WO1989006239A1 - Elastase inhibiting polypeptides and process for their preparation by genetic recombination - Google Patents

Elastase inhibiting polypeptides and process for their preparation by genetic recombination Download PDF

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WO1989006239A1
WO1989006239A1 PCT/JP1988/001342 JP8801342W WO8906239A1 WO 1989006239 A1 WO1989006239 A1 WO 1989006239A1 JP 8801342 W JP8801342 W JP 8801342W WO 8906239 A1 WO8906239 A1 WO 8906239A1
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pro
fusion protein
polypeptide
gly
protein
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PCT/JP1988/001342
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Takashi Sugiyama
Takashi Kamimura
Kenichi Masuda
Masahiro Okada
Eiko Ohtsuka
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Teijin Limited
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Publication date
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    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site

Definitions

  • the present invention relates to an elastase inhibitory polypeptide, a fusion protein suitable for producing the same, and a method for producing an elastase inhibitory polypeptide from the fusion protein. Furthermore, the present invention relates to a fusion protein gene used for producing the fusion protein, a plasmid having the gene, and a microorganism.
  • target proteins clinically or economically valuable proteins
  • a target protein is produced using a microbial cell as a host cell
  • a gene encoding the target protein is first isolated from various cells or chemically synthesized, and then the gene is transformed in the host cell. Expression, and as a result, the target protein is produced.
  • obstacles or problems in gene expression and production of the target protein To produce the target protein and a part thereof efficiently and in a commercially advantageous scale in microbial cells, these problems must be solved first. Must be solved.
  • the gene of the target protein is linked to the gene of the partner protein (hereinafter referred to as carrier protein) in the fusion protein, and the gene is expressed as a fusion protein gene in microbial cells.
  • carrier protein the gene of the partner protein
  • a gene encoding a target protein is linked to an endogenous gene encoding a microbial cell protein or a part thereof under the control of a microbial cell promoter, and the gene thus constructed is linked to the microorganism.
  • Methods for expressing in cells are known. According to this method, a fusion protein of the target protein fused with all or a part of the microbial cell protein is obtained, and these are not subjected to intracellular degradation.
  • Microbial proteins used as carrier proteins for such purposes include? -Galactosidase.
  • the second specific measure is that the gene encoding the target protein is a foreign protein that is difficult for microbial cells to recognize as a foreign substance.
  • an exogenous DNA gene
  • a fusion protein of the target protein fused with all or a part of the exogenous protein can be obtained.
  • exogenous proteins as carrier proteins include ⁇ -interferon (I. Ivanov et al.,
  • the biological activity inherent in the target Xu white may be attenuated or completely eliminated.
  • the biological activity of the carrier protein for example, antigenic activity is concerned, and the fusion protein cannot be used clinically as it is. Therefore, it is necessary to separate only the target protein from the fusion protein.
  • the amino acid sequence at the linking site between the carrier protein and the target protein hereinafter referred to as “cross-linking peptide” was designed so as to be site-specifically cleaved, and the fusion protein was produced in microbial cells.
  • the target protein may be separated from the post-fusion protein.
  • a fusion protein produced in a microbial cell White is created to make up the N-terminal portion of the fusion protein.
  • Such site-specific cleavage methods include a chemical cleavage (cleavage) method using a chemical reagent and a biological cleavage (cleavage) method using an enzyme.
  • Chemical cleavage methods include cyanogen bromide treatment, hydroxylamin treatment, formic acid treatment, NBS (N-succinic acid imid) treatment, and lithium methylamine ZNBS treatment. , Bromine hydrochloride treatment and the like.
  • cyanogen bromide treatment method The most commonly used method is the cyanogen bromide treatment method, and Itakura et al. Cut off somatostatin, a hundred protein, from somatostatin fused to Escherichia coli / 5-galactosidase using cyanogen bromide. (K. Itakura et al., Science 198, 1056, 1977; JP-A-54-163600). Under acidic conditions, cyanogen bromide hydrolyzes peptide bonds at methionine residues.
  • a methionine residue is present adjacent to the N-terminal of the N-terminal amino acid of the target protein, and a methionine residue is present in the amino acid sequence of the target protein.
  • cyanogen bromide is necessarily limited.
  • Examples of the method using an enzyme include a method using endopeptidase. Endopeptidase recognizes specific (single or multiple) amino acids in the amino acid sequence inside the polypeptide and preferentially binds the peptide at the carboxy side of certain amino acids. Disconnect. Where endopeptidase specific The amino acid or amino acid sequence that is recognized and cleaved by the enzyme is called the recognition amino acid or the amino acid sequence.
  • endopeptidases that have been used to release the target protein by cleaving the fusion protein produced by bacteria include the following. Trypsin used to release human calcitonin from human calcitonin fused with tryptophan synthetase
  • G-X is used as a recognition amino acid sequence used to release ANP from atrial sodium diuretic peptide (ANP) fused with rec A protein.
  • the method of producing a target protein as a fusion protein with a carrier protein in microbial cells has provided a powerful method for producing the target protein.
  • a microbial cell protein was used as a carrier protein, the expression level as a fusion protein was low, which was not satisfactory from the viewpoint of commercial production.
  • the fused protein is normally present as a soluble component in a microbial cytoplasm or a periplasmic solution. Frequent separation and purification processes were required.
  • Amino acid sequences that can be cleaved by enzymatic treatment When the recognition amino acid sequence is used, the cleavage and release of the target protein by the enzyme may occur depending on the conditions of the carrier protein and the target protein (primary amino acid sequence, secondary and tertiary structure, etc.) present on both sides of the recognition amino acid sequence. The problem was that it was not always successful and it was not possible to predict how much cleavage and release would be.
  • Site-specific release of target protein Selection of a fusion protein having a recognition amino acid sequence to be performed involves not only chemical treatment or enzymatic treatment but also various factors such as expression, production and accumulation of the fusion protein. A carrier protein and a cross-linked peptide satisfying all these factors, which can be widely applied to the production of a target protein, have not been known hitherto.
  • Leukocyte Protease Inhibitor (hereinafter referred to as SLPI) is an elastase inhibitory protein derived from human polymorphonuclear leukocytes, and is present in human mucus, such as parotid secretions, bronchial secretions, semen, and cervix.
  • the amino acid sequence of this protein isolated from parotid secretions has been determined (RCThompson. Proc. Nath. Acad. Sci. USA. 83 »6692-6696, 1986; — 501291), and the protein gene has been isolated and sequenced from the human parotid gland gene library (RCThompson et al., Nucl. Acid Res. 14, 7883-7896, 1986; Tokushu Sho 62) -501262).
  • SLPI inhibits human polymorphonuclear leukocyte elastase and is therefore expected to be used as a medicament for preventing the progression of emphysema and the like, which is considered to be caused by the degradation of elastin by elastase.
  • SLPI has estrase inhibitory activity as well as estrase inhibitory activity, so that physiologically important trypsin-like serine proteases, such as trypsin, plasmin, and calcium It is feared that it has inhibitory activity against lein, thrombin, etc., and therefore, if SLPI itself is administered, it may adversely affect blood coagulation and fibrinolytic systems. Only difficult to use as Tsuta Akira's Lanyun
  • the present invention provides a novel perastase in which the activity of inhibiting SLP I's trypsin-like serine protease is significantly reduced while maintaining the activity of inhibiting SLP I's elastase-inhibiting activity (chymotrypsin-like serine protease inhibitory activity).
  • the present invention provides an inhibitory polypeptide and a method for producing the same. As a prerequisite means, when a target protein is produced by gene expression using a microbial cell, the expression level is high as a fusion protein.
  • An ideal carrier protein that simultaneously satisfies the two points that facilitate the downstream process such as isolation and purification of the fusion protein, and a cross-linking peptide that can cleave and release the target protein from the fusion protein intact and reliably. I will provide a.
  • the present invention generally comprises approximately half of the carboxy-terminal side of human polymorphonuclear leukocyte elastase inhibitory protein (SLP I)-has elastase inhibitory activity, and has a trypsin-like serine protease inhibitory activity.
  • SLP I human polymorphonuclear leukocyte elastase inhibitory protein
  • the present invention further provides the following formula ( ⁇ ′) useful as an intermediate for the production of said polypeptide:
  • Z z is composed of approximately the carboxy-terminal half of human polymorphonuclear leukocyte elastase inhibitory protein (SLPI), has an elastase inhibitory activity equivalent to that of SLPI, and has a trypsin-like serine proteinase inhibitory activity.
  • SLPI human polymorphonuclear leukocyte elastase inhibitory protein
  • B is under conditions that do not denature the desired protein, chemical or biological methods or base petit de crosslinking with ⁇ amino acid sequence cleavable by represents the homopolymers; where B is the Z 2 ⁇ amino terminus ⁇ Combined with amino acids.
  • a fusion protein represented by the formula:
  • the present invention further provides a method for producing an elastase-inhibiting activity polypeptide represented by the following formula (I) (where X is Gly) or a homopolymer thereof, comprising the following formula (IV):
  • Y and Z are as defined in formula ( ⁇ ), and n represents an integer of 1 to 10, where Gly in formula (IV) is the same as Asn at the amino terminus in Z. Joined)
  • the present invention further provides a method for producing an elastase-inhibiting activity polypeptide represented by the following formula (I) (wherein X is not present) or a homopolymer thereof, comprising the following formula (IV) ): Y— B '— Z' (V)
  • Y and Z are as defined in formula ([pi), and B 'is - -Val-Pro-Arg h or - (- Leu-Va 1 -Pro- represents Arg preparative n (n is Represents an integer of 1 to 10), where Asn of Z is bonded to Arg of B '.]
  • the present invention further provides a gene encoding a carrier protein comprising human growth hormone or a polypeptide fragment thereof and a gene encoding a target protein or a part thereof chemically or biologically under conditions that do not denature the target protein.
  • the present invention provides a fusion protein gene linked via a gene encoding a peptide or polypeptide having an amino acid sequence cleavable by a chemical method.
  • the target protein include an amino acid sequence represented by the following formula (M) or a part thereof having an elastase-damaging activity, or a perastase-inhibiting activity polybepti having an amino acid sequence biologically equivalent thereto.
  • M amino acid sequence represented by the following formula (M) or a part thereof having an elastase-damaging activity, or a perastase-inhibiting activity polybepti having an amino acid sequence biologically equivalent thereto.
  • the present invention also provides a plasmid having the gene, and a microbial cell having the plasmid.
  • FIG. 1 shows the primary sequence of amino acids of SLPI (amino-acids are indicated by single letter notation).
  • Fig. 2 shows the use of codons with high graininess in E. coli.
  • FIG. 3 shows chemically synthesized oligonucleotide fragments 1 to 6.
  • Figure 4 shows the polypeptide (Met-he 1 — Phe 139 ) of a human-grown formon fragment (N- of Phe at position 1 of the amino acid sequence from Phe at position 1 to Phe at position 139 of human form).
  • a fusion amino acid sequence consisting of the gene of the polypeptide (Met added to the end) and the gene of the SLPI (Asn 55 — Ala 1 ° 7 ) SLPI fragment polypeptide is coded.
  • 1 shows the primary sequence of the gene to be synthesized, and shows the chemically synthesized oligonucleotide fragments 7 to ⁇ of the gene.
  • FIG. 5 shows a scheme for constructing a fusion protein expression plasmid (Examples 2 and 3).
  • FIG. 6 shows the SDS-PAGE pattern of the expressed fusion protein (Example 4).
  • FIG. 7 shows the SDS-PAGE pattern after the fusion protein was treated with thrombin (Example 5) and treated with hydroxylamine (Example 6).
  • FIG. 8 shows the results obtained by reverse phase HPLC of the mixture after the sulfonated fusion protein was treated with thrombin. For major peaks, assign peaks 1 to 5 in order of elution time.
  • FIG. 9 shows an SDS-PAGE portal field of peaks 1 to 5 obtained in FIG.
  • Fig. 10 shows the rewinding performed according to Example 11 Activated form (Asn 55 — Ala 1 * " 7 ) Reverse phase of SLPI fragment polypeptide
  • FIG. 11 shows the reversed phase HPLC analysis of the main peak in FIG. 10 under the same conditions as in FIG. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • polypeptide consisting of approximately one half of the C-terminal end of SLPI starting from Ser at position 1 and ending with Ala at position 107 is capable of maintaining SLPI elastase inhibitory activity while maintaining SLPI elastase inhibitory activity. For the first time, it was confirmed that it did not substantially have the activity of triscine-like serine protease.
  • the range in SLPI constituting the polypeptide of the present invention is not always critical.
  • a preferred example of the polypeptide of the present invention is a polypeptide comprising an amino acid sequence from Asn at position 55 to Ma at position 107 of SLPI.
  • the polypeptide may be composed of a plurality of, for example, 2 to 10 repeats to form a homopolymer.
  • Such a polypeptide has the following formula (I):
  • X represents Gly or absent, and n is 1 to 13
  • the amino terminus of the above polypeptide may be Asn (X is absent) by means of cleavage of the fusion protein during its production, and Gly is added to the amino terminus of Asn (X is present). Gly).
  • polypeptide having an amino acid sequence in addition to the above-mentioned polypeptide having an amino acid sequence, one or more amino acids are deleted from the amino acid sequence, and one amino acid is deleted from the amino acid sequence. And / or a polypeptide having an amino acid sequence in which one or more amino acids in the amino acid sequence are replaced by another amino acid. As long as has the biological properties described above, it belongs to the scope of the present invention.
  • Such a protein cannot be obtained by conventional methods such as, for example, proteolytic enzyme treatment of natural SLP I, and is obtained by gene expression in microbial cells using the gene recombination technique of the present invention.
  • the target protein is a low-molecular-weight protein, and is expressed as a fusion protein using human growth hormone as a carrier protein.
  • a fusion protein is treated with trombin or hydroxylamine.
  • the method of the present invention in which the protein is processed, and the target protein is cleaved and released, can be produced for the first time.
  • the present invention provides a fusion protein represented by the above formula ( ⁇ ′), which is useful as an intermediate for producing the above elastase-inhibiting activity polypeptide.
  • this fusion protein is represented by the following formula (E) :
  • Y represents a carrier protein comprising human growth hormone or a fragment thereof
  • n an integer of 1 to L 0.
  • a target protein consisting of the elastase inhibitory activity polypeptide having the amino acid sequence biologically equivalent thereto or a portion thereof or a biologically equivalent amino acid sequence
  • B represents a peptide having an amino acid sequence which can be cleaved by a chemical or biological method under conditions that do not denature the target protein, or a homopolymer thereof; where B and Asn of Z bind to each other. I have. ] It is a fusion protein represented by these.
  • the carrier protein in the formulas ( ⁇ ′) and ( ⁇ ) has a high expression level of the fusion protein, and is present as an inclusion body in microbial cells, so that human growth is easy to isolate and purify. It is preferred to use formone and a part thereof.
