、 B B R P 4 2 を コ ー ドす る 遺伝子の プ ロ モ ー タ 一 、 B B R P 4 2 の シ グナ ルぺプチ ドを コ 一 ド し 、 さ ら に下流に は

N c o I 、 B a m H I 、 X b a l 、 P s t l 、 S p h l H i n d lE サ イ ト カ、 ら 成 る ポ リ ク ロ ーニ ン グサ イ ト を持 つ て い る 。 こ の N c o I サイ 卜 に異種蛋白質遺伝子を直 接連結す る こ と に よ っ て一つ の発現単位を作成す る こ と 力くで き る 。 N c o l で切断す る こ と に よ り シ グナルぺ プ チ ド の 最後 の ア ミ ノ 酸 の A 1 a を コ ー ドす る D N A 部分- が切断 さ れて し ま う た め遺伝子を連結す る ； 合に は、 そ の 5 ' 末端に A l a を コ ー ドす る D N A を付加 し てお く 必要があ る 。 ま た こ の プラ ス ミ ド は、 バチ ノレ ス • ブ レ ビ ス 中 で は複製で き な い の で p B R E - 3 上で作成 し た発 現単位をバ チ ル ス ♦ ブ レ ビ ス 4 7 中で複製可能な プ ラ ス ミ ド に移す必要があ る 。 例え ば、 異種蛋 白質遺伝子を p B R E — 3 に組込ん だプラ ス ミ ドカ、 ら E c o R I と H i n d mで切出 し た D N A 断片 を、 p H P 1 3 な ど の バ チ ル ス 中で も 複製可能な シ ャ ト ルべ ク タ ー の適当 な サ ィ 卜 に挿入す る こ と が必要であ る 。

以下 に 、 B. I i chen i form i s の α — ァ 一ゼ と ヒ ト 上皮成長因子を発現 さ せた例を示す。

実験例 5 . B . I i cheni f orm i s 一 ア ミ ラ ー ゼの発現 ベ ク タ 一 の構築お よ びノ 'チ ル ス · ブ レ ビ ス 4 7 の で の発

B . 1 i cheni f orm i s a — ア ミ ラ ー ゼ遺伝子を含むプ ラ ス ミ ド p T N 1 (T . Yuuki . et a 1. ( 1985 ) J . Biochem . , 98 , 1147— )力、 ら B a m H I , B e I I で切出 し た D N A 断片 を、 実験例 4 で作成 し た p B R E — 3 の B a m H I サ イ ド に揷入 し 、 ァ ミ ラ ー ゼ遺伝子が正 し い方向 に入 っ た も の を選択 し て、 p A M Y — 1 を作成 し た。 こ の プ ラ ス ミ ドカ、 ら N c o I , E c 0 4 7 1 [[ で不要な部分を取 り 去 り 、 o

代 り に

2

Όメ

5'

CGCCGTTTAGAATTACCCTGCGACTACGTCATAAAACTTA

3'

3'

GGTACATGCCCAATGACGGCCAACATTGGAAGC CCATGTACGGGTTACTGCCGGTTGTAACCTTCG

5'

\ o

、 り 成 る 一対の合成 D N A を挿入す る こ と に よ っ て p A M Y 一 2 を作成 し た。 p A Μ Υ - 2 は、 B B R P 4 2 を コ — ドす る 遺伝子の プ ロ モ ー タ 一 、 B B R P 4 2 の シ グナ ルぺプチ ド と それに続い て B . I icheniforniis の 一 ア ミ ラ ー セ を コ 一 ドす る 1 つ の発現単位を持 っ てい る 。 さ ら に p A M Y - 2 か ら E c o R I , H i n d IEで 発現単位をふ く む D N A を切 出 し 、 大腸菌、 B . subt i 1 is の シ ャ ト ルべ ク タ ー の ひ と つであ る Ρ H P 1 3 の

