WO1986000932A1 - Process for producing fatty acids by fermentation - Google Patents

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WO1986000932A1
WO1986000932A1 PCT/JP1985/000408 JP8500408W WO8600932A1 WO 1986000932 A1 WO1986000932 A1 WO 1986000932A1 JP 8500408 W JP8500408 W JP 8500408W WO 8600932 A1 WO8600932 A1 WO 8600932A1
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staphylococcus
oils
fats
culture
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PCT/JP1985/000408
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Inventor
Hajime Yoshizumi
Teruo Amachi
Takaharu Tanaka
Kyoichi Ogura
Sumio Asami
Hiroshi Ishigooka
Masahiro Nakao
Original Assignee
Suntory Limited
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6409—Fatty acids
    • C12P7/6418—Fatty acids by hydrolysis of fatty acid esters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase

Definitions

  • the present invention provides a method for producing a fatty acid by a lipase decomposition method which does not have the above-mentioned disadvantages of the conventional lipase decomposition method, and in particular, provides monoglyceride diglyceride.
  • the present invention solves the above problem by a method for producing a fatty acid, which comprises culturing the bacterium in a medium having the bacterium, or culturing the bacterium in the medium, adding fats and oils on the way, and collecting the fatty acid from the culture solution.
  • FIG. 2 is a gas chromatogram of a fatty acid produced by the method of the present invention (Example 2), in which 1, 2, and 3 are the same as those in FIG.
  • Figures 3 and 4 show thin products showing the hydrolysis products of olive oil by the method of the present invention using various strains of staphylococcal caustic cavities.
  • Fig. 5 is a thin-layer chromatogram showing the decomposition products of hydrolysis of olive oil by the method of the present invention using various strains of Staphylococcus evidermidis. It is a rotagram.
  • FIG. 6 is a thin-layer chromatogram showing a decomposition product obtained when oily oil is decomposed by the method of the present invention using various strains of Staphylococcus aureus.
  • Figures 7 and 8 show thin-layer chromatographs showing the products of Triolein digestion using lipases derived from various strains of Staphylococcus capitaces. It is a togram.
  • Staphylococcus ⁇ palaeus strains examples include IAM1011, IAM1098, and IAM12082. Also, as a strain of Staphylococcus' cavity, for example, ATCC 27840 Strains, ATCC 27841, ATCC 27842, ATCC 27843, and Tl-1 (SAM 0001). Among these microorganisms, the microorganism having the code "IAM-" is the Institute of Applied Microbiology, Yayoi, Bunkyo-ku, Tokyo. 1-chome, Bunkyo-ku, Tokyo, JAPAN), and can be easily obtained. The microorganisms with the code "ATCC” are american 'type cano reticulata collectis. (American Type Culture Collection) [12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, United States; (12301 Parklawn Drive,
  • This microbial staphylococcus capiteis T-1-1 (SAM 0001) is the Microbial Industrial Technology Research Institute of the Ministry of International Trade and Industry of the Ministry of International Trade and Industry (1-1-3 Higashi, Yatabe-cho, Tsukuba-gun, Ibaraki Prefecture). ) [Fermentation
  • fatty acids are produced by decomposing fats and oils by lyase produced by the bacteria.
  • the decomposition method for example, the following method can be used.
  • an oil or fat as a raw material is introduced into a medium in which the bacteria can grow, and the medium is inoculated with the bacteria, and the fat and oil are decomposed in parallel with the growth of the bacteria.
  • the above-mentioned bacteria are first grown in a medium in which the above-mentioned bacteria can grow, then the raw material fat is added to this medium, and the surrounding culture is carried out. Do.
  • all of the raw material fats and oils can be first added to the culture medium, but first, a part of the fats and oils is added to the medium to start cultivation, and then bacterial growth and the already added oils are started.
  • the remaining fat can be added continuously or stepwise while monitoring the degree of fat decomposition.
  • the raw material fats and oils can be added at once, or can be added stepwise or continuously.
  • the time at which the fat or oil is added may be, for example, at the beginning of the cultivation when the bacteria have started to grow, or at the time when the growth of the bacteria has almost ended, or in the middle of these. May be at any time.
  • the inoculated culture in which the bacterium of the present invention has been pre-cultured using a liquid medium not containing oil or fat in advance is inoculated to a medium for main culture with or without oil or fat for main culture.
  • Conditions of culture and reaction varies depending strains used, 20 'Te C ⁇ 40, preferably 30' c ⁇ 37 'C temperature, medium P H 5. 0 ⁇ 9. 0, preferably 6.0 It is preferable to carry out liquid culture under aerobic conditions such as aeration, agitation, and shaking.
