WO1982002212A1 - Method for assaying cholinesterase activity - Google Patents

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WO1982002212A1
WO1982002212A1 PCT/JP1981/000405 JP8100405W WO8202212A1 WO 1982002212 A1 WO1982002212 A1 WO 1982002212A1 JP 8100405 W JP8100405 W JP 8100405W WO 8202212 A1 WO8202212 A1 WO 8202212A1
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • Y10S435/817—Enzyme or microbe electrode

Definitions

  • Colin esterase is a general term for enzymes that hydrolyze cholesterol into cholesterol and organic.o
  • Cii-E which is contained in erythrocytes, nervous system, muscle, etc., and specifically separates acetylcelline or acetyl- -methylcholin, and serum, liver, stomach, etc. , which specifically separates benzoylcholin and mainly separates relatively long-chain fatty acid cholesterols such as ptyrylcholin.
  • the most useful for diagnosing the disease is to determine the activity of the channel Ch-: B, and to measure the Ch-E activity in extracorporeal blood. ⁇ , ⁇ ⁇ 3 ⁇ 4 3 ⁇ 4 ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇
  • the component of the present invention is that ⁇ 55-093 ⁇ 96 No. 10,000 was emitted to ⁇ , so that it becomes ⁇ ⁇ and ⁇ - One four one
  • ni and R 2 represent hydrogen or ig either of which represents a low alkoxy of ci to C 4
  • S represents a halogen atom
  • NADP DP p-Hydroxybenzoate is formed in the presence of the coenzyme NAD PH
  • the harmful substances such as pyrilbinascorbin during the lubrication can be used to prevent the color reaction.
  • the ⁇ -hydroxy acid used in the present invention is a genus of Pseudomonas, for example,
  • 0 can be prepared by a conventional method, P Yu ⁇ solvent - ⁇ Seto carboxymethyl benzoic ⁇ Ku port Rye de and
  • N, N-bis (2-hydroxylexetil ⁇ ) glycine and N-tris- (hydroxymethyl) methelglycine are used.
  • FAD flavin adenidine nucleotide
  • the reagents and elements used in the method of the present invention can be used in a wide range of concentrations without affecting the results of the Cli-E activity measurement. It is not necessary to restrict it to a narrow range a, and it is not necessary to limit it tightly, and it is 200 ⁇ 5000 preferably, 220-700 0 / ⁇ , complement ⁇ 0-1-0-7 mm M, 0, 3 to 0.5 mM, group 0.2 to 2 Om preferably ⁇ 0.2 to 2 mM, FAD 0.1 ⁇ M to 30 M, preferably 1 to 5 M
  • Fig. 1 shows the reaction time when incubating around plate 50 and the M of NAD PH in the present invention.
  • Fig. 3 shows a correlation diagram between the present invention and the butyrylthiocholine method, and Fig. 3 shows rare serum as a trial subject in Shinjing ⁇ 2; There is 0
  • Trishydroxymethyl-minomethane-maleic solution 50 mM p-Hydroxyzolincholine ImM sodium 0.003 mM
  • Tris-hydroxymethylaminoamine 6 ⁇ 06 g 3 ⁇ 4 Dissolve in water (about 800) and adjust to pH 8.2 with maleic acid solution. O P-hydroxybenzoic acid Turkey re-down-tio over de 3 5 1, 5 3 ⁇ 4 -. 2 Na door Li ⁇ -time 2 52 ⁇ ,
  • FIG. 2 shows the result of mounting two types of serum.
  • Ch-E living value is calculated by the following formula]? Calculated o
  • ⁇ formula ⁇ Molecular extinction coefficient X Serum amount A 340 is the change in the luminous intensity of 34 G ji ni per minute o
  • the molecular extinction coefficient of NADPH is 6.22
  • Table 1 shows the results of activity measurement for A using the method described above.
  • Tris-hydroxymethyl-minomethane-malein ⁇ ® solution 50 mM p-hydroxybenzoylcholine, eodo 1.
