WO1989006532A1 - Oozing-proof liposome preparation - Google Patents

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WO1989006532A1
WO1989006532A1 PCT/JP1989/000022 JP8900022W WO8906532A1 WO 1989006532 A1 WO1989006532 A1 WO 1989006532A1 JP 8900022 W JP8900022 W JP 8900022W WO 8906532 A1 WO8906532 A1 WO 8906532A1
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WO
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gelatin
ribosome
liposome
freeze
human tnf
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PCT/JP1989/000022
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English (en)
French (fr)
Inventor
Kiyotada Yasui
Toshiro Higashi
Yuu Imasato
Original Assignee
Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd. filed Critical Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.
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Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes

Definitions

  • the present invention relates to a liposome formulation in which the leakage of an active ingredient after freezing or freeze-drying is prevented, and more particularly, to a liposome in which an inner aqueous phase of liposome contains gelatin. , Albumin or polyethylene
  • a ribosome formulation for freezing or lyophilization containing a water-soluble polymer substance as an active ingredient characterized by holding a call (hereinafter referred to as “formulation of the present invention") About.
  • a liposome has an onion-like multi-layer structure consisting of a large number of phospholipid bilayers that are separated from each other by an aqueous substance (hereinafter referred to as “multilayer”). Ribosomes) and those with a single phospholipid bilayer containing aqueous material (hereinafter “single-layer ribosomes").
  • the outer layer the outside of the phospholipid bilayer that is the outermost layer of the multilayer liposome or the outside of the phospholipid bilayer of the monolayer liposome is referred to as the outer layer.
  • the "aqueous phase” is referred to as the “inner aqueous phase” between the phospholipid bilayers in the multilayered liposome or inside the phospholipid bilayer of the monolayer liposome. I will do it here.
  • the liposome is capable of housing any water-soluble substance and is easily phagocytosed by the macrophage.
  • the liver, spleen, Active research is being conducted as a means of pharmacotherapy to efficiently transfer the active drug into the living body because it is easily incorporated into the silk endothelium system such as bone marrow.
  • Libosome itself is stable even in refrigerated storage, but some of the water-soluble substances enclosed in ribosome are unstable in refrigerated storage and in solution. In many cases, it is essential to freeze or freeze-dry them. However, it is known that ribosomes can freeze or freeze-dry, causing water-soluble substances wrapped in the inner aqueous phase to leak out. It is one of the factors that limit the gender.
  • the present inventors have established that the inner water phase of the ribosome is free of gelatin, albumin, or polyethylene coconut by freezing it. Alternatively, the present inventors have found that leakage of a water-soluble polymer substance due to freeze-drying can be sufficiently prevented, and completed the present invention.
  • This may be used alone or in combination with other components, or a known stabilizer may be added.
  • liposomes include multi-layer liposomes and single-layer liposomes, and the formulations of the present invention are of either type. Can be used.
  • Cholesterol is added as a film strengthening agent, and phosphatidic acid, dicetinolephosphate, stealine oleamine, etc. are added as charged substances. You can use something else.
  • the lipophilic substance is dissolved in an organic solvent, and the solvent is removed with a mouthpiece evaporator under a stream of nitrogen or under vacuum, and the lipid residue is filmed on the container wall.
  • the water-soluble active ingredient Aqueous solution in which a hydrophilic polymer substance and gelatin, albumin or polyethylene glycol are dissolved, and liposomal dispersion is performed by stirring or ultrasonic treatment. Get the liquid. This is sequentially filtered through a filter having a reduced pore size, or filtered at high pressure using a filter of a polycarbonate.
  • the particle size may be made uniform by using an emulsifier.
  • the obtained liposome dispersion liquid is subjected to centrifugation, ultrafiltration, permeation, gel filtration, etc., to separate and remove substances that have not been incorporated into the ribosome, followed by freezing.
  • Add saccharides such as mannitol and sucrose and aminoic acids such as daricin and freeze-dry.
  • freezing it is better to add a known protective substance to the external aqueous phase o
  • the preparation of the present invention produced as described above may be thawed if it is frozen and thawed at the time of use, and lyophilized if it is at the time of use or may be added with an appropriate aqueous solvent. Thus, it can be used as injections, oral preparations, and external preparations.
