WO1987000553A1 - Process for preparing hetero-protein - Google Patents

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WO1987000553A1
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heterologous protein
producing
protein
hetero
transformant
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Hironobu Watanabe
Hideyuki Ishikawa
Masanori Nagai
Hirofumi Arimura
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The Green Cross Corporation
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a heterologous protein by recovering a heterologous protein from a heterologous protein S-producing transformant obtained by a genetic engineering technique.
  • Recombinant DNA technology has made it possible to express and produce heterologous proteins in bacteria and other hosts.
  • HIFN human interferon
  • ⁇ -kinase ⁇ -kinase
  • ⁇ - ⁇ human tissue-derived plasminogen activator
  • the present invention solubilizes a heterologous protein precipitated in the body of a transformant obtained by a genetic engineering technique, restores an active form in a biological assay, and achieves a higher yield. It is an object of the present invention to provide a method for recovering a heterologous protein at a high efficiency, particularly a method for preventing a protein from being degraded during a purification step.
  • the present invention relates to a method for producing a heterologous protein by culturing a heterologous protein-producing transformant obtained by a genetic engineering technique to produce a heterologous protein, and recovering the produced heterologous protein.
  • the starting material in the present invention is a transformant capable of expressing a heterologous protein obtained by a genetic engineering technique, and its host is a host capable of producing and accumulating a heterologous protein in the body, particularly a cell.
  • Escherichia coli is exemplified.
  • a method for obtaining various heterologous protein S-producing transformants by genetic manipulation may be a known method or a method analogous thereto.
  • Such methods include, for example, Japanese Patent Application No. 59-371119 (applicant: Green Cross) as a method for producing perokinase, and Japanese Patent Application No. 59-2-2 as a method for producing IFN-r. 2 9 8 6 4 (Applicant: Green Cross), a method for producing HBsAg is disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. Sho 59-42421 discloses a method for producing TPA.
  • the term “recovery of a heterologous protein” in the present invention refers to the step of isolating and purifying the heterologous protein accumulated in the above-mentioned transformant from the transformant.
  • the chlorine ion is present in all or part of the recovery step, but is preferably present in all steps. Since the recovery is usually performed by first lysing the transformant in a buffer solution, the presence of chlorine ions in the buffer solution, especially the subsequent removal until the high-purity is completed, is performed. Preferably not.
  • Chloride ion is usually present in the form of a salt that can be dissociated into chlorine ion.
  • the chlorine ion dissociable salts include alkali metal chlorides (sodium chloride, chloride chloride, etc.) and alkaline chloride earth metal salts (calcium chloride, magnesium chloride, etc.).
  • alkali metal chlorides sodium chloride, chloride chloride, etc.
  • alkaline chloride earth metal salts calcium chloride, magnesium chloride, etc.
  • magnesium chloride is preferably exemplified.
  • the chloride ion is preferably present in a salt form at a concentration of 0.1 M or more, preferably about 0.2 to 3 M.
  • a buffer used for recovering a heterologous protein generally, a buffer having a pH of 5 to 10 and preferably a buffer having a pH of 7 to 8 is used. Mild street liquid (pH 8.0) is an example. Chloride ion dissociable salts may be added to the buffer. I like it. The final concentration of the salt added is 0.1 M or more, preferably 0.2 to 3 M.
  • the suspension die Bruno milling, sonication or French breath treatment etc. And perform the extraction process. It is preferable that the dynomill treatment is performed at a rotation speed of about 3000 rpm for 1 to 10 minutes, preferably 1 to 3 minutes together with ⁇ 0.1 ⁇ gliding beads.
  • the heterologous protein S is purified.
  • conventional techniques can be appropriately used as a protein purification method.
  • a fractionation method based on a difference in solubility such as an ammonium sulfate fraction, an ethanol fraction, and an acrylol fraction, and a centrifugal separation method are suitable.
  • the ammonium sulfate fractionation is carried out by combining a 10 to 20% saturated ammonium sulfate fractionation step and a 40 to 50% saturated ammonium sulfate fractionation step.
