JPH0259128B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は選択性制癌剤、殊にハイブリドーマの
産生したヒトの癌抗原に対する単クローン性抗体
（以下“MoAb”と略す）と制癌作用物質とが炭
素―窒素共有結合しているヒトの癌細胞に対し特
異的に親知性を有す制癌剤に関する。

悪性腫瘍、即ち癌に対する治療薬としては、既
に多数の細胞毒性物質が臨床的に実用又は試用さ
れているが、これらはいずれも癌細胞に対し非特
異的であつて、正常細胞に対しても毒性を有する
ので、有効濃度に達するまで投与量を増加するの
は不可能であるという本質的な欠点がある。この
ため、現在においても癌の化学療法剤に対する信
頼性は乏しく、早期発見、外科手術というのが依
然として癌治療の大道である。

そこで近年に至り、制癌作用や細胞毒性を有す
る物質を特殊なキヤリヤーに結合させ、これを選
択的に癌細胞に伝達、作用させるというアイデア
が生まれ、この線に沿つて、癌細胞の持つ抗原に
対する抗体の利用が研究されてきた。元来、同一
個体の同種の、又は異種の抗腫瘍抗体は、必ずし
も癌細胞に対し傷害作用を発揮するという訳では
ないが、高い確率をもつて癌細胞に結合する性質
を有する点では共通している。この性質を利用し
て、例えば、 ●ダウノマイシン等の制癌剤と抗腫瘍免疫グロブ
リンのFab′二量体とを共有結合させた例（特
開昭51−144723号）、 ●ジフテリア毒素とウサギSV₄₀抗体をグルタル
アルデヒドで架橋した複合体（F.L.Moolten
et al.，J.Natl.Cancer Inst.，Vol.55，pp.473
〜477（1975））、 ジフテリア毒素と抗リンパ球抗体とをクロラ
ムブシルを介して結合した結合体（Nature，
Vol.271，pp.752〜754（1978））、 などが発表れており、この他、特開昭55−
136235、同55−49321、同56−16418、同56−
16417などの発明も公開されている。

しかしながら、これらの文献で使用される抗体
はどれも単一の抗体ではなく、正常細胞の抗原に
対する抗体をも併せ含有するため、癌細胞に対す
る選択性が不充分であつて、このため、薬剤が正
常細胞に対しても傷害的に作用する可能性が高
い。

しかるに、本発明者らは癌細胞に対してのみ選
択的に作用しうる抗腫瘍薬剤の創製に努力した結
果、細胞融合法により得られた融合細胞（ハイブ
リドーマ）が産生する蛋白を精製することにより
ヒト癌細胞の抗原に対するMoAbを得ることに成
功し、これを抗腫瘍薬剤又は細胞毒性物質と炭素
―窒素共有結合させることにより、ここに癌細胞
に対して特異性のある選択性制癌剤を得ることが
できた。

即ち、本発明の薬剤は、癌細胞の成長を抑制し
又はこれを死滅させる作用を有する活性成分と、
該活性成分を担持し、これを癌細胞に誘導する担
体成分とから構成される。活性成分は、今日制癌
剤として実用されていると否とを問わず強力な細
胞毒性作用を有するものが好ましく、例えばエン
ドキサン、ナイトロミン、サルコリシン、ミレラ
ン、シクロホスフアミドなどのアルキル化剤、ア
メトプテリン、８―アザグアニン、５―フルオロ
ウラジル、シトシンアラビノシド、６―メルカプ
トプリンなどの代謝拮抗物質；マイトマイシン
Ｃ、アクチノマイシンＤ、アドリアマイシン、ダ
ウノマイシン、ザルコマイシン、などの抗生物
質；ビンブラスチンなどのアルカロイド；ムギ由
来の塩基性ポリペプチド（SP₁，SP₂，SP―Ｈな
ど）、ジフテリア毒素、ボツリヌス毒素、破傷風
毒素、リシン（ricin）のような毒性蛋白又はペ
プチドが例示できる。

但し、これらの制癌作用物質は、原始的（直
接）又は二次的（間接）に抗体の遊離アミノ基又
はカルボキシル基と炭素―窒素共有結合を形成し
うる反応性残基を有しなければならない。

