KR930012114B1 - 신규한 플라스미드 pEAT8과 이를 이용하여 알파원앤티트립신 단백질을 제조하는 방법 - Google Patents

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Description

신규한 플라스미드 pEAT8과 이를 이용하여 알파원앤티트립신 단백질을 제조하는 방법

제1도는 본 발명에 따른 알파원앤티트립신 발현벡터인 플라스미드 pEAT8의 제조과정을 나타낸 도면.

제2도는 본 발명의 실시예 1에서 제한효소 분석법에 의해 pEAT8 플라스미드를 확인한 분석사진.

제3도는 본 발명의 실시예 1에서 전기영동법에 의해 제조합 단백질 생산을 확인한 사진.

제4도는 본 발명의 실시예 1에서 면역블랏법에 의한 알파원앤티트립신 생산을 확인한 사진.

제5도는 본 발명의 실시예 2에서 온도별로 살펴본 알파원앤티트립신의 분획 및 발현량을 살펴본 사진.

제6도는 본 발명의 실시예 3에서 DEAE-Sephacel 컬럼을 거친 분획들에 대한 280nm에서의 흡광도 양상을 나타낸 그래프.

제7도는 본 발명에 따른 실시예 3에서 DEAE-Sephacel 컬럼을 거친 대표적 분획들에 대한 12％ SDS- 전기영동 결과를 나타낸 사진.

제8도는 본 발명에 따른 실시예 3에서 고속도 액체 크로마토그라피(FPLC)의 Mono Q 컬럼을 거친 분획들에 대한 280nm에서의 흡광도를 나타낸 그래프.

제9도는 본 발명에 따른 실시예 3에서 고속도 액체 크로마토그라피(EPLC)의 Mono Q 컬럼을 거친 대표적 분획들에 대한 12％ SDS-전기영동 결과를 나타낸 사진.

제10도는 본 발명의 실시예 3에서 재조합 알파원앤티트립신 분리정제 과정중 대표적 과정들에 대한 12％ SDS-전기영동 결과를 나타낸 사진.

제11도는 본 발명의 실시예 4에서 일라스타제에 대한 인체 알파원앤티트립신과 분리정제한 재조합 알파원앤티트립신의 저해활성도를 비교하여 나타낸 그래프.

제12도는 T7 파지전사 및 활성화 서열을 나타낸 도면.

제13도는 인체 알파원앤티트립신을 코우드화 하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면.

본 발명은 신규한 플라스미드 pEAT8과 이를 이용하여 인체 혈장단백질인 알파원앤티트립신 단백질을 제조하는 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 유전자 조직에 의해 제조된 신규한 플라스미드 pEAT8을 이용하여 호흡기종의 치료제로 사용되고 있는 알파원앤티트립신 단백질을 E.coli 세포내에서 다량 발현시키고, 이를 활성이 있는 안정된 형태로 보다 간편하고 고수율로 분리정제하여 제조하는 방법에 관한 것이다.

알파원앤티트립신은 혈장내에 존재하는 여러 종류의 프로테아제 저해제들 중 하나로 생체내에서의 역할은 탄성조직(elastic tissue)을 프로테아제의 공격으로부터 보호하는 반면에, 염증이 생긴 부위에서는 불활성화 되어 세포가 프로테아제에 의해 액체화되어 주위 세포로부터 분리되는 것을 도와준다(Carell 등, Nature, 제298권, 329페이지, 1982년).

또한, 알파원앤티트립신은 트립신, 카이모트립신, 일레스타제, 콜라게네이즈, 트롬빈, 플라스민과 같은 대부분의 세린프로테아제에 대해 저해작용을 가지지만, 특히 중성 백혈구(neutrophil leucocyte)로부터 분비되는 일레스타제에 대한 저해제로서 기능이 중요하다.

한편, 이러한 알파원앤티트립신은 유전자의 선천적 결핍증이나 많은 양의 흡연 또는 심한 환경공해로 인해 혈장내에서 활성이 있는 형태의 양이 상대적으로 감소하게 되고, 결과적으로 이에 따른 프로테아제-저해제 균형이 깨져 허파는 신축성을 잃게되며, 난치병인 호흡기종으로 발전하게 된다. 따라서, 이와 같은 질병을 치료하고 예방하기 위해 알파원앤티트립신을 인체혈액에서 분리정제하여 치료제로 사용하거나(Gadek 등, Am.Rev.Resp.Dis., 제127권, Suppl., 2, 45페이지, 1983년) 또는 분자량이 작은 효과적인 저해제 유사체를 개발하는 것이 연구되어 왔다(McRae 등, Biochemistry, 제19권, 3973페이지, 1980년).

