KR910007573B1 - 재조합 유전자 기술에 의한 에라스타제 억제 폴리펩티드 제조방법 및 에라스타제 억제 폴리펩티드 - Google Patents
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Abstract
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Description
[발명의 명칭]
재조합 유전자 기술에 의한 에라스타제 억제 폴리펩티드 제조방법 및 에라스타제 억제 폴리펩티드
[도면의 간단한 설명]
제1도는 SLPI의 1차 아미노산 서열을 나타낸 것으로서 한자로된 약어로 표시하였다.
제2도는 바람직하게 대장균에 사용되는 암호를 사용하여(Asn55-Ala107)SLPI폴리펩티드에 대한 합성 구조적 유전자의 서열을 나타내며 여기에서(Asn55-Ala107)SLPI는 SLPI의 제55번 Asn부터 제107번 Ala까지의 아미노산 서열을 이루는 폴리펩티드를 의미한다.
제3도는 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드 단편(1)부터 (6)까지를 나타낸다.
제4도는 (Met-1Phe1-Phe139)인체성장 호르몬단편(N-말단에 Met이 부가된 인체성장 호르몬의 제1번 Phe부터 139번 Phe까지의 아미노산 서열을 이루는 폴리펩티드)을 암호화하는 유전자와 (Asn55-Ala107)SLPI를 암호화하는 유전자를 결합시키는 결합펩티드를 암호화하는 합성 올리고뉴클레오티드 단편(7) 내지 (10)을 나타낸다.
제5도는 융합단백질 유전자를 발현시키기 위한 플라스미드 구조(실시예 2 및 3)의 개요를 나타낸다.
제6도는 발현된 융합단백질을 SDS-PAGE 처리한 결과(실시예 4)를 나타낸다.
제7도는 융합단백질을 트롬빈으로 처리(실시예 5)하거나 히드록실아민으로 처리(실시예 6)하여 얻어진 SDS-PAGE도면을 나타낸다.
제8도는 S-술폰화 융합단백질을 트롬빈 처리하여 제조되는 혼합물의 분석결과를 나타낸 것으로서 주된 피이피(peak)는 용출순서에 따라 1 내지 5번으로 정했다.
제9도는 제8도에 있는 최고점 1번 내지 5번의 SDS-PAGE처리결과를 나타낸다.
제10도는 실시예 11에서 제조한 재생된 (Asn55-Ala107)SLPI를 역으로 HPLC용출한 결과를 나타낸다.
제11도는 제10도에서와 같은 HPLC조건을 사용하여 제10도의 주 피이크를 역으로 HPLC분석한 결과를 나타낸다.
[발명의 상세한 설명]
[발명의 분야]
본 발명은 단백질을 융합하여 에라스타제(elastase)억제 폴리펩티드를 제조하는 방법뿐만 아니라 에라스타제 억제 폴리펩티드 및 이것을 제조하기에 적합한 융합단백질에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 융합단백질의 제조에 사용되는 융합단백질 유전자, 발현 플라스미드 및 이와 같은 것을 운반하는 미생물에 관한 것이다.
[배경기술]
DNA재조합 기술이 진보함에 따라 임상적으로나 경제적으로 가치있는 단백질(이하 목적단백질이라고 한다)을 미생물 세포내에서 생산하는 것이 가능해졌다. 미생물 세포를 숙주세포로 사용하여 이러한 단백질을 제조할 때 우선 다양한 세포들로부터 목적단백질의 유전자 암호를 분리해내거나 화학적으로 합성하고나서 유전자를 숙주세포내에서 발현시키면 목적단백질의 제조가 이루어진다.
그럼에도 불구하고 유전자의 발현 및 목적단백질의 제조에 있어서 장애 및 문제점이 존재하므로 미생물내에서 효과적이고 상업적 가치가 있는 규모로 목적단백질 또는 그 일부분을 제조하기 위해서는 우선 상기 문제점들이 해결되어야 한다.
예를들어, 펩티드 또는 아미노산 잔기가 100개 이하인 단백질과 같이 비교적 분자량이 낮은 단백질이 생성될 때 미생물 세포내에서는 생성된 펩티드 또는 단백질을 외부물질로 인식하여 여러 가지 종류의 단백질 분해효소로 가수분해하려는 경향이 있으며 이로인해 목적단백질을 효과적으로 형성하는 것이 불가능해진다. 그러므로 이 문제를 해결하기 위해서는 다양한 접근방법이 시도되어 왔다.
이러한 접근방법의 하나로서, 목적단백질의 유전자 및 목적단백질과는 다른 단백질(담체단백질을 가리킨다.)의 유전자를 연결시켜 융합단백질을 구성하고 미생물 세포내에서 융합단백질 유전자를 발현시켜 목적단백질을 형성하는 방법이 공지되어 있다.
이 방법의 실시로는, 목적단백질을 암호화한 유전자를 미생물 세포단백질 또는 단백질의 일부를 암호화한 내인성 유전자와 접합시켜서 미생물 세포내에서 이 구성된 유전자를 발현시키는 것이 공지되어 있다. 이러한 방법으로, 목적단백질이 세포내에서 가수분해되지 않는 모든 미생물 세포단백질 또는 그 일부와 융합되어 이루어진 융합단백질을 얻을 수 있다. 상기 목적에 맞는 담체단백질로 사용되는 이러한 미생물 단백질에는 β-갈락토시다아제(S.다나까(Tanaka)외, Nucl.Acids.Res. 10, 1741-1754, 1982), β-락타마아제(P.코넬리스(Cornelis)외, Mol.Gen.Genet. 186, 507-511, 1982), 클로람페니콜아세틸 전이효소(A.홉덴(Hobden)외, WPI 87-88509/13)알칼린 포스파타아제(일본특허 공개공보 제58-225098)등이 포함된다. 또한, 목적단백질이 단백질 분해되지 않도록 보호할 뿐만 아니라 목적단백질을 더욱 용이하게 정제되도록하는 담체단백질의 실례로서는 스태필로코귀스(Staphylococcus) 단백질 A가 공지되어 있다(일본특허 공개공보 제62-190087호 ; T.모크스(Moks)외, Biochemistry 26, 5239-5244, 1987).
이 방법의 두 번째 실시로는, 목적단백질을 암호화하는 유전자를 외부 단백질이면서도 세포내에서 이물질로 인식되지 않는 외인성 단백질 또는 그 단백질의 일부의 유전자와 접합하여 발현시키는 방법이 공지되어 있다. 이 방법으로는 목적단백질이 융합된 외인성 단백질 또는 그 일부를 안정하게 높은 수준으로 얻을 수 있다. 이러한 외인성 단백질의 실례로는 β-인터페론(I.이바노프(Ivanov)씨외, FEBS Lett. 210 56-60, 1987), α₁-항트립신(반 테르 스트라텐 A.(Vander Straten A)외, Bioscience Report 6 363-373, 1986) 등이 있다.
이렇게 얻은, 목적단백질과 담체단백질로 이루어진 융합단백질은 때로는 목적단백질의 생물학적 활성을 완전히 상실하게 되거나 목적단백질의 생물학적 활성이 감소된다. 또한 만일 융합단백질에 목적단백질의 생물학적 활성이 있다 하더라도 융합단백질은 예컨대 항원성과 같은 담체단백질의 생물학적 활성을 나타내려는 경향이 강하므로 이와 같은 융합단백질이 임상적으로 사용될 수는 없다. 따라서 목적단백질을 융합단백질로부터 분리해야 하는 것이다. 이렇게 하기 위해서는 접합을 위치-특이적으로 분리하기 위해 담체단백질과 목적단백질 사이의 접합 아미노산 서열(이하 결합펩티드라고 한다.)을 성공적으로 조작하여, 세포내에서 융합단백질을 생성한 후에 목적단백질을 융합단백질에서 분리해내도록 한다.
일반적으로 미생물 세포내에서 생성된 융합단백질은 담체단백질이 융합단백질의 N-말단 부위를 구성하도록 조작한다. 이러한 구조는 결합펩티드를 분리시킴으로써 담체단백질 및 N-말단 아미노산 잔기인 메티오닌으로부터 유리된 목적단백질을 제공할 수 있고 따라서 임상적으로 장점이 있게 된다.
이러한 위치-특이적 분리방법에는 화학적 시약을 사용하는 화학적 분리방법 및 효소를 사용하는 생물학적 분리방법이 포함된다. 화학적 분리방법에는 브롬화 시아노겐법, 히드록실아민법, 포름산법, NBS(N-브로모숙신이미드법), 리튬/메틸아민/NBS법, 브롬/염산법등이 포함된다. 대개 브롬화 시아노겐법이 사용되며 이다구라(Itakura)등은 브롬화 시아노겐을 사용하여 대장균 β-갈락토시다아제와 융합된 소마토스타틴(somatostatin)으로부터 목적단백질인 소마토스타틴을 산출하는 데에 성공하였다(K.이다구라 외, Science 198, 1056, 1977 ; 일본특허 공개공보 제54-163600호). 브롬화 시아노겐은 산성상태에서 메티오닌 잔기의 펩티드 결합을 가수분해한다. 그러므로 융합단백질을 위치-특이적으로 분리하기 위해서는 목적단백질의 N-말단에 메티오닌 잔기가 있어야 하고 목적단백질의 아미노산 서열중에는 메티오닌 잔기가 함유되어서는 안되므로 브롬화 시아노겐을 적용하는 것을 필요에 따라서는 제한해야 한다. 효소법에는 펩티드 중간분해효소 (endo peptidase)법이 포함된다.
