JPS63245679A - 新規組換えプラスミドｐＢＬＡＫ１ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、血中ペプチドであるブラジキニン（Ｂｒａｄ
ｙｋｉｎｉｎ）　（Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ　（ｙｌｙ
　Ｐｈｅ　−３ｅｒ　−Ｐｒ。

−Ｐｈｅ−Ａｒｇの９個のアミノ酸配列よりなるペプチ
ド、以下、ＢＫと略す。）を生産可能とする新規組換え
プラスミドに関するものである。

ＢＫは、血中ペプチドの一種であり、血圧降下作用（血
管拡張作用）を有する。このような作用を有することか
ら、ＢＫは、高血圧症等の治療薬としての利用が期待さ
れている。本発明の新規組換えプラスミドｐＢＬＡＫ１
は、第１図において示されるＤＮＡ配列を有する。この
新規組換えプラスミドｐＢＬＡＫ１及びｐＢＬＡＫｌを
含有するＥ、　ｃｏｌｉ　Ｃ６００株の利用としては、
医療、医薬品工業等の分野に好適である。

従来の技術 ＢＫは、血中ペプチドの一種であり、血圧降下作用（血
管拡張作用）、腸管収縮作用、血管透過作用などの作用
を有することが知られている。

ＢＫは＋　Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ　−Ｐｈｅ
　−ＳｅｒＰ　ｒ　ｏ　−Ｐ　髭心人ｒ　ｇの９個のし
一アミノ酸により構成されていることが明らかにされて
いる。ＢＫはこれ自体が活性なペプチドであり、Ｎ末端
にＬｙｓがついたカルリジン（Ｋａ　１１　ｉｄ　ｉｎ
）、またＭｅｔ−ＬｙｓのついたＭｅ　ｔ　−Ｌｙ　ｓ
−ブラジキニンもＢＫよりも低いが活性を有することが
知られている。ＢＫは。

短いペプチドであり、既にＢｏｉｓｓｏｎｎａｓら（Ｂ
ｏｉｓｓｏｎｎａｓｅｔ　ａｌ、＋　Ｈｅ１ｖ　Ｃｈｉ
ｍ、　Ａｃｔａ、　ｖｏｌ　４３．　ｐｐ、　１３４９
　（１９６０））によって化学合成が行われている。

本発明は、ＢＫの新合成法の開発の一環として行なわれ
たものである。本発明の技術的背景としては、いわゆる
遺伝子操作技術がある。ＢＫを暗号化する遺伝子を組込
んだプラスミド及びそのＥ。

ｃｏｌｉでの発現に関しては、これまでのところ知られ
ていない。

問題点 一般に２分子量１万以下のポリペプチドは、Ｅ。

ｃｏｌｉなどの宿主中で産生させてもプロテアーゼなど
によって分解されるため安定に存在しない。

これは２分子として小さいため安定なコルフォメ二″−
□ 一ジョンをとれないためであると考えられている。

従って、遺伝子操作技術を利用してＢＫなどの短いポリ
ペプチドを生産しようとした場合、融合遺伝子を作成し
、融合タンパクとして発現させることが必要である。例
えば、板金らは、１４個のアミノ酸より成るソマトスタ
チンの遺伝子操作を利用した合成を報告している。彼ら
の方法は、ソマトスタチンを暗号化する遺伝子を化学合
成し、これをβ−ガラクトシダーゼ遺伝子と融合し、多
コピープラスミドに組み込み９組換えプラスミドをＥ、
ｃｏｌｉに導入し、β−ガラクトシダーゼのカルボキシ
末端側にソマトスタチンをメチオニンヲ介して融合させ
た融合タンパクとして発現させている（Ｋ、　Ｉｔａｋ
ｕｒａ　ｅｔ　ａｌ−＋　５ｃｉｅｎｃｅ、　ｖｏｌ、
　１９８．　ｐｐ、　１０５６　（１９７７）　）が、
融合タンパクが不溶化すること。