그러나, 알파원앤티트립신 단백질은 그 원료가 사람혈액인 혈액제제의 일종으로서 원료의 제한 및 다른 전염세균 또는 바이러스의 감염과 같은 문제와 반감기(halflife)가 6일 뿐인점 때문에 현재로서는 유전공학 기법을 통한 생산이 보다 안정하고 경제적인 것으로 평가되고 있다.

종래에 보고된 바에 의하면, 알파원앤티트립신 유전자를 E.coli(Bollen 둥, FEBS Lett., 제166권, 67페이지, 1984년 : Courtney 등, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 제81권, 669페이지, 1984년 : Tessier 등, FEBS Lett., 제208권, 183페이지, 1986년 : Johansen 등, Mol.Biol.Med., 제4권, 291페이지, 1987년 : Sutiphong 등, Mol.Biol.Med., 제4권, 307페이지, 1987년) 또는 효모(Rosenberg 등, Nature, 312권, 77페이지, 1984년 : Travis 등, J.Biol.Chem., 제260권, 4384페이지, 1985년 : Cabezon 등, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 제18권, 6594페이지, 1984년 : Moir 등, 제56권, 209페이지, 1987년)에서 발현시킨 예가 있다.

그러나, 현재까지 보고된 바로는 E.coli에서 발현된 알파원앤티트립신의 수율은 대부분 낮은 편이었으며 (5％ 이하), 또한 아직까지는 E.coli에서 발현된 알파원앤티트립신의 정제방법에 대한 보고가 없었다. 또한, 재조합 플라스미드를 통해 E.coli 세포에서 외부 단백질을 발현시켰을 때 많은 경우가 대량 생산에 성공하지 못하게 된다.

이러한 문제점의 요인은 전사효율이 낮거나 번역효율이 낮은 등의 이유로 유전자의 발현 수율 자체가 낮아서 폴리펩티드가 적게 생기거나 폴리펩티드가 일단은 많이 생산되지만 안정한 3차 구조를 이루지 못하여 분해될 수 있는 문제와 폴리펩티드가 많이 생성되어 축적되더라도 활성이 없는 형태로 응집되어 세포내에서 균질성 단백질 과립(inclusion body) 상태로 존재하게 된다(Williams 등, Science, 제215권, 687페이지, 1982년 : Marston,Biochem.J., 240권, 1페이지, 1986년)는 문제이다.

따라서, 이들 재조합 단백질들은 숙주세포내에서 폴딩(folding)이 제대로 이루어지지 않는데, 이는 폴딩 과정의 중간물질(folding intermediate)이 불안정하거나, 또는 다른 단백질(chaperone)의 도움이 필요하기 때문일 것으로 생각된다(King, Biotechnology, 제4권, 제297페이지, 1986년).

한편, 재조합 단백질이 단백질 과립 형태로 생산될 때에는 대체로 발현수율이 높다는(경우에 따라서는 총세포단백질의 50％ 이상) 장점이 있지만, 응집이 된 단백질을 재활성화(refolding)시켜야 한다. 이때, 단백질 재활성화 조건은 단백질마다 다르며 아직까지는 폴딩기작을 이해하지 못해서 주로 시행착오의 방법으로 그 조건을 찾아내는 형편이다. 또한 재활성화 수율도 예측할 수 없으며 아주 낮은 경우에는 대량 생산의 효과를 기대할 수 없다는 문제점이 있다.

따라서, E.coli 세포내에서 활성이 있는 형태의 재조합 단백질을 생산하려는 노력이 지대한 바, 경우에 따라서 재조합 균주의 배양온도를 낮추어 줌으로써 (Schein과 Noteborn,Biotechnology, 제6권, 291페이지, 1988년 : Takai 등, Biotechnology, 제6권, 948페이지, 1988년 : Mizukai 등, Biotech.Lett., 제8권, 605페이지, 1986년 : 이상철과 유명희. Eur.J.Biochem., 제187권, 417페이지, 1990년)재조합 단백질을 활성이 있는 형태로 생산할 수 있다고 알려졌다.