펩티드 중간분해효소는 아미노산 서열 중간에서 한군데 또는 그 이상의 특정 아미노산을 인지하여 특이적으로 특정 아미노산의 카르복실부위에서 펩티드 결합을 분리한다. 여기에서, 펩티드 중간분해효소에 의해 특이적으로 인식되는 아미노산 및 아미노산 서열은 "인식된 아미노산" 또는 "인식된 아미노산 서열"이라고 부르기로 하겠다.
목적단백질을 산출하기 위해서, 미생물 세포에 의해 생성된 융합단백질을 절단하는데 사용하는 여러 가지 펩티드 중간분해효소에는 트립토판 합성효소로부터 인체의 칼시토닌을 산출하는데 사용되는 트립신(WO84/00380 ; β-갈락토시다아제와 융합된 β-엔돌핀으로부터 β-엔돌핀을 산출하는데 사용되는 트립신 ; β-갈락토시다아제와 융합된 엔케팔린(enkephalin)으로부터 엔케팔린을 산출하는데 사용되는 소의 엔테로 펩티다이제(V.N.도브리닌(Dobrynin)외, Bioory-Khim 13, 119-121, 1987) ; 인식된 아미노산 서열로서 Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys를 사용하여 클로람페니콜아세틸 전이효소와 융합된 인간의 심방성 나트륨 뇨배설인자(h-ANF)로부터 h-ANF를 산출하는데 사용되는 엔테로키나아제(A.홉덴외, WPI 87-088509/13) ; 인식된 아미노산 서열로(Ile/Leu/Pro/Ala)-(Glu/Asp/Gln/Asn)-Gly-Arg를 사용하여 λC11과 융합된 β-글로빈으로부터는 β-글로빈을, 클로람페니콜 아세틸 전이효소와 결합된 칼시토닌-글리신으로부터는 인간의 칼시토닌-글리신을 산출하는데 사용되는 Xa인자(일본특허 공개공보 제61-135591호) ; 및 recA단백질과 융합된 심방성 나트륨 뇨배설 단백질(ANP)로부터 ANP를 산출하는데 사용되는 세가지, 즉 인식된 아미노산 서열로서는 Glu-X를 사용하는 단백질 분해효소 V8, 인식된 아미노산 서열로 Glu-Gly-Arg를 사용하는 Xa인자 및 인지된 아미노산서열로 Arg-Ala-Leu-Leu-Ala-Gly-Pro-Arg 또는 Gly-Pro-Arg를 사용하는 트롬빈등이 있다.
목적단백질을 미생물 세포내에서 담체단백질과 융합된 형태로 생성하는 방법은 목적단백질을 제조하는 유력한 수단을 제공하는 것이다. 그러나 담체단백질로서 미생물 세포 단백질을 사용하는 방법은 융합단백질의 발현정도가 더 낮기 때문에 경제적 생산관점에서 만족할 만한 방법이 될 수 없다. 또한 외인성 단백질을 담체단백질로 사용할 때 생성된 융합단백질은 보통 미생물 세포질이나 주변 세포질에 가용성인 성분으로 존재하기 때문에 융합단백질을 단리(isolation)하기 위해서는 복잡한 분리 및 정제방법을 사용해야 한다.
상기 문제점들 이외에도 융합단백질 접근방법에는 또 다른 문제점들이 제기된다. 즉 융합단백질로서 생성된 목적단백질 그 자체가 무용하다는 점이다. 이 결과 융합단백질로부터 목적단백질을 산출해내는 것이 필요하고 융합부위를 형성하는 결합 펩티드를 찾아내는 것이 중요하게 된다. 브롬화 시아노겐에 의해 절단되는 메티오닌으로 융합되면 브롬화 시아노겐의 사용이 제한되므로 불리하며 효소에 의해 절단될 수 있는 보편적인 결합 펩티드를 사용해야 한다. 효소에 의해 절단될 수 있는 아미노산 서열(인식된 아미노산 서열)을 사용할 때에는 담체단백질 및 목적단백질의 존재하에서의 상황(1차 아미노산, 2차 및 3차 구조 등등)에 따라 목적단백질을 산출해내기가 어려우므로 절단 및 적절한 유리 정도를 예측하기가 어려웠다. 위치-특이적으로 목적단백질을 유리하는 인식된 아미노산 서열이 있는 융합단백질을 선택하는 것은 절단하기 위한 화학적 처리 또는 효소적 처리 뿐만 아니라 융합단백질의 발현, 생성 및 축적에도 영향을 준다. 현재 상기의 모든 조건을 충족시키는 담체단백질 및 결합펩티드를 포함하는 융합단백질 체계는 공지된 바 없다.
인체에서 분비되는 백혈구 단백질 분해효소 억제제(secretory leukocyte protease inhibitor, 이하 SLPI라 한다)는 인체의 다형핵 백혈구에서 유래되는 에라스타제(elastase)와 같은 억제단백질이며 이하선 분비물, 기관지 분비물, 정액 플라즈마, 경부점액등과 같은 인체의 점액내에 존재한다. 이하선 분비물에서 단리한 억제 단백질의 아미노산 서열은R.C.톰슨(Thompson)외, Proc.Nat.Acad.Sci.USA 83, 6692-6696, 1988 ; PCT 일본국내공개 제62-501291호)에 정의되어 있고 이 단백질의 유전자를 인체의 이하선 유전자 라이브러리에서 단리 및 배열하였다. (R.C.. 톰슨외,Nucl.Acid Res. 14, 7883-7896, 1986 : PCT 일본국내 공개 제62-501262호).
SLPI는 인체의 다형핵 백혈구 에라스타제를 억제하므로, 에라스타제에 의한 탄력소(elastin)의 가수분해에 의해 일어나는 것으로 알려져 있는 기종(emphysema)억제 치료제로 사용될 전망이다. 그러나 SLPI는 에라스타제 억제활성 및 췌장 트립신 억제활성을 동시에 나타내므로, SLPI가 트립신, 플라즈민(plasmin), 칼리크레인 (killikrein0, 트롬빈등과 같이 생리적으로 중요한 트립신류의 세린 단백질 분해효소를 억제하게 되어 만일 SLPI자체가 투여되었을 경우에는 혈액응고-섬유소용해 체계등에 영향을 미칠 염려가 있기 때문에 인체에 치료제로 사용하기 어렵다. 따라서 본 발명은 SLPI와 같은 트립신류 세린단백질 분해효소의 억제활성이 현저히 감소하면서도 SLPI의 에라스타제의 억제활성(키모트립신류 세린 단백질 분해효소의 억제활성)이 유지되는 신규한 에라스타제 억제 폴리펩티드와, 그 선결수단으로서 유전공학에 의해 미생물을 사용하여 목적단백질을 생성하는데 있어서 융합단백질이 높은 수준으로 발현되어야 하는 요구와 융합단백질을 단리 및 정제하는 것을 포함하는 하류과정(downstream process)이 더욱 용이해야 한다는 요구를 동시에 만족시키는 이상적 담체단백질과 연결부위를 확실하게 절단하고 목적단백질을 원형대로 방출되도록 조장하는 결합 펩티드를 제조하는 방법을 제공한다.
따라서 본 발명은 일반적으로, 인체에서 분비되는 백혈구 단백질 분해효소 억제제(SLPI)의 C-말단의 반을 이루고 트립신류 세린 단백질 분해효소의 억제활성이 에라스타제 억제활성보다 낮은 에라스타제 억제 폴리펩티드와, 하나 또는 그 이상의 아미노산 첨가, 하나 또는 그 이상의 아미노산 결실 및/또는 하나 또는 그 이상의 아미노산 교체상태에서 상기 생물학적 활성이 있는 폴리펩티드를 제공한다.
또한 본 발명은 상기와 동일한 폴리펩티드를 제조하기 위한 중간체로서 유용한 융합단백질을 제공하며 식(Ⅱ')로 나타낼 수 있다.
Y-B-Z₂ (II')
여기에는 Y는 인체성장호르몬 또는 그 단편들로 이루어진 담체단백질을 나타내고 ; Z₂는 인체에서 분비되는 백혈구 단백질 분해효소 억제제(SLPI)의 C-말단의 반을 이루고 에라스타제 억제활성이 있으며 트립신류 세린 단백질 분해효소의 억제활성이 에라스타제 억제활성보다 낮은 에라스타제 억제 폴리펩티드, 또는 하나 또는 그이상의 아미노산이 첨가, 하나 또는 그이상의 아미노산이 결심 및/또는 하나 또는 그이상의 아미노산의 교체된 상태에서 상기 생물학적 활성이 있는 폴리펩티드를 나타내며 ; B는 목적단백질이 변성되지 않은 상태하에서 화학적 또는 생물학적으로 절단될 수 있는 아미노산 서열이 있는 결합펩티드 또는 이것의 단일중합체를 나타내는데 이때의 B는 Z2에 있는 N-말단 아미노산에 결합된다.
또한 본 발명은 에라스타제 억제 폴리펩티드 또는 청구범위 1에서 식(Ⅰ)로 나타낸 것과 같이 상기 폴리펩티드의 단일중합체 제조방법을 제공하는데 청구범위 1에서 X 는 Gly를 나타내며 식(Ⅳ)로 나타낸 융합단백질을 처리하는 단계를 이룬다.
Y
Asn-Gly
nZ (IV)
여기에서 Y 및 Z의 의미는 식(II)에서 정의된 것이고 n은 1 내지 10의 정수이며 식(IV)에 있는 Gly는 히드록실아민 또는 이와 유사한 화합물과 함께 Z내의 N-말단 Asn에 연결되어 있다.