  • Human growth hormone is a polypeptide consisting of 191 amino acid residues starting at position 1 Phe and ending at position 191 Phe.
  • this is used as a carrier protein to express a gene in Escherichia coli, a translation initiation Met signal is required, and the expressed protein is necessarily a methionyl-height growth hormone. Therefore, this is also a carrier protein of the present invention.
  • a partially modified form of the amino acid of the human growth form in which the amino acid is partially different from the natural form, is included in the carrier protein of the present invention. Some have replaced other amino acids.
  • a polypeptide fragment from Phe at position 1 to Phe at position 139 and a polypeptide fragment from Phe at position 1 to Gl ⁇ at position 122 from Phe are preferable. .
  • Any known cross-linkable peptide or homopolymer thereof at the fusion site can be cleaved chemically or by a biological method using an enzyme or the like under conditions that do not denature the target protein.
  • a recognition amino acid sequence is provided.
  • a cross-linked peptide cleavable with hydroxyamine and LTAsn-Gly (P. Bornstein Meth. Enzymol., 47, 132, 1977) or its repetitive sequence "Asn-Gly) justify-(n is 1 to 10
  • the target protein can be reliably released.
  • the amino acid sequence at the fusion site is opened by thrombin.
  • amino acid sequence previously reported as a cleavable amino acid sequence is as follows: jAla-Asp-Ser-Gly-Glu-Gly- Asp-Phe-Leu-Ala-Glu_Gly-Gly-Gly-Val-Arg-Glu- Gly-Val-Asn-Asp-Asn-Glu-Glu-Gly-Phe-Phe-Ser-Ala-Arg, Asp-Asp-Pro-Pro-Thr-Val-Glu-Leu-Gln-Gly-Leu-Val- Pro-Arg (BBlomback et al. BB 115, 371-396, 1966 T-Takagi et al., Biochemistr 13, 750-756, 1974) can be used, but the shorter amino acid sequence Val-Pro -Arg or Leu-Val-Pro-Arg or their repetitive sequences
  • the fusion protein represented by the formula (I) may be cleaved at the crosslinked amino acid or peptide B.
  • this cleavage is performed with hydroxylamin or a homolog thereof, ⁇ Asn-Gly is used as B.
  • the elastase represented by the formula (I) is obtained by treating the fusion protein represented by the above formula (IV) with hydroxylamine or a homolog thereof, for example, alkylhydroxylamine or hydrazine.
  • An inhibitory polypeptide or a homopolymer thereof is obtained, wherein X in formula (I) is Gly.
  • the fusion protein represented by the formula [ ⁇ ] of the present invention is produced by a known means of gene recombination in itself.
  • the gene encoding the carrier protein consisting of human growth hormone or a fragment thereof and the gene encoding the protein of interest or a part thereof are treated under conditions that do not denature the protein of interest. It is characterized by using a fusion protein gene linked through a gene encoding a peptide or a polypeptide having an amino acid sequence cleavable by a chemical or biological method.
  • Human growth hormone expression plasmid pGH-L9 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 115956 (1984)) was digested with the restriction enzymes BglII and SalI, and the latter half of the human growth hormone gene. Is removed. Further, (Asn 55 - Ala 1 07 ) the SLPI subclass loan pUC-D6 hydrolyzed with Mlu I and Xho I, - obtaining (Asn 55 Ala 1 07) SLPI gene Furagume down bets. -Combine the above two fragments with a synthetic DNA linker (DNA fragments 7 and ⁇ , or DNA fragments 9 and ⁇ shown in Fig.
  • pGH-TE is a fusion protein expression plasmid having a thrombin cleavage sequence
  • pGH-HE is a fusion protein expression plasmid mediated by a hydroxylamin cleavage sequence.
  • the gene encoding the amino acid sequence that recognizes the fusion portion that connects the target protein gene and the gene encoding human growth hormone or a part thereof is a human growth hormone that is a carrier protein or a part thereof.
  • An amino acid sequence that can be easily cleaved by treating the expressed fusion protein with hydroxyamine and isolate the target protein, preferably ⁇ HAsn-Gly ⁇ -» Any gene can be used as long as it encodes , ⁇ , 0.
  • Synthetic DNA linkers can also be inserted between the carrier protein (human growth hormone or a part thereof) and the gene encoding these recognition amino acid sequences in order to match the reading frame.
  • the target protein gene may be a hormone or a factor, for example, There are genes for matmedin, IGF-I, IGF-II, EGF (skin growth factor) and PDGF (platelet-derived growth factor).
  • lymphokines, enzymes, and enzyme-inhibiting proteins such as interferon, interleukin, neuropeptide, intestinal peptide, blood coagulation and fibrinolytic factor (Factor-1 VI, Factor VDIC , Factor] X, mouth tin C, protein S), a! It is a gene for antitrypsin, SLPI, TIMP (a tissue inhibitor of meta-oral proteinase) and lung surface active protein.
  • the antibody or a part thereof, or the trap or a part of the gene is also included in the target protein gene.
  • the target protein may be not only a naturally-occurring protein but also an unnaturally-improved protein or a fragment thereof. In these cases, the gene corresponding to the improved protein or a fragment thereof is expressed. Any gene that can be used may be used.
  • a polypeptide at the carboxy-terminal side of SLPI for example, a polypeptide fragment from Asn at position 55 to Ala at position 107 is used.
  • the corresponding gene or a gene in which the gene is linked by 2 to 10 ° may be used.
  • the fusion protein gene of the present invention can be ligated to a suitable promoter and downstream of an S D (Shine Targano) sequence by
  • promoters include tripfan ⁇ operon 'promoter (trp motor), lactose' operon 'promoter (lac promoter), tac promoter, pL promoter, The Ip promoter and the like are preferable, and the 5'-flanking sequence of pHG-L9 in which the interval between the SD sequence and the translation initiation signal ATG is optimized using the trp promoter is particularly preferable (Japanese Patent Application Laid-Open No. 60-234584).
  • the fusion protein gene expression type DNA for efficiently expressing the fusion protein includes a trp promoter, an SD sequence, a translation initiation code, a gene encoding human growth hormone or a part thereof, and then a cross-linking peptide. It is preferable that the gene to be encoded, then the gene encoding the target protein or a part thereof, and the translation termination codon be linked in this order.
  • Such a fusion protein gene expression type DNA can be prepared by inserting the DNA into an appropriate plasmid, for example, PBR322 or a similar plasmid. Preferred is PBR322.
  • Examples of microbial host cells for expressing the fusion protein gene of the present invention include Escherichia coli and Bacillus subtilis, and E. coli cells are particularly preferred.
  • the fusion protein gene expression type plasmid can be introduced into a microbial host cell, for example, an Escherichia coli cell using a known method (M.V.Norgard et al., Gene. 3 ⁇ 279, 1978).
  • the transformed microorganism thus obtained is itself cultured by a known method.
  • the medium include M9 medium containing darcose and casamino acid (edited by T. Maniatis et al., Molecular loning, P440 Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1982).
  • M9 medium containing darcose and casamino acid edited by T. Maniatis et al., Molecular loning, P440 Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1982.
  • Cultivation is carried out for 2 to 36 hours under conditions suitable for the transformed microorganism of interest, for example, by shaking with aeration and stirring. Also, in order to make the promoter function efficiently at the start of or during culture, 3-indoleacrylic acid (for the tr promoter), isopropyl-1-91-D-thiogalactoside (tac promoter). In some cases, an inducer such as) can be added.
  • the transformed microbial cells are collected, for example, by centrifugation, suspended in, for example, a phosphate buffer, and disrupted by, for example, sonication. Can be isolated with high purity. It is a feature of the present invention that this fusion protein can be cleaved by treatment with hydroxyamine or thrombin as it is, and the target protein can be separated and released intact. If necessary, sulfonated molecules of the target protein can be separated by sulfonating the cystine residue of the fusion protein and treating with trombin.
  • a fusion protein linked by an amino acid sequence that can be cleaved with hydroxylamin (a homologue thereof, that is, a compound having a similar chemical structure and the same action). Which can be cleaved with thrombin (along with its homologue, ie, an enzyme having a similar chemical structure and similar action) under alkaline conditions for 2 to 4 hours under alkaline conditions.
  • thrombin (along with its homologue, ie, an enzyme having a similar chemical structure and similar action) under alkaline conditions for 2 to 4 hours under alkaline conditions.
  • thrombin was produced for 37 to 24 hours.
  • Elastase inhibitory polypeptide can be separated and purified from the reaction solution by appropriately combining known separation and purification methods.
  • These known separation and purification methods include methods using solubility such as salting out and solvent precipitation, filtration, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
  • Methods that mainly use differences in molecular weight methods that use differences in charge such as ion-exchange chromatography, ion-exchange high-performance liquid chromatography, and specific methods such as affinity chromatography. Examples include a method using affinity, a method using a difference in hydrophobicity such as reversed-phase high-performance liquid chromatography, and a method using a difference in isoelectric point such as isoelectric focusing.
  • a known disulfide bond type Using the synthesis reaction, the SLP I fragment polypeptide of the present invention can be converted into an active higher-order structural protein.
  • this protein Since this protein has polymorphonuclear leukocyte elastase inhibitory activity, it has various pathological conditions, such as emphysema and rheumatoid arthritis, glomerulonephritis, periodontitis, muscular atrophy, and other leukocyte elastase-mediated tissues It can be used as a therapeutic drug for various diseases including destruction, and a therapeutic drug for MDS, neutrophil-induced allergic lung disease, septic shock and the like.
  • This protein can be lyophilized to a powder if necessary.
  • stabilizers such as sorbitol, mannitol, dextroth, maltose, glycerol, and human serum albumin (HSA) can be added.
  • HSA human serum albumin
  • This protein is used in the treatment of the above diseases in the form of a pharmaceutically acceptable preparation.
  • the method of administration is oral or parenteral, such as intravenous. It can be used in the form of a formulation suitable for internal administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, transdermal administration, rectal administration, airway administration (pulmonary or nasal administration), intraarticular administration, administration using an ionophoretic device, and the like.
  • DNA 0.1-1 is cut with restriction enzyme digestion buffer (Mlu I and Pst I digestion, final concentration 10 mM Tris-HC ⁇ (pH 7.5) -lOmM MgC ⁇ 2 — 0.1 mg Zfflfi gelatin 60 mM aC ⁇ -6 mM main Rukapu Tetano one Honoré, BamH I, Bgl I, Nde I, Sal I, if a Xho I disconnect, final concentration 10mM Tris-HC £ (pH 7.5 ) - lOmM MgC £ 2 - 0. 1 mg Roh ⁇ gelatin The solution was dissolved in 10 W, and 2 to 4 units of each restriction enzyme were added, and the mixture was reacted at 37'C for 1 hour or more to perform cleavage.
  • restriction enzyme digestion buffer Mlu I and Pst I digestion, final concentration 10 mM Tris-HC ⁇ (pH 7.5) -lOmM MgC ⁇ 2 — 0.1 mg
  • an aqueous solution of 90 mM 'Tris-boric acid (pH 8.0)-2 mM EDTA was used as an electrophoresis buffer.
  • agarose gel electrophoresis was performed to cut out a band corresponding to the target DNA, and the method of Weis lander et al. (L. We is 1 ander, Ana 1. Biochem., 98 »305 (1979)).
  • Ligation was performed by reacting at 16'C for 12 hours.
  • Plasmid DNA was prepared from the obtained ambicillin-resistant colonies using Birnboim et al.'S method (Birnboim, HC and J. Dol, Nucleic Acids Res., L. 1513 (1979)), and appropriate plasmid DNA was prepared. Hydrolysis was performed using various restriction enzymes, and the pattern was broken by agarose gel electrophoresis to obtain the desired clone.
  • plasmid DNA was used as type II, and primers M13, M3, RV or PBR322 primers were used as primers.
  • DNA sequencing was performed using S2 (both from Takara Shuzo) and M13 Sequence Kit (Amersham Japan).
  • Oligonucleotide synthesis was performed by the phosphoramidite method using a fully automatic DNA synthesizer (Applied Biosystems, Model 381A). Purification of the synthetic oligonucleotide was carried out according to the manual of Applied Biosystems. In other words, by keeping an aqueous ammonia solution containing synthetic oligonucleotides at 55 for overnight, the protecting groups of DNA bases were removed, and gels using Sephadex G-50 Fine 'gel (Pharmacia) were used. By filtration, a high molecular weight synthetic oligonucleotide fraction is collected.
  • a purified solution of synthetic oligonucleotide was obtained by applying a solution containing synthetic oligonucleotide to a gel filtration column (Sephadex G-50). If necessary, the polyacrylamide gel electrophoresis was repeated to improve the purity of the synthesized oligonucleotide.
  • the synthetic oligonucleotide purified product 0.1 to 1.0 thus obtained was subjected to a polynucleotide kinase reaction in the presence of 1 mM ATP to phosphorylate the 5 'end.
  • the phosphorylation reaction was performed in 50 mM Tris-HC £ (H9.5) -10 mM MgC £ 2 — 5 mM aqueous solution of dithiothreitol using 5 units of polynucleotide kinase (P-L biochemical canolez). .
  • the two synthetic oligonucleotides corresponding to the upper and lower chains shown in Fig. 3 with phosphorylated 5 'end were mixed, and the temperature of the aqueous solution was gradually increased from 70'C to room temperature. Annealing was performed by cooling.
  • 1 plasmid pUC119 (manufactured by Takara Shuzo) is cut with restriction enzymes BaniHI and PstI according to Method 1, and the linearized fragment is subjected to agar ⁇ -sgel electrophoresis. Separation was performed by (Method 2), and linear plasmid was collected from the gel according to Method 3. The recovered linear plasmid was mixed with the annealed synthetic fragments (1, and 2), (, and 4), or (5, and ⁇ ), and each of the 6 was mixed. Thereafter, a ligation reaction was performed with T4MA ligase according to Method 4.
  • the ligation reaction solution was added to the Escherichia coli (HB101) competent cells 200 prepared according to Method 5, and transformation was performed by Method 5. From the colonies grown on the selection medium (Method 5), a plasmid DNA was prepared by Method 5. Confirmation of the production of the desired subclone pUC-D6 (the latter half of SLPI, including Asn 55 — Ala 1 Q7) was carried out according to Method 1, by using the restriction enzymes BamHI, SalI, MluI, NdeI, and XhoI. , Or PstI, and confirmed by agarose electrophoresis (method 2) cleavage pattern. Also, according to Method 6,
  • the nucleotide sequence was directly confirmed by DNA sequence analysis.
  • human growth hormone expressing plasmid pGH-L9 (M. Ikehara II>. Proc. Na 11. Acad. ScI. USA, 81, 5956 (1984)) 1 was replaced with the restriction enzyme Bgl. Cleavage with ⁇ and Sal I, separation by agarose electrophoresis (method 2), and recovery from the gel (method 3).