그렇지만, 이러한 방법이 모든 재조합 단백질 생산에 다 적용되는 것은 아니며, 또 다른 한 가지의 문제점은 재조합 단백질의 활성이 있는 형태로 숙주세포내에서 다량으로 생성된다고 할지라도 정제단계가 너무 복잡하게 되면 최종으로 수거되는 수율이 낮게 되며 단백질 활성도 감소될 수 있고 정제비용이 많이 들어 대량 생산화(Scale-up)하는데 문제가 된다. 결국, 발현대상 단백질을 최대의 수율로 최대의 활성이 있는 형태로 생성하기 위해서는 상기한 여러 가지의 요인들이 동시에 고려되어야 하며, 이를 효율적으로 생산하기 위해서는 매우 많은 연구가 필요하다.

따라서, 본 발명은 알파원앤티트립신을 유전공학기법을 이용하여 E.coli에서 발현 생산함에 있어서, 유전자 조작에 의해 알파원앤티트립신 발현벡터인 플라스미드 pEAT8을 제조하고 이를 이용하여 E.coli 세포내에서 알파원앤티트립신을 다량 발현시킨 다음, 이를 안정된 활성상태로 보다 간편하면서도 고수율로 분리정제하는 알파원앤티트립신의 새로운 제조방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 인체 알파원앤터트립신이 대장균에서 융합 단백질 형태로 발현되도록 연결된 DNA 서열을 함유하는 재조합 DNA 발현벡터 pEAT8을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 플라스미드 pEAT8에 의해 형질전환된 E.coli 균주를 포함한다.

또한, 본 발명은 인체 알파원앤티트립신을 유전자 조작에 의해 형질전환체로부터 제조하는 방법에 있어서, 상기 신균주 BL21(DE3)(pEAT8)를 만들고, 이를 배양시켜서 생성된 인체 알파원앤티트립신 코우드로된 재조합 단백질을 세포추출물로부터 분리하여 활성이 있는 형태로 전환시키고 정제하여 알파원앤티트립신을 제조하는 방법을 포함한다.

이와 같은, 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 유전자 조작에 의해 알파원앤티트립신 cDNA로부터 새로운 재조합 DNA 발현벡터를 제조하고, 이로부터 신규한 재조합 플라스미드 pEAT8를 제조한 다음, 이를 E.coli에 형질전환시키고 배양하여 이로부터 알파원앤티트립신을 생산하도록 하므로써 정제된 알파원앤티트립신을 제조하는 방법에 특징이 있는 것이다.

이를 공정별로 설명하면 다음과 같다.

＜재조합 DNA 발현벡타의 제조＞

본 발명은 인체로부터 얻은 공지의 알파원앤티트립신 cDNA 서열이 클론된 공지의 플라스미드로부터 제한효소 절편을 분리하여 파지 T7의 프로모터인 전사활성화 서열이 시스템을 이용하는 공지의 플라스미드 pET-8c에 클로닝하므로써, 새로운 발현벡터를 제조하는 것이다.

이렇게 제조된 새로운 발현벡터는 pET-8c의 ATG 개시코든에 의해 코드되는 메티오닌 잔기위에 알파원앤티트립신의 두번째 잔기가 바로 연결된 상태의 폴리펩디드를 코드하게 된다.

＜신규한 플라스미드 pEAT8의 제조＞

상기와 같이 재조합된 DNA 발현벡터를 E.coli 균주에 형질전환시키고, 이로부터 플라스미드 DNA를 분리하여 알파원앤티트립신 유전자가 바른 방향으로 삽입된 것을 선별하여 플라스미드 pEAT8이라 명명하였다.

이렇게 새로운 플라스미드 pEAT8의 특징은 파지 T7 프로모터를 이용하고 ATG 개시코든 바로되에 알파원앤티트립신의 두번째 아미노산을 코드하는 GAT 염기가 연결되도록 함으로써 다른 아미노산이 융합되지 않은 상태의 알파원앤티트립신은 발현하는 벡터이다.

＜형질전환체 E.coli의 제조방법＞

상기 신규한 플라스미드 pEAT8에 의해 코드되는 알파원앤티트립신 단백질을 발현시키기 위해 플라스미드를 분리하여 숙주미생물로서 예컨대 E.coli 균주에 도입하여 Hanahan의 방법으로 형질전환시켜 BL21(DE3)(pEAT8)라 명명하였으며, 이 균주는 한국과학기술원 유전공학센타 유전자은행에 1991년 4월 17일자로 기탁하고 기탁번호는 KCTC 0009BP로 부여받았다.