担体成分はヒト癌抗原に対する単一抗体であつ
て発明の主要部を構成する。このものは、ヒトの
癌細胞で感作された適当な実験動物、例えば
BALB／ｃマウスの脾臓細胞と、マウス由来の
骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）との融合細胞（ハ
イブリドーマ）で、これをクローニングすること
により、ヒト癌細胞の癌特異抗原と結合能のある
MoAbを産生する融合細胞を選択、分離し、次い
でこの選択された癌特異抗原と結合能を有する抗
体産能を有する融合細胞を増殖させることにより
得られる。

培養法又は動物体内で増殖した融合細胞（ハイ
ブリドーマ）は採集され、それから適宜の手段で
抗体が分離される。発明目的上、この癌抗体は可
及的純粋でなければならず、理想的には電気泳動
的に単一にまで純化されているのが好ましい。

精製された抗体は、次いで所望の抗腫瘍性薬剤
又は細胞毒性物質と炭素―窒素共有結合せしめら
れる。この結合は、抗体の有する遊離のアミノ基
又はカルボキシル基と薬剤の持つアミノ基、カル
ボキシル基、アルデヒド基などを化学的に反応さ
せることにより行われるが、具体的には例えば以
下の諸法がある。

(i) 薬剤が塩基性蛋白又はポリペプチドである場
合―この場合、結合体の合成中に抗体・抗体、
薬剤・薬剤、抗体・薬剤・薬剤などの副生物の
生成を如何に防ぐかという点が重要である。さ
らに、結合体が抗体として特異性を有しなけれ
ばならないのも当然である。しかし発明者は、
薬剤中のアミノ基の大部分をグアニジル化した
後、その遊離アミノ基を、抗体中の酸性アミノ
酸部分のカルボキシル基とカルボジイミド試薬
を用いて縮合させると、一般に良好な結果の得
られることを確認した。この方法を適用しうる
具体的な薬剤としては、例えばムギ由来の塩基
性ポリペプタイド（SP₁，SP₂，SP―Ｈなど）、
マイトマイシン、ダウノマイシン、アドリアマ
イシン、ACNU、カルボコン、メルフアラン、
クロラムブチルなどが例示される。

(ii) 薬剤が糖を構成成分とする場合―この場合、
薬剤の糖部分における隣接したヒドロキル基
（一部アミノ基の場合もある）の間をメタ過ヨ
ウ素酸ナトリウムを用い切断してアルデヒド基
を生成させた後、抗体の塩基性アミノ基との間
にシツフベースを形成させ、このシツフベース
を水素化ホウ素ナトリウムのような選択的還元
試薬で還元して相当するアミノメチル体とす
る。この方法により結合できる薬剤化合物の具
体例としては、例えばダウノマイシン、アドリ
アマイシン、FT―207、シタウビン、チオイノ
シンなどが例示される。

(iii) 薬剤がアミノ基を有する場合―この場合はグ
ルタルアルデヒドの如き二価アルデヒドにより
薬剤のアミノ基と抗体のアミノ基とを交叉結合
させる。結合物は必要に応じ飽和化合物に還元
される。

以下実施例により発明の実施手段を具体的に述
べるが、もちろん説明は単なる例示であつて発明
思想の内包・外延を限るものではない。

実施例 １ （ハイブリドーマ（225，28S）の培養及び
MoAbの精製） 予めダルベツコ変法イーグル培地（Dulbecco′s
Modified Eagle Medium）（Ｄ―MEM）、（10％
の仔牛血清を含む）中で培養したハイブリドーマ
（225.28S）をBALB／ｃマウス（♀、８〜12周
令）の腹腔内に５×10⁶個づつ接種する。なお、
マウスには接種の１周間前にプリステイン（２，
６，10，14―テトラメチルペンタデカン）を0.3
mlづつ腹腔内へ投与し、ハイブリドーマが生育し
易い状態にしておく。