  • Figure 1 shows the effect of Trehalose concentration added to the external aqueous phase on human TNF inclusion after freeze-thaw
  • Figure 2 shows the effect of gelatin added to the external aqueous phase. It shows the effect of ion concentration.
  • the black circles are the ribosome preparations of the present invention
  • the white circles are the control liposome preparations.
  • a liposome suspension was prepared in the same manner as (1) except that gelatin was not added.
  • Trehalose or gelatin is added to the liposome suspensions of (1) and (2) above, and the mixture is added to the liposome suspension shown in Figs.
  • the amount of human TNF in the external aqueous phase is measured by enzyme-linked immunosorbent assay (EIA) by a competitive method, while the total amount of human TNF is measured.
  • EIA enzyme-linked immunosorbent assay
  • the liposome of the present invention in which human TNF and gelatin coexist in the internal aqueous phase has the gelatin in the internal aqueous phase. It is clear that human TNF has a higher shelter rate than RiboSome. Also, as can be seen from Fig. 1, the addition of trehalose to the external water phase was found to have the effect of further improving the shelter rate.
  • the addition of gelatin to the external aqueous phase lowers the hull rate in the ribosome of the present invention and reduces the gelatin to the internal water. Even in ribosomes not included in the phase, the hull rate is reduced at the practical concentration of gelatin in the external aqueous phase (0 to 3 mg / ml). It showed properties different from those of liposomal protective substances such as recellol and sugars.
  • Example 1 The gelatin-encapsulated liposome suspension prepared in 1 was stored for 24 hours with the sample, and the sample was stored for 10 minutes in a constant temperature bath at 40 mm. The gelled sample was stored in a freezer at -70 for 1 hour, frozen, and thawed at room temperature. The ratio of human TNF enclosure was measured by EIA using a competitive method. Was. The former housing ratio is 67.9% and the latter housing ratio is 69.0%, indicating that gelatin in the internal water phase is solified (even if it is gelled). The effect was shown.
  • Example 2 After dissolving and mixing the sphalco mg, coslo-mole mg and stearyl lamine 100 mg each in the mouth and mouth solution, and removing the solvent, the human TNF2, After adding 4 million JRU and 80 mg of gelatin (molecular weight about 7,000), stirring and filtering with a Men-Brain filter, the aqueous solution shown in Table 1 or Table 2 was added. It was freeze-thawed or freeze-dried and redissolved in a 1: 1 ratio to the ribosome suspension. Freeze-drying was carried out under the following conditions: pre-freezing-50 * C, primary drying 20 times, secondary drying 20 degrees of vacuum and 0. I torr. Reconstitution was performed using 50 mM phosphate buffer, pH 7.0.
  • the amount of human TNF in the external water phase was measured using EIA by the competitive method, while the total amount of human TNF was measured using Triton X100. After solubilizing the liposome, the measurement was performed to determine the burial rate.
  • liposomes in which human TNF and gelatin coexist in the internal aqueous phase are more apparent than liposomes that do not contain gelatin.
  • the crab mortality rate of crab human TNF is high, and Table 3 Retention of human TNF by ribosome after freeze-thaw
  • a liposomal preparation was prepared in the same manner as in Example 3 except that 200 mg of bovine serum anolebumin was used instead of 200 mg of gelatin, and the housing ratio was determined. '
  • ribosomes in which human TNF and albumin coexist in the internal aqueous phase are better than liposomes that do not contain albumin.
  • the ratio of human TNF husks was high, and the addition of sucrose to the external water phase was found to have the effect of further improving the husk ratio Table 4 Retention of human TNF of ribosome after freeze-thaw
  • Example 3 In the same manner as in Example 3 except that 200 mg of polyethylene glycol (molecular weight: about 20,000) was used instead of 200 mg of gelatin, Bosom preparations were prepared and freeze-thawed. Also, lyophilization was performed under the same conditions as in Example 2. The housing ratio was determined in the same manner as in Example 3. As shown in Tables 5 and 6, compared to ribosomes that do not use the polyethylene glycol, the resources that include the polyethylene glycol are not included. Posom has clearly higher human TNF enclosure rates after freeze-thaw and freeze-dry reconstitution. Table 5 Retained TNF retention of ribosomes after freeze-thaw
  • human IL-1 (hereinafter simply referred to as “human IL-lj”) prepared in Example 2 of JP-A-61-27122 and 80 mg of gelatin (molecular weight: about 7000) were added.