  • the cultivation time is about 20 to 70 hours when culturing with oils and fats added from the beginning, and when adding fats and oils in the middle of cultivation, until the fats and oils are completely decomposed after the addition of fats and oils is completed. Continue the culture or continue the reaction under the same conditions as for the culture.
  • the fats and oils used in the method of the present invention are not particularly limited as long as they contain glyceride, and are vegetable fats and oils such as olive oil, pear oil or castor oil, animal fats and oils. For example, beef tallow or oil or a mixture thereof can be used.
  • the amount of the fat added depends on the potency of the rivase produced in the medium, but is preferably about 0.5 to 5.0 (v / v)%.
  • fatty acids accumulate in the culture.
  • This fatty acid can be obtained by filtering or centrifuging the culture solution to remove bacteria, followed by extraction, fractional crystallization, and color separation from the culture supernatant obtained by a conventional method.
  • Extraction of free fatty acids from the culture supernatant is performed using an organic solvent that has low polarity and does not mix with water, such as ethyl acetate, chloroform and benzene. After extraction, the solvent is distilled off under reduced pressure, and the residue is mixed and stirred with alcohol such as methanol, so that the fatty acids are transferred to the alcohol 10 layer, but the fats and oils remain.
  • the fatty acid can be purified from the undegraded alcohol-free fraction containing no fat and oil thus obtained by a squeezing method, a fractional crystallization method, a liquid-liquid extraction method, or the like. Further, the preparation can also be performed by normal-phase column chromatography using silica gel or the like, or reverse-phase column 15 chromatography using RP-18 or the like.
  • Example 1 Production of a fatty acid using Staphylococca caveis; a modified method of adding fats and oils first
  • the obtained culture was removed by centrifugation. 30 ethyl acetate was added to the supernatant, and the mixture was stirred for 1 hour. After stirring, the mixture was allowed to stand for 1 hour to separate phases. The ethyl acetate layer was removed and concentrated under reduced pressure to dryness to obtain a residue. To the residue was added methanol of 3 and the mixture was stirred with a mixer at 5. This was centrifuged to obtain a methanol layer. The methanol phase was concentrated under reduced pressure to dryness, and the residue was dissolved in 2 n-hexane.
  • Example 2 Production of Fatty Acid Using Staphylococcus Capitais; Modified Staphylococcus cavitais (ATCC-27840) in which fats and oils are added after culturing
  • Staphylococcus Capitais Modified Staphylococcus cavitais (ATCC-27840) in which fats and oils are added after culturing
  • the cells were subjected to rotary shaking culturing in 200 ⁇ medium.
  • the same main culture medium 7 & as in Example 1 was placed in a 14-volume jar fermenter, and sterilized by pressure at 120 in advance for 15 minutes.
  • FIG. 2 shows the gas chromatogram of the substance of the present invention obtained by the above method.
  • AFF-buton medium AFF-peptone 10% and NaC 0.5%)
  • Example 4 Degradation of triolein by lipase from various strains of Staphylococcus sp. And rivases derived from other microorganisms
  • the bacterium belonging to the genus Staphylococcus described in Example 3 is cultured, and after the culture, the cells are removed by centrifugation. The supernatant was obtained and used as the enzyme solution.