ハイブリドーマの接種後２周間目よりマウスが
斃死するまで腹水を収集する。この腹水を3000r.
p.m.，10分間遠心して赤血球及びプリステインを
除く。上清に飽和硫酸アンモニウム溶液を終濃度
33.3％になるように充分混合しながら加え、４℃
で１時間以上放置する。生成した沈澱を遠心分離
する（10000r.p.m.，10分，４℃）。集められた沈
澱を少量のリン酸塩緩衝生理食塩水液（Ca⁺⁺及び
Mg⁺⁺なし）（PBS）に溶かし、透析用チユーブ
（Cellophane Tubing―Seamless，米国Union
Carbide社製）中に填めて１夜PBSに対し透析す
る。この間少くとも４回外液の交換を行い、最後
にＭ／100トリスー塩酸緩衝液（PH8.0）に対し透
析した後、予め同一緩衝液で緩衝化されたDE―
52カラム（2.5×16.5cm）に負荷する。このカラ
ムを同一の緩衝液を用い、但し該液中の食塩濃度
が０〜0.5Mで直線的に変化するように食塩を添
加して溶出する。溶出ピーク画分（280nmにおい
て）中のMoAbの活性は ¹²⁵―プロテインＡを
用い、ヒト悪性黒色腫（Human Mallignant
Melanoma）への結合（binding）量で測定する。
活性画分を４℃で濃縮後、セフアデツクス
（Sephadex）Ｇ―200カラム（1.5×90cm）を通す
と、280nmの吸収パターンでは単一のピークにま
で精製される。このMoAbは電気泳動的にも単一
である。このものは凍結乾燥するか又は凍結状態
で保存できる。なお、以上の培養及び精製単離手
段は、ハイブリドーマの産生する、ヒト悪性黒色
腫抗原に対する他のMoAb，例えば376.74，
376.96，465.14，473.54，653.25（以上の数値はハ
イブリドーマとその産生するMoAbの種類を示
す。）に対しても適用される。各抗体は悪性黒色
腫の抗原に対してのみ特異的に結合するが、抗体
の種類により多少結合部位を異にするため、数種
のMoAbと薬剤との結合体との混合物は、結合部
位を異にする数種の抗体・薬剤結合体によるカク
テル療法の可能性を示唆する。

実施例 ２ （薬剤・MoAb結合体の製造、その１） Ｏ―メチルイソ尿素2.582ｇ（0.5モル）を水25
mlに溶かす。これを10N苛性ソーダを用いてPH
3.2に調整後、SP―Ｈ（麦類中から本発明者らに
より単離された塩基性ポリペフチドで、４本の―
Ｓ―Ｓ―鎖で結ばれた45ヶのアミノ酸単位から構
成される。特開昭56−49342号参照。）300mgを添
加、溶解させた後、さらに苛性ソーダ液を注加し
てPH9.2まで上げ、４℃で48時間放置する。次い
で反応画分液をセフアデツクスＧ―10を用いゲル
濾過し、溶出液を凍結乾燥すると、グアニジル化
SP―Ｈの標品299mgが得られる。この標品では、
原SP―Ｈ中の５個のε―リジンの遊離アミノ基
のうち約４個がグアニジル化されているが、その
抗腫瘍細胞活性は無処理のSP―Ｈと殆んど変ら
ない。

以上のグアニジル化SP―H35mgと、前例で得
た抗体の凍結乾燥品10mgを1.5mlのPBSに溶解し、
これに水溶性カルボジイミド水溶液60μを添加
した後、6N塩酸でPH8.5に調整し、室温下で４時
間攪拌する。反応液は攪拌中止後、直ちにセフア
デツクスＧ―200カラム（1.5×90cm）を用いてゲ
ル濾過に附す。この際、溶離液としてPBSを用
い、24ml／時の速度でカラム中を自然流下させ、
溶出液を４mlづつ分画する。第１図に示す如く、
溶出液は波長280nmにおける吸光度を指標として
Ｆ―〜Ｆ―の３個のフラクシヨンに分画され
る。後述の如く、フラクシヨンＦ―（チユーブ
No.９〜10）及びＦ―（チユーブNo.12〜15）は所
望のSP―Ｈ・MoAb結合体である。これに対し
フラクシヨンＦ―（チユーブNo.26〜30）は、恐
らく未反応のグアニジル化SP―Ｈであろうと考
えられる。