  • the sugars shown in Tables 7 and 8 were added in a predetermined amount and thawed or freeze-dried and redissolved.
  • 'C primary drying—20'C, secondary drying, 20 and agitation at a vacuum of less than 0.1 ltorr ..
  • Reconstitution was performed using a 50 mM phosphoric acid buffer solution, pH 7.0.
  • the human I-1 was quantified by EIA using the competitive method, and the hull ratio was determined in the same manner as in Example 1.
  • the liposome containing gelatin had a housing ratio of human I1 after freeze-thaw and freeze-dry reconstitution of 95% or more. I knew something.
  • Meth A sarcoma cells (2 X 1 0 5) were implanted intradermally into BALB / c strain female Ma U scan (8 weeks old).
  • the human TNF ribosome preparation prepared in Example 7 1 was administered once at 3,000 JRU / animal into the tumor, and the degree of healing at 24H of the transplantation was observed. 'Of course, all the mice were completely cured. The tumor weight was less than 1%. The other was judged to be completely cured.
  • the human TNF ribosome preparation of the present invention shows reduced toxicity as compared to human TNF alone, and also has a natural healing effect of TNF. You can see this.
  • the preparation of the present invention can be very useful as a ribosome preparation of a water-soluble polymer substance because the preparation can prevent leakage of a water-soluble polymer substance by freezing or freeze-drying.

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Description

明
漏出防止 リ ボ ソ 一 ム 製剤
技術分野 本発明 は、 凍結後又 は凍結乾燥後の有効成分漏出を防止 し た リ ポ ソ ー ム 製剤 に 関 し 、 更に 詳細 に は、 リ ポ ソ ー ム の 内水相 にゼ ラ チ ン ， ア ルブ ミ ン若 し く はポ リ エ チ レ ン グ リ 細