  • the centrifugation is carried out by treating the cells at 5000 to 20000 r.p.m. for 10 to 60 minutes to remove the sediment and collecting the centrifuged supernatant. Also in this treatment, a dissociation salt composed of chlorine ion is added, if desired, similarly to the above-mentioned buffer solution. Preferred salts and their amounts are the same as described above.
  • the collected fraction is then subjected to folding if desired.
  • a buffer solution of PH 6 to 8 or 0.01 to 0.2 M (for example, a tris buffer solution) is preferably used.
  • the break-through time is preferably 10 o'clock More than a minute.
  • the addition of the chlorine dissociable salt is the same as described above.
  • heterologous proteins can be highly purified by a fractionation means (preferably affinity chromatography using a monoclonal antibody), each of which is optionally adapted to the heterologous protein.
  • a fractionation means preferably affinity chromatography using a monoclonal antibody
  • the highly purified heterologous protein S is processed by a conventional technique according to the purpose of formulation.
  • the bacteria or bacteria may be removed and sterilized as required, and then excipients, stabilizers, and solubilizers will be examined.
  • the heterologous protein to which the production method of the present invention is applied may be any as long as a transformant obtained by a genetic engineering technique can be produced, and for example, interferon (", and r), Oral kinase, HBsAg, TPA and the like.
  • Fig. 1 shows that IFN-r recovered in Experimental Example 1 was subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and subjected to anti-IFN-r after Western blotting. This shows the result of detecting IFN-r by staining with an enzyme antibody method using a monoclonal antibody.
  • 16.5 K, 15.2 ⁇ and 17.3 ⁇ indicate electrophoretic fractions with molecular weights of 16500, 15200 and 17300, respectively.
  • the culture is centrifuged at 4000 rpm for 20 minutes to collect the cells, and washed with 30 mM NaCp, 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0).
  • the washed cells were lysed with a lysis buffer [30 mi1 NaC £. 50 m EDTA, 250
  • the dyno treatment is performed at 3000 rpm for 1-3 minutes.
