WO1983003763A1 - Process for preparing l-asparaginase-immobilizing agent for teating leucemia - Google Patents

Process for preparing l-asparaginase-immobilizing agent for teating leucemia Download PDF

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WO1983003763A1
WO1983003763A1 PCT/JP1983/000126 JP8300126W WO8303763A1 WO 1983003763 A1 WO1983003763 A1 WO 1983003763A1 JP 8300126 W JP8300126 W JP 8300126W WO 8303763 A1 WO8303763 A1 WO 8303763A1
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gel
asparaginase
blood
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PCT/JP1983/000126
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Masao Nambu
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Nippon Oil Company, Limited
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    • C12N11/098—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer formed in the presence of the enzymes or microbial cells

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing -asparaginase immobilizing agent for the treatment of leukemia, particularly in a cell with high anti-thrombotic column and high elongation-bearing column having excellent mechanical strength.
  • the present invention relates to a method for producing an enzyme therapy agent for leukemia, which embeds (fixes) asparaginase.
  • asparagine is indispensable (essential amino acid) for the proliferation of leukemia cells, and it has been pointed out that it is not necessary for normal cells (non-essential).
  • the method is expected as a treatment for leukemia that does not damage normal cells, and much research efforts have been made (IT. et al. f Bioe em. Biophys. Ess, Comnivn,, 12 ⁇ 50 (1963)) 0 In normal cells, asparagine synthesis
  • Asparagine (asparagine) can be formed from salt or its ester, so asparagine is required as an essential amino acid, whereas leukemia cells are tumorigenic. Since the synthesis activity is defined, asparagine cannot be produced in cells, and protein synthesis is performed using asparagine, which is slightly present in plasma. Therefore, the principle of this treatment is to inject asparaginase into the patient's J & flow to separate asparagine in the blood (asparagine).
  • Ci3 ⁇ 4ri «), 17, 885 (1969)) this treatment has little impairment to normal hematopoiesis.
  • its practical value is low, and it is considered to be low in practical use, and it is used in various combinations with ib ⁇ therapeutic agents and late irradiation therapy, such as Bledson, vincristine, methotrexa-1, 6-mercaptobrine, cytarabine, and cyclophosphamide. It has only been attempted and has resulted in significant disappointment. But in this case, ⁇ ! ), The immune response ⁇ due to the administration of this heterologous protein was It is foreseeable that the promise of this therapy will again be promising, provided that means of evasion are provided.
  • the solution is to temporarily guide the blood out of the body and contact it with a polymer material that has immobilized or embedded immobilized asparaginase C enzyme 2) to reduce the dissolved asparagine in the blood.
  • immobilized enzyme By immobilized enzyme], and after that, the blood flow is returned to the body (extracorporeal circulation method)
  • the immune reaction caused by the heterologous protein (nitrogen) is largely attenuated (or eliminated) (D Sampson et al. T Trans. Am. Soc. Artif.
  • the present invention newly provides a polymer material for immobilizing nitrogen on blood serum which can meet the above-mentioned demands.
  • anti-Mi agent such as anticoagulants (heparin, hirudin, antithrombin), platelet aggregation inhibitors (R-denyl cyclase, prostaglandin ⁇ , methylxanthine), fibrinolytic agents (Perkinase, streptokinase), etc., applied to the surface of medical materials or adsorbed via ion-bonding functional groups ⁇ : Or, these are covalently bonded to the surface of medical materials.
  • anticoagulants heparin, hirudin, antithrombin
  • platelet aggregation inhibitors R-denyl cyclase, prostaglandin ⁇ , methylxanthine
  • fibrinolytic agents Perkinase, streptokinase
  • the present invention provides, for the first time, a medical material having high antithrombotic properties derived from a hydrogel having excellent mechanical strength.
  • the present invention provides a method for producing an immobilized nitrogen-containing agent having excellent antihemophilicity by encapsulating asparaginase in a specific antithrombotic hydrogel.
  • a chemical bonding operation using a chemical reagent or radiation is carried out at all, as in a conventional method.
  • an immobilized nitrogen agent that can be firmly embedded in a mouth gel and exhibit its activity.
  • poly (vinyl alcohol) is used as a raw material for synthesizing an anti-thrombotic hide mouth gel.
  • gelation of Bolivir alcohol is used as a raw material for synthesizing an anti-thrombotic hide mouth gel.
  • the resulting gel is soft and often has other curing means (secondary
  • this borax glue can exist under alkaline ⁇ S atmosphere
  • Phenols such as fenault, naphthol, Congo Red, etc.
  • the permanent gelation is carried out at a low temperature of 40 or less, especially at 5 to 18 C below.
  • the method of gelling is also famous for a long time.
  • the resulting glue is agar, carragena ⁇ , jelly-like soft product (or mucus)], ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ .
  • the remaining part is desiccated.
  • the shape of the material in water or in the temperature range of 40 to 5 OC is more rapidly deformed, and has a melting point that disperses and dissolves all the time, making it difficult to recognize its value as a medical material.
  • Japanese Patent Publication No. 5-2 5 2 1 0, 2 5 2 1 1) is soft, poorly water-soluble mucus or non-fluid S-gel, or dry and water-soluble Powder (frozen / dried powder).
  • the inventor of the present invention made use of boliviru alcohol to produce a permanent insoluble anti-blood flotation highly-containing permanent immobilized selenium agent excellent in mechanical mechanical features.
  • the hydrogel obtained in the present invention is conventionally used for gelation of an aqueous synthetic polymer solution or for immobilization of an enzyme in the process of gelation and its pretreatment, alkali, radical, and radiation. It does not require any solvents, reaction reagents and permanent inorganic solvents, and therefore does not damage L-asparaginase. Moreover, the gel obtained by the present invention has a high water content, and has both rubber-like pillars and excellent mechanical strength. In addition, the gel of the present invention i is completely insoluble in permanent or warm water, does not exhibit tackiness, and is completely different from the above-described cold-release gel of a voryl alcohol permanent solution.
  • the present invention is a novel antimicrobial agent which is completely different from the knowledge of the conventional cold gelation of aqueous solution of bolible alcohol, or the gelation by known chemical treatment of aqueous solution of bolible alcohol.
  • the present invention relates to cooling obtained under specific conditions from an aqueous solution containing polyvinyl alcohol and asparaginase. Melting the solidified material, by subjecting it to partial depertation]? Thus, a highly hydrated glue with excellent antithrombotic properties can be obtained, and asparaginase is
  • the present invention relates to an asparaginase (asparaginase, asparaginase, asparaginase) enzyme which contains at least 97 mol of saponification, and contains at least borovir alcohol having an average viscosity of 1,800.
  • a 1 / -asparagine amide hydrolase (1 / -sjxtragine aviidohydrolse)) containing a permanent solution is optionally injected into a container or in a mold. Solidification ⁇ Molded, and after that, the molded body was allowed to be ingested, and the dewatering rate (cooling, solidification, weight loss rate of the molded body) was partially removed until it reached 5i or more. Production of immobilized enzyme preparation for anti-thrombotic treatment of leukemia, which is characterized by reaching a water content of 45 to 92% (based on wet body). G in the law
  • the saponification degree of the boryl alcohol used in the present invention requires 97 mol or more, preferably 98 mol or more. Even if the saponification degree is in the range of 80 to 88 mol, in particular, 85% or less of borovir alcohol, it can only be weakened, and the object of the present invention will not be changed.
  • the degree of polymerization of poly (vinyl alcohol) required in the present invention must be above 1.8 G 0. Degree of polymerization: from 300 to less than 1,500, especially under 1,400, only a soft liquid or a weak keel is formed. For ⁇ 3 ⁇ 43 ⁇ 4 :... '— I..
  • polyvinyl alcohol having a degree of polymerization of about 1,800 to 3.300 can be used.
  • an aqueous solution having a voryl alcohol concentration of 6% or more is prepared. Therefore, the volatility of the volcanic alcohol can be, for example, 6 to 25 wi.
  • the viscosity can be further increased to, for example, about 90, but the viscosity of the aqueous solution at room temperature reaches 100,000 cP or more, and the viscosity increases or decreases during storage. It may be difficult to handle] ?, slightly. But it is also possible to reduce by even if the seismic intensity path 5wi, between dehydration when required which will be described later, Nagahi: yellow, expenses C dehydration power cost) is increased.
  • a known tris (hydroxymethyl) amino methane or phosphate for example, as described in Example 3-3 ⁇ 7-8.5, is used as a buffer component for sparaginase. It is good to add o
  • a permanent solution of boryl alcohol is added, if necessary.
  • 1001C X 5 may be used as the bacteria treatment condition, but if the bacteria are contaminated with heat-resistant bacteria, for example, apply 120TC X 15 to '6 high-pressure and steam bacteria.
  • an ultraviolet irradiation sterilization method can be used, its effectiveness is limited to the irradiated surface, and it is therefore desirable to use it in combination with the above-mentioned heat sterilization method. In any case, the material used in the present invention is not degraded, and it is difficult to implement the present invention.
  • the sterilized permanent solution is then mixed with the enzyme to be immobilized.
  • the enzyme commercially available Escherichia coli can be used as it is.
  • Serachi-Marcesense 53 ⁇ 4 ⁇ ⁇ ⁇ ma; escets li, Broteus vulgaris (Proteus vulgaris, Paclidium cadaveris (Bacter nm cadaverts j-series, Ervia alaroideae)
  • Escherichia coli B-type EC-2 As an enzyme effective against leukemia of the previous arrest, Escherichia coli B-type EC-2 is now commercially available!?, Which can be obtained in the form of lyophilized powder or 50 glycerin aqueous solution. All of them can be used in the present invention.
  • the operation of sintering this seol to the aqueous alcohol solution can be carried out, for example, at 70 or less. However, in consideration of the tendency of the nitrogen to degrade, the operation is carried out at 37C or room temperature.
  • the amount of nitrogen added was 7% of that of polyvinyl alcohol in permanent solution. It is preferable to keep the weight under double weight (indicated by weight of enzyme freeze-dried powder ⁇ ) from the viewpoint of immobilizing most of the enzyme. In this case, it is possible to reduce the In the present invention, the present inventors have confirmed that the present invention has the ability to protect 7 ⁇ -potentiated ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ 3 ⁇ 4 3 ⁇ 4 ⁇ 3 ⁇ 4 ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ . Glycerin, aspartic acid, aspartate, casein and the like are particularly required as agents, but 2: It is permissible to add further known protective agents.
  • the thus obtained permanent solution containing both bolilacoal alcohol and asparagina'ase is poured into a container of arbitrary shape or a desired molding die, and cooled. Solidify ⁇ Mold.
  • the molding ffi type is desirably a type of end use, but may be an arbitrary shape type intended to be subjected to deformation processing such as renovation later. It is included in the mold for molding.
  • Cooling, solidifying and molding coolants include, for example, sashimi-ice (23:77) (—21 C), calcium chloride—Yong (30:70) -55 C) Alternatively, use dry eye-methyl alcohol (1 72 C) N liquid nitrogen (1 196 TC), etc., and cool to a low temperature, and solidify and mold. If the cooling is insufficient, the shape of the dull obtained through the drying process will follow the shape expected at the beginning, that is, the shape of the Bolibul alcohol permanent solution injection container or the mold ⁇ ⁇ In addition, Dal's nuclear strength is inferior. Liquid rim can be cooled down to —2S 9C, but practically freon refrigeration
  • the aqueous solution of volibil alcohol is solidified and molded in a mold having an arbitrary shape, and thereafter, the upper surface force par and / or the lower surface cover (or both) are formed in the mold. If there is, one or both of them can be removed], and the permanent shape described below can be applied while maintaining the shape of the molded body. Therefore, the shape of the gel of the present invention is favorable for the reaction 5 of immobilized nitrogen.
  • any size and shape can be determined in consideration of the dispersion of the reaction products.
  • Preferred shapes of the molded product include molding ffi-types such as Raschig rings, porosity, teralet, interlock saddles, pole rings, etc., which are already used in the chemical industry for distillation towers or gas absorption towers. ⁇ for filling column for filling, or mirror type for pipe forming as extracorporeal blood circulation channel o Also described in U.S. Pat. It is also possible to use a flat plate having projections or a ⁇ -shaped tooth plate.
  • the immobilized oxygen agent (ker) of the present invention obtained by using these molds is excellent in contact with a substrate necessary for the activity of the immobilized oxygen and in quality transfer.