コ ー ルを舍む こ と を特徴 と す る 水溶性高分子物質を有効成 分 と す る 凍結用又 は凍結乾燥用 リ ボ ソ ー ム製剤 （以下 「 本 発明 の製剤 」 と い う ） に関す る。 リ ポ ソ 一 ム に は水性物質に よ り 相互に一定の間隔を保た れた多数の リ ン脂質二重層 か ら な る 玉葱様多薄層構造を有 す る も の （ 以下 「 多重層 リ ボ ソ ー ム 」 と い う ） と 、 水性物 質を舍む単一の リ ン脂質二重層を有する も の （ 以下 「一枚 層 リ ボ ソ ー ム 」 と い う ） が あ る 。 本明細書に おい て は、 多重層 リ ポ ソ 一 ム の一番外側に あ る リ ン脂質二重層 の外側又 は一枚層 リ ボ ソ ー ム の リ ン脂質 二重層 の外側を 「 外水相 」 と 、 多重層 リ ボ ソ ー ム 中 に あ る 各 リ ン脂質二重層 間又 は一枚層 リ ボ ソ ー ム の リ ン脂質二重 層 の 内側を 「 内水相 」 と呼ぶ こ と に す る 。 リ ポ ソ ー ム は、 水溶性物質な ら 何で も 包舍で き る こ と マ ク ロ フ ァ ー ジ に よ り 貪食作用 を受 けや す く 肝臓 ， 脾臓 ， 骨髄等の細絹内皮系に取り 込まれやすい こ と等か ら 、 生体 内へ主薬を効率的 こ移行さ せ る薬物療法の一手段 と して活 発な研究が行われて い る 。
リ ボ ソ ー ム 自 身 は冷蔵保存で も安定で あ る が、 リ ボ ソ 一 ム に包舍さ れた水溶性物質の 中に ば冷蔵保存で も溶液中で は不安定な も のが多 く 、 こ れ ら について は凍結又は凍結乾 燥保存す る こ と が不可欠で あ る。 と こ ろ が、 リ ボ ソ ーム は 凍結又 は凍結乾燥に よ り 、 内水相 に包舍 さ せた水溶性物質 が漏出する こ とが知 ら れてお り 、 こ の製剤の実用性を制限 する 一因 と な っ て い る 。
背景技術
従来、 漏岀 を防止す る手段 と して は、 外水相に ジメ チ ル ス フレホ キ シ ド ， グ リ セ ロ ーゾレ ， ァ ラ ニ ン ， グ リ シ ン べタ イ ン ( J . Pharm. Pharmacol . 38， 259 ~ 263 (1986) ) 、 多 糖類 ， ボ リ ビ ュ ル ビ ロ リ ド ン ， マ ン ニ ト ー ル （ Int. J. Pharm . 22, 299〜 310 (1984) ) 、 デ キ ス ト ラ ン ， ア ラ ビア ゴ ム ， ポ リ ビ ニ ノレ ア ル コ 一 レ ， ポ リ ビ ニ ノレ ビ ロ リ ド ン ， 雄 牛ア ルブ ミ ン ， 庶糖 （特公昭 6卜 21449) を用 いてい る例及 び内外両水相 に ト レ ハ ロ ー ス ， マノレ ト ース ， ラ ク ト 一 ス ， ス ク ロ ース ， グルコ ー ス ， デキ ス ト ラ ン等の糖を用 いて い る 例 （特表昭 62-500102)等が報告さ れて い る が、 いずれ も 漏出防止の効果が不十分で あ る 。
発明 の開示 本発明者等は、 リ ボ ソ ー ム の内水相に ゼ ラ チ ン ， ア ルブ ミ ン又 はボ リ エ チ レ ン ダ リ コ ーノレを 舍有 さ せ る こ と に よ り 、 凍結又 は凍結乾燥に よ る 水溶性高分子物質の漏'出を十分に 防止で き る こ と を見出 し、 本発明を完成 し た。
本発明の製剤の リ ポ ソ ー ム に内包 さ れる 有効成分で あ る 水溶性高分子物質 と し て は、 瘙壌死因子 （tumor necrosis factor ; 以下 「 TNF 」 と略す ） ， イ ン タ ー ロ イ キ ン 1 ( 以 下 「 IL-1」 と 略す），イ ン タ ー フ ェ ロ ン ， イ ン ス リ ン ， ゥ ロ キ ナ ー ゼ， プ ロ ゥ ロ キ ナ 一ゼ， ヘ モ グ ロ ビ ン ， ス 一ノヽ ·ー ォ キ シ ド デ イ ス ム タ ーゼ， ソ マ ト ス タ チ ン ， へパ リ ン等が挙 げ ら れ る 。
こ れは単独又は他の成分 と の組み合わせで あ っ て も よ く 、 或い は公知の安定化剤を加え て も よ い。
リ ポ ソ一ム に は前述 の よ う に、 多重層 リ ボ ソ ー ム と 一枚 層 リ ポ ソ 一 ム があ る が、 本発明の製剤に は い ずれの タ イ プ の も の も使用 す る こ と がで き る 。
