CH659393A5 - Verfahren zur herstellung von immobilisierten l-asparaginasepraeparaten zur behandlung von leukaemie. - Google Patents

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf die Herstellung von immobilisierten L-Asparaginasepräparaten für die Behandlung von Leukämie. Im besonderen betrifft es ein Verfahren zur Herstellung von enzymatischen, die Leukämie heilenden Präparaten durch Einbettung (Immobilisierung) von Asparaginase, einem Antileukämie-Enzym (L-Asparaginase), in ein stark wasserhaltiges Gel mit ausgezeichneter Antithrom-bogenizität und mechanischer Stabilität.

Stand der Technik

Die JP-A-52-151 723 beschreibt L-Asparaginasepräpara-te, die durch Beschichten eines L-Asparaginase enthaltenden Human-Fibrinogens auf ein hitzeresistentes Grundgewebe mit adsorbiertem oder gebundenen Thrombin erhalten wurden. Diese Entgegenhaltung offenbart weder, noch schlägt sie die Verwendung von Polyvinylalkohol zur Herstellung des Präparates vor.

Die JP-A-50-29 728 beschreibt eingebettete Enzym-Fiberprodukte, erhalten durch Bedecken von Fiberprodukten und daran Anbringen eines Enzyms wie die L-Asparaginase mit einer halbdurchlässigen Membran, die aus Polymeren von zusammengesetzt ist, worin Ri Wasserstoff oder Niedrigal-kyl, R2 (R.30)nR4, R3 ein Niedrigalkylen, R4 Wasserstoff oder Alkyl und n eine ganze Zahl, die mindestens 1 ist, bedeutet. Auch diese Entgegenhaltung offenbart weder, noch schlägt sie die Verwendung von Polyvinylalkohol vor.

Es wurde schon lange gezeigt, dass Asparagin (eine na-s türliche Aminosäure) für das Wachstum von Leukämiezellen essentiell ist. In der Leukämietherapie wurden ausgedehnte Untersuchungen bezüglich Elimination von Asparagin, welches für normale Zellen nicht notwendigerweise nötig ist (nicht essentiell), aus dem Blut durchgeführt, und es wird er-lo wartet, dass diese Art von Therapie bei normalen Zellen keine Schädigung verursacht [L. T. Mashburn et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 12, 50 (1963)]. Während in normalen Zellen das Asparagin durch Asparaginsynthetase, ein Asparagin synthetisierendes Enzym, aus Asparaginsäure 15 oder Asparaginsäuresalzen gebildet wird, benützen Leukämiezellen für die Proteinsynthese das in kleiner Menge im Blut vorkommende Asparagin, da sie selber infolge Tumorgenese über eine mangelnde Asparagin-Synthese-Aktivität verfügen und selber kein Asparagin bilden. Deshalb basiert 20 die Therapie auf der Idee, die Proteinsynthese (Wachstum) von Leukämiezellen zu verhindern, indem man dem Blut von Patienten Asparaginase hinzufügt, um das im Blut vorhandene Asparagin abzubauen (man erzeugt einen Aspara-ginmangel und erhält ihn aufrecht).

2s Man zeigte, dass für die Therapie von gewissen Leukämiearten und festen Tumoren, die lymphatische Leukämie eingeschlossen, verschiedene Asparaginasen nützlich sind. Man wurde auf diese Behandlungsweise als eine spezifische und günstige therapeutische Idee aufmerksam, welche die 30 Hemmung des Leukämiezellwachstums ohne Schädigung der normalen Zellen beinhaltet [H. Marquardt, Arzneimit-tel-Forsch., 18, 1380(1968)]. Unter Verwendung von Asparaginase von Escherichia coli B wurden ausgedehnte klinische Untersuchungen durchgeführt [R. H. Adamson et al., 35 Cancer Chemother. Rep., (1) 52, 617 (1968)]. Als Resultat dieser Versuche wurde betont, dass die durch die Verabreichung eines fremden Proteins bewirkte Antigen-Antikörper-Reaktion (Immunreaktion) beim Menschen ein Problem darstellt; zusätzlich wurden Nebenwirkungen wie Erbrechen, 40 Nausea, Anorexie, Pyrexie, Gewichtsverlust, Hypohepatie, Pankreatitis, Oligochromämie, Urämie, Fibrinogenopenie, Hyponoia, Hautausschlag, Diarrhö, Pararitium, Anämie, Leukopenie, Thrombopenie, anaphylaktischer Schock, Kopfschmerzen, Gefässschmerz, Reizung und Krampf beob-45 achtet [P. Laboureur, Pathol. Biol. (Paris), 17, 885 (1969)]. Demzufolge hielt man diese therapeutische Methode trotz der fehlenden Schädigung von normalen Zellen für wenig nützlich und im Gegensatz zu früheren Erwartungen wurde in gewissem Umfang eine Kombinationstherapie mit chemo-50 therapeutischen Präparaten wie Prednison, Vincristin, Methotrexat, 6-Mercaptopurin, Cytarabin und Cyclophospha-mid, und Bestrahlung durchgeführt. Falls man Mittel finden würde, diese durch fremde Proteine hervorgerufene Immunreaktion zu unterdrücken, wird erwartet, dass diese Behand-55 lungsmethode erneut grosse Hoffnungen erwecken würde. Als eine mögliche Lösung dieses Problems wurde vorgeschlagen, das Blut zeitweise dem Körper zu entziehen, mit immobilisierter Asparaginase (Enzym in makromolekulares Material eingebettet oder an dieses gebunden) in Kontakt zu 6o bringen, das im Blut gelöste Asparagin dadurch zu zersetzen, und dann wieder in den Körper zurückzuführen (Kreislauf ausserhalb des Körpers) [D. Sampson et al., Trans. Am. Soc. Artif. Intern. Organs, 18, 54 (1972)]. Bei diesem Plan jedoch stellte sich die Koagulation des Blutes, hervorgerufen durch 65 den Kontakt mit dem enzym-immobilisierenden Material (makromolekulares Material), als neues Problem heraus, ob-schon die Immunreaktion mit dem fremden Protein (Enzym) durch Verwendung einer entsprechenden Immobilisierungs

3

659 393

technik stark abgeschwächt (oder aufgehoben) werden konnte.

Behelfsmässig könnte man in Anbetracht einer geringen Antithrombogenizität in jeglichem bekannten enzym-immo-bilisierenden Material dem Blutstrom ein Antikoagulans wie Heparin zufügen. Die kombinierte Verwendung von grösseren Mengen Arzneimittel, Heparin eingeschlossen, über einen längeren Zeitraum selber ist nicht wünschenswert. Demzufolge lag der Wunsch nahe, ein makromolekulares Material zu entwickeln, welches nicht nur fähig ist, die Asparaginase zu immobilisieren und zu erhalten, sondern welches auch eine Immunreaktion mit dem Enzym verhindern und beim Kontakt mit dem Blutstrom keine Thrombosen machen sollte.

Die vorliegende Erfindung bringt neue antithrombogene makromolekulare Materialien zur Immobilisierung des Enzyms, welches für die vorgenannten Bedürfnisse geeignet ist.

Die durch Oberflächenkontakt von synthetischem oder natürlichem makromolekularem Material mit Blut entstehenden Thrombosen oder Ablagerungen von Blutkomponenten wurde schon lange als wichtiges Problem erkannt, welches bei der Entwicklung von künstlichen Ventilen, Blutgefässen, Nieren, Kathetern und ähnlichem überwunden werden muss. Die Bemühungen wurden fortgesetzt, Materialien zu finden, welche sich kaum als fremde Materie gegenüber Blut verhalten, d. h. kaum Thromben verursachen, welche auf der Zerstörung von Blut beruhen.

Es wurden eine Anzahl Versuche durchgeführt, um eine minimale Menge eines Antikoagulans in die Prothesenoberfläche mit der Idee einzubringen, damit das Antikoagulans nicht überall im Körper (Blutkreislauf) gegenwärtig ist, um eine Koagulation des Blutes durch den Kontakt mit der Prothesenoberfläche zu verhindern. Zum Beispiel ist die Anwendung eines Antikoagulans wie Heparin, Hirudin oder Antithrombin, eines Plättchen-Agglutinationshemmers wie Adenylcyclase, Prostaglandin E oder Methylxanthin, oder eines Fibrinolyseaktivators wie Urokinase oder Streptokinase auf der Prothesenoberfläche, deren Adsorption durch Ionen-Bindung von funktionellen Gruppen und deren Fixation auf der Prothesenoberfläche durch kovalente Bindungen bekannt. Jedoch ist diese Anwendungs- oder Adsorptionsmethode nachteilig, weil das Antikoagulans sowie andere Agenden rasch eliminiert werden und so nur eine kurze Wirkungsdauer haben. Die Methode der kovalenten Bindung zeigte sich als ebenfalls nicht brauchbar, weil oft eine durch die Anwendung einer chemischen Reaktion begleitende Zerstörung des Antikoagulans eintritt und durch die Einführung von kovalenten funktionellen Gruppen die Möglichkeit besteht, am Körper gegenteilige Reaktionen hervorzurufen; es wird auch erwartet, dass der Effekt nicht genügend gross ist, wenn das Antikoagulans mit kovalenten Bindungen fixiert wird [H. Tanzawa et al., Trans. Am. Soc. Artif. Intern. Organs, 19,188 (1973)].

Um diese Schwierigkeiten zu verhindern, wurde versucht ein Antikoagulans in eine Prothese zu mischen und dort einzubetten [H. Tanzawa et al., Trans. Am. Soc. Artif. Intern. Organs, 19,188 (1973)]. Es wurde jedoch daraufhingewiesen, dass das Antikoagulans innert kurzer Zeit vollständig ausgewaschen (befreit) wird, wenn es nicht durch eine chemische Bindung fixiert (eingefangen) ist. Es wurde festgestellt, dass diese Zeitperiode 5 —8 Stunden, längstens aber 5 Tage beträgt. Deshalb ist das Bedürfnis nach neuen, besseren gerinnungshemmenden Materialien gross.

Die vorliegende Erfindung liefert neue, stark gerinnungshemmende medizinische Materialien, Hydrogele mit grosser mechanischer Stabilität.

Die Erfindung liefert ein Verfahren zur Herstellung von immobilisierten Enzympräparaten durch Einbettung von

Asparaginase in ein bestimmtes antikoagulierendes Hydro-gel.

Die Erfindung liefert Präparate mit immobilisiertem Enzym, in welchen die L-Asparaginase beständig in ein medizinisches Hydrogel eingebettet wird, ohne jeglichen Schaden genommen zu haben, da keinerlei konventionelle chemische Reaktionen unter Verwendung von chemischen Reagentien oder Bestrahlungen verwendet wurden.