  • the Rivaze value of this enzyme solution is as follows ⁇ strain reversase activity
  • the enzyme solution obtained from the culture of this invention 3 U / enzyme solution with a lipase house of H 1 mj g Doo the Rio lay down 1

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Description

明 細 書
発酵法による脂肪酸の製造方法 技 術 分 野
本発明は、 工業製品、 医薬、 香料、 化粧品の製造等、. 広範 な化学工業において使用されている脂肪酸の製造方法に関す る。 背 景 技 術
現在、 工業原料として用いられている脂肪酸の製造方法と して、 バラフィ ン類を酸化して高級脂肪酸を合成する方法、 精製した天然油脂を高圧分解法、 ト イ ッチュル分解法等非酵 素的方法により分解する方法、 及び天然油 旨をリパーゼ製品 により酵素的に分解する方法等が知られている。
しかしながらバラフ ィ ン類を酸化して合成する方法には製 品品質上の問題がある。 天然油脂を非酵素的に分解して脂肪 酸を製造する方法においては、 一旦生成した脂肪酸や原料油 脂中に含まれていた不純物が分解し、 又はこれらが相互に反 応して種々の不純物が生成し、 このために製品脂肪酸が毒性. 刺激性、 着色、 臭気等を有し、 従ってこれを医薬、 化粧品等 の製造に安全に使用することはできない。 他方、 油脂をリバ —ゼで分解して脂肪酸を製造する方法においては、 反応が穩 和な条件で行われ、 しかも油脂のみが特異的に分解され、 従 つて反応中に有害不純物が生成しな _いので、 高純度の脂肪酸 を製造するのに有利な方法であると考えられる。 wweo/ua ^
しかしながら、 リバーゼ製品は比較的高価であり、 しかも 従来のリバーゼを使用した場合油脂が完全に加水分解されず. その結果モノ グリ セ リ ド及びジグリ セ リ ドが残留して脂肪酸 収率が低いため、 リ バーゼ分解法は経済的不利益を有してい た。 このよう な経済的欠点を解决する手段の 1 つと してリバ ーゼを用いて油脂類を分解する際に、 分解反応系に水に不溶 性の有機瑢媒を添加する こ とにより リパーゼの使用量を低減 せしめる方法が提案されている （特開昭 59-91889) 。 しかし ながら、 この方法は必ずしも実用的とは言えない。
10
発明の開示
この発明は、 従来技術の リパーゼ分解法が有する上記のよ う な欠点を有しないリパーゼ分解法による脂肪酸の製造方法 を提供する ものであり、 特に、 モノ グリ セリ ドゃジグリ セ リ
15 ドを残留せしめる こ とな く ト リ グリ セ リ ドを実質上完全に脂 肪酸とグリ セ リ ンとに分解する酵素を使用する こ と、 及び該 酵素を最も柽済的な方法で使用するこ とに向けられる。
上記の問題点は、 スタフ ィ ロコ ッカス (Staphylococcus )属 に属し、 リパーゼを生産する こ とができる細菌を油脂類を舍
20 有する培地に培養し、 又は該細菌を培地に培養しその中途に おいて油脂類を添加し、 そして培養液から脂肪酸を採取する こ とを特徴とする脂肪酸の製造方法により解決される。
本発明の方法によれば、 油脂類が実質上完全に加水分解さ れモノ ダリ セラ.ィ ド及びジグリ セライ ドが残留しないため、
25 常用の方法に比べて経済的に脂肪酸を製造する こ とができる 図面の簡単な説明
第 1図はこの発明の方法 （実施例 1 ) により製造された脂 肪酸のガスク ロマ トグラムであり、 図中 1 はォ レイ ン酸、 2 はパルミチン酸、 そして 3 はリ ノ ール酸のビークをそれぞれ 示す。
第 2図はこの発明の方法 （実施例 2 ) により製造された脂 肪酸のガスク ロマ トグラムであり、 図中 1、 2 、 及び 3 はそ れぞれ第 1図の場合と同じである。
第 3図及び第 4図はスタ フ ィ 口コ ッカ ス · キ ヤ ビテイ スの 各種の菌株を用いてこ の発明の方法によりオ リ一ブ油を加水 分解した場合の分解生成物を示す薄層ク ロマ トグラムである < 第 5図はスタフ ィ ロコ ッ カス · ェビデルミデイ スの各種の 菌株を用いてこの発明の方法によりオリ ーブ油を加水分解し た場合の分解生成物を示す薄層ク ロマ トグラムである。