  • the cooling speed of the cooling operation for the purpose of cooling, solidification, and molding described above may be slow cooling of about 0.1 to 7 TCZ, or rapid cooling of 7 to 1,000 CZ.
  • the bolibi infused into the above-mentioned container or mold is used.
  • the dehydration rate is set to 5 wi or more, for example, the water content of the gel is 20 to 92, preferably 60 to 90 wt ⁇ >
  • the water content can be set to 20 or less, but in this case, as described later, it is possible to reach a water content of 5 G to 9 Owi by immersing it forever.
  • the cooling, solidification, and molding are subjected to a slight de-elongation treatment (vacuum drying) regardless of the concentration of polyvinyl alcohol.
  • the removal rate should be 5 wi or more, more preferably 15 wi or more.
  • this partial water treatment is indispensable to the present invention.
  • sufficient deprotection is observed in freeze-drying of injection solutions or freeze-drying of hydrated foods such as coffee, milk, guar juice, noodles, etc.
  • this partial dehydration treatment is indispensable for the present invention, and is extremely important. Since it is significant, when omitted, the non-fluidity, non-adhesiveness, and high 3 ⁇ 4j & ⁇ hydrogels that are permanent and have excellent mechanical strength can never be obtained. In addition, when the cooling / solidification method is used to maintain the cooling / solidification state, the foaming is likely to occur when the molded body is melted and then depressurized. Even after the removal, the elasticity is poor and the cloudy gel is formed too much.
  • Degree of vacuum in the vacuum dewatering takes the present invention may be any cooling and solidification permanent content sharp poured cormorants a shall, for example, 1 0 an if & down, good Mashiku below, more preferably 0.1 T3S J S ⁇ The following are usually invited. *
  • the cooling, solidification, molding, and partial dewatering steps are then performed, for example, in a usual manner, so as to form an elastic glue.
  • the melting point of the gel of the present invention is as described above, whereas the melting point of the gel obtained when the beer alcohol permanent solution is left (stored) at about 0 to 30 C is about 15 to 29 C.
  • the gel of the present invention dissolves in hot water, and a hard film is rapidly formed on the surface at 60 C or higher. High temperature melting must be avoided and should it melt below 40-50 ° C?
  • the gel can be easily removed from the container or the ⁇ -shaped support. It absorbs water in germ ice or sterile saline and reaches a content of 50-92 wi (wet body basis) in 1-6 mm, but is a strong column.
  • the gel of the present invention shows a strong elasticity despite the fact that it contains such a large amount of water, and even when squeezed tightly, it temporarily deforms, but immediately returns to its original shape and loses its shape. .
  • an adult stands upright on one or both feet on the plate-like gel having a water content of 88 or more according to the present invention, it may cause temporary deformation, but immediately returns to its original shape.
  • Shape is weak.
  • the gel of the present invention is not sticky. Plate (8 s «8 8 X 2 s s), cylinder (inner diameter 3, outer diameter 6 « s, length 6), spherical (diameter, etc. Even after stirring for 0 days, no phenomena such as mutual adhesion and shape loss are observed at all., After rinsing for 1 year in physiological saline, it did not dissolve, and its elasticity and strength did not change (for example, This is in stark contrast to the fact that when konjac is soaked in Edo for several days, the appearance of vivid color breaks is in stark contrast, and the simple cooling of the polyvinyl alcohol permanent solution (frozen gel) is the result of sticky columns. And often a fluid mucus or
  • the shape of the injection container or the mirror type of the polyvinyl alcohol aqueous solution is arbitrarily selected, and the wet gel of a desired shape (granular, membrane, lump, plate-like, cylindrical pull-out, or any other type of cane) is selected. It can be.
  • the obtained molded body may be molded into another shape by cutting or the like.
  • the dal of the present invention covers a lot of eternity
  • the gel content obtained by immersing the gel in a saline solution or saline solution ranges from 70 to 92%. Therefore, the highly water-containing gel of the present invention is often a simple ice (or physiological saline) in spite of the above-mentioned rubbery elastic body having excellent mechanical strength, in terms of chemical and biochemical properties. Ei) It behaves like it is, and the pillar of reaction with the birthplace is utterly i? Also, it shows excellent thrombus resistance to blood.
  • the highly impregnated gel of the present invention shows: ⁇ : thrombosis injection under the condition that thrombus formation is observed in vorbil-pyrrolidone, silicone, Teflon and the like.
  • Hydro-pi-gel which has been attracting attention as a medical material, that is, poly (2-hydroxyethyl methacrylate) usually has a permanent content of 38 to 4 Owi.], And has poor mechanical strength ( SD Bmck,
  • the normal content is 70 to 92 wt ⁇ .
  • a high moisturizing gel of 80-92i can be easily obtained, and it has excellent mechanical strength, so it is superior to conventional non-hydrophilic injection and hydrophilicity and moisturizing materials. It has value as an anti-hematile village fee.
  • the gel material of the present invention includes asparagine (molecular weight: 132), asparagine (molecular weight: 133), elongated ammonium (molecular weight: 35.), glucose (molecular weight: 180), and glycerin (molecular weight: 92).
  • asparagine molecular weight: 132
  • asparagine molecular weight: 133
  • elongated ammonium molecular weight: 35.
  • glucose molecular weight: 180
  • glycerin molecular weight: 92
  • enzymes having a molecular weight of about 100,000 are hardly permeated, while enzymes having a molecular weight of about 300,000 or more are not easily permeated. Therefore, L encapsulated in the gel of the present invention
  • the gel of the present invention is produced, it is immersed in physiological saline. , Initially, the element of ⁇ is evacuated. However, after that, even if long-term immersion »(or washing) is followed, the enzymatic disturbing phenomenon is no longer observed, and thereafter, without concern for heterologous protein migration, continuous (or repeated) ) Flight S is available.
  • the amount of nitrogen lost at the beginning of the above-mentioned immersion is about 10 to 15 of the amount of sedine used before the gel production of the present invention, but even in the present invention, By taking measures to prevent the release of known nitrogen, this loss of nitrogen can be avoided.
  • the immobilized nitrogen agent is treated with a glutaraldehyde permanent solution in order to suppress the migration of nitrogen to some extent.
  • the method of immersion is often adopted (see TMS Chang, Bizyms, 14.
  • the hide pi-gel of the present invention is a very low forest material in that no reaction between the living tissue and the living tissue is observed when it comes into direct contact with the living tissue. . That is, when the hydrogel of the present invention (1X1X1 ⁇ ) is dissected after subcutaneous implantation for 1 to 3 months into the back of a house egret, the gel adheres to the living tissue and adheres to it. When the living tissue is incised, the entire area around the dull is evenly covered with a thin film! We can put a scalpel into a part of this thin film and separate this film easily. There is little cell infiltration in this skin and other biological tissues, and there is no inflammatory response.
  • the asparaginase-embedded immobilized enzyme preparation of the present invention can be placed in the abdominal cavity.
  • the hydrogel of the present invention is a highly water-containing dal exhibiting excellent antihemolytic properties, it can also be used as an immobilized sedative agent constituting an extracorporeal blood circulation circuit.
  • the hydrogels of the present invention show excellent anti-hemolytic properties, such as Even a gel guarantees exactly the same behavior as permanent or saline. Though it is not unreasonable to think that increasing the water content of the material will contribute to the improvement of anti-hematility, it is important to assume that the material is a medical material (ie, a structure). It is not possible to increase the water content indefinitely.
  • the hydrogel of the present invention uses the water content upper limit (60-80) of the conventionally proposed poly (vinyl alcohol) -daltaraldehyde-based or poly (2-hydroxyethyl methacrylate) -based hydroxyl. Merrill et al. T ACS Polymer Preprint, 13 ⁇ 513 (1972)), but it can be much higher than 9 2 ⁇ ⁇ This leads to a decline.
  • an anticoagulant (anticoagulant) can be included.
  • Heparin C (heparin C, heparin sodium, karnum, nkarcium, umada nesim) is effective as a J0L agent.
  • the above-mentioned raw material of the present invention Add Permanent solution, that is, Heparin powder, Heparin Permanent solution, Heparin suspended Permanent solution to Permanent solution containing Borobil alcohol and nitrogen. Execute. In this case, Heavenline can be determined to be less than 10 ⁇ .
  • the heparin encapsulated in the hydrogel of the present invention is not washed away within a short period of time, and is released over a long period of time. It is usually not necessary to add large amounts of heparin to the polyvinyl alcohol permanent solution.
  • U preferably, after a known glutaraldehyde treatment, ⁇ by immersion in bacterial or sterile saline for 1 to k k]? It can be used as a wet gel having a water content of 50 to 92 wt%, which is close to a water-absorbing state, after stabilizing its shape. However, during this immersion operation, parylene slightly leaks out of the hydrogel.
  • the loss is usually only about 0.5 to 1 times the total embedding amount, and the antithrombotic property of the hydrodal of the present invention depends on this.
  • heparin loss When heparin was immersed in 5 saline for 6 h, heparin loss was about 0,6, and after that, for at least 28 days,
  • the long-term sustained release of parin to the hull fence in the present invention is unique. Obviously, it is very favorable for medical use.
  • the gel of the present invention can be easily obtained as a relative product of any shape, for example, by producing a hydro ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ It can be an external circulation channel for blood.
  • Current artificial blood vessels made of polyester or Teflon are also prone to thrombus formation, which makes it difficult to substitute arterioles with a diameter of 5 or less, and is not suitable for static blood vessels with low blood flow rates.
  • the hydrogel pipe or hebalin wrapper hide mouth glue vibe of the present invention can be used for at least 4 weeks in a channel having a diameter of 2 to 5].
  • the hydrogel pive or heparin-encapsulated hydrogel of the present invention can be used for at least 4 weeks in a channel having a diameter of 2 to 5].
  • harmful substances associated with the hydrodal (or hebalin-encapsulated hydrogel) of the present invention can be used as long as care is taken not only to wash and remove the unreacted glutaraldehyde used in the post-treatment but in the known manner. You need to worry about 3 ⁇ 4.
  • Polyurethane 'dimethyl chill siloxane as a conventional typical anti blood material, always as tetrahydrofuran, Jiokisan have captive the risk of ⁇ the Xue acid, moreover, T very easily ⁇ bacteria indoor dust-free]? Adsorption Therefore, the hydrogel and heparin-encapsulated hydrogel of the present invention can be easily handled, as opposed to being handled in a special cleaning room different from a normal operating room.
  • the permanent solution of boryl alcohol is cooled and solidified by removing the 'molding' part.] It has excellent mechanical strength, which is completely different from the conventionally known polyvinyl alcohol dal. Anti-blood full of worship
  • the inventor of the present invention has found for the first time an immobilized enzyme agent of this type of anti-plug column by cooling, solidifying, and partially removing polyvinyl alcohol and a method for producing the same. ⁇ ,
  • the immobilized enzyme preparation of the present invention may be used for lymphocytic leukemia, myeloid leukemia, and
  • acute leukemia has a high remission rate, but acute myeloid leukemia, m-haired epithelioma, and other leukemias (or leukemia-related diseases, Melanoma Applicable to any solid tumor.
  • immobilized enzyme preparation of the present invention as described above, the immune response is avoided 7t, and there is no concern about side effects.15 It is used to induce relaxation and further maintain and enhance remission. You can try.
  • the immobilized enzyme preparation of the present invention is used in the bloodstream at 37 C and is used intermittently for about one week!
  • the activity of degrading guesparagine is reduced to 80 to 90 at the beginning, and the continuous use for about one month lasts.
  • this silicone agent should be stored at 0 ⁇ 1 GC after production.
  • the hydrogel 'pipe is placed in a polyethylene bag in which the residual gas has been degassed under vacuum, and sealed.
  • a beasple dog with a weight of 6 was connected between the femoral artery of the right hind limb and the extracorporeal shunt provided in the left hind limb femoral vein by connecting an asparagine zipper tube from the polyethylene bag.
  • Blood flow CL5G
  • the level of asparagine in the arterial blood flow was 0.5 / (6.6) after 4 from the original 3 J6 475i ??) w).
  • a new piece (length 9) is inserted into a dog (jugular vein weighing 7). Separate the membrane, drop 1 xylocaine s, make 5 incisions in the direction of the blood vessel sui, and center the incision
  • Each thread is temporarily wrapped around the top and bottom to hesitate the blood flow.
  • the lumen of the vein is washed with sterilized saline, and then, while being willing to damage the intima of the blood vessel, a new piece of the above-mentioned tube (ring) is introduced into the periphery, Next, adjust this to the central side so that the incision ⁇ matches the position of the center of the ring.