  • PC-D62 obtained in Example 1 was digested with restriction enzymes Mlu I and Xho I, separated by agarose electrophoresis (Method 2), and a DNA fragment of about 0.15 Kbp was recovered from the gel (Method 3).
  • Escherichia coli HB101 which has plasmid pGH-TE, is known as the E. coli HB101 strain (PGH-TE).
  • PGH-TE E. coli HB101 strain
  • FIG. 4 (FIG. 4), a transfection of the fusion expression plasmids pGH and HE and Escherichia coli HB101 having the same was obtained by mimicking the same procedure as in Example 2.
  • Escherichia coli HB101 harboring the plasmid pGH-HE is referred to as E. coli HB101 strain (pGH-HE) by FRI.
  • An E. coli HB101 strain having the fusion protein gene expression plasmid pGH-TE obtained in Examples 2 and 3 and an E. coli HB101 strain having PGH-HE were added to an L-medium containing 50 to 100 FigZi of ampicillin.
  • the washed cells are suspended in a TE buffer of 1/10 volume of the culture, and the cells are disrupted using an ultrasonic generator (Kubota Shoji Co., Ltd., 200M type), followed by centrifugation.
  • the obtained fusion protein was obtained as an inclusion body in the sedimented part.
  • the precipitate was washed with a 0.5% aqueous solution of Triton X-100-lmMEDTA, then washed again with TE buffer, and washed with a 7 ⁇ urea-20
  • Rui 6 M guanidine hydrochloride one 2 0 mil Tris (P H8.
  • Lane 2 shows the protein derived from the Escherichia coli BH101 strain
  • lane 3 shows the protein obtained with the pGH-TE-HB101 system
  • lane 4 shows the electrophoretic state of the protein obtained with the pGH-HEZHB101 system.
  • Escherichia coli HB101 having pGH-TE obtained in Example 4 was cultured.
  • 1-120 (W / W) of the total protein amount of human thrombin (manufactured by Sigma) was added, and the mixture was reacted at 37 ° C for 15 hours.
  • the reaction solution was processed by the method described in Example 4 and subjected to SDS-polyacryl gel electrophoresis. The results are shown in Fig. 7 (lanes 2 to 4).
  • the fusion protein (MW 20,000) is cleaved by thrombin, and the human growth hormone-derived peptide (MW 14,000) and the desired (Asn 35 — Ala '° 7 ) SLPI fragment polypeptide (MW) About 6,000).
  • lane 1 is the same molecular weight marker as in FIG.
  • a protein solution obtained by culturing Escherichia coli HB101 having PGH-HE obtained in Example 4 was used as a solution having a final concentration of 2 M hydroxylamine-0.2 M Tris (pH 9,0). The reaction was performed at 45'C for 4 hours. The reaction solution was treated by the method described in Example 4 and subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. The results are shown in Fig. 7 (lanes 5 to 7).
  • the fusion protein (MW approx. 20,000) was cleaved by hydroxylamin, and the peptide derived from human growth hormone (MW approx. 14,000) and the desired N-terminus were glycated (Asn 55 — Ala).
  • SLPI fragment Helsingborg peptidase de see that shows the two bands of molecular weight of about 6, 000) ivy.
  • the N-terminal amino acid sequence of the obtained polypeptide was identical to the sequence of the desired (Asn 55 —Al a 1 Q7 ) SLPI fragment. That is by the door and Russia Nbin or non-Dorokishirua Mi emissions go-between, the fusion protein from - was it confirmed that the (Asn 55 Ala 107) SLPI fragment poly Bepuchi de has been cut out properly. P88 / 0132
  • the elastase inhibitory activity of the expressed fusion protein, the product cleaved with thrombin, and the product cleaved with hydroxylamin was measured as follows.
  • Buffer 0.1 M HBPES, 1.0 M NaC, 0.1% PEG-6000
  • Elastase polymorphonuclear leukocyte elastase from human sputum
  • Elastase EPC, Funakoshi Pharmaceutical
  • elastase inhibitory activity was detected with or without treatment with thrombin or hydra-xylamine.
  • Fig. 8 shows the results obtained by analyzing a part of the reaction solution by reversed-phase HPLC.
  • Figure 9 shows the results of fractionation of fractions of each peak and analysis by SDS-PAGE.
  • N-terminal amino acid sequence was determined using Biosystems 470A). Table 3 shows the results.
  • the sulfonated derivative of the peptide was found to be beak 1.
  • the dialysate was dialyzed against 10 L of 0 ⁇ reduced glutathione solution, and further subjected to 2 HI permeation with 10 L of 50 mM Tris-HC buffer (pH 8.5).
  • the resulting solution was separated by Reverse Phase HPLC, active (Asn 55 - Ma '° 7 ) SLPI fragment polypeptide de 1 mg was obtained.
  • the HPLC separation pattern is shown in FIG.
  • Buffer 0.1 M HEPES, L 0 M NaC £, 0.1% PEG-6000
  • Enzyme solution Dissolve each enzyme in the above buffer so that the concentration is 10 times the final concentration shown in Table 4.
  • Example 1 2 the 8% and inhibitory activity assay of Example 1 2 in the presence of 8% ⁇ shea serum albumin (Sigma), the active (Asn 55 -Ala 107) SLPI fragment polypeptide peptide human Sputum-derived polymorphonuclear leukocyte elastase inhibitory activity was measured, and the same inhibitory activity was shown without any effect.
  • the elastase inhibitory polypeptide of the present invention is a strong elastase. Although it has an inhibitory activity on zeolites, it has very low inhibitory activity against other serine proteases, especially trypsin-like serine proteases, and is therefore expected to be used as a drug for inhibiting the progression of emphysema.
  • the fusion protein expression system of the present invention using human growth hormone or a part thereof as a carrier protein is extremely efficient for the production of relatively low-molecular-weight peptides by genetic recombination, and is almost only very efficient. Can be used.

Description

明 細 書 エラスターゼ阻害活性ポリ ぺプチ ド及び
遺伝子組換えによるその製造方法
技術分野
本発明は、 エラスターゼ阻害活性ポリ ペプチ ド及びそれを 製造するのに適した融合蛋白、 並びにこの融合蛋白からエラ スターゼ阻害活性ポリ ぺプチ ドを製造する方法に関する。 更 に、 本発明は、 この融合蛋白を生産するのに使用される融合 蛋白遺伝子、 それを有するプラス ミ ド及び微生物にも関する ものである。
背景技術 ■
組換え D N A技術の進歩により、 臨床的、 又は経済的に価 値ある蛋白 （以下、 目的蛋白とよぶ） を、 微生物細胞内で産 生することが可能になった。 かかる目的蛋白を、 微生物細胞 を宿主細胞に使用して生産する際、 まず目的蛋白をコー ドす る遺伝子を種々の細胞から単離し又は化学的に合成し、 次い で宿主細胞内で遺伝子の発現を行い、 その結果として目的蛋 白を産生している。 しかし遺伝子発現や目的蛋白産生には幾 つかの障害、 又は問題があり、 目的蛋白及びそれらの一部分 を微生物細胞内で効率的にしかも商業的に有利な規模で産生 するには、 まずこれらの問題を解決しなければならない。 例えば、 比較的低分子量の蛋白、 例えば、 ア ミノ酸残基数 100以下のぺプチ ド又は蛋白を微生物細胞内で直接遺伝子発 現により生産しょう とする場合、 産生されたかかるべプチ ド 又は蛋白は微生物細胞内で異物として認識され、 微生物細胞 中に存在する数種の蛋白分解酵素の作用で分解を受け、 目的 蛋白を効率的に生産できないことは、 しばしば経験されるこ とである。 そして、 かかる問題点を解決するため、 種々のァ ブローチが試みられている。
これらのアプローチの一つとして、 目的蛋白の遺伝子を融 合蛋白中の相手方蛋白 （以下担体蛋白と呼ぶ） の遺伝子と連 結し融合蛋白遺伝子として、 これを微生物細胞内で遺伝子発 現させ、 目的蛋白を生産する方法が知られている。
一つの具体的な方法として、 目的蛋白をコードする遺伝子 を、 微生物細胞プロモーターの調節下にある微生物細胞蛋白 又はその一部をコードする内因性遺伝子に連結し、 そしてこ の構成された遺伝子を微生物細胞内で発現させる方法が知ら れている。 この方法によると、 微生物細胞蛋白の全て又ば一 部分と融合した目的蛋白の融合蛋白が得られ、 これらは細胞 内分解を受けない。 かかる目的のための担体蛋白として用い られている微生物由来蛋白にば、 ?ーガラク トシダーゼ
(S.Tanakaら、 ucl. Acids Res. 10, 1741-1754, 1982)、 β —ラクタマーゼ (P. Cornells ζ> . o 1. Gen. Genet.186, 507- 511, 1982)、 ク ロラムフヱニコ一ルァセチル ト ラ ンスフェ ラ —ゼ （A.ホーデンら、 WPI 87-88509/13) 、 アルカ リ ホスフ ァターゼ （特開昭 58— 225098 ) 等がある。 また、 目的蛋白質 をプロテアーゼによる分解からの保護と同時に、 目的蛋白の 精製を容易にすることを併せ持つ担体蛋白の例として、 ブ ド ゥ状球菌プロティ ン A (特開昭 62— 190087 ； T. Moksら、 Biochemistry 5239-5244, 1987)がある。