第 6 図はスタフ イ ロコ ッカス · ァウ レウスの各種の菌株を 用いてこの発明の方法により オ リ一ブ油を分解した場合の分 解生成物を示す薄層ク ロマ トグラムである。
第 7図及び第 8図はスタ フ ィ ロコ ッカ ス · キ ヤ ピテ イ スの 各種の菌株由来のリパーゼを用いて ト リ オ レイ ンを分解した 場合の生成物を示す薄層ク ロマ トグラムである。
第 9図は各種の市販リバーゼを用いて ト リ オ レ イ ンを分解 した場合の生成物を示す薄層ク ロマ トグラムである。 発明を実施するための最良の形態
微生物
この発明の方法においては、 スタフィ ロコ ッカス属に属し リパーゼを生産するこ とができる細菌を使用する。 このよう な細菌と して、 例えばスタ フ イ ロコ ッ カス · キヤ ビテイ ス staphylococcus capitis) 、 スタ フ イ ロ コ ッ カ ス ' ェ ビデ ノレミ テ ィ ス (Staphylococcus epidermidis)ヽ スタ フ ィ πコ ッ カス · ァ ゥ レウ ス (Staph lococcus aureus) 等を使用する こ とができる。 シユー ドモナス (Pseudonionus) 属の細菌由来の リ 'ーゼ、 リ ゾプス（Bhizopus)属の糸状菌由来のリ バーゼ、 キ ャ ンデ ィ ダ (Candida) 属の酵母由来のリパーゼ等を使用し て ト リ グリ セ リ ドを分解した場合、 分解物と してかなり の量 のモノ グリ セ リ ド及びジグリ セ リ ドが生成し、 このために脂 肪酸の収率が低下する。 これに対してスタフ イ ロコ ッカス属 の細菌に由来する リパーゼにより ト リ ダリ セ リ ドを分解した 場合、 ジグリ セ リ ドはほとんど生成せず、 モノ グリ セ リ ドは 生成するとしてもその量は極めて少ない。 特に、 スタフ イ ロ コ ッカス ' キヤ ピチ イ ス由来の ーゼで ト リ グリ セ リ ドを 分解した場合、 モノ グリ セ リ ド及びジグリ セ リ ドは実質上全 く生成しない。 従って、 この発明の方法に使用する微生物と してはスタフ イ ロコ ッカス · キ ヤ ビテイ スが最も好ま しい。 この発明の方法に使用する こ とができるスタフ ィ ロコ カ ス ♦ ァ ゥ レウスの菌株と しては例えば IAM 1011株、 IAM 1098 株、 IAM 12082 株等を挙げる こ とができる。 また、 スタフ ィ ロコ ッカス ' キヤ ビテイ スの菌株と しては例えば ATCC 27840 株、 ATCC 27841株、 ATCC 27842株、 ATCC 27843株、 T-l-1株 (SAM 0001)等を挙げるこ とができ る。 これらの微生物の内、 符号 " IAM - を有する微生物は東京大学応用微生物研究所 ： 東京都文教区弥生 1 — 1 — 1 (Institute of Applied Micro- biogy, the University of Tokyo ; 1 - 1 \ ayo i 1 - chome , Bunkyo -ku, Tokyo, JAPAN)に保存されており容易に入手する こ とが できる。 また符号 " ATCC " を有する微生物はァメ リ カ ン ' タ ィ プ · カノレチユア · コ レク シ ョ ン（American Type Culture Collection) 〔12301 パー ク ラ ウ ン · ドラ イ ブ · ロ ッ ク ビル ' メ リ ー ラ ン ド 20852 · 米国 ； （12301 Parklawn Drive,
Rockville, Maryland 20852, U.S.A.) 〕 に保存されており容 易に入手する こ とができる。
前記のスタ フ ィ ロ コ ッ カ ス · キ ヤ ビテ イ ス T-1-1株（SAM 0001) は本発明者等がヒ トの頭皮から分離した新菌株であつ て次のよう な性質を有する。
( A) 形 態
(1) 大きさ ； 直径 0. 8 〜 1. 2 mの球菌、 2 〜 4偭集つ て存在。
(2) 運動性 ； なし。
(3) 胞子形成 ； 観察されず。
(4) グラム染色性 ； 陽性。
(5) 抗酸性 ； なし。
( B ) 生育状態
(1) 肉汁寒天平板培養 ； やや凸状、 円形、 表面平滑、 不 透明白色のコ ロ ニーを形成。 コ ロニーは小さ く 、 径 1 〜 3 m/m である。
(2) 肉汁液体培養 ； 生育良好、 液全体が混濁。
(3) 肉汁ゼラチン穿剌培養 ； ゼラチンを液化せず、 線状 に生育。
(4) 肉汁寒天斜面培養 ； やや凸状、 表面平滑。 不透明白 色。 生育良好。