膜強化剤 と して コ レ ス テ ロ ール， 荷電物質 と し て ホ ス フ ァ チ ジ ン酸， ジ セ チ ノレ ホ ス フ ェ ー ト ， ス テ ア リ ノレ ア ミ ン等 を加え た も の を用 いて も よ い。
本発明の製剤の製造概略の一例を以下に説明す る 。
親油性物質を有機溶媒に溶解 し、 窒素気流下又は真空下に 口 一 タ リ ー エ バポ レ ー タ ー で溶媒を除去 し、 脂質残渣を 容 器の壁上に フ ィ ル ム 化す る 。 そ こ へ、 有効成分で あ る 水溶 性高分子物質及びゼ ラ チ ン ， ア ル ブ ミ ン又はボ リ エ チ レ ン グ リ コ ー ルを溶解 した水溶液を添加 し、 撹拌又は超音波処 理に よ り リ ポ ソ 一 ム分散液を得る 。 こ れを孔径の減少する フ ィ ル タ ー で順次濾過 した り ボ リ カ ー ボ ネ ー ト の フ ィ ル タ 一を用 いて高圧で濾過 した り 、 高圧乳化機 （ マ ン ト ン ゴー リ ン乳化機） を用 い る こ と に よ り 粒子径を揃えて も よ い。 得 ら れた リ ポ ソ 一 ム 分散液を遠心分離， 限外濾過， 透折， ゲル濾過等に付 し、 リ ボ ソ ー ム に取 り 込ま れなかっ た物質 を分離除去 し、 凍結を行 う か又はマ ン ニ ト ー ル ， 庶糖等の 糖類や ダ リ シ ン等の ァ ミ ノ 酸類を添加して凍結乾燥を行 う 。 凍結の場合、 外水相 に公知の保護物質を加え る 方が好ま し い o
以上のよ う に して製造 し た本発明の製剤 は、 凍結させた も の は使用時に融解 して、 凍結乾燥 させた も の は使用時に そ の ま ま又は適当な水性溶媒を加え る こ と に よ り 、 注射剤， 経口剤， 外用剤等 と して用 い る こ と がで き る 。
図面の簡単な説明
図 1 は凍結融解後の ヒ ト T N F 包含率に対す る 、 外水相 に 加え た ト レ ハ ロ ー ス濃度の影響を示 してお り 、 図 2 は外水 相に加えたゼ ラ チ ン濃度の影響を示 して い る 。 いずれも 黒 丸印が本発明 の リ ボ ソ ー ム製剤で あ り 、 白丸印が対照 リ ポ ソ 一 ム製剤で あ る 。 以下に実施例を挙 げて本発明を更に詳細 に 説明す る が、 本発明 は こ れ ら に限定 さ れ る も の で はな い。
荬施例 1
①卵黄ホ ス フ ァ チ ジ ル コ リ ン 1 gを ク 口 口 ホ ル ム 10 m 1に溶解 し 、 ロ ー タ リ ー エ バ ポ レ ー タ 一 で ク ロ ロ ホ ノレ ム を 除去 し た後、 特開昭 60 - 232097 実施例 3 で調製 し た ヒ ト TNF (以 下、 単に 「 ヒ ト TNF j と い う ） 2, 400 万 JRU 及びゼ ラ チ ン （分子量約 10万） 80mg を加え た 50mMリ ン 酸緩衝液 （pH 7.0)を加え ガ ラ ス ビーズを入れて撹拌 し、 脂質を分散 さ せた後、 0.8 m, 0.65 m, 0.45 ^ m, 0.3 〃 m, 0.22〃 m の メ ン ブ レ ン フ ィ ル タ ー で逐次濾過 し粒子径を整え た後、 セ フ ァ ロ ー ス 4Bの 力 ラ ム を 用 い て ゲ ル濾過 （溶離液 ； 50 mMリ ン酸緩衝液 pH7.0) し、 外水相 の薬物及びゼ ラ チ ン を 除去 した。
②ゼ ラ チ ンを加え な い こ と 以外は① と 同様に して リ ポ ソ 一 ム 懸濁液を調製 し た。
③上記①， ②の リ ポ ソ ーム懸濁液に ト レ ハ ロ ー ス 又 はゼ ラ チ ン を図 1 及び図 2 に示 し た量加え一 70て の冷凍庫に 1 時間保存 し て凍結 さ せ、 室温で融解さ せ た後、 競合法に よ る 酵素免疫測定 （ 以下 「 E I A 」 と い う ） で外水相中 の ヒ ト TNF 量を測定 し、 一方全 ヒ ト TNF 量 は ト リ ト ン X100 で リ ボ ソ ー ム を 可溶化 し た後測定 し、 包舍率を 求め た 。 結果を図 1 及び図 2 に示す。
