WO1983000810A1 - Selective carcinostatic agent - Google Patents

Description

明 細 書

発 明 の 名 称 .

選択性制趦剤

[技 術 分 野〕

本発明は選択性制癥剤、 殊にハ イ プ リ ド ー マの産生 し た ヒ ト の瘙抗原に対する単ク ロ ー ン往抗体 （ 以下 "MoAb " と略す ） と制^作用物質とが化学 ⁷的 4て結合 している ヒ ト の癌細胞に対し特異的に親和性を有す制痣剤に関する。

〔背 景 技 術〕

悪性腫瘍、 即ち崈に対する治療薬と しては、 既に多数 の細胞毒性物質が臨床的に実用又は試用 されているが、 これらは ずれ も瘙細胞に対し非特異的であ って、 正常 細胞に対 して も毒性を有するので、 有効濃度に達するま で投与量を増加するのは不可能である と う 本質的な欠 点がある。 このため、 現在にお て も瘙の化学療法剤に 対する信頼性は乏 し く 、 早期発見、 外科手術 と い う のが 依然と して痣治療の大道である。

そこで近年に至 、 釗铯作用や細胞毒性を有する物質 を特殊なキ ヤ リ ヤ ーに結合させ、 これを選択的に癥細胞 に伝達、 作用 させる とい う アイ デアが生ま れ、 この線に 沿 っ て、 癀細胞の持つ抗原に対する抗体の利用が研究さ れて き た。 元来、 同一個体の ί 又は異種の抗腫瘍抗体は、 必ず し も搔細胞に対 し傷害作用を発撢する と い う 訳では が、 高 確率を も っ て瘙縐胞に ^合する性質を有す る点では共通 している。 こ の性質を利 ¾ して、 例えば、

O PI • ダ ウ ノ マイ シ ン等の制瘙剤と抗腫瘍免疫グロ ブ リ ン の Fab'二量体と を共有結合させた例 （ 特開昭 51-144723 号 ） 、 ―

• ジ フ テ リ ア毒素 と ク サギ 抗体 をグル タ ルア ルデ ヒ ドで架橋した複合体 （F.L Moo 1 ten et al ;J Natl

Cancer Inst. , Vol , 55. pp.473 ~ 477 C 1975 ) ) 、

• ジ フ テ リ ア毒素と抗 リ ン パ球抗体と をク D ラ ム ブ シ ル を介して結合した結合体 （Nature , Vol .271. pp.752〜

754(1978 ) ) 、

な どが発表されてお ]? 、 こ の他、 特開昭 55-136235 、 同 55-49321 、 同 56-16418 、 同 56-16417 ど の発明 も公 開 されている。

しかし ながら、 これら 文献で使用 される抗体はどれ も単一の抗体では ¾ く 、 正常細胞の抗原に対する抗体を も併せ含有するため、 瘙細胞に射す-る選択性が不充分で あ っ て、 こ のため、 薬剤が正常細跑に对 して も 傷害的に 作用する可能性が高 。

〔発 明 の 開 示〕

しかるに、 本尧¾者らは痣細胞に対してのみ選択'的に 作用 し う る抗腫瘍薬剤の創製に努力 した結果、 細胞融合 法に よ 得られた融合細胞 （ ハイ ブ リ ドーマ ） が産生す る蛋白を精製する こ と に よ 1? ヒ ト瘙細胞の抗原に対する MoAb を 得 る こ と に成功 し、 これを抗腫脣薬剤又は細胞 毒性物質と化学的に結合させる こ と に よ 、. こ こ に瘀細 胞に対 して特異性のある選択性制瘙剤を得る こ とができ