상기 균주의 세균학적성질, 배양학적성질 및 미생물학적 특성을 검토한 결과는 다음과 같다.

세균학적 성질은 E.coli B strain과 비슷하고 다양한 배지에서 잘자라고, Ion 프로테아제가 결여되어서 단백질을 순수분리 하는데 잇점이 있디.

＜알파원앤티트립신 단백질의 생산＞

상기 형질전환된 E.coli 세포를 유전자발현 및 유도에 적절한 M9ZB 배지에서 배양하여 0.04mM의 IPTG를 가하여 발현을 유도시키되 배양온도를 40℃으로 조정하여 재조합 알파원앤티트립신 단백질이 세포내에서 균질성이 높은 불용성 단백질 과립상태로 생산되도록 한 다음, 이를 분리하고 트라이톤을 이용하여 이물질을 추출제거한 후에, 고농도의 우레아로 녹이고 pH 10.7의 강알카리 용액을 가하여 희석한 후 pH 8.0에서 우레아를 투석으로 제거하여 활성있는 재조합 알파원앤티트립신으로 전환시킨다.

그후 상기 재활성화된 재조합 단백질을 DEAE-Sephacel 및 Mono-Q 컬럽 크로마토그래피를 통해 순수하게 정제한 상태로 제조할 수 있다.

＜알파원앤티트립신의 확인＞

상기와 같이 얻어진 알파원앤티트립신의 확인을 위해 항-알파원앤티트립신 항체를 이용하여 면역 블랏을 행한 결과 본 발명에 따라 얻어진 단백질이 항체와 특이적으로 결합하는 것으로 확인되었다.

또한, 상기 단백질의 발현수율의 측정결과 총 세포단백질의 20％ 정도에 이르는 것으로 나타났으며, 분자량은 약 46,000(46KDa) 정도에 해당하는 폴리펩티드가 유도된다.

＜알파원앤티트립신의 활성측정＞

제조된 알파원앤티트립신의 활성측정을 일라스타제를 이용하여 Travis 등의 방법과 유사한 방법으로 측정하여 본 결과 알파원앤티트립신의 량에 대한 알라스타제 활성저해 효과는 비례하였으며, 천연의 인체 알파원앤티트립신보다 훨씬 효율적으로 일라스타제 활성을 저해하는 것으로 나타났다. 또한, 시그마사(Slgma사)에서 구입한 인체 알파원앤티트립신의 순수도가 50％에 불과한 것을 감안하더라도 재조합 알파원앤티트립신은 천연의 것에 비해 조금도 뒤지지 않는 저해활성도를 나타내는 것으로 밝혀졌다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 방법에 따르면 활성이 있으면서도 안정된 형태의 알파원앤티트립신 단백질을 종래보다 간편하고도 고수율로 대량 생한할 수 있는 효과적 방법으로서, 본 발명에서는 재조합 인체 알파원앤티트립신 단백질을 E.coli에서 다른 아미노산 서열이 융합되지 않는 상태로 다량으로 생산하는데 성공하였으며, 생산되는 재조합단백질은 재조합 균주의 배양온도에 따라 용존된(soluble) 형태와 불용성과립 형태의 비율이 달라지는 성질이 있다.

일반적으로 37℃ 이하에서는 주로 활성이 있는 형태로 생산되는데 이를 숙주의 세포추출물로부터 분리하는데는 적어도 수개의 컬럼 크로마토그라피를 거쳐야 하며 최종 생산되는 알파원앤티트립신의 순수도도 95％를 넘지 못하고, 또한 활성도 자연형태(authentic)의 단백질에 비해 30％ 정도밖에 되지 않는다.

따라서, 본 발명에서는 재조합균주의 배양온도를 높여 알파원앤티트립신를 활성이 없는 단백질과립상태로 다량 생산되도록 유도한 후, 단백질 응집물을 세포추출액에서 원심분리로 쉽게 분리한 후 재활성화시켜 거의 대부분이 다시 활성이 있는 형태로 전환시킬 수가 있다.