第二の具体的な方策として、 目的蛋白をコー ドする遺伝子 を、 微生物細胞にとっては異物の蛋白ではあるが異物として 認識され難いため.に微生物細胞内での産生が安定に行われる 外来性蛋白の全て又は一部分をコー ドする外因性 D NA (遺 伝子） に結合させ、 この融合遺伝子を発現させる方法がある。 この方法によると外来性蛋白の全て又は一部分と融合した目 的蛋白の融合蛋白が得られる。 かかる担体蛋白としての外来 性蛋白の例として、 ^一イ ンターフヱロ ン （I . Ivanovら、
PEBS Lett.210, 56-60, 1987) 、 a , —ア ンチ ト リ プシン
( van der s tra ten .り、 Bioscience Reports Ό, ύΒ3-ύ tS, 1986) がある。
かく して得られる目的蛋白と担体蛋白とを含んで成る融合 蛋白では、 目的胥白が本来有する生物活性が減弱あるいは完 全に消失している場合がある。 また、 たとえ融合蛋白が目的 蛋白の生物活性を有している場合でも、 担体蛋白の生物活性、 例えば抗原活性が懸念され、 融合蛋白のままでは臨床的には 用いられない。 そこで、 融合蛋白から目的蛋白のみを切り離 すことが必要になる。 このためには、 担体蛋白と目的蛋白の 連結部位のァミノ酸配列 （以下、 架橋べプチ ドと呼ぶ） を、 部位特異的に切断できる様にデザィ ンし、 融合蛋白を微生物 細胞で産生させた後融合蛋白から目的蛋白を切り離せば良い。
一般的には、 微生物細胞で産生される融合蛋白は、 担体蛋 白が融合蛋白の N—末端部分を構成するように作成される。 このような構成によつて架橋べプチ ドでの開裂により担体蛋 白及び N—末端ァミノ酸残基メ チォニンのいずれも伴わない 目的蛋白を得ることが可能であり、 更に臨床的に有利である。 かかる部位特異的開裂方法として、 化学試薬を用いる化学 的開裂 （切断） 方法と酵素を用いる生物学的開裂 （切断） 方 法がある。 化学的開裂方法としては、 臭化シア ン処理法、 ヒ ドロキシルァ ミ ン処理法、 ギ酸処理法、 N B S ( N—臭化こ はく酸ィ ミ ド） 処理法、 リ チウム メチルァ ミ ン Z N B S処 理法、 臭素ノ塩酸処理法等がある。
最も繁用されているのは臭化シアン処理法で、 板倉らは、 大腸菌 /5—ガラク ト シダーゼに融合したソマ トスタチンから、 臭化シァンを用いて百的蛋白であるソマ トスタチンを切り離 すことに成功している（K . I takuraら、 Science 198 , 1056, 1977； 特開昭 54— 163600 ) 。 臭化シアンは酸性条件で、 メ チ ォニン残基においてべプチ ド結合を加水分解する。 従って融 合蛋白の部位特異的切断には、 目的蛋白の N —末端ア ミノ酸 の N末端に腠接してメ チォニン残基が存在し、 且つ目的蛋白 のァミノ酸配列中にメチォニン残基が存在しないことが必要 で、 臭化シアンの適用は必然的に限定されることとなる。 酵素を用いる方法としては、 例えば、 エンドべプチダ一ゼ を用いる方法がある。 エン ドべプチダ一ゼは、 ボリペプチ ド 内部のアミノ酸配列中の特異的な （単一の又は複数の） ア ミ ノ酸を認識し、 特定のァミノ酸のカルボキシ側でペプチド結 合を優先的に切断する。 ここでェン ドぺプチダーゼに特異的 に認識され切断されるァ ミノ酸又はァ ミ ノ酸配列を認識ァ ミ ノ酸又は認識ァ ミノ酸配列と呼ぶ。 細菌の産生する融合蛋白 を切断して目的蛋白を放出させるのに用いられてきたェン ド ぺプチダーゼの種々の例としては以下のものがある。 ト リ プ ト ファ ンシンセタ一ゼと融合したヒ トカルシ トニンからヒ ト カルシ トニンを放出させるために使用される ト リ プシン
(W084/00380)、 /9ーガラク ト シダーゼと融合した i5エ ン ド ルフ ィ ンから / —エ ン ドルフ ィ ンを放出させるために使用さ れる ト リ プシン、 i? 一ガラク ト シダーゼと融合したエンケフ ァ リ ンからエンケファ リ ンを放出させるために使用されるゥ シェ ンテロぺフ *チダーゼ (V.N.Dobrynin b . Bioory-Khim 13, 119-121, 1987)、 ク ロラムフヱニコール ァセチル ト ラ ンス フヱラーゼに融合したヒ ト心房性ナ ト リ ゥム尿排泄因子
(h-ANF) から h-ANF を放出させるために使用される、 認識ァ ミノ酸配列として Val-Asp- Asp-Asp-Asp-Lys を用いたェンテ 口キナーゼ （A.Hobdenら、 WPI 87-088509/13 ) 、 ス C11と 融合した /5—グロビンから /?一グロビンを放出させるために 使用される、 及び、 ク ロ ラムフエ二コール ァセチル ト ラ ン スフエラ一ゼと融合したヒ トカルシ トニン一グリ シンからヒ トカルシ トニンーグリ シンを放出させるために使用される、 認識ァ ミノ酸配列として （Ile/Leu/Pro/Ala) - (Glu/Aspノ Gin/ Asn)- Gly-Argを用いたファ クター X a (特開昭 61— 135591 ) 、 rec A蛋白と融合した心房性ナ ト リ ウム利尿性ぺプチ ド（ANP) から ANP を放出させるために使用される、 認識ア ミノ酸配列 として G -X を用いた V 8プロテアーゼ、 認識ア ミノ酸配列 として G l u- G l y- Argを用いたファ クタ一 X a 、 認識ア ミノ酸 配列と L T Arg- Al a- Leu- Leu- l a-G l y- Pro- Arg 又は G l y- Pro - Arg を用いたス ロ ンビン （特開眧 62— 135500 ) 等がある。
目的蛋白を担体蛋白との融合蛋白として微生物細胞内で産 生する方法は、 目的蛋白の製造方法として有力な方法を提供 してきた。 しかしながら、 微生物細胞蛋白を担体蛋白として 用いた場合は、 融合蛋白としての発現量が低く、 商業的生産 の観点から満足できるものではなかった。 また、 外来性蛋白 を担体蛋白として用いた場合は、 直生された融合蛋白は、 通 常、 微生物細胞質液中あるいはペリ ブラズム液中の可溶性成 分として存在するため、 融合蛋白を単離するのに頻雑な分離、 精製プ πセスが必要であつた。
以上の問題点に加うるに、 融合蛋白アプローチの本質的な 問題もあった。 それは目的蛋白を融合蛋白として産生できて も、 そのままでは利用価値はないという点である。 融合蛋白 からの目的蛋白の放岀が必要であり、 そのための融合部を形 成する架橋ペプチ ドの選択は重要である。 臭化シアンにより 開裂されるメチォニンによる融合では適用範西が狭いのが問 題であり、 凡用性の高い架橋べプチ ドの開発が望まれている, 酵素処理にて開裂できるァミノ酸配列 （認識ァ ミノ酸配列） を用いた場合、 認識ァミノ酸配列の両側に存在する担体蛋白 及び目的蛋白の状況 （一次アミノ酸配列、 二次及び三次構造 等） で、 酵素による目的蛋白の開裂及び放出が必ずしもうま く い く とば限らず、 開裂及び放出がどの程度い くか予測でき ないことも問題点であつた。 目的蛋白を部位特異的に放出さ せる認識アミノ酸配列を有する融合蛋白の選択には、 化学的 処理あるいは酵素処理のみではな く、 融合蛋白の発現、 産生 及び蓄積という色々な要因が関与している。 目的蛋白の産生 に広範囲に適用できる、 これら全ての要因を満足する担体蛋 白及び架橋ペプチ ドは、 従来知られていなかった。
ヒ ト分泌性白血球蛋白分解酵素阻害蛋白 （Secretory
Leukocyte Protease Inhibitor. 以下 SLPIという ） はヒ 卜多 形核白血球由来のエラスターゼ阻害蛋白であり、 ヒ トの粘液、 例えば耳下腺分泌物、 気管支分泌物、 精液、 頸部分铋物等に 存在する。 耳下腺分泌液から単離したこの蛋白のアミノ酸配 列力、'決定されており (R.C.Thompson . Proc . Na th . Acad . Sc i . USA.83» 6692-6696, 1986 ； 特表昭 62— 501291 ) 、 また、 ヒ ト耳下腺遺伝子ライブラ リーより この蛋白遺伝子が単離され そして配列決定されている （R.C.Thompsonら、 Nucl. Acid Res. 14, 7883-7896, 1986 ； 特表昭 62 - 501262 ) 。
SLPIは、 ヒ ト多形核白血球エラスタ一ゼを阻害し、 従って エラスターゼによるエラスチンの分解により惹起されると考 えられる肺気腫等の進行防止のための医薬としての使用が期 待される。 しかしながら、 SLPIはエラスターゼ阻害活性と同 時に腠ト リ プシン阻害活性を併せ持つており、 そのために、 生理的に重要な ト リ プシン様セ リ ンプロテアーゼ、 例えば ト リ ブシン、 プラス ミ ン、 カ リ ク レイ ン、 ト ロ ンビン等に対す る阻害活性を有することが懸念され、 従って SLPIそれ自体を 投与した場合、 血液凝固 · 線溶系等に悪影響を与えるおそれ があり、 この点でヒ ト疾患治療薬として用いることが難しか つた 明の蘭云
従って本発明は、 SLP Iのェラスターゼ阻害活性 （キモ ト リ プシ ン様セリ ンプロテアーゼ阻害活性） を維持しながら SLP I の ト リ プシ ン様セリ ンプロテアーゼ阻害活性が著しく低下し ている新規なヱラスターゼ阻害性ポリペプチ ド、 及びその製 造方法を提供するものであり、 そしてその前提となる手段と して、 微生物細胞を用いて遺伝子発現で目的蛋白を生産する 際、 融合蛋白として発現量が高く、 融合蛋白の単離 · 精製等、 ダウンス ト リ ームプロセスが容易となる 2点を同時に満足す る理想的な担体蛋白と、 目的蛋白を無傷でしかも確実に融合 蛋白から開裂及び放出できる架橋ぺプチ ドを提供する。
従って本発明は一般に、 ヒ ト多形核白血球エラスタ一ゼ阻 害蛋白質 （SLP I ) のカルボキシ末端側のおよそ半分から成り - ェラスタ一ゼ阻害活性を有し、 ト リプシン様セリ ンプロテア —ゼ阻害活性がェラスターゼ阻害活性に比べて極めて低いェ ラスターゼ阻害性ボリ ぺプチ ド、 並びに 1偭もしく は複数個 のアミノ酸の付加、 欠失及びノ又は置換を有し上記の生物学 的活性を有するポリ ペプチ ド、 並びにそのホモポリ マーを提 供する。
本凳明はさらに、 前記ポリ ベプチ ドの製造のための中間体 として有用な、 次の式 （ Π ' ) ：
Y— B - Z 2 ( E ' )
〔式中、 Yはヒ ト成長ホルモン又はそのポリぺプチ ド断片か CT/JP88/01342
9 らなる担体蛋白を表し ；
Z z はヒ ト多形核白血球エラスターゼ阻害蛋白質 （SLPI) のカルボキシ末端側のおよそ半分から成り、 SLPIと同等のェ ラスターゼ阻害活性を有し、 ト リ プシン様セリ ンプロテア一 ゼ阻害活性がェラスターゼ阻害活性に比べて極めて低いェラ スターゼ阻害性ポリ ペプチ ド、 あるいは 1個も し く は複数個 のア ミノ酸の付加、 欠失及びノ又は置換を有し上記の生物学 的活性を有するポリ ペプチ ドを表し ； そして
Bは目的蛋白を変性しない条件下で、 化学的又は生物学的 方法により切断可能なァ ミノ酸配列を有する架橋べプチ ド又 はそのホモポリマーを表し ； ここで Bは Z 2 のァ ミノ末端ァ ミノ酸と結合している。 〕
で表される融合蛋白質を提供する。
本発明はさらに、 後記の式 （ I ) (式中 Xは Glyである） で 表されるエラスターゼ阻害活性ポリ ぺプチ ド又はそのホモポ リ マーの製造方法であって、 次の式 （IV) ：
Y -(-Asn-Gl Z ( IV )
〔式中、 Y及び Zは式 （ Π ) において定義する通りであり、 そして nは 1〜 1 0の整数を表し、 こ こで式 （IV) 中の Gly は Z中のアミノ末端の Asnと結合している〕
で表される融合蛋白を、 ヒ ドロキシルァ ミ ン又はその同族体 で処理することを含んで成る方法を提供する。
本発明はさ らに、 後記の式 （ I ) (式中 Xは存在しない） で 表されるエラスターゼ阻害活性ポリ ぺプチ ド又はそのホモポ リ マ一の製造方法であって、 次の式 （IV) ： Y— B ' — Z ' ( V)
〔式中、 Y及び Zは式 （ Π ) において定義する通りであり、 そして B ' は - -Val-Pro-Arg h又は -(-Leu-Va 1 -Pro- Arg ト n を表し （ nは 1〜 1 0の整数を表す） 、 ここで Zの Asnは B ' の Argと結合している。 〕
で表される融合蛋白を、 トロ ンビン又はその同族体で処理す ることを含んで成る方法を提供する。
本発明はさらに、 ヒ ト成長ホルモ ン又はそのポリ ペプチ ド 断片からなる担体蛋白をコードする遺伝子と、 目的蛋白又は その一部分をコードする遺伝子が、 目的蛋白を変性しない条 件下で化学的又は生物学的方法により切断可能なァミノ酸配 列を有するぺプチ ド又はポリぺプチ ドをコ一ドする遺伝子を 介して結合している融合蛋白遺伝子を提供する。 該目的蛋白 の一例として、 後記式 （ M ) で表されるァミノ酸配列もしく はェラスターゼ驵害活性を有するその一部分又はそれらと生 物学的に同等のァミノ酸配列を有するヱラスターゼ阻害活性 ポリ ベプチ ドが特に挙げられる。
本発明はまた、 前記遺伝子を舍有するプラスミ ド、 及び該 プラス ミ ドを舍有する微生物細胞を提供する。 図面の簡単な説明
第 1図は、 SLPIのアミノ酸の一次配列 （アミ-ノ酸は一文字 赂記法で表示した） を示す。
第 2図は、 大腸菌での使用穎度の高いコ ドンを用いた
(Asn55-Ala107) SLPI断片ポリ ペプチ ド （51^1中の 5 5位の ii
Asn から 107位の Maまでのア ミノ酸配列から成るポリぺプ チ ド） の合成構造遺伝子の一次配列を示す。
第 3図は、 化学合成したオリ ゴヌク レオチ ド断片①〜⑥を 示す。
第 4図は（Met- he1— Phe139) ヒ ト成長ホルモ ン断片ポリ ペプチ ド （ヒ ト成長ホルモ ンの 1位の Phe から 139位の Phe までのアミノ酸配列の 1位の Pheの N未端にさ らに Metが付 加されたポリ ペプチ ド） の遺伝子と SLPI (Asn55— Ala1 °7)SLPI 断片ポリ ペプチ ドの遺伝子とを連結して成る融合ア ミノ酸配 列をコー ドする遺伝子の一次配列を示し、 該遺伝子の化学合 成オ リ ゴヌク レオチ ド断片⑦〜⑩を示す。
第 5図は、 融合蛋白発現プラス ミ ド構築スキームを示す (実施例 2及び 3 ) 。
第 6図は、 発現した融合蛋白の SDS- PAGEパターンを示す (実施例 4 ) 。
第 7図は、 融合蛋白を ト ロ ンビン処理 （実施例 5 ) 及びヒ ドロキシルア ミ ン処理 （実施例 6 ) した後の、 SDS-PAGEパタ ーンを示す。
第 8図は、 スルホ化融合蛋白を ト ロ ンビン処理した後の混 合物を、 逆相 HPLCにて分折した結果を示す。 主なピークにつ いて、 溶出時間の速い順序にピーク 1 〜 5 とする。
第 9図は、 第 8図で得られたピーク 1 〜 5 の SDS-PAGEプ口 フ ィ ールを示す。
第 1 0図は実施例 1 1 にしたがって、 巻きもどしを行った 後の活性型（Asn55— Ala1*"7) SLPI断片ポリ ぺプチ ドの逆相
HPLCによる溶出プロフ ィ ールを示す。
第 1 1図は第 1 0図における主ピークの、 第 1 0図と同一 条件での逆相 HPLC分折を示す。 発明を荬施するための最良の形態