及び融合タンパクに容易に測定可能な酵素活性がないこ
と、などから生成物の単離・精製の上で障害が考えられ
ている。

発明の目的 本発明は、ＢＫの新合成法の開発の一環として行なわれ
たものであるが、ＢＫを暗号化する遺伝子を組み込んだ
プラスミドがないこと、また上記ソマトスタチンの例に
ならいＢＫとβ−ガラクトシダーゼとの融合タンパクと
して発現させることには問題があることから、可溶性で
かつ容易に測定可能な酵素活性を有する融合タンパクを
発現する遺伝子を有する組換えプラスミドの開発を目的
とした。このような組換えプラスミドを含有する菌体を
利用することによりＢＫを含んだ融合タンパクの生産が
可能となり、また容易に測定可能な酵素活性を利用する
ことにより、融合タンパクの精製が容易になることが考
えられる。

本発明者らは、鋭意研究の結果、枯草菌のジヒドロ葉酸
還元酵素遺伝子を用いることにより、上記目的が達成で
きることを見いだし、その知見に従って、ジヒドロ葉酸
還元酵素（以下、ＤＨＦＲと略す。）とＢＫの融合タン
パクを暗号化する遺伝子を組み込んだ組換えプラスミド
ｐＢＬＡＫ１を発明の構成 本発明者らは＋　Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓのＤＨＦＲにつ
いて。

［１６８個のアミノ酸より成り立っていること。

（２）遺伝子中に存在するＥｃｏＲＩ部位の下流の配列
によって暗号化されるカルボキシ末端側の６アミノ酸よ
り成るアミノ酸配列を他のアミノ酸配列と置き換えても
ＤＨＦＲの生産性及び活性に問題がないこと、（３）カ
ルボキシ末端側アミノ酸配列が変化したＤＨＦＲは不溶
化しないこと、を明らかにしている。この結果を利用す
ることにより、ＢＫを暗号化する遺伝子を読み取り枠を
あわせてＢ、　５ｕｂ−ｔｉｌｉｓ　ＤＨＦＲ遺伝子の
ＥｃｏＲＩ部位下流に組込み。

酵素活性を保有するＤＨＦＲ−ＢＫ融合タンパクの合成
が可能である。

本発明の組換えプラスミドｐＢＬＡＫ１は、　（１）　
ＢＫを暗号化するＤＮＡの分子設計及び化学合成。

及び（２）化学合成りＮＡのＢ、　５ｕｂｔｉｌｉｓの
ＤＨＦＲ遺云子のＥｃｏＲＩ部位下流への組み込み、の
結果得られたものそ属ツ。

（１）ＢＫを暗号化するＤＮＡの分子設計及び化学合成
。

ＢＫを暗号化するＤＮＡとしては、以下に示す４０ヌク
レオチドよりなる２本の配列をホスホアミダイト法によ
り化学合成し、それらを結合して用いている。

１、５’−ＡＡＴＴＣＴＡＴＧＣＧＣＣＣＡＣＣＧＧＧ
ＴＴＴＣＴＣＡＣＣＧＴＴＣＣＧＣＴＡＡＧ　−３’ ２．５’−ＧＡＴＣＣＴＴＡＣＣＧＧＡＡＣＧＧＴＧＡ
ＧＡＡＡＣＣＣＧＧＴＧＧＧＣＧＣＡＴＡＧ〜３′ Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓのＤＨＦＲ遺伝子のＥｃｏＲＩ
部位（５′−ＧＡＡＴＴＣ：　−３’の配列、ＧＡの間
を切断）とその上流の塩基配列及びそれが暗号化するア
ミノ酸配列が以下に示すようなことから。

５′・・・ＧＡＡ、ＡＡＡ、ＡＡＧ、ＡＡＴ、ＴＣＴ、
・・・３′Ｇｌｕ、　Ｌｙｓ、　Ｌｙｓ、　Ａｓｎ、　
Ｓｅｔ。

ＥｃｏＲＩ切断部位に導入でき、かつ導入の方向を定め
る為に、下流側はＢａｍＨＩ切断部位（５’−ＧＧＡＴ
ＣＣ−３’の配列、　ＧＧの間を切断）に導入できる配
列とした。また、ＢＫとＤＨＦＲとの融合（翰メチオニ
ン（Ｍｅｔ）を介しており、融合タンパクをブロムシア
ンで処理することにより、ＢＫを切り出すことができる
構造としている。上記配列１．はＢＫを暗号化する配列
であり、２．はその相補鎖配列である。上記配列１．を
導入することにより、以下に示すようにＤＨＦＲのカル
ボキシ末端側にＭｅｔを介してＢＫが融合したタンパク
を暗号化する配列が得られる。