또한 본 발명은 폴리펩티드 또는 청구범위 1항에서 식(I)로 표현된 상기 폴리팹티드의 단일중합체를 제조하는 방법을 제공하는데 이때 X는 존재하지 않고 식(V)로 표현된 융단백질을 처리하는 단계를 이룬다.
Y-B'-Z (V)
여기에서 Y 및 Z의 의미는 식(Ⅱ)에 정의되었고 B'은
Val-Pro-Arg
n 또는
Len-Val-Pro-Arg
n을 나타내는데 이때의 n은 1 내지 10인 정수이고 X안에 있는 Asn은 트롬빈 또는 이와 유사한 화합물과 함께 B'내의 Arg에 연결되어 있다.
또한 본 발명은, 목적단백질이 변성되지 않고 조건하에서 화학적 또는 생물학적으로 변성될 수 있는 아미노산 서열이 있는 펩티드 또는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 거쳐서 목적단백질 또는 그 일부를 암호화하는 유전자에 결합된 담체단백질로서 인체성장호르몬 또는 그 단편을 암호화하는 유전자를 이루는 융합단백질 유전자를 제공한다. 목적단백질의 실례로서는 식(Ⅲ)으로 표현되는 아미노산 서열이 있는 에라스타제 억제 폴리펩티드, 또는 에라스타제 억제활성이나 이것과 생물학적으로 당량인 아미노산 서열을 나타내는 상기 폴리펩티드의 일부분을 들 수 있다.
본 발명은 또한 상기 유전자를 운반하는 플라스미드 및 플라스미드를 운반하는 미생물 세포를 제공한다.
[발명을 수행하기 위한 바람직한 방법]
본 발명자들은 애초에 제1번 Ser로 시작하여 107번 Ala로 끝나고 SLPI의 C-말단의 대략 반을 이루는 폴리펩티드를 에라스타제의 억제활성을 유지하면서도 실질적으로 트립신류 세린 단백질 분해효소에 대한 억제활성이 전혀없다는 것을 확인하였다.
본 발명의 폴리펩티드를 형성하는 SLPI의 길이가 결정적으로 중요하지는 않다. 본 발명의 폴리펩티드의 바람직한 실례로서는 SLPI의 55번 Asn으로 시작하여 107번 Ala로 끝나는 폴리펩티드를 들 수 있다. 이 폴리펩티드를 2 내지 10회 반복하면 단일중합체를 형성할 수 있다. 이 폴리펩티드를 다음식(Ⅰ)과 같다.
여기에서 X는 Gly를 나타내거나 존재하지 않고 n은 1부터 10까지의 정수, 또는 에라스타제 억제활성이나 생물학적으로 폴리펩티드에 당량인 아미노산 서열을 나타내는 폴리펩티드의 일부를 의미한다.
본 발명의 폴리펩티드를 제조하는데 있어서 융합단백질을 절단하기 위해 사용하는 방법에 따라 폴리펩티드의 아미노-말단은 X가 존재하지 않는 Asn이거나 X가 Gly인 Asn에 부착된 Gly이다.
즉 상기 아미노산 서열이 있는 폴리펩티드 이외에도 본 발명에는 하나 또는 하나이상의 아미노산이 결실, 하나 또는 하나이상의 아미노산이 첨가 및/또는 하나 또는 하나이상의 아미노산이 상기 생물학적 활성을 나타낼 정도로 다른 아미노산으로 교체된 아미노산 서열이 있는 폴리펩티드가 포함된다.
이러한 단백질은 SLPI를 단백질 분해효소로 처리하는 것과 같은 종래 방법으로는 제조할 수 없으나 오직 본 발명의 재조합 유전자 기술에 의해 미생물 세포내에서 유전자를 발현시킴으로서만 제조할 수 있다. 즉, 목적단백질이 저분자량인 단백질이기 때문에 예를들어 담체단백질로서 인체성장호르몬을 함유하는 융합단백질의 형태내에 목적단백질을 유전적으로 생성시키고 목적단백질을 산출하기 위해서 융합단백질을 트롬빈과 같은 효소나 히드록실아민과 같은 화학물질로 절단하는 본 발명에 의해서만 목적단백질이 제조될 수 있다.
따라서 본 발명은 상기 에라스타제 억제 폴리펩티드를 제조하기 위한 중간체로서 유용한 상기 식(Ⅱ')의 융합단백질을 제공한다. 식(Ⅱ')로 표현되는 융합단백질내에서 목적단백질이 SLPI의 55번 Asn부터 107번 Ala까지를 이루는 융합단백질은 다음식(Ⅱ)로 나타낼 수 있다.
Y-B-Z (II)
여기에서 Y는 인체성장호르몬 또는 그 단편으로 이루어진 담체단백질을 나타낸다. Z는 에라스타제 억제 폴리펩티드 또는 식(Ⅱ)으로 표현되는 서열이 있는 상기 폴리펩티드의 단일중합체인 폴리펩티드를 나타낸다.
여기에서 n은 1부터 10까지의 정수, 또는 에라스타제 억제활성이나 생물학적으로 폴리펩티드에 당량인 아미노산 서열을 나타내는 폴리펩티드의 일부를 의미하여 B는 결합 펩티드를 나타내거나 목적단백질이 변성되지 않는 상황하에서 화학적으로나 생물학적으로 절단가능한 아미노산 서열이 있는 상기 결합펩티드의 공중합체를 나타내는데, 이때 B는 Z내에 있는 아미노말단 Asn에 결합되어 있다.
식(Ⅱ') 및 (Ⅱ)에 있는 담체단백질로서는 발현수준이 높은 융합단백질을 제공하고 미생물 세포내에서 봉입체(inclusion body)로 존재하며 단리 및 정제가 용이한 인체성장호르몬 또는 그 단편이 바람직하다. 인체성장호르몬은 1번 Phe로 시작되어 191번 Phe로 끝나는 191개 아미노잔기로 구성된 폴리펩티드이다. 목적단백질이 대장균내의 담체단백질을 사용하여 발현될 경우 코돈번역을 개시하는데 Met잔기가 필수적이므로 발현된 단백질을 메티오닐기 인체성장호르몬이어야 한다. 그러므로 이러한 단백질을 본 발명의 담체단백질의 범위에 해당된다. 또한 정상적인 인체성장호르몬의 아미노산 서열이 부분적으로 바뀐 변형인체성장호르몬은 본 발명의 담체단백질의 범위에 해당된다. 이러한 변형 인체성장호르몬의 예로서는 53번째 시스테인이 다른 아미노산으로 교체된 변형성장호르몬이 있다. 담체단백질로서 사용된 인체성장호르몬의 부분으로서는 1번 Phe로부터 139번 Phe까지의 단편이나 1번 Phe로부터 122번 Gln까지의 단편이 바람직하다. 접합부위의 결합펩티드나 이들의 단일중합체에는 공지된 서열을 포함하여 모든 인식된 아미노산 서열이 포함되는데 목적단백질이 변성되지 않는 조건하에서 이 서열을 화학적으로나 생물학적으로 절단할 수 있다.
예를들어 Asn-Gly(P.Bornstein, Meth.Enzymol. 47, 132, 1977)이나 이것의 반복서열(Asn-Gly)n을 히드록실아민에 의해서 절단되어 목적단백질을 산출할 수 있는 결합펩티드로 사용할 수 있는데 이때 n은 1부터 10까지의 정수를 나타낸다. 또한 1차 아미노산 서열에 대한 영향 및 담체단백질과 목적단백질의 입체효과 없이 목적단백질을 확실하게 단리 및 분리하기 위해서 트롬빈으로 절단할 수 있는 융합 아미노산 서열로는 공지된 아미노산 서열
식(Ⅰ)로 나타낸 본 발명의 폴리펩티드를 형성시키기 위해서는 식(Ⅱ)로 나타낸 융합단백질을 접합부위 B에서 절단한다. 히드록실아민이나 이와 유사한 화합물에 의해 절단이 수행되는 경우에는 (Asn-Gly)n이 B로서 사용된다. 즉, 상기 식(Ⅳ)로 표현되는 융합단백질을 히드록실아민이나 예컨대 알킬히드록실아민, 히드라진등과 같은 히드록실아민과 유사한 화합물로 처리하여 에라스타제 억제 폴리펩티드 또는 이것의 단일중합체를 얻을 수 있는데 이때 식(Ⅰ)에 있는 X는 Gly이다. 또한 결합펩티드 B에서 절단이 이루어질 때에는 예를들어 (Val-Pro-Arg)n이나 (Leu-Val-Pro-Arg)n이 B로 사용된다. 즉, 상기 식(Ⅴ)로 표현되는 융합단백질을 예컨대 사람의 트롬빈, 소의 트롬빈, 말의 트롬빈, 돼지의 트롬빈등과 같은 트롬빈 또는 이와 유사한 화합물로 처리하여 식(Ⅰ)로 표현되는 에라스타제 억제 폴리펩티드 또는 이것의 단일중합체를 얻을 수 있으며 이때 X는 존재하지 않는다.
식(Ⅱ)로 표현되는 융합단백질은 공지된 유전자 재조합기술에 따라 제조된다. 이러한 경우에 본 발명은 아미노산 서열상 화학적 또는 생물학적 절단이 가능한 펩티드나 폴리펩티드를 부호화하는 유전자를 거쳐 목적단백질 또는 그 일부를 부호화하는 유전자에 결합된 담체단백질로서는 인체성장호르몬 또는 그 단편을 부호화하는 유전자로 이루어진 융합단백질 유전자를 사용하는 것을 특징으로 한다.