In der vorliegenden Erfindung wird Polyvinylalkohol als Ausgangsmaterial zur Herstellung von gerinnungshemmendem Hydrogel verwendet. Es wurden viele Methoden zur Gelbildung (Herstellung von Hydrogelen) von Polyvinylalkohol vorgeschlagen. Wie im folgenden zusammengefasst bringen jedoch alle Methoden Probleme in Wirksamkeit oder Produkteigenschaften mit sich.

(1) Durch Lufttrocknung einer wässrigen Polyvinylalkohol Lösung erhält man einen feuchten oder trockenen Film, welcher jedoch schwach ist, eine geringe Beständigkeit gegenüber Wasser und keine Festigkeit in Wasser hat und nur für beschränkte Anwendungen verwendet werden kann (Jap. Pat. Publikation No. 9523/1965).

(2) Auch bei Zufügen einer Säure zu einer wässrigen Suspension von Polyvinylalkohol und Tetraäthylsilikat wird ein ähnlicher Film wie unter (1) beschrieben erhalten. Bei dieser Methode wurde auch eine Gefriertrocknung nach Zufügen einer Säure zu einer wässrigen Lösung vorgeschlagen. Der daraus resultierende Film jedoch ist von geringer Stabilität und ist kaum formbar (Jap. Pat. Publikation No. 30358/ 1980 und 11311/1980).

(3) Eine Geliermethode, welche Bestrahlung einer wässrigen Lösung von Polyvinylalkohol mit Kobalt 60 (Gammastrahlen) vorsieht, ist gut bekannt. Diese Methode benötigt nicht nur eine spezielle Ausrüstung (Einrichtungen für die Bestrahlung), sondern weist auch hohe Bestrahlungskosten auf und liefert nur schwache Gels, welche zusätzliche Verfestigungsprozesse (sekundäre Verfestigung) erforderlich machen. Deshalb zeigt das nach dieser Methode hergestellte Gel nur eine geringe Verwendungsmöglichkeit, ausgenommen spezielle Anwendungen wie künstliche Glaskörper (flüssige Füllung für das Innere eines Augapfels) für welche eine sehr viskose Flüssigkeit (oder ein weiches Gel) erwünschenswert ist (J. Material Sei., 1974, 1815 und Jap. Offenlegung No. 55647/1975).

(4) Ferner war schon lang bekannt, dass eine wässrige Lösung von Polyvinylalkohol nach Mischen mit Borsäure (oder einer wässrigen Lösung von Borax = Natrium tetrabo-rat Decahydrat) sofort geliert. Das daraus hervorgehende Gel ist jedoch schwach und flüssig; ausserdem zerreisst er, wenn man ihn mit den Fingerspitzen aufnimmt, sodass es schwierig ist, die ursprüngliche Oberfläche nach einer Formgebung zu erhalten [J. Am. Chem. Soc., 60, 1045 (1938) und Franz. Pat. No. 743942 (1933)].

Obwohl das Boraxgel in alkalischer Lösung beständig ist, fallt er bei einem pH von höher als 8 zusammen. Deshalb ist er kaum brauchbar und für eine medizinische Anwendung von geringem Wert.

(5) Es wurden auch verschiedene Gelierverfahren für Po-lyvinylalkohole unter Verwendung von Phenolen wie Phenol, Naphthol oder Kongo Rot, einer Aminoverbindung oder einer metallischen Verbindung wie einer Titan-,

Chrom- oder Zirkon-Verbindung vorgeschlagen. In all diesen Verfahren stiess man jedoch auf die gleichen Nachteile wie in (4) (Jap. Pat. Publikation No. 9523/1965 und 23204 1965).

(6) Es ist ebenfalls bekannt, dass ein Polyvinylalkohol unter Verwendung eines kreuz-verknüpfenden Reagens oder einer kopolymerisierenden Verbindung wie einem Aldehyd, einem Dialdehyd, einem ungesättigten Nitrii, einem Diisocy-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

659 393

anat, Trimethylolmelamin, Epichlorhydrin, Bis(beta-hydro-xyäthyl)sulfon, Polyacrylsäure, Dimethylolharnstoff oder Maleinsäureanhydrid geliert werden kann. Diese Methode erfordert jedoch ein Verfahren, mit einem chemischen Reagens und liefert auch kaum einen festen, stark wässrigen Gel [Textile Res. J., (3) 189 (1962) und Brit. Pat. No. 742 900 (1958)].

(7) Ebenfalls war seit langem bekannt, dass eine Lösung von wässrigem Polyvinylalkohol durch Stehenlassen bei einer tiefen, nicht über 40 °C, oder besser bei einer zwischen 5 und 18 °C oder tiefer liegenden Temperatur geliert werden kann.

Bei Raumtemperatur gebildete Gels sind jedoch leicht verletzlich wie Agar oder Carrageen. Überdies lösen sie sich allein schon bei starkem Rühren, durch Rühren nach Zugabe von Wasser oder bei schwachem Erwärmen.

Es ist auch bekannt, dass es vorzuziehen ist, eine tiefe Temperatur zur Herstellung des gekühlten Gels aus einer wässrigen Lösung von Polyvinylalkohol zu verwenden. Zum Beispiel ist es bekannt, die Herstellung bei 18 °C, bei einer tiefen, nicht höher als 0 °C oder einer noch tiefer liegenden Temperatur durchzuführen [Polymer J., 6,103 (1974)].

In jedem Fall aber ist das so erhaltene Gel schwach (oder eine viskose Flüssigkeit) wie Agar, Carrageen oder Gallerte. Es ist nicht nur sehr klebrig, sondern auch wenig widerstandsfähig gegenüber Wasser, sodass es in Wasser quillt, sich stark ausdehnt und weich wird; es löst sich im Wasser teilweise auf und das Zurückbleibende ist kleisterartig. In Wasser oder in warmem Wasser von 40—50 °C deformiert sich das Gel noch rascher, fällt auseinander oder löst sich im Wasser auf. Diese Nachteile machen es für eine medizinische Verwendbarkeit kaum wertvoller.

(8) Schwammartige Produkte, aus Polyvinylalkohol durch Formung erhalten, waren auch seit langem bekannt. So wie diese im Gewebe instabil sind, wo sie zersetzt oder degeneriert werden, rufen sie unter den gegebenen Umständen gegenteilige Reaktionen hervor, sodass deren Verwendung vor kurzem eingeschränkt wurde [J. R. Lewis, Plastic + Re-constructive Surgery, 35, 51 (1951)].

(9) Es ist ebenfalls bekannt, dass man eine kleine Menge Polyvinylalkohol zu einer wässrigen Lösung von einer wasserlöslichen macromolekularen gelierfahigen Substanz wie Agarose, Agar, Albumin, Alginat, Curdlan, Carrageen, Ca-sein, CMC, Furcellaran, Gelatine, Methylcellulose, Pectin, Stärke, Tamarinde Gummi, Xanthangummi, Tragakanth-gummi oder Guarmehl geben kann, diese Mischung kühlt, in ein ein Geliermittel enthaltendes Bad (Koagulationsbad) taucht oder gefriertrocknet (Jap. Pat. Publikation No.

25210/1981 und 25211/1981). Auch bei diesem Verfahren wird nur eine schwach viskose gegenüber Wasser wenig beständige Flüssigkeit, ein nichtflüssiges Gel oder ein wasserlösliches Pulver erhalten.

Als Ergebnis von Studien über die Entwicklung eines Verfahrens zur Herstellung von wasserunlöslichen, anti-thrombogenen, stark wasserhaltigen immobilisierten Enzympräparaten mit ausgezeichneten mechanischen Eigenschaften durch Verwendung von Polyvinylalkohol wurde durch uns gefunden, dass stark wasserhaltige Gels mit eingebettetem Enzym und einem Wassergehalt von 45—92 Gew.% hergestellt werden können, indem man eine wässrige Lösung von Polyvinylalkohol und Enzym kühlt, bei einer Temperatur von kleiner als —15 °C verfestigen lässt und formt und anschliessend unter den genannten Bedingungen im Vakuum ohne Auftauen teilweise entwässert (U. S. Pat. Appi. No. 344 006). Die vorliegende Erfindung offenbart die Weiterentwicklung der oben genannten Befunde. Die entsprechend der Erfindung erhaltenen Hydrogele bewirken keine Schädigung der L-Asparaginase, da während des Geliervorganges und deren Vorbehandlung weder Säuren, Alkalien, Radikalquellen, Bestrahlung, organische Lösungsmittel, Reagentien noch anorganische Lösungsmittel ausser Wasser verwendet werden müssen, welche bis jetzt normaler-s weise bei der Gelbildung oder Immobilisierung des Enzyms benötigt wurden. Im weiteren zeigen die entsprechend der Erfindung erhaltenen Gels einen hohen Wassergehalt, eine gummiähnliche Elastizität und hohe mechanische Festigkeit. Die Gels der Erfindung sind auch unlöslich in kaltem oder io warmem Wasser, nicht klebrig und unterscheiden sich damit vollständig von den zuvorgenannten durch Kühlung einer wässrigen Lösung von Polyvinylalkohol erhaltenen Gels. Somit liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von L-Asparaginase immobilisierenden Produkten 15 durch Verwendung eines neuen antithrombogenen Gels, welches sich vollständig von früheren Entdeckungen bezüglich Gelbildung aus wässrigen Polyvinylalkohollösungen durch Kühlung oder chemischer Behandlung der Lösung unterscheidet.

20 Diese Erfindung basiert auf der Entdeckung, dass stark wasserhaltige Gels mit ausgezeichneter Antithrombogenizi-tät hergestellt werden können, indem man ein gekühltes und verfestigtes Produkt, welches unter den genannten Bedingungen aus einer wässrigen Lösung von Polyvinylalkohol 25 und Asparaginase erhalten wurde, ohne zu schmelzen einer teilweisen Entwässerung unterwirft, und dass die in diesem stark wasserhaltigen Gel eingebettete (gefangene) Asparaginase fähig ist, das Asparagin im Blutkreislauf zu zersetzen und zu eliminieren, ohne an der Oberfläche des Gels, durch 30 den das Blut fliesst, Thromben zu bilden.

Darstellung der Erfindung Diese Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von antithrombogenen immobilisierten Enzymprä-35 paraten für die Behandlung von Leukämie, welches beinhaltet, dass man eine wässrige Lösung, welche 6 Gew.% oder mehr eines Polyvinylalkohols mit einem Hydrolysierungs-grad von 97 Mol% oder höher und einem durchschnittlichen Polymerisationsgrad von 1800 oder mehr enthält, zusammen 40 mit L-Asparaginase (Asparaginase, L-Asparagin-amidohy-drase), einem Asparagin zersetzenden (hydrolysierenden) Enzym in ein Gefäss oder eine Form mit entsprechender Oberfläche leert, diese Lösung kühlt, bei einer Temperatur von kleiner als — 15 °C verfestigen und formen lässt und die-4s se geformte Masse ohne auftauenzulassen partiell bis auf eine Rate (Grad der Gewichtsabnahme der gekühlten, verfestigten und geformten Masse) von 5 Gew.% oder mehr entwässert und wenn gewünscht, das Produkt bis auf einen Wassergehalt von 45 — 92 Gew.% (auf einer Feuchtgewichtsso basis) ins Wasser eintaucht.