５°−ＧＡＡＡＡＡＡＡＧＡＡＴＴＣＴＡＴＧＣＧＣＣ
ＣＡ−ＧｌｕＬｙｓＬｙｓＡｓｎＳｅｒＭｅｔＡｒｇＰ
ｒ。

ＣＣＧＧＧＴＴＴＣＴＣＡＣＣＧＴＴＣＣＧＣＴＡＡＧ
−３″−ＰｒｏＧＩｙＰｈｅ　ＳｅｒＰｒｏＰｈｅＡｒ
ｇ（２）化学合成りＮＡのＢ、５ｕｂｔｉｌｉｓのＤＨ
ＦＲ遺伝子のＥｃｏＲＩ部位下流への組み込み。

上記列１．及び２．は、互いに相補的であり、一方の末
端はＥｃｏＲＩ切断配列、他方はＢａｍＨＩ切断配列を
有する。本発明者らは、既にＤＨＦＲのカルボキシ末端
側にロイシンエンケファリンを融合シた融合タンパクの
遺伝子を有する組換えプラスミドｐＢＳＦＯＬＥＫＩを
開発している（特許゛酢−゛ｊ配置−２３４００３）。

ｐ　ＢＳＦＯＬＥＫｌはロイシンエンケファリンを暗号
化する配列をはさむ形で、ＥｃｏＲＩ部位及びＢ　ａ　
ｍ　ＨＩ部位をそれぞれ１箇所ずつ有する。従って、化
学合成したＢＫを暗号化するＤＮＡをｐＢｓＦＯＬＥＫ
ｌのＥｃｏＲＩ　−ＢａｍＨＩ部位に導入することによ
りＤＨＦＲ−ＢＫ融合タンパクを発現可能な組換えプラ
スミドを作成することができる。

本発明のプラスミドｐＢＬＡＫ１は、４７７４塩基対の
大きさを有し、宿主であるＥ、ｃｏｌｉをトリメトプリ
ムおよびアンピシリン耐性に形質転換することができ、
第１図に示される塩基配列によって確定される新規な組
換えプラスミドである。プラスミドｐＢＬＡＫ１は、制
限酵素ＥｃｏＲＩ、　ＢａｍＨＩ。

ＢｇｌｌＩ、　ＢｓｔＥＩＩ、　ＰｓｔＩ、　ＰｖｕＩ
Ｉ、　５ａｌＩによって、各々１箇所切断され＊　Ａａ
　ｔ　ＩＩ　、Ｃ１ａ　Ｉ　−ＨｉｎｄｆＪｌ。

ＨｐａＩによって各々２箇所切断される。

第１図は、ｐＢＬＡＫｌの全塩基配列を示す図であり２
本鎖ＤＮＡのうち片方の配列だけを示している。第２図
は、ｐＢＬＡＫｌ中に存在するＤＨＦＲ−ＢＫ融合タン
パクを暗号化する部分の塩基配列及びタンパクのアミノ
酸配列を示す図である。制限酵素ＥｃｏＲＩの認識切断
部位は、６７６〜６８１塩基の所に、第２図においては
、４８０〜４８５塩基の所に存在する。制限酵素Ｂａｍ
ＨＩの認識切断部位は、第１図において、７１５〜７２
１塩基の所に存在する。このＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩ切
断によって得られる４０ヌクレオチドよりなる配列が上
記合成りＮＡによって導入された配列である。

ＤＨＦＲ−ＢＫ融合タンパクは、第２図に示されるよう
に１７２個のアミノ酸より構成される。

融合タンパクのアミノ末端側から１６２番目までは、　
Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓのＤＨＦＲのアミノ酸配列と同一
であり、１６４〜１７２番目の配列がＢＫの配列である
。１６３番目のアミノ酸はＭｅｔであり、ブロムシアン
で融合タンパクを処理することによりＢＫを切り出すこ
とが可能な構造である。融合タンパクの分子量は１９，
８０１である。