  • Mouth Xybenzoic acid water Hesitate 1,0 0 0 After dissolving, the total amount is 1, 0 0 0 ⁇ ⁇
  • the test sample was combined with 1.0 Q of the sample serum or the standard serum, and the test sample was added at 0 ⁇ 5 ⁇ ⁇ after 37.5 minutes, incubated at 37 ° C for 10 minutes, and then the test sample was added at 0 Q. 1 Add S, stop the reaction, and measure the light intensity at 340 nm. O At this time, the absorbance of the sample is A ⁇ , and the 3 ⁇ 4 likelihood of the falcon serum is As o o (3) Ch- E sought am
  • Example 5 the pH of the trishydroxymethylaminoaminomaleine buffer was 8.5, the FAD-2 sodium medium was 0.3 mM, the P- human Dorokishi depreciation; instead of 3 ⁇ 4 incense ⁇ of ⁇ containing 3 ⁇ 4 3 3 0 U, the measured solution was ⁇ , o example was carried out measurement 3 ⁇ 4 similarly 3 ⁇ 4 intensity 5 similar ⁇ gave 0. -

Description

細 謇
コ リ ンエステラーゼ活性測定法 技 銜 分 野
本癸钥は、 血滑中のコ リ ンエステラーゼ（以下 C h 一 E と略称 活倥を測定するための方法並びにその方法 ¾実施 するための試案；^関する 0 η ^ ίΖ
コ リ ンエステ ラーゼは、 コ リ ンエステルを コ リ ン と有機 とに加水分解する酵素の総称である o
生体内には、 赤血球、 神经系、 筋肉等に含まれ、 了セチ ルコ リ ン又はァセチル - - メチルコ リ ンを特異的に分^ する其正 C ii - Eと血清、 肝朦、薛藤等に含まれ、 ベンゾ ィ ルコ リ ンを特異的に分藓し、 プチリルコ リ ンのよ うな比較 的炭素镇の長 脂肪漦のコ リ ンエステルを主に分赘するプ ソィ ド C h - E とがある o それらの中で、病気の診^に利^ されるのは、 フ'ン ィ ド C h - : Bの活性浏定て、 殊 血 «中 の C h - E活 測定は肝疾葸、 锊に ¾性の肝笑 ¾ ί*瞢ゃ肝 硬変の ¾合、 ¾ しく C h - Ε活性が低下することから、 肝
fe fg ff香を ¾3る上で、 堇妥な意床をもって る o また、 有
O PI ATiO¾ 機リ ン矗案による中毒の治療ゃ抗 C li - E剤を便甩する際 の診断にも不可欠である o
C k - E活性測定のための方法と しては、 既にガス分析 法、 厶 p S法、 比色法、 UV法、 瑩光法、 電極法などが知 られている o そのなかて、 △ p H法と比色法とが日常の臨 床検査と して晋及している o △ P H法は、 C h - Eによ ]? 生成した酢漦を p H指示薬！:用 て測定する方法てあるが、 検量線が極度に曲が ]?、 その補正のための操作が繁雞 う えに、 正確性にも問 がある o 比色法には、 法〔 Garrr.P. J,Clin.C]ieni, 11 (2) ： 9 1 ( 1 9 6 5 3ゃ酵 素法〔五味邦英 ， 籙床病理荐集第 2 9号： 145(1977 〕 がある 0 D TN B法はァセチルテ才コ リ ン、 ブチ リルチオ コ リ ン及びブロ ピオ-ルチオコ リ ンなどを基質と して用い、 生成したチォコ リ ンに 5 , 5 ジチォビス - 2 -ニ ト ロ安 息香鼓（ D T N B ¾加え、 黄色に発色せしめてそれを測 定するものであるが、 その^、 標準物質と して S H化合物 である： g元 ダルタテオンが用いられる o それ^、 この方 法はビ リ ル ビンや ¾元物質の彭眷による試裟 杲の不正磧 性がまぬがれ うえ、 試 ¾の安定住が問 に る o 酵素 法は、 ベンゾィ ル コ リ ンゃ才ル ン ト ルオイ ル コ リ ン どを