実施例 ３ （薬剤・MoAb結合体の製造、その２） アドリアマイシン40mgを１mlのPBS中に溶解
し、この溶液にやや過剰量のメタ過ヨウ酸ナトリ
ウム（NaIO₄）を加え、暗所で１時間放置する。
得られた反応液にグリセリン水（1M）を終濃度
0.05Mになるように加えて過剰の過ヨウ素酸ソー
ダを分解する。この薬剤溶液に、0.15Mの炭酸カ
リウム溶液１ml中に溶かした実施例１の抗体20mg
を加え（PH9.5）、室温で１時間反応させる。この
反応液に水素化ホウ素ナトリウムを該反応液１ml
当り0.3mgの割で加え、37℃で２時間放置してか
らゲル濾過すると、アドリアマイシン・MoAb結
合体が得られる。

実施例 ４ （薬剤・MoAb結合体の製造、その３） 実施例１で得た抗体30mgとダウノマイシン５mg
をPBS3mlに溶解し、これにグルタルアルデヒド
を終濃度0.1％になるように加え、室温で15分間
放置する。得られた反応液をゲル濾過して精製す
ると、目的のダウノマイシン・MoAb結合体が得
られる。

〔本発明物質の免疫学的性質〕

以上各実施例で得られた薬剤・抗体結合体は標
的癌細胞に対し選択的に結合する性質を有する。
以下、本事実を証する実験事実を記載する。

（実験材料） 細 胞：Colo38細胞（ヒト悪性黒色腫細胞）、
及びRaji細胞（Ｂ―細胞由来のヒトリンホイ
ド細胞） 培養液：Colo38用―10％仔牛血清添加ダルベ
ツコ変形イーグル培地（前出）Raji用―10％
仔牛血清添加RMPI1640培地 薬 剤：実施例２記載のSP―Ｈ・MoAb結合
体、PBSに溶解して適用。なお、稀釈には
夫々の培地溶液を使用。

（実験方法） Colo38及びRaji細胞を予め３日間培養し、各
細胞を５回培養液と同組成の洗滌液で洗つてか
ら、プラスチツク製プレートに各プレート当り
10⁵個づつ細胞を散布する。これらのプレートに
薬剤（結合体）を終濃度として１ml当り０〜
100μg添加し、４℃で１時間攪拌しながら放置す
る。次いで細胞を同様に５回洗い、黄色ブドウ状
球菌（Staph.aureus sp.）由来の、 ¹²⁵で標識
されたプロテインＡを適量加えて１時間放置し、
同様に５回洗滌後、ガンマーカウンター（ベツク
マン社（米国）製）を用いて ¹²⁵の細胞に対す
る付着量を測る。因みに、プロテインＡは結合体
のFc部分に結合するため、細胞に結合体が結合
しておればプロテインＡもそれに結合するので、
放射能の測定により結合の有無及び程度が判る。

（実験結果） 以上の実験結果は第２図に示される。図示の如
く癌特異抗原を持つColo38は実線で、該抗原を
持たないRajiは点線で示される。MoAb
（225.28S）、結合体（Ｆ―）、結合体（Ｆ―
）はその濃度に従つてColo38細胞に結合して
いるのが判る。これに反し適応抗原を有しない
Raji細胞に対しては、抗体（225.28S）、結合体
（Ｆ―）及び結合体（Ｆ―）のいづれも全
く結合していない。フラクシヨンＦ―はColo
細胞に結合しないので、ゲル濾過時の挙動と併せ
て未反応のSP―Ｈであろうと推測される。なお、
対照とした未結合の薬剤単独（SP―Ｈ）は、抗
体を有しないため当然のことながらColo及び
Rajiいづれの細胞に対しても結合しない。

〔本発明物質の細胞障害効果（その１）〕 本発明に係る薬剤・抗体結合体は抗原細胞に対
し明らかに選択性を有する。以下、この結論を支
持する実験事実を示す。

（実験材料） 上掲実験と同じ。

（実験方法） 各細胞をプレート当り２×10⁵個づつ分散させ、
同時に各結合体を培地１ml当り０〜100μづつ
添加して37℃、48時間培養した後、一部の細胞を
採取してその生死を終濃度0.05％のトリパンブル
ーに対する染色性の存否（染色されないものを
“生”、染色されるものを“死”として判断）をチ
ユルクービユルカー（Tu¨rk―Bu¨rker）計算盤を
用いて算定した。