제5도에는 (Met-1Phe1-Phe139)인체성장호르몬 단편 및 (Asn55-Ala107)SLPI단편 폴리펩티드로 이루어진 융합단백질을 발현시키는 pGH-TE 및 pGH-HE플라스미드를 구성하는 방법이 도시되어 있다.
인체성장호르몬 발현 플라스미드인 pGH-L9(Proc.Natl.Acad.Sci.USA., 81, 5956, 1984)는 BglⅡ 및 Sal Ⅰ제한효소로 소화되어 인체성장호르몬 유전자의 후반 1/3을 제거하게 된다. 반면에 (Asn5-Ala197)SLPI유전자로 이루어지는 pUC-D6플라스미드는 Mlu I 및 Xho I으로 소화되어 (Asn55-Ala197)SLPI유전자 단편을 얻게 된다.
상기 두가지 단편 및 제4도에 나타난 합성 DNA연쇄자(linker) (7) 및 (8), 또는 (9) 및 (10)은 T4 DNA리가아제(ligase)를 사용하여 연결되어 성장호르몬 단편 및 (Asn5-Ala197)SLPI단편으로 이루어지고 융합단백질을 발현하는 pGH-TE 및 pGH-TE플라스미드를 얻게 된다. 제5도에서, pGH-HE는 트롬빈이 절단된 서열을 함유하는 융합단백질을 발현하는 플라스미드이고 pGH-HE는 히드록실아민이 절단된 서열이 함유된 융합단백질을 발현하는 플라스미드이다.
목적단백질을 부호화하는 유전자와 인체성장호르몬 유전자 또는 그 단편을 결합시키는 인식 아미노산 서열을 부호화하는 유전자로서는 아미노산서열, 바람직하게는(Asn-Gly)n을 부호화하는 인체성장호르몬 또는 그 단편들과 동일한 판독구조물(reading frame)로부터 생성된 모든 유전자가 가능하고 이때 n은 1부터 10까지의 정수를 나타내며 상기 유전자는 히드록실아민으로 처리함으로써 용이하게 절단되어 목적단백질을 산출할 수 있다. 또한 상기 유전자로서는 아미노산서열, 바람직하게는 (Val-Pro-Arg)n또는 (Leu-Val-Pro-Arg)n을 부호화하는 모든 변성 유전자가 가능하고 이때 n은 1부터 10까지의 정수를 나타내며 상기 유전자는 트롬빈 처리를 함으로써 용이하게 절단되어 목적단백질을 생성할 수 있다. 담체단백질, 즉 인체성장호르몬 또는 그 단편 및 인식아미노 서열을 암호화하는 유전자 사이에 동일한 판독구조를 결합시키기 위해서는 그 사이에 합성 DNA연쇄자를 삽입할 수 있다.
목적단백질을 암호화하는 유전자에는 호르몬이나 예컨대 소마토메딘(Somato medin), IGF-I, IGF-Ⅱ, IGF(표피성장인자), PDGF(혈소판에서 유래된 성장인자)와 같은 인자를 암호화하는 유전자들이 있다.
또한 상기 유전자들은 림프액, 효소, 효소억제단백질을 암호화하는 유전자이다. 예를들면 인터페론, 인터로이킨(interleukin), 장펩티드, 예컨대 Ⅶ인자, ⅧC인자, IV인자, C 단백질 및 S단백질, α₁-항트립신, SLPI, TIMP(금속함유-단백질 분해효소에 대한 조직억제자, tissue inhibitor of metallo-proteinase) 및 폐의 계면활성단백질과 같은 혈액응고인자가 있다.
또한, 목적단백질을 암호화하는 유전자로서는 항체 또는 그 일부 및 보체 (complement) 또는 그 일부를 암호화하는 유전자가 있다.
목적단백질은 원래의 단백질 뿐만 아니라 변형된 단백질이나 그 단편일 수도 있으며 후자의 경우에 있어서 변형된 단백질 또는 그 단편들을 발현할 수 있는 유전자를 사용할 수 있다.
본 발명에 따르면, 에라스타제 억제 폴리펩티드나 그 단일중합체를 얻기 위해서는 SLPI의 카르복시-말단의 절반을 암호화하는 유전자, 또는 상기 유전자가 2 내지 10회 반복되어 이루어진 유전자를 사용할 수 있다.
본 발명의 융합단백질 유전자에는 하류에 적절한 프로모터(promotor)를 결합시킴으로써 발현 플라스미드안으로 융합단백질 유전자를 도입할 수 있다. 바람직한 프로모터로서는 트립토판 오페론(operon) 프로모터(trp 프로모터), 락토오스 오페론 프로모터(lac 프로모터), tac프로모터, PL프로모터, Ipp프로모터등이 있다. 특히 trp 프로모터 및, SD서열과 전사(translation)개시코돈 사이의 간격이 최적인 pGH-L9의 5'에 접하는 서열이 바람직하다(일본특허 공개공보 제60-234584호).
융합단백질을 효과적으로 발현시키기 위해서는 trp프로모터, SD서열, 전사-개시코돈, 인체성장호르몬이나 그 단편을 암호화하는 유전자, 목적단백질이나 그 단편을 암호화하는 유전자 및 전사종결 코돈을 상기 순서에 의해 결합시킨다. 이렇게 결합시킨 유전자를 예컨데 pBR322 또는 관련된 플라스미드와 같이 적절한 플라스미드내에 삽입시키면 융합단백질을 발현시키는 플라스미드를 구성하게 되는 것이다. 이때 pBR322플라스미드를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 융합단백질 유전자를 발현시키기 위한 미생물 숙주세포로는 대장균, 고초균(Bacilus scbtilis) 등이 있으며 특히 대장균이 바람직하다. 공지된 방법, M.V.Norgard외, Gene, 3, 279, 1978에 의해서 상기 융합단백질 발현 플라스미드는 대장균 세포와 같은 미생물 세포안으로 도입될 수 있다.
이렇게 얻은 변형미생물을 공지된 방법에 따라 배양한다. 배지로서는 글루코오스 및 카스아미노산(casamino acid)이 함유된 M9배지(T.Maniatis ed.Molecular Cloning, P440, Spring Harbor Laborator, New York, 1982)를 들 수 있으며 만일 숙주세포내에서 발현 플라스미드를 안정화할 필요가 있으면 앰피실린(ampicillin)등을 첨가한다.
세포배양은 형질이 변환된 미생물에게 적합한 상태하에서 수행하도록 하는데 예를들면 공기를 쐬어주면서 37℃에서 2 내지 36시간동안 진동시킴으로써 교반하는 것이다. 또한 프로모터가 효과적으로 작용하도록 자극하기 위해서는 예컨대 3-β-인돌 아크릴산(trp프로모터를 사용할 경우) 및 이소프로필-β-D-티오갈락토시드(tac프로모터를 사용할 경우)등과 같은 촉진제를 첨가할 수 있다.
배양을 한 뒤에는 예를들어 원심분리를 하고나서 인산염 완충액등에 재분산시키고 초음파처리등에 의한 분쇄 및 원심분리함으로써 쉽게 순수형태의 융합단백질을 얻는 방법으로 형질전환된 미생물세포를 모을 수 있다. 본 발명의 장점은 이러한 융합단백질을 히드록실아민이나 트롬빈 처리를 하여 절단함으로써 목적단백질을 형성시킬 수 있다는 것이다. 만일 필요하다면 융합단백질의 시스테인 잔기를 술폰화하고 이어서 트롬빈으로 처리하여 목적단백질을 술폰화한 분자로 형성시킬 수도 있다.
히드록실아민(유사화합물 즉, 히드록실아민과 구조가 유사하고 작용이 같은 화합물로 포함된다.)으로 절단될 수 있는 아미노산 서열을 거쳐서 결합된 융합단백질을 알칼리 상태하에서 45℃로 2시간동안 히드록실아민으로 처리하거나, 트롬빈(유사화합물, 즉 트롬빈과 구조가 유사하거나 생물학적 작용이 같은 효소도 포함된다.)으로 절단될 수 있는 아미노산 서열을 거쳐서 결합된 융합단백질을 37℃에서 2 내지 24시간동안 트롬빈으로 처리하여 융합단백질로부터 목적단백질을 산출 및 분리할 수 있다.
만일 목적단백질이 이황화 결합을 거친 3차 구조라면 이 목적단백질은 예를들어 Chance등의 방법(R.E. Chance외, Peptides : Seventh U.S. Peptide Symposium Proceedings, DH.Rich and E.Gross ed., 721-728, Pierce Chemical Co. Rockford, IL.,1981)에 의해 원래의 단백질과 동일한 3차 구조이면서도 생물학적으로 활성인 분자로 전환될 수 있다. 술폰화반응을 포함하는 방법에 있어서는 술폰화된 목적단백질을 환원시키고 분자내 이황화결합을 형성시킴으로써 원래의 단백질과 동일한 3차 구조이면서도 생물학적으로 활성인 단백질을 제조할 수 있다.
본 발명의 (Asn55-Ala197)SLPI폴리펩티드, 즉 에라스타제 억제 폴리펩티드는 공지되어 있는 적절한 분리 및 정제방법에 의해 반응 혼합물로부터 분리 및 정제될 수 있다. 이러한 공지된 분리 및 정제방법으로는 용해도차를 이용한 염색(Saltingout) 및 용매침전등의 방법 : 전하차를 이용하는 이온교환 크로마토그래피 및 고성능 이온교환 액체 크로마토그래피등의 방법 ; 특정 친화성을 이용한 친화크로마토그래피등의 방법 : 소수성의 차이를 이용한 역고성능 액체 크로마토그래피등의 방법 ; 및 등전점의 차를 이용한 등전점분리법(electrofocusing)등이 있다.