OMPI た。

即ち、 *発明の薬剤は、 瘙細胞の成長— 'を抑制し又はこ れを死滅 させる作甩を有する活性成分と、 該活性成分を 担持し、 これを癍細胞に誘導する担体成分と か ら镌成さ れる。 活性成分は、 今日制瘙剤 と して実用 されている と 否と を問わず強力 細跑 ¾性作用 を有する も のが好ま し く 、 例えばエ ン ド キ サ ン 、 ナ イ ト ロ ミ ン 、 サ ノレ コ リ シ ン 、 ミ レ ラ ン 、 シ ク ロ ホ ス フ ァ ミ ド どのァノレキ ル化剤、 ァ メ ト ブテ リ ン 、 8 — ァザグァ ニ ン 、 5 — フ ルォ ロ ク ラ ジ ノレ 、 シ ト シ ン ァ ラ ビ ノ シ ド 、 6 — メ ノレカ ブ ブ リ ン な ど の代謝拮抗物質 ； マイ ト マイ シ ン （：、 ァク チ ノ マイ シ ン D 、 ァ ド リ ア マ イ シ ン 、 ダ ク ノ マ イ シ ン 、 ザル コ マ ィ シ ン どの抗生物質 ； ビ ン ブラ ス チ ン どのア ル 力 口 ィ ド； 麦類の塩基性ポ リ べプチ ド ( SP₁ , SP₂ ， SP-H ど）、 ジ フ テ リ ア毒素、 ッ リ ヌ ス毒素、 破傷風毒素、 シン （ri cin) の よ う 毒性.蛋白又は.ぺブチ ドが例示でき る。

担体成分は ヒ ト 癒抗原に対する単一抗体であ つ て発明 の主要部を構成する。 この も のは、 ヒ ト の痒細胞て感作 された適当な実験動物、 例えば XB/c マウス の脾臓細胞 と、 マ ウ ス由来の骨髄鍾細胞（ ミ エ 一マ細胞 ） との融合 細胞 （ ハ イ ブ リ ド ー マ ） で、 こ れを ク ロ ー ニ ン グする こ と に よ ]? 、 ヒ ト瘙細胞の癀特異抗翳と結合能のある MoAb を産生する融合細胞を選択、 分齄 し、 次 でこ の選択さ れた癥特異抗原 と結合能を有する抗体産能を有する融合 細胞を増殖 させる こ と によ 得 られる。 培養法又は動物体内で増殖した融合擗胞 （ ハイ ブ リ ド 一マ ） は採集され、 それから適宣の手段； r抗体が分離さ れる.。 発明目的上、 この瘙抗体は可及的純粋でなければ

らず、 理想的には電気^動的に単一にま で純化されて るのが好ま しい。

精製された抗体は、 次いで折望の抗腫瘵性薬剤又は細 胞毒性物質と化学的に結合せしめ られる。 こ の結合は、 抗体の有する遊離-のァ ミ ノ基又はカ ル ボキ¾ ^基と薬剤の 持つア ミ ノ基、 力 ル ポキ シ ル基、 ア ルデ ヒ ド基な どを化 学的 反応させる こ と よ 行われるが、 具体的 は例 えば以下の諸法がある。

( i) 薬剤が塩基性 g白又はボ リ ぺプチ ドである場合——

この場会、 結合体の会'成中に抗体 · 抗体、 薬剤 - 薬 剤、 抗体 · 薬剤 · 薬剤 .どの副生物の生成を如何に防 ぐかと う 点が重要である。 さ らに、 結会体が抗体と して特異性を有 し ければ ら いのも 当然である。

しか し癸明者は、 薬剤中のア ミ ノ基の大部分をグァ二 ジル化 した後、 その遊雜ァ ミ ノ基を、 抗体中の酸性ァ ミ ノ酸部分のカ ル ボキ シ ル基と カ ル ボジィ ミ ド試薬を 用いて縮合させる と、 一股に良好 結 の得 られる こ と を確認 した。 こ の方法を適用 し う る具体的 薬剤と しては、 例えば麦類の塩基性ポ リ ペプ チ ド （ SP^ SP₂ , SP-H ど）、 マ イ ト マ イ シ ン 、 ダ ク ノ マ イ シ ン、 ア ド リ ア マ イ シ ン、 ACNU 、 カ ノレ ポ コ ン 、 メ /レ フ ァ ラ ン 、 ク ロ ラ ム ブチ ル ど力；伊 j示される。