ΟΜΡΙ 基質と して用 、 酵素反応によ ]3生成したコ リ ンをコ リ ン ^キシタ'ーゼを用 てベタイ ンに変化させる o その時生成 する過該化水素によ ]?、 ベルォキ シダーゼの存在下で 4 - ア ミ ノ 了ンチ ビ リ ン と フエノールなどとの^化的縮合反応 を進行させ、 発色裎 ^を測定する万法でるる o この方法は, コ リ ンにコ リ ンォキシダーゼ¾作 させる ものてあるため, 血淸中に共存する リ ン脂質の分 な どによって生じるコ リ ンの影 受けた j?、 ピリ ル ビンゃァス コ ル ビン などの 還元物質によって彭簪をうはる o また自動分祈 ¾置による 測定には逼して な o
従来法のそれら不利を ¾服するため、'本 II出 II人の特潁 昭 5 5 - 0 9 3 8 9 6には、 p - ヒ ド ロ キ * ^^ゾイル リン誘 導谇 ¾基«と して用い、 C ii - _Eの^素作用によって生成 する p - ヒ ドロ キシ安 、香^を^化剤の存在下で、 4 -ァ ミ ノアンチビリ ンと ¾化; fit合せしめて看色化合 に変え、 その着色 ¾度を比色定量する ことによる皿 ^中の C ii - E 活性を浏定する万法が提茱されている o 発 明 の 示
本発 ¾の对彖は、 ^^^ 5 5 - 0 9 3 δ 9 6号の万 Sを 炅に発 ^ し たも.ので、 问^にして、 と しての Ρ - 一 4一
ヒ ドロ キシベンゾィルコ リ ン誘導俸 C p - H B C _) から
C h - Eの 素作用で生成した P - ヒ ドロキシ安恳香 ( p - H B A に褐餑素-コチンア ミ ドアデニ ンジヌ ク レオ テッ ド 7ォス フェー ト 元¾ ( N A D P H の存在下、 P - ヒ ド πキシ安息香該水^化^素 （ p - H B H を作用さ せて漦化し、 その 、 違行する N A D P Hの-コチン了ミ ドアデ-ンジヌ ク レオチッ ド 7ォスフ土一ト ¾化型
への変化に伴う 尤度の ^少、 又は溶存鼓素量の消費を她 定することによるコ リ ンエステラーゼの浏定方; ¾亚びにそ の方法を実旌する試薬である ο
発明で便用す'る ρ - ヒ ドロキシベンゾィ ルコ リ ン篛， 体（ p - H B C ) は、 一^式
X'
Figure imgf000006_0001
( 式中、 n i 及び R 2は水素又はその igれか一方が c i 〜 C 4 の低敉アルコ キシ ¾を表： し、 ： Sはハロ ゲン原子を 表わす で示される o
^発明による剡定 S ¾化字^て示せば、 ^のと ]3であ る o
G.v?i CCh-E3
(1) -HBC+H,0 ► P-HBA+コリン
(2) p-HBA+0,+H -DBA+H20
NADP
Figure imgf000007_0001
DP 上記、 反応式 (1)で生成し p - ヒ ドロキシ安息香漦 (P- H B A は、 補酵素 NAD P Hの存在下て、 p - ヒ ドロキ
'^Ε香 ¾水¾化酵素 （ ρ - Η Β Η の作用.によ J？、 反応式
(2)に示されて る様に、 3 , 4 - ジヒ ドロキシ安息香漦 (
3 , 4 -DBA に変化する 0 この際、 NA D P Hは + に綮化され、 それに泮つて吸光度が7 少するから、 .その潔 少度 ¾¾：長 3 4 0 EL mで測定することによって、 C h - E 活性値を求める ができる。 そしてその 、 3 4 0 11 m に ける NAD P Hの 光度の瘃少 ¾は、 その変化を反応 のスター ト時の測定の後、 連続的に剡定するか、 又は一定 時間後に場合によ J3反応阻害剤によ ？、 人為的に反応をス ト ツブさせ、 或はス ト ップさせることな く測定することに つて行う β 反； 5¾ス ト ッ プさせるには、 ネオスチグミ ン， ェゼリ ン及び有 ¾リ ン系のものなど、 C ii - E活性を阻害 させる公^のものを便^する o 本発明では、 また p - ヒ ド