표 4에 나타낸 바와 같이 여러 가지 단백질 분해효소에 대하여 본 발명의 에라스타제의 억제활성을 비교하는데 있어서, SLPI의 에라스타제 억제활성이 유지되더라도 예컨대 인체의 트롬빈, 인체의 플라스민 및 인체의 칼리크레인(kallikrein)과 같은 트립신류 세린 단백질 분해효소의 억제활성은 현저하게 감소된다. 그러므로 SLPI에 비교해보면 본 발명 (Asn55-Ala197)SLPI폴리펩티드의 트립신에 대하여 에라스타제 억제활성이 개선되었고, 본 발명의 폴리펩티드가 유용한 임상적 약물로 바람직한 것이다.
본 발명의 단백질은 다형핵 백혈구 에라스타제의 억제활성이 우수하기 때문에 ARDS, 호중구(neutrophile)와 연관된 호중구성 알레르기 폐질환 및 패혈증 뿐만 아니라 기종, 변형관절염(rheumatoidarthritis), 사구체성 신장염 치근막질병 및 근위축증등을 포함하는 여러 가지 질병치료제로서 사용될 수 있다.
필요에 따라 본 발명 단백질을 분말로 형성하기위해 유탁화할 수도 있다. 이러한 유탁화 반응에 있어서 소르비톨, 만니톨, 덱스트로스, 말토오스, 글리세롤, 인체혈청 알부민등과 같은 안정화제가 사용된다.
본 발명 단백질은 상기 질병을 치료하기 위해서 약리학적으로 용인될 수 있는 형태로 사용된다. 투여경로는 이온삼투요법용 장치를 사용한 투여뿐만 아니라 구강, 또는 비경구적 투여, 예를들어 정맥내, 근육내, 피하, 경피, 직장 및 호흡기(기도내,비강내)를 통한 투여가 있다.
본 명세서와 도면에 있어서는 아미노산 및 펩티드등을 생략형으로 나타내었는데 사용된 기호는 IUPAC IUB(생물학적 명명법 위원회)에 의한 것이거나 종래에 당분야에서 사용되던 기호이다.
[실시예]
이제 본 발명을 보다 상세히 실시예의 방법으로 기술하겠으나 이 실시예로 본 발명을 제한하려는 의도는 아니다.
실시예에 사용된 여러 가지 유전공학기술은 다음과 같다.
(1) 제한효소에 의한 DNA절단(방법 1)
DNA 0.1 내지 1μg을 제한 효소완충액(MluⅠ 또는 PstⅠ 절단, 10mM Tris-HCl, pH7.5, 10mM MgCl, 0.1mg/ml 젤라틴, 600mM NaCl, 6mM 메르캅토에탄올 ; BamHⅠ, Bgl Ⅱ, NdeⅠ, SalⅠ 또는 XhoⅠ 절단, 10mM Tris-HCl, pH7.5, 10mM MgCl₂, 0.1mg/ml 젤라틴, 150mM NaCl 및 6mM 메르캅토에탄올, 단 모두 용액속에서의 최종농도이다.) 10μ 에 용해시키고 제한효소 2 내지 4단위를 용액에 가한 후 37℃에서 한시간동안 반응을 수행하였다.
(2) 아가로스 겔 전기영동(방법 2)
제한효소 절단후, 수성 글리세롤 50%내에 브로모-페놀 블루가 0.25% 있는 용액을 3μl가하고 아가로스겔 전기영동(농도 0.7 내지 1%)을 수행하였다.
전기영동 완충물로는 90mM 트리스-브롬화물(pH8.0), 2mM EDTA 수용액을 사용하였다.
(3) 아가로스 겔로부터 DNA 단편들의 회수(방법 3)
용융점이 낮은 아가로스 겔을 사용하여 아가로스 겔 전기영동을 수행하고 목적단백질을 나타내는 띠(band)를 잘라낸 후 L.Weislander 등, Anol. Biochom., 98,305(1978) 방법으로 DNA를 회수하였다.
(4) T4 DNA 리가아제를 사용한 연결(방법 4)
연결시킬 DNA 단편들을 혼합하고 에탄올로 공동 침전한 후 침전물을 연결 완충액(66mM Tris-HCl, pH7.6, 6.6mM MgCl₂, 10mM 디티오 트레이톨, 1mM ATP)에 용해시키고 T4 DNA 리가아제 2 내지 10단위를 용액에 가한 후 16℃에서 12시간동안 반응을 진행시켰다.
(5) 적당한 세포의 제조 및 형질전환(방법 5)
표준 CaCl₂법(M.V.Norgard등)을 수정하여 대장균을 형질전환 하였다. 즉, 대장균 HB101을 18시간동안 배양하여 L배지(트립톤 1%, 효모추출물 0.5%, NaCl 0.5%, pH7.2)5ml에 접종하고 600nm(OD600) 에서의 혼탁도(turbidity)가 0.3이 되도록 배양하였다.
이 세포들을 냉마그네슘 완충액(0.1M NaCl, 5mM MgCl₂, 5mM Tris-HCl, pH7.6, 4℃)에 2회 세척하고 냉칼슘완충액(100mM CaCl₂,250mM KCl, 5mM MgCl₂, 5mM Tris-HCl, pH7.6, 4℃) 2ml 내에서 재분산시킨 뒤 이 현탁액을 4℃에 25분간 세워두었다. 세포들을 모으고나서 냉칼슘완충물 200μl 내에 분산시키고 세포현탁물을 연결반응을 수행할 용액과 10:1 비율(v/v)로 혼합하였다. 이 혼합물을 4℃에서 60분간 유지하고 이 혼합물에 LBG배지(트립톤 1%, 효모추출물 0.5%,NaCl 1%, 글루코오스 0.08%, pH7.2) 1ml를 가한 다음 37℃에서 1시간동안 세포배양을 수행하였다. 배양육즙을 접종시켜 플레이트(plate)당 100μl 비율로 선택배지(앰피실린을 30㎍/ml 함유하는 L배지 플레이트)를 만들었다. 이 플레이트를 37℃로 하룻밤동안 인큐베이트하여 형질전환을 진행시켰다. 결과적으로 생성된 항 앰피실린 군체로부터 Birnboim, H.C. 및 J. Doly Nucleic Acids Res., 7, 1513(1979)의 방법에 의해 플라스미드 DNA를 제조하여 적절한 제한효소로 소화시켰다.
이 가수분해 양식을 아가로스 겔 전기양동으로 분석하여 복제물을 얻었다.
(6) DNA 뉴클레오티드 서열의 결정(방법 6)
주형(template)으로는 플라스미드 DNA를, 프라이머(primer)로는 M13 프라이머 M3, RV 또는 pBR322 플라이머 S2(두가지 모두 Takara Shuzo, Japan 제를, 그리고 M13 서열 키트(kit)(Amersham Japan)를 사용하여 Chen, E.Y 및 Seeburg, P.H., DNA, 4, 165(1985)의 방법에 의해 DNA 서열조작을 수행하였다.
(7) 기타의 방법들
매니아티스(Maniatis)외, Molecular Clonings, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982의 방법으로 기타의 DNA 조작을 수행하였다.
[실시예 1]
(Asn55-Ala107)SLPI 폴리펩티드 단편에 대한 구조유전자 합성 및 하위클로닝(subcloning)
대장균에 흔히 사용되는 코돈을 선택하고, 목적유전자를 구성하기 위하여 제2도에 나타낸 것과 같이 적절한 위치를 인식할 수 있는 제한효소를 사용함으로서 제1도에 도시된 바와같은 SLPI 아미노산 서열(R.C. Thompson씨등, Proc. Natl. Acad, Sci. USA, 83, 6692, 1986 ; V. Seemuller 씨등, FEBS Lett., 199 , 43, 1986)을 토대로 하여 (Asn55-Ala107)에 대한 유전자 단편을 구성하였다.
그 다음으로, 구성된 뉴클레오티드 서열을 제3도에 도시된 바와같이 3부분으로 분할하여 6개의 올리고뉴클레오티드를 생성시켰다. 올리고뉴클레오티드는 전자동 DNA 합성기 (Applied Biosystems,Model 381A)를 사용하여 포스포아미디트(phosphoamidite)법에 의해 합성되었다. Applied Biosystems의 프로토콜(protocol)에 따라 올리고뉴클레오티드를 정제하였다. 즉, 수성 암모니아내의 합성 올리고뉴클레오티드를 하룻밤동안 55℃로 유지하여 DNA 염기의 아미노 라디칼을 탈보호(deprotect)하고 세파덱스 G-50 미세겔(Pharmacia)을 사용하는 겔여과법에 의해 고분자량인 합성올리고뉴클레오티드를 분리하였다.
그 다음에는 올리고뉴클레오티드 단편을 폴리아크릴아미드(겔농도가 20%이며 7M 요소가 함유되어 있다)로 전기영동하고 이동되는 양식을 자외선 투영에 의해서 관찰하였다. 목적 올리고뉴클레오티드에 해당되는 띠를 잘라내서 작은 조각으로 절단하고 겔조작에 DNA 용리완충액(500mM NH4OAc, 1mM EDTA, 0.1% SDS, pH7.5)을 2 내지 5ml 가한 후 이 물질 전체를 37℃에서 하룻밤동안 흔들어 주었다.