OMPI 《ii) 薬剤が糖を構成成分とする場合 ——

この場合、 薬剤の糖部分における隣接 したヒ ド ロ キ ル基 （ 一部ア ミ ノ基の場合 も あ る ） の間を メ タ過 ョ ク 素酸ナ ト リ ク ムを用い切断 してア ルデ ヒ ド基を生成さ

5 せた後、 抗体の塩基性ァ ミ ノ基と の間にシ ッ フベー ス

を形成 させ、 このシ ッ フベー スを水素化ホ ク素ナ ト リ ク ムの よ う 選択的還元試薬で還元 して相当する ァ ミ ソ メ チ /レ体と する。 この方法に よ 結合で き る薬剤化 合物の具体例と しては、 例えばダ ウ んマイ シ ン 、 ア ド

10 リ ア マ イ シ ン 、 FT— 207、 シ タ ク ビ ン 、 チ ォ イ ノ シ ン な

どが例示される。

一 (iii) 薬剤がァ ミ ノ基を有する場合——

この場合は グル タ ル ァ ルデ ヒ ド の如 き 2 価 ァ ノレデ ヒ ト' に よ ]? 薬剤と抗体のァ ミ ノ基と を交叉結合させる _β i s 結合物は必要に応じ飽和化合物に還元 さ.れる。

[図面の簡単な説明〕

第 1 図は、 SP-H ·抗体結合反応生成物のセ フ アデ プ ク ス G - 200 に よ る分画状況を示すグ ラ フ （ 溶出曲線図: ^ 第 2 図は、 SP^I ·抗体結合体の Co l ο 38細胞に対する選択的 0 吸着能を示すグ ラ フ、 第 3 図及ひ'第 ⁴ 図は SP - H'MoAb 結 合体の Co l o 38 細胞 （ メ ラ ノ ーマ細胞 ） 及び Ra j i細胞（ 正常細胞 ） に対する阻害効果を示すグ ラ フ 、 第 5 図及び 第 6 図は SP^i 'MoAb 結合体の Co l o 38細胞及び Ra j i 細胞 に対する チ ミ ジ ン取 こみ阻害効果を示すグラ フ 、 第 7 5 図はア ド リ ア マイ. シ ン -MoAb 結合体の Co l o 38細胞に対す る細胞障害効果を示すグ ラ フ 、 第 8 図及び第 9 図は-、 本 発明に係る SP - H'MoAb 結合体の担癀マ ク スに対する延命 効果を示すグラ フ である。 第 2 図〜第 6 図を通じ実線は

Colo38 に対する結果を、 点線は Raji 細胞に対する結果を 示 し、 ま た△、 〇、 會、 □、 及び▲は夭 々 MoAb単独、 結 合体 I ( 第 1 図 F— I ) 、 結合体 H ( 第 1 図 F - Π ) 、 フ ラ ク シ ヨ ン III ( 第 1 図 F - DI ) 及び SP - H単独（：物質番号 SUN 9102) を現わす。 ま た、 第 7 ¾中〇は-ァ―ド リ ア マ イ シ ン • MoAb 結合体、 （ )はア ド リ アマイ シ ン単独、 は MoAb単 - 独を、 第 8 図及び第 9 図中▲は SP - H'MoAb 結合体を、 〇 は MoAb 単独を、 ·は薬剤無投与を、 △は SP - H単独を示す。

〔発明を実施するための最良の形態 〕

以下実施例によ 発明を実施するための最良の形態を具 体的に述べるが、 も ちろん説明は単 ¾る例示であ っ て、 発明思想の闪每 · 外延を限る も のでは ¾:い。