(5) リ ト マス ミ ルク ； 色調変化せず。 凝固又は液化を認 めず。
(6) メ チルレ ッ ド （MR) テス ト ； 陽性。
(7) フォ ーゲス ' プロスカ ウ エル （VP) テス ト ； 陽性。
(8) イ ン ドール生成 ； なし。
(9) 硫化水素生成 ； なし。
(10) デンプン分解能 ； な し。
(11) ク ェ ン酸利用能 ； コ ーザ一 · ク リ ステ ンセ ン反応陽 性。
(12) 無機窒素源利用能 ； 硝酸塩を利用するが、 ア ンモニ ゥム塩を利用せず。
(13) 色素産生能 ； なし。
(14) ゥレアーゼ反応 ； 陰性。
(15) ォキシダーゼ反応 ； 陰性。
(16) カ タ ラ ーゼ反応 ； 陽性。
(17) 生育範囲 ； PH 5〜 9、 温度 20'c〜40て最適生育温度
32で 〜 35で 。
(18) 酸素要求性 ； 通性嫌気性。
(19) 糖利用能 ； 酸生成 （ + ) ； D —グルコ ース、 D — フ ラ ク ト ース、 D —マ ンノ ース、 シユ ーク ロ ース、 グ リ セ リ ン
酸、 ガス生成 （一） ； D —ガラ ク ト ース、 D —キ シ ロ ース、 L ーァ ラ ビノ ース、 マル ト ース、 ラ ク ト ース、 ト レノヽロ —ス、 D — ソノレビ ッ ト、 イ ノ シ ッ ト、 デンプン。
D— グルコ ースから乳酸を生成。
(20) 耐塩性 ； あり （10〜20%の食塩水中生育） 。
(21) リパーゼ活性 ； あり。
(22) レシチナーゼ活性 ； あり。
(23) コアグラ一ゼ活性 ； なし。
(24) フ ォ スフ ァ ターゼ活性 ； なし。
(25) デォキ シ リ ボヌ ク レアーゼ活性 ； あり 。
こ の微生物スタ フィ ロコ ッカ ス · キ ヤ ピテ イ ス T- 1-1 (SAM 0001) は通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所 （茨城 県筑波郡谷田部町東 1 丁目 1番 3号） 〔 Fermentation
Research Institute Agency of Indus rial Science and' Technology Ministry of International Trade and Industry l-1 - 3Ya tabe- cho H i gash i , Tsukuba- gun, Ibaraki -ken, Japan) に微ェ研菌寄 第 7723号 （FERM P-7723)として 寄託されている。 なお、 この微生物は、 1985年 7月 1 1 日に 微ェ研条寄第 834号（FERM BP-834) としてブタぺス ト条約に 基く国際寄託に移誉された。 培養および反応
この発明に従えば、 前記の細菌が生産する リバ―ゼによつ て油脂類を分解して脂肪酸を生成せしめる.。 分解方法の態様 として例えば次の方法を使用することができる。
( 1 ) 前記の細菌が増殖することができる培地に原料となる 油脂をまず導入し、 こ の培地に前記の細菌を接種して、 そし て細菌の増殖と併行して油脂の分解を行う。
(2) 前記の細菌が增殖することができる培地に前記の細菌 をまず增殖せしめ、 次にこの培地に原料油脂を添加し、 引き 繞き培養を行い、 そして培養と併行して油脂の分解を行う。 前記（1 ) の方法においては、 原料油脂のすべてを最初に培 地に加えることができるが、 まず最初に油脂の一部分を培地 に加えて培養を開始し、 その後細菌の増殖とすでに加えた油 脂の分解の程度を監視しながら残りの油脂を連続的又は段階 的に加えることができる。
'前記（2) の方法においても、 前記（1 ) の場合と同様、 原料 油脂を 1度に添加することもでき、 又は段階的もしく は連繞 的に添加することもできる。 これらの場合において、 油脂を 添加する （又は添加を開始する） 時期としては、 例えば細菌 が增殖を開始した培養初期でもよ く、 又細菌の増殖がほぼ終 了した時期でもよ く 、 これらの中間の任意の時期であっても よい。
この発明の方法においては、 前記の細菌が増殖し、 そして リパーゼを生産することができる任意の培地を使用すること ができる。 培地中の炭素源として例えばグルコ ース、 フ ラ ク トース、 シユーク ロース、 又はグリ セロールなどを単独で又 は組合わせて使用することができ、 窒素源としてはカゼィ ン - 大豆などに由来する種々のペプ ト ン、 又は酵母エキスなどを 単独で又は組合わせて使用することができる。 リ ン酸塩、 マ グネシゥ ム塩、 マ ンガン塩や食塩などの無機塩類、 あるいは 各種ビタ ミ ン類など菌の生育を促す化合物をさ らに添加して もよい。