  • the molecular weight of the obtained IFN—r was ⁇ 300, and no reduction in molecular weight was caused by this treatment step.
  • Example 1 IFN from the transformants - Extraction of r, performs recovery, and compared the effect of the addition of salt (M g C £ 2), it showed the result in Table 1.
  • the salt was added to the buffer and the permeate, respectively, and all others were the same as in Example 1.
  • the additives, amounts added, and IF-r activity are shown in Table 1, and the molecular weight of IFN-r is shown in FIG. The control is without Mg C £ 2 .
  • the present invention has achieved an approximately four-fold improvement in yield and prevention of low molecular weight as compared with the conventional extraction and recovery methods.
  • the present invention also provides a higher industrial level of heterologous protein even in gene recombination technology using Escherichia coli or the like as a host, which has not been able to obtain sufficient production efficiency because of its accumulation in cells. It enables collection.

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Description

明 細 書
異種蛋 S質の製造方法
技術分野および発明の開示
技術分野
本発明は、 遺伝子操作技術によって得られた異種蛋 S産生性 形質転換体から異種蛋白質を回収することによる異種蛋白質の 製造方法に関する。
背景技術
組換え D N A技術により、 異種蛋白質を細菌、 その他の宿主 中で発現 · 生産させることが可能となった。
たとえば、 ヒ ト イ ンタ ーフヱ ロ ン （以下、 H I F N ) の各型 ( . P r ) 、 ゥ σキナーゼ、 Τ Ρ Α (ヒ ト組織由来プラス ミノゲン活性化因子） を舍め、 多 く のヒ トの蛋白質がこれら蛋 白質をコー ドしている D M Aで宿主を形質転換し、 得られた形 質転換体を当該異種蛋 S質の発現に好適な条件下で増殖させる ことにより、 宿主内で産生されている。 しかしながら、 異種蛋 白質はしばしば宿主内で不溶化し、 沈殺する。 所望の蛋白質が このような沈澱を形成する場合、 これらの回収には次の問題が ある。 第一に、 宿主内に沈殺している蛋白質を宿主物質より分 離し、 且つ可溶化させる必要がある。 第二に、 所望の蛋白質は 生物学的には不活性な形態が多い。 第三に、 精製工程中におい て、 宿主由来の蛋白分解酵素の存在によって、 所望蛋白質の低 分子化がおこる。
これらの問題を解決するための先行技術として、 蛋白変性剤 処理による方法 （特開昭 5 9 — 1 6 1 3 2 1 ) 、 塩酸一グァニ ジン処理による方法 （U S P — 4 4 7 6 0 4 9 ) が提案されて いるが、 所望蛋白質の回収は十分ではない。
発明の開示
本発明は、 遺伝子操作技術によって得られた形質^換体から、 当該形質転換体の体内に沈殺した異種蛋由質を可溶化し、 生物 学的検定において活性な形態を回復させ、 より高収率に異種蛋 白質を回収する方法、 特に精製工程中における蛋白質の低分子 化を防止する方法を提供することを目的とする。
本発明は、 遺伝子操作技術によって得られた異種蛋白質産生 性形質転換体を培養して異種蛋 0質を産生せしめ、 生産された 異種蛋白質を回収することによる異種蛋白質の製造方法におい て、 異種蛋白質を体内に産生した形質転換体から異種蛋白質の 回収処理を塩素ィォンの存在下で行う ことを特徴とする異種蛋 白質の製造方法からなる。
(a)出発原料
本発明における出発原料は、 遺伝子操作技術によって得られ る異種蛋白質発現性となった形質転換体であり、 その宿主は異 種蛋白質を体内に産生、 蓄積しうるもの、 特に菌体である。 好 適には、 大腸菌が例示される。