本発明者等は、 第 1位の Serから始まり第 107位の Alaで 終わる SLPIの内その C一末端側のおよそ半分から成るポリぺ プチドが、 SLPIのェラスタ一ゼ阻害活性を維持しながら SLPI の ト リブシン様セリ ンプロテアーゼ活性を実質的に有しない ことを初めて確認した。 本発明のポリベプチ ドを構成する SLPI中の範囲は必ずしも臨界的ではない。 本発明のボリぺプ チ ドの好ましい一例として SLPIの 5 5位の Asnから 107位の Maまでのァ ミノ酸配列からなるボリ ベプチ ドが挙げられる。 このボリぺプチ ドは複数、 例えば 2〜 1 0個反復してホモポ リマーを構成していてもよい。
このようなポリ ペプチ ドは、 次の式 （ I ) ：
X ·(— Asn-Pro-Thr- Arg- Arg-Lys-Pro-Gly-Lys-Cys- Pro-Val-Thr-Tyr-Gly-Gln-Cys-Leu-Met-Leu- Asn-Pro-Pro-Asn-Phe-Cys-Glu-Met-Asp-Gly- Gln-Cys-Lys-Arg-Asp-Leu-Lys-Cys-Cys-Met- Gly-Met-Cys-Gly-Lys-Ser-Cys-Val-Ser-Pro- Val-Lys-Ala -— ft
( I )
(式中、 Xは Glyを表すか又は存在せず、 そして nは 1 〜 13
1 0 の整数を表す。 ）
で表されるァ ミノ酸配列もし く はエ ラ スターゼ阻害活性を有 するその一部分又はそれらと生物学的に同等のア ミノ酸配列 を有するエ ラ スターゼ阻害活性ボリ ぺプチ ド又はそのホモポ リマーである。
上記ボリ ペプチ ドのァ ミノ末端は、 その製造の際の融合蛋 白質の開裂手段により Asnの場合 （ Xが存在しない） もあり、 また Asnのァミノ末端に G l yが付加されている （ Xが G l yで ある） 場合もある。
なお、 本発明は、 前記のア ミノ酸配列を有するボリ べプチ ドのほかに、 該ァ ミノ酸配列から 1個又は複数倔のァ ミノ酸 が欠失し、 該ァ ミノ酸配列に 1個又は複数個のァ ミノ酸が付 加され、 そして //又は該アミノ酸配列中の 1偭又は複数個の アミノ酸が他のアミノ酸により置き換えられているァ ミノ酸 配列を有するボリ ぺプチ ドも、 それらが前記の生物学的性質 を有する限り、 本発明の範囲に属する。
かかる蛋白は、 天然の SLP Iを、 例えば、 蛋白分解酵素処理 するような従来の方法では得ることはできず、 本発明の遺伝 子組換え技術を用いて、 微生物細胞内での遺伝子発現によつ て初めて産生することが可能となった。 即ち、 ここで目的蛋 白は低分子量蛋白であり、 例えばヒ ト成長ホルモンを担体蛋 白とした融合蛋白として遺伝子発現し、 かかる融合蛋白を例 えば ト ロ ンビ ン処理あるいはヒ ド ロキ シルア ミ ン処理し、 目 的蛋白を開裂、 放出するという本発明の方法で、 初めて産生 が可能となったのである。 従って本発明は、 前記のエラスターゼ阻害活性ポリベプチ ドの製造のための中間体として有用な、 前記式 （ Ε ' ) で表 される融合蛋白を提供する。 この式 （ Ε ' ) で表される融合 蛋白において、 目的蛋白部分が SLPIの第 5 5位の Asnから 107位の Maまでのアミノ酸配列から成る場合、 この融合蛋 白は次の式 （ E ) ：
Y - B— Z ( Π )
〔式中、 Yはヒ ト成長ホルモ ン又はその断片からなる担体蛋 白を表し ；
zは式 〔 m〕 ：
-— Asn-Pro-Thr- Arg- Arg-Lys-Pro-Gly-Lys-Cys- Pro-Val-Thr-Tyr-Gly-Gln-Cys-Leu-Met-Leu- Asn-Pro-Pro-Asn-Phe-Cys-Glu-Met-As -Gly- Gln-Cys-Lys-Arg-Asp-Leu-Lys-Cys-Cys-Met- Gly-Met-Cys-Gly-Lys-Ser-Cys-Val-Ser-Pro- Val-Lys-Ala „
( I )
(式中、 nは 1〜： L 0 の整数を表す。 ）
で表される配列もしく はその一部分又はそれらと生物学的に 同等のァ ミノ酸配列を有するエラスターゼ阻害活性ポリ ぺプ チ ド又はそのポリ マーからなる目的蛋白を表し ； そして
Bは目的蛋白を変性しない条件下で、 化学的又は生物学的 方法により切断可能なァ ミノ酸配列を有する架撟ぺプチ ド又 はそのホモボリマーを表し ； ここで Bと Zの Asnが結合して いる。 〕 で表される融合蛋白である。 式 （ Π ' ) 及び式 （ Π ) 中の担体蛋白としては、 融合蛋白 の発現量が高く、 微生物細胞内で封入体 （inclusion body) として存在するため単離、 精製が容易であるヒ ト成長ホルモ ン及びその一部分を用いるのが好ましい。 ヒ ト成長ホルモン は、 1位 Pheから始まり 191位 Pheで終わる 191ア ミノ酸残 基よりなるポリ べプチ ドである。 これを担体蛋白として用い 大腸菌で遺伝子発現させる場合、 翻訳開始 Metシグナルが必 要で、 発現した蛋白は必然的にメ チォニルヒ ト成長ホルモ ン となる。 従って、 これも本発明の担体蛋白である。 また、 ヒ ト成長ホルモ ンのァ ミノ酸が天然のものと一部異なる一部改 変体も、 本発明のキ ヤ リヤー蛋白に舍まれるが、 これらの例 としては、 5 3位のシスティ ンが他のア ミノ酸と置き換わつ たものがある。 ヒ ト成長ホルモンの一部を担体蛋白として用 いる場合、 1位の Pheから 139位の Pheまでのポリ ペプチ ド 断片及び 1位の Pheより 122位の Gl ηまでのポリ ペプチ ド断 片が好ましい。
融合部の架橋ペプチ ド又はそのホモポリ マー Β としては、 目的蛋白を変性しない条件下で、 化学的に又は酵素等を用い る生物学的方法により切断可能な、 公知のものを舍むあらゆ る認識ァ ミノ酸配列が舍まれる。
例えば、 ヒ ドロキシルァ ミ ンで開裂可能な架橋ペプチ ドと LTAsn-Gly(P.Bornstein Meth. Enzymol . ,47, 132, 1977) 又はその反復配列 "Asn- Gly )„ - (nは 1 〜 1 0 の整数を表 す） を使用することにより、 確実に目的蛋白を放出すること ができる。 また融合部のァ ミノ酸配列に ト ロ ンビンにより開 裂可能なアミノ酸配列として、 従来報告されているア ミノ酸 配歹! jAla - Asp - Ser - Gly - Glu - Gly- Asp - Phe - Leu - Ala - Glu_Gly - Gly-Gly-Val-Arg-Glu-Gly-Val-Asn-Asp-Asn-Glu-Glu-Gly- Phe-Phe-Ser-Ala-Arg, Asp-Asp-Pro-Pro-Thr-Val-Glu- Leu- Gln-Gly- Leu- Val -Pro-Arg (B · B lombackらヽ BB 115, 371- 396, 1966 ί T-Takagiら、 Biochemistr 13, 750-756, 1974) 等を用いることもできるが、 より短いァ ミノ酸配列 Val-Pro- Arg 又は Leu- Val-Pro- Argあるいはこれらの反復配列
•(-Val-Pro-Ar ト n又は -Leu- Val -Pro-Arg n ( nは 1〜 1 0 の整数を表す） を用いることにより、 担体蛋白及び目的 蛋白のア ミノ酸一次配列、 立体構造に影響を受ける事なく、 確実に目的蛋白を放出、 分離できる。 これらの場合、 それぞ れ Bの C—末端の Gly, Arg又は Argと Z中の N—末端の Asn が結合している。
式 （ I ) で表される本発明のボリ ぺプチ ドを製造するには、 式 （ I ) で表される融合蛋白質を架橋アミノ酸又はペプチ ド Bにおいて開裂せしめればよい。 この開裂をヒ ドロキシルァ ミ ン又はその同族体により行う場合、 B として ~Asn-Gly が使用される。 すなわち、 前記の式 （IV) により表される融 合蛋白をヒ ドロキシルア ミ ン又はその同族体、 例えばアルキ ルヒ ドロキシルア ミ ン、 ヒ ドラジン等により処理することに より式 （ I ) で表されるエラスターゼ阻害性ポリ ペプチド又 はそのホモポリ マーが得られ、 この場合式 （ I ) 中の Xは Glyである。 また、 架橋ペプチ ド Bにおける開裂を ト ロ ンビ ン又はその同族体により行う場合、 Bとして例えば -Val-Pro-Arg ~n、 又は " -Leu- Va 1 - Pro- Arg が使用さ れる。 すなわち前記の式 （ V ) で表される融合蛋白を ト ロ ン ビン、 又はその同族体、 例えばヒ ト ト ロ ンビン、 ゥ シ ト ロ ン ビン、 ゥマ ト ロ ンビン、 ブタ ト ロ ンビン等により処理するこ とによって式 （ I ) で表されるエラスタ一ゼ阻害性ポリ ぺプ チ ド又はそのホモボリマーが得られ、 この場合 （ I ) 中の X は存在しない。
本発明の式 〔 Π〕 で表される融合蛋白は、 その手法自体は 公知の遺伝子組み換えの手段によって生産される。 この場合 に、 本発明においては、 ヒ ト成長ホルモ ン又はその断片から なる担体蛋白をコードする遺伝子と、 目的蛋白又はその一部 分をコー ドする遺伝子が、 目的蛋白を変性しない条件下で、 化学的又は生物学的方法により切断可能なァ ミノ酸配列を有 するペプチ ド又はボリ ペプチ ドをコー ドする遺伝子を介して 結合している融合蛋白遺伝子を用いることを特徵とする。
(Met" 'Phe1 - Phe139 ) ヒ ト成長ホルモ ン断片と （Asn55— Ala107) SLPI断片ポリ ペプチ ドの融合蛋白を発現するプラス ミ ド （pGH-TEあるいは pGH-HE) を構築する方法を第 5図に示 す。
ヒ ト成長ホルモ ン発現プラス ミ ド pGH-L9(Proc.Natl. Acad. Sci. USA.， 115956 (1984))を制限酵素 Bgl Π及び Sal I で消 化し、 ヒ ト成長ホルモン遺伝子後半 1ノ 3を除去する。 また、 (Asn55 - Ala1 07 ) SLPIサブク ローン pUC-D6を Mlu I 及び Xho I で加水分解し、 （Asn55— Ala1 07) SLPI遺伝子フラグメ ン ト を得る。 - 以上 2者のフラグメ ン ト と、 合成 D N Aリ ンカ一 （第 4図 に示す D N Aフラグメ ン ト⑦及び⑧、 又は D N Aフラグメ ン ト⑨及び⑩） を合わせて、 T4-DNAワガーゼで連結して、 ヒ ト 成長ホルモン断片と（Asn55— Ala 1 Q7) SLPI断片の融合蛋白発 現プラス ミ ド pGH-TE、 及び pGH- HEを得る。 第 5図において、 pGH- TEば、 ト ロ ンビン切断配列を舍有する融合蛋白発現ブラ ス ミ ドであり、 pGH-HEは、 ヒ ドロキシルァ ミ ン切断配列を介 する融合蛋白発現プラスミ ドである。
目的蛋白遺伝子と、 ヒ ト成長ホルモン又はその一部分をコ 一ドする遺伝子とを違結する融合部の認識ァミノ酸配列をコ 一ドする遺伝子は、 担体蛋白であるヒ ト成長ホルモン又はそ の部分の遺伝子と同じリーディ ングフ レームのもので、 発現 した融合蛋白をヒ ドロキシルアミ ンで処理することによって 容易に開裂し、 目的蛋白を分離できるア ミノ酸配列、 好まし く は ~HAsn-Gly ^-»=,~,0 をコードする遺伝子であればいか なるものでも良い。 また発現した融合蛋白を ト ロ ンビン処理 することによって容易に開裂し、 目的蛋白を分離できるアミ ノ酸配列、 好ましく は " Val-Pro-Arg ^~n=1~10 あるいは -^Leu-Val-Pro-Arg ^-η=ι~ιο をコードする遺伝子であれば いかなる ものでも良い。
担体蛋白 （ヒ ト成長ホルモン又はその部分） とこれら認識 ァ ミノ酸配列をコ一ドする遺伝子の間に、 リーディ ングフレ ームを合わせるために合成 D NAリ ンカーを揷入することも できる。
目的蛋白遺伝子としては、 ホルモ ン又は因子、 例えば、 ソ . マ トメ ジン、 IGF- I、 IGF- Π、 EGF (皮膚成長因子） 及び PDGF (血小板誘導成長因子） の遺伝子がある。 また、 リ ンホカイ ン、 酵素、 酵素阻害蛋白、 例えば、 イ ンターフュ ロ ン、 イ ン ターロイ キ ン、 ノ イ ロペプチ ド、 腸管べプチ ド、 血液凝固線 溶因子 （ファ クタ一VI、 ファ クター VDI C 、 ファ クター] X、 プ 口ティ ン C、 プロテイ ン S ) 、 a！ ア ンチ ト リ プシン、 SLPI、 TIMP (メ タ口プロティ ナーゼのティ シユー · ィ ンヒビター） 及び肺表面活性蛋白の遺伝子である。 また、 抗体もし く はそ の一部分、 又は捕体も し く はその一部分の遺伝子も目的蛋白 遺伝子に舍まれる。
目的蛋白は、 天然型蛋白のみならず、 非天然型の改良型蛋 白又はそれらの断片であっても良く、 これらの場合には、 改 良型蛋白に対応する遺伝子、 あるいはそれらの断片を発現し 得る遺伝子を用いればよい。
本発明において、 エラスターゼ阻害活性ポリ ぺブチ ド又は そのホモポリ マーを得る場合には、 SLPIのカルボキシ末端側 のポリ ペプチ ド、 例えば 5 5位の Asnから 107位の Alaまで のボリ ぺプチ ド断片に対応する遺伝子、 又はその遺伝子が 2 〜 1 0偭連結した遺伝子を用いればよい。
本発明の融合蛋白遺伝子は、 適当なプロモーター及び S D ( シャ イ ン · タルガーノ ） 配列の下流につな ぐこ とにより、
• 発現型遺伝子とするこ とができる。 使用可能なプロモーター と して、 ト リ プ ト フ ァ ン ♦ オペロ ン ' プロモータ一 （trp プ 口モーター） 、 ラク トース ' オペロ ン ' プロモータ一 （lac プロモーター） 、 tac プロモーター、 p Lプロモーター、 Ip プロモーター等があげられ、 とりわけ trp プロモータ一 を用い、 S D配列と翻訳開始シグナル A T Gの間隔を最適化 した pHG- L9の 5 ' フラ ンキング配列が好適である （特開昭 60-234584) 。
融合蛋白を効率的に発現させるための融合蛋白遺伝子発現 型 D N Aは、 trp プロモーター、 S D配列、 翻訳開始コード ン、 次いで、 ヒ ト成長ホルモン又ばその一部分をコードする 遺伝子、 次いで、 架橋ペプチ ドをコードする遺伝子、 次いで 目的蛋白又はその一部分をコードする遺伝子、 そして翻訳終 了コードンがこの順序で連結したものが好ましい。 かかる融 合蛋白遺伝子発現型 D N Aは、 適当なブラスミ ド、 例えば PBR322およびこれに類緣のプラスミ ドに揷入することにより、 融合蛋白遺伝子発現型プラスミ ドが作製できる。 好ましいの は PBR322である。
本発明の融合蛋白遺伝子を発現させるための微生物宿主細 胞と しては、 大腸菌、 枯草菌などがあげられ、 とりわけ大腸 菌細胞が好ま しい。 上記融合蛋白遺伝子発現型ブラスミ ドは、 例えば、 公知の方法（M.V.Norgardら、 Gene. 3^ 279, 1978) を用いて微生物宿主細胞、 例えば大腸菌細胞に導入すること ができる。
このようにして得られた形質転換された微生物を、 それ自 体は公知の方法で培養する。 培地としては、 例えばダルコ一 スとカザミノ酸を舍む M 9培地 （T.Maniatisら編、 Molecular し loning, P440 Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1982) があげられ、 発現型プラス ミ ドの宿主内安定化のため に、 必要に応じて、 例えば、 アンピシ リ ン等を添加するのが . 望ま しい。