（実験結果） 実験結果は添附第３図及び第４図に示される。
前記結合体及びはメラノーマ抗原を有する
Colo38細胞に対し細胞障害効果を示すが（第３
図参照）、癌抗原を有しないRaji細胞には殆んど
障害効果を示さない（第４図参照）。これに反し
対照として用いたMoAb（225.28S）はいづれの細
胞をも傷害せず、また薬剤単独（SP―Ｈ）及び
フラクシヨン、Ｆ―はどの細胞に対しても強い
障害作用を呈している。

〔本発明物質の細胞障害効果（その２）〕 その１の実験を実施例３で得られたアドリアマ
イシン・MoAb結合体を用いて反反復した。結果
を第７図に示す。図示の如く対照の抗体単独は
Colo38細胞に対し全く致死効果を有しない。対
照のアドリアマイシン及び本発明薬剤は共に同一
細胞に対し強力な致死効果を有するが、後者は前
者に比し一層強力である。

〔本発明物質の細胞生理作用〕

本発明物質が標的細胞に対し阻害効果を発揮す
る理由は、薬剤単独使用時と同様であろうと思わ
れる。これを検証するため、細胞のチミジン取り
こみ能を阻害する作用があることが判つている
SP―Ｈと抗体との結合体につき以下の実験を行
う。

（実験材料） 前掲各実験と同じ。

（実験方法） 各細胞をプレート当り各２×10⁵個づつ分散し、
同時に各結合体及び対照物質を培地１ml当り０〜
200μgづつ添加して37℃、８時間培養する。その
後、各プレートに1μCiの ³H―チミジンを加え、
16時間経過後に夫々の細胞の取りこみチミジン量
を測定する。

（実験結果） 第５図が示すとおり、結合体及びは、標的
細胞のColo38に対しその添加濃度に従つてチミ
ジンの取りこみを阻害している。これに対し、第
６図に示す適合抗原を持たないRaji細胞では、チ
ミジンの取りこみは全く影響を受けない。なお、
対照である抗原単独及びSP―Ｈ単独では、予想
されるとおり、前者はチミジンの取りこみを全く
阻害せず、後者は強い阻害を示す。

〔本発明物質の実験動物に対する抗腫瘍効果（そ
の１）〕 前実験において、本発明物質が試験管内で標的
細胞に対し選択的に細胞障害作用を奏する事実が
確認されたので、次に実際の標的細胞（ヒトメラ
ノーマ、Colo38）をヌードマウスに接種し、こ
れに本発明物質を投与して生体内での有効性を検
討したところ、その効果を明らかに観察できた。
以下、その実験事実を記載する。

（実験材料） 細 胞：Colo38（ヒト悪性黒色腫細胞） 培養液：10％仔牛血清添加 RMPI 1640培地。

薬 剤：実施例２記載のSP―Ｈ・MoAb結合
体 動 物：BALB／cA（―nu／JCR）ヌードマウ
ス♀６周令。ヒトメラノーマ細胞は各マウス
に3.6×10⁶個づつ皮下注射。薬剤及び対照
（抗体単独及びSP―Ｈ単独）は夫々0.1mg／
マウス、１mg／マウス及び0.5mg／Kgの割で
１，３，５及び20日目に腹腔内注射。

（実験結果及び考察） 結果は第８図に示される。対照群のマウス（各
６匹）は30日以内に死亡した。即ち5P―Ｈ単独
又は抗体単独の注射はマウスの生存を延長できな
かつたが、本発明薬剤投与群（各６匹）は対照群
に比べて明らかに生存日数が延長され、37日後ま
で生存した。

〔本発明薬剤の実験動物に対する腫瘍効果（その
２）〕 その１の実験において、標的細胞を腹水型の
Colo38に代えて同様の実験を反復した結果を第
９図として示す。図示の如く対照群のマウスは20
日までに全部死亡したが、本発明薬剤投与群のマ
ウスは早くとも25日間生存し、１匹は60日後もな
お生存した。従つて本発明薬剤の効果は前例に比
べ一層明瞭である。