  • the incision line was sutured using a cut-in guide (cdiffut, diameter 0.18 »s.) To resume blood flow and to the center of the ring insertion.
  • the rubber-highly hydrous nitrogen-containing gel of the present invention can be obtained simply by drying the permanent solution containing bolur alcohol and sulphone. Comparative example 2.
  • Example 1 the viscosity of boryl alcohol was 78.5 mol, the viscosity average polymerization degree was 1,800, and the viscosity of permanent solution (20) was 36 cP. The same operation was performed using alcohol. Cooled 'solidified / molded' de-iced body 5.7 f (demineralization rate 1 (oi many) was obtained, but after melting, it softened even at 5 ° C, and in addition to a small amount of gel layer, a large amount of polyvinyl The alcohol soak solution was observed to separate layers.
  • the shochu permanent enzyme-encapsulated cell of the present invention can be obtained even with a low saponification alcohol.
  • Example 1 of Bolibul alcohol! A) a saponification degree 9 9.2 moles large, the viscosity average polymerization degree of 500, 4 aqueous solution viscosity of (2 0 C) 5.6 ⁇ ; TfJ sales Cambodia of J 3 - with Ruaruko Lumpur, was operated in the same manner, the agar Only a similar fragile gel, 5.7 f (departure rate 1 Owi;), was obtained, and almost no elasticity was observed.
  • the hydrogel pipes (length 1) obtained in Example 1 were cut every 4 OTs, and each of them was knitted silk thread (JIS M.1, diameter 0.1 «) which had been treated with sericin (seWci» :) elution. , 120C X 30 ⁇ ⁇ , cagd dart (c ⁇ ⁇ ⁇ , intestinal tract, 0.18 as in diameter, ethylene oxide in ⁇ ), dexon yarn (Boli-Dari-ko, ⁇ 0.18 «,
  • the hydrogen-containing hydroglube of the present invention is easily sewn and causes a loss in quality, so that it can be inserted into a living blood vessel. It seemed to be enough.
  • the hydrogel pipe was subjected to the same anti-coagulant injection test as in Example 2, and almost no occurrence was found.
  • This aqueous solution 41 was sterilized according to Example 1,
  • L-asparaginase (lyophilized powder lyo ⁇ ylize ! D powder 250 wiit 823 ⁇ 4 ⁇ ) was mixed at 33 C.
  • the above aqueous solution 40 ⁇ was poured into a 7 ⁇ 7 square polyethylene container, and the solution was added at 50 C for 6 hours. After that, let it break down. Then, perform vacuum dehydration for 6 h. O Next, break the vacuum and take out the molded body (thickness of about 7 »). (A white opaque gel with a removal rate of 18 wi and a water content of 90 wt ⁇ was obtained.
  • test sample After shaving the skin of the back of a rabbit (body weight: 2.5 kg), apply a 0.5 ether alcohol solution of hexidine to the mouth, disinfect it using .70 ethyl alcohol, dissect about 5 L of the skin, and make an incision of about 5 L of ethyl alcohol.
  • the test sample which had been disinfected by the above-mentioned method, was introduced and combined with the skin.
  • the sample When the sample is touched on the captive surface, the sample moves through the detached part of the subcutaneous tissue. After 3 days, the ileum and redness disappeared, and after 6 days, the thread was removed. After 8 days, the sample is already fixed and does not move even if the finger is eclipsed. After that, for one month, the location of the implant remained unchanged, and the symptoms of i-Panla spread throughout the body. 30 days later, samples including the subcutaneous tissue were removed, but the samples were
  • OMPI WIFO The joint and menisci are removed.
  • the femoral articular cartilage was removed, and instead of this cartilage, the above sample was inserted and fixed in the articular surface of the femur.
  • the knee was placed at a 150 ° flexion position, and a plaster bandage was applied from the upper thigh to the foot. This was removed after three weeks.
  • the joint had slight ileum but no local redness, good primary healing, no secretion, and the knee had about 120 flexures and two protections. Show.
  • the passive range was 150-90 °.
  • the tissue specimen was embedded in formalin-fixed paraffin, hematoxylin, eosin-stained, and maroli-stained, and examined by microscopy. As a result, the joint surface of the femoral shaped joint was coated with the joint.] Both skeletal hyperplasia and inflammatory response in the medullary cavity were observed.
  • Lymphosarcoma twm wr
  • lymphosarcoma (diameter
  • a beagle dog (female, 5 years old, 6) with edema of 30 X 30 » « in the lower jaw, showing symptoms such as anorexia, hypertrophy of the tonsils, hypertrophy of the soft palate, and inflammation, was subjected to biopsy. According to the lymphoma.
  • lymphoma Two days later, the lymphoma almost disappeared, and biopsy showed a large number of necrotic portions and mitotic undifferentiated lymphoblast islands in the cortex (coriea?). Three days later, lymphoblasts are He recovered before he was issued.

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Description

钥 細 雩
白血病治療用^ -ァスバラギナ一ゼ固定化剤の製造法 ；
〔技 術 分 野〕
本発與は白血病治療用 -ァスパラギナーゼ固定化剤の製造法 に係 、 特に抗血栓柱と機械的強度に優れた高含永柱ケ'ル中に、 白血病治療闱餑素ァスパラギナーゼ（ -ァスパラギナーゼ、 L - asparaginase)を包埋（固定化）する、 白血病の酵素療法剤の 製造法に関する。
〔背 景 技 銜〕
白血病細胞の増殖にァスパラギンが不可欠（必須アミノ漦）で あることは古くから指摘されて 、 正常細胞に必ずしも必要で い (非必須）了ミノ漦であるァスバラギンを血液中から除去す る白血病の治療法は、 正常細胞 ¾損傷しな 白血病治療法として 期待され、 多くの研究努力が重ねられた（ I . T
Figure imgf000003_0001
et al.f Bioe em. Biophys. Ess, Comnivn, , 12^ 50 (1963) ) 0正常細 胞に いては、 ァスパラギン合成餑素ァスパラギンシンセターゼ
C Asparagine synthetase )によ！?、 ァスパラギン漦塩またはそ のエステルからァスバラギン ¾·生成じうるため、 ァスバラギンを 必須アミノ漦として要求し いのに反し、 白血病細胞に^ては、 腫瘍化によ]?、'こ'のァスパラギン合成活拄を夂如しているため、 細胞内に けるァスバラギンの生成が不可能で、 血漿中にわずか に存在するァスパラギンを利用しつつ、 蛋白合成を行るう。 した がって、 この治療法の原理は、 ァスパラギナーゼを患.者の J&流へ 注入することによ 1?、 血液中のァスパラギンを分锊（ァスバラギ
_0?' PI ν'Ιίϋ ン夂乏状態を達成 ·維持）し、 白血病細胞を蛋白合成（増殖）不 能に:^とし入れることにある。
各種のァスパラギナ一ゼが、急柱リンパ住白血病を初めとする 若干種の白血病 よび固形 βに有用であることが確められてい る。 この治療法は、 正常弒飽に障害を与えること^:く、 白血病細 胞の増殖を狗制 C阻止 )する特異 、 きわめて好ましい治療理念 に基づくとして注目され（ E.M rqvardt , Ar^n vm ttelforsh. , IS^ 1380 C1 68) )、 更に、 主に大腸菌 ( Escherichia coli ) 起篛のァスパラギナーゼを用いる臨 試験が重ねられてきた ΟΒ· Η· Adams on ei al . t Cancer O emother. Bep. , (l) 521 617 (1968)) oその結果、 この酵素を単に人 に投与する場合、 異種 蛋白'である とに都乡惹起される抗原抗侔^ δ c 反応 ) i) 点として指摘され、 嘔吐、 気、 食欲不接、 発熱、 体重滅少、 肝 機能低下、 す 炎、 ヘモグロビン续少、 尿毒症、 フイブ!；ノーゲ ン渎少、 脳機能低下、 発瘆、 下痢、 ひょう疽、 貧血、 白血球渎少、 血小钣減少、 アナフィラキシー往ショック死、 頃痛、 血管痛、 m 祎不安定、 痙攣 ¾どの副作用が明らかにされたため（Ρ. Ιαδό^- re r, Fathol . Biol . Ci¾ri«), 17, 885 (1969) )、 この治療法 は、 正常造血雜跑への障害が少¾いものの、その実用価値は低い とされ、 ブレド ソン、 ビンクリスチン、 メ ト トレキサ一、 6 - メルカブトブリン、 シタラビン、 シクロホスフアミ ド¾どの ib^ 療法剤 よび故射籙照射療¾ との多種係用 '例か^試みられて いるにすぎず、 当初の期待を大きく裏 ·§}る結果を招 ている。 し かし、 この場合、 饭！)に、 この異種蛋白投与による免疫反 ίδを回 避する手段が提供されるならば、 この治療法に再び大き 期待の られることは十分予見されるところである。 この解^:策とし て、 血液を一時的に体外へ導き、 これを固定化ァスパラギナーゼ C酵素を結合または包埋した高分子材 )と接鲑させることによ 2?、 血液中の溶存ァスパラギンを固定化酵素によ]?分 し、 しかる後、 この血流.を体内へ戻す方式（体外循環方式） （ D* Samp s on etal " Trans. Am- Soc. Artif. Intern, Organs, 18, 54(1972)) が提案されて る。 この場合、 適切 ¾酵素固定化法を採ることに よ 、 異種蛋白（餑素）に因る免疫反応は大镉に整滅（または消 失 するが ( D. Sampson et al . t Trans. Am. Soc. Artif .