培養は目的の形質転換された微生物に適した条件、 例えば 振盪による通気及び攪拌を加えながら、 3 7 てで 2〜 3 6時 間行う。 また、 培養開始時または培養中に、 プロモーターを 効率良く 機能させる目的で、 3 — 一イ ン ドールアク リル酸 ( tr プロモーターの場合） 、 イ ソプロ ピル一 9一 D—チォ ガラク ト シ ド （ tac プロモーターの場合） などの誘導薬剤を 加える こ ともできる。
培養後、 例えば、 遠心分離により、 形質転換された微生物 細胞を集め、 例えば、 リ ン酸バ'ッファーに懸濁させ、 例えば、 超音波処理により細胞.を破砕し、 遠心分離により容易に融合 蛋白を高純度に単離することができる。 この融合蛋白は、 そ のまま、 ヒ ドロキシルア ミ ン処理あるいは ト ロ ンビン処理に よって開裂でき、 無傷で目的蛋白を分離、 放出できるのが本 発明の特徴である。 必要によっては融合蛋白のシスティ ン残 基をスルホ化し ト ロ ンビ ン処理する事により 目的蛋白のスル ホ化分子を分離する事が出来る。
ヒ ドロキシルァ ミ ン （その同族体、 即ち化学構造が類似し 同様の作用を有する化合物を舍む。 以下、 同じ。 ） で開裂で きるア ミ ノ酸配列で連結した融合蛋白では、 ヒ ドロキシルァ ミ ンをアルカ リ条件下、 4 5 にて 2〜 4時間、 ト ロ ンビン (その同族体、 即ち化学構造が類似し同様の作用を有する酵 素を舍む。 以下、 同じ。 ） で開裂できるア ミ ノ酸配列で連結 した融合蛋白では、 ト ロ ンビンを 3 7 ·(：にて 2〜 2 4時間作 用させることで、 目的蛋白を容易に融合蛋白より分離し、 単 離することができる。
かく して得られた目的蛋白が、 ジスルフィ ド結合を介して 高次構造を形成している場合、 例えば、 チャ ンスらの方法
(R.E. Chanceら、 Peptides ： 第 7回米国ぺプチ ドシンポジゥ ム Proceedings (Dj ich及び E,Gross編） ヽ 721-728, Pierce Chemical Co., Rockford, IL. (1981)参照） を用いることに より、 天然の蛋白と同様な高次構造を有する生物学的に活性 な蛋白とすることができる。 トロ ンビン開裂法でスルホ化法 を経由する方法では、 スルホ化目的蛋白を還元後分子内ジス ルフィ ド結合を形成させ天然の蛋白と同一の高次構造を有す る生物学的に活性な蛋白とすることができる。
本発明で得られる（Asn55— Ala107) SLPI断片ポリベプチ ド
(エラスターゼ阻害活性ポリペプチ ド） は、 それ自体公知の 分離、 精製法を適当に組み合わせて反応液中より分離、 精製 することができる。 これらの公知の分離、 精製法としては、 塩折や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、 透折法、 限 外濾過法、 ゲル濾過法および S D S—ポリ アク リルァ ミ ドゲ ル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、 ィ オ ン交換ク ロマ トグラフィー、 イオン交換高速液体ク ロマ ト グラフィ ーなどの荷電の差を利用する方法、 ァフィ二ティ一 ク ロマ トグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、 逆 相高速液体ク 口マ グラフィ一などの疎水性の差を利用する 方法、 等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法な どがあげられる。 また、 それ自体公知のジスルフ ィ ド結合形 成反応を用い、 本発明の SLP I断片ポリ ペプチ ドを、 活性を有 する高次構造蛋白にすることもできる。
本発明のヱラスターゼ阻害活性ポリ ベプチ ドの各種蛋白分 解酵素に対する阻害活性を比較した場合、 後で第 4表に示す ように、 SLP Iが有するエラスターゼ阻害活性は維持されてい るが、 ヒ ト ト ロ ンビン、 ヒ トプラス ミ ン、 ヒ トカ リ ク レイ ン などの ト リプシン様セリ ンプロテア一ゼに対する阻害活性は 顕著に低下しており、 全体としてヒ ト白血球エラスターゼの 阻害に対する選択性が向上している。 従って、 SLP Iに比べて、 本発明のポリぺプチ ド（As n 5 5— A l a 1 0 7) SLP Iのェラスターゼ 阻害活性は ト リ プシンに対するそれより改善されており、 従 つて臨床医薬としてより有利であると期待される。
この蛋白には、 多形核白血球エラスターゼ阻害活性がある ため、 各種の病的状態、 例えば、 肺気腫および慢性関節リ ウ マチ、 糸球体腎炎、 歯周炎、 筋萎縮症、 その他白血球エラス ターゼ介在組織破壞を包含する各種疾患の治療薬、 及び MDS、 好中球起因ァ レルギ一性肺疾患、 敗血症ショ ッ クなどの治療 薬として利用できる。
この蛋白は、 必要により これを凍結乾燥により粉末とする ことができる。 凍結乾燥に際しては、 例えば、 ソルビ トール、 マンニ トール、 デキス ト ロース、 マル トース、 グリ セロール、 ヒ ト血清アルブミ ン （ H S A ) などの安定剤を加えることが できる。
この蛋白は薬学的に許容出来る製剤の型で前記疾患の治療 に用いられる。 投与法は経口投与又は非経口投与例えば静脈 内投与、 筋肉内投与、 皮下投与、 経皮投与、 経直腸投与、 経 気道投与 （経肺又は経鼻投与） 、 関節内投与、 ionophoretic deviceを用いる投与などに適した製剤の形で使用できる。
なお本明細書および図面において、 アミノ酸、 ペプチ ド、 その他に閬し略号で表示する場合、 それらは IUPAC-IUB (Commission on Biological Nomenclature) による略号める いは当該分野における慣用略号に基づいた。 実施例
以下、 実施例により、 本発明をより具体的に説明するが、 本発明はこれらに限定されるものではない。
なお、 実施例において採用された種々の遺伝子工学的手法 は、 以下の如き方法で行った。
( 1 ) 制限酵素により D N Aの切断 （方法 1 )
D N A 0. 1〜 1 を制限酵素切断用バッファー （Mlu I , Pst I切断でば、 終濃度 10mM Tris-HC^ (pH 7.5 ) -lOmM MgC ί 2 — 0. 1 mgZfflfiゼラチン一 60mM aC^ - 6 mMメ ルカプ トェタノ一ノレ、 BamH I , Bgl I , Nde I , Sal I , Xho I切 断でば、 終濃度 10mM Tris-HC£ (pH 7.5 ) — lOmM MgC £ 2 - 0. 1 mgノ^ゼラチン一 150mM NaCi 一 6 milメルカプ トエタ ノールとなる水溶液） 1 0 Wに溶解させ、 それぞれの制限酵 素 2〜 4ユニッ トを添加して、 3 7 'Cで 1時間以上反応させ 切断を行った。
( 2 ) ァガロースゲル電気泳動 （方法 2 )
制限酵素による切断後、 3 の 0.25%ブロモフヱノ一ルブ ル一 ' 5 0 %グリ セロール水溶液を加え、 ァガロースゲル電 気泳動 （ゲル濃度 0. 7〜 1 %) を行った。
電気泳動バッフ ァーとしては、 9 0 mM ' Tris—ホウ酸 （pH 8. 0 ) — 2 mM EDTA水溶液を用いた。
( 3 ) ァガロースゲルより D N Aフラグメ ン トの画収 （方法 3 )
低融点ァガロースゲル （シグマ社製） を用いて、 ァガ口一 ス電気泳動を行い、 目的とする D N Aに相当するバン ドを切 り出し、 Weis landerらの方法 ( L . We i s 1 ander , Ana 1. B i ochem . , 98» 305 (1979)) により面収した。
( 4 ) T4-DNAリガーゼによる連結反応 （方法 4 )
連結すべき D N Aフ ラグメ ン トを混合しエタノール沈殺の 後、 連結反応用バッ フ ァ (66m Tris— HC (PH 7. 6 ) - 6. 6 mM MgC £ 2 一 lOmMジチオス レィ トーノレ一 1 mM ATP) 20≠ に溶かして、 2〜 1 0 ュニ ッ トの T4- DNAリ ガーゼを加え、
1 6 'Cで 1 2時間反応させて連結を行つた。
( 5 ) コ ンビテ ン ト セル調製および形暂転換 （方法 5 )
大腸菌 HB101株の形質転換は、 通常の CaCjg 2 法 （M.V.
Norgardらの方法） の改良法で行った。 すなわち、 5 の L 培地 （ 1 % ト リ プ ト ン、 0. 5 %酵母エキス、 0. 5 % aCi 、 PH7. 2 ) に大腸菌 HB101株の 1 8時間培養液を接種し、 菌体 を舍む培養液の 600nmにおける濁度（0D600)0.3まで生育させ る。 菌体を冷たいマグネシウム ' ノ ツファー （ 0. 1 M aCjg - 5 mM MgC i z 一 5 mM Tris-HC^ (pH 7. 6 ) 、 4 t ) 中で 2回洗い、 2 の冷やしたカルシウ ム ' ノ ッ フ ァ ー （100mM CaC £ 2 -250mM C& - 5 mM MgC £ 2 - 5 mM Tris
(pH 7. 6 ) 、 4 'C ) 中に再懸濁させ、 4 てで 2 5分間放置す る。 集菌後菌体を 200 の冷カルシウム · バッファ一中に懸 濁し、 違結反応溶液と 1 0 ： 1 (vol. ： vol. ) 混合する。 こ の混合物を 6 0分間、 4 'Cで保った後、 1 ^の L B G培地
( 1 % ト リ プ ト ン、 0· 5 %酵母エキス、 1 % NaC£ 、 0.08% グルコース、 pH7. 2 ) を添加し、 3 7 'Cで 1時藺振盪培養す る。 培養液を、 選択培地 （アンビシリ ン 3 0 Z を含む L 培地プレー ト） に プレー トの割合で接種する。 プレ — トを 3 7 'Cで 1晩培養して、 形質転換株を生育させる。
得られたアンビシリ ン耐性のコ ロニーより、 Birnboimらの '法 ( Birnboim, H. C. and J. Dol , Nucleic Acids Res . , L.1513 (1979))を用いて、 プラス ミ ド D N Aを調整し、 適当 な制限酵素を用いて加水分解を行い、 ァガロースゲル電気泳 動により、 そのパターンを解折して、 目的のクローンを得た。
( 6 ) D N A塩基配列の决定 （方法 6 )
Chenらの方法 (Chen, E. Y. and Seeburg, P.H. , 隠， j, 165 (1985)) に従って、 プラスミ ド D NAを籙型として、 ブ ライ マ一ば M 13プライマー M 3 , R Vあるいは PBR322ブラィ マ一 S 2 (いずれも宝酒造製） を用い、 M13シークェンスキ ッ ト （アマシャム · ジャパン製） を使用して D N A配列決定 を行つた。
( 7 ) その他の方法
すべての D N A操作は Maniatis等の方法（Molecular Clonings Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982) こより 亍 つた。
荬施例 1.
(Asn55-Ala107) SLPI断片ポリ ぺプチ ドの構造遺伝子の合成 とサブク α—二ング
第 1図に示す SLPIのア ミノ酸配列 （R.C.Thompsonら、 Proc. Natl. Acad. Sci. , USA, 83, 6692 (1986) ； V· Seemul lerら、 FEBS Lett., 199, 43 (1986)) を基にして、 大腸菌において 使用頻度の高いコ ドンを選択し、 遺伝子構築のために、 第 2 図に示すように適当な位置に制限酵素認識部位を設け（Asn55 -Ala107) SLPI断片遺伝子のデザィ ンをした。 次に第 3図に 示す位置で区切って、 6本のオリ ゴヌク レオチ ドを化学合成 した。 オリ ゴヌク レオチ ドの合成は全自動 D N A合成機 （ァ プライ ド . バイオシステムズ、 モデル 381A ) を用いて、 ホス フォア ミダイ ト法により行った。 合成オリ ゴヌク レオチ ドの 精製は、 アプライ ド ' バイオシステムズ社のマニュアルに準 じて行った。 すなわち、 合成オ リ ゴヌク レオチ ドを含むア ン モニァ水溶液を 5 5てで一晩保つことにより、 D N A塩基の 保護基をはずし、 セフアデックス G-50ファイ ン ' ゲル （ファ ルマシア） を用いたゲル瀘過によって、 高分子量の合成オリ ゴヌク レオチ ド画分を分取する。 次いで、 7 M尿素を舍むポ リ アク リ ルァ ミ ドゲル電気泳勳 （ゲル濃度 2 0 %) の後、 紫 外線シャ ドウイ ング法により泳動パターンの観察を行い、 目 的のオリ ゴヌク レオチ ド部分に相当するバン ドを切り出し、 そのポリ アク リ ルア ミ ドゲル断片を細かく破砕した後、 2〜 5 の D N A溶出用バッ ファー（500mM NH40Ac- 1 m« EDTA — 0. 1 %SDS(pH7. 5 ))を加え、 3 7 'Cで一晩振盪した。 遠心 分離により、 目的の D N Aを舍む水相の回収を行った。 最後 に合成オリ ゴヌク レオチ ドを舍む溶液をゲル濾過力 ラム （セ フアデッ クス G- 50 ) にかけることにより、 合成オ リ ゴヌク レ ォチ ドの精製品を得た。 なお、 必要に応じて、 ポリ アク リ ル ァミ ドゲル電気泳動を操り返し、 合成ォリ ゴヌク レオチ ドの 純度の向上をはかった。 このようにして得られた合成オリ ゴ ヌク レオチ ド精製物 0. 1〜 1. 0 を、 1 mMA T P存在下でポ リ ヌク レオチ ドキナーゼ反応を行い、 5 ' 末端側をリ ン酸化 した。
リ ン酸化反応はポリ ヌク レオチ ドキナーゼ （ P — Lバイオ ケミカノレズ） 5 ニッ トを用いて 5 0 mM Tris -HC£ ( H 9. 5 ) -10mM MgC £ 2 — 5 mMジォチスレイ トール水溶液中で 行った。 5 ' 末端をリ ン酸化した、 第 3図で示す上の鎖と下 の鎮に相当する 2本の合成オリ ゴヌク レオチ ドを混合し、 そ の水溶液温度を 7 0 'Cから室温まで徐々に冷却することによ り、 ァニーリ ングを行った。
サブクローニングのために、 1 のプラスミ ド pUC119 (宝 酒造社製） を、 方法 1 に準じて、 制限酵素 BaniH I および Pst Iで切断し、 線状化された断片をァガ π—スゲル電気泳勖 (方法 2 ) で分離し、 方法 3に準じて線状プラスミ ドをゲル より画収した。 回収した線状プラスミ ドと、 アニーリ ングさ せた合成フラグメ ン ト （①、 及び②） 、 （③、 及び④） 、 又 は （⑤、 及び⑥） 各 6 を混合し、 ヱタノ一ル沈毂の後、 方 法 4に準じて T4MAリガ一ゼで連結反応を行った。 方法 5 に従って調製した大腸菌 （HB101)のコ ンビテン ト細 胞 200 に連結反応液を加えて、 方法 5で形質転換を行った。 選択培地 （方法 5 ) に生育したコロニーより、 方法 5でブラ ス ミ ド D N Aを調製した。 目的のサブク ローン pUC-D6 (SLPI の後半部分、 Asn55— Ala1 Q 7を含む） の製造確認は、 方法 1 に準じて、 制限酵素 BamH I , Sal I , Mlu I , Nde I , Xho I、 又は Pst I でそれぞれ切断し、 ァガロース電気泳動 （方 法 2 ) の切断パターンで確認した。 また、 方法 6 に従って、
D N A塩基配列解折を行って塩基配列を直接確認した。
実施例 2.