図 1 , 図 2 に示 し た よ う に ヒ ト TNF と ゼ ラ チ ンが内水相 に共存す る 本発明 の リ ポ ソ 一 ム は、 ゼ ラ チ ンを内水相に舍 ま な い リ ボ ソ ーム よ り も明 ら かに ヒ ト T N F の包舍率が高い こ と がわか る 。 ま た図 1 力、 ら わかる よ う に、 外水相への ト . レ ハ ロ ー ス の添加 は更に包舍率を改善す る 効果が認め ら れ た。
—方、 図 2 に示 し た よ う にゼ ラ チ ン の外水相への添加は、 本発明 の リ ボ ソ ー ム で は包舍率を低下さ せ、 ゼ ラ チ ンを 内 水相 に含ま な い リ ボ ソ ー ム において も、 外水相ゼ ラ チ ン の 実用濃度（0〜 3mg/ml) では包舍率を低下 さ せてお り 、 従来 知ら れて.い る ダ リ セ ロ ー ルや糖類等の リ ポ ソ 一 保護物質 と は異な る 性質を示 し た。
実施例 1 の 2
実施例 1 ①で作製 し たゼ ラ チ ン内包 リ ボ ソ 一 ム懸濁液を て で 24時間保存 し た試料と 40て の恒温槽中で 10分間保存 して 内水相 の ゼ ラ チ ンをゲ ル化 し た試料を — 70て の冷凍庫 に 1 時間保存 して凍結 させ、 室温で融解さ せた後、 競合法 によ る EIA に よ り ヒ ト TNF の包舍率を測定 し た。 前者の包 舍率は 67.9% であ り 、 後者の包舍率 は 69.0% であ り 、 内水 相のゼ ラ チ ンがゾル化 して （ て も ゲル化 して いて も 同 じ保 護効果を示 し た。
実施例 2 ス フ ァ ル コ mg , コ ス ロ一ノレ mg, ス テ ア リ ル ァ ミ ン 100 m g を それぞれク 口 口 ホ ル ム に溶解 し て混和 し 、 溶媒を 除去 し た後、 ヒ ト TNF2 , 400万 JRU 及 びゼ ラ チ ン （分子量約 7000) 80mg を添加 し て撹拌 し メ ン -ブ レ ン フ ィ ル タ ー で濾過 し た後、 表 1 又 は表 2 に示 し た 水溶液を リ ボ ソ ー ム 懸濁液に対 して 1： 1 の割合で加え て 凍結融解又 は凍結乾燥再溶解 し た。 凍結乾燥は予備凍結 - 50*C , 一次乾燥一 20て ， 二次乾燥 20て 真空度 0. I torr. 以下の条件で行 っ た。 再溶解は 50mMリ ン酸緩衝液 ， P H7.0 を用 いて行 っ た.。
②ゼ ラ チ ン を加え な い こ と 以外は① と 同様に して対照 リ ポ ソ 一 ム を得た。
③上記①， ②の リ ボ ソ ー ム に つ い て 、 競合法に よ る E I A を 用 い て ヒ ト TN F の包舍率を測定 し た。 表 1 及び表 2 に示 し た よ う に ゼ ラ チ ン を 舍 ま な い リ ポ ソ ー ム に 比 べ 、 ゼ ラ チ ン を内包する リ ボ ソ ー ム は 、 明 ら かに凍結融解及び凍 結乾燥再溶解後の ヒ ト T N F の包舍率が高い こ と がわか つ た。
(以 下 余 白） 1 凍結乾燥再溶解後の リ ボ ソ ー ム か ら の ヒ ト TNF 漏 出 に及ぼすゼ ラ チ ン と各種糖の影響
Figure imgf000010_0001
(以 下 余 白）
2 凍結融解後の リ ボ ソ ー ム か ら の ヒ ト T N F 漏出に及 ぼすゼ ラ チ ン と各種糖の影響
Figure imgf000011_0001
(以 下 余 白）
荬施例 3