以上各実験が示す如く、本発明に係る薬剤・
MoAb結合体は、適合抗原を持つ特定の癌細胞に
対してのみ強い親和性を現わし、当該癌細胞を死
滅させ又はその増殖を阻止する効果を有する反
面、正常細胞に対しては殆んど影響を与えないの
で、選択的癌治療剤としての貢献が嘱望される。

本発明物質は臨床的に血管内又は筋肉内注射の
形で投与されるか又は癌組織に対し直接適用され
るのが最適であろう。先の実験結果が示すとお
り、結合体は標的癌細胞の癌特異抗原と結合し、
その後、癌細胞の食作用（phagocytosig）及び
飲作用（pinocytosis）により内部に取りこまれ
る結果、当該細胞に致死効果を奏するものと推定
される。この際、適応抗原を有しないその他の正
常細胞にはこの結合体が結合しないため、当然致
死作用が表われないものと考えることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、SP―Ｈ・抗体結合反応生成物のセ
フアデツクスＧ―200による分画状況を示すグラ
フ（溶出曲線図）、第２図は、SP―Ｈ・抗体結合
体のColo38細胞に対する選択的吸着能を示すグ
ラフ、第３図及び第４図はSP―Ｈ・MoAb結合
体のColo38細胞（メラノーマ細胞）及びRaji細
胞（正常細胞）に対する阻害効果を示すグラフ、
第５図及び第６図はSP―Ｈ・MoAb結合体の
Colo38細胞及びRaji細胞に対するチミジン取り
こみ阻害効果を示すグラフ、第７図はアドリアマ
イシン・MoAb結合体のColo38細胞に対する細
胞障害効果を示すグラフ、第８図及び第９図は、
本発明に係るSP―Ｈ・MoAb結合体の担癌マウ
スに対する延命効果を示すグラフである。第２図
〜第６図を通じ実線はColo38に対する結果を、
点線はRaji細胞に対する結果を示し、また△、
〇、●、□、及び▲は夫々MoAb単独、結合体
（第１図Ｆ―）、結合体（第１図Ｆ―）、フ
ラクシヨン（第１図Ｆ―）及びSP―Ｈ単独
（物質記号SUN9102）を現わす。また、第７図中
〇はアドリアマイシン・MoAb結合体、○†い魯▲

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ハイブリドーマの産生したヒトの癌抗原に対
   する単クローン性抗体中の遊離アミノ基又はカル
   ボキシル基が、制癌作用物質の反応性残基との間
   で炭素―窒素共有結合していることを特徴とする
   選択性制癌剤。 ２ ハイブリドーマが、ヒトの悪性黒色腫で感作
   した動物（BALB／マウス）の脾臓細胞と動物
   の骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）との融合細胞で
   ある請求項１記載の制癌剤。 ３ 制癌作用物質が、ムギ由来の細胞毒性を有す
   る塩基性ポリペプチドである請求項１記載の制癌
   剤。 ４ 抗体中の酸性アミノ酸の遊離カルボキシル基
   と制癌作用物質中のε―リジンのアミノ基とが、
   酸アミドを形成して炭素―窒素共有結合している
   請求項３記載の制癌剤。 ５ 抗体中の塩基性アミノ酸の遊離アミノ基と制
   癌作用物質中の遊離カルボキシル基とが、酸アミ
   ドを形成して炭素―窒素共有結合している請求項
   １記載の制癌剤。 ６ 抗体中の塩基性アミノ酸の遊離アミノ基が、
   糖を構成要素中の一部とする制癌作用物質の骨格
   炭素原子とアミノメチル結合を形成して炭素―窒
   素共有結合している請求項１記載の制癌剤。 ７ 抗体中の塩基性アミノ基の遊離アミノ基が、
   制癌作用物質遊離アミノ基と飽和二価アルデヒド
   を介して交叉的にシツフベース又はアミノメチル
   結合を形成して炭素―窒素共有結合している請求
   項１記載の制癌剤。