목적 올리고큐클레오티드를 함유하는 수성 용액을 원심분리에 의해 취하였다. 최종적으로 합성 올리고뉴클레오티드가 함유된 용액을 겔여과 컬럼(세파덱스 G-50)에 적용시켜 정제된 합성 올리고뉴클레오티드 생성물을 얻었다. 필요에 따라서는 합성 올리고뉴클레오티드의 순도를 개선하기 위해 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 반복할 수 있다는 점을 유의하도록 한다. 합성 올리고뉴클레오티드 0.1 내지 1.0μg을 ATP 1mM존재하에 폴리뉴클레오티드 활소(Kinase)로 반응시킴으로써 5'-말단을 인산화하였다. 인산화반응은 폴리뉴클레오티드 활소(P-L Biochemicals)를 사용하여 Tris-HCI(pH9.5)50mg, MgCl₂10mM, 디티오트레이톨 5mM 수성용액내에서 수행한다.
제3도에 도시된 상부사슬 및 하부사슬의 5'-말단이 인산화된 합성 올리고뉴클레오티드를 수성용액에 넣고 혼합하여 70℃로부터 실온으로 서서히 냉각함으로서 두 개의 올리고뉴클레오티드를 어니일링(annealing)하였다.
하위클로닝을 위해서는 , 제1방법에 의해 플라스미드 pUC119(Takara Shuzo, Japan)를 BamHI 및 PstI으로 절단하고, 선상으로 배열된 단편들을 제2방법에 의해 아가로스 겔 전기영동으로 분리한 후 이 선형 플라스미드를 제3방법으로 회수하였다. 회수된 선형 플라스미드를 어니일링한 합성단편들 (1) 및 (2), (3) 및 (4), 또는 (5) 및 (6) 6μg과 혼합하고 에탄올로 침전시킨 후 제4방법에 의해 T4DNA 리가아제를 사용하여 연결하였다.
연결된 혼합물에 제5방법에 의해 제조된 적합한 대장균 세포 200μl를 첨가하고 제5방법에 의해 형질전환을 수행하였다. 선택적인 배양배지(제5방법)에서 기른 군체(colony)로부터 제5방법에 의한 플라스미드 DNA를 제조하였다.
제1방법에 의해 제한효소 BamHI, SalI, MluI, NdeI, XhoI 또는 PstI으로 절단함으로써 SLPI의 후반부인 Asn55-Ala107의 카르복시 말단을 함유하는 목적 하위클론 pUC-D6를 구성하고 제2방법에 의해 아가로스 겔 전기영동함으로써 절단되는 양상을 관찰하였다. 또한 제6방법에 의해 DNA를 배열하여 하위클론의 뉴클레오티드 배열을 완성하였다.
[실시예 2]
인체성장호르몬의 단편(Met-1Phe-1ㅡPhe139), 트롬빈의 절단부위를 거쳐 결합된 SLPI 단편 폴리펩티드(Asn55-Ala107) 및 이것이 형질전환체로 이루어지는 융합단백질을 발현시키기 위한 플라스미드 제조.
제5도에 도시하는 바와같이 인체성장호르몬 유전자(M. Ikehara 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5956, 1984)를 발현시키기 위해 발현 플라스미드 1μg을 BglII 및 SalII으로 절단하고, 생성된 단편을 제2방법에 의해 아가로스 전기용동으로 분리한 다음 제3방법에 의해 겔로부터 회수하였다.
또한 실시예 1에서 얻은 pUC-D6 2μg 을 MluI으로 절단하고 생성된 단편을 분리한 다음 약 0.15Kbp (인 DNA 단편들을 제3방법으로 회수하였다. 반면에, 트롬빈으로 절단될 수 있는 아미노산 서열을 암호화하는 제4도의 DNA단편 (7) 및 (8)을 화학적으로 합성하였다.
그 다음에 상기와 같이 회수한 두가지 DNA 단편 각각 1μg씩과 어니일링한 합성단편 (7) 및 (8)을 혼합하고 에탄올로 침전시킨다음 제4방법에 의해 T4DNA 리가아제를 사용하여 연결시키고 실시예 1에서와 동일한 방법에 의해 연결 혼합물로 대장균 HB101을 형질전환시키고나서 선택적 배지에서 자란 군체들로부터 목적 융합단백질 유전자의 발현 플라스미드 pGH-TE를 가지고 있는 형질전환체를 얻게 되었다. 플라스미드 pGH-TE를 함유하는 대장균 HB101는 대장균 HB101(pGH-TE)라고 표시되어 1988년 12월 1일자로, Budapest Treaty 하의 국제수탁기관인 일본국 이바라기껜 쯔꾸바-시 히가시 1-1-3, Fermentation Research Instituet(FRI), Agency of Industrial Science and Technology 에 FERM BP-2168로서 수탁되어 있다.
[실시예 3]
인체성장호르몬 펩티드(Met-1Phe-1ㅡPhe139), 히드록실아민 절단부위를 거쳐 결합된 SLPI 단편 폴리펩티드(Asn55-Ala107) 및 그 형질전환체로 이루어지는 융합단백질을 발현시키기 위한 플라스미드제조.
제5도에 도시된 바와같이 실시예 2에 기술된 것과 동일한 방법을 반복하되, 합성 DNA단편 (7) 및 (8)을 사용하여 대신 히드록실아민에 의해 절단되는 아미노산 서열을 암호화하는 제4도의 합성 DNA 단편 (9) 및 (10)을 사용함으로써 융합단백질 발현 플라스미드 pGH-HE 및, 플라스미드를 가지는 대장균 HB101 형질전환체를 얻게 되었다.
플라스미드 pGH-HE를 함유하는 대장균 HB101은 대장균(pGH-HE)로 표시되었고 1988년 12월 1일자로 Budapest Treaty사의 국제수탁기관인 FRI에 FERM BP-2167로서 수탁되어 있다.
[실시예 4]
융합단백질 유전자의 발현
각각 실시예 2 및 3에서 제조한, 융합단백질 유전자 발현 플라스미드 pGH-TE를 가진 대장균 HB101 및 융합단백질 유전자 발현 플라스미드 pGH-HE를 가지는 대장균 HB101을 별도로 앰피실린이 50 내지 100μg/ml 함유된 L배지(트립톤 1%, 효모추출물 0.5%, NaCl 1%, pH7.5 압열멸균)에 주입하고 하룻밤 동안 배양하였다.
글루코오스 0.2% 및 카스아미노산 5mg/ml가 함유된 M9 배지 (Na2HPO40.6%, KH₂PO₄0.3%. NaCl 0.05% HN₄Cl 0.1% 수성용액, pH7.4)를 압열면균하고 이 배지에 각각 압열멸균된 MgSO₄수성용액과 CaCl₂수성용액을 가하여 최종농도가 각각 2mM과 0.1mM이 되게 한다. 하룻밤동안 배양하여 OD669이 0.1인 상기 배양세포를 이 배지에 가하고 37℃에서 배양하였다. OD669이 0.5로 되면 배양물에 3-β-인돌아클릴산을 가하여 최종농도가 40μg/ml로 되게하고 37℃에서 OD669이 1.0이 될 때까지 흔들어 주면서 계속 배양하였다. 그리고나서 원심분리에 의해 세포를 수집한 다음 TE 완충물(50mM Tris-HCl, 4mM EDTA, pH7.5)로 세척하였다.
이렇게 세척한 세포들을 1/10부피로 TE 완충액에 분산시키고 초음파 분쇄기(Kubota Shoji,Type 200 M)로 분쇄하였다. 이 분쇄물을 원심분리하여 봉입체 형태의 목적단백질을 함유하는 침전물을 얻게 되었다. 이 침전물을 0.5% 트리톤 X-100, 1mM EDTA 수성용액으로 세척하고 다시 TE 완충액으로 세척한 다음 7M 요소, 20mM Tris-HCl(pH8.0) 수성용액이나 6M 구아니딘 염산염, 20mM Tris-HCl(pH8.0)에 용해시켰다.
이 용액을 20mM Tris-HCl(pH8.0)에 대해 투석하여 융합단백질 수성용액을 얻고 이 생성된 수성용액에 Tris-HCl 완충액(pH6.8), SDS, 2-메르캅토에탄올 및 글리세롤을 가하여 최종농도가 각각 60mM 2%, 4%, 10%가 되도록 한 다음 이 혼합물을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(O. K. Laemmli,Nature, 227, 650(1970))처리하였다.
이 결과는 제6도에 도시하였다.
제6도에 있어서는 제1열(land)은 분자량 크기의 표시를 나타내고 제2열은 대장균 HB101에서 유래하는 단백질을 나타낸 것이며 제3열은 대장균 HB101/pGH-TE 로부터 얻어진 단백질을 나타내고 제4열은 대장균 HB101-(pGH-HE)로부터 얻은 단백질을 나타낸 것으로서 모두 전기영동으로 처리한 결과를 도시한 것이다.
여기에서 융합단백질은 실질적으로 이온교환 크로마토그래피 및 역 크로마토그래피로 정제하였다.
[실시예 5]
트롬빈에 의한 융합단백질 절단
실시예 4에서 pGH-TE를 함유하는 대장균 HB101을 배양하여 얻은 단백질 용액에 트롬빈(Sigma)을 전체 단백질 중량에 비해 1/200양 만큼 가하고 37℃에서 15시간 반응을 수행하였다.
반응혼합물을 실시예 4와 동일한 방법으로 처리하고 나서 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 수행하였다.
이 결과는 제7도의 제2열부터 4열 까지에 도시되어 있다.
인체성장호르몬 및 분자량이 약 6,000인 목적 (Asn55-Ala107)SLPI 단편 폴리펩티드로부터 유래된 분자량 약 14,000의 펩티드에 해당되는, 2개의 띠로 나타나는 트롬빈에 의해 분자량이 약 20,000인 융합단백질이 절단된다는 것을 확인하였다.