①卵黄ホ ス フ ァ チ ジ ル コ リ ン 900 m g , ジ ノヽ · ル ミ ト イ ル ホ ス フ ァ チ ジ ン酸ナ ト リ ゥ ム lOOmg を ク ロ ロ ホ ル ム 10m lに溶解 し、 ロ ー タ リ 一 エ ノ ポ レー タ ーで ク ロ 口 ホ ルム を除去 し た後、 ヒ ト TNF2 , 40.0万 JBU 及びゼ ラ チ ン （分子量約 7000) 200mg を加え た 50 m Mリ ン酸緩衝液 （p H 7.0 )を加え ガ ラ ス ビーズを入れて撹拌 し、 脂質を分散さ せた後、 0. 2 a m の ボ リ カ ー ボ ネ ー ト メ ン ブ レ ン フ ィ ル タ ー で高圧濾過 し、 粒子径を整えた後、 セ フ ァ ロー ス 4Bの 力 ラ ムを用 いてゲ ル濾過（ 溶離液 ； 50mM リ ン酸緩衝液 PH7.0)し、 外水相の 薬物及びゼ ラ チ ン を除去 し、 リ ボ ソ ーム懸濁液を調製 し た。 こ の リ ポ ソ ー ム懸濁液に 40% 庶糖水溶液を リ ポ ソ一 ム懸濁液に対 して 1： 1 の割合で加え一 70て の冷凍庫に 1 時間保存後、 室温で融解させた。
②ゼ ラ チ ンを加え な い こ と以外は① と同様に して対照 リ ボ ソ 一 ムを得た。
③上記①， ②の リ ボ ソ ー ム に つ い て 、 競合法に よ る E I A を 用 いて外水相中の ヒ ト TNF 量を測定 し、 一方全 ヒ ト TNF 量は ト リ ト ン X100で リ ポ ソ一ム を可溶化 し た後測定 し、 包舍率を求め た。
表 3 に示 し た よ う に ヒ ト T N F と ゼ ラ チ ンが内水相 に共存 する リ ポ ソ ーム は、 ゼ ラ チ ン を内包 しな い リ ポ ソ 一ム よ り も 明 ら かに ヒ ト TNF の包舍率が高 く 、 ま たタ {·水相へ の庶糖 表 3 凍結融解後に おけ る リ ボ ソ ー ム の ヒ ト T N F 保持率
Figure imgf000013_0001
実施例 4
ゼ ラ チ ン 200mg の代わ り に牛血清ァ ノレブ ミ ン 200mg を用 い る 他は、 実施例 3 と 同様に して リ ポ ソ一ム 製剤を調製 し 包舍率を求め た。 '
表 4 に示 し た よ う に ヒ ト T N F と ア ルブ ミ ン が内水相に共 存す る リ ボ ソ ーム は、 ア ルブ ミ ン を 内包 し な い リ ポ ソ 一 ム よ り も 明'ら かに ヒ ト T N F の包舍率が高 く 、 ま た外水相へ の 庶糖 の添加 は更に包舍率を改善す る 効果が認め ら れた 表 4 凍結融解後に お け る リ ボ ソ ーム の ヒ ト TN F 保持率
Figure imgf000014_0001
実施例 5
ゼ ラ チ ン 200m g の代わ り にボ リ エ チ レ ン グ リ コ ール （分 子量約 20， 000) 200.mgを用 い る 他は-、 実施例 3 と同様に して リ ボ ソ ー ム製剤を調製 し—、 凍結融解を行っ た。 ま た、 実施 例 2 と同様の条件に よ っ て凍結乾燥を行 っ た。 実施例 3 と 同様に して包舍率を求めた。 表 5 及び表 6 に示 した よ う に ボ リ エ チ レ ン グ リ コ ー ルを合ま な い リ ボ ソ ーム に比べ、 ボ リ エ チ レ ン グ リ コ ー ルを内包する リ ポ ソ一ム は、 凍結融 及び凍結乾燥再溶解後の ヒ ト TNF の包舍率が明 ら かに高い こ と がわか つ 表 5 凍結融解後に おけ る リ ボ ソ ー ム の ヒ ト TNF 保持率
Figure imgf000015_0002
表 6 凍結乾燥再溶解後に おけ る リ ボ ソ ー ム の
ヒ ト TNF 保持率
Figure imgf000015_0001
^ 4
実施例 6
卵黄ホ ス フ ァ チ ジ ル コ リ ン 700mg,コ レ ス テ ロ ー ル 200rag, ス テ ア リ ル ァ ミ ン lOOmg を それぞれク 口 口 ホ ルム に溶解 し て混和 し、 溶媒を除去 した後、 特開昭 61- 27122実施例 2 で 調製 し た ヒ ト IL-1 ( 以下、 単に 「 ヒ ト IL-lj と い う ） 8.4mg 及びゼ ラ チ ン （ 分子量約 7000)80mg を添加 して撹拌 しメ ン プ レ ン フ ィ ル タ ー で濾過 し た後、 表 7 及び表 8 に示 した糖 を所定量加えて凍結 解又は凍結乾燥再溶解 した。 凍結乾 燥は予備凍結— 50'C ，一次乾燥— 20'C ，二次乾燥 20て ， 真 空度 0. ltorr.以下の条拌で行 っ た。 再溶解は 50mMリ ン酸緩 衝液， P H7.0を用 いて行 っ た。 ヒ ト Iし- 1の定量は競合法に よ る E I A によ り 行い、 包舍率は実施例 1 と 同様に して求め た。