実施例 1- (ハイ ブリ ドーマ （225, 28S)の培養及び MoAbの精

製 ）

予め ダノレ べ ッ コ変法ィ ーグノレ培地（(Dulbecco's Modified Eagle Medium)CD→iE¾£) 、 （ 10% の仔牛血清を含む）） 中で 培養したハ イ ブ リ ド ー マ （225.28S) を BALB/c マウ ス （？、 8〜： L2週令 ） の腹腔 P に 5 X 10⁶儡づっ接種する。 なお、 マ ウ ス には接種の 1 週閭前 ブ リ スティ ン （2, 6, 10， 14- テ ト ラ メ チル ペ ン タデカ ン ） を 03 づっ腹腔闪へ投与し、 ハイ ブ リ ドーマが生育し易 状慈に してお く 。

ハイ ブ リ ド ー マの接種後 2 週間目 よ マ ク スが斃死す

OMPI るま で腹水を収集する。 こ の腹水を 3000 r.p.m.. 10分間遠 心 して赤血球及びプ リ ステ ィ ンを除 く 。 上清に飽和硫酸 ア ン モ ニ ク ム溶液を終濃度 33.3% な る よ う に充分混合 しながら加え、 4 で 1 時間以上故置する。 生成 した沈 澱を遠心分離する （ 10000 r.p.m., 10分 . 4 ） 。 集められ た ¾澱を少量の リ ン 酸塩緩銜生理食塩水液（ Ca¾び Mg な し ） （PBS) に溶か し、 透析用チ ュ ー ブ （Ce i 1 ophane Tubing-Seamless , 米国 Union Carbide 社製 ) 中に填め て一夜 PBS に対し透析する。 こ の閭少 く と も 4 回外液の - 交換を行い、 最後に M/100 ト リ ス 一塩酸緩衝液 （： pH8.0 ) に対 し透析 した後、 予め同一緩銜液で緩衝化された DE- 52カ ラ ム （"2.5 X 16.5CTZ ) に負荷する ό こ の カ ラ ムを同一の 緩衝液を用い、 但 し該液中の食塩濃度が 0 〜 0.5Μで直線 的に変化する よ う に食塩を添加 して溶出する。 溶出 ビー ク画分 （ 280nm おいて ） 中の MoAb 活性は ¹²⁵1—ブ σテ イ ン Α を用い、 ヒ ト 悪性黒色腫 （Human Mai lignant Melanoma) への結合 （binding) 量で測定する。 活性画分を 4 で濃 縮後、 セ フ ア デ ッ ク ス （Sepbadex) G-200 カ ラム （1.5X90 n) を通すと、 280nmの吸収パタ ー ンでは単一の ビークにま で精製される。 こ の MoAbは電気泳動的に も単一であ る。 この も のは凍結乾燥するか又は凍結状態で保存で き る。 なお、 以上の培養及び精製単離手段は、 ハイ プ リ ド ー マ の産生する、 ヒ ト 悪性黒色腫抗原に対する他の MoAb、 例 えば 376.74, 376.96. 465.14, 47354. 65325 ( 以上の钦値 はハイ ブ リ ドーマ とその産生する MoAb の種類を示す。）に 対 して も 適用 される。 各抗体は悪性黒色腫の抗原に対し てのみ特異的に結会するが、 抗体の種類- よ 多少結合 部位を異にするため、 钦種の MoAbと薬剤 と の結合体との 混合物は、 結合部位を異にする数種の抗体 · 薬剤結合体 に よ る カ ク テル療法の可能性を示唆する。

実施例 2. ( 薬剤 · MoAb結合体の製造 ， その 1 )