E c o R I , H i n d mサ ィ ト に揷入す る こ と に よ っ て p A M Y 一 3 を作成 し た。 こ の プラ ス ミ ドを用 い て、 高 橋 ら の方法 （J . Bacteriol , (1983) 156, 1130-1134) に従 い、 ノくチルス ♦ プ レ ビス 4 7 を形質転換 し た。 得 ら れた 形質転換体を、 1 Q s / ml の エ リ ス 口 マ イ シ ン を含む T 2 培地 ( 1 % ペプ ト ン s 0 . 5 % 肉エ キ ス 、 酵母エ キ ス 、 1 グノレ コ ー ス ） に植え 3 7

°Cで振 と う 培養を行 っ た。 培養液か ら 菌体を遠心分離に よ り 取 り 除 き 、 上清中の ア ミ ラ ー ゼ活性を H. Fuwaの方法 の松崎変法 （J . Biochmistry 41.583.1954) に よ り 定 し. た。 そ の結果、 ア ミ ラ ー ゼが培地中 に分泌 さ れて い る こ と が確認 さ れた。

実験例 6 . p A M Y — 3 に よ っ て形質転換 さ れたバチ ル ス · ブ レ ビ ス 4 7 が分泌す る ァ ミ ラ ー ゼの 定量

実験例 5 で得 ら れた p A M Y — 3 を含むバ チ ル ス ♦ ブ レ ビ ス 4 7 形質転換体を、 1 ◦ μ g Z mlの エ リ ス 口 マ イ シ ンを含む T 2 培地、 2 0 0 ^ ^ / mlの エ リ ス ロ マ イ シ ン を含む T 2 培地、 2 0 0 0 mlの エ リ ス ロ マ イ シ ン を含む L S 培地 （ 1 %ペ プ ト ン 、 0 . 5 %酵母エ キ ス 、 0 . 2 5 %食塩） ま た は 1 % グゾレ コ ー ス と 2 0 0 ;/ g の エ リ ス 口 マ イ シ ン を含む L S 培地に植え 、 3 7 。Cで振 と う 培養を行 っ た。 2 4 時間 ご と に培養液の一部を取 り 、 遠心に よ っ て菌体を除い た上清を ァ ミ ラ ー ゼ酵素液 と し て活性測定に用 い た。 上清中の ア ミ ラ ー ゼ活性の測定は、 実験例 5 と 同様 に 、 H. Fuwaの方法の松崎変方を用 い て行 つ た。 第 7 図 に上清中 に分泌 さ れ る ア ミ ラ ー ゼ活性の時 間経緯を示す。 2 4 時間の時点で は 2 0 ◦ g Z mlの ェ リ ス マ イ シ ンを含む L S 培地で の分泌が最 も 良 く 、 次い で 2 0 0 g Z mlの エ リ ス ロ マ イ シ ン を含む T 2 培地、 1 % グル コ ー ス と 2 0 0 u mlの エ リ ス 口 マ イ シ ン を 含む L S 培地、 1 ◦ β g Z mlの エ リ ス 口 マ イ シ ン を含む T 2 培地の順で あ っ た。 し か し 培養時間力 7 2 時間 に な る と 、 1 0 ^ g / ml の エ リ ス 口 マ イ シ ンを含む T 2 培地 1 % グル コ ー ス と 2 0 0 g mlの エ リ ス ロ マ イ シ ン を. 含む L s 培地、 2 0 0 u g / ml のェ リ ス ロ マ イ シ ン を含 む L S 培地、 2 0 0 g y ml の エ リ ス ロ マ イ シ ン を含む T 2 培地の順 と な つ た。 7 2 時間後の l O /U g Z mlの ェ リ ス 口 マ イ シ ン を含む T 2 培地では 1 ml当 た り 9 2 0 ュ 二 'ソ 卜 の ア ミ ラ ー ゼが分泌 さ れて い