Bester Weg zur Ausführung der Erfindung Es ist erforderlich, dass der Hydrolysierungsgrad des in der vorliegenden Erfindung verwendeten Polyvinylalkohols ss 97 Mol% oder höher, vorzugsweise 98 Mol% oder höher ist. Die Verwendung eines Polyvinylalkohols mit einem Hydrolysierungsgrad von 80 — 88 Mol%, besonders bei einem solchen von 85 Mol% und weniger ergibt nur ein schwaches Gel, was nicht dem Gegenstand der Erfindung entspricht. 60 Der erforderliche Polymerisationsgrad des gemäss der vorliegenden Erfindung verwendeten Polyvinylalkohols beträgt 1800 oder mehr. Mit einem Polymerisationsgrad von 300—1500, im besonderen mit einem solchen von 1100 und kleiner bildet sich nur eine viskose Flüssigkeit oder ein weiss ches Gel. Nach der vorliegenden Erfindung ist es gewöhnlich bequem, käufliche Produkte mit einem höheren Polymerisationsgrad (Grad der Polymerisation zwischen 1800 und 2600) zu verwenden, obwohl auch Polyvinylalkohole mit ei

5

659 393

nem Polymerisationsgrad von z.B. 1800—3300 gebraucht werden können.

Zunächst wird entsprechend der vorliegenden Erfindung eine wässrige Lösung eines Polyvinylalkohols mit einer Konzentration von 6 Gew.% oder höher hergestellt. Die Konzentration des Polyvinylalkohols kann z. B. 6—25 Gew.% sein. Obschon die Konzentration höher, bis ungefähr 90 Gew.% sein könnte, wird die Viskosität der wässrigen Lösung bei Raumtemperatur den Wert 10 000 cP oder mehr erreichen und die Lösung wird noch viskoser oder die Gelbildung kann beginnen. Demzufolge wird die Verwendung von höheren Konzentrationen ein wenig Schwierigkeiten bei der Handhabung bereiten.

Obwohl die Konzentration auch erniedrigt werden könnte, z. B. auf 5 Gew.% oder weniger, wird die unten erwähnte Entwässerungszeit verlängert und die Kosten (Stromkosten für die Entwässerung) werden ansteigen.

Nebenbei erwähnt wird zu dieser wässrigen Lösung besser Tris(hydroxymethyl)aminomethan, Phosphate oder Ähnliches z. B. mit einem pH 7—8.5 als Pufferkomponente für die Asparaginase in der üblichen Art und Weise zugefügt.

Wenn erforderlich wird gemäss der vorliegenden Erfindung die wässrige Polyvinylalkohollösung vor der Zugabe der Asparaginase sterilisiert. Innert kurzer Zeit kann dies erreicht werden, wenn die Sterilisation während 5 Min. bei 100 °C durchgeführt wird. Wenn jedoch eine Kontamination mit hitzebeständigen Mikroorganismen vorliegt, wird eine Hochdruck-Dampfsterilisation z. B. während 15 Min. bis 6 Stdn. bei 120 °C durchgeführt. Wenn hingegen eine Sterilisation mit UV-Bestrahlung angewendet werden soll, ist es wünschenswert, wenn eine mit der vorgenannten Hitzesterilisation kombinierte Behandlung angewendet wird, da der vorhergenannte Prozess nur an der bestrahlten Oberfläche wirksam ist. Keine dieser Behandlungen führt zu einer Verschlechterung der in der Erfindung zu verwendenden Materialien und es entstehen keine Probleme bezüglich Durchführbarkeit der Erfindung.

Die sterilisierte Lösung wird dann mit einem zu immobilisierenden Enzym vermischt. Als gewöhnlich verwendetes Enzym wird die käufliche Asparaginase von Escherichia coli B des Typs EC-2 ohne weitere Behandlung verwendet. Abgesehen davon können auch Asparaginasen von Serratia mar-cescens, Proteus vulgaris, Bacterium cadaveris, Erwinia aroi-deae und Erwinia caratovora, und ferner von Meerschweinchenserum verwendet werden. Über diese Asparaginasen wurde schon berichtet, dass sie therapeutisch wirksam sind gegen Leukämie [L. T. Mashburn et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 12, 50 (1963), Arch. Biochem. Biophys., 105, 450 (1964), J. D. Broome, Nature, 191,1114 (1961), J. Exp. Med., 118,99,121 (1963)]. Diese können nützlich sein für die nebenwirkungsfreie Behandlung durch Einbettung in die Hydrogels der Erfindung, um die Immunreaktion zu verhindern.

Käufliche Asparaginase, als üblich wirksames Enzym gegen Leukämie, ist diejenige von Escherichia coli B des Typs EC-2, welche als gefriergetrocknetes Pulver oder in 50%iger wässriger Glycerinlösung erhältlich ist. Beide Formen können in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Das Hinzufügen des Enzyms zu der wässrigen Polyvinylalkohollösung wird mit Rücksicht auf die Hitzeentartung des Enzyms vorzugsweise bei einer Temperatur von 37 °C bis Raumtemperatur durchgeführt, obwohl dies auch bei Temperaturen von 70 °C und darunter durchgeführt werden kann.

Es ist vorzuziehen, die zugefügte Enzymmenge auf den siebten Teil der Menge an Polyvinylalkohol in der wässrigen Lösung zu begrenzen (ausgedrückt bezüglich Gewicht des gefriergetrockneten Pulvers), um den grössten Teil der Enzymmenge zu immobilisieren. Nach dem Schritt der später beschriebenen Gelbildung sind ungefähr 85 Gew.% oder mehr des Enzyms eingeschlossen.

Es wurde durch uns bestätigt, dass der Polyvinylalkohol der vorliegenden Erfindung selber eine hohe Enzym-schüt-zende Aktivität hat und keine zusätzlichen Enzym-schützen-den Agentien wie Glycerin, Asparaginsäure, Aspartate, Ca-sein und Ähnliches nötig sind. Zusätze von diesen bekannten schützenden Agentien können jedoch gemacht werden.

In der vorliegenden Erfindung wird die wässrige Lösung, welche nun sowohl Polyvinylalkohol wie Asparaginase enthält, in ein Gefâss von beliebiger Form oder in eine Form mit gewünschter Oberfläche geleert; man lässt abkühlen, verfestigen und formen. Während es doch vorzuziehen ist, eine Form mit einer der endgültigen Verwendung entsprechenden Oberfläche zu verwenden, kann eine Form mit beliebiger Oberfläche in der Absicht verwendet werden, nachher eine Umformung wie z. B. Schneiden vorzunehmen. Dies liegt im Rahmen der möglichen Formen gemäss der Erfindung.

Zum Kühlen, Verfestigen und Formen können z. B. Kühlmittel wie Natriumchlorid/Eis (23 : 77) ( — 21 °C) oder Calciumchlorid/Eis (30 : 70) ( — 55 °C), Trockeneis/Methanol (—72 °C) oder flüssiger Stickstoff ( — 196 °C) verwendet werden. Die Verfestigung und Formung werden nach Abkühlen auf —15 °C oder tiefer durchgeführt. Wenn die Kühlung ungenügend ist, wird die Oberfläche des Gels nach der weiter unten beschriebenen Dehydration nicht genau mit der gewünschten Oberfläche, nämlich der Oberfläche des ursprünglich verwendeten Gefasses oder der Form, in die die Polyvinylalkohollösung geleert wurde übereinstimmen. Zusätzlich wird die mechanische Stabilität des Gels geringer sein. Wenn auch flüssiges Helium eine Kühlung bis auf

— 269 °C erlaubt, ist es vom praktischen Standpunkt aus gesehen vorzuziehen, die Kühlung in einer Kühltruhe z. B. bei

— 35 °C oder tiefer durchzuführen. Ohne Kühlung, Verfestigung und Formung wird wie in den bekannten Verfahren nur ein Enzym enthaltender Polyvinylalkoholfilm, welcher in Wasser keine Festigkeit zeigt oder nur ein schwaches Gel gebildet; man kann so kein elastisches, stark wasserhaltiges, wasserfestes und antithrombogenes, gummiähnliches Enzympräparat (Hydrogel) gemäss der Erfindung herstellen. Beim erfindungsgemässen Kühlen, Verfestigen und Formen wird eine wässrige Lösung von Polyvinylalkohol in einer Form beliebiger Oberfläche verfestigt und geformt; anschliessend wird der obere oder untere Teil der Form oder beide, wenn überhaupt, entfernt und unter Erhaltung der Oberfläche wird dann der geformte Artikel einer Entwässerung unterworfen. Mit Rücksicht auf die Bequemlichkeiten in der Reaktion des immobilisierten Enzyms, der Diffusion des Substrates und des Reaktionsproduktes kann das Gel der Erfindung jede beliebige Form und Gestalt haben. Die gewünschte Gestalt des geformten Artikels kann durch Formen, wie sie in der chemischen Industrie für die Formung von Raschig Ringen, gelochten Platten, Telleretten, Intolax Sattelkörpern, Pali Ringen und Ähnlichem für Destillationstürme, Gasabsorptionstürme oder Ähnliches gebraucht werden, oder durch eine Form für eine Kolonne, in welche solches Material gefüllt wird oder durch eine Form für ein Rohr für einen Blutkreislauf ausserhalb des Körpers hergestellt werden. Eine Form für eine flache oder gebogene Platte mit Hinblick auf die U.S. Pat. Appi. No. 344 006 kann ebenfalls verwendet werden. Die durch solche Formen hergestellten immobilisierten Enzympräparate entsprechend der Erfindung sind bezüglich Aktivität des immobilisierten Enzyms wie der Übertragung der Masse im Kontakt mit dem Substrat besser. Sie sind auch besser bezüglich Druckabfall des ausserkörperlichen Blutkreislaufs welcher geringer ist als mit

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

659 393

einfachen Körnern, Platten, Filmen oder Mikropartikeln. Natürlich sind Körner, Späne von Platten und andere Formen durch die Erfindung abgedeckt. Die Kühlgeschwindigkeit des Kühlvorganges der oben beschriebenen Abkühlung, Verfestigung und Formgebung kann langsam, mit einer Rate von ungefähr 0.1 — 7 °C/Min. sein. Sie kann auch schnell sein, mit einer Rate von 7 —1000 °C/Min.