0 - メ チルイ ソ尿素 2582 （ 05 モ ル ）を水 25 m に溶か す。 これを 10 N苛性ソー ダを用 て ρΗ3·2 調整後、 SP- Η ( 麦類中から本発明者ら に よ ] 3 単齄された塩基性ポ リ ペプチ ド で、 4 末の一 S— S—鎖で結ばれた 45ケのァ ミ ノ酸 単位から構成される。 特開 ¾ 54 - 49342号参照。） 3 0 0mgを 添加、 溶解させた後、 さ ら に苛性ソ ーダ液を注加して pH .2ま で上げ、 4 で 48時間放置する。 次 で反応 ¾分液 をセ フ ア デ 7 ク ス G — 10を用 ゲル瀘通 し、 溶出液を凍 結乾燥する と、 グァニジル化 SP— Hの標品 299mgが得られ る。 この標品では、 原 S P— H 中の 5 個の e — リ ジンの遊 雜ァ ミ ノ 基の う ち約 4 個がグァニ ジ ル化されて るが、 その抗腫瘍細胞活性は無 理の S P— H と殆んど変ら _c 以上のグァニジル化 S P— H 35 mgと、 前例で得た抗体の 凍結乾燥品 10mg を 1.5 m の P B S に溶解し、.これに水溶性 力 ルボジィ ミ ド水溶液 60 £ を添加した後、 6 N塩酸で pH 8.5 に調整し、 室温下で 4 時閬撹拌する。 反応液は撹拌中 止後、 直ち にセ フ ア デ 'ノ ク ス G— 2 0 0カ ラ ム （ 1.5 X 90cm)を 用いてゲル瀘過に附す。 こ の際、 溶離液と して PBS を用 、 2 ^X の速度でカ ラ ム -中を自然流下させ、 溶出液. を 4 miづっ分画する。 第 1 図に示す如 く 、 溶出液は波長

280nm における吸光度を指標と して F— ι 〜 F - ΙΠ の 3 個の フ ラ ク シ ョ ン に分画される。 後述の如 く 、 フ ラ ク シ ョ ン F-I ( チ ュ ー ブ A 9 〜 10 ) 及び F - Π ( チ ュ ー ブ 12〜： 15 ) は所望の SP-H 'MoAb 結合体である。 これに対し フ ラ ク シ ョ ン F - ΠΙ ( チ ュ ー ブ ^ 26〜 30 ) は、 恐ら く 未反応のグァ 二ジル化 S P— H であろ う と考えられる。

実施例 3. ( 薬剤 · MoAb結合体の製造 . その 2 )

ア ド リ ア マ イ シ ン 40mg を 1 の PBS 中に溶解 し、 こ の - 溶液にやや過剌量のメ タ 過 ョ ク酸ナ ト リ ク ム （Na I0₄) を 加え、 暗所で 1 時間放置する。 得られた反応液にグ リ セ リ ン水（ IM)を終濃度 0.05 M に る よ う に加えて過剩の過 ョ ク '素酸 ソ ー ダを分解する。 こ の薬剤溶液に、 0.1 5 M の 炭酸力 リ ' ク ム溶液 中に溶か した実施例 1 の抗体 20mg を加え （pH9.5 ) 、 室温で 1 時間反応させる。 こ の反応液に、 水素化ホ ク素ナ ト リ ク ム を該反応液 1 ^当 i? 0.3mg の割で 加え、 3 7 ^で 2 時間放置 し てか らゲル瀘過する と、 ア ド リ ア マ イ シ ン ' MoAb結合体が得られる。

実施例 4. ( 薬剤 · MoAb 結合体の製造， その 3 )

実施例 1 で得た抗体³ Omg と ダ ウ ノ マ イ シ ン ⁵ mgを PBS

3 m に溶解 し、 こ れ にグル タ ル ア ルデ ヒ ド を終瀵度 0ュ％ になる よ う に加え、 室温で 15分間放置する。 得 られた反 応液をゲル瀘過 して精製する と、 目的の ダ ク ノ マイ シ ン • MoAb 結合体が得られる。