본 발명에 의해 경제된 재조합 인체 알파원앤티트립신 단백질은 순수도가 97％가 이상이었으며 활성은 자연상태의 알파원앤티트립신과 같았다. 또한, 경제단계가 훨씬 더 간편하여져서 최종 수거율도 매우 높다는 장점이 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의거 상세히 설명하면 다음과 같다.

[실시예 1]

인체 간 cDNA 라이브러리(libray)에 스크린하여 얻은 알파원앤티트립신 cDNA??이상철과 유명희, 한국생화학회지, 제22권, 148페이지, 1989년??를 E.coli 내에서 다른 아미노산이 융합되지 않은 상태로 발현하기 위해 파지 T7 프로모터 시스템을 이용한 플라스미드 pET-8c[Studier와 Moffatt, J.Mol.Biol., 제189권, 113-130페이지, 1986년]에 클로닝하였다. 플라스미드 pET-8c는 pBR322의 tet 유전자 부위에 파리 T7의 프로모터가 제1도에서와 같이 삽입되어 잇는데, 플라스미드 pET-8c를 제한효소, NcoI으로 전달한 후, 클리나우 효소로 처리하여 끝부분을 블런트앤드(blunt end)로 전환시켰다.

한편, 알파원앤티트립신 cDNA 서열이 클론된 pUC-AT(R) 플라미드[이상철과 유명희, 한국생화학회지, 제22권, 148페이지, 1989년]로부터 알파원 앤티트립신을 코드하는 1.3kb BamH I 제한효소 절편을 분리하여 클리나우 효소로 처리하고 블런트엔드로 전환시킨 후, 상기 pET-8c DNA와 연결시켜 이.콜라이 K12균주 HMS174 [Studier와 Moffatt, J.Mol.Biol., 제189권, 113-130페이지, 1086년]에 형질전환시켰다. 얻어진 재조합 균주로부터 플라스미드 DNA를 분리하여 제한효소 분석법에 의해 알파원앤티트립신 유전자가 바른 방향으로 삽입된 것을 선별하여(제2도 참조) pEAT8이라고 명명하였다.

이와 같이 제조된 pEAT8 플라스미드에 의해 코드되는 알파원앤티트립신은 제1도의 상단에서 보는 바와 같이 ATG 개시고돈에 의해 코드되는 메치오닌잔기 뒤에 알파원앤티트립신 구조단백질의 두번째 잔기가 바로 연결되는 상태의 폴리펩티드가 된다.

앞에서 제조된 플라스미드 pEAT8에 의해 코드되는 알파원앤티트립신 단백질을 E.coli 내에서 발현시키기 위해 플라스미드를 분리한 후, E.coli B균주 BL21(DE3)[Studier와 Moffatt, J.Mol.Biol., 제189권, 113-130페이지, 1986년]에 형질전환시켰다. 각각의 재조합 균주들이 알파원앤티트립신을 생산할 수 있는가를 조사하기 위하여 이들 균주들을 37℃에서 배양한 후, 600nm에서 흡광도가 0.7 정도되었을 때 0.04mM의 IPTG(isopropyl-β-D-thiogalacto pyranoside)를 넣어 재조합단백질의 생성을 유도하였다. 배양을 3시간 정도 더 진행시킨 뒤 세포추출액을 만들어 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동법[Laemmli, Nature, 제227권, 680-685페이지, 1970년]에 의해 재조합 알파원앤티트립신의 생성을 확인하였다. 제3도에서 볼 수 있듯이 pEAT8에 의해 분자량 약 46,000(460kDa) 정도의 폴리펩티드가 유도되는 것을 알 수 있었으며, 비교 벡터인 pET-8c가 존재하는 균주에서는 그 생성이 유도되지 않았다.

발현된 폴리펩티드가 알파원앤티트립신임을 확인하기 위해 항-알파원앤티트립신 항체를 이용하여 면역블랏[Towbin 등. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 제76권 4350페이지, 1979년]을 행한 결과 발현된 단백질이 항체와 특이적으로 결합함을 알았다(제4도 참조). 재조합 단백질의 발현 수율을 측정하기 위해 상기의 겔을 밀도측정기(densitometry)로 분석한 결과가 다음 표1에 나타낸 것과 같이 pEAT8를 지닌 균주에서는 알파원앤티트립신 단백질이 총 세포단백질의 20％ 정도까지 발현되었다. 발현된 46kDa 폴리펩티드는 알파원앤티트립신 유전자에 의해 고드되는 단백질의 기대했던 분자량과 동일하였으며, 인체(authentic) 알파원앤티트립신 보다는 그 크기가 작았는데, 이는 E.coli 내에서 발현된 단백질이 글라이고실레이션(glycosylation)이 안되었기 때문으로 간주된다.