実験例 7 . ヒ ト 上皮成長因子 （ h 一 E G F ：) 発現べ ク タ ー の構築お よ びバチ ノレ ス · ブ レ ビス 4 7 での発現

ヒ 卜 上皮成長因子は、 5 8 ァ ミ ノ 酸か ら な る 比較的小 さ な ポ リ ぺプチ ドであ り 、 本実験例では、 ヒ ト 上皮成長 因子を コ ー ドす る D N A と して化学合成 し た も の を用 い た。 D N A を合成す る 際、 上流に は シ グナル配列の最後 の A 1 a を コ ー ドす る 配列を、 下流に は終止 コ ド ン を コ 一 ト す る T A A を含み さ ら に両端に は、 N c o I お よ び

X b a I サィ ト に锆合可能な D N A を 4 本に分け て合成 し た。 こ の合成 D N A を p B R E — 3 の N c o I , X b a I サイ ト に挿入 し て p E G F - 1 を作成 し た。 こ の プ ラ ス ミ 卜 力、 ら E c o R I と H i n d in に よ つ て切出 し た

D N A 断片を p H P 1 3 に揷入す る と に よ つ て p E G

F - 2 を作成 し た。 こ の発現ぺ ク タ一を実験例 5 と 同様 にバチ ル ス · ブ レ ビス 4 7 に導入 し た。 得 ら れた形質転 換体を 1 0 ^ g / ml の エ リ ス 口 マ イ シ ン を含む T 2 培地 に植え、 3 7 °Cで振 と う 培養を行 つ た。 菌体を除い た上 清中 の h — E G F を、 抗 h — E G F 抗体を用 い て調べた 結果、 上清中 に h — E G F の存在が確認 さ れた。

実施例 8 . p E G F — 2 に よ っ て形質転換 さ れたバチ ル ス · ブ レ ビ ス 4 7 の分泌す る h — E G F の定量

実験例 7 で得 ら れた p E G F — 2 に よ っ て形質転換 さ れたバチ ノレ ス ♦ ブ レ ビ ス 4 7 を 1 0 g / ml の エ リ ス 口 マ イ シ ン を含む T 2 培地 に植え 3 7 C で振 と う 培養を行 つ た。 2 4 時間 ご と に培養液の一部を取 り 、 遠心に よ つ て菌体を除い た上清中 の h — E G F の濃度を ヒ 卜 上皮成 長因子 に対す る モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体を用 い た E L I S A <£ (Currentprotocols in molecular biology Vol .2 Green Publ ishing Associates and Wi ley-I nterscience 1989) に よ り 定量 し た。 標準試料 と し て精製 さ れた組み 換え ヒ ト E G F (ア ー ス製薬株式会社製） を用 い た。 第 8 図 に そ の結果を示す。 h — E G F の量は 4 8 時間 ま で 増加 し 、 そ れ以上の培養で は増加 し な か っ た。 こ の時の h — E G F の量は l ml 当 た り 1 0 , 5 ^ g で あ っ た 。 実施例 9 ,— バ チ ル ス · ブ レ ビ ス 4 7 に よ り 分泌 さ れた h — E G F の精製お よ び N 末の ァ ミ ノ 酸配列の確認

ノ 、 チ ノレ ス · ブ レ ビ ス 4 7 よ り 分泌 さ れた h — E G F の N 末の シ グ ナ ルぺプチ ドが正 し く 切断 さ れて い る ど う か を確認す る た め h — E G F の精製を行 っ た。 実験例 7 で 得 ら れた P E G F — 2 に よ っ て形質転換 さ れたバチ ルス ♦ ブ レ ビ ス 4 7 を 1 O w g / ml の エ リ ス ロ マ イ シ ン を含 む L S 培地に植え、 3 7 °Cで 4 8時間振 と う 培養を行 つ た。 培養上清 4 0 mlに 9 . 7 2 g の硫安を加え、 4 。Cで 1 時間静置 し た後、 遠心に よ り 残渣を取除 き 、 BUTYL- T0Y0PEARL 6 5 0 S ( ト ー ソ ー株式会社製） を充填 し た カ ラ ム に吸着 さ せ、 4 0 %硫安を含む P B S ( 0 . 8 % N a C 1 , 0 . 0 2 % K C 1 , 0 . 1 4 4 %