遺伝子操作によって各種異種蛋 S質産生性形質転換体を得る 方法は、 既知の方法またはそれに準ずる方法に従えばよい。 か かる方法としては、 例えば、 ゥロキナーゼを生産する方法とし て特願昭 5 9 - 3 7 1 1 9 (出願人 ： ミ ドリ十字） 、 I F N - rを生産する方法として特願昭 5 9 — 2 2 9 8 6 4 (出願人 ： ミ ドリ十字） 、 H B s A gを生産する方法として特開昭 5 8 — 1 0 4 8 8 7および特開昭 5 9 — 4 8 0 8 2、 T P Aを生産す る方法として特開昭 5 9 — 4 2 3 2 1 にその開示がある。
( )形質転換体からの異種蛋白質の回収
本発明における異種蛋白質の回収とは、 上述 )の形質転換体 内に蓄積された異種蛋白質を、 形質転換体内から単離精製する 工程をいう。
塩素イ オ ンは、 回収工程の全工程または一部の工程に存在さ せるが、 好ましく は全工程に存在させる。 而して、 当該回収は、 通常、 まず形質転換体を緩衝液に溶菌する操作に付されるので、 当該锾衝液中に塩素イ オ ンを存在させること、 特に以後高度精 製を終わるまで除去しないことが好ましい。
塩素イ オ ンは、 通常塩素イ オ ンに解離しうる塩の形態で存在 させる。 塩素イ オ ン解離性の塩としては、 例えば塩化アルカ リ 金属塩 （塩化ナ ト リ ウム、 塩化力 リ ゥムなど） 、 塩化アル力 リ 土類金属塩 （塩化カルシウム、 塩化マグネ シウムなど） などが 好ましく、 特に塩化アルカ リ土類金属塩が好ましい。 具体的に は、 塩化マグネシウムが好適に例示される。
塩素イオンは、 塩の形態として 0. 1 M以上、 好ましく は 0. 2 〜 3 M程度の濃度で存在させることが好ましい。
以下、 具体的な回収工程を説明する。
(b-1)锾衝液の調製 '·
異種蛋白質の回収に使用される緩衝液としては、 一般的には P H 5 〜 ： 1 0のもの、 好ましく は、 ρ Η 7〜 8のものが用いら れ、 例えば、 2 5 O mMト リス塩酸緩街液 （ p H 8. 0 ) などが例 示される。 緩衝液に、 塩素イ オ ン解離性塩が添加されるこ とが 好まレぃ。 塩の添加終濃度は 0. 1 M以上、 好ましく は 0. 2 〜 3 Mである。
(b-2)抽出処理 ：
前記緩街液に形質転換体を懸濁させ （O D 65。 の測定値が、 1 0 0 〜 2 0 0 ) 、 この懸濁液をダイ ノ ミル処理、 超音波処理 あるいはフレンチブレス処理等によつて抽出処理をする。 ダィ ノ ミル処理は ø 0. 1 «グラィ ディ ングビーズと共に回転数 3000 r. p.m.程度で 1 〜 1 0分間、 好ましく は 1 〜 3分間行う ことが 好適である。
(b-3)精製 ：
上記抽出処理後、 通常、 異種蛋 S質の精製が行われる。 精製 には蛋白質の精製法として慣用技術が適宜利用できる。 例えば、 硫安分画、 エタノ ール分画、 ァク リ ノ ール分画等の溶解度差に 基づく分画方法および遠心分離の方法等が好適である。
硫安分画は、 1 0 〜 2 0 %飽和硫安分画工程と 4 0 〜 5 0 % 飽和硫安分画工程を組み合わせることによつて実施される。
遠心分離は 5000 〜20000 r.p.m.、 1 0 〜 6 0分間処理に付 し沈殺物を除去し、 遠心上清を回収するこ とによって行われる。 この処理に際しても、 所望により前記緩衝液と同様に塩素ィ ' ォンからなる解離塩が添加される。 好ましい塩およびその添加 量は前述と同様である。
(b-4)透折 ：
回収画分は所望により、 次いで透折を行う。 透折に際しては、 好ましく は PH 6 〜 8 、 0. 0 1 〜 0. 2 Mの緩衝液 （例えば、 ト リ ス緩衝液など） が用いられる。 透折時間は、 好ましく は 1 0時 間以上である。 塩素ィォン解離性塩の添加は前述と同様である《 (b-5)高度精製：
各種異種蛋白質は、 所望により各々異種蛋白質に適応した分 画手段 （好適には、 モノ ク ロ ーナル抗体を用いたァ 7ィニティ 一クロマ トグラフィ ー） を行う ことによって高度精製される。 製剤化 ：
高度精製された異種蛋 S質は、 各々製剤化目的に応じて自体 慣用技術によって処理される。 医薬品とする場合には、 所望に より除菌 · 滅菌処理を行った後、 賦形剤、 安定剤、 溶解剤の検 討を行い、 液状あるいは乾燥製剤とする。
本発明の製造方法が適用される異種蛋白質は、 遺伝子操作技 術によって得られた形質転換体が産生しうるものであればいず れでもよ く 、 例えばイ ンタ ーフヱロ ン （ "、 および r ) 、 ゥ 口キナーゼ、 H B s A g、 T P Aなどが例示される。
図面の簡単な説明
第 1図は、 実験例 1 にて回収した I F N— rを S D S—ボリ ア ク リ ルアミ ドゲル電気泳動にかけ、 ゥヱスタ ン—ブロ ッ テ ィ ング ( Western - Blotting ) を行った後、 抗 I F N— rモノ クローナル抗体を用いた酵素抗体法で染色して、 I F N - rを 検出した結果を示すものである。 図中、 1 6.5 K、 1 5.2 Κ、 1 7.3 Κは各々分子量 16500、 15200 、 17300 の泳動画分を示 す。
実施例
以下、 本発明を具体的に説明するために実施例および実験例 を示す。 実施例 1
ヒ トイ ンターフェロン一 rボリペプチ ドをコー ドす ¾ D N A 断片が組み込まれたプラス ミ ド P Y S 6 1 (特願昭 5 9 - 2 2 9 8 6 4 ) を担持する大腸菌 W 3 1 1 0株を L B +グルコース (glucose) 培地 〔 ト リ スベース（Tris base) 0· 6 3 g 、 ボ リ べ プト ン（polypeptone) 1 0 g、 酵母抽出物 5 g 、 N a C £ 5 g 、 グルコ ース 1 g 、 ア ンビシリ ン 2 0 mgを水に溶かし 1 と する〕 で 3 7 'c 一夜培養し、 この培養液 2 0 0 m を 1 0 £ の K M - 9培地 （ N a 2 H P 04 1 2 0 g N a H 2 P 04 6 0 g 、 N a C 2 0 g 、 カザミノ酸 3 0 0 g、 酵母抽出物 5 0 を水に溶かし 1 0 《 とする） に接種し、 3 7 'Cで 1時間培養 後、 ト リプトファ ン遺伝子のィ ンデューサーであるィ ン ドール アク リル酸を 4 0 mi加え、 さらに？〜 1 0時間培養を続け る。 培養液を 4000 r.p.m.、 2 0分間遠心して集菌し、 3 0 mM N a C £ , 5 0 mM ト リ ス塩酸緩衝液 （pH 8. 0 ) で洗浄する。 洗 浄された菌体を、 溶菌緩衝液 〔 3 0 mi1 N a C £ . 5 0 m E D T A、 2 5 0 |^ ト リ ス塩酸 （ 118. 0 ) 、 1 0 / mi P M S F (phenyl meth l sul f onyl f luoride)、 0. 5 M M g C £ 2) に菌体濃度が O D 65。 = 1 6 0 となるように懸濁し、 ø 0. 1 «« グライディ ングビーズと共にダイ ノ ミルに充塡する。 ダイノ ミ ル処理は回転数 3000 r. p.m.で 1 〜 3分間行う。
次に 18000 r. p. m.、 3 0分間遠心して上清を得、 これを 0. 5 M M g C £ 2 を含む 0. 1 M ト リ ス塩酸 （pH 7. 0 ) を外液と して透折した後、 イ ンターフヱロ ン— r ( I F N — ? ) の量を c ρ e阻止法 〔 Have 11 , E. A. and Vi leek, J. , Antimicrob. Agents Chemother., 2巻， 476〜484買 （1972) 〕 〔但し、 ウイ ルスとしては Sindbis virus. 動物細胞としてはヒ ト羊膜由来 の F L 3 — 1 cellsを用いた〕 により定量した。 結果、 1. 2 x 1 09 IU/ £であった。
得られた I F N— rの分子量は、 Π300 であり、 本処理工程 により何等の低分子化はおこ っていなかった。
実験例 1
実施例 1に準じて、 形質転換体より I F N - rの抽出、 回収 を行い、 塩 （M g C £ 2 ) の添加による効果を比較検討し、 そ の結果を表 1に示した。 塩は、 緩衝液および透折液に各々添加 し、 その他はすべて実施例 1 と同様にした。 添加物、 添加量、 I F - r活性については表 1に、 I F N - rの分子量は第 1 図に示した。 コ ン ト ロ ールは M g C £ 2 無添加の場合である。
表 1
Figure imgf000009_0001
かく して本発明は、 従来法による抽出、 回収法に比して、 約 4倍の収率の向上および低分子化の阻止を達成した。 この結果、 本発明は従来菌体内蓄積性であることから十分な生産効率を得 ることができなかった大腸菌等を宿主として使う遺伝子組換技 術においても、 より高い産業レベルでの異種蛋白質の回収を可 能とするものである。

Claims

請求の範囲
(1) 遺伝子操作技術によって得られた異種蛋白産生性形質転 換体を培養して異種蛋白質を産生せしめ、 生産された異種蛋白 質を回収することによる異種蛋白質の製造方法において、 異種 蛋白質を体内に産生した形質転換体からの異種蛋白質の回収処 理を塩素ィ ォンの存在下で行う ことを特徴とする異種蛋白質の 製造方法。
(2) 塩素イ オンが、 塩素イ オン解離性塩の形態で添加される 特許請求の範囲第 (1)項記載の異種蛋白質の製造方法。
(3) 塩素ィ ォン解離性塩がアル力 リ金属塩またはアルカ リ土 類金属塩である請求の範囲第 (2)項記載の異種蛋白質の製造方法,
(4) 塩素ィ ォ ン解離性塩が塩化マグネシゥムである請求の範 囲第 (2)項記載の異種蛋白質の製造方法。
(5) 塩素イ オン解離性塩の濃度が 0. 1 M以上である請求の範 囲第 (1)項記載の異種蛋白質の製造方法。
(6) 塩素イ オン解離性塩の濃度が 0. 2 〜 3 Mである請求の範 囲第 (1)項記載の異種蛋 0質の製造方法。
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