[표 1]

[실시예 2]

E.coli에서 플라스미드 pEAT8에 의해 생성된 알파원앤티트립신은 배양상태에 따라 불용성과립 형태나 활성이 있는 수용성 형태로 생성되는데, 불응성과립 형태는 활성은 없으나 경제하기가 쉬우므로 불용성과립을 가장 잘 만드는 배양조건을 찾아 분리경제하기로 했다. 먼저, M9ZB배지(1리터 배치에 NH₄Cl 0.5g, KH₂PO₄1.5g, NaHPO₄3g, 글루코오스 4g, MgSO₄0.24g, 박토-트립톤 5g, NaCl 2.5g을 포함함)를 제조하여 멸균한 후, 여기에 pEAT8 플라스미드를 갖는 BL21(DE3) 균주 100분의 1정도의 량을 종자배양(seed culture)하여 접종한 후, 30℃와 40℃에서 배양하였다. 이 배양액의 흡광도가 600nm에서 0.7정도 되었을 때 IPTG를 최종 농도 0.04mM로 첨가하여 알파원앤티트립신의 생성을 유도시켰다. 이런 유도 후 약 3시간을 더 배양한 후, E.coli를 모아서 초음파분쇄기(sonicator)를 이용하여 세포를 분쇄한 후, 17,000×g에서 10분간 원심분리하여 침전물과 상등액을 분획하여 12％ SDS-전기영동을 하여 발현량은 살펴본 결과를 제5도에 나타내었다. 제5도에서 볼 수 있듯이 40℃에서 발현된 알파원앤티트립신은 많은 부분이 불용성 과립 형태로 존재함을 알 수 있었다.

[실시예 3]

불용성 상태로 존재하는 α1-AT을 분리경제하기 위해 Schoner의 방법[Schoner 등, Bio/Technology, 제3권, 151페이지, 1985년]과 Marston의 방법 [Marstor 등, Bio/Technology, 제2권, 800페이지, 1984년]을 일부 변형시켜 다음과 같은 방법으로 계속 진행하였다.

상기, 실시예 2에서 기술한 바와 같이 알파원앤티트립신을 발현시키는 pEAT8 플라스미드를 함유하는 E.coli BL21(DE3)를 M9ZB 배지에서 40℃에서 배양하여 600nm에서의 흡광도가 0.7일 때 최종농도가 0.04mM이 되도록 IPTG를 가하여 알파원앤티트립신을 발현시킨 후, 3시간 더 배양하여 7,000×g에서 15분간 원심분리하여 세포를 회수하였다. 회수된 세포를 완충용액 A(50mM Tris-Cl, 50mm NaCl, 1％ EDTA, 0.5％ glycerol, pH 8.0)에 다시 녹인 후(1liter 배양액 경우에 약 20ml의 비율로 녹임) 초음파분쇄기로 분쇄한 후 1,000×g에서 10분간 원심분리하여 분쇄되지 않은 세포를 침전물 형태로 수거하여 제거한 다음, 다시 17,000×g에서 10분간 원심분리하여 불용성 과립형태의 알파원앤티트립신이 함유되어 있는 침전물을 모았다.

이 침전물을 4％ 트라이톤(Triton X-100)이 함유된 완충용액 A에 녹여서 잘 흔들어 준 후, 다시 원심분리(17,000×g, 10분)하여 침전물을 모았다.

이와 같은 세척과정을 두 번 더 거친후, 소량의 완충용액 A(1liter 배양액 경우 5ml)에 녹인 후, 8M 우레아가 함유된 완충용액 A를 9배 가하여 상온에서 천천히 저어주면서 1시간 방치하였다. 그후, pH 10.7상태의 5mM KH₂PO₄완충용액을 다시 9배 가하여 상온에서 방치하면서 pH는 계속 10.7로 유지시켰다. 이때의 pH 조절에는 1M KOH용액을 이용하였다. 30분 후, HCl을 이용하여 pH를 8.0을 적정하여 다시 상온에서 30분간 방치한 후 이 용액을 아미콘 YM30막(Amicon YM30 membrane)을 이용하여 원래 완충용액 A에 녹인량의 약 20배 정도가 될 때까지 농축하였다. 이후 이 농축액을 4℃에서 완충용액 A에 대해 투석시켜 우레아를 제거시키며 폴딩시킨 후, 다시 pH 6.5 완충용액으로 미리 평형화된 DEAE-Sephacel 컬럼(1.5×10cm)에 투입하여 NaCl 기울기 0-500mM (각각 150ml)로 용출시켰다.