〔 本発明物質の免疫学的性質 ] 以上各実施例で得られた薬剤 · 抗体結合体は標的铯細 に対し選択的に結合する性質を有する。 以下、 本事実 証する実験事実を記載する。

c 実験材料 ）

細 胞 ： Colo 38 細胞（ ヒ ト悪性黒色腫細胞 ） 、 及び

a j i 細胞 ( B —細胞由来の ヒ ト リ ンホ イ ド 細胞 ）

培養液 ： Col o38 用一 10%仔牛血清添加ダルべ ッ コ変

- 形イ ー グル培地 （ 前出 ）

Raji 用 一 10%仔牛血清添加 RMPI1640培地 薬 剤 ： 実施例 2 記載の SP - H*MoAb 結合体、 PBS に 溶解 して適用。 なお、 稀釈には夫 々の培地 溶液を使用。

C 実験方法 ）

Co lo 38 及び Raj i 細胞を予め 3 日間培養 し、 各細胞 を 5 回培養液と同組成の洗浄液で洗っ てから、 ブ ラ ス チ ッ ク製ブ レ ー ト に各ブ レ ー ト 当 10⁵個つ'つ細胞を散 布する 。 こ れ ら の ブ レ ー ト に薬剤 （ 結合体 ） を終濃度 と して 当 0 〜 ： LOO 添加 し、 4 で 1 時間撹拌 しながら放置する。 次 で細胞を同様に 5 回洗 、 黄 色ブ ド ク 状球菌 (Staph, aureus sp .； 由来の、 ¹²⁵1で標 畿さ れたブ D テ ィ ン Aを適量加えて 1 時間放置 し、 同 様に 5 回洗净後、 ガン マ 一 力 ク ン タ ー （ ベ ッ ク マ ン社 C 米国 ) 製 ) を用いて の細胞に対する付着量を測 る。 因みに、 プ σ テ ィ ン Αは結合体の FC部分に結合す るため、 細胞に結合体が結合 しておればプ ロ テ イ ン A もそれに結合するので、 放射能の測定に よ ！？ 桔合の有 無及び程度が判る。

( 実験結果 ）

以上の実験結果は第 2 図に示される。 図示の如 く 癌 特異抗原を持つ Col ₀38 は実裉で、 該抗原を持た い Raji は点裱で示される。 MoAb(225.28S) 、 結合体 I (F-I)、 結合体 Π (F - Π) はその濃度に従 っ て Colo 38細胞に結合 しているのが判る。 これに反 し適応抗原を有し い Raji 細胞に対 しては、 抗体 （225.28S：) 、 結合体 I (F - 1 ) 及 び結合体 Π (F— Π：) の つ'れ も全 く 結合 して 。 フ ラ ク シ ヨ ン F— ΙΠ は Co 10 钿胞に^合し いので、 ゲル 瀘過時の挙動と併せて未反応の SP— H であろ う と推測 される。 な お、 対照と した未結合の薬剤単独 （SP- H ) は、 抗体を有 し ¾ ため当然のこ と なが ら Co l o 及び Ra j i づれの钿胞に対 して も結合し ¾い。

〔 本発明物貧の钿胞障害効果 （ そ.の 1 ) 〕

本発明に係る薬剤 · 抗体結会体は抗原細胞に対し明ら かに選択性を有する。 以下、 この結論を支持する実験事 実を示す。

( 実験材料 )

上掲実験と同 じ。

( 実赣方法 ）

各細胞をブ レ ー ト 当 2 X 10⁵個つ'つ分散 させ、 同時 に各^合体を培地 1 m 当 0 〜： 100 づっ添加 して 37°C

O PI 32!

48時間培養した後、 一部の細胞を採取してその生死を 終濃度 0.0 5 %の ト リ パ ン ブルーに対する染色性の存否 ( 染色されな も のを " 生 " 、 染色される も のを "死" と して判断 ） をチ ュ ノレク ー ビュ ノレ カ ー （Tii r k-Biirke r ) 計算盤を用 て算定した。