培養にあたっては、 あらかじめ油脂を舍まない液体培地を 用いてこの発明の細菌を前培養した接種培養物を、 油脂を舍 有するか又は舍有しない本培養用培地に接種して本培養を行 なう。
培養及び反応の条件は、 使用する菌株によって異なるが、 20 'c〜40て、 好ましく は 30 'c〜37 'C の温度、 培地中 PH 5. 0〜 9. 0、 好ましく は 6. 0〜 7. 0 とし、 通気 ' 攪拌 · 振とう等に よる好気的条件下で、 液体培養するのが好ましい。
培養時間は、 最初から油脂を加えて培養を行う場合は約 20 〜70時間であり、 培養の中途において油脂を加える場合は、 油脂の添加が終了した後さ らに油脂が完全に分解するまで培 養を继続し、 又は培養と同様な条件で反応を継铙する。
こ の発明の方法に使用する油脂は、 グリ セライ ドを含有す るものであれば、 なんでもよ く、 植物性油脂、 例えばオリ ー ブ油、 ヤ シ油もし く はヒマ シ油、 動物性油脂、 例えば牛脂も しく は鲸油又はこれらの混合物を使用することができる。 油 脂の添加量は、 培地中に生成されるリバ一ゼのカ価等により 異なるがおよそ 0. 5〜 5. 0 (v / v) %とするのが好ま しい。
Figure imgf000012_0001
10 脂肪酸の採取
本発明によって、 脂肪酸は培養液中に蓄積する。 この脂肪 酸は培養液を濾過あるいは遠心分離して除菌した後得られる 培養液上澄より常法に従い、 例えば抽出、 分別結晶法、 カ ラ
5 ムク ロマ トグラフ ィ ー等により簡単に精製できる。
遊離脂肪酸の培養上澄からの抽出は酢酸ェチル、 ク ロ ロホ ルム、 ベンゼン等極性が低く 水と混ざり合わない有機溶媒を 用いて行なう。 抽出後溶媒を減圧溜去し、 残渣をメ タノ ール 等のアルコ ールと混合撹拌するこ とによ り脂肪酸はアルコ ー 10 ル層に移行するが、 油脂は残留する。 このよう にして得られ た未分解の油脂を含有しないアルコ ール可溶性画分からの脂 肪酸の精製は圧搾法、 分別結晶法、 液 · 液抽出法等によつて 行なう事ができる。 さ らに、 シ リ カゲル等を用いた順相カ ラ ムク ロマ ト グラフ ィ ーあるいは RP— 18等を用いた逆相カ ラム 15 ク ロマ トグラフィ ーによっても锖製を行なう事ができる。
次に、 実施例によ り こ の発明をさ らに具体的に説明する。 実施例 1. スタ フ ィ ロ コ ッ カ ス · キ ヤ ビチ イ スを用いる脂肪 酸の製造 ； 油脂を最初に添加する変法
200ηιί .の Ρ培地 〔酵母エキス 0. 5 % (w/v)、 ボ リ ペプ ト ン 20 (ペプ ト ン ： 武田薬品製） 1 % (w/v)、 グルコ ース 0. 1 %
(w/v)、 NaCi 0. % ( /v) . pH 6. 3 ] を 500m 容のフ ラ ス コに入れ、 120でにて 1 5分間殺菌した。 このよう にして調 製した 3本のフ ラスコ にスタ フ イ ロ コ ッ カ ス . キ ヤ ビテ イ ス T-1-1 を接種し、 3 0 'Cにて 2 4時間 240rpmにて回転振と う 25 培養を行い接種用培養物を得た。 AFFペプ ト ン （大豆蛋白質加水分解物、 味の素製） 5 % ( w/ v)、 NaC i 0. 5 % ( w/ v)、 PH 6. 3を含有する培地 3 0 £ を 5 0 ί容ジャ ーフ ァ ーメ ンタ ーに入れ 120 *c にて 2 0分間 殺菌した。 この培地に前記の接種用培養物を加え、 さ らにあ らかじめ 120 'C にて 1 5分間殺菌しておいたォリ ーブ油 300 πι £ を加えた。 3 0 'C にて 3 0時間、 300 rpmの攪拌及び 1. 0 vvm の通気の下で培養を行った。
得られた培養物は遠心分離により除菌した。 上澄液に 3 0 の酢酸ェチルを加え、 1時間攬拌した。 攪拌後 1時間静置し て相分離した。 酢酸ェチル層を取り、 減圧濃縮乾固して残渣 を得た。 この残渣に 3 のメ タノ ールを加え、 5 ででー晚攪 拌した。 これを遠心分離してメ タノ ール層を得、 このメ タノ 一ル相を減圧濃縮乾固し、 残渣を 2 の n -へキサ ンに溶解 した。 n -へキサ ン溶液を減圧濃縮乾固し、 残渣を 100 m の ベンゼンに溶解し、 シ リ カゲルカ ラム（5 X 55 on ) の上にのせ た。 カ ラムを 1 のベンゼンで洗い、 2 のベンゼン · ク ロ πホルム 1 ： 1混合溶液で溶出した。 次に 3 のク ロ口ホル ムで溶出し、 この画分より混合脂肪酸 100 gが得られた。 上記方法で得られた本混合脂肪酸のガスク ロマ トグラムを 図 1 に示す。