제7도에 있어서 제2열은 제6도와 동일한 분자량을 나타내었다.
[실시예 6]
히드록실아민에 의한 동일한 분자량을 나타내었다.
실시예 4에서 pGH-TE가 함유된 대장균 HB101을 배양하여 얻은 단백질용액을 조정하여 최종농도를 히드록실아민 2M 및 Tris 0.2M(pH9.0)로 하고 45℃에서 4시간동안 반응을 진행시켰다. 반응혼합물을 실시예 4와 동일한 방법으로 처리하여 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 수행하였다.
결과는 제7도의 제5열 내지 제7열에 도시되어 있다. 분자량이 약 20,000인 융합단백질은, 인체성장호르몬 및 분자량이 약 6,000이고 N-말단이 글리신으로 되어 있는 목적(Asn55-Ala107)SLPI 단편 폴리펩티드에서 유래된 분자량 약 14,000의 폴리펩티드에 해당되는 2개의 띠로 나타나는 히드록실아민에 의해 절단되었다.
[실시예 7]
실시예 5 및 6에서 얻은 SDS-폴리아크릴아미드 겔로부터 목적 SLPI 폴리펩티드 단편이 함유된 띠를 잘라내고 70% 포름산으로 겔로부터 폴리펩티드를 추출한 다음 추출물을 여과하고 여과후에 여과액을 감압하에 건조시켰다.
건조시료를 트리플루오르아세트산에 용해시키고 Applied Biosystems사의 프로토콜에 따라 폴리브렌(polybrene)이 피복된 필터상에 고정시킨 다음 단백질 서열기 (Applied Biosystems 120A)로 PTH-아미노산을 N-말단부터 절단하고 PTH 분석기(Applied Biosystems 120A)로 분석함으로서 아미노산 서열을 N-발단부터 결정하였다.
N-말단부터의 아미노산 서열에 대한 결과는 표 1에 나타나 있다.
[표 1]
이러한 결과에서 상기와 같이 얻어진 각 폴리펩티드의 N-말단 아미노산 서열은 목적(Asn55-Ala107) SLPI 단편의 아미노산 서열과 같았다는 것이 확인되었다.
즉, (Asn55-Ala107)SLPI 단편 폴리펩티드는 트롬빈 또는 히드록실아민에 의해 정확히 유리되었다는 것이 확인되었다.
[실시예 8]
상기 발현된 융합단백질, 트롬빈으로 절단된 생성물 및 히드록실아민으로 절단된 생성물에 대한 엘라스타제 억제활성은 다음과 같이 평가되었다.
시약용액
완출용액 : 0.1M HEPES, 1.0M NaCl, 0.1% PEG-600(pH7.5)
에라스타제(사람의 타액중에 있는 다형핵 백혈구 에라스타제) : 완충용액(보존용액_내의 에라스타제와 같은 에라스타제(EPC Co., Funakoshi Yakuhin)2mg/ml를 상기 완충용액(1.0×10-8)내에서 30,000배 회석하였다.
기질용액 : DMSO(보존용액)내에 있는 Meo-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-pNA(Backem) 18mg/ml를 상기 완충액(3×103M)내에 10배로 회석하였다.
96구멍 ELISA 마이크로플레이트의 각 구멍에 상기 완충용액 140μl, 시험용액 시료용액 20μl 및 에라스타제용액 20μl를 넣었다.
이 혼합물을 37℃에서 1시간동안 교반하고 각각의 구멍에 기질용액을 20μl식을 가한다음 37℃에서 1시간동안 반응을 수행하여 상기 혼합물을 발색(發色)시켰다.
이 결과물질에 대하여 450nm에서의 흡광도를 측정하고 결과를 표 2에 나타내었다.
[표 2]
융합단백질은 트롬빈으로 절단처리하거나 히드록실아민으로 절단처리하더라도 마찬가지로 에라스타제 억제활성을 나타내었다.
[실시예 9]
융합단백질 시스테인 잔기의 술폰화
실시예 5에서 얻은 융합단백질 250mg을 7M 요소 100ml 0.5M Tris-HCl(pH8.2)에 용해시켜 생성된 용액에 이황산나트륨(Wako Junyaku)을 가하여 최종농도 0.3mM이 되게 하고 45℃에서 30분동안 반응시켰다. 그 다음에는 테트라티온산나트륨(Sigma)을 가해서 최종농도 0.05mM이 되게하고 45℃에서 30분동안 반응시켰다.
이 반응혼합물을 투석관(10k)에 넣고 10l의 물에 대하여 1회, 50mM Tris-HCl 완충액(pH8.5)10l에 대하여 2회 투석하였다.
[실시예 10]
트롬빈에 의한 술폰화 융합단백질의 분리
실시예 9에서 술폰화 융합단백질 용액에 송아지의 트롬빈(Sigma)을 총단백질에 비해 1/200 중량/중량 양 만큼 가하고 37℃에서 12시간동안 반응을 진행시켰다.
제8도에는 반응혼합물의 일부에 대한 역 HPLC 분석이 나타나 있다. 또한 각 피이크의 단편들을 얻고 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 결과는 제9도에 나타나 있다.
각 단편들의 N-말단 아미노산 서열은 단백질 서열기(Applied Biosystems 470A) 및 PTH 분석기(Applied Biosystems 470A)를 사용하여 정하였다.
표 3에 결과가 나타나 있다.
[표 3]
상기 결과로부터 (Asn55-Ala107)SLPI 단편 폴리펩티드의 술폰화 목적유도체가 피이크 1에 해당된다는 것을 알게 되었다. 예비컬럼(Vydac-214 TP1010)을 사용하여 피이크 1을 얻고 동결건조하여 (Asn55-Ala107)SLPI 폴리펩티드 단편의 술폰화유도체 2mg을 얻었다.
[실시예 11]
Asn0-Ala107SLPI 폴리펩티드 단펴의 술폰화 유도체를 활성분자로 재생(refolding)하는 단계
실시예 10에서 얻은 (Asn55-Ala107)SLPI 폴리펩티드 단편의 술폰화 유도체 2mg을 50mM Tris-HCl(pH8.0)1ml에 용해하고 이 용액에 2-메르캅토에탄올을 최종농도가 1%로 되도록 가한 후 45℃에서 2시간동안 반응을 수행하였다.
이 용액에 3M 아세트산나트륨(pH5.0)1ml을 가하고 혼합물을 투석관에 넣어 50mM 아세트산나트륨(pH5.0), 10μl M 산화 글루타티온 및 20μM 환원 글루타티온을 함유하는 용액 10ι에 대하여 투석한 다음 50mM Tris-HCl 완충액(pH8.5)10ι에 대하여 2번 투석하였다.
그 다음 생성된 용액을 역 HPLC로 분석하여 활성- 형(Asn55-Ala107)SLPI 단편 폴리펩티드 1mg을 얻었다.
HPLC 분리양식은 제10도에 나타나 있다.
[실시예 12]
활성화(Asn55-Ala107)SLPI 단편 폴리펩티드의 세린프로테아제 억제활성분석
실시예 11에서 방법으로 재생하므로써 얻어지는 활성-형(Asn55-Ala107)SLPI 단편 폴리펩티드를 측정하여 다양한 프로테아제에 대한 억제활성을 정하였다.
분석결과는 다음과 같이 나타났다.
완충액 : 0.1M HEPES, 1.0M NaCl, 0.1% PEG-6000(pH7.5)
효소용액 : 다음 효소들이 상기 완충용액에 표 4에 나타낸 농도보다 10배 높은 농도로 용해시켰다.
(1) 사람타액의 다형핵 백혈구 에라스타제(EPC co. ; Funakoshi Yakuhbin), (2) 송아지 췌장의 트립신(Sigma), (3) 송아지 췌장의 키모트립신(Sigma), (4) 돼지 췌장의 에라스타제(Sigma), (5) 사람의 혈장 트롬빈(Kabi, Daiichi Kagaku Yakuhin), (6) 사람의 혈장 플라스민 (Kabi, Daiichi Kagaku Yakuhin), (7) 사람의 혈장 칼리크레인(Kabi, Daiichi Kagaku Yakuhin).
기질용액 : 상기 효소 (1) 내지 (7)에 대해서는 다음 기질(1) 내지 (7) 각각을 디메킬 술폭시드에 10mM농도로 용해하여 원액을 제조한 다음 이를 상기 완충용액에, 용해시켜서 최종농도보다 10배 높은 농도가 되게하여 기질용액을 제조하였다.
1) Backem 2) Kabi ; Daiichi Kagaku Yakuhin
96-웰(well) ELISA 마이크로플레이트에 상기 완충용액 140μl, 시험용액 20μl, 및 효소용액 20μl를 가하고 혼합물을 37℃에서 30분간 교반하였다. 그 다음에는 웰에 기질용액 20ιl를 가하고 혼합물을 37℃에서 1시간동안 교반하여 동일하게 진행시키고 405nm에서 흡광도를 측정하였다.
억제단백질로서는 α1-AT(Sigmg) 및 활성-형 (Asn55-Ala107)SLPI 단편 폴리펩티드를, 그리고 양성대조표준으로서는 아프로티딘(Boehringer)를 사용하였다.
이러한 단백질들의 다양한 농도에서 억제활성을 측정하여 50% 억제를 보이는 억제 단백질의 농도를 계산하였다.
결과를 표 4에 나타내었다.
[표 4]
또한, 상기 자료를 기초로 하여 본 발명(Asn55-Ala107)SLPI의 억제 상수Ki를 딕슨(Dixon), M 및 웹(Webb), E.C.의 방법(1979), Enzyme, Longmam 또는 헨더슨(Henderson), P.J.F의 방법(1972) Biochem. J. 127, 321-333.으로 계산하였다.