ｐＢＬＡＫｌを含有するＥ、ｃｏｌｉは、ＤＨＦＲ−Ｂ
Ｋ融合りα諺りを細胞内で作ることができる。

すなわち、ｐＢＬＡＫｌを含有するＥ、ｃｏｌｉを培養
し、菌体を集め、これを音波破砕し、２００００回転／
分回転時間遠心分離して得られる上清中に。

ＤＨＦＲ−′ＢＫ融合タンパクのほとんど全てが存在す
る。即ち、融合タンパクは不溶性でなく可溶性の状態で
Ｅ、ｃｏｌｉ細胞中に産生されている。また。

この上清から、ＤＨＦＲ酵素活性を目安に精製したタン
パクは、ＢＫに対する抗体と反応することが明かとなっ
た。即ち、ＤＨＦＲ−ＢＫ融合タンパクは、ＤＨＦＲ酵
素活性を有し、これを指標に分離精製を行うことができ
る。従って２本発明のｐＢＬＡＫＩを用いることにより
、遺伝子操作技術を利用したＢＫ生産を行うことが可能
となったのである。

本発明に係わる新規組換えプラスミドｐＢＬＡＫ１は、
ｐＢｓＦＯＬＥＫｌ　（特許出願６１−２３４００■及
び化学合成したＤＮＡをもちいて、実施例１に記す方法
に従って作成することができるが、プラスミドの作成方
法によって本発明が制限されるものではない。

本発明のプラスミドｐＢＬＡＫ１は＊　Ｅ、ｃｏｌｉＣ
６００株に導入されて安定状態に保たれ、ｐＢＬＡＫｌ
を含有するＥ、ｃｏｌｉ　Ｃ６００株は微工研にＦＥＲ
Ｍ　、　Ｐ−９３００として寄託されている。

次に本発明の実施例を示す。

実施例１ 組換えプラスミドｐ　Ｂ　ＬＡＫ　１の作成０．００１
ｒｒ１ｇノブラスミドｐＢｓＦＯＬＥＫ１　（特許出願
　６ｌ−２３４００３）を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａ
　ｍ　ＨＩを用いて切断後、１９６アガロースゲル電気
泳動法により分離した。約４．７キロ塩基対のＤＮＡ断
片を切り出し透析チューブに入れｌ　ｍｌの５０ｍＭ　
Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ８，０を加えシールし、電気溶
出法（ｅｌｅｃｔｒｏｅｌｕｔｉｏｎ法、　Ｔ、Ｍａｎ
ｉａＮｓら＋Ｍｏ−１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　
Ａ　Ｌｏｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　ｐ、Ｌ　
６４ｐＣｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ　（１９８２）、文献１）により、ゲル
からＤＮＡを回収し、エタノールでＤＮＡを沈殿後、減
圧下に沈殿を乾燥した（ＤＮＡ−１と呼ぶ）。この配列
は、第１図の’４−；ｅ７７番目と７１６〜４７７４番
目の配列である。（第１図は、環状構造の配列を便宜上
直鎖上配列で表わしているため、４７７４番目の塩基と
１番目の塩基は隣り合ってつながっている。） ＢＫを暗号化するＤＮＡとしては、以下に示す配列のも
のをホスホアミダイト法により化学合成して用いた。

１．５′−ＡＡＴＴＣＴＡＴＧＣＧＣＣＣＡＣＣＧＧＧ
ＴＴＴＣＴＣＡＣＣＧＴＴＣＣＧＣＴＡＡＧ−３″ ２．５°−Ｇ、ＡＴ、ＣＣＴＴＡＧＣＧＧＡＡＣＧＧＴ
ＧＡＧＡＡＡＣＣＣＧＧＴＧＧＧＣＧＣＡＴＡＧ−３’ この２本のＤＮＡをホスホアミダイト法に従って化学合
成し、精製後、ポリヌクレオチドキナーゼで５′−末端
をリン酸化した後、各々を約ｏ、　ｉ　ｉ（約０．ＯＯ
Ｏｌｒｎｇ（７）ＤＮＡを含んでいる）ずつ取り。