(Met^Phe1 - Phe1 39 ) ヒ ト成長ホルモン断片と（Asns 5— Ala 1 07 ) SLPI断片ボリ ぺプチ ドの融合蛋白発現プラス ミ ド pGH- TE ( ト ロ ンビン切断部位を介する） およびその性質転換体の調製
第 5図に示すように、 ヒ ト成長ホルモ ン発現プラスミ ド pGH-L9(M. Ikehara ζ> . Proc . Na 11. Acad . Sc i . USA, 81, 5956 (1984) ) 1 を制限酵素 Bgl Π と Sal I で切断し、 ァガロー ス電気泳動 （方法 2 ) で分離し、 ゲルより回収した （方法 3 ) 。 また、 実施例 1 で得られた P C-D62 を、 制限酵素 Mlu I と Xho I で切断し、 ァガロース電気泳動 （方法 2 ) で分離し、 約 0.15 Kbpの D N A断片をゲルより回収した （方法 3 ) 。 一 方、 第 4図に示した如き ト ロ ンビンで切断可能なァ ミ ノ酸配 列をコー ドする合成 D N Aフラグメ ン ト⑦及び⑧を別に化学 合成した。 そして、 前記の回収した 2種の D N A断片とア ン ニーリ ングした合成フラグメ ン ト⑦ ， ⑧各 1 を混合し、 ェ タノ 一ル沈澱の後、 T4DNA リガーゼで連結反応 （方法 4 ) を 行った。 実施例 1 と同様な方法で大腸菌 HB101に形質転換を 行い、 選択培地に生育したコ ロニーより、 目的とする融合蛋 白発現プラスミ ド PGH-TEを有する組み換え菌を得た。 プラス ミ ド pGH-TEは実施例 1 と同様の方法で構造確認した。
なお、 プラスミ ド pGH-TEを舍有する大腸菌 HB101は、 大腸 菌 HB101株（PGH-TE)として、 工業技術院微生物工業技術研究 所 （ F R I ) 、 日本国 305、 茨城県つく ば市東 1丁目 1番 3 号に、 微ェ研条寄第 2168号 （FERM BP-2168) として、 1988年
12月 I Bに、 ブダペス ト条約に基づき国際寄託された。
実施例 3.
(Met^Phe1 -Phe139) ヒ ト成長ホルモン断片と（Asn55— A la 1 ° 7 ) SLPI断片ポリ ぺプチ ドの融合蛋白発現プラス ミ ド pGH-HE (ヒ ドロキシルァミ ン切断部位を介する） 及びその形質転換体の 調製
第 5図に示す方法で、 実施例 2の合成フラグメ ン ト⑦ ， ⑧ の代わりに'、 別途合成したヒ ドロキシルァ ミ ンで切断可能な ァミノ酸配列をコ一ドする合成 D NAフラグメ ン ト⑨ ， ⑩
(第 4図） を用いて、 実施例 2 と同様な摸作を行い、 融合発 現プラスミ ド pGH，HE及びそれを-有する大腸菌 HB101の形質転 換体を得た。
なお、 このプラスミ ド pGH- HEを舍有する大腸菌 HB101は、 大腸菌 HB101株（pGH- HE)として、 F R I に、 微ェ研条寄第
2167号 （FEBM BP-2167) として、 1988年 12月 1 日にブダぺス ト条約に基づき国際寄託された。 実施例 4.
融合蛋白遺伝子の発現
実施例 2及び 3 で得られた融合蛋白遺伝子発現プラス ミ ド pGH-TEを有する大腸菌 HB101株、 及び PGH- HEを有する大腸菌 HB101株を、 50〜 lOOfigZi のァンピシリ ンを舍む L培地
( 1 % ト リ プ ト ン一 0. 5 %酵母ェキス— 1 % NaC （pH 7. 5 ) をオー トク レープ滅菌して使用） に接種し、 一晩培養した。
0. 2 %グルコース及び 5 mgノ^のカザミノ酸を舍む M 9培 地 （ 0. 6 %NazHP04 一 0. 3 % H2P04 - 0.05% NaC£ — 0. 1 %NH4CJ2 水溶液、 pH7. 4 ) をオー トク レーブ滅菌した後に、 別途にオー トク レープ滅菌した MgS04 水溶液及び CaC 2 水 溶液をそれぞれ最終濃度 2 及び 0. 1 mMになるように加えた ものに、 前記の一晩培養液を、 OD660が 0. 1 となるように加 え、 3 7 'Cで培養を行った。 0D660が 0. 5 となった時に、 ： Λ 終濃度 4 0 になるよう 3— /?ーィ ン ドールアク リ ル酸 を培養液中に添加し、 さらに 0D660が 1. 0 に到達するまで、 3 7 'Cで振盪培養を続けた。 その後、 遠心分離により大腸菌 菌体を集めた後、 T Eバッファー （50mH Tris— HC ， mM EDTA , pH7. 5 ) を用いて菌体の洗浄を行った。
洗浄後の菌体を、 培養の 1 / 1 0容の T Eバッ ファーに懸 濁させ、 超音波発生装置 （久保田商事㈱、 200M型） を用いて 菌体を破壊した後、 遠心分離し、 目的とする融合蛋白を沈殺 部分に封入体 （Inclusion body) として得た。 沈澱を 0. 5 % Triton X- 100-lmMEDTA水溶液で洗浄した後、 再び T Eバッ フ ァ一で洗浄し、 7 ^ 尿素ー 2 0 |^ Tris (pH8. 0 ) 水溶液あ るいは 6 Mグァニジン塩酸一 2 0 mil Tris (PH8. 0 ) 水溶液 に溶かして、 2 0 mM Tris (pH8. 0 ) に対して透析を行い、 粗精製した融合蛋白水溶液を得た。 得られた水溶液に対して- Tris-HC^ ノ ツ ファー （pH6. 8 ) 、 S D S、 2 —メ ルカプ ト エタノール、 グリセロールをそれぞれ最終濃度 6 0 mM、 2 %■ 4 %、 1 0 %になるよう に加え、 S D S—ポリ アク リ ルア ミ ドゲル電気泳動 （U.K.Laemmli, Mature, 227, 680 (1970) ) を行った。 その結果を第 6図に示した。 第 6図においてレー ン 1 は、 下記に示す分子量マーカーを示す。 レーン 2 は大腸 菌 BH101株由来の蛋白、 レーン 3 は pGH-TEノ HB101 系で得ら れた蛋白、 レーン 4 は pGH- HEZHB101 系で得られた蛋白の電 気泳動の状態を示している。
なお、 その後、 粗精製蛋白は、 ィォン交換ク 口マ トグラフ ィ一、 逆相クロマ トグラフィ一によつて精製した。 蛋白質 分子量
Lysozyme 14,400
Soybean trypsin inhibitor 21,500
Carbonic anhydrase 31,000
Ovalbumin 45,000
Bovine serum albumin 66,200
Phosphor lase B 92,500 実施例 5.
融合蛋白の ト 口 ンビンによる切断反応
実施例 4で得られた pGH-TEを有する大腸菌 HB101を培養し て得られた蛋白溶液について、 全蛋白質量の 1 ノ120 量 （W /W ) のヒ ト ト ロ ンビン （シグマ社製） を加え、 3 7 てで 1 5時間反応を行つた。 反応液を実施例 4 に示した方法で処 理し、 S D S—ポリ アク リ ルゲル電気泳動を行った。 その結 果を第 7図に示した （レーン 2〜 4 ) 。 融合蛋白 （分子量約 20,000) はスロ ンビンによって切断され、 ヒ ト成長ホルモン 由来のペプチ ド （分子量約 14, 000 ) と、 目的とする（Asn35— Ala' °7) SLPI断片ポリ ペプチ ド （分子量約 6, 000)の 2本のバ ン ドを示すことがわかった。 なお、 第 7図において、 レーン 1 は第 6図の場合と同じ分子量マーカーである。
実施例 6.
融合蛋白のヒ ドロキシルア ミ ンによる切断反応
実施例 4で得られた PGH-HEを有する大腸菌 HB101を培養し て得られた蛋白溶液について、 終濃度で 2 Mヒ ドロキシルァ ミ ン一 0. 2 M Tris(pH9, 0 ) となる溶液として、 4 5 'Cで 4 時間反応させた。 反応液を実施例 4 に示した方法で処理して、 S D S—ポリ アク リルァミ ドゲル電気泳動を行つた。 その結 果を第 7図に示した （レーン 5 〜 7 ) 。 融合蛋白 （分子量約 20,000 ) はヒ ドロキシルァ ミ ンによって切断され、 ヒ ト成長 ホルモン由来のペプチ ド （分子量約 14, 000 ) と、 目的とする N—末端がグリ シル化された（Asn55— Ala1 07 ) SLPI断片ボリ ぺプチ ド （分子量約 6, 000)の 2本のバン ドを示すことがわか つた。
実施例 7.
実施例 5 , 6 で得られた S D S—ボリ アク リ ルア ミ ドゲル の結果から、 目的とする SLPI断片ポリ ぺプチ ドのバン ドを切 り出し、 7 0 %ギ酸でポリ ペプチ ドをゲルより抽出し、 濾過 の後減圧下で乾燥し乾固させた。 乾固させたサンプルを、 ト リ フルォロ酢酸に溶かし、 Applied Biosys tems社のマ二ユア ルに従ってボリ プレンフィルターに吸着させて、 プロティ ン♦ シーケンサー （Applied Biosysteras 470A)にて N—末端より P T H—ァ ミノ酸の切断を行い、 P T Hアナライザ一（Applied Biosystems 120A)にて解折を行って、 N—末端からのァミノ 酸配列を浃定した。 その結果は第 1表のとおりであった。
m 1 ¾
Figure imgf000036_0001
この結果より、 得られたボリ ペプチ ドの N—末端のァミノ 酸配列は、 目的とする（Asn55— Ala 1 Q7) の SLPI断片の配列と —致した。 すなわち ト ロ ンビン又はヒ ドロキシルァ ミ ンによ つて、 融合蛋白から（Asn55— Ala107) SLPI断片ポリ ベプチ ド が正しく切り出されていることが確認できた。 P88/0132
35 荬施例 8.
発現させた融合蛋白、 スロ ンビンで切断した生成物、 及び ヒ ドロキシルァ ミ ンで切断した生成物について、 エラスター ゼ阻害活性を次の様にして測定した。
〔試蕖溶液〕
緩衝液 ： 0. 1 M HBPES, 1. 0 M NaC , 0. 1 % PEG-6000
( H 7. 5 )
エラスターゼ （ヒ ト喀痰由来多形核白血球エラスターゼ） ： エラスターゼ （EPC 社製、 フナコ シ製薬） 2 m Z
/^の緩衝液 （保存液） を 30, 000倍に上記緩衝液で 希釈して調製する （ 1. 0 X 10_8M ) 。
基質溶液 ： MeO-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-p (Backem ¾t) の
.1 8 rag id DMS0溶液 （保存液） を 1 0倍に上記 緩衝液で希釈して調整する （ 3 X10_3M ) 。
ELISA用 9 6穴マイ ク ロプレー トの穴に 140 の上記緩衝 液を加え、 次に被験サンプル溶液 2 0 Wを加え、 次にエラス ターゼ溶液 2 0 を加えた。 この混合物を 3 7てにて 1時間 攪拌した後、 基質溶液 2 0 Wを加えて 3 7 'Cにて 1時間反応 せしめることにより発色せしめ、 405nraでの吸光度を測定し た。 この結果を第 2表に示す。 2
Figure imgf000038_0001
融合蛋白については、 ト ロ ンビン処理又はヒ ド aキシルァ ミ ン処理の有無にかかわらず、 エラスターゼ阻害活性が検出 された。
実施例 9.
融合蛋白のシスティ ン残基のスルホ化
実施例 4で得られた融合蛋白 250mgを 7 M尿素— 0. 5 M Tris-HCjg (pH8.2 )100ffl2に溶かした後、 終濃度 0.3 mMとな るように亜硫酸ナ ト リ ウム （和光純薬） を加えて 4 5 で 3 0分反応させた。 次に、 終濃度 0.05mMとなるように 4チォ ン酸ナ ト リ ウム （シグマ社） を加えて 4 5てで 3 0分反応さ せた。 反応液を透圻チューブ （10K) にいれて、 10Lの水に 対して 1画、 10Lの 5 0 mM Tris-HC^ 緩衝液 （pH8. 5 ) に 対して 2回透圻を行った。
実施例 1 0.
スルホ化融合蛋白の ト 口 ンビンによる切断反応
実施例 9で得られたスルホ化融合蛋白溶液に、 全蛋白質量 の 1ノ 2000量 （ Wノ W) のゥ シ ト ロ ンビン （シグマ社） を加 え、 3 7 てで 1 2時間反応させた。 反応液の一部を逆相 HPLC にて分折した結果を図 8に示す。 また、 各ピークのフラク シ ョ ンを分取して、 SDS-PAGEにて解折した結果を図 9 に示す。
各フラク ショ ンについて、 プロテイ ン. シーケ ンサ一
(Applied Biosystems 470A)と P T Hアナライザー（Appl i ed
Biosystems 470A)を用いて、 N—末端ア ミノ酸配列を決定し た。 その結果を第 3表に示す。
第 3 表 サ イ ク ル 数
ピ ー ク 番 号
1 2 3 5 6 8 9 10
1 Asn Pro Thr Arg Arg し ys Pro G 1 y Lys 2 Ala His Arg Leu His
3
Met Phe Pro Thr lie
4 / / / / /
Ala His Arg Leu His
5
(Asn55— Ala1。7) SLPI Asn Pro Thr Arg Arg Lys Pro Gly lys Cys 以上の結果より、 目的とする（Asn55— Ala'°7) SLPI断片ポ
リ ぺプチ ドのスルホ化誘導体は、 ビーク 1であることがわか
つた。 分取 HPLCカ ラム （Vydac-214TP1010)を用いて、 ピーク
1 を分取して凍結乾燥を行い、 （Asn55— Alai°7) SLPI断片ポ
リ ぺプチ ドのスルホ化誘導体 2 mgを得た。
実施例 1 1 .
(Asn55-Ala107) SLPIポリ べプチ ド断片のスルホ化誘導体の
活性分子への refolding 実施例 1 0で得られた（Asn55— Ala107) SLPIポリ ぺプチ ド 断片のスルホ化誘導体 2 mgを 5 0 mM Tris— HC (pH8.0 ) 1 に溶かして、 終濃度 1 %となるように 2 —メ ルカプトェ タノールを加え、 4 5てで 2時簡反応させた。 その溶液に、 3 M酢酸ナ ト リ ウム （pH5.0 ) 1 を加えて、 透折チューブ にいれて、 5 0 mil酢酸ナ ト リ ウム （pH5.0 ) — 1 0 rfl酸化型 ダルタチオン一 2 0 ^還元型グルタチォン溶液 10 Lに対して 透析を行い、 更に 10Lの 5 0 mM Tris— HC 緩衝液 （pH8.5 ) に対して 2 HI透圻を行った。 得られた溶液を、 逆相 HPLCにて 分離して、 活性型（Asn55— Ma'°7) SLPI断片ポリペプチ ド 1 mgが得られた。 HPLCの分離パターンを第 1 0図に示す。
実施例 1 2.