N a H P 0 ₄ , 0 . 0 2 4 % K H ₂ P 0₄ p H 7 . 4 ) で洗浄後、 硫安濃度を 4 0 %力、 ら 0 %に徐々 に落 と し 、 h — E G F を溶出 さ せた。 溶出液の う ち h — E G F を含 む分画を さ ら に高速液体 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ 一で精製す る た め、 C 1 8 カ ラ ム （ハイ バー高速液体 ク ロ マ ト グラ フ ィ 一用充填カ ラ ム LiChrospher 1 0 0 R P — 1 8、 関東化学株式会社） に吸着 さ せ、 0 . 1 %の ト リ フ ルォ 口 酢酸を含む ◦ %か ら 4 0 %の ァ セ ト ニ ト リ ノレ溶液の グ ラ ジ ェ ン ト に よ り h — E G F を溶出 さ せた。 h — E G F を含む分画を取 り 、 そ の一部を用 い N末 2 0 個の ァ ミ ノ 酸配列分析を お こ な っ た （ A B I 社製 4 7 7 A ) 。 得 ら れた ァ ミ ノ 酸配歹 ij iま、 Asn— Ser— Asp— Ser— Glu— X— Pro— Leu— Ser-His-Asp-Gly-Tyr-X-Leu-His-Asp-Gl -Val-X であ つ た。 X は解読不明 の残基を示す。 N末の ア ミ ノ 酸残基は A s n であ り ヒ ト 上皮成長因子の N末の残基 と 一致 し 、 シ グナ ル配列が正 し く 切断 さ れて い る こ と が確認 さ れた。 ま た、 解読不明の残基 と は、 ア ミ ノ 酸が修飾 さ れてい る た め に分析で き な い場合 と 、 ア ミ ノ 酸力 C y s 残基であ - 2 1 - る 場合があ る が、 今回得 ら れた ア ミ ノ 酸配列中 の X 残基 に対応す る ヒ ト 上皮成長因子の ア ミ.ノ 酸残基 はすべて . C y s 残基であ る こ と 力、 ら X は C y s に対応 し 、 バチ ル ス · ブ レ ビ ス 4 7 よ り 分泌 さ れた h — E G F の N 末 2 〇 個の ァ ミ ノ 酸配列 は正 し い配列を持 っ て い る と 結論 さ れ o

実施例 1 0 . バ チ ルス · ブ レ ビ ス 4 7 に よ る サ ル由来 の プ ロ イ ン シ ュ リ ン誘導体の分泌発現

ノく チ ノレ ス · ブ レ ビ ス 4 7 に お け る サ ノレ由来 の プ ロ イ ン シ ュ リ ン誘導体の分泌発現に つ い て検討 し た。 用 い た遺 伝子は第 9 図 に示 さ れてい る も のであ る 。

こ の誘導体は、 サ ルの プ ロ イ ン シ ュ リ ン の N 末端 に

Met-Ala-Thr-Thr-Ser-Thr-Gly-Asn-Ser-Ala-Arg の人工 的ァ ミ ノ 酸配列が付加 さ れて い る 。 こ の誘導体を コ ー ド す る D N A 断片を実験例 4 で得 ら れた発現べ ク タ ー p B R E — 3 の N c o I と S a 1 I サ イ ト の 間 に 挿入 し ， p I N T 9 0 d l を作製 し た。 こ の プラ ス ミ ド力、 ら