Nach Beendigung des wie oben in dieser Erfindung beschriebenen Kühlvorgangs und der Verfestigung einer in ein Gefäss oder eine Form geleerten gemischten wässrigen Lösung eines Polyvinylalkohol und eines Enzyms wird der geformte Artikel einer Entwässerung unter Vakuum unterworfen. Wenn die kalte, verfestigte und geformte Masse aus dem Kühlraum entfernt und sofort durch Absaugen entwässert wird, taut der verfestigte und geformte Artikel nicht auf, auch wenn keine externe Kühlung erfolgt, denn wie die Feuchtigkeit entfernt (sublimiert) wird, wird das Material gekühlt. Man kann in dem Masse erwärmen, wie der verfestigte und geformte Artikel nicht auftaut und die Entwässerung beschleunigt werden kann. Es ist eine Tatsache, dass die Temperatur im Dehydrationsschritt keiner speziellen Beschränkung unterliegt, vorausgesetzt dass der verfestigte und geformte Artikel nicht auftaut. Diese Temperatur hat keinen merkbaren Einfluss auf die Qualität des Gels. Der Entwässerungsgrad im Dehydrationsschritt ist 5 Gew.% oder mehr, was einen Wassergehalt des Gels von 20—92 Gew.%, vorzugsweise 60—90 Gew.% (Feuchtgewicht) ergibt. Der Wassergehalt kann auch 20 Gew.% oder weniger sein und kann anschliessend durch Eintauchen in Wasser auf einen Wassergehalt von 50—90 Gew.% erhöht werden.

In der vorliegenden Erfindung wird der Entwässerungsvorgang (Vakuumtrocknung) in gewissem Ausmass unabhängig von der Konzentration des Polyvinylalkohols beim kalten, verfestigten und geformten Artikel angewendet. Die Geschwindigkeit der Entwässerung (Grad der Gewichtsabnahme im gekühlten, verfestigten und geformten Artikel) in diesem Dehydrationsschritt beträgt 5 Gew.% oder mehr, vorzugsweise 15 Gew.% oder mehr. Da die Festigkeit des Gels in dem Masse steigt und solche Eigenschaften wie die Nichtklebrigkeit und die Resistenz gegenüber Wasser besser werden, wie die Entwässerung fortschreitet, ist die teilweise Entwässerung etwas Grundsätzliches in dieser Erfindung. Jedoch ist der Entwässerungsvorgang (Trocknung) nicht so stark, wie dies für eine Lyophilisierung von injizierbaren pharmazeutischen Lösungen oder für eine Gefriertrocknung von wasserhaltigen Lebensmitteln wie Kaffee, Milch, Fruchtsäften und Nudeln nötig wäre; die oben beschriebene partielle Dehydration ist genügend, um der Erfindung zu genügen. Wie oben beschrieben wird die Festigkeit des Gels mit fortschreitender Entwässerung bemerkenswert gesteigert, sodass der Dehydrationsgrad entsprechend der gewünschten Festigkeit gewählt werden kann.

Da dieser partielle Entwässerungsvorgang in jeglicher Anwendung der vorliegenden Erfindung etwas Grundlegendes und Bezeichnendes ist, wird es keinen Weg geben, ohne diese Dehydration solche wie in der vorliegenden Erfindung beschriebene antithrombogene, nichtflüssige, nichtklebrige, stark wasserhaltige Hydrogels mit vorzüglicher mechanischer Festigkeit zu erhalten. Wenn überdies die unter reduziertem Druck durchgeführte Dehydration des gekühlten, verfestigten und geformten Artikels nicht unter Erhaltung des gekühlten und verfestigten Zustandes, d.h. nach dem Auftauen durchgeführt wird, wird das Vorgehen infolge heftiger Blasenbildung undurchführbar werden, und es wird in der Folge nur ein trübes Gel von schwacher Elastizität gebildet, auch wenn die Dehydrationszeit verlängert wird.

Das Vakuum während der Entwässerung der Erfindung kann von jeder beliebigen Grösse sein, vorausgesetzt dass das Wasser des gekühlten und verfestigten Gegenstandes entfernt werden kann. Gewöhnlich wird ein Druck von 10 mmHg oder weniger, vorzugsweise von 1 mmHg oder weniger oder noch besser von 0.1 mmHg oder weniger verwen-s det.

Das aus der Kühlung, Verfestigung, Formung und teilweiser Entwässerung hervorgegangene Produkt der Erfindung lässt man nun z. B. bei normaler Temperatur stehen, damit es auftauen kann, was ein Gel von hoher Elastizität io liefert. Die Geschwindigkeit des Schmelzens kann entweder langsam mit einer Rate von 1 — 3 ' C/Min. oder schnell mit einer Rate von 3 —1000 :C/Min. sein. Der Schmelzpunkt eines Gels, welcher durch Stehenlassen einer wässrigen Lösung von Polyvinylalkohol bei einer Temperatur von ungefähr 15 0—30 °C beträgt 15—29 °C, wohingegen der Schmelzpunkt eines Gels der Erfindung 60 °C und höher ist. Deshalb kann zum raschen Auftauen warmes Wasser oder Luft verwendet werden. Da das Gel der Erfindung jedoch in heissem Wasser löslich ist und bei Temperaturen von 50 °C und höher an der 20 Oberfläche rasch einen zähen Film bildet, sollte ein Auftauen bei einer höheren Temperatur vermieden werden, und es ist wünschbar, dass das Tauen bei Temperaturen von 40—50 °C oder tiefer durchgeführt wird.

Nach dem Auftauvorgang kann das Gel leicht aus dem 25 Gefäss oder der stützenden Form entfernt werden. Es absorbiert innerhalb von 1—6 Stdn. Wasser bis zu einem Gehalt von 50—92 Gew.% (Feuchtgewicht), wenn es in sterilisiertes Wasser oder sterilisierte physiologische Kochsalzlösung gegeben wird, bleibt aber immer noch ein festes Elastomer. 30 Das Gel der Erfindung, welches wie oben erwähnt einen hohen Wassergehalt aufweist, weist eine hohe Elastizität auf. Wenn es stark ausgepresst wird, wird es für eine gewisse Zeit deformiert, erlangt aber sofort die ursprüngliche Gestalt ohne bleibende Veränderung wieder. Auch wenn eine er-35 wachsene Person mit einem Fuss oder beiden Füssen auf eine Gelplatte mit einem Wassergehalt von 88 Gew.% steht, deformiert sich die Platte vorübergehend und erhält ihre ursprüngliche Gestalt ohne bleibende Veränderung wieder. Bisher waren hoher Wassergehalt und grosse mechanische 40 Stabilität miteinander unvereinbar und stellten in der Entwicklung von medizinischen Polymeren ein Problem dar. Auf der andern Seite ist das Gel der Erfindung in beidem, dem Wassergehalt und der mechanischen Stabilität zufriedenstellend und ist ein neues Gel, welches sich vollständig 45 von den nach früheren Kenntnissen durch Lufttrocknung einer Lösung von Polyvinylalkohol erhaltenen Filmen oder nach früheren Kenntnissen erhaltenen wasserlöslichen Gels, welche durch Stehenlassen von wässrigen Lösungen von Polyvinylalkohol bei Temperaturen von 0 — 30 °C oder tiefer, so unterscheidet.

Auch wenn mit Druck auf den Gel der Erfindung eingewirkt wird, schwindet das darin enthaltene Wasser kaum. Wenn z. B. ein Kompressionsdruck von 4 kg/cm2 an ein Gel mit einem Wassergehalt von 90 Gew.% angelegt wird, 55 schwindet (fliesst aus) die Wassermenge nur 1 —2% der gesamten darin enthaltenen Wassermenge. Offenbar vom hohen Gehalt an wie oben beschrieben fest zurückgebundenem Wasser abhängig ist das spezifische Gewicht des Gels ungefähr so klein wie dasjenige von Wasser. Es sinkt kaum in 60 Wasser.

Das Gel der Erfindung weist keine Klebrigkeit auf. Auch wenn ungefähr 10 g eines zu Platten (8 mm x 8 mm x 2 mm), Zylindern (3 mm innerer Durchmesser, 6 mm äusserer Durchmesser und 6 mm Länge) oder Kugeln (4 mm 65 Durchmesser) geformten Gels während 40 Tagen in 50 ml sterilisiertem Wasser gerührt werden, beobachtet man weder eine Adhäsion zwischen den Kugeln noch eine Deformation der Teilchen. Es erfolgt keine Auflösung oder Änderung in

7

659 393

der Elastizität oder Festigkeit, wenn sie für ein Jahr in eine physiologische Kochsalzlösung eingetaucht werden. Dies steht in auffallendem Kontrast zur beobachteten durch einige Tage langes Eintauchen in Leitungswasser bewirkte Deformation von Teufelszungengel. Es steht ebenfalls in auffallendem Kontrast zu den Eigenschaften von solchem Gel, welches durch einfaches Kühlen (Gefrieren) von einer wässrigen Lösung von Polyvinylalkohol gebildet wurde, das eine hohe Klebrigkeit aufweist, das lediglich eine viskose Flüssigkeit darstellt oder im besten Fall gelatine-, pudding- oder agar-ähnlich und wenig widerstandsfähig gegenüber Wasser ist, sodass es sich im Wasser rasch verteilt oder auflöst.

Bei der vorliegenden Erfindung können feuchte Gels von der gewünschten Form (Teilchen, Film, Stück, Platte, Zylinder oder andere Form) durch entsprechende Wahl der Gestalt des Gefässes oder der Form, in welche die wässrige Polyvinylalkohollösung geleert wird, hergestellt werden. Die Formgebung kann mit der Gestalt des Endproduktes in Übereinstimmung sein oder der so geformte Artikel kann in einen anderen umgeformt werden z.B. durch Zuschneiden oder Späneschneiden.

Der Wassergehalt des Gels der Erfindung, in welchem eine grosse Menge Wasser eingebettet werden kann, kann durch 1 — 6 stündiges Eintauchen in Wasser oder physiologische Kochsalzlösung rasch auf 50—92 Gew.% erhöht werden.

Bemerkenswert ist, dass der Wassergehalt des Gels, welcher gemäss der Erfindung durch Tiefkühlen, Formen und partielle Entwässerung einer eingangs 6—20 Gew.%igen wässrigen Lösung von Polyvinylalkohol und anschliessendes Eintauchen in Wasser oder physiologische Kochsalzlösung erhalten wurde, 70—92 Gew.% sein kann. Demzufolge verhält sich das hoch wasserhaltige Gel der Erfindung, obwohl es ein gummiähnliches Elastomer mit einer wie oben erwähnten hohen mechanischen Festigkeit ist, vom chemischen oder biochemischen Standpunkt aus gesehen oft wie Wasser (oder physiologische Kochsalzlösung), ist beinahe unreaktiv gegenüber lebendem Gewebe und ist im Kontakt mit Blut hoch antithrombogen. Tatsache ist, dass die durch Kontakt von Blut mit Glas, Nylon, Polystyrol, Polyester, Polyäthylen, Polyurethanschaum, Teflon, Silikon oder Poly-vinylpyrrolidon hervorgerufene Koagulation hingegen mit einem hoch wasserhaltigen Gel der Erfindung nicht auftritt, auch nicht unter solchen Bedingungen, wo Thromben gebildet werden mit Polyvinylpyrrolidon, Silikon, Teflon oder Ähnlichem.