活性型（Asn55— Ala107) SLPI断片ポリぺプチ ドのセリ ンプロ テアーゼ阻害活性測定
実施例 1 1 に示した方法によって、 refoldingを行った活 性型（Asn55— Ala107) SLP I断片ポリ ペプチ ドの各種セ リ ンプ 口テア一ゼの砠害活性を測定した。 測定方法を次に示す。
(試薬溶液）
緩衝液 ： 0. 1 M HEPES, L 0 M NaC£ , 0. 1 % PEG-6000
(PH7.5 )
酵素溶液 ： 各酵素を第 4表に示す終濃度の 1 0倍濃度とな るように上記緩衝液に溶かす。
( 1 ) ヒ ト喀痰由来多形核白血球エラスタ一ゼ
( E P C社製 ： フナコ シ薬品）
( 2 ) ゥシ脬臓ト リ プシン （シグマ社製） ( 3 ) ゥ シ脬臓キモ ト リ ブシン （シグマ社製）
( 4 ) ブタ脬臓エラスターゼ （シグマ社製）
( 5 ) ヒ ト血漿 ト ロ ンビン （力ビ社製 ： 第一化学薬品） ( 6 ) ヒ ト血漿プラス ミ ン （力ビ社製 ： 第一化学薬品） ( 7 ) ヒ ト血漿カ リ ク レン （カビ社製 ： 第一化学薬品） 基質溶液 ： 上記の酵素 （ 1 ) 〜 （ 7 ) のために、 それぞれ 次に示す各基質を濃度が 1 O mMとなるように、 ジメ チルスルホキシ ドに溶かして保存溶液とし て、 終濃度の 1 0倍濃度となるように上記緩衝 液に溶かして、 基質溶液とする。 基 質 反応液終濃度
( 1 ) MeO-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-pNAn 0.3 mM
( 2 ) Bz-Arg-pNA° 1.0 mM
( 3 ) Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA° 0.1 mM
( 4 ) Suc-Ala-Ala-Ala-PNAn 0.1 mM
( 5 ) H- D- Phe-Pip-Arg-pNA2> 0.1 mM
( 6 ) H-D-Val-Leu-Lys-pNA2) 0.1 mM
( 7 ) H-D-Pro-Phe-Arg-pNA > 0.1 mM
1 ) Backem社製 2 ) 力ビ社製 ： 第一化学薬品
ELISA用 9 6穴マイ クロプレー トの穴に 140 の前記緩衝 液を入れ、 次に 2 0 Wの被験サンプル溶液を加え、 次に 2 0 の酵素溶液を加えて、 この混合物を 3 7 'Cにて 3 0分間攪 拌した。 次に、 2 0 Wの基質溶液を加えて 3 7 てにて 1時間 攪拌し、 発色せしめ、 405nmにて吸光度を測定した。 白として、 活性型（Asn55— Ma107) SLPI断片ポリ ぺプチ ドぉ よび陽性対照として —AT (シグマ社製） とァプロチニ ン （ベ一リ ンガ一社製） を使用し、 これらの溶液の濃度を変 化させ阻害活性 Oを測定して、 5 0 %の阻害活性を示す阻害蛋 白濃度 （ I C5。値： 3） を求めた。 その結果を第 4表に示す。
第 4 表
Asn55- (X i ― P I Aprotinin ヒト喀痰由来多形核白血球 1 10" 9 3X10- "9M 3X10" 7M エラスターゼ ο-9Μ)
ゥシ膝臓トリプシン 1. 3X10- 7M 2X10- "7 1 10" 7M ゥシ塍臓キモトリプシン 1X10- 8M 2X10- 5X10" 8M
(10"8M)
ブタ塍臓エラスターゼ 2X10- M 3X10 -7 >2X10- 6M ヒ ト血漿トロンビン > 2X10" 6M >2 10 -6 >2X10" 6
(10- 11 M)
ヒ ト血漿プラスミン > 2X10- 6M >2X10 "6 5X10" 9M ヒ ト血漿力リクレン > 2X10" 6M >2 10 "6M 7X10-
(10"8M)
また、 上記のデータより Dixonらの方法 （Dixon, and Webb, E.C. (1979) "Enzymes" .Longman.) X Hendersonらの 方法 （Henderson, P丄 F,， (1972) Biochem. J. , 127, 321-333.) に従って、 本発明の Asn55— Ala1 <J7SLPIの阻害定数 Ki を求 めた。 その結果を第 5表に示す。
第 5 表
Dixon 法 henderson 法 ヒ ト喀痰由来多形核白血球 3X10- 11 M 2X10"10 M エラスターゼ
ゥシ膝臓ト リプシン 6X 10"8M 2X10"8M .以上の結果、 本発明のエラスタ一ゼ阻害性ペプチ ドにおい ては、 ヒ ト喀痰由来多形核白血球エラスターゼの ki [ki(E)] とゥシ脬臓ト リ プシンの ki [ki(T)] の測定結果より、 胆害定 数 ki の相対比 [ki (T)Zki (E)]は 100分の 1から 1,000分の 1 となり、 SLPIに比べて、 エラスターゼに対する特異性が向 上していることが明らかとなった。 なお、 SLPIにおいては、 上記ェラスターゼに対する ki (E)と上記ト リ プシンに対する ki (T)はほぼ同等であることが知られている（B.C.Thompson ら、 Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 83. 6692, 1986) 0
荬施例 1 3.
血清アルブミ ンの驵害活性に及ぼす影響
0, 8 %および 8 %のゥシ血清アルブミ ン （シグマ社製） の 存在下で実施例 1 2 の阻害活性測定法により、 活性型（Asn55 -Ala107) SLPI断片ポリ ペプチ ドのヒ ト喀痰由来多形核白血 球エラスタ一ゼ阻害活性を測定したところ、 何等影響な く同 等の阻害活性を示した。
実施例 1 4.
熱安定性
活性型（^1155— 31。7) SLPI断片ポリ ペプチ ドの 5 0 mM Tris (pH7.8 ) 溶液を、 5 0 てで 2時間処理したのち、 ヒ ト 喀痰由来多形核白血球ェラスターゼ阻害活性を測定したとこ ろ、 100%活性を維持する事が認められた。 産業上の利用可能性
本発明のエラスターゼ阻害性ポリ ぺプチ ドは強いエラスタ —ゼ阻害活性を有するが他のセリ ンプロテア一ゼ、 特に ト リ プシン様セリ ンプロテアーゼ、 に対する阻害活性が非常に低 いため、 肺気腫の進行を抑制するための医薬等としての用途 が期待される。
また、 本発明の、 ヒ ト生長ホルモン又はその部分を担体蛋 白として用いる融合蛋白発現系は、 比較的低分子のペプチ ド の遺伝子組換えによる製遣のために極めて効率的であり しか も凡用され得る。
規則第 1 3規則の 2の寄託された微生物への言及
寄託機関 ： 通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所 あて名 ： 日本国茨城県つく ば市東 1丁百 1番 3号
受託番号及び寄託した日付：
1 . 微ェ研条寄第 2167号 昭和 6 3年 1 2月 1 日 2 . 微ェ研条寄第 2168号 昭和 6 3年 1 2月 1 日

Claims

請 求 の 範 囲 '
1. 式 （ I ) ：
X Asn-Pro-Thr- Arg-Arg-Lys-Pro-Gly-Lys-Cys- Pro-Val-Thr-Tyr-Gly-Gln-Cys-Leu-Met-Leu- Asn-Pro-Pro-Asn-Phe-Cys-Glu-Met-Asp-Gly- Gln-Cys-Lys-Arg-Asp-Leu-Lys-Cys-Cys-Met- Gly-Met-Cys-Gly-Lys-Ser-Cys-Val-Ser-Pro- Val-Lys-Ala -„
( I )
(式中、 Xは Glyを表すか又は存在せず、 そして nは 1〜 1 0の整数を表す。 ）
で表されるァ ミノ酸配列もし く はエラスターゼ阻害活性を有 するその一部分又はそれらと生物学的に同等のア ミノ酸配列 を有するエラスターゼ驵害活性ポリ ぺプチ ド又はそのホモポ リ マー。
2. 分子中のシスティ ン残基が 1〜 8個スルホ化されてい る、 請求項 1 に記載のポリ ペプチ ド又はそのホモポリ マー。
3. 分泌型白血球蛋白分解酵素阻害蛋白 （SLPI) のカルボ キシ末端側のおよそ半分から成り、 エラスターゼ阻害活性を 有し、 ト リ プシン様セ リ ンプロテアーゼ阻害活性のェラスタ ーゼ阻害活性に対する相対阻害活性が 1 0分の 1以下である エラスターゼ胆害性ポリ ペプチ ド、 並びに 1個もし く は複数 個のア ミノ酸の付加、 欠失及びノ又は置換を有し上記の生物 学的活性を有するポリ ぺプチ ド。
4. 式 （ E ) ：
Y - B - Z ( Π )
〔式中、 Υはヒ ト成長ホルモ ン又はそのポリ ペプチ ド断片か らなる担体蛋白を表し ；
ζは式 （ m ) ：
t ~ Asn-Pro-Thr-Arg-Arg-Lys-Pro-Gly-Lys-Cys- Pro-Val-Thr-Tyr-Gly-Gln-Cys-Leu-Met-Leu- Asn-Pro-Pro-Asn-Phe-Cys-Glu- et-Asp-Gly- Gln-Cys-Lys-Arg-Asp-Leu-Lys-Cys-Cys-net- Gly-Met-Cys-Gly-Lys-Ser-Cys-Val-Ser-Pro- Val-Lys-Ala ト n
( I )
(式中、 nは 1〜 1 0の整数を表す。 ）
で表される配列もし く はその一部分又はそれらと生物学的に 同等のァ ミノ酸配列を有するェラスターゼ阻害活性ポリぺブ チ ド又はそのポリマ一からなる目的蛋白を表し ； そして
Bは目的蛋白を変性しない条件下で、 化学的又ば生物学的 方法により切断可能なァ ミノ酸配列を有する架橋べプチ ド又 はそのホモポリマーを表し ； ここで Bと Z中のアミノ末端の
Asnと結合している。 〕
で表される融合蛋白。
5. 前記式 （ H ) 中のシスティ ン残基が 1〜 8偭スルホ化 されている、 請求項 4に記載の融合蛋白。
6. 担体蛋白が、 天然のヒ ト成長ホルモ ンのァ ミノ酸残基 番号 1位の Pheから 139位の Pheまでのポリ ペプチ ド断片で ある、 請求項 4 に記載の融合蛋白。
7. 担体蛋白が、 天然のヒ ト成長ホルモ ンのァ ミ ノ酸残基 番号 1位の Pheから 122位の G 1 nまでのポリペプチ ド断片で ある、 請求項 4 に記載の融合蛋白。
8. Bが "(~Asn-Gly , ^-Val-Pro-Arg 及び
-(-Leu-Val-Pro-Arg ( nは 1〜 1 0の整数を表す） から なる群から選ばれるァ ミノ酸配列を有する架橋べプチ ド又は ポリ ペプチ ドであり、 そして Z中のア ミノ末端の Asnは Bの それぞれ Gly, Arg又は Argのいずれかと結合している、 請求 項 4に記載の融合蛋白。
9. 式 （ Π ' ) ：
Y - B - Z 2 ( Π ' )
〔式中、 Yはヒ ト成長ホルモン又はそのポリ ペプチ ド断片か らなる担体蛋白を表し ；
Z z はヒ ト多形核白血球ヱラスターゼ砠害蛋白質 （SLPI) のカルボキシ末端側のおよそ半分から成り、 エラスターゼ阻 害活性を有し、 セリ ンプロテァーゼ阻害活性がェラスターゼ 阻害活性の 100分の 1以下であるエラスターゼ阻害性ポリ ぺ プチ ド、 あるいは 1個もし く は複数個のァ ミノ酸の付加、 欠 失及び Z又は置換を有し上記の生物学的活性を有するポリ ぺ プチ ドを表し ； そして
Bは目的蛋白を変性しない条件下で、 化学的又は生物学的 方法により切断可能なァ ミノ酸配列を有する架橋べプチ ド又 はそのホモポリ マーを表し ； ここで Bは Z z のァ ミノ末端ァ ミノ酸と結合している。 〕 で表される融合蛋白質。 '
10. 請求項 1に記載の式 （ I ) (式 Φ Xは Glyである） で表 されるェラスタ一ゼ阻害活性ポリぺプチ ド又はそのホモポリ マ一の製造方法であって、 次の式 （RO ：
Y ^-Asn-Gly Z (IV) 〔式中、 Y及び τは式 （ Π ) において定義した通りであり、 そして ηは 1〜 1 0の整数を表し、 ここで式 （IV) 中の Gly は Z中のアミノ末端の Asnと結合している〕
で表される融合蛋白を、 ヒ ドロキシルァ ミ ン又はその同族体 で処理することを含んで成る方法。
11. 請求項 1に記載の式 （ I ) (式中 Xは存在しない） で表 されるエラスタ.一ゼ阻害活性ポリ ぺブチ ド又はそのホモポリ マーの製造方法であって、 次の式 （V) ：
Y— B ' — Z ( V)
〔式中、 Y及び Zは式 （ II ) において定義した通りであり、 そして B ' は -^Val-Pro-Argト„又は -^Leu-Val-Pro-Argト n を表し （ nは 1〜 1 0の整数を表す。 ） 、 ここで Zの Asnは B ' の Argと結合している。 〕
で袠される融合蛋白を、 ト ロ ンビン又はその同族体で処理す ることを含んで成る方法。
12. ヒ ト成長ホルモン又はそのポリ ペプチ ド断片からなる 担体蛋白をコードする遺伝子と、 目的蛋白又はその一部分を コ一ドする遺伝子が、 目的蛋白を変性しない条件下で化学的 又は生物学的方法により切断可能なァ ミノ酸配列を有する架 橋ペプチ ド又はそのホモポリ マーをコー ドする遺伝子を介し て結合している融合蛋白遺伝子。
13. 前記目的蛋白又はその一部分が、 前記式 （ m ) で表さ れるァ ミノ酸配列もし く はエラスターゼ阻害活性を有するそ の一部分又はそれらと生物学的に同等のァ ミノ酸配列を有す るエラスターゼ阻害活性ボリ ペプチ ドである請求項 1 2 に記 —載の融合蛋白遺伝子。
14. 目的蛋白を変性しない条件下で化学的又は生物学的方 法により切断可能なァミノ酸配列が、 "HAsn-Gly η , -Val-Pro-Arg -n 又は -(-Leu- Val -Pro- Arg ト n ( ϋは 1 〜 1 0 の整数） である請求項 1 2 に記載の融合蛋白遺伝子。
15. 担体蛋白が、 天然のヒ ト成長ホルモ ンのァ ミ ノ酸残基 番号 1位の Pheから 139位の Pheまでのポリ ペプチ ド断片で ある、 請求項 1 2に記載の融合蛋白遺伝子。
16. 請求項 12〜： 15のう ちいずれか 1項に記載の融合蛋白遺 伝子を舍む融合蛋白遺伝子発現型プラス ミ ド。
17. 請求項 12〜15のう ちいずれか 1 項記載の融合蛋白遺伝 子を舍む組み換え微生物細胞。
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