E c o R I と H i n d lE に よ っ て切 り 出 し た発現単位を、 p H P 1 3 の E c o I と H i n d lE サ イ ト の 間 に揷入 し 、 p I N T 9 0 d 2 を作製 し た。 こ の p I N T 9 0 d 2 をバ チ ル ス ♦ ブ レ ビ ス 4 7 に導入 し 、 得 ら れた形質転 換体を 2 0 0 g / ml の エ リ ス 口 マ イ シ ン を含む T 2 培 地 に植え 、 3 7 °Cで 4 8 時間振 と う 培養を行 っ た。 培養 液 1 ml を取 り 、 遠心 に よ り 菌体を取除 い た上清を凍結乾 一 2 S - 燥 し 、 Laem m 1 i の方法 （前述） に従 っ て S D S ポ リ ア ク リ ノレア ミ ド電気泳動で蛋 白 を分離 し た。 さ ら に蛋 白 を電 気泳動的 に ナ イ ロ ン膜に転写 し 、 抗 ヒ ト イ ン シ ユ リ ン抗 体お よ びホ ー ス ラ デ ィ シ ュ · パーォ キ シ タ 一 ゼで標識 し た二次抗体を用 い て Western-Blottingを行 つ た

Current Protocols in molecular biology vol .2 Green Publishing Associates and liiley-Interscience 1989) 。 そ の結果、 第 1 0 図 に示すよ う に、 抗 ヒ ト イ ン シ ュ リ ン抗体 と 反応す る 単一の蛋 白質のバ ン ドが確認 さ れた。

Claims

請 求 の 範 囲

1 . 下記の配列 （ I ) で実質的 に表 さ れ る シ グナル ぺ プチ ドを コ 一 ドす る 塩基配列力、 ら な る D N A。

Met-Phe-Ser-Lys-Thr-Lys-Met-Gl y- et-Leu- Met - G 1 y - Thr - Met - A 1 a - Va 1 - Va 1 -し eu - Ser -! - ( I )

Gl y-Ser-I l e-Gl y-Gl y-Al a-Met-Al a

2 . シ グナルべプチ ドを コ 一 ドす る 塩基配列が下記 の配列 （ Π ) の も のであ る 、 請求項 1 記載の D N A。

ATG-TTT-AGC-AAA-ACA-AAA-ATG-GGA-ATG-CTG- ATG-GGA-ACG-ATG-GCA-GTA-GTT-TTG-AGT-CTG- ( Π )

GGT-AGC-ATA-GGC-GGA-GCJ-ATG-GCR

( こ こ で、 J は A 又は C を表わ し 、 R は A 又 は G を表わ す）

3 . 請求項 1 ま た は 2 記載の シ グナ ルべ プチ ドを コ 一 ドす る D N A と 、 そ の下流側末端 に連結 さ れた所望の 異種蛋 白質を コ ー ドす る D N A と を組込み、 かつ 、 こ れ ら 外来性遺伝子の発現に必要な D N A を持たせた も の で あ る こ と を特徵 と す る 、 発現ベ ク タ ー。

4 . 宿主細胞を培養 し た と き 培養初期 に前記外来性 遺伝子を発現 さ せ る プ ロ モ ー タ ー を含んでな る 、 請求項 3 記載のベ ク タ 一。

5 . プ ロ モ ー タ ー が下記の塩基配列 （ ΠΙ ) の少な く と も 3 0 塩基対以上を有 し て な る も のであ る 、 請求項 3 ま た は 4 記載のベ ク タ ー。

TACGATTTTCCCTCAAGTTTTCCTTTTTTCTCAAA ( ΠΙ )

CGGGAATCTAAAAATACCCATGTACACTTGGTCTT

6 . 下記の塩基配列 （IV) で表 さ れ る 翻訳調節信号 を転写開始点 と翻訳開始点 と の 間 に含んでな る 、 請求項 3 ― 5 いずれか一項記載のべ ク タ ー。

TAACAAAGAACAAGCACACTACACGAGCATAGACG AAAGGGTTGAGTGTAT ( IV )

7 . 請求項 3 — 6 の いずれか一項記載のベ ク タ ーで 宿主細胞を形質転換 し、 該形質転換体を培養す る こ と に よ り 所望の蛋白質を培地中 に分泌 さ せ る こ と を特徴 と す る 、 所望の蛋 白質の製造法。

8. 宿主細胞がバチルス属細菌であ る 、 請求項 7 記 載の製造法。

9 . バ チ ノレ ス属細菌がバ チ ル ス · ブ レ ビ ス であ る 、 請求項 8記載の製造法。