Poly(2-hydroxyäthylmethacrylat), welches ehemals als Hydrogelmaterial in der medizinischen Verwendung Beachtung gefunden hatte, enthält gewöhnlich so wenig Wasser wie 38 —40 Gew.% und ist von geringerer mechanischen Stabilität [S.D. Bruck, J. Biochem. Mater. Res., 7, 389 (1973)]. Obwohl vorgeschlagen wurde, den Wassergehalt auf 60 Gew.% zu vergrössern, ist es problematisch, da mit steigendem Wassergehalt die mechanische Stabilität abnimmt [J.D. Andrade (Verf.), «Hydrogels for Medicai and Related Applications» S. 23 (1976) ACS Symp. Ser.].

Auf der andern Seite können hoch wasserhaltige Gels mit gewöhnlich einem Wassergehalt von 70—92 Gew.%, oder sogar einem solchen von 80—92 Gew.%, gemäss der vorliegenden Erfindung hergestellt werden, welche in der mechanischen Stabilität auch besser sind, wertvolle antithrombogene Materialien darstellen und besser sind als alle nach bisherigen Kenntnissen hergestellten hydrophoben, hydrophilen Materialien und medizinischen Hydrogels.

Während das Gelmaterial der Erfindung fähig ist, Substanzen von kleinem Molekulargewicht wie Asparagin (MG 132), Asparaginsäure (MG 133), Ammoniumhydroxyd (MG 35), Glukose (MG 180) und Glycerin (MG 92) leicht durchdringen zu lassen, ist es fast unfähig, Moleküle mit einem Molekulargewicht von ungefähr 100 000 und völlig unfähig, Enzyme mit einem Molekulargewicht von ungefähr 300 000 oder grösser durchdringen zu lassen. Demzufolge läuft die im Gel der Erfindung eingebettete Asparaginase (MG 100 000—170 000) kaum aus dem Gel. Im weiteren werden Zellen und makromolekulare Proteine im Blut nicht in die Region der eingebetteten Asparaginase eindringen, sodass die durch Annäherung der Antikörper im Blut [Lymphozyten, Immunglobulin (MG 160 000 — 890 000)] an die Asparaginase, welche ein fremdes Protein ist, bis auf eine Distanz von 0.1 nm oder weniger verursachte Antigen-Antikörper-Reaktion verhindert wird.

Tatsächlich wird Enzym beim Eintauchen des erfin-dungsgemässen Gels in physiologische Kochsalzlösung freigesetzt. Dann jedoch beim weiteren Eintauchen (oder Waschen) für eine genügend lange Zeit wird kein weiteres Enzym mehr freigesetzt, und das Gel kann ununterbrochen (oder wiederholt) verwendet werden, ohne die Möglichkeit, dass das Enzym freigesetzt wird. Der anfängliche durch Eintauchen bewirkte, oben erwähnte Enzymverlust ist klein, ungefähr 10—15% der ursprünglich zur Herstellung des Gels der Erfindung verwendeten Enzymmenge. Um diesen Enzymverlust zu verhindern, kann in der Erfindung eine kombinierte vorbeugende Behandlung durchgeführt werden. Tatsächlich wird oft eine Eintauchbehandlung eines immobilisierten Enzyms in eine wässrige Lösung von Glutaraldehyd verwendet [T.M.S. Chang, Enzym, 14, 95 (1972), G. Brown et al., Biotechnol. Bioeng., 15, 359 (1973)]. Wenn diese bekannte Behandlung beim immobilisierten Enzympräparat der Erfindung angewendet wird, wird der zuvorerwähnte auf der Freisetzung von Enzym beruhende Verlust auf ein Niveau von 1—2% der ursprünglichen Enzymmenge reduziert. Die Eintauchbehandlung in eine wässrige Glutaraldehydlö-sung wird vorteilhaft beim Gel der Erfindung verwendet, da aufgrund der sterilisierenden Wirkung der wässrigen Lösung das Präparat von immobilisiertem Enzym gleichzeitig sterilisiert wird.

Die Hydrogels der Erfindung sind ein Material, welches gegenüber lebendem Gewebe sehr wenig schädlich ist, da es nicht reaktiv ist, wenn es damit in direkten Kontakt tritt. Z.B. wurde ein Hydrogel (1 x 1 x 1 cm) für die Zeit von 1 — 3 Monaten auf dem Rücken eines Kaninchens subkutan implantiert und einer histologischen Untersuchung unterworfen. Das Gel wurde gut festgehalten und durch das lebende Gewebe eingekapselt. Das lebende Gewebe wurde eingeschnitten und man fand, dass das ganze Gel einheitlich mit einem dünnen Film umgeben war, welcher mit einem Messer leicht abgestreift werden konnte. Man beobachtete keine zelluläre Infiltration in diesen Film und anderes lebendes Gewebe, was nicht auf eine entzündliche Reaktion hinzeigt. Diese gute Biokompatibilität des Hydrogels der Erfindung erlaubt ein Verweilen des immobilisierten Enzympräparates der Erfindung mit eingebauter Asparaginase in der Bauchhöhle anstelle der gut bekannten Behandlung durch intraperitoneale Verabreichung von freier Asparaginsäure [J.G. Kidd, J. Exp. Med., 98, 565, 583 (1953)].

Wie oben beschrieben sind die Hydrogels der Erfindung stark wasserhaltige Gels mit hoher antithrombogener Aktivität, und demzufolge können sie auch als Präparat von immobilisiertem Enzym zur Konstruktion eines ausserhalb des Körpers liegenden Blutkreislaufs verwendet werden. Es muss jedoch zugegeben werden, dass für die stark antithrombogenen Hydrogels der Erfindung nicht ein vollkommen identisches Verhalten mit demjenigen von Wasser oder physiologischer Kochsalzlösung garantiert werden kann, noch so hoch die Hydration auch sein mag. Jedoch ist es vernünftig, in Betracht zu ziehen, dass eine Erhöhung des Wassergehalts im

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

659393

Material eine Erhöhung in der antithrombogenen Aktivität bringt und dass der Wassergehalt nicht ohne Begrenzung erhöht werden kann, insofern als man an medizinischem Material (Strukturen) interessiert ist (um eine mechanische Festigkeit sicherzustellen). Der Wassergehalt des Hydrogels der Erfindung kann die obere Begrenzung des Wassergehalts von Hydrogels aus Polyvinylalkohol-Glutaraldehyd oder Poly(2-hydroxyäthylmethacrylat) (60—80%) [E.W. Merrill et al., ACS Polymer Preprint, 13,513 (1972)] weit überschreiten, doch ein Wassergehalt über 92 Gew.% resultiert in einer Abnahme der mechanischen Festigkeit des Gels.

Mit dem Ziel der Erhaltung der Antithrombogenizität über eine lange Zeitspanne, während der Wassergehalt des Gels der Erfindung im Bereich zwischen 45 und 92 Gew.% fixiert ist, kann ein antithrombogenes Agens (Antikoagulans) im Gel der Erfindung eingebettet werden.

Als antithrombogenes Agens sind Heparine (Heparin-säure, Heparin Natriumsalz, Heparin Kaliumsalz, Heparin Calciumsalz und Heparin Magnesiumsalz) wirksam. Um die Antithrombogenizität für eine lange Zeitspanne durch Einbettung des zuvorgenannten antithrombogenen Agens in das stark wasserhaltige Gel der Erfindung besser zu erhalten, wird eine wässrige Lösung oder Suspension von Heparin zur anfänglichen wässrigen Lösung eines Polyvinylalkohols und eines Enzyms zugefügt und vermischt. Die Konzentration des Heparins in diesem Verfahren kann 10 Gew.% oder weniger sein. Obwohl natürlich zur Herstellung einer Suspension eine grössere Menge Heparin zur wässrigen Lösung zugefügt werden kann, ist es normalerweise nicht nötig, solche grösseren Mengen Heparin zuzufügen, da das in das Gel der Erfindung eingebaute Heparin nicht innerhalb einer kurzen Zeitperiode ausfliessen wird, eingebaut bleiben wird, während es gleichmässig freigesetzt wird.

In der vorliegenden Erfindung, dem oben erwähnten Kühlen, Verfestigen, Formen und partiellen Entwässern der wässrigen Lösung von Polyvinylalkohol, verteilen sich Enzym und Heparin gleichmässig und 99% oder mehr des Heparins wird aus der wässrigen Lösung in das Gel eingebaut. Die Gestalt des Gels kann in einem feuchten Gel mit einem Wassergehalt von 50—92 Gew.% mit beinahe im Gleichgewicht stehender Hydration durch bekannte Behandlung mit Glutaraldehyd und darauffolgendem 1 bis 6 stündigen Eintauchen in sterilisiertes Wasser oder physiologische Kochsalzlösung stabilisiert werden. Eine kleine Menge des Heparins fliesst während der Eintauchoperation aus dem Hydrogel aus, aber der Verlust ist gewöhnlich klein, bei 0.5 — 1 % der totalen eingebauten Menge, ohne Einfluss auf die Antithrombogenizität des Hydrogels der Erfindung. Heparin Natriumsalz wurde z. B. in einer Konzentration von 3 Gew.% in einer wässrigen Lösung von Polyvinylalkohol gelöst. Die Mischung wurde den Behandlungen entsprechend der Erfindung unterworfen und man erhielt 5 g eines Gels (gesamte Oberfläche 50 cm2, eingebautes Heparin 4800 Einheiten (30 mg)/g). Das Gel wurde für 6 Stdn. in 5 ml physiologische Kochsalzlösung eingetaucht und man beobachtete ein Ausfliessen (Verlust) von Heparin von ungefähr 0.6%. Wenn es anschliessend für 28 Tage oder länger im Körper mit dem Blutstrom in Kontakt gebracht wurde, blieb Heparin auf der Oberfläche des Hydrogels zurück. Im Vergleich mit in einen aldehydüberbrückten Gel aus Polyvinylalkohol eingebautem Heparin, welches gewöhnlich innerhalb von 1 —6 Stdn. oder längstens innerhalb von 5 Tagen vollständig ausgelaufen ist, zeigt das gemäss der vorliegenden Erfindung eingebettete Heparin eine einzigartige, gleichmässige Freigabe und ist bei medizinischen Materialien offenbar sehr vorteilhaft. Das Gel der Erfindung wird leicht in jeder Form erhalten. Z. B. kann ein Hydrogelrohr oder ein eingebautes Heparin enthaltendes Rohr mit 2—6 mm innerem Durch-

8

messer hergestellt und ausserhalb des Körpers als Kreislauf für Blut verwendet werden. Allgemein erhältliche künstliche Blutgefässe aus Polyester oder Teflon sind stark thrombogen und machen als Ersatz für dünne Arterien von 5 mm oder 5 weniger Durchmesser Schwierigkeiten. Andererseits sind sie nicht verwendbar in Venenregionen mit langsamem Blut-fluss. Auf der andern Seite bewirkt das Hydrogelrohr oder des eingebautes Heparin enthaltende Rohr auch für den Fluss mit 2—5 mm im Durchmesser über eine Periode von io wenigstens 4 Wochen keinen Thrombus. Während dieses Kreislaufs wurde die Oberfläche des Hydrogelrohrs oder des eingebautes Heparin enthaltenden Rohres mit leicht anhaftendem lebenden Gewebe (Protein) überzogen, was eine befriedigende Biokompatibilität anzeigt.