( 実験結果 ）

実験結果は添附第 3 図及び第 4 図に示される。 前記 結合体 I 及び Π はメ ラ ノ ー マ抗原を有する Colo 38細胞 に対し細胞障害効果を示すが （ 第 3 図参照 ） 、 痛抗原— を有 し Raj i細跑には殆んど障害効果を示さ い （ 第 4 図参照 ） 。 これに反し対照と して用 た MoAb C225 28S ) はいずれの細胞を も傷害せず、 ま た薬剤単独 （ SP-Ή) 及びフ ラ ク シ ョ ン ， F— Πίは どの細胞に対して も 強 障害作用を呈している。

[ 本発明物質の細胞障害効果 （ その 2 ) ]

その 1 の実験を実施例 3 で得られたァ ド リ アマイ シ ン • MoAb 結合体を用 て反復した。 結果を第 7 図に示す。 図示の如 く 对照の抗体単独は Colo 38細胞に対 し全く 致死 効果を有 し 。 対照のァ ド リ アマイ シ ン及び本発明薬 剤は共に同一細胞に対し強力 致死効果を有するが、 後 者は前者に fcし一層強力である。

C 本発明物質の細胞生理作招 ]

本発明物質が標的細胞に対 し阻害効果を発揮する理由 は、 薬剤単独使用時と同様であろ う と思われる。 これを 検証するため、 細胞のチ ミ ジ ン苡 こみ能を阻害する作 ϋ¾

用がある こ と が判 っ ている SP— H と抗体と の桔合体につ き 以下の実験を行 う 。

( 実験材料 ）

前摁各実験と 同 じ。

( 実験方法 ）

各細胞をブ レ ー ト 当 i? 2 X 10⁵個つ'つ分散 し、 同時に 各結合体及び対照物貧を培地 1 ^当 ]) .0 〜2 0 0 づっ 添加 して 37て、 8 時閭培養する 。 その後、 各プ レ ー ト に l A Ciの ³ H — チ ミ ジ ン を加え、 16時間径過後に夫 々 の細胞の取 こ みチ ミ ジ ン量を測定する。

C 実験結果 ）

第 5 図が示す と 、 結合体 I 及び Π は、 —'標的細胞 の CDIO 38に対しその 加濃'度に従 っ てチ ミ ジ ンの取 i? こみを阻害 して る。 これに対し、 第 6 図に示す適合 抗原を持た Raji ^膣では、 チ ミ ジ ン の取 ！？ こみは 全く 影響を受けない。 お、 対照である抗原単独及び SP - H 単独では、 予想される と ？ 、 前者はチ ミ ジン の取 こ みを全 く 阻害せず、 後者は強い阻害を示す。 C 本発明物質の実験動物に対する抗腫瘙効果（その 1 ) 〕

前実験において、 本発^物質が試験管内で標的細胞に 対し選択的に細胞障害作用を奏する事夷が確認 されたの で、 次に実際の標的 飽 （ ヒ ト メ ラ ノ ー マ ， Colo38 )を ヌ ー ド マ ウ ス に接種 し、 こ れ に本発明物質を投与 して生' 体内での有効性を検討 した と こ ろ、 その効果を明 らかに 観察で き た。 以下、 その笋験事実を記載する。 Ϊ4!

( 実験材料 ）

細 胞 ： Col。³8 C ヒ ト 悪性黒色腫埤胞 ）

培養液 ： 10% 仔牛血清添加

RMPI 1640 培地 ₀

薬 剤 ： 実施例 2 記載の SP - H'MoAb結合体

動 物 ： BALB/cA C-nu/JCR) ヌ ー ド マ ウ ス $ 6 週舍。

ヒ ト メ ラ ノ ー マ耙胞は各マ ウ ス に 3.6 X 10⁶ 個つ'つ皮下注射。 薬剤及び対照 （ 抗体単独 及び SP— H単狻 ） は夭 々 0.1mg/マク ス、 lmg - /マク ス 及び 05 mg /kg の割で 1 ,3 ,5及び 20 日 目 に腹腔闪注射。