이때의 280nm에서의 흡광도 양상과 대표적인 분획들에 대한 12％ SDS-전기영동 결과는 제6도와 제7도에 나타내었다. 이중 가장 순수한 알파원 앤티트립신 함유분획들은 이미 95％ 이상의 순수도를 보이며, 더 순수한 알파원앤티트립신을 얻기 위해서는 고속도 액체 크로마토그라피(FPLC ; fast performance liquid chromatography)의 Mono Ω컬럼에서 pH 6.5 완충용액(NaCl 기울기, 0-300mM)에 대해 용출을 시키면 97％ 이상의 순수도를 지닌 알파원앤티트립신을 얻을 수 있다(제8도 및 제9도 참조), 이같은 분리 경제 방법에서 대표적 과정에서의 분리정도는 제10도와 상기 표1에서 나타낸 바와 같다.

[실시예 4]

알파원앤티트립신의 활성측정은 Travis 등의 방법[Tarvis 등, Methods in Enzymology, 제80권, 754페이지, 1981년]을 약간 변형시켜 행하였다.

즉, 완충용액(0.1M Tris, pH 8.0)에 들어있는 일라스타제 20μι(24.75mM, 0.62μg)와 같은 완충용액에 들어있는 알파원앤티트립신 용액을 일정량 섞은 후, 같은 완충용액으로 1ml을 만들어 5분간 반응시킨 후, 일라스타제의 기질인 석시닐-(L-알라닐)-p-니트로아닐리드를 80μι(최종농도 0.8mM) 가하여 잘 섞은 후 410nm에서의 흡광도를 5분간 관찰하였다. 알파원앤티트립신이 들어가지 않은 알파원앤티트립신에 의한 일라스타제의 활성저해를 알파원앤티트립신의 활성도로 정하여 측정한 결과 위의 조건에서 10μg의 인체 알파원앤티트립신(Sigma사 제품)을 가했을 때 20％의 일라스타제활성이 감소되었으나, 본 실시예에서 분리경제한 재조합 알파원앤티트립신을 10μg 가했을때는 약 70％의 일라스타제 활성이 감소하였다. 이 결과는 제11도에 나타내었다.

Claims (6)

1. 인체 알파원앤티트립신을 코우드하는 플라스미드 pEAT8에 의해 E.coli에 형질전환된 신균주 BL21(DE3)(pEAT8)(기탁번호 : KCTC 0009BP).
2. 신균주 BL21(DE3)(pEAT8)를 배양시켜서 생성된 인체 알파원 앤티트립신 코우드로 된 재조합 단백질을 세포추출물로부터 분리하여 알파원앤티트립신 활성이 있는 형태로 전환시키고 경제하는 것을 특징으로 하는 인체 알파원앤티트립신 단백질을 제조하는 방법.
3. 제2항에 있어서, 상기 신균주 BL21(DE3)(pEAT8)은 배양은 M9ZB 배지에서 IPTG로 단백질 생성을 유도시키는 증식조건에서 배양시키되 배양온도를 40℃로 조정하여 인체 알파원앤티트립신 재조합 단백질을 단백질과립 상태로 생산하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
4. 제2항에 있어서, 상기 단백질과립 상태의 인체 알파원앤티트립신 재조합 단백질을 분리하여 트라이톤으로 이물을 추출제거하고, 이를 고농도의 우레아로 녹인 후 완충용액으로 10배 희석시켜 우레아를 제거하여 활성화된 알파원앤티트립신으로 전환시키는 것을 특징으로 하는 제조방법.
5. 제2항에 있어서, 상기 활성화된 재조합 알파원앤티트립신을 DEAE-Sep-hacel 및 Mono Ω컬럼크로마토그라피를 통해 순수하게 정제하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
6. 인체 알파원앤티트립신이 대장균에서 융합단백질 형태로 발현되도록 연결된 DNA 서열을 함유하는 제조합 DNA발현벡터 pEAT8.