표 5에 결과를 나타내었다.
[표 5]
표 5에서 보는 바와같이 사람타액의 다형핵 백혈구 에라스타제에 대한 억제상수[Ki(E)]송아지의 췌장 트립신에 대한 억제상수[Ki(T)]의 비율, 즉 [Ki(T)/Ki(E)]는 1/100 내지 1/1000이며 원래의 SLPI에 비해 에라스타제에 대한 특이성이 증가했음이 밝혀졌다.
원래의 SLPI에서는 Ki(E)가 대충 Ki(T)와 같았다는 점에 주목해야 한다.(R.C. 톰슨외, Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 83, 6692(1980).
[실시예 13]
억제활성에 대한 혈청알부민의 효과
사람타액의 다형핵 백혈구 에라스타제에 대한 활성-형(Asn55-Ala107)SLPI 단편 폴리펩티드의 억제활성을 송아지의 혈청 알부민 0.8% 또는 8% 존재하에서 실시예 12와 동일한 방법으로 측정하였다. 송아지의 혈청 알부민은 자체의 활성에는 아무런 영향없었고 동일한 억제활성을 나타내었다.
[실시예 14]
열 안정성
50mM Tris-HCl(pH7.8) 내의 활성-형(Asn55-Ala107)SLPI 단편 폴리펩티드를 50℃에서 2시간동안 처리한 후 사람타액의 타형핵 백혈구 에라스타제에 대한 억제활성을 측정하였다.
활성은 동일수준으로 유지되었다.
[공업적응용]
본 발명의 에라스타제 억제 폴리펩티드는 높은 에라스타제 억제활성을 나타내면서도 다른 세린 프로테아제에 대하여, 구체적으로는 트립신류 세린 프로테아제에 대하여 억제활성이 낮기 때문에 기종의 진행을 억제하는 유용한 치료제로서 유망하다.
또한 인체성장호르몬이나 그 일부를 사용하는 본 발명의 융합단백질 발현 시스템은 매우 효과적이며 유전자 재조합에 의해 비교적 분자량이 낮은 펩티드를 생산하기 위해 널리 사용될 수 있다.
Claims (17)
- 식(1) :
(여기에서 X는 Gly를 나타내거나 존재하지 않고 n은 1 내지 10의 정수를 나타냄)로 표시되는 아미노산 서열, 또는 에라스타제 억제활성을 나타내는 이것의 일부, 또는 생물학적으로 이것과 동등한 아미노산 서열을 갖는 에라스타제 억제 폴리펩티드 또는 이것의 단일중합체. - 제1항에 있어서, 1 내지 8개의 시스테인 잔기가 술폰화되어 있는 것을 특징으로 하는 에라스타제 억제 폴리펩티드 또는 이것의 단일중합체.
- 인체에서 분비되는 백혈구 프로타아제 억제자(SLPI)의 C-말단의 절반을 이루고, 트립신-류 세린 프로테아제 억제활성이 에라스타제 억제활성이 1/10을 초과하지 못하는 에라스타제 억제활성이 있으며, 상기 생물학적 활성이 있는 폴리펩티드내에는 한 개 또는 한 개 이상의 아미노산이 추가, 한개 또는 한 개 이상의 아미노산이 결실 및/또는 한 개 또는 한 개 이상의 아미노산이 교체되어 있는 것을 특징으로 하는 에라스타제 억제 폴리펩티드.
- 식(II) :Y-B-Z (Ⅱ)로 표현되는 융합단백질에 있어서, Y는 인체성장호르몬이나 그 단편으로 이루어진 담체단백질을 나타내고는, Z는 식 (Ⅲ) :
(여기에서 n이 1 내지 10의 정수)으로 표현되는 에라스타제 억제 폴리펩티드 또는 이것의 단일 중합체를 나타내거나 또는 이것의 일부가 에라스타제 억제활성을 나타내거나 아미노산 서열이 생물학적으로 이것에 동등한 목적펩티드를 나타내며, B는 목적단백질이 변성되지 않는 조건하에 화학적 또는 생물학적으로 절단가능한 아미노산 서열이 있는 결합 펩티드 또는 폴리펩티드를 나타내고 여기에서 B가 Z의 아미노 말단 Asn에 결합되는 것을 특징으로 하는 융합단백질. - 제4항에 있어서, 식(Ⅲ)에서 1 내지 8개의 시스테인 잔기가 술폰화되어 있는 것을 특징으로 하는 융합단백질.
- 제4항에 있어서, 담체단백질이 원래의 인체성장호르몬의 제1번 아미노산 잔기 Phe로부터 제139번 아미노산 잔기 Phe까지인 폴리펩티드 단편인 것을 특징으로 하는 융합단백질.
- 제4항에 있어서, 담체단백질이 원래의 인체성장호르몬의 제1번 아미노산 잔기로부터 제122번 아미노산 잔기 Gln 까지인 폴리펩티드 단편인 것을 특징으로 하는 융합단백질.
- 제4항에 있어서, B가 결합펩티드이거나Asn-Gly
n,
Val-Pro-Arg
n및
Leu-Val-Pro-Arg
n으로 이루어지는 군중에서 선택되는 아미노산 서열이 있는 폴리펩티드이고 여기에서 n은 1부터 10까지의 정수를 나타내며 Z의 아미노산 말단 Asn이 각각 B의 Gly, Arg 또는 Arg에 결합되는 것을 특징으로 하는 융합단백질.
- 식(Ⅱ') :Y-B-Z₂ (Ⅱ)로 나타낸 융합단백질에 있어서, Y는 인체성장호르몬이나 이것의 단편으로 이루어진 담체단백질을 나타내고, Z2는 인체에서 분비되는 백혈구 프로테아제 억제제(SLPI)의 C-말단의 절반으로 이루어지고 트립신-류 세린 프로테아제 억제활성이 에라스타제 억제활성의 1/10을 초과하지 않는 에라스타제 억제활성을 가지는 에라스타제 억제 폴리펩티드 및 상기 생물학적 활성이있고 한 개 또는 한 개 이상의 아미노산이 첨가, 한 개 또는 한 개 이상의 아미노산이 결실 및/또는 한 개 또는 한 개이상의 아미노산이 교체되어 있는 폴리펩티드를 나타내며, B는 결합펩티드이거나 목적단백질이 변성되지 않는 조건하에서 화학적 또는 생물학적으로 절단될 수 있는 아미노산 서열이 있는 폴리펩티드를 나타내고, 여기에서 B가 Z₂내의 N-말단 아미노산에 결합되는 것을 특징으로 하는 융합단백질.
- 제1항의 식(Ⅰ)에서 X가 Gly를 나타내고, 식(Ⅳ) :Y(Asn-Gly)nZ (Ⅳ)(여기에서 Y 및 Z는 식(Ⅱ)에서 정의된 것과 같고 n은 1부터 10까지의 정수이며 식(Ⅳ)의 Gly는 히드록실아민이나 이것의 유사체와 함께 Z의 N-말단 Asn에 결합된다)로 표현되는 융합단백질 처리단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 에라스타제 억제 폴리펩티드 또는 이것의 단일중합체를 제조하는 방법.
- 제1항의 식(Ⅰ)로 표현되는 폴리펩티드나 이것의 단일 중합체에 있어서 X가 존재하지 않고, 식(V) :Y-B'-Z (V)(여기에서 Y 및 Z는 식(Ⅱ)에서 정의된 것과 같고 B'은Val-Pro-Arg
n또는
Leu-Val-Pro-Arg
n을 나타내며 이때 n은 1부터 10까지의 정수이고 X는 트롬빈 또는 이것의 유사체에 의해 B'의 Arg에 결합된다)로 표현되는 융합단백질 처리단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 목적단백질이 변성되지 않는 조건하에서 화학적 또는 생물학적으로 절단될 수 있는 아미노산 서열이 있는 결합펩티드 또는 이것의 단일 중합체를 코딩하는 유전자를 거쳐 목적단백질 또는 이것의 일부를 코딩하는 유전자에 결합하는 담체단백질인 인체성장호르몬이나 이것의 단편을 코딩하는 유전자로 이루어지는 것을 특징으로 하는 융합단백질 유전자.
- 제12항에 있어서, 목적단백질 또는 이것의 일부가 식(Ⅲ)으로 나타나는 아미노산 서열이 있는 에라스타제 억제 폴리펩티드 이거나, 에라스타제 억제활성을 나타내거나 생물학적으로 이와 동등한 아미노산 서열을 나타내는 에라스타제 억제 폴리펩티드의 일부인 것을 특징으로 하는 유전자.
- 제12항에 있어서, 목적단백질이 변성되지 않는 조건하에서 화학적 또는 생물학적으로 절단될 수 있는 아미노산 서열이Asn-Gly
n,
Val-Pro-Arg
n또는
Leu-Val-Pro-Arg
n이며 여기서 n이 1 내지 10인 정수인 것을 특징으로 하는 융합단백질 유전자.
- 제12항에 있어서, 담체단백질이 원래의 인체성장호르몬의 제1번 아미노산 잔기 Phe로부터 제139번 아미노산 잔기 Phe 까지인 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 융합단백질 유전자.
- 제12항 내지 15항중의 어느 한항에 따르는 융합단백질 유전자로 이루어지는 것을 특징으로 하는 융합단백질 유전자의 발현 플라스미드.
- 제12항 내지 15항중의 어느 한항에 따르는 융합단백질 유전자를 운반하는 것을 특징으로 하는 형질전환된 미생물세포.
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