ΟΜ?Ι
、 T O 口キシ安息香^水钹化酵素の作用 ¾うけて消賫せられる反 応系中に溶存する 素量の消袞速度 ¾黢素電毬を用 て測 定することによ ]3、 C ii - £活倥¾釗定することがてき る o
また、 允 g計を^ て N A D P Hの^光の ¾少を測 定して、 C li - E活性を ¾ 定すること もてきる o
本発明は、 呈色反応系を便 ¾し¾いため、 ϋ滑中のピリ ル ビ ンゃァス コル ビン などの遠元物質による彭害 ¾う
ることな く、 またリ ン脂質からのコ リ ンによる彭 もない ο その上、 多教揆体処理の可詛な自動分祈袅 *に逼^して、 反応速度測定法で簡単且つ迅速に C 1ι - Ε活性の , 定がで
δる Ο
本癸明て使^する ρ - ヒ ドロキシ安恳香^永該化^素は、 シュ一 ドモナス （Pseudomonas 属に虞する 匿、 例えば
シュ— ドモナス · タ-キューネ CPs . dacun ae 、 シュ一 ド モナス · デスモ リ チカ （Ps .desmol ti ca 、 シユー ドモナ ス · フル才 レ ツセ ンス Ps · flu ore c ens 、 シユー ドモナ ス · ブチタ' Ps. put i da などから生 される 〔Kei j'i
Yano , e i Ar ima,Agr .Bi ol .Ciiem. ,33(5) : 689 ( 1969 〕 o
^兗 ¾で使 する の p -ヒ ドロキシベンゾィルコ リ ン
は ΐ≥及び安定住が良好でる ]?、 TI 溶 ¾での ^Sf所中
Ο ΡΙ
差換え に 2通間以上保存することが可能である o
- この も のは、 常法によって製造することが出来る 0 例え ば、 有^溶媒中で P - ァセ ト キシ安息香漦ク 口 ライ ドと
N , N -ジメ チルエタ ノールァ ミ ンとを反応させたのち、 冷時ハロ ゲン化メ チルを反応させる 0 次いで、 N , N - ジ メ チルホルムアミ ドと ヒ ドラ ジン ヒ ドラー ト に溶群し、 目 的物を得る o
本発明で便用する基質の C - E反応に ける至適 p H
1、 7 · 5〜9 . 5てるるが、 特に p H 8 · 2が望ま し o 反応時の p HI:維持するための缓衝剤と しては、 例えば、
ト リ ス ヒ ドロ キシメ チルァ ミ ノ メ タ ン、 グ リ シルダ リ シン、 リ ン 塩、 ホ ウ酸塩、 ピロ リ ン ¾、 パル ビタ—ル該塩、
N , N - ビス （ 2 - ヒ ドロ キシェチル ^) グ リ シン、 N - ト リ ス - ( ヒ ドロ キシメ チル ） メテルグ リ シン ¾どが用いら れる。
p - ヒ ドロキシ安息香^水 化 ί#素は、 フ ラ ビンアデ- ンジヌ ク レオチッ ド （以下 F A Dと略称） ¾与の^素であ るのて、 本発明の測定法に ては、 F ADを適当量存在 させた方が 利である o
また便用する酵素によっては、 5"^15mM程度のサ リ チル
〇M?I― 漦を添加することによ ]?、 酵素反 Sに一層の直線性を付与 することができる 0
本発钥方法で用いられる試薬及び 素は、 C li - E活性 測定の結果に影蓥を及ぼすことる く、 広範囲の ¾度で使用 することがてきるので、 それらの便用量は必らずしも狭い 範 aに葳密に限定する必要は く、 穽素 200^5000 好ま しく は、 22 0〜 7 0 0 ϋ/^、 補^累 0 · 1〜0 · 7 m M好ま しくは、 0 , 3〜 0 . 5 m M、 基貧 0 · 2〜2 Om 好ま しく は ϋ . 5〜2 mM、 F A D 0 . 1 β M~ 3 0 M 好ま しく は、 1〜 5 Mの範通て便用することができる o 第 1図は、 本発 に いて、 皿请 5 0 を周 てィ ン キュベ一シヨンした時の反応時閬と、 NAD P Hの M保 ¾ 示し、 第 21^は、 本発明とブチリルチオコ リ ン法との相関 図を示し、 第 3図は、 実旌^ 2に て試科と して稀 血 清を； aいた時の談素漫度の瘃少を示すものである 0
実 例を孕げて說明するが、 本発 ^はこれによってなん ら ¾S定されるもので ¾ 0