上記方法で得られた本発明物をシリ 力ゲルク ロマ トグラフ ィ 一に上記と同条件で再度付し、 ォ レイ ン酸画分を集めるこ とにより、 ォレイ ン酸 7 6 gが得られた。 実施例 2. スタフ ィ ロ コ ッ カス · キヤ ピテ イ スを用いる脂肪 酸の製造 ； 油脂を培養後に添加する変法 スタ フイ ロコ ッカ ス · キ ヤ ビテ イ ス （ATCC-27840) を、 実 施例 1 と同様に 200πι£ の Ρ培地で回転振盪培養した。 1 4 容ジャ ーフ ァ ーメ ンタ一中に実施例 1 と同様の本培養用培地 7 &を入れ、 あらかじめ 120で、 1 5分間加圧滅菌した。 こ の培地中へ、 前記の前培養液を加え、 3 0 て にて 2 4時間、 300rpm、 2. 0 vvm で攪拌通気培養を行なった。 得られた培養 液に 100 のオリ —ブ油を加えて、 3 0 でにて 1 2時間、 300rpmで攪拌を行なった。 得られた結果物を実施例 1 に準ず る方法で精製を行ない、 混合遊離脂肪酸 3 8 gが得られた。 上記方法で得られた本発明物質のガスク ロマ トグラムを図 2 に示す。
実施例 3. スタフイ ロコ ッカス属の各種の菌株を用いるオ リ ーブ油の分解
1 0 % AFFぺブト ン培地（AFFぺプ ト ン 1 0 %及び NaC 0.5 %) に 1 %のオリ ーブ油を加え、 これに次の菌株を接種して 3 0 'c にて、 3 日間振とう培養した。
(1) スタ フ イ ロ コ ッ カ ス（St. ) ' キ ヤ ビテ イ ス ATCC 27840 (2) St. キ ヤ ビテ ィ ス. ATCC 27841
(3) St. キ ヤ ピテ イ ス ATCC 27842
(4) St. キ ヤ ビテ イ ス ATCC 27843
(5) St. キ ヤ ビテ イ ス T-1-1 (FERM P-7723)
(6) St. ァゥ レウス IAM 1011
(7) St. ァゥ レウス IAM 1098 (8) St. ァゥ レウ ス IAM 12082
(9) St. ェ ビデルミ デ イ ス Να 2
(10) St. ェ ビデルミ ディ ス Να 3
(11) St. ェ ビデルミ デ イ ス Να 5
(12) St. ェ ビデル ミ デ イ ス α 8
(13) St. ェ ビデル ミ デ イ ス Να 1 1
培養 2 日目及び 3 日目にサ ンプルを採り、 ク ロロホルムで 脂肪酸を抽出し薄層クロマ トグラフィ ーによ り脂肪酸組成を 調べた。 薄層ク ロマ トグラフ系は次の通り とした。
溶媒系 ： ク σ 口ホルム アセ ト ン （96 ： 4 ) 。
発 色 ： 1 % C e(S04) 2 / 1 0 % HzS04. 加熱。
薄層板 ： シリ カゲル Kieselgel 60 F 254
(Merk 社製） 。
この結果を第 3図〜第 6図に示す。 この図から明らかな通 り、 いずれの菌株においてもジグリセリ ド （ 1 , 3 —ジォレ イ ン及び 1 , 2 — ( 2 , 3 —） ジォレイ ン》 は検出されず、 モノ グリ セリ ド （モノォレイ ン） もほとんど検出されず、 脂 肪酸 （ォレイ ン酸） が主とし生成した。
実施例 4. スタフ ィ ロ コ フ カス属の各種の菌株からのリ パー ゼ及びその他の微生物由来リバーゼによる ト リオ レィ ンの分解
例 3 に記載したのと同様にして （但し培地にオリ —ブ油を 加えない） 、 例 3 に記載したスタフイ ロコ ッカ ス属細菌を培 養し、 培養後遠心分離により菌体を除去し、 上清液を得、 こ れを酵素液として使用した。 この酵素液のリバ—ゼカ価は次 の通りであった α 株 リバーゼ活性
( U / m£ ) スタ フ イ ロ コ ッ カ ス ' キ ヤ ビテ イ ス
1 A T C C 2 7 8 4 0 1 1. 7
2 A T C C 2 7 8 4 1 1 3. 5
3 A T C C 2 7 8 4 2 4. 6
4 A T C C 2 7 8 4 3 1 2. 4
5 T一 1 — 1 6. 1
スタ フ イ ロ コ ッ カ ス · ァ ゥ レウス
6 I A Μ 1 0 1 1 3. 2
7 I A M 1 0 9 8 1. 0
8 I A M 1 2 0 8 2 2. 1
スタ フ イ ロ コ ッ カ ス · ェ ピデルミ デ ィ ス