15 Es ist nicht nötig sich bei der vorliegenden Erfindung bezüglich der Verbindung von schädlichen Substanzen mit dem Hydrogel (oder dem Heparin eingebauten Hydrogel) der Erfindung zu beunruhigen, sofern man den unreagierten Glutaraldehyd nach erfolgter Nachbehandlung ausgewa-20 sehen und entfernt hat. Bei Polyurethan-dimethylsiloxan als einem typischen antithrombogenen Material nach dem damaligen Stand der Technik stiess man immer auf Schwierigkeiten, da die Möglichkeit von begleitendem Tetrahydrofu-ran, Dioxan, Essigsäure usw. bestand und überdies in einem 25 sterilisierten Raum gern Staub absorbiert wurde, sodass man die Handhabungen im Unterschied zu einem konventionellen Operationsraum in einem speziell gereinigten Raum durchführen musste. Auf der andern Seite ist es sehr einfach, das Hydrogel und das Heparin enthaltende Hydrogel der Er-30 findung zu handhaben.

Obwohl der Mechanismus, nach dem diese antithrombogenen hoch wasserhaltigen Gels, welche von bekannten Polyvinylalkohol Gels bezüglich mechanischer Festigkeit und Elastizität vollständig unterscheidbar sind, durch Kühlen, 35 Verfestigen, Formen und partielle Entwässerung einer wässrigen Lösung eines Polyvinylalkohols gebildet werden, nicht vollständig klar ist, glaubt man, dass während des Kühlvorgangs, der Verfestigung, Formung und darauffolgender partiellen Entwässerung und vor allem während der zur Erhö-40 hung der mechanischen Festigkeit und Elastizität durchgeführten partiellen Entwässerung eine grosse Zahl von intramolekularen und intermolekularen Verwicklungen gebildet werden.

Jedenfalls sind solche durch uns gefundene antithrombo-45 gene immobilisierte Enzympräparate und das Verfahren zur Herstellung derselben durch Kühlung, Verfestigung und partielle Entwässerung von Polyvinylalkohol neu.

Die immobilisierten Enzympräparate entsprechend der vorliegenden Erfindung zeigen eine starke Rückbildung der so lymphozytären Leukämie, der myelozytären Leukämie, speziell der lymphatischen Leukämie und können auch bei verschiedenen Leukämiearten wie akute myeloide Leukämie und malignes Chorionepithelioma (oder leukämieähnlichen Krankheiten, festen Tumoren wie Melanomen) verwendet 55 werden, bei denen erkannt wurde, dass bekannte, freie Asparaginasen wirksam sind.

Bei den immobilisierten Enzympräparaten entsprechend der vorliegenden Erfindung wird die Immunreaktion wie oben erwähnt vermieden, und deshalb können sie ohne die 60 Nebenwirkung zu beteiligen zur Einleitung, der weiteren Aufrechterhaltung und zur Verbesserung dieser Rückbildung verwendet werden.

Die Asparagin zersetzende Aktivität der immobilisierten Enzympräparate entsprechend der Erfindung wird nach un-65 gefähr einer Woche ununterbrochener Verwendung auf 80—90% und nach einem Monat auf die Hälfte des Anfangswertes reduziert. In einigen Fällen, je nach Wiederauftauchen der Symptome, ist eine Erneuerung des immobili-

9

659 393

sierten Enzympräparates deshalb nötig. Im Vergleich zu den früher bekannten Verfahren jedoch, wo das teure Enzym durch Tropfinfusion (verordnet) wiederholt täglich oder alle zwei Tage über eine lange Periode von 4—28 Tagen in hohen Dosen (z.B. 10 000 Einheiten pro 50 kg Körpergewicht, ca. 75 mg/Tag) verabreicht wurde, ist die Lebensweise entsprechend der Erfindung, bei welcher das immobilisierte Enzympräparat über eine lange Zeitperiode in Kontakt mit dem Blutstrom sein kann, vom operationeilen und ökonomischen Standpunkt aus besser.

Die Enzympräparate können relativ einfach gehandhabt werden und sind unter der Bedingung, dass sie nach der Herstellung bei 0 — 10 °C aufbewahrt werden mit einer beobachteten Reduktion an Aktivität von 10% oder weniger für ungefähr 6 Monate stabil.

Die Erfindung wird im folgenden anhand Ausführungsbeispielen beschrieben werden.

Beispiel 1

In 201 g einer wässrigen Lösung von Tris(hydroxyme-thyl)aminomethan-Salzsäure (50 mM —0,2 mM) bei einem pH-Wert von 8 wurden 32,8 g eines im Handel erhältlichen pulverförmigen Polyvinylalkohol (Hydrolysierungsgrad 99,4 Mol%, durchschnittlicher Polymerisationsgrad 2600, Viskosität der 4%igen wässrigen Säure bei 20 °C 66 cP) (Wassergehalt 8,5 Gew.%) zu einer 13 Gew.%igen wässrigen Lösung hinzugefügt. 25 g der wässrigen Lösung wurden bei Zimmertemperatur 6,9 g einer L-Asparaginase-Lösung (handelsübliches Produkt, 50%ige wässrige Glyzerin-Lösung, 290 Einheiten/ml) um eine wässrige Lösung enthaltend 10 Gew.% Polyvinylalkohol, 10 Gew.% Glyzerin (das Lösungsmittel für die im Handel erhältliche Enzym-Lösung) und 0,04 Gew.% des Enzyms zu ergeben (pH 8).

In einer Form für das Rohrgiessen mit einem inneren Durchmesser von 1 mm, einem äusseren Durchmesser von 3 mm und einer Länge von 1 m wurden 6,3 ml der wässrigen Polyvinylalkohol-Asparaginase-Lösung gegossen, gefolgt durch ein Kühlen bei —40 °C während 4 Stunden. Dann wurde die obere Abdeckung der Form entfernt und die abgekühlte, gefestigte und geformte Masse wurde einer Vakuum-Entwässerung während 6 Stunden ohne Auftauen unterworfen. Das Vakuum wurde abgeschaltet und der geformte Artikel (Gel in Form einer Röhre) wurde herausgenommen.

Nach dem Auftauen wurde ein 5,3 g wiegendes Rohr erhalten (Entwässerungsverhältnis 15 Gew.%, Flüssigkeitsgehalt

88 Gew.%) mit einem inneren Durchmesser von 1 mm und einem äusseren Durchmesser von 2,7 mm. Das Rohr wurde in eine l%ige wässrige Lösung Glutaraldehyd bei Zimmertemperatur während 15 Min. eingetaucht und bei 5 °C über Nacht gelassen. Das Waschen wurde zehnmal je mit 30 ml einer wässrigen Lösung von Tris(hydroxylmethyl)aminome-than-Salzsäure (47 mM —0,3 mM) bei einem pH-Wert von 7,5 enthaltend 0,9 Gew.% Natriumchlorid (sterilisiert) wiederholt, um 5,7 g eines Hydrogel-Rohres (Flüssigkeitsgehalt

89 Gew.%) zu erhalten. Es ist zu bemerken, dass ein grosser Betrag des Aldehyds und eine Spur Protein in den ersten Waschwasser festgestellt wurde, doch nichts davon im Waschwasser nach Beendigung der Waschoperationen.

In einen mit gasförmigem Propylenoxyd (bei Zimmertemperatur während 10 Stunden) sterilisierten Polyäthylen-Sack, der anschliessend bei Vakuum entgast wurde, wurde das obig hergestellte Hydrogel-Rohr gelegt und der Sack dicht geschlossen.

Zwischen der Schenkel-Arterie des rechten Hinterlaufs und einem ausserkörperlichen Shunt der Schenkel-Vene des linken Hinterlaufs eines Spürhundes (Beagle) von 6 kg Gewicht wurde das eingebettete Asparaginase enthaltende Rohr aus dem Polyäthylen-Sack angeschlossen. Der Hund wurde unter natürlichem Blutdurchfluss gehalten. Die Aspa-ragin-Konzentration im Arterienblutstrom wurde von 36 mM (475 ppm) auf 0,05 mM (6,6 ppm) nach 4 Stunden reduziert und nach 5 Stunden nicht mehr entdeckt (1 ppm oder weniger).

Beispiel 2

Ein Stück eines nach Beispiel 1 erhaltenen eingebetteten Asparaginase enthaltenden Rohrs (7 cm Länge) wurde mit einer Zugfestigkeit von 5 kg/cm2 belastet und es wurde gefunden, dass das Rohr nicht gebrochen wurde.

Dann wurde ein Stück des gleichen Rohres (4 cm Länge, 0,25 g) eingeschnitten, um eine dünne Platte zu erhalten, die mit 4 kg/cm2 belastet wurde. Gewichtsverlust durch Ausschwitzen von Wasser betrug nur 2 mg.

Ein Stück des gleichen Rohres (9 mm Länge) wurde durch das folgende Verfahren in die Halsvene eines Hundes (Körpergewicht 7 kg) eingeführt. Die Halsvene wurde aseptisch unter intravenöser Pentobarbital-Anästhesie und intu-bierte Steuerung der Atmung freigelegt. Nach dem Entfernen des umgebenden Gewebes wurde ein Längsschnitt in einer Länge von 5 mm durchgeführt. Das zentrale und peri-pherale Ende des Schnittes wurde je mit einem Faden gebunden, um den Blutfluss zeitweise abzusperren. Unmittelbar nach der Operation wurde das Innere der Vene mit sterilisierter physiologischer Salzlösung gewaschen und das oben erwähnte Rohrstück (Ring) auf der Peripheralseite eingeführt, wobei sorgfältig eine Verletzung der Intima des Blutgefässes vermieden wurde. Der Ring wurde dann gegen die zentrale Seite gezogen, um die Einschnittslinie und das Zentrum des Rings zu vereinen. Der Schnitt wurde mit einem Catgut von 0,18 mm Durchmesser, das mit Äthylenoxyd sterilisiert worden war, geschlossen. Dann, unter Wiederherstellung des Blutflusses wurde das Zentrum des eingeführten Ring abgebunden. Nach zwei Wochen wurde die gleiche Region wie oben beschrieben wieder geöffnet und es wurde eine dünne Schicht durch die ganze Oberfläche des Rings beobachtet. Es wurde keine Thrombogenesis beobachtet.