実 1
(1) ;
Figure imgf000010_0001
トリスヒドロキシメチル了ミノメタン-マレイン 液 50mM p -ヒドロキシ ゾィルコリン ·ョ- ImM ナ ト リ ウ ム 0.003mM
NAD P H - 4ナ ト リ ウム 0.3mM
P _ヒドロキシ安息 ィ匕^ ¾ 700UZ
(D 詞 製 法
ト リ ス ヒ ドロ キシメ チルァ ミ ノ メ タ ン 6 · 0 6 g ¾： 水約 8 0 0 に溶解し、 マレイ ン酸溶液で p H 8 . 2 とする o これに、 P - ヒ ド ロ キシベンゾィ ルコ リ ン · ョー ド 3 5 1 、 5¾ - 2ナ ト リ ゥム 2 . 52^、
. NA'DP - 4ナ ト リ ウム 2 7 2 、 p - ヒ ド πキ シ安息 香漦水黎化酵素 7 0 0 ϋ ¾溶解した後、^ *¾jで 1,000 ^と し、 測定液にする o
(2) 測定操作法 - 測定液 3 を取 3 7 °Cになるまて予懾加温 ( 3分閫 位） し、 これに血清 5 0 を加える o 11ちに 3 7 で
3 4 0 n mに ける吸光度の渎少 ¾連 的に ¾定する （ 日立 7 0 5型自動測定装《¾使用 o
二種類の血清を^いて実装した結杲は、 図 2に示すと
])、 反応時闓の^返と と もに狄光度は瘃少し、 反応速
O PI
、 VvlPO 度が一定にるった拔態で、 C h - E活住値は下記の式に よ ]?計算される o
〔式〕
Figure imgf000012_0001
分子吸光係数 X血清量 A 3 4 0は 1分間当 の 3 4 G ji niに ける 敝光度の変化量 o
N A D P Hの分子吸光係数は 6 . 2 2
更に、 血清 ¾水で 4 "から 4"まで稀^したサンブルを 5 0
A 用 て、 前述の方法によ 活性測定した結杲を表 1に 示す o .
Figure imgf000012_0002
同禄にして、 血请 1 5 ¾類の C h. - E活柱 ¾測定すると 共に、 これらとブチ リ ルチ才コ リ ン D TNB法（ G .Szasz Clin.Ckim.Ae a. ,19:191,1968 との相 々係を調べ たその^杲は、 1^1 2に示されて る o fJRSA
OMPI
、/ V/IPO 実施例 2
変更して、 ト リ ス ヒ ドロ キシメ チルァ ミ ノ メ タ ン マ レイ ン酸緩衝液の H¾ 8 · 5 と し、 FAD - 2ナ ト リ ゥ ムを 2 5 ¾ p - ヒ ドロ キシ安息香漦水酸化酵素 2 2 0 ϋを便周した o
例 1 とほぼ同様の好結果が得られた ο
実¾例 3
(1) 試 案
① 組成 （最終癀度
トリスヒドロキシメチル了ミノメタン-マレイン^ ®液 50mM p -ヒドロキシべンゾィルコリン，ョード 1. OmM
F AD - 2ナ ト リ ウ ム 0.003mM
NAD PH - 4ナ ト リ ウ ム 1.5mM p -ヒド口キシ安息香漦水 化奪素 700 Uズ
® 詞 ^ 法
ト リ ス ヒ ドロ キシメ チルァ ミ ノ メ タ ン 6 . 0 6 g ¾
水約 8 0 0 ^に溶解し、 マ レ イ ン ^溶液 ¾加え p H
8 . 2 とする o れに！） - ヒ ド π キシベンゾィルコ リ ン 3 3 5 1 、 ？ 0 - 2ナ ト リ ゥ 厶 2 . 5 .
NA D P H - 4ナ ト リ ウ ム 3 5 g、 P - ヒ ドロ キ
ΟΜ?Ι シ安息香酸水漦化酵素 7 0 0 ϋを溶獰した後、 全量き
1 , 0 0 0 とする ο
(2) 測定操.作法
測定液を 3 7 ^にるるまで加葸し、 これを漦素センサ 一が接して るセル内に導入し、 血清を 添加す る ο この時の漦素邊度の消費を羧素センサー （ スタ ツ ト グルコースアナラザー S — 8 0 ： A I C社製 によ D測 定する o
その結果は、 図 3に示すよ うに反； Sの進行とともに漦 素瘼度（電圧 は渎少し 7 o - また、 例 1 におけると同様、 水によ D 〜 4に稀^し た血清を用 た試験 ¾行った。その結杲は、 図 3及び表 2 に示されていると ]?、 ¾めて満足 ^ ίき ものである o
(3) C 3ι - Ε活性値単位換箅 .