これを６０°Ｃでインキュベートすることによりアニー
ルさせた（これをＤＮＡ−２と呼ぶ）。

ＤＮＡ−１を０．０５ｒｎｌのリガーゼ用反応液（１０
ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣＩ、　ｐＨ７，４，５ｍＭ　Ｍ
ｇ　Ｃ１２，１０ｍＭジチオ、トレ゛イトール、０．５
ｍＭ　　ＡＴＰ）　　に溶解シタ後、　０．０５ｆｆｌ
Ｊ（７）ＤＮＡ−２及ヒ、０．５ユニツト（７）Ｔ　４
−ＤＮＡ　！Ｊ　カー−ｔ／を加工、３７°ｃ、１時間
、ＤＮＡの連結反応を行なわせた。この反応物をｐ形質
転換法（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ
、上記文献１．ｐｐ、２５０）ｌｃ従ッテ、　Ｅ、ｃｏ
ｌ　ｉ　Ｃ６００株に取り込ませた。この処理をした菌
体を、５０■／ｌのアンピシリンナトリウム及び１ｏＩ
ＩＩｇ／ｌのトリメトプリムを含む栄養寒天培地（ｌｌ
中に、１ｇのグルコース、１ｇのリン酸２カリウム、５
ｇのイーストエキス、５ｇのポリペプトン、及び１５ｇ
の寒天を含む寒天培地）上に塗布し、３７°Ｃで２４時
間培養することにより、約５０個のコロニーを得ること
ができた。これらのコロニーがら。

適当に８個選び、１．５ｍｌのＹＴ＋Ａｐ培地（１１中
に、５ｇのＮ　ａ　Ｃ１＊　８　ｇのトリプトン、５ｇ
のイーストエキス、及び５０ｍｇのアンピシリンナトリ
ウムを含む液体培地）１で３７℃で、−晩菌体を培養し
た。培養液をそれぞれ、エッペンドルフ遠心管にとり、
１２０００回転／分で１ｏ分間遠心し、菌体を集めた唾
上清を捨て、これにＱ、　ｌ　ａｔの電気泳動サンプル
調製液（０，０６２５ＭのＴｒ　ｉ　ｓ　−ＨＣｌ　。

ｐＨ６，８，２％のラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳと
略す。）、１０９６のグリセリン、５９６の２−メルカ
プトエタノール、及びｏ、ｏｏｉ９６プロムフエノール
ブルーを含む。）を加え、菌体を懸濁し、これを沸騰水
中に５分間保つことにより菌体を溶かした。この処理を
したサンプルを５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法
（Ｕ、に、Ｌａｍｍ１ｉ　　Ｎａｔ−ｕｒｅ、ｖｏｌ、
２２７．ｐｐ、６８０−６８５　（１９７０）に従って
分析した。綜準サンプルとしてｐＢＳＦＯＬＥＫＩを含
有するＥ、ｃｏＨに同様な処理をしたもの及び分子量マ
ーカーサンプルとしてラクトアルブミン、トリプシンイ
ンヒビター、トリプシノーゲン、カーボニックアンヒド
ラーゼ、グリセロアルデヒド−３リン酸デヒドロゲナー
ゼ、卵アルブミン、及び牛血清アルブミンを含むサンプ
ルを泳動した。その結果、８個のコロニーのうち、３個
のコロニーでは、ｐＢｓＦＯＬＥＫｌを含有するＥ、ｃ
ｏｌｉ；６（作ルＤＨＦ　Ｒ−ロイシンエンケファリン
融合タンパクが消失し、新たに、それより、ｄｔｏｏ。

ダルトン大きいタンパクが作られていることが明らかと
なった。また、新たに得られたタンパクバンドの量は、
ｐＢｓＦＯＬＥＫｌを含有するＥ、ｃｏｌｉが作るＤＨ
ＦＲ−ロイシンエンケファリン融合タンパクのバンドの
量と大差がないことから、遺伝子発現の効率は変化して
いないものと考えられた。

この３個から適当に１個選び、これをＹＴ十八へ培地で
培養しｐ　ＴａｎａｋａとＷｅｉｓｂｌｕｍの方法（Ｔ
、　Ｔａ−ｎａｋａ、　Ｂ、Ｗｅｉｓｂｌｕｍ　ｐ　Ｊ
、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、　ｖｏｌ　１２１゜ｐ
ｐ、３５４　（１９７５））にしたがってプラスミドを
調製した。得られたプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＬＢ
ａｍＨＩ、　Ｂｇ目Ｉ、　ＢｓｔＥ］Ｉ、　ＰｓｔＩ　
、　ＰｖｕｆｔＴ、　Ｓａｔ　Ｉ。