Intern. Organs, 18, 54(1972))、 循環血液流と酵素固定化材 (高分子材）との接触による ¾現象が、 新たる難点として^ している（ H. E≠en, Arzneimforsk. , 21, 1671(1971) )。
公知の酵素固定化用高分子村はいずれも抗 栓性に乏しいため、 やむを得ず、 便法として、 へパリンなどの凝血阻止剤を血流へ添 加する方法が採られるが、 へバリン どの医薬を大量に長時間併 周すること自侔、 生理学上好ましくるい。 したがって、 ァスバラ ギナーゼを確実に固定化 ·保持すると'ともに、 その酵素に因る免 疫反 ίδを回避し、 しかも血液流と接鲑しても血拴を生じることの い新た ¾高分子材が望まれている。
本発明は上記の要望に応えうる抗血拴の餑素固定化用高分子材 を新たに提供する。
合成高分子または天然高分子を医^材科として用いる場合、 こ れらと血液との接蝕面に いて、 血拴または血液成分の沈着する 現象は、 人工弁、 Λ 血管、 人工腎朦、 カテーテル等の開発上、 克服すべき重要課題として古くから認讒され、 血液に対する異物 として挙動し難い材科、 すなわち、 血液被壊による血 成を来 it い材料を求める努力が続けられてき？ o
医用村料と血液との接餽面に ける凝血を防止するには、生体 - 内全域（循環血液）に凝血剤を含有させるに及ば いとの考えの もとに、 医甩材料の表面に徵量の抗 Mi剤 させる試みが多 案され、 例えば、 抗凝血剤（へパリン、 ヒルジン、 アンチト ロンビン）、 血小板凝集抑制剤（了デニールサイクラーゼ、 プロ スタグランジン^、 メチルキサンチン）、 線溶活性剤（ ゥロキナ ーゼ、 ストレブトキナーゼ） どを、 医用材料表面に塗布するか、 イオン結合性官能基を介し吸着させる方^:、 あるいは、 これらを 医用材料表面へ、 共有結合によ ]?固定化する手法が知られている c しかし、 この場合、 塗布、 吸着法に いては、 抗疑血剤等が脱離 し易く、 有効時間カ い'難点がある。 一方、 共有結合法に いて は、 化学反応を施すことに因る抗髮血剤の損傷をしばしば俘うほ か、 新たに共有結合性官能基を導入することによる生体への影饗 も懸念され、 しかも、 共有結合によ 固定された抗薆 J&剤の劫杲 を十分に期待 き ¾ ことから、 やは！?有用な手法とは認められ ( if. T nz wa et aし, rans. Am. Soc. Artif. Inter ^ Organs 19, 188(1973) )。
これらの難点を回避する方式として、 抗凝血剤を医用 料中に 混合、 包楚する試みがある ί JS. な wな et σί· , Trans. Am. Soc. Artif. Intern. Organs, 19， 188(1973) )。 しかし、 化学
¾Ό 結合による固定化（捕捉）処理の施されていない抗凝血剤は、 短 期間内に流出（放出）し尽すことがしばしば指摘され、 '有効期間 としては 5〜8 ¾、 もしくは、 たかだか 5日程度とされ、 新たに、 抗血拴の優れた材料か められている。
本発明は、 機械的強度の優れたヒドロゲルから -る抗血栓性の 高い医用材料を初めて提供する。
本発明は、 特定の抗血栓性ヒドロゲルに、 ァスパラギナ一ゼを 包埕することによる抗血拴性の優れた固定化餑素剤の製造法を提 供する。
本発明は、 常法のよう 化学試薬または放射線による化学結合 操作を全く実施することるく、 したがって、 固定化対象とする i -ァスパラギナ一ゼ ¾:¾んら損傷すること く、 これを医用ヒ ド 口ゲル中に強固に包埋し、 その活性を発撣させうる固定化餑素剤 を提供する。
本発明は、 抗血栓性ヒ'ド口ゲル合成原料として、 ボリビニルァ ルコ ールを用いる。 もっとも、 ボリビ ルアルコールのゲル化法
( ヒドロゲル合成法）については、 既に多くの処法が提案されて いる。 しかし、 下記に要釣すると 、 ずれにも、 操作上また は生成物の性状に難がある。
(1) ボリビ-ルアルコ ール永溶液を風乾することによ 2?、 湿潤皮 膜または乾燥皮膜^ #られるが、 これらは酎永性に劣！？、 水中 に ける劚直性を全く有しない軟弱 フィルムにすぎず、 限ら れた用途に用いられるにすぎるい（日本特公昭 40- 9523 ) o (2) ボリ ビ-ルアルコ一ルとテトラエチルシリケートを含む懸濁 永溶液に漦を加 乾する方法によっても、 やは]?、 上^ (1)と
同様の皮膜力 られるにすぎ 。 この場合、 懸i永 液に漦
を加え、 凍結 *乾燥する提案もあるが、 生成する皮膜の強度は
かえって低下し、 ほとんど成型不能である（日本特公昭 55 - 30358、 日本特公昭 55 - 11311 )o '
(3) ボリビ-ルアルコール水溶液へ、 コパルト 60 (ァ線）を照
射するゲル化法が周知である。 しかしこの場合、 特珠 旌設
(放射線照射旎設 )を不可欠とするうえ、 照射経費もかさみ、
しかも得られるゲルが軟弱で、 しばしば他の硬化手段（ 2次的
硬化処理）を要する。 したがって、 この方法で得られるゲルは、
Λ 竊子侔（限球內充てん液） どの、 高粘柱液（または軟質
ゲル）力 まれる 珠用途 外には利^し雞ぃ（ · Material
1974, 1815,日本特開昭 50 - 55647 )o
(4) ボリビニルアルコール永溶液へホゥ漦（またはホゥ酸^液）
ある はホウ^ (またはホウ 水溶液） （注：ホウ砂 =四ホウ
酸ナト ウム十水和 ¾7 ) ¾加えると.、 即座にグル化することも
古くから著名である。 しかし、 得られるゲルは、 款弱で、 流勳
拄¾有し、 しかも単に指先でつま ことによ 直ちに千切れる
ため、 成型後の彤態は保持され難い（ J. An Ckem. Soc" 60,
1045(1938)、フランス特許 743942(1933))0
またこのホウ砂グルはアルカリ性雾 S気下では存在しうるが、
下では容易に崩壊する。 したがって医用 #科には利用 く、 価値に乏し 。
(5) フエノー 、 ナフトール、 コンゴ一· レッ ド等のフエノール ' ?、£
G:,ri
Ί70 ' 類またはアミノ化^、 あるいはチタン、 クロム、 ジルコニゥ ム等の金属化合物によるボリ ビニルアルコールのゲル'化法も多
^^案されているが、 いずれも上 §¾4)と同様の蕖点がある（日 本特公昭 4 0 - S 5 2 3、 日本特公昭 4 0 - 2 3 2 0 4 )。 (6) アルデヒ ド、 ジアルデヒ ド、 不麁和-ト リル、 ジイソシアナ —ト、 ト リメチロールメラミン、 ェビクロロヒ ドリ ンゝ ビス一 ( ヒ ドロキシェチル）スルホン、 ホ · {；アクリル酸、 ジメチ 口ール尿素、 無水マレイン酸等の架檬剤または共重合成分によ るボリ ビ-ルアルコールのゲル化も周知であるが、 いずれも化 学試菜を用いる操作を要するほか、 高含永性の強固 ¾ゲルは得 難い（ Te tile Res. J. t {3\ 189 (1962)、英国特許 7 42,9 0 0 C i 958 ) ) 0
(7) ボリビ-ルアルコール永溶液を 4 0で以下、 特に 5〜： 1 8 C 下の低温に故置することによ]?ゲル化させる手法も古くから 著名である。
しかし、 室温付近に いて生成するゲルは寒天、 力ラグナン のようにもろく、 しかも、 これは単に漦しくかきまぜるか、 水 を加えてかきまぜるか、 あるいは 干¾めることによ]?溶解す のボリ ビ-： ^アルコール永溶液の故冷ダルを得るのに、 低 温が好まし ことも周知で、 例えば I 8 ：、 更には 0 Cあるい は 0 C«¾下の低温で実施する例も知られている（ ymeTム，
Figure imgf000009_0001
しかし、 ずれにしても、 得られるグルは、 寒天、 カラゲナ ン、 ゼリー様の軟弱品（または粘液）であ]?、 漦し べトツキ (粘着 ）を示すうえ、 酎永性に乏しく、 永中では著しく膨滴 し、 更に軟化すると共に、 一部は水中に溶出し、 残部は糊拔と 化す。 また、 水中ある は 4 0〜5 O Cの温永中では、 更に迅 速に形くずれし、 永中に分散 ·溶释する ¾どの舞点を有し、 医 用材料としての価値を認め難い。
{8) ボリビ-ルアルコールをホルマール化して得られるスポンジ
状生成物も古くから著名であるが、 生体内で ではなく、 分
、 変質に俘 、 有害作用を周囲に及ぽすため、 近年その用途 はきわめて限定されるに到っている J* IL iois, Plastic & Be constructive Surgery, 35, 51 (1965) J Q
(9) ゲル化能を有する永溶性高分子、 例えばァガロース、 寒天、
アルブミン、 アルギン酸塩、 カードラン、 カラダナン、 カゼィ ン、 CMC、 ファーセレラン、 ゼラチン、 メチルセルロース、 ベクチン、 瀑教、 タマリンドガム、 ザンタンガム、 トラガント ガム、 グァーガム等の永溶液へ少量のボリビニ^アルコールを 添加後、 これを放冷するか、 ケ'ル化剤含有浴（凝固浴）へ浸漬 するか、 あるいはこれを凍結 する手法も知られているが
日本特公昭 5 8 - 2 5 2 1 0 , 2 5 2 1 1 ) ^ このよう 手 法によっても、 やは]?軟弱で酎水性の乏しい粘液または非流動 Sゲル、 あるいはパサパサした水溶性の乾燥粉末（凍結 · 乾漦 粉） られるにすぎな 。
本発明者は、 ボリビュルアルコールを利用して、 接械的諸特 倥にすぐれた永不溶の抗血桎性高含永固定化薛素剤を、 安俪且つ
C ？ I ' .：. 9 ； 安定に製造する方法を開発すベく検討した結果、 特定条件のもと に、 ボリビ-ルアルコールと酵素とを含む水溶液を一 1 よ 低い温度で冷却 ·固化 ·成型した後、 これを融解させること く, 部分的に真空脱水することによ]?、 含水率 4 5〜9 2wi多の高含 水性の、 酵素包埕ゲルが得られることを先に発見, (米国特許出 願第 3 4 4 0 0 6号）、 これをさらに展開さ^:発明を完成した。
本発明で得られるヒドロゲルはゲル化の遏程るらびにその前 ^理 工程に いて、 従来、 合成高分子水溶液のゲル化あるいは酵素の 固定化に常用されている漦、 アルカリ、 ラジカル篛、 放射鏢、 有 接溶媒、 反応試薬および永 外の無機溶媒 どを全く必要とせず、 従って L -ァスパラギナーゼを損傷することが い。 しかも本発 明で得られるゲルは、 含水率が高く、 ゴム状の彈柱と、 すぐれた 接械的強度をも兼備している。 また、 本発 §iのゲルは、 永または 温水に不溶で、 粘着性を示さず、 の点に いても、 前記のボリ ビュルアルコール永溶液の放冷ゲルとは全く異なる。するわち、 本発钥は、 来のボリビ-ルアルコール水溶液の故冷ゲル化、 あ るいは 来知られたボリビュルアルコール水溶液の化学的処理に よるゲル化 どに関する知見とは全く異なる新規抗血栓住ゲルを 用いる -ァスパラギナーゼ固定化剤の製造法を提供するもので
¾)る。
本発明は、 ボリビ-ルアルコールとァスバラギナーゼとを含む 水溶液から、 特定条件のもとに得られる冷却。固化体を融 させ ることるく、 これに部分的脱永処理を施すことによ]？、 抗血栓性 の優れた高含水グルが得られ、 しかも、 ァスパラギナーゼがこの
く ひ ん .— 高含永ゲル中に包埕（捕捉）され、 ここへ血液を供給することに よ]?、 ゲル表面に血辁を生じることなく血流中のァスバラギンを 分薛 ·除去しうることを見いだした事実に基つ'く。
〔発 明 の 開 示〕
本発明は、 けん化度 9 7モル多以上、 粘度平均— 合度 1, 8 0 0 上のボリビ-ルアルコールを 以上含有し、 しかも、 ァス バラギン分解（加永分解）酵素としての ァスパラギナーゼ (ァスパラギナーゼ、 1/ -ァスパラギン アミ ドヒドロラーゼ（1/ - sjxtragine aviidohydrol se ) )を含む永溶液を、 任意^^:の 容器または成型 ¾誇型へ注入後、 これを一 1 5 Cよ 低い ¾度で 冷却 ·固化♦成型し、 しかる後、 この成型体を ®摂させること ¾ く、 脱水率（冷却 ·固化 ·成型体の重量減少率） 5 i 以上に到 達するまで、 部分的に脱永し、 必要に応じ水中に ¾»することに よ]?、 含水率 4 5〜9 2¾ ί多（湿潤体基準）に到達させることを 特铵とする抗血栓性の、 '白血病治療用固定化酵素剤の製造法にあ る G
〔発钥を実施するための最良の形態〕
本発明に用いるボリビュルアルコールのけん化度は、 9 7モル 多以上、 好ましくは 9 8モル 以上を要する。 けん化度 80〜88 モル 、 特に 8 5 ¾ル 下のボリビ ルアルコールを ても、 軟弱 ケ 'ル ^!られるにすぎず、 本発明の目的は違成されるい。 本発明に招 るボリビ-ルアルコールの重合度は、 1，8 G 0 上を要する。 重合度 3 0 0〜： 1,5 0 0未潢、 特に 1, 4 0 0议下では 钻穉液または軟弱ケ'ル^^成するにすぎ 。车¾¾に ては、 ：. . .· '— i . .