① 単位既知の血清 2 0 £を上記劍定法と同穩に操作
し、 その溺定篋との比て表わす ο
〔式〕
瓖隼血清
定 m b mV/ m i s.
試科血清 e mY m i n
C PI
、 、 WIPO 試科血请 UZ a
© 瀵度既知の Ρ - ヒ ド πキシ安息香漦 2 0 Α ¾反応
させ、 反応 t(r後の漦素の消費量よ 換算する o
〔式〕
P - ヒ ドロキシ安息香漀 SL Π2Μ 反応前後の該素籩度の差 b mV 試科血清 c mV niii 試科血清 Uノぶ = aXcr 0 (-r X 0.02aX5X104 ;
表 2
Figure imgf000015_0001
実施例 4
例 3 と冋様に して、 ただト リス ヒ ド πキシメ チル了 ミ ノ メ タ ンマレイ ン漦緩衝液の p Hを S . 5に： F AD - 2ナ ト リ ウムを 2 .5 に、 p - ヒ ド口 キシ安息香鼓水 化 素
¾ 2 2 0 ϋに変更した ο 3同様の結果が得られた ο
実 例 5
£ 4丁 10 (1) 試 案
'① 組成（最終漫度
® トリスヒドロキ メチル了ミノメタン-マレイン 液 50 mM
F AD - 2ナ ト リ ウ ム 0.003mM
P _ヒドロキシ安息 ¾¾ k鼓化^ , 00 ΟϋΖ
NADPH- 4ナト リ ウム 0. 5mM
@ トリスヒドロキンメ 5=·ル了ミノメタン-マレイン 使 5 OmM
p -ヒト キ， ィルコリン.ョー： 1.5mM
Θ ネオスチグ ミ ン水溶液 20mM
® m
Θ リ ス ヒ ドロ キシメチル了 ミ ノ メ タ ン S . 06 g を永約 8 Q 0 に溶薛し、 マ レイ ン ¾溶液て
8 . 2 る 0 これに F AD - 2ナ ト リ ウ ム 2 . 5
Figure imgf000016_0001
、 p - ヒ
口 キシ安息香酸水逡化奢素 1 , 0 0 0 ϋ¾溶镜した 後、 全量を 1 ， 0 0 0 ^とする ο
@ リ ス ヒ キシメ チル了 ミ ノ メ タ ン S · 0 6 g
を水約 8 0 O a に溶解し、 マ レイ ン ¾溶¾で P H
8 . 2 とする o これに P - ヒ ドロキシベンゾィルコ リ ン · ョー ド 5 2 6 . 5 t した後、 全量を
ΟΙΛΠ
、/ WIPO — 1 , 0 0 0 3^とする。
a ネ ί"スチグミ ン 6 gを水約 1 , 000 ^に溶解する o (2) 測定搡作法
0 ブラ ンク 水 2 0 に試案④を 1 , 0 ^混合し、 3 7 で 5 分後に試案 <§)¾ 0 · 5 添加し、 3 7 °C i 0分間イ ン キュベーシ ヨ ン後に試案 0 . 1 加えて直ちに 3 4 0 n mで吸光度を測定する。 この時の吸光度は AB とする 0 ,
® 試 料
料血清又は標单血清 2 Q £ に試案 を 1 . 0 ^合し、 3 7 5分後に試桨@ 0 · 5 ¾添加し、 37 て 1 0分間イ ンキュベーシ ョ ン した後に試案 Θを 0 . 1 添加し、 Sちに反 を停止させ、 3 4 0 n m で 光度を測定する o この時の試料の吸光度は A τ ， 擦隼血清の ¾尤度は Asとする o (3) C h - E活 amの求め万
血滑の C - E活性 1直は下記の式よ ]?求める o 〔式 〕
AB - Aェ
X 標旱 ffの早 m
一 ΟΜ?Ι ― 、ノル —曹0 - 血清を水て 1ズ 4〜 4 4 まで稀釈したサンブル！： 5 0 甩 てこの方法によ D活性を測定した結果を次に表 示する ο
表 3
Figure imgf000018_0001
実旌例 s
例 5 と同様にしてただト リ ス ヒ ドロキシメチルァミノメ タ ンマレイ ン漦缓衝液の p Hを 8 . 5、 F AD - 2ナ ト リ ゥ ム ¾ 0 . {) 3 mