JPS62207300A - 天然型ヒトインタ−フエロン−αの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はヒトインターフェロン−αの製造法に関する。

従来の技術 ヒトインターフェロン−α（ＩＦＮ−α）はヒト白血球
インターフェロンとも称され、各種腫瘍に対する効果も
明らかとなり、また遺伝子組換え技術による大量生産も
可能となって〔ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケ
ミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、　）、２５６．９７５０（１９８１）］、抗
腫瘍剤としての市販も間近となっている。

ヒトインターフェロン−αは、ＤＮＡ組換え法を適用し
た場合、大腸菌中で回収し得る程度の量で発現されてお
り通常モノクローナル抗体カラムを用いて培養液から分
離される〔ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミス
トリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、　）、２５６．９７５０（１９８１）。この
ようにして分離されたインターフェロンには天然型の蛋
白質以外にジスルフィド結合、スルフヒドリル基に起因
すると考えられる不純物が混在する。

ＥＰＣ公開１０８５８５−Ａ号公報においては、これら
の不純物は非還元条件下にドデシル硫酸ナトリウムポリ
アクリルアミド電気泳動（Ｓ　Ｄ　Ｓ　−ＰＡＧＥ）分
析にかけてサイズを測定すると単量体蛋白質の数倍の分
子量を示す低重合体（オリゴマー）であることがわかる
物質、および非還元条件下の５ＤＳ−ＰＡＧＥにおいて
やや緩慢に移動する“スローモノマー“から成ると述べ
ている。

ヒトインターフェロン−αは、Ｎ末端から第１゜第２．
第３および第４の４個のシスティン残基を有しており、
組換え型ヒトインターフェロン−α２（ＩＦＮ−α２．
ＩＦＮ−αＡとも称される）の場合は、アミノ酸番号１
，２９．９８および１３８のアミノ酸にンステイン残基
を有している。天然型の分子配置ではアミノ酸番号１−
９８．および２９−　、＋　３８でこれらが結合してい
る。２つ一１３８結合か活性に必要であり、活性は１−
９８結合が破壊された後ら維持されていると考えられて
いる。上記ＥＰＣ公開特許公報によるとヒトインターフ
ェロン−α２の場合、２９−１３８結合はそのままで１
−９８結合が切れることにより“スローモノマー”が生
ずると考えられると述べている。そしてこれらの“スロ
ーモノマー゛など還元型インターフェロン−αは、精製
の途中で、空気酸化を受けて、ランダムなジスルフィド
結合を形成し、多くはオリゴマーとなり、一部は、その
ままの状態でとどまり、製品中に存在すると考えられる
。

オリゴマーはヒトインターフェロン−α２の活性が低い
。“スローモノマー°は、これ自身活性であるが免疫原
性を有すると云われ、またオリゴマーを形成しやすい。

従って天然型のものから、これら不純物を分離除去する
ことが強く望まれる。

従来不純物中のオリゴマーはゲルろ過によって除去され
る。しかしながらこの方法は回収率が良くないばかりか
、より重大な欠点として“スローモノマー”を除去でき
ない。この欠点を克服した方法として上記ＥＰＣ公開特
許公報では、比較的ａ厚な溶液（５〜ｌ　Ｏｍｇ／　滅
）をｐＨ３，５〜４．１゜３０〜３４℃で１０−１４時
間インキユベレートすることにより“スローモノマー”
とオリゴマーを沈澱さ什る方法を開示しているが、この
方法によると菌体中に多量に存在する“スローモノマー
”が同時に沈澱してしまうことになり非常に不経済であ
る。

発明が解決しようとする問題点 本発明者らは組換え大腸菌中に蓄積されているヒトイン
ターフェロン−αは、ジスルフィド結合をした天然型モ
ノマー（“ファストモノマー”）と同時に含まれる“ス
ローモノマー”が大部分未酸化のスルフヒドリル基のま
まの完全もしくは部分還元型モノマーで存在しているこ
とを明らかにした。

ずなイっち出来るだけ短時間でモノクローナル抗体カラ
ムに吸着し、弱酸性で溶出して得たインターフェロン溶
液をＳＤＳ’−ＰＡＧＥで分析すると“スローモノマー
”に一致する大きなスポットが認められること、および
逆相系の１（ＰＬＯで分析すると“スローモノマー“に
一致する位置に大きなピークが認められること、さらに
逆相系の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の“
スローモノマー”のピークか単一ではなく複雑に分かれ
ていることから、大腸菌中に蓄積されているのは、大部
分はスルフヒドリル基を有する完全もしくは部分還元型
であることを明らかにした。

上記知見に基づき、“スローモノマー”をオリゴマーへ
ほとんど移行させず、′ファストモノマー（天然型）”
に選択的に酸化移行させる技術を確立し、それに基づき
本発明を完成した。

問題を解決ずろための手段 本発明は、３０％以上が還元型であるヒトインターフェ
ロン−αの希薄水溶液を熟成することを特徴とする天然
型ヒトインターフェロン−αの製造法を提供するもので
ある。

上記ヒトインターフェロン−αは、天型物として得られ
るものおよび遺伝子組換え技術で製造されたもののいず
れをも意味する。

また各種公知のヒトインターフェロン−αスピーシーズ
も前記第１〜第４のシスティンを有し〔ファーマコロジ
ー・アンド・テラポイテイクス（Ｐｈａｒｍａｃ、　Ｔ
ｈｅｒ、　）、２７．３７１−４０１（１９８５）Ｌ上
記ヒトインターフェロンに包含される。とりわけ大腸菌
で生産された第４図で示されるアミノ酸配列を宵するヒ
トインターフェロン−αＡが好ましい。

還元型ヒトインターフェロン−αとは、スルフヒドリル
基のままの完全もしくは部分還元型の側鎖をｉ〜４有す
るヒトインターフェロンを意味し、６スローモノマー”
と称する。

本発明においては、３０％以上（分子数比）、好ましく
は４５％以上の“スローモノマー”を含むヒトインター
フェロン−α水溶液が有利に使用される。

希薄水溶液は、通常所望により緩衝剤により農度調整さ
れ、濃度１％以下、好ましくはＯ１％以下、とりわけ０
０８〜００２％（０，８ｍｇ／７Ｊ　−０、２ｍｇ／鑓
）のものが好ましい。

熟成は、適切な条件下通常空気酸化することにより達成
される。

例えば、ｐＨを、酢酸などの有機酸を用いて（０，１〜
０．５Ｎのものが好ましい）３．０〜３５．とりわけ３
０〜３．３に調整し、温度２５〜４５℃、好ましくは３
０〜４０℃で自然放置により行う。

なお、上記熟成による空気酸化の温度は、上記に制約さ
れるものではない。低温になるほど長時間を要するので
、通常２５〜４５℃で行う。熟成は、攪拌等などの操作
を加えない方がオリゴマーの生成防止の見地から好まし
い。

熟成は、上記条件下２〜８日間、好ましくは３〜５日間
行う。

上記熟成による本発明の空気酸化の速度をスローモノマ
ーの、ファストモノマーへの移行による減少であられせ
ば、その半減期は、２日である。

なお、上記したオリゴマーとは部分的に重合したものを
色味する。このような重合生成物は単量体の別々の分子
間のジスルフィド結合に起因すると推測されている。オ
リゴマーには、二ｍ体、三量体、四ｍ体およびそれ以上
の高分子量の重合体が含まれる。

本発明方法の出発物質である３０％以上が還元型である
ヒトインターフェロン−αの希薄水溶液は、例えばヒト
インターフェロン−α遺伝子を組込んだ大腸菌を培養し
て得た菌体を、例えば、酸で菌を殺し、遠心分離して菌
体を集め、凍結し、抽出バッファーで抽出し、モノクロ
ーナル抗体カラムに吸着し、酢酸水溶液で溶出して得た
精製液や還元剤で還元して人工的に“スローモノマー”
となった還元型などを用いることができる。

本発明により製造される天然型ヒトインターフェロン−
αは高純度、高収率であり天然のヒトインターフェロン
−αと同様、第１番目と第３番目および第２番目と第４
番のシスティンがジスルフィド結合で結ばれた立体構造
を有し、公知の天然のヒトインターフェロン〜αと同様
の生理活性を有し、抗腫瘍剤、抗ウィルス剤等として用
いることができる。

とりわけ、従来の方法に対し”スローモノマー“が“フ
ァストモノマー”に移行するため“ファスト工程が容易
になるばかりか、収量も増大する。

作用および実施例 以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、
これらにより本発明が制限的に解釈されるものではない
。

なお、実施例に開示する原料としてのヒトインターフェ
ロン−α水溶液は、ＥＰＣ公開第１４４０６４号公報に
記載の方法で製造したものである。

実施例１ 菌体中に蓄積されているインターフェロン−αのスルフ
ヒドリル基の存在を明確にするために、下記の迅速精製
法を行って得たモノクローナル抗体カラム溶出液のスル
フヒドリル基を、エルマン（Ｅ　ｌ　ｌ　ｍａｎ）の試
薬を用いて測定した。まず酸で殺した菌体を遠心分離機
で分離して得た菌体ペーストの凍結物を出発原料とし、
４倍量の塩酸グアニジノ（蛋白変性剤）とトライトンＸ
−１００（界面活性剤）を含む抽出バッファーで抽出し
た。抽出液を遠心分離して得た上澄液に６倍量のバッフ
ァーを加え薄め析出物を除いた上澄液を小さなモノクロ
ーナル抗体カラムに通液し、カラムを洗浄バッファーで
洗浄後、０．２Ｎ酢酸で溶出し、インターフェロン−α
の精製液を得た。抽出から溶出迄約５時間で行った。そ
の結果を第１表に示す。

第１表　迅速精製法で得たモノクローナル抗体溶出液中
のインターフェロン−αのＳＨ基の定量 ※分子量　１９，０００として算出。

第１表から明らかなように迅速精製法で得たモノクロー
ナル抗体溶出液中には多量のＳ　Ｉ−１基が検出された
。

実施例２ 実施例１と同様モノクローナル抗体溶出液を非還元条件
下で５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析し“ファストモノマー゛、“
スローモノマー”、オリゴマー含量を測定した。その結
果を第２表に示す。

第２表　迅速精製法で得たモノクローナル抗体溶出液の
非還元５ＤＳ−ＰＡＧＥによる分析 第２表からも５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析に於ても多量の“ス
ローモノマー”の存在は明らかである。

５ＤＳ−１’ΔＧＥは分子量に応じて物質を分析する１
気泳動の方法である。５ＤＳ−ＰＡＧＥは、例えば、β
−メルカプトエタノールあるいはノチオスレイトールの
様な還元剤の存在下であらゆるジスルフィド結合を対応
するスルフヒドリル基に還元した状態で泳動を行う還元
条件下での５ＤＳ−ＰＡＧＥと、還元剤を使用しないて
泳動を行う非還元条件下での５ＤＳ−ＰＡＧＥがある。

非還元条件下での５ＤＳ−ＰＡＧＥはジスルフィド結合
に帰因するオリゴマー等の存在を知る上に良い方法であ
る。

実施例３ ０．１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ　−１００を含む０．２Ｍ酢
酸溶液でモノクローナル抗体カラムから溶出した組換え
型ヒトインターフェロン−α２溶液（ｐＨ３，３）の一
部（２旙）をとり、蛋白濃度を１．２ｍ［（／成に調整
しｐＨを種々に変えて２５°Ｃで１５時間保温した。こ
れらのサンプルを非還元条件の５ＤＳ−ＰＡＧＥにかけ
、ゲルをＣｏｏｍａｓｓ　１ｅＢｒｉｌｌｉａｎｔ　　
Ｂｉｕｅ　　Ｒ−２５０で染色し、脱色後、デンシトメ
ーターでファストモノマー、スローモノマーおよびオリ
ゴマーの含量を測定した。

その結果を第１図に示す。

第１図から明らかなようにｐｒ（は低い方が良く、活性
に与える影響を考慮するとｐＨ３，Ｑ〜３．５が最適条
件である。

実施例４ 実施例３と同様にヒトインターフェロン−α２溶液（ｐ
Ｈ３，３）の一部（２威）をとり、蛋白濃度を０．２ｍ
ｇ／！Ｌｍ調整し、種々の温度で１５時間保温した。こ
れらのサンプルを実施例３と同様に非還元条件の５ＤＳ
−ＰＡＧＥでファストモノマー１スローモノマーおよび
オリゴマーの含量を測定した。その結果を第２図に示す
。ただし、５０℃で保温した場合には沈澱が生じ、５Ｄ
Ｓ−ＰＡＧＥの分離用ゲル中に泳動されないため、デン
シトメーターで測定した回収率が６３％にまで低下した
。第２図から明らかなように温度は高い方が変換率は良
くなるが、５０°Ｃ以上では沈澱が生じるため、２５℃
〜４５℃の温度が最適である。

実施例５ 実施例３と同様にヒトインターフェロン−α２溶液（ｐ
ｔｌ　３　、３　）の一部（２滅）をとり、濃度を０．
２ｍｇ／ｍに調整し、ｐＨ３，３，３７°Ｃで種々の０
与間保温した。これらのサンプルを実施％１３と同様（
こ５ＤＳ−ＰＡＧＥでファストモノマー、スローモノマ
ーおよびオリゴマーの含量を測定した。その結果を第３
図に示す。本条件下で長時間保温するにしたがい、スロ
ーモノマーｈ（減少し、ファストモノマーが増加した。

オリゴマーの増加（よ′（マとんどみられなかった。

発明の効果 本発明により、これまで不純物として和１用できず除去
されていた還元型ヒトインターフェロン−αから有用な
天然型ヒトインターフェロン−α力く製造できる。

【図面の簡単な説明】

第１図、第２図および第３図は、実施ｐｌ　３　、４お
よび５に開示した５ＤＳ−ＰＡＧＥＩこよる分析の結果
をそれぞれ示す。図中、釦よファストモノマ＝１０はス
ローモノマー、△はオリゴマーギそれぞれ示す。 第４図は、ヒトＩＦＮ−αＡのアミノ酸配列を示す。 第　　Ｉ　　図 ｔｉ 第２図 温　　度　　（’Ｃ） 第３図 時　　間　（ｂｒ） リ　　　　　−四　　　　　〇　　　　　−コ　　　　
　α　　　　　飄　　　　：Ｉ　　　　　コ　　　　Ｈ
仁Ａ　　　　ｒ−１ｒ−Ｉ　　　　ＧＪ　　　　（１３
１）　　　史Ｑ　　　　Ｑ　　　　Ｑ　　　　ｑ　　　
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Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ３０％以上が還元型であるヒトインターフェロン−αの
   希薄水溶液を熟成することを特徴とする天然型ヒトイン
   ターフェロン−αの製造法。