Vergleichsversuche mit einem Silikon-Gummiring und einem Teflonring in Hunden mit Gewicht von 7 bis 15 kg ergaben eine deutliche Thrombogenesis in einer so kurzen Zeitspanne wie zwei Wochen mit fast zugestellten Blutgefässen, wodurch die Überlegenheit des eingebetteten Enzym enthaltenden Hydrogels gemäss der Erfindung in Antithrombogenizität angezeigt wurde.

Vergleichsbeispiel 1

In ein quadratisches Gefäss mit einer Grösse von 6 x 6 cm wurde auf den Boden 30 g der gleichen wässrigen Lösung von Polyvinylalkohol und Asparaginase wie in Beispiel 1 geleert, das bei gewöhnlicher Temperatur während zwei Tagen stehengelassen wurde. Es wurde eine farblose, klare, weiche Schicht erhalten. Beim Eintauchen der Schicht in Leitungswasser während 6 Stunden wurde diese teilweise in Wasser aufgelöst und die verbleibende Schicht war klebrig. Es wurde nicht das gummiähnliche Gel wie in Beispiel 1 erzeugt.

Dies weist daraufhin, dass das Trocknen allein einer wässrigen Polyvinylalkohol und Enzym enthaltenden Lösung nicht ein gummiartiges, hoch wasserhaltiges, Enzym enthaltendes Gel erzeugt.

Vergleichsbeispiel 2

Das gleiche Verfahren wie in Beispiel 1 wurde wiederholt unter Benutzung eines im Handel erhältlichen Polyvinylalkohols mit einem Hydrolysis-Grad von 78,5 mol.%, einem durchschnittlichen Polymerisationsgrad von 1800 und einer Viskosität der 4%igen wässrigen Lösung (20 C) von 36 cP

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

659 393

10

an der Stelle des darin benutzten Polyvinylalkohols. Es wurden 5,7 g eines gekühlten, verfestigten, geformten und entwässerten Produkts erhalten (Entwässerungsgrad 10 Gew.%) das nach dem Schmelzen bei 5 °C erweicht wurde, wonach ein kleiner Betrag einer Gelschicht und ein grosser Betrag einer dicken wässrigen Lösung von Polyvinylalkohol beobachtet wurde.

Dies weist daraufhin, dass die Benutzung von Polyvinylalkohol mit einem niedrigen Hydrolysis-Grad kein wasserre-sistentes Gel mit eingebettetem Enzym produziert wie gemäss der vorliegenden Erfindung.

Vergleichsbeispiel 3

Das gleiche Verfahren wie in Beispiel 1 wurde wiederholt unter Benutzung eines im Handel erhältlichen Polyvinylalkohols mit einem Hydrolysis-Grad von 99,2 mol.%, einem durchschnittlichen Polymerisationsgrad von 500 und einer Viskosität der 4%igen wässrigen Lösung (20 °C) von 5,6 cP an der Stelle des darin benutzten Polyvinylalkohols. Es wurde 5,7 g eines agarähnlichen, zerbrechlichen Gels (Entwässerungsgrad 10 Gew.%) erhalten.

Dies deutet daraufhin, dass die Benutzung eines Polyvinylalkohols mit einem niedrigen Polymerisations-Grad nicht ein gummiähnliches, Enzym enthaltendes Gel mit hoher mechanischer Festigkeit wie in der vorliegenden Erfindung erzeugt.

Vergleichsbeispiel 4

Die gleiche wässrige Polyvinylalkohol-Enzym-Lösung wie in Beispiel 1 wurde abgekühlt, verfestigt und bei —40 °C geformt und bei gewöhnlicher Temperatur während 3 Stunden stehengelassen. Es wurde ein schwaches, klebriges Gel (6,3 g) gebildet mit einer geringen Elastizität und mit einer derartig niedrigen Zerreissfestigkeit, dass es mit einer so kleinen Belastung wie 0,3 kg/cm2 zerriss. Bei Immersion von 1 g des Gels in 3 ml Wasser wurde es in ungefähr 20 Stunden derart verformt, dass es eine trübe, wässrige Schicht ergab, was auf eine beträchtliche Auflösung des Polyvinylalkohols hinweist.

Wie weiter oben beschrieben, erzeugt Abkühlen, Verfestigen und Giessen einer wässrigen Lösung von Polyvinylalkohol und Enzym nach dem Schmelzen nur ein klebriges Gel mit einer niedrigen mechanischen Festigkeit und einer geringen Wasserwiderstandsfähigkeit. Es wird kein wasserresi-stentes, eingebettetes Enzym enthaltendes Gel erzeugt mit einer hohen mechanischen Festigkeit, wenn nicht teilweise Entwässerung ohne Auftauen des gekühlten, verfestigten und gegossenen Produkts durchgeführt wird, wie gemäss vorliegender Erfindung.

Das gleiche Hydrogel-Rohr wie in Beispiel 1 (1 m Länge) wurde in 4 cm-Portionen geteilt. Es wurde ein Nahttest durchgeführt, durch Anastomisieren des Stücks mit einem seidengewobenen Faden (JIS Nr. 1,0,1 mm Durchmesser, sterilisiert bei 120 °C während 30 Min.) das eine Auflösungsbehandlung mit Sericin unterworfen wurde, einem Catgut (Darmdraht, 0,18 mm Durchmesser, sterilisiert mit Äthylenoxyd), einem Dexon-Faden (Polyglycolsäure, 0,18 mm Durchmesser, sterilisiert bei 120 °C während 30 Min.) und einer schräg geschnittenen Nadel je bei einer Fadendistanz von 1,5 mm.

Mit irgendeiner der verwendeten Nähte wurde das Enzym enthaltende Hydrogel-Rohr gemäss der Erfindung leicht genäht und es wurden keine Brüche am Ort der Naht festgestellt, wodurch es den Anschein hat, dass das Rohr stark genug ist mit Blutgefässen in lebendem Gewebe vernäht zu werden.

Ein Antithrombosegenezitäts-Test des Hydrogel-Rohrs wurde auch in gleicher Weise durchgeführt wie in Beispiel 2,

um anzuzeigen, dass keine Thrombogenesis beobachtet wurde.

Beispiel 3

s In 914 g einer Tris-Puffer-Lösung mit einem pH-Wert von 7,5 wurden 86 g eines im Handel erhältlichen Poly-vinylalkoholpulvers aufgelöst (Hydrolysis-Grad von 97 mol.%, ein durchschnittlicher Polymerisationsgrad von 1800 und eine Viskosität der 4%igen wässrigen Lösung io (20 °C) von 28 cP) (Wassergehalt 7 Gew.%), dies zu einer 8,0 Gew.%igen Lösung.

Zu 41 g einer wie in Beispiel 1 sterilisierten, wässrigen Lösung wurden mittels Rühren bei 33 °C 82 mg L-Asparaginase (lyophilisiertes Pulver, 250 Einheiten/mg) hinzugefügt. 15 In ein quadratisches Polyäthylen-Gefäss mit einer Grösse von 7 x 7 cm wurden auf den Boden 40 g der obig vorbereiteten, wässrigen Lösung gegeben, die bei — 50 °C während 6 Stunden gekühlt wurde. Sie wurde dann einer Vakuum-Entwässerung während 6 Stunden ohne Schmelzen unter-20 worfen. Das Vakuum wurde dann abgesetzt und der gegossene Artikel (ungefähr 7 mm dick) wurde entfernt und geschmolzen. Es wurden 33 g eines weissen opaken Gels (Ent-wässerungs-Grad 18 Gew.%, Wassergehalt 90 Gew.%) erhalten.

25 Ein Stück mit einem Volumen van 20 x 13 x 5 mm wurde vom Hydrogel herausgeschnitten und als in den Körper zu implantierendes Testmaterial verwendet.

Die Haut eines Kaninchens (Körpergewicht 2,5 kg) wurde auf dem Rücken rasiert und mit einer 0,5%igen Äthylal-30 kohol-Lösung von Chlorohexidin behandelt. Die rasierte Stelle wurde mit 70%igem Äthylalkohol sterilisiert und dann in einer Länge von ca. 1,5 cm geschnitten. Das obige Testmaterial wurde an dieser Stelle implantiert und die Haut genäht. Die Stellung des implantierten Testmaterials wurde 35 derart ausgerichtet, dass sie nicht über die Schnittlinie hinausragte. Nach 24 Stunden wurden Rötung und leichte Geschwulste beobachtet und das implantierte Testmaterial wurde innerhalb des entfernten Bereichs des subkutanen Gewebes bewegt. Nach 3 Tagen verschwanden die Geschwulst-40 bildung und die Rötung, und die Nähte wurden nach 6 Tagen entfernt. Nach 8 Tagen war das Testmaterial befestigt und bewegte sich beiin Abtasten nicht. Auch nach einem Monat wurden keine Änderungen des implantierten Bereichs und keine systematischen Symptome beobachtet. Nach 30 45 Tagen wurde das Testmaterial mit dem subkutanen Gewebe herausgeschnitten. Das Material war mit Kapselzellen ummantelt, die nicht hafteten, doch in der Nähe befestigt waren. Die Kapsel wurde mit 10%igem Formalin behandelt und in Paraffin eingebettet, gefolgt durch eine Hämatoxylin-50 Eosin-Doppelfärbung und van Gieson-Färbung. Es wurden eine geringe Anzahl von Pseudo-Acidozyten und runde Zellen beobachtet, doch eine sehr geringe zellulare Infiltration und praktisch keine Entzündungsreaktion.

Andererseits wurde um das als Nahtmaterial benutzte 55 Catgut eine starke Fremdkörperreaktion beobachtet, nachdem die Nähte herausgenommen wurden. Zu Vergleichszwecken wurde ein Schwamm mit einem Volumen von 20 mm x 13 mm auf gleiche Art wie oben subkutan in den Rücken eines Kaninchens implantiert. Das Verschwinden 60 der Rötung und der Schwellungen benötigten 14 Tage. Eine Herausnahme nach einem Monat ergab, dass das Volumen des Schwamms um etwa 10% verringert worden war, und eine starke Infiltration und eine Anzahl von Fremdkörper-Riesenzellen wurden im Bereich des Umfangs des Schwam-65 mes beobachtet. In einem Vergleichstest mit Methylmeth-acrylat-Harz verschwand die Rötung und die Schwellungen nach einer Woche, und es wurde eine beachtliche Infiltration von Pseudo-Acidozyten beobachtet. Es wurde somit gefun

11

659 393

den, dass das erfindungsgemässe Hydrogel bezüglich Bio-Compatibilität weit überlegen war.