例えば重合度 1，8 0 0〜3.3 0 0程度のボリ ビニルアルコールが使 招できるが、 通常市販されている高重合度品（重合度 1,'8 0 0〜
2, 6 0 0 )をそのまま用いるのが良い。
本発明では、 まずボリビュルアルコール滠度 6«?ί 以上の水溶 液を調合する。 したがって、 ボリビュルアルコー の饞度として は、 例えば 6〜2 5wi とすることができる。 この ¾度を更にた とえば 9 0 程度まで高めることもできるが、 常温に ける水溶 液の粘度が 1 0,0 0 0 c P以上にも達し、 また貯蔵中に粘度上昇あ るいはケ'ル化をきたすこともあ]?、 若干、.取扱い難い。 この震度 を例えぱ 5wi よ 低くすることもできるが、 後述の脱水所要時 間が長ひ :き、 経費 C脱水動力費）がかさむ。
¾ 、 この永溶液に、 好ましくは、 了スパラギナーゼ用の緩衝 液成分として、 公知の、 例ぇぱ3? ^ 7〜8.5の、 ト リス （ ヒ ドロ キシメチル）ァミノメタンまたはリ ン酸塩 ¾どを、 常法ど ]?添 加するのが良い o
本発钥に いては、 上記ボリビ-ルアルコール水溶液へ酵素を 添加するに先立ち、 必要に応じ、 ボリビュルアルコール永溶液を 狨茵する。 镔菌処理条件としては、 1001C X 5 で目的を達する 場合もあるが、 耐熱性菌に汚染されている場合は、 たとえば、 120TC X 1 5 〜'6 の高圧 ·蒸気钹菌を施す。 紫外線照射镔菌 法も使用できるが、 その有効性が照射表面に限られる とから、 前記の加熱滅菌法と併用するのが望まし 。 いずれにしても、 こ れらの処理によ]?、 本発明に用いる資材が変質することはなく、 本発 §§の実施に んら支障をきたさるい。 狻菌された永溶液は、 次に、 固定化対象とする酵素と混合され る。 酵素としては、 通常市販のェシェリチア 'コ》J B^EC - 2 型ァスパラギナーゼをそのまま用いることができる。 この他、 セ ラチ了 ·マルセセンス ( 5¾ττα·έΐな ma ;escetsリ系、 ブロテウス · ブルガリス（ Proteus vulgaris 、 パク亍リ ウム ·カデべリ ス ( Bacter nm cadaverts j系、 ェルビ-ァ ·ァロイデアェ
( Erw m rotde e )糸、 エルビニ了 *カロトボラ ET inia c rotovor )系さらにはモルモット血清系のァスパラギナーゼ を用 ることも差支え ¾ 。 これらのァスパラギナ一ゼは、 いず れも、 白血病に対する治療効果が既に報告されて ！？（ L. T. M shb m et l . f Bioc em. Bio-phys - Ees. CoTitnwn. , 12, 50 (1963) , Arch. Biochef Bio≠,ys.t 105, 450 (1964) , J. D. Broome, Nitwes 191, 1114 (1961), J. Β&φ. Med" 118 , 99, 121 (1963) )、本発明のヒドロダルへ包埋することによ！?、 それらの免疫反応を抑え、 副作用を伴うこと く治療に役立てる ことができる。
前逮の、 白血病に有効る酵素として、 現在主に、 ェシエリチヤ ' コリ B系 EC - 2型が市販されて !?、 凍結乾燥粉末ある は 50 グリ セリン水溶液の状態で入手することができ、 その す れをも、 本発明に用 る とができる。 この薛素を、 ボリビ-ル アルコール水溶液へ添那する操作は、 例えば 70 以下で実 す ることもできるが、 この餑素の熱劣化镇向に配慮し、 3 7C い し常温に て実 j|するの： ^良 。
餑素の添加量としては、 永溶液中のボリ ビ ルアルコ ールの 7 倍重量 下（酵素凍結乾燥粉末重量基箄表示）にとどめるのが、 酵素の大部分を固定化する観点から好ましく、 この場合、 後述の ゲル化工程を経ることによ 1?、 薛素の約 8 5¾;ί 以上を捕捉でき 本発明に いては、 ボリビュルアルコ ール自侔7 ^強力 ¾酵素保 護作用を有することを、 本発明者は確認して 、 したがって、 この他に、 酵素保護剤としてのグリセリン、 ァスパラギン酸、 ァ スパラギン酸塩、 カゼイン ¾どを特に必要としるいが、 2：れら公 知の保護剤を更に添加することも差支え 。
本発明に ては、 このようにして得られたボリビ-ルアルコ ールとァスパラギナ'ーゼの双方を含有する永溶液を、 任意形拔の 容器または所望の成型用铸型へ注入し、 冷却 ·固化 ·成型する。
ここで成型 ffi篛型とは、 最終用途の形软のものが望ましいが、 後 に裁新等の変形処理を加えることを意図したうえの任意形状の篛 型でも良く、 これらも、 本発明の成型用篛型に包含される。
冷却，固化 ·成型 の冷却剤としては、 例えば、 余塩-氷（23 ： 7 7 ) ( — 2 1 C )、 塩化カルシウム-永（ 3 0 : 7 0 ) -5 5 C ) ¾どの寒剤、 あるいはドライアイ -メチルアルコール (一 7 2 C ) N 液体窒素（一 196TC ) ¾どを用い、 一 6でよ]?低 温 度に冷却し、 固化'成型する。 冷却が不十分であると、 後逑する 乾燥工程を経て得られるダルの形状が、 当初予期した形態すなわ ち、 ボリビュルアルコ ール永溶液注入容器または成型甩篛型の形 状と合致し難いほか、 ダルの檨核的強度に劣る。 液体 リゥムを 甩 れぱ、 — 2 S 9Cまで冷却できるが、 実用上はフレオン冷凍接
ΟΙ.ίΡΙ
/ YV ir U を用い、 例えば一 3 以下に冷却するのが良 。 この冷却'固化 •成型を省略するときは、 永中に て剛直性を全く欠く、 単 る、 従来公知の酵素含有ボリビュルアルコ ールフィルムある は 軟弱ゲルが生成するにすぎず、 本発明の殍拄に富む 含水住の、 耐永性で抗血栓法のゴム 薛素剤（ ヒドロゲル） 得られる^
本発明による冷却 ·固化♦成型に ては、 ボリビュルアルコ —ル水溶液は任意の形状の篛型内で固化 ·成型され、 しかる後、 銬型に上面力パーまたは下面カバ一（あるいはその双方）がある 場合は、 それらの一方又は双方を取]?はずし、 成型体の形 を保 持しつつ、 後述の脱永処理を施すことができる。 したがって、 本 発明のゲルの形抆 しては、 固定化餑素の反 ί5に好都合 ¾、 基質
よび反応生成物の 散を考慮し、 任意の大きさと形抆を違定す ることができる。 好ましい成型体の形状としては、 既に化学工業 に いて、 蒸留塔またはガス吸驭塔などに用いられているラシヒ リング、 多孔 、 テラレット、 インターロック 'サドル、 ポール リングなどの成型 ffi篛型及び、 これらの充 物を収めるための充 損用カラム成型用篛型あるいは体外血液循環流路としてのパイブ 成型用鏡型 よることができる o また'米国特許 ffi願第 3 4 4 0 0 S 号に記載した突起を有する平板又は齒板^の籙型を用 ることも できる。 これらの 型用篛型を用 て得られる本発明の固定化餑 素剤（ケ'ル）は、 固定化餑素の活動に必要な基質との接餒、 質 移動の点 て優れ、 また、 体外循環血液流の圧力損失の低い 点に いても、単 る粒拔品、 寂牧品、 獏状品または锾細径の球 欤品 どに比し優れている。 もちろん粒拭品等も本発 ¾に含まれ
C PI るし、 板状体を得て後に切断する等の方法も本発明に含まれる。
前述の冷却 ·固化 ·成型を目的とする冷却操作の冷却速'度として は、 0. 1〜 7 TC Z 程度の緩慢冷却でも差支えなく、 また、 7〜 1,000 C Z の急速冷却によることもできる。
本発明に ては、 前述の容器または篛型へ注久されたボリビ
-ルアルコールと酵素との混合水溶液が冷却 ·固化されたことを 確認後、 これに真空脱水を施す。 この場合、 冷凍室から冷却 ·固 化 ·成型侔を取 ]?出し、 これを真空乾燥室へ移し、 直ちに吸引 · 脱永するならば、 永分の除去（昇華）に伴るい、 試料が冷却され るので、 特に外部冷却を施さ くとも、 固化 ·成型体が融解する ことは ¾い。 冷却 ·固化 ·成型 が融解し い程度に加熱するこ とは差支え く、 これによ]?脱水を促進することができる。つま 脱水工程の温度としては、 冷却 ·固化 ·成型侔を融解させ
かぎ]?、 特に制限は く、 これがケ'ルの品位に特に影饗すること は い。 この脱水工程に いては、 脱水率を 5wi 以上とし、 た とえばゲルの含水率を 2 0〜9 2 、 好ましくは 6 0〜9 0wt ^>
(湿潤体基犟）に到達させる。 含水率を 2 0多以下とすることも できるが、 この場合においても後述 るように、 永中に浸漬させ ることによ ?含水率 5 G〜9 Owi に到達させることができる。
本発明に ては、 ポリビ ルアルコールの濃度のいかんにか かわらず、 冷却 ·固化 ·成型体に若干の脱永処理（真空乾燥）を 施す。 この場合、 脱永率（冷却 ·固化 ·成型侔の重量渎少率）と しては、 5wi多以上、 よ j?好ましくは 1 5w i 以上が採用される。
す ¾わち、 脱水が進行するとともにダル強度が著しく高ま i?、 し
O PI
, VvirO かも非粘着性、 尉永性 ¾どの諸性 が著しく改善されることから、 この部分説水処理は本発明にと]?不可欠である。 もっとも、 本発 明に いては、 注射萘液の渌結乾燥あるいはコーヒー、 ミルク、 杲汁、 めん類等の含水食品の凍結乾燥に見られる十分なる脱永
(乾燥）処理を行う必要はなく、 上述のとお の部分脱水処理に よ D、 十分本発明の目的が達成され、 上記のと 、 ^水が進行 するに伴いケ'ル強度が著しく高まることから、 所望のゲル強^に
- ί5じ、 脱永量を選定することができる。
いずれにしても、 この部分的脱水処理は本癸明に不可欠で、 き わめて重大'： 意義を有するため、 これを省略するとき、 本発明に 述べる非流動性、非粘着性、 かつ高含永性で、 しかも機械的強度 に優れる ¾j&拴性ヒドロゲルは決して得られる 。 また、 冷却 · 固化状態を維持すること く、 冷却 *固化 *成型体を融解後、 渎 圧脱永する方式によるときは、 泡立ちが漦しく、 ほとんど、 操作 続行不可能であるうえ、 たとえ長時間を費して脱永しても、 弾性 に乏し 白濁ゲル力 成する すぎ ¾ 。
本発明に ける真空脱水の真空度は冷却 ·固化永分が鋭永しう るものであればいずれでもよく、 たとえば、 1 0 if &下、 好 ましくは 以下、 さらに好ましくは 0.1 T3SJS ^以下が通常 招 られる。 *
本 明に ては、 次に、 冷却 ·固化 *成型 ·部分脱水侔を、 例えば常 ®:置し、 齄漭させることによ 、 弾性に富むグル^ られる。 ^度としては l〜3 CZs5の緩慢齄 、 または 3〜
OO の急遠敏解のいずれによることも差支え ¾ 。 ボリ
WHO ビ-ルアルコール永溶液を、 0〜3 0 C程度で放置（貯蔵）する 場合に得られるゲルの融点が 1 5〜2 9 C前後であるのに反し、 本発明のゲルの融点は 以上に及ぶため、 温水または温風に よる急速齄解も差支え ¾いが、 本発明のゲルも熱湯中では溶解す ること、 6 0 C以上では表面に硬質皮膜が急速に^生すること どから、 .高温融解は避け ¾ければならず、 4 0〜5 0 C以下て融 解させるのか" ましい。
この融辯操作後、 容器または篛型の支持部から、 ゲルを容易に 取]?はずすことができる。 これは弒菌氷または滅菌生理食塩水中 に いて吸水し、 1〜6 ¾で含永率 5 0〜9 2wi （湿潤体基準） に達するが、 お強固 弾柱体である。 本発明のゲルはこのよう に多量の水分を含むにかかわらず、 強固な彈性を示し、 堅く握]? しめても、 一時的に変形するが、 直ちに元の形状に復し、 形くず れしる 。 また、 本発明の、 含水率 8 8多の板状ゲル上へ成人が 片足または両足によ 直立しても、 やは]?—時的変形をきたすも のの、 直ちに元の形状に復し、 形くずれしるい。 高含水 と機械 的強度とは、 従来から医用高分子 TOを開発するうえで、 両立し 難い難題とされているが、 本発明のケルは、 上述の高含水性と強 度とを有し、 従来のボリビ-ルアルコール水溶液を風乾して得ら れる皮膜あるいは前途のボリビ ルアルコール水溶液を単に 0〜
3 0 C以下に貯蔵する場合に生成する水溶性ゲルとは全く異なる 新規ケ'ルである。 .