Ａａｔ　Ｉｌ、　Ｃ１ａ　Ｉ、　Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ　、
　Ｈｐａ　Ｉによって切断を試みたところ、各々１．１
．１．１．１．１．１．２．２，２゜２箇所切断される
ことが明らかとなった。得られたプラスミドをｐＢＬＡ
Ｋｌと称した。ｐＢＬＡＫＩの全塩基配列を、ジデオキ
シ法に従って決定した。

その結果、第１図に示す塩基配列が明らかとなり。

プラスミドｐ、ＢＬＡＫＩは４７７４塩基対より成り立
っていることが明らかとなった。

実施例２ 組換えプラスミドｐＢＬＡＫ１を含有するＥ、ｃｏｌｆ
Ｃ６００株からのＤＨＦＲ−ＢＫ融合タンパクの精製。

プラスミドｐＢＬＡＫ１を含有するＥ、ｃｏｌｉＣ６０
０株を３１のＹＴ十Ａｐ培地中で３７℃で一晩培養後、
菌体を遠心分離により集めた。湿重量約１２ｇの菌体が
えられた。菌体を０．１　ｍＭのエチレンジアミン４酢
酸２ナトリウム（ＥＤＴＡ）を含む１０ｍＭリン酸カリ
ウム緩衝液ｐＨ７，０（緩衝液１）に懸濁し、超音波破
砕により細胞を破砕した後。

２０、　ＯＯＯ回転／分、１時間の遠心分離により上清
３５ｍ１を得た。得られた上清のＤＨＦＲの酵素活性を
測定したところ、９０ユニツト／　ｍｌという値であっ
た。（全活性３１５０ユニツト、全タンパク９０２■、
比活性３．５ユニツト７■）。ＤＨＦＲ酵素活性ｉｔ、
ＤＨＦＲ反応液（０，０５ｍＭジヒドロ葉酸、０．０６
ｍＭ　ＮＡＤＰＨ，１２ｍＭ　２−メルヵプトエターノ
Ｌ’、’−５−０’ｍＭ　　リン酸カリウム緩衝液（ｐ
Ｈ７，０））を、１−のキュベツトにとり、これに酵素
液を加え９分光光度計中で、３０°Ｃで反応を行わせ、
３４０ｎｍの吸光度の時間変化を測定することにより行
った。酵素１ユニツトは、上記反応条件において、１分
間に１マイクロモルのジヒドロ葉酸を還元するのに要す
る酵素量として定義した。得られた遠心上清を、ＤＥＡ
Ｅ−）コパール６５０Ｍカラム（２５０ｒｍ、　、ｘ　
１５００　ｍｍ、約７５ｃＩｄ）に吸着させ、５０ｍＭ
のＫＣＩを含む緩衝液１で溶出した。約６ｄずつ７ラク
シヨンを集め、ＤＨＦＲの酵素活性を測定し、酵素活性
を有する画分を集めた。６５−の酵素液が得られた（回
収活性１８９７ユニツト　（６０％）、回収タンパク２
５１ｎｇ、比活性７５．９ユニツト７■）。これをアミ
コン限外ろ過装置を用いて約１−にまで濃縮し、これを
トヨパールＨＷ５５カラムクロマトグラフィーにより分
画した。約２．８ｍｌずつフラクションを集め、ＤＨＦ
Ｒの酵素活性を測定し、酵素活性のピーク画分を集めた
。１１．２−の酵素液が得られた（回収活性１１５１ユ
ニット（−８′−１奔）２回収タンパク５．７１ｎｇ、
比活性２０２ユニット／ｍｇ）。得られた酵素タンパク
をＳＤＳ電気泳動法により分析したところ、均一であり
、ラクトアルブミン、トリプシンインヒビター、トリプ
□シノーゲン、カーボニックアンヒドラーゼ、グリセロ
アルデヒド−３リン酸デヒドロゲナーゼ、卵アルブミン
、及び牛血清アルブミンを分子量マーカーとして、精製
ジヒドロ葉酸還元酵素の分子量を推定したところ２０．
０００であり、塩基配列から予想される分子ｆｆ１１９
，８０１とほぼ一致した値であった。