Beispiel 4

Ein in den Körper zu implantierendes Testmaterial wurde vorbereitet durch ein Eintauchen des Hydrogels gemäss Beispiel 3, mit einem Volumen von 13 x 13 x 1,5 mm, in eine 2 Gew.%ige wässrige Lösung Glutaraldehyd bei Zimmertemperatur während 15 Minuten und bei 6 °C während 8 Stunden und Waschen mit 10 10 ml-Portionen von Tris-Puffer-Lösung.

Ein Längsschnitt wurde in einer Länge von 3 cm am medialen Kniegelenk eines Kaninchens (Körpergewicht 2,5 kg) gemacht. Dieser Längsschnitt wurde am medialen viereckigen Schenkelmuskel durchgeführt und die Patella wurde nach aussen versetzt. Während das Kniegelenk gebogen wurde, wurde fetthaltiges Gewebe der vorderen Oberfläche entfernt und das Kreuzband wurde durchgeschnitten. Dann wurden die Gelenkkapseln, ausgenommen die äussere Gelenkkapsel, und der Meniskus entfernt. Anschliessend wurde der Oberschenkelgelenkknorpel entfernt. Das obige Testmaterial wurde auf der Oberschenkelgelenkfläche anstelle des Knorpels eingefügt und befestigt. Das Kniegelenk wurde mit einem Winkel von 150° gebeugt und ein Pflasterverband wurde vom oberen Teil des Oberschenkels bis zum Fuss angebracht. Es wurde 3 Wochen später entfernt und am Gelenk wurde eine leichte Schwellung entdeckt, doch weder Rötung noch lokales Fieber, gute primäre Coaptation und kein Exsudat. Das Kniegelenk hatte einen Beugemuskel von ungefähr 120° und ein geschützter humpelnder Gang wurde beobachtet. Das Kniegelenk wurde mit Gewalt in einem Bereich zwischen 150 und 90° bewegt. Muster wurden mit For-malin fixiert, in Paraffin eingebettet und mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt, Mallory's Färben unterworfen und mikroskopisch untersucht. Die Gelenkoberfläche des Oberschenkels war mit Verbindungsgewebe eingekapselt und weder reaktive knöcherne Hyperplasie noch Entzündung der Knochenmarkhöhle durch das implantierte Testmaterial wurde beobachtet.

Ein Vergleichstest wurde mit einem Methylmethacrylat-Harz von 1,5 mm Dicke in gleicher Weise wie oben durchgeführt. Der Befund nach 3 Wochen war der folgende: Es wurde eine Schwellung beim Gelenk beobachtet und zusätzlich dazu lokales Fieber und wellenförmige Bewegungen im oberen Teil der Patella beobachtet. Das Kniegelenk konnte nur leicht mit Gewalt bewegt werden, doch war es nicht spontan bewegbar. Es wurde eine entzündliche Zelleninfiltration und eine fibrose Narbenbildung beobachtet. Dieser Befund weist daraufhin, dass das Enzym enthaltende Hydrogel gemäss der Erfindung eine bessere Biokompatibilität erbrachte.

Beispiel 5

Acht Stücke mit einem Volumen von 13 x 13 x 1,5 mm des Hydrogels, erzeugt im Beispiel 4, wurden wie in diesem Beispiel einer Glutaraldehyd-Behandlung und Waschen unterzogen. Diese acht Stücke wurden intraperitoneal in Mäuse mit Bläschen, die durch eine subkutane Injektion von 600 000 Zellen 6C3HED Lymphosarcoma (J. G. Kidd, J. Exp. Med., 98, 565, 582, (1953), J.D. Broome, J. Exp. med., 118, 99,121 (1963)) erzeugt werden, bei der rasierten Stelle der Fussbeuge gerade unterhalb der Rippenränder implantiert. Am 30. Tag nach der Implantation konnte kein Sar-com visuell beobachtet werden und die Betastung wies auf keine Abnormitäten hin. Die Asparagin-Konzentration wurde von einem Anfangswert von 30 mM (400 ppm) auf 0,2 mM (3 ppm) am zweiten Tag vermindert, die während dem Experiment unverändert blieb.

Vergleichsbeispiel 5 Die mit dem gleichem Lymphosarcom wie in Beispiel 5 subkutan behandelten Mäuse wurden einer intraperitonealen Injektion von 2 ml einer physiologischen Salzlösung al-5 lein unterworfen. Papulöse Tumore mit einem Durchmesser von 2 —3 mm wurden auf der Haut in der Gegend der subkutanen Injektion nach 7 Tagen beobachtet. Dieses Ergebnis zeigt offensichtlich, dass die im obigen Beispiel verwendete Asparaginase einen Tumor verhindernden Effekt aufweist.

Vergleichsbeispiel 6

Falls 2 ml einer physiologischen Salzlösung, enthaltend darin gelöstes Asparaginase-Pulver (Enzym 2 mg/ml, 500 i5 Einheiten/ml) intraperitoneal anstatt der physiologischen Salzlösung von Vergleichsbeispiel 5 injiziert wurde, entwik-kelten sich Lymphosarcome (3 mm Durchmesser) nach 11 Tagen.

Wie bereits erwähnt wurde, bewirkt die Verabreichung 2o freier Asparaginase Kurzzeiteffekte im allgemeinen. Es wird angenommen, dass das fremde Protein in einer relativ kurzen Zeitspanne durch den Angriff der Proteinase im Körper verschwindet. Dementsprechend wird vorgeschlagen, Aspa-raginase-Verabreichungen alle 6 Stunden oder jeden 2. Tag 25 gewöhnlicherweise mit einer hohen Dosis durchzuführen (L.T. Mashburn et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 12, 50 (1963), R.H. Adamson et al., Cancer Chemther. Rep., (1) 52, 617 (1968)), welches oft gefährliche Nebeneffekte produziert. Im Gegenteil werden in Beispiel 5 dauerhaftere Wir-30 kungen des immobilisierten Enzympräparats gemäss der Erfindung gezeigt.

Beispiel 6

35 Bei einem Spürhund (weiblich, 5 Jahre alt, 6 kg) mit Ödemen mit einer Grösse von 30 x 30 mm unter der Unterkiefergegend und Symptome wie Appetitlosigkeit, Vergrösse-rung der Mandeln und Vergrösserung und Entzündung des Gaumens wurde mittels Biopsie Lymphosarcom diagnosti-40 ziert.

Acht Stücke des immobilisierten Asparaginase enthaltenden Hydrogels, die gemäss Beispiel 5 erhalten wurden, wurden intraperitoneal im Hund implantiert. Der Hund erlangte wieder Appetit am nächsten Tag. Die Lymphknoten wurden 45 aufgeweicht und nach zwei Tagen auf 3x3 mm reduziert. Degenerierende Lymphgefässe wurden mikroskopisch beobachtet. Nach zwei weiteren Tagen verschwanden die Lymphknoten. Keine Abnormitäten wurden nach 50 Tagen beobachtet.

Beispiel 7

Lymphknoten eines 6 Jahre alten Hundes (männlich, 2,94 kg) mit Appetitlosigkeit und in Lethargie wurden durch 55 Biopsie als Lymphosarcom diagnostiziert.

Acht Stücke des immobilisierten Asparaginase enthaltenden Hydrogels, erhalten gemäss Beispiel 5, wurden intraperitoneal im Hund implantiert. Nach zwei Tagen erlangte der Hund wieder Appetit und das Erweichen der Lymphknoten 6o wurde durch Betasten bestätigt. Weitere zwei Tage später wurden die Lymphknoten zu 2 x 2 mm reduziert und der Hund wurde aufmerksam und lebhaft.

Nach zwei weiteren Tagen waren die Lymphknoten beinahe verschwunden und durch Biopsie wurde in der Cortex 65 viele Nekrosen und Inseln von undifferenzierten Lymphge-fässen in Mitose beobachtet. Weitere 3 Tage später hatte sich der Hund erholt und es wurden keine Lymphgefässe mehr festgestellt.

659 393 12

Beispiel 8

Einem Schäferhund von 5 Jahren (3,5 kg) mit oberfläch- Hund den Appetit zurück und war aufmerksam. Die liehen Lymphknoten von 40 x 30 mm Grösse in der politea- Lymphknoten wurden auf 2 x 2 mm reduziert. Die Ver-

len Gegend mit Symptomen wie wiederholtes Erbrechen, grösserung der Milz und der Mandeln ging wesentlich zu-

lymphoide Enopathie, Vergrösserung der Milz, Vergrösse- 5 rück. Das Hodensacködem verschwand. Es wurden keine rung der Mandeln und Hodensacködeme wurden Atropin Abnormitäten im Harnsäureserum, Stickstoff-Harnstoff-

zum Unterbinden des Erbrechens verabreicht und intraperi- Serum, beim Erythrozytenzählen und Leukozytenzählen toneal acht Stücke des immobilisierten Asparaginase enthal- festgestellt. Nach weiteren 3 Tagen waren die Lymphknoten tenden Hydrogels implantiert. Nach 3 Tagen erlangte der verschwunden.

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Claims (7)

659 393 PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Herstellung von immobilisierten L-Asparaginase-Präparaten als Mittel für die Leukämie-Therapie, dadurch gekennzeichnet, dass eine wässrige Lösung, enthaltend 6 Gew.% oder mehr eines Polyvinylalko-hols mit einem Hydrolyse-Grad von 97 Mol% oder höher und einem durchschnittlichen Polymerisationsgrad von 1800 oder mehr und eine antileukämische Asparaginase, in ein Gefäss oder eine Gussform entsprechender Form gegossen und bei einer Temperatur von tiefer als — 15 °C gekühlt, verfestigt und geformt wird und dann die geformte Masse ohne Auftauen teilweise bis zu einem Entwässerungsgrad von 5 Gew.% oder mehr entwässert wird, gefolgt von einer Einstellung eines Wassergehalts von 45—92 Gew.%.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der wässrigen Lösung Heparin hinzugefügt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des Polyvinylalkohols in der wässrigen Lösung 6—25 Gew.% beträgt.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1—3, dadurch gekennzeichnet, dass die Abkühlungs-, Verfestigungs- und Formungstemperatur —35 °C oder tiefer beträgt.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1—4, dadurch gekennzeichnet, dass der Entwässerungsgrad im ersten Entwässerungsschritt 15 Gew.% oder mehr beträgt.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1—5, dadurch gekennzeichnet, dass die teilweise Entwässerung als Vakuum-Entwässerung durchgeführt wird.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1—6, dadurch gekennzeichnet, dass das entwässerte Gel zum Einstellen des Wassergehalts in Wasser eingetaucht wird.

Technisches Gebiet