本発明のゲルに圧力を加えても、 含有水分の浸出はほとんど見 られず、 例えば、 含永率 9 0 έ多のゲルに 4 /^の圧 US力を
CMFI 課しても浸出（流出）水量は、 含有永の 1〜2 にすぎ い。 こ のように、 多量の水分を強固に保持することからも明らかなと
i？、 このケ'ルの見かけ比重は、 ほぼ水と同程度であ！?、 永中で辛 うじて沈降するにすぎ い。
本発 のゲルには、 粘着性がない。板状 ( 8 s« 8爾 X 2 «s )、 円筒 .（内径 3 、 外径 6 «s、 長さ 6 ） 、 球状（直径 等 に成型したゲル約 1 0 を、 5 の滅菌水中で 4 0日間かきま ぜても、 相互付着、 形くずれ等の現象は全く認められ ¾い。 、 生理食塩水中に 1年間浸清したが、 溶解せず、 弾性 よび強度も 変ら い（これは、 例えばこんにゃくを数日間永道永に浸漬した 場合、 漦しい彩くずれが起るのと、 きわめて対照的である。 また、 ポリビ-ルアルコール永溶液の単なる放冷ダル (凍結ゲル )が著 し 粘着柱を示し、 しばしば流動性粘液状あるいは、 たかだかゼ
リー、 ブリン、 寒天拔で、 しかも耐水性に乏しく、 水中で分散 · mmしゃすいのときわめて対照的である）。
本発明に いては、 ボリビニルアルコール水溶液の注入容器ま たは鏡型の形状を任意に選定し、 所望の形状（粒状、 膜牧、 塊 、 板状、 円筒拔その他任意形杖）の湿 ゲルとすることができる。
最終目的物の形 に合わせて成型してもよいし、 一且得た成型体 を切削等によ]?別の形に成型してもよ 。
本発钥のダルは多量の永を包埕し、 永または生理食塩永に 1〜
6時間浸漬することによ j 含水率 5 0〜9 2wi にまで容易に 到達する。 特に、 本発 §9に ける原科永溶液のボリビ-ルアルコ
一 ¾度を S〜 2 0w に違定して凍結 *成塱 ·部分銳永を旃し、
、Ί— VvI O ' 更に永または生理食塩永に浸漬して得られるゲルの含永率は 7 0 〜9 2ίϋέ にも及ぶ。 したがって、 本発明の高含水ゲルは、 前述 の優れた機械的強度を有するゴム状弾性体であるにもかかわらず、 化学的 ¾らびに生化学的には、 しばしば、 単 る氷（または生理 食塩永）同然の挙動を示し、 生侔との反応柱はき めて輊徴であ i？、 血液に対しても、 優れた 栓牲を示す。 す わち、 ガラス、 ナイ ロン、 ボリスチレン、 ポリエステル、 ボリエチレン、 ボリ ウ レタン； オーム等に いては血液はきわめて容易に凝固し、 テフ ロン、 シリ コーン、 ボリ ビ-ルビ口 リ ドン等に いても、 血液凝 固が起きるのに反し、 本発明の高含永ゲルは、 ボリビ-ルピロリ ドン、 シリコーン、 テフロン等に血栓形成が認められる条件のも とに いても、 :^:血栓注を示す。
徒来、 医用材料として注目されているヒド πゲル、 す わち、 ボリ （ 2 -ヒドロキシェチルメタクリレート）の含永率は通常 38 〜4 Owi多であ]?、 しかも機械的強度に劣る（ S. D. Bmck,
Biomed. Mater. 7 , 389 (1973) ) D その含水率を 6 (Ησέ
^程度まで高めることも提案されたが、 含水率が向上するととも 接械的強度は更に低下する難点があ'る（ J. D. ndrade Ced^、 * Hydrogels for Medical and Related Appl cattons " p. 23
1976 ^ACS Syinp. Ssr. 。
これに反し、 本発明に いては、 通常含永率 7 0〜9 2wt ^
更には 8 0〜9 2 i の高含永ゲルが容易に得られるうえ、 接械 的強度にも優れることから、 従来の非親水注および親水性、 含永 拄医屈材料のいずれにも勝る抗血 ¾性村料としての価値を有する。
fO REA 一 ΟΜΠ 、 WiFO 本発明のゲル素材は、 ァスバラギン（分子量 132 )、 ァスバラ ギン漦（分子量 133 )、 永漦化アンモ-ゥム（分子量 3 5 .)、 ブ ドウ糖（分子量 180 )、 グリセリン（分子量 9 2 ) どの低分子 量物質を容易に透過せしめるのに反し、 分子量 1 0万程度の酵素 は、 ほとんど透過させず、 また、 分子量 3 0万程度以上の酵素は 全く透過させるい。 したがって、 本発明のゲル内に包埕された L
-ァスパラギナーゼ（分子量 1 0〜1 7万）は、 ダル外へほとん ど漏 せず、 しかもゲル外部から、 血液中の 跑 よび高分子蛋 白質が、 餑素包埕部分の内部へ侵入し ため、 血流中の抗体
( リンパ球、 免疫グロブリン（分子量 1 6〜8 9万）、 、 異種 蛋白^:してのァスパラギナ一ゼと 0.1 以内に接近することに よ]?ひき起こされる抗原抗体反応は回避される。
もっとも、 本発明のゲルの生成後、 これを生理食塩永に浸漬す ることによ j？、 当初は、 ^の餑素が遊難される。 しかし、 その 後は、 たとえ長時間浸 » (または洗浄）を統けても、 もはや酵素 の遊難現象は認められず、 その後は、 異種蛋白遊籙を懸念するこ と く、 連続（または反復）便 Sできる。 上記の浸 Λ当初に遊籙 される餑素損失量は、 本発明のゲル生'成に先立ち便用された薛素 量の 1 0〜1 5 程度であるが、 本発明に いても、 既に公知の 餑素の遊離阻止処理を俘^することによ]?、 この餑素損失を回避 することができる。 するわち、 酵素の固定化（または包垣固^ ί匕） にあた 、 多少とも餑素が遊 ΪΙするのを抑制すること ¾どを 的 として、 固定化餑素剤をグルタルアルデヒド永溶液に浸 »する^ 理法が、 しばしば採用されるが（ T. M. S. Chang, Bizyms, 14.
O FI 95 ( 1972 ) , G. Brovn et な ）、 この周知処法を、 本発明に いて得られる固定化酵素剤へ適 ffiすることによ！)、 前記酵素遊離 損失量は著しく低下し、 もとの薛素使用量の 1〜2 にまで改善 される。 ^のグルタルアルデヒド水溶液への浸漬操作は、 この永 溶液の滅菌作用に基づき、 固定化酵素剤の消毒を ¾ねうることか らも、 本発明のダルにと]?好ましい。
本発明のヒド πゲルは、 生体組緣と直接接触した場合の生侔組 織との間の反応が見られ い点に て、 生体への有害性のきわ めて少 ¾ぃ林料である。すなわち、 本発明のヒドロゲル（ 1 X 1 X 1 ^ ) ¾：, 例えば家ゥサギの背皮下に 1〜3力月埕植後、 解剖 した場合、 このゲルは生体組鐵に われて密着し、 カブセル状 と化しているが、 この生体組織を切開すると、 ダルの周囲全面が 一様に薄膜によ！? われて ]?、 この薄膜の一部にメスを入れ、 この皮膜を容易に剝離することができる。 この皮膜及びその他生 体組織に、 細胞浸潤はほとんど認められず、 炎症反応は欠如して いる。 このように、 本発明のヒド グルの生体適合性の優れるこ とから、 旧来の、 遊離ァスパラギナーゼを腹腔内へ（ intmpe- Htmeal ly ) 投与する治療法（ J. G. Kidd, J. cp. Μ&ά
98 , 565, 582 (1953) )に替え、 本発明のァスパラギナーゼ包埋 固定化酵素剤を腹腔内に留置することもできる。
既に述べたと IK 本発明のヒドロゲルは、 優れた抗血辁性を 示す高含水ダルであることから、 血液の体外循環回路を構成する 固定化薛素剤として用いることもできる。 もっとも、 本発钥のヒ ドロゲルは、 のように優れた抗血拴性を示すが、 かに高含水 ゲルと言えども、 永または生理食塩水と完全に同一の挙動を保証 するものではる 。 材料の含水率を高めることが抗血 ¾性の向上 に寄与するとの思考に不合理は ¾いが、 医用材料（するわち構造 物）を前提とするかぎ]? (接械的強度を確保する必要上:）含水率 を無制限に高めることは不可能である。 本発 のヒドロゲルは、 従来提案されたボリビニルアルコール · ダルタルアルデヒド系ぁ るいはボリ （ 2 -ヒドロキシェチルメタクリ レート ）系のヒドロ ケ'ルの含水率上限値（ 6 0〜 8 0 ） E. W. Merrill et al. t ACS Polymer Preprint , 13^ 513 (1972))を、 はるかに超える ことができるが、 更に含永率 9 2ι ^多を超えると、 やは]?、 ケ'ル の機械的強度低下につ がる。
本発明のダルの含永率を 4 5〜 9 2wi多にとどめ、 しかも更に 十分 抗血栓倥を長期間にわた!?確保する目的から、 本発明に ては、 本発 §9のゲル内へ抗血拴剤（凝血阻止剤 )を包垣させる ことができる。
この ¾ J0L检剤としては、 へパリン Cへパリン漦、 へパリンナト ゥム、 ンカリ ゥム、 ンカルシゥム、 ンマダ ネシゥム）が有効である。本発明の抗血拴柱高含永ゲルに、 上記 抗血桎剤を包埕し、 その抗血栓性を更に確実に、 長期間にわた]? 確保するには、 前述の、 本発明の原料永溶液、 す わち、 ボリビ -ルアルコールと餑素を含む永溶液へ、 へバ lj ン粉末、 へバリン 永溶液、 へパリン懸镉永溶液の ずれかを添加 ·浸：合する操^を 実旎する。 この場合、 へバリン錢袞としては 1 0¾^ 以下に違定 することができる。へパリンを更に多量添加し、 永溶液中に一部 懸濁させることももちろ 支え いが、 本発明のヒドロゲルに 包埕されたへパリ ンは、 短期間内に流失すること く、 '長期にわ た]?包埋 '狳放されるため、 特に大量のへパリンをボリビニルァ ルコール永溶液へ添加することは通常必要で い。
本発明に いては、 かくして得られるボリビュルアルコール * 酵素 *へパリンの永溶液に、 前述の冷却 '固化 ·成型 ·部分脱水 処理を施すことによ ？、 水溶液中のへパリ ンの 9 9 以上をグル 内に均一に分散'包埕させることができる。 これは前述したと
U、 好ましくは、 公知のグルタルアルデヒド処理を施した後、 渎 菌永または滅菌済み生理食塩水に 1〜ら k浸漬することによ]？、 含水率 5 0〜9 2w t多の、 ^吸水状態に近い湿潤ゲルとして、 その形状を安定化させたのち用 ることができる。 もっとも、 こ の浸漬操作中に、 ヒ ドロゲルからへパリ ンがわずか がら流出す
るが、 その損失量は、 通常、 全包埋量の 0.5〜1多程度にすぎず、 本発明のヒドロダルの抗血栓性は、 これによ j?左右されるもので
はない。 例えば、 ボリビ-ルアルコール水溶液にへバリンナト リ ゥムを 多溶解後、 本発明の処法を適用して得られるゲル 5 f
(全表面積 5 0 ^ ,へバリン包埕量： , 8 0 0単位（ 3 0 ） 1
を 5 の生理食塩永に 6 h浸漬した場合、 へパリンの流失 失） は約 0， 6多で、'その後、 少るくとも 2 8日間、 生 内の血液流に
接しても、 、 ヒドロゲル表面にへパリンが存在する。 ボリビ
-ルアルコールのアルデヒ ド架橋ゲル等に包埕されたへパリ ンは
通常 5〜8 、 もしくはたかだか 5日程 Kで全量流岀することか
ら、 本発^に ける包垣へパリ ンの長期徐放効杲は特異であ 、 WIPO V 医用 料としてきわめて好ましいことが明らかである。本発明の ゲルは、 任意形牧の戚型品として容易に得られ、 例えば g径 2〜 6 s»の、 ヒド ηグル♦ノくィブまたはへバリン包垣ヒドロゲル · ζ イブを製作し、 血液の侔外循環流路とすることができる。 現用の ボリエステルまたはテフ口ン製の人工血管では れも血栓形成 が漦しく、 直径 5 以下の細動脈代替には難があるほか、 血液流 速の小さ 静脤部には適甩し難いが、 本発钥のヒドロゲル ·パイ ブまたはへバリン包垣ヒド口グル ·バィブは、 直径 2〜 5 の流 路、 にお ても、 少¾くとも 4週間にわた])血栓を生じず、 この 間に、 本発明のヒ ドロゲルパイブまたはへパリン包埕ヒドロゲル
•パイブの全表面にわた 、 生体組铙（蛋白質）が薄く密着し、 生体適合性が十分に達成される。
本発钥に いては、 単 、 公知の後 ¾理に用いるグルタルアル デヒド未反応分の洗淨 ·除去に留意するかぎ 、本 ¾ のヒドロ ダル (またはへバリン包埕ヒド Πグル )の有害物随伴を懸念する 必要が ¾ 。 従来の代表的抗血 材としてのポリウレタン 'ジメ チルシロキサンが、 常に、 テトラヒ ドロフラン、 ジォキサン、 薛 酸等を隨俘する危険を俘い、 しかも、 Tきわめて容易に^菌室内の ほこ]?を吸着するため、 通常の手術室とは異 る特殊る清淨室に お て取扱わねば ¾ら のに反し、 本発明のヒドロゲル及びへ パリン包迤ヒドロゲルの取扱 は容易で る。
本発^ て、 ボリビュルアルコールの永溶液を冷却 ·固化 '成型'部分脱永することによ ]?、 従来公知のボリビニルアルコ —ル系ダルとは全く具 る、 機玆的強度の優れた拜注に富む抗血
REA
O PI - . 」 o
栓性高含水ヒドロゲルの得られる理由は明らかで いが、 冷却 · 固化'成型 らびに、 これに続く部分的脱永処理時に、 'ボリビ- ルアルコ ールの分子内;^よび分子間にきわめて多数の水素結合が 形成され、 特に、 部分脱永時に、 グル組織の結晶化度が高ま]?、
5 機械的強度と弾拄の向上をきたすことに因ると推察される。
いずれにしても、 この種の抗虛栓柱の、 ボリ ビニルアルコール の冷却 ·固化 ·部分脱永による固定化酵素剤及びその製法は、 本 発明者が初めて見いだしたものである。 ·，
本発明の固定化酵素剤は、 リンパ性白血病、 骨髓性白血病、 特
10 に急性リンパ性白血病に寛薛率が高いが、 急性骨髄性白血病、 m 性被毛上皮腫 どの、 従来の遊離ァスパラギナ一ゼ投与効杲の認 められた各種白血病（または白血病類檨疾患、 黒色腫 どの固形 腫瘍）へ適用できる。本発明の固定化酵素剤に いては、 前記の ように免疫反応が回避される 7tめ、 副作用を懸念すること く、 15 これを用 て寛辫の導入'、 更には寛解の維持 ·強化に努めること ができる。
本発明の固定化酵素剤は、 3 7 Cの血流中に いて、 1週間程 度違続使用されることによ！?、 そのゲスパラギン分解活性は当初 の 8 0〜 9 0 へ低下し、 また 1力月程度の連続使用によ]?、 活
20 性力浮減することから、 症秋の回復状況によっては、 固定化酵素 剤の更新を要する場合もあるが、 高懾 薛素を多量に（例えば佯 重 5 0 あた]? 1万単位、 約 7 日：、 しかも 4〜2 8日間 の長期にわた 、 違日または隔日に反復点滴静注（使い捨て）す る従来法に比し、 固定化酵素剤を血流と接 させたまま長時間敖 置しうる本発明の方式が、 操作上るらびに轻済性の点 て^ れている。
また、 この餑素剤は、 製造後 0〜1 G Cに保存するかぎ]?、 約
6力月安定で、 この間の活性低下は i 0 以下であることから、 取扱いも比較的容易である。 -:'
次に実 例に基づき、 本発 §§を説钥する。
実旌例 - 1.