精製したＤＨＦＲ活性を有するタンパクをイムノアッセ
イにより測定したところ、ＢＫに対する抗体と反応し、
化学合成したＢＫによって抗原−抗体反応が競争的に阻
害されることが明らかとなった。また、精製したＤＨＦ
Ｒ活性を有するタンパクのカルボキシ末端側のアミノ酸
配列をカルボキシペプチダーゼ法を用いて検討したとこ
ろ、−Ｐｈｅ　　５ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ　−Ａｒｇ　
（カルボキシ末端）であることが判明した。この配列は
、ＢＫのカルボキシ末端側配列と完全に一致している。

以上の結果は、ＤＨＦＲ−ＢＫ融合タンパクが、確かに
ＢＫを含んでいることを示している。

発明の効果 上記のように、新規組換えプラスミドｐＢＬＡＫ１は、
ＤＨＦＲ−ＢＫ融合タンパクを可溶性の状態で生産する
。さらに、産性したＤＨＦＲ−ＢＫ融合タンパクはＤＨ
ＦＲ酵素活性を示し、精製を容易に行うことができる。

このような性質を有することから９本発明の新規組換え
プラスミドｐ　ＢＬＡＫ　１及びそれを含有するＥ、ｃ
ｏｌ＋は、ＤＨＦＲ−ＢＫ融合タンパクの生産、及びそ
れを利用したＢＫの生産に有益である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ｐＢＬＡＫｌの全塩基配列を示した図であり
、２本鎖ＤＮＡのうち片方のＤＮＡ鎖配列配列を、５′
末端の方向に記述している。図中符号は、核酸塩基を表
わし、Ａはアデニンを、Ｃはシトシンを、Ｇはグアニン
を、Ｔはチミ」４示している。図中番号はｐＢＬＡＫＩ
に２箇所存在する制限酵素Ｃ１ａＩ切断認識部位のうち
制限酵素ＨｉｎｄＩ［切断部位に近い方のＣ１ａＩ切断
認識部位の、ＡＴＣＧＡＴの最初の”Ａ”を１番として
数えた番号を示している。 第２図は、ｐＢＬＡＫｌ中に存在するＤＨＦＲ−ＢＫ融
合タンパクを暗号化する部分の塩基配列及びタンパクの
アミノ酸配列を示す図である。図中符号は、核酸塩基及
びアミノ酸を表わし、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇ
はグアニンを、Ｔはチミンを、Ａｌａはアラニンをｔ　
Ａｒｇはアルギニン’ｉ：、Ａｓｎハアスパラギンを、
Ａｓｐはアスパラギン酸をｅ　Ｃｙｓはシスティンを＋
０１ｎはグルタミンを。 Ｇｌｕはグルタミン酸を、Ｇｘｙはグリシンを、Ｈ４ｓ
はヒスチジンを、　　ＩｌｅはインロイシンをｔＬｅｕ
はロイシンを、Ｌｙｓはリジンを、Ｍｅｔはメチオニン
を、Ｐｈｅはフェニルアラニンを、　　Ｐｒｏはプロリ
ンを、　　Ｓｅｔはセリンを、　Ｔｈｒはトレオニンを
、　Ｔｒｐはトリプトファンを、Ｔｙｒはチロシンを、
Ｖａｔは）酸であｓ　’−ｉ’−チオニンを暗号化する
ＡＴＧコドンのＡ”を１番として数えた番号を示してい
る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて安定に複製され、宿主である
   Ｅ．ｃｏｌｉにトリメトプリム耐性及びアンピシリン耐
   性を与えることができ、トリメトプリム耐性を付与する
   遺伝子がＢａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓのジヒド
   ロ葉酸還元酵素遺伝子の３′末端側が一部改変されたこ
   とによりジヒドロ葉酸還元酵素−ブラジキニン融合タン
   パクを暗号化し、４７７４塩基対の大きさを有し、第１
   図において示されるＤＮＡ配列を有する新規組換えプラ
   スミドｐＢＬＡＫ１。 ２、特許請求範囲第１項記載の新規組換えプラスミドｐ
   ＢＬＡＫ１を含有するＥ．ｃｏｌｉ　Ｃ６００株。