( 実験結果及び考察 ）

結果は第 ^ 8 図に示される。 対照群のマ タ ス （ 各 6匹） は 30日以闪に死亡 した o 即ち SP- H単独又は抗体単独 の注射はマ ウ スの生存を延長で き るかっ たが、 本発明 薬剤投与群 （ 各 6 匹 ） は対照群に比べて明 らかに生存 日飲が延長され、 ³⁷ 日後まで生存 した。

[ 本発明薬剤の実驗動物に对する腫瘍効果 （その 2 ) ]

その 1 の実験にお て、 標的細胞を腹水型の Colo 38に 代えて同様の実験を反復 した结果を第 9 0と して示す。 図示の如 く 対照群のマ ク ス 20日 ま でに全部死亡したが、 本発明薬剤投与群のマ ウ スは早 く と も 25日間生存 し、 1 匹は 60日 後 も なお生存 した。 従っ て本発^薬剤の効果は 前例に比べ一層明瞭であ る。

本発明物質は蹉床的に 管闪又は筋肉內注射の形で投 J 5;

与されるか又は瘙組織に対 し直接適用 されるのが最適で ' あろ う 。 先の実験結果が示す とお ]? 、 結合体は標的癥細 胞の症特異抗原 と結合 し、 その後、 瘙細胞の食作用 （phagocytosis ) 及び飲作用 （pinocytosi s) に よ ¾部に取 ！？ こ ま れる結果、 当該細胞に致 ¾効果を奏する も の と推定さ れる。 こ の際、 適応抗原を有 し な その他の正常細胞に はこの結合体が結合し ¾いため、 当然致死作用が表われ

い も の と考える こ とがで き る。

〔産業上の利用可能性 〕 .

以上各実験が示す如 く 、 本発明に係る薬剤 · MoAb結合 体は、 適会抗原を持つ特定の瘙細胞に対 してのみ強 親 和性を現わ し、 当該痛細胞を死滅 させ文はその増殖を阻 止する効果を有する反面、 正常細胞 対しては殆んど影 響を与え ので、 選択的瘙治療剤 と しての人類の痣克 服への貢献が嘱望 される。

-BU EAU

0MPI

Claims

ひら） 請 求 の 範 囲

(1) ハイ ブ リ ド ーマの産生 した ヒ ト の痛抗原に対する単

ク σ — ン性抗体と制瘙作用物質とが化学的に結合して

る選択性制瘙剤。

(2) ハイ ブ リ ド ーマが、 ヒ ト 悪性黒色腫で感作 した動物

C BALB /cマ ウ ス ） の胖臓細胞 と動物の骨髄腫細胞 （ ミ ェ σ — マ細胞 ） との融合細胞である特許請求の範囲第

(1)項記載の制瘙剤。

(3) 制瘙作用物質が麦由来の細胞毒性を有する塩基性ポ

リ ペプチ ドである特許請求の範囲第（1)項又は第 (2)項記 載の制銪剤。

(4) 抗体中の酸性ア ミ ノ 酸の遊離力 ル ボキ シ ル基と，制

作用物貧中の e — リ ジ ン のア ミ ノ 基とが酸ア ミ ドを構 成 して結合している特許請求の範囲第 (3)項記載の制癥 剤 o

(5) 抗体中の塩基性ア ミ ノ 酸の ^離ァ ミ ノ基と、 制瘙作

用物質中の遊離カ ル ボ キ シ ノレ基とが酸ア ミ ドを構成 し て結合 して る特許請求の範囲第 (1)項又は第 (2)項記載 の制街剤。

(6) 抗体中 の塩基性ア ミ ノ酸の遊離ァ ミ ノ基が、 糖を構

成要素 とする制瘙剤の骨核炭素原子と結合して る特 許請求の範 H第（1)項又は第（²)項記載の制癍剤。

(7) 抗体中の塩基性ア ミ ノ 酸の遊齄ァ ミ ノ 基が制癥作用

物質と飽和. 2 価ア ルデヒ ドを介.して交叉結合 している 特許請求の範囲第（1)項又は第（²)項 E載の制 S剤。

OMPI