市販ボリビ-ルアルコール（けん化度 99.4モル 、 粘度平均 重合度 2,600、 4多水溶液の粘度（ 20 C ) 66cP )の粉末
3 8 ^ (含永率 8.5¾ί多 ）を、 ρ丑 8のトリス（ヒ ドロキシメ チル）ァミノメタン ·塩酸（ 50τηΜ- 0.2 TOM)水溶液 201 に 溶解して、 1 3 i 永溶液とし、 これに、 高圧水蒸気钹茵処理
( 120CX25 ）を施す o この永溶 25 へ、 1 -了スパラ ギナ一ゼ（市厥品、 50多グリセリン永溶液、 290¾aii/^)O 溶液 6.6 を室 に て混合することによ]?、 ボリ ビュルアル コール 1 Qv>t<^、 グリセリン（市展品餑素溶液の溶媒） 1 Qwt^、 酵素 0· 0 の永溶液 i HS を得た。
内径 1OT、 外径 3 、 長さ 1?»の イブ成型用篛型を、 高圧水 蒸気铰菌後、 上記のボリビ-ルアルコール . ァスパラギナーゼ永 溶液 を法入し、 一 4 で 4 冷却する。 しかる後、 篛型 の上面力パーを取]?はずし、 冷却 ·固化 ·成型体を ¾薛させるこ となく、 ら hの真空銳:^を施す。 次に真空を孩 ]?、 成型 Cパィ ブ拔ケ 'ル）を取]?出し、 齄 させたところ、 5.3 （鋭永率 15 wt^、含液率 8 Swi p、 、 内径 外径 2.7 のパイブを得 f O PI た。 とれを、 Ϊ グル^ルアルデヒ ド水溶液に、 室温に いて 15 、 更に 5 C いて 1晚浸漬後、 食塩 0. 9wi を含む p if 7. 5 のトリス（ヒ ドロキシメチル）ァミノメタン-塩漦（ 4 7 ττ Μ - G.3 w ^i )水溶液 3 C弒菌済み）による浣淨操作を 1 0回反 復し、 5.7 （含液率 8 9wi ）のヒドロゲル 'パイブを得た。
¾ 、 上記洗 液には 当初、 多量のアルデヒ ドとこん跡量の蛋 白質が検出されたが、 洗浄操作終了時の洗液には、 これらのいず れも検出され い。
あらかじめブロビレンォキシド ·ガスによる弒茵（室温 X 1 0
%：)を施し、 しかる後、 残留ガスを真空脱気したボリエチレン製 バッグへ 前記ヒ ドロゲル 'パイブを収め、 密封する。
体重 6 のビーグル犬の右後肢の大腿部動脈と、 左後肢大腿部 赘脈に設けた体外シャント間に、 前記ボリエチレン製バッグから 取]?出したァスパラギナ一ゼ包 パイブを接続し、 自然血流 CL5G
）のもとに放置したところ、 動脈血流中のァスパラギン ¾ 度は、 当初の 3 J6 475i??)w)から、 4 後 0.5 / ( 6. 6
： pjm へ低下し、 5 後には、 もはや検出され いまで（ Ipjm 以下） 漠少した。
実施例 2.
実旌例 1と同様 操作によ]?得たァスパラギナーゼ包埕パイブ の新片（長さ 7 ^ )に 5 Zedの 張 j?荷重を課したが、 切新さ れ¾い とを知った。
同じく断片（長さ 4 ^， 0.2 5 f ：)を切]?開いて得られる薄板 に 4 :の荷重を謀したが、 永分浸岀による重量泜下は 2 に
CMFI O すさ った o
同じく新片（長さ 9 )を、 ィヌ（体重 7 の頸静脈に挿入 する。 す わち、 ラボナール静脈麻粋と揷管謂節呼吸のもとに、 無菌的に頸静脈を露出させて外膜を剝離し、 1 キシロカインを s 滴下後、 血管綏軸方向に 5 «切開するとともに、 切開部の中枢側
とま梢^にそれぞれ、 一時的に糸をかけ、 血流を逡断する。直ち に、 静脈内腔を渎菌済生理食塩永を用 て洗浄し、 しかる後、 血 管内膜を傷つけ いよぅ資意しつつ、 上記パイブ新片（ リング） を末梢僩に揷入し、 次 で、 これを中枢側に^、 切開籙とリン0 グ中央部の位置とが合致するよう調整後、 エチレンォキシドによ
る钹茵を したカツトグ一ト（ cdiffut ,直径 0. 1 8 »s.) ¾用いて 切開線を縫合し、 血流を再開するとともに、 リング挿入中央部に
いて結紮した。 2週間を経て、 上記の部分を再び切開した結果、 Vング全面に薄皮が認められるものの、 血铨は認められるかった。
5 シリ コーンゴム製リングとテフロン製リングについても同様に、 体重 7〜 1 5 ¾のィヌを S 比較検討したが、 2週間後には ¾に、 いずれも著しい血 ¾を生じ、 血管はほとんど ¾拔態に達するこ とから、 本発明の酵素包 ¾ヒ ド πグ の ¾J0L拴 の優れて るこ とを知った。
S 比敦 ii 1. '
実旌^ 11のボリビュル了ルコ一ルとァスノ ラギナーゼを含む永 灘 3 0 を、 6 X S eの底面の角彭容器へ注ぎ、 常温で 2日間 放置した結果 ^色透明の敦弱 »膜を得た。 この膜を永道永
浸¾したが、 k中に一薄溶 するうえ、 膜自侔粘着 ¾を示 οι.ί?ι_ -。 To実施例 1の場合のよう ゴム^グルは全く生成し 。
す わち、 ボリビュルアルコ ールと薛素を含む永溶液'を単に乾 燥させても、 本発明のゴム^高含水性餑素含有ゲルは得られ ¾ぃ。 比較例 2.
実施例 1のボリビュルアルコ ールのかわ]?に、 ん化度 7 8, 5 モル 、 粘度平均重合度 1, 8 0 0、 4 永溶液の粘度（ 2 0 ） 36 cPの市扱ボリビュルアルコールを用い、 同様に操作した。 冷 却'固化 ·成型'脱氷体 5.7 f (脱永率 1 ( oi多 )を得たが、 融 . 解後は 5 に いても軟弱化し、 少量のゲル層のほかに、 多量の ボリビニルアルコール浸厚永溶液が層分離するのを認めた。
す ¾わち、 けん化度の低いボリビュルアルコ ールを甩 ても、 本発明の酎永性酵素包埕ケ'ルは得られる 。
比較例 3.
実旎例 1のボリビュルアルコ ールのかわ！)に、 けん化度 9 9.2 モル多、 粘度平均重合度 500、 4 水溶液の粘度（ 2 0 C ) 5.6 <; J3の TfJ販ボリビ-ルアルコ ールを用い、 同様に操作したが、 寒 天に似たもろいゲル 5. 7 f (脱永率 1 Owi ；)が得られたにすぎ ず、 ほとんど弾性は認められ いこと'を知った。
す ¾おち、 重合度の低 ボリど-ルアルコ ールを用いても、 本 発 の機械的強度の優れたゴム状の、 酵素含有弾性ゲルは得られ い。
比較夠 4.
実 に いて、 ポリビュルアルコ ール -酵素の永溶液を一 4 0 Cに て 6 A冷却'固化.成型後、 常温に て 3 放置 した。 ¾祜¾ -任グル ^ jlが生腐したが、 汪に乏しく、 引張 ]3強度としては、 わずかに 0. 3 Z ^で既に切新された。 ま た、 このゲル 1 を永 に浸 ¾したところ、 約 2 0 で形くず れし、 永層は濁 ]5、 ボリビ ルアルコールがかる]?溶 したこと を知った。 - このよう 、 たとえ、 ボリビ-ルアルコール *酵素の永溶液に 冷却 ·固化 ·成型を施しても融解後、 強度が低く酎永控の乏し 粘着倥ゲルが得られるにすぎず、 本発明に従い、 冷却 *固化'成 型後、 齄辯させずに部分脱永する操作を施さ ¾ かぎ 1 本発钥 に述べる強度の高い] I†永 Sの餑素包埕ケ 'ルは生成し 。
実施例 1で得られるヒドロゲルパイブ（長さ l )を 4 OTごと - に切新し、 それらにつき、 セリ シン（ seWci»：)溶出処理済みの 編み絹糸（ JIS M. 1 ，直径 0. 1 « , 120C X 3 0 钹茵済 )、 カグ トダート（ c ί^ίί , 腸線、 直径 0. 1 8 as、 エチレンォキシ ド 茵済）、 デキソン糸（ボリダリ コール蒙糸、 直径 0. 1 8 «、
120 X 3 0 該菌済） ¾らびに ta.per cut針を使招して、 たが いに物合し、 糸間陽 1. 5： ^として縫合試験を行う。
ずれの種類の籙合糸の場合にも、 '本¾ ^の餑素含有ヒドログ ルバイブは容易に縫合され、 錢目に ける 損 く生じるかつ たことから、 生体血管への.後合にも、 十分 えうると見 ¾された。 またこのヒドロゲルパイブについて実 饲 2と同様の抗血卷注 試験を行 ¾つた結 発生はほとんど見られなかつた。
実^例 3.