9 Να 2 2 1. 0
1 0 Να 3 9. 4
1 1 Να 5 2 1. 9
1 2 Να 8 1 0. 1
Figure imgf000016_0001
上記のリパーゼカ価は次のようにして測定した。
試験管 （ ø 25 X 200mra)中に 2 5 tn Tris-HC^ 锾衝液 （ pH 8. 0 ) / 1 0 mM CaC ί 2 5m の反応媒体にォリ ーブ油 lm JZ を 添加し、 ミキサーで激し く撹拌し、 酵素液 0.5m を加える。 この試験管を毎分 300回転の速度で往復振とう しながら 30で にて 3 0分間反応を行う。 その後、 2 Ο ι ^ のエタノ ールを 加えて反応を止め、 生成脂肪酸を 0.05 N水酸化ナ ト リ ウム水 溶液で滴定する。 比較値は上記組成の反応液にエタノ ールを 加えた後に酵素液を加えたものを同様に滴定して求める。 リ パーゼ活性の単位（Uni t)は、 国際生化学連合（I . U. B) の酵素 委員会の提案に従い、 上記の反応条件で 1分間に 1 moleの 脂肪酸を遊離する活性を 1 Unitと定める。
次に、 各酵素液につき、 リパーゼカ価が 3 Uni t以下のもの を除き、 力価が 3 となるように稀釈した。
他方、 比較のため市販の酵素橒品 （ベーリ ンガーマ ンハイ ム社） を用いて、 これを力価が 3. 0 Uノ mi となるように溶 解して酵素液を調製した。 酵素標品と しての次の 3種類を用 いた。
(1) リ ゾブス · アルヒズス (Rhizopus arrhizus)由来のリ' ノヾ ゼ
(2) キ ャ ンディダ . シ リ ン ド ラ セ一（Candida cy 1 indracea) 由来のリパーゼ
(3) シュー ドモナス sp. (Pseudomonas s p . )由来のリノヾ ー ゼ。
酵素液の調製にあたっては、 前記の酵素標品（1) および（2) については 0.1 MOPS - HCi 缓衝液 （pH 6. 0 ) を使用し、 （3) については 2 5 mM Tris-HCi 缓衝液 （pH 8. 0 , lOmM CaC SL 2) を使用した。
こ の発明の培養液から得た酵素液については、 3 U / H の リ パーゼを舎有する酵素液 1 mjg に ト リ オ レイ ン 1
を加えて 3 0 でにて振とう し、 0分、 10分、 30分、 60分、 及 r KJ οο/υυ^ J 85/00408
16 び 120分後にサンプリ ングし、 これをク ロ口ホルムで抽出し、 ク ロ口ホルム相 2 & を例 3 に記載した薄層ク ロマ トグラフ ィ 一により分折した。 市販酵素標品については、 3. 0 U / m £ の酵素液 1 πι £ を使用したほか、 上記と同様とした。
結果を第 7図〜第 9図に示す。 この図から明らかな通り、 巿販酵素により ト リ オレイ ンを分解した場合、 かなりの量の モノ ォ レイ ン及びジォ レイ ンが生成したが、 この発明のスタ フイ ロコ ッカス由来の酵素を使用した場合、 これらの生成が 極めて少なく 、 特にスタフィ ロコ ッカス · キヤビテイ ス由来
10 の酵素を使用した場合には、 モノォレイ ン及びジォレイ ンが 全く検出されなかつた。 産業上の利用可能性
この発明は、 純度の高い脂肪酸を工業的規模で経済的に製
15 造するために有用である。

Claims

請 求 の 範 囲
1. スタ フ イ ロ コ ッ カ ス (Staphylococcus)属に属し、 リ ノヾ ーゼを生産することができる細菌を油脂類を舍有する培地に 培養じ、 又は該細菌を油脂類を舍有しない培地にて培養を開 始しその中途において油脂類を添加し、 こう して培養液中に 脂肪酸を生成せしめ、 そして培養液から脂肪酸を採取するこ とを特徴とする脂肪酸の製造方法
2. スタ フ イ ロ コ ッ カ ス属の細菌がスタ フ イ ロ コ ッ カ ス ' 千 ャ ピティ ス （Staphylococcus capitis)である請求の範囲第 1項記載の方法。
3. スタ フ イ ロ コ ッ カ ス ' キ ヤ ビテ イ ス (Staphylococcus capi tis)細菌がスタ フ ィ ロ コ ッ カ ス · キ ヤ ピテ イ ス
(Staphylococcus capi tis) T-l-1 (SAM 0001) (FERM P-7723) (FERM BP-834) である請求の範囲第 2項記載の方法。
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