表 7 及び表 8 に示 し たよ う に、 ゼ ラ チ ン を内包す る リ ポ ソ ー ム は、 凍結融解及び凍結乾燥再溶解後の ヒ ト Iい 1の包 舍率が 95% 以上で あ る こ とがわかっ た。
(以 下 余 白）
ー -
Figure imgf000017_0002
8 凍結乾燥再溶解後に おけ る リ ポ ソ 一 ム の ヒ ト I L - 1 保持率
Figure imgf000017_0001
寞施例 T
①卵黄ホ ス フ ァ チ ジ ノレ コ リ ン 700mg ,コ レ ス テ ロ 一 ノレ 200mg, デ シル ァ ミ ン 100 m g をそ れぞれク ロ ロ ホ ノレ ム に溶解 して 混和 し、 溶媒を除去 した。 ヒ ト TNF2, 400万 JRU を 5mM リ ン酸緩 液舍有 0.9¾食塩水 1 m 1に溶解 し た溶液 （以下 「 TNF 単独 」 と い う ） lOral及びゼ ラ チ ン （分子量約 7000) 80mgを こ れに添加 して撹拌 し、 メ ンブ レ ン フ イ ノレタ ーで 濾過 した後、 40% 庶糖水溶液を リ ボ ソ ー ム懸濁液に対 し て 1： 1 の割合で加え、 予備凍結一 50 'C , —次乾燥一 20て ， 二次乾燥 20'C , 真空度 0。1 torr. 以下の条件で凍結乾燥 を行 っ た。 50mMリ ン酸緩衝液， pH7.0を用 いて こ れを再溶 解 し た。 '
②①の リ ボ ソ ー ム製剤又は ヒ ト TNF 単独を 300, 000 JRU/ 匹と な る よ う に健康な ddY 系雄性マ ウ ス に静脈注射 し、 翌日 の生存率を調べた。 ヒ ト TNF 単独.で は、 全数が死亡 し た の に対 し、 ヒ ト TNF リ ボ ソ ー ム製剤で は全数が生存 し て い た 。
実施例 8
BALB/c系雌性マ ウ ス （ 8 週令） に Meth A sarcoma 細胞 ( 2 X 1 0 5 ) を皮内移植 し た。 7 日 目 に実施例 7 ①で作 製し た ヒ ト TNF リ ボ ソ ーム製剤 3, 000JRU/匹を腫瘍内に 1 回投与 し た後、 移植 24H 目 の治癒の程度を見た と こ 'ろ、 全 数の マ ウ ス が完治 して いた。 尚、 腫瘍重量が 1 %以下に な つ た も のを完治 と 判断 した。
実施例 7 及び 8 か ら 、 本発明の ヒ ト T N F リ ボ ソ ー ム製剤 は ヒ ト T N F 単独に比べ て毒性の低減が見 ら れ、 しか も T N F 本来の治癒効果を も 有 して い る こ と がわかる 。
産業上 の利用 可能性
本発明の製剤は、 凍結又 は凍結乾燥に よ る 水溶性高分子 物質の漏出が防止で き る の で 、 該物質の リ ボ ソ ー ム 製剤 と して き わめ て有用 で あ る 。
(以 下 余 白）

Claims

請 求 の 範 囲
1 . リ ボ ソ ー ム の 内 水相 に ゼ ラ チ ン ， ア ル ブ ミ ン若 し く はボ リ エ チ レ ンダ リ コ ールを舍む こ とを特徴 とする 水溶性 高分子物質を有効成分 とす る 凍結又は凍結乾燥 リ ポ ソ ー ム 製剤。
2 . 外水相 に糖又はア ミ ノ 酸を舍む特許請求の範囲第 1 項記載の凍結 リ ボ ソ ー ム製剤。
3 . 水溶性高分子物質が蛋白であ る特許請求の範囲第 1 項記載の リ ボ ソ 一 ム製剤。
4 . 蛋白力、' ヒ ト 癌壌死因子又は イ ンタ ー ロ イ キ ン 1 で あ る特許請求の範囲第 1 項記載の リ ポ ソ ー ム製剤。
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