市 ボリビニルアルコール Cけん化変 7モル ，轱変平均重
C FI 合度 1,800、 4 水溶液の粘度（ 20 C ) 28cJ° )の粉末 86
(含水率 7wi多）を、 piT7.5のトリス緩衝液 914fに溶解し、 8.Qwi^とした。
この水溶液 41 を、 実施例 1に準じ弒菌し、 この永溶液へ、
L -ァスパラギナーゼ（凍結乾燥粉末 lyo≠ylize!d powder 250 wiit 82¾¥を、 33 Cに いて混合した。底面 7 X 7 の 角形ボリエチレン製容器へ、 上記水溶液 40 ^を注入し、 一 50 Cで 6 冷却する。 しかる後、 これを 解させる^と ¾く、 6 h の真空脱水を施す o 次に真空を破 、 成型体（厚さ約 7»)を取 ])出し、 ^解したところ、 33 （脱永率 1 8wi多、 含水率 90 wt^の白色不透明ゲルを得た。
このヒ.ドロゲルから、 20i«X 13 «X 5 «の断片を切取]?、 生体内埋入試験試料とする。
家兎（体重 2.5 ¾ )の背部皮膚を剃毛し、 ク 口へキシジンの 0.5 ェテ ア コール溶液を塗布し、 さらに.70 ェチルアル コールを用 そ消毒後、 皮膚を約 L 5 切開し、 ェチルアルコー ルによる消毒を施した上記試験試料を埕入 、 皮虜を鐽合した。
この場合、 皮膚切開線が埋入試料上に位置し いよう留意した。
24 後の所見としては、 皮膚 とわずか 腫腸を認め、
試料を皮虜面上かち指触すると、 試料は、 皮下組織の剝離部分を 移動する。 3日後、 腫腸と発赤は消失し、 6日後抜糸した。 8日 後、 試料は既に固定され、 指蝕しても移動しない。 その後 1力月 間、 埋入局所に変化 く、 全身にわた i?¾んらの症状.も焦い。 30 日後、 皮下組緣をも含めて、 試料を摘出したが、 試料は袪包組織
OMPI WIPO一 に包まれて 、 稆互間の癒着は認められ ¾ が、 密着抆態を呈 していた。 この被包組緣を 1 0 56ホルマリ ン処理（固定）後、 ッ エロィジンに包埋し、 へマトキシリン、 ェォジン重染色とワンギ 一ソン氏染色を実施して観察したところ、 偽好酸球と円形化組緣 球が少数認められるものの、 細胞浸潤はきわめて軽度で、 炎症反 応はほとんど欠如している。
—方、 縫合糸として用いた c fl^i の周囲には、 抜糸後も強度 の異畅性組綠反応が認められた。 また、 比較のため前記と同様の
2 O ffl» 1 3 asX 5 «の海綿を、 同様に家兎背部皮下に埋入した 場合、 ¾ ^と腫腸の消失に 1 4日を要し、 1力月後の摘出所見に よれば、海綿の寸法が 1 0 程度滅少して ]?、 海綿周辺部に強 度の細胞浸潤と多数の異物性巨細胞を認め、 膿瘍化している。 メ チルメタクリレート樹脂についても、 同様に比較試験したが、 発 赤と腫腸の消失に 1週間を要し、 偽好酸球の浸潤も著しい。す わち、 本発明のヒドロゲルのほうが生体適合性の点に いて、 は るかに優れることを知った。
実施例 4.
実施飼 3で得たヒドロゲルの切断片 1 3 X 1 3 X 1.5 «を、 室 瘟に いて 2w グルタルアルデヒド水溶液へ 1 5 « 更に
に いて 8 浸漬 ¾ p iT 7. 5のトリス緩衝液 1 0 による洗淨を
1 0回反復することによ]?、 生体 SA試験片を作成した。家兎
(体重 2.5 K? )の膝関節内側を縦方向に 3 切開し、 四頭股筋の 内側を縦切して膝蓋骨を外僩へ脱臼させ、 膝関節を屈 ®させて関 節前部の脂肪組籙を切除し、 交叉靱帯を切断後、 後関節蓑以外の
OMPI WIFO 関節蓑 よび半月板を切除する。 次に、 大腿骨関節軟骨を削除し、 この軟骨に代えて、 上記試料を大腿骨関節面に挿入 ·固定後、 膝 闋節 150度屈曲位に いて、 大腿上部から足部までギプス包帯を 施し、 3週間後にこれを除いた。 この時点に いて、 関節には軽 度の腫腸を認めるが発赤局所熱感は無く、 一次性癒合も良好で、 分泌液は見られず、 膝関節は約 120 曲位をと 2 保護 ¾ίϊを 示す。他動的可動範囲は 1 5 0〜9 0° であった。組緣標本につき、 ホルマリン固定パラフィン包埋、 へマトキシリン、 ェォジン染色、 マロリ一染色を施し鏡検の結果、 大腿骨造形関節面は結合組緣に よ]?被覆されてお 1?、 揷入試料による反応住骨質増殖と骨髄腔内 炎症性反応はいずれも認められ ¾い。
一方、 同じく 1· 5 β»の厚みのメチルメタクリレート樹脂につき、 同様の比較試験を実施したところ、 3週間後の所見として、 関節 に腫腸のほか、 局所熱感を認め、 膝盖上部に波動を触知した。 ギ ブス包帯除去後の膝関節^:は、 他動的にわずか 9可動性を認める が、 自動的にはほとんど関節運勦が認められ ¾い。 また、 大腿骨 関節面には、 炎症性細胞浸潤と線維性癥«Μ纔とが認められた。
すなわち、 これらの.所見から、 本発明の酵素含有ヒドロゲルは生 体適合性の良 ことカ^ il明した。
実施例 5. '
実施例 に いて得たヒ ドロゲルの切新片 1 3 X 1 3 X 1. 5 » 8枚を、 同様にダルタルアルデヒ ド^ S後、 淨した。 6 C 3丑 EDリンパ肉腫細胞（ J' G. dd, · Εχρ· Mfid. , 98, 565, 582 (1953), J. D. Brooms , J, Bcp. Med. , 118, 99, 121 (1963) )
Οί·ίΡΙ
~ -r 600,000個を、 肋骨下方の足の付け根の剃毛部に皮下注射して
水胞を形成させたマウスの腹腔内へ上記切新片 8枚を埋植したと
ころ、 30日を経ても、 肉腫は、 肉眼によ 認めえず、 触診の結
杲も、 んら異常を認めなかった。 この間、 血漿中のァスバラギ
ン癀度は、 当初の 30 M( 400p3? )から、 翌日には (L2w
Jlf( 33)jw»)へ低下し、 その後も、 この状態が持続した。
比較例 5.
実施例 5に て 63 C EDVンパ肉腫細跑を皮下注射した
マウスの腹腔内へ、 単るる生理食塩水（ sa n* )2 を注射した
ところ、 7'日後、 皮下注射部の皮膚に、 直径 2〜 3 «の丘抆隆起
したリンパ肉腫（
Figure imgf000036_0001
twm wr )が見られた。即ち、 上記実
施例におけるァスパラギナーゼの腫疡 ^阻止劫果が明白である。
比較例 6.
比較例 5に ける生理食塩水の代]?に、 ァスパラギナーゼ粉末
を溶解し: ^理食塩水（酵素 2 « 500 vnit Tsl ) 2 を、
同様に腹腔内へ注射したところ、 11日後に、 リンパ肉腫（直径
3«ι)が^した 0
とのように、遊離のァスパラギナーゼを投与しても、 ""^にそ
の有効持続期 の短いことは既に指摘されると 1?で、 この異種
蛋白力性体内の蛋&質分解酵素の攻擎を受け、 比較的早期に消镔
するためと考えられてお 、 したがって、 通常、 多量のァスパラ
ギナーゼを、 6あごとに、 ある は隔日に反復投与する試みが採
られ - Mts bum et l.t Biochem. JBiofhys . Res. Commr vn, , 12， 50 (1963), R* H. Mamson et al.r Cancer Oie ther.
、 i¾p. , (l) 52, 617 (1968))、 これによ！?、 しばしば漦しい副作用 を招く。 これに対し、 実施例 5に述べた本発明の固定化'酵素剤の 持続有効性が明白である。
実施例 6.
下顎部に 3 0 X 3 0 »«の浮腫を有し、 食欲不提、' 扁桃腺肥大、 軟口蓋の肥大と炎症などの症状を呈するビーグル犬（メス， 5歳、 6 ）が、 生体細胞検査によ 、 リンパ腫と された。
実施例 5の方法によ 得られたァスパラギナーゼ固定化ヒドロゲ ル新片 8枚を、 このィヌの腹腔へ埕入した。翌日、 ィヌの食欲が 回復し、 2'日後には、 リンバ瘤は軟化し、 しかも 3 X 3 ssに縮小 し顕徵鏡観察によ 、 退化リンパ芽細胞が観察された。 更に 2日 後には、 リンパ瘤は消失し、 5 0日後も異常を認めるかった。
実施例 7.
下顎下方に 3 0 X 3 5 の表在性リンパ肉腫を有し、 食欲不提 と昏睡拔態にある 6歳のィヌ .オ : 2. 9 4 ¾ )のリンパ瘤を生体 細胞検査し、 リンパ肉腫症 診新さ^れた。
実施例 5の方法によ 1?得られたァスパラギナーゼ固定化ヒ ドロ ダル切断片 8枚を、 このィヌの Jgj^埋植したところ、 2.日後に 食欲は回復し、 触診によ]?、 リンパ瘤の軟化が確認された。
更に 2日後、'リンパ瘤は 2 X 2 anへ縮小し、 ィヌの様態は好転 した。
更に、 2日後、 リンパ瘤はほぽ消失し、 生体細胞検査によ 、 皮質（ coriea? ) には多数の壊死部分と有糸分裂状状態の未分化 リンパ芽細胞島が見られた。 お 3日後には、 リンパ芽細胞が検 出され いまでに回復した。
実施例 8.
ひかがみ popliteal )部に 4 0 x 3 5 «の表在拄リンバ瘤を 有し、 しばしば嘔吐を反復し、 リンパ節瘤炎症、 脾肥大、 扁栊腺 肥大、 陰囊浮腫を示す 5歳のシェパード犬（ 3.4 K? )に、 嘔 阻 止の目的でアトロビンを投与後、 その腹腔へ、 実旌例 5の方法に よ 得られるァスパラギナーゼ固定化ヒドロゲル断片 8枚を埋植 した結果、 3日後、 ィヌの食欲と体力は回復し、 リンバ瘤は 2 X 2 «まで綜小し、 脾肥大と扁桃腺肥大も著しく輊渎され、 «の 浮腫は 失した。血清尿酸と血中尿素窒素分、 赤血球数、 白 数はいずれも異常なく、 更に 3日後にリンパ癀も消失した。

Claims

〔請 求 の 範 囲〕
1, けん化度 9 7モル 以上、 粘度平均重合度 1, 8 0 0以上のボ
リ ビ -ルアルコールを 6wi 以上含み、 しかも、 白血病治療用
ァスパラギナーゼを含む水溶液を、 任意形状の容器または成型 用鴒型へ注入し、 とれを一 1 5 Cよ 低い温度で冷却 *固化 · 成型した後、 この成型体を、 融解させることるく、 脱水率 5wi
多以上に到達するまで、 部分的に脱水し、 しかる後、 含水率 45 〜 9 2w に到達させることを特徵とする白血病治療用 I -ァ
スパラギナーゼ固定化剤の製造法。
2. 水溶 にへパリ ンを することを特徴とする請求の範囲第
I項に記載の方法。
3. 水溶液中のボリビ-ルアルコールの漫度が 6〜2 5wi多であ
ることを特徴とする請求の範囲第 1項又は第 2項に記載の方法。
4. 冷却 ·固化 ·成型温度が一 3 5 C以下であることを特徵とす
る請求の範囲第 1項〜第 3項のいずれかに記載の方法。
5. 部分脱永における脱永率が 1 5wi 上であることを特徵と
する請求の範囲第 1項〜第 4項のいずれ に記載の方法。
6， 部分脱水が真空乾燥によって行 ¾われることを特徵とする請
求の範囲第 1,項〜第 5項のいずれかに記載の方法。
7. 部分脱永の後 ^得られたゲルを永に浸漬することを特徵とす
る請求の範园第 1項〜第 6項のいずれかに記載の方法。
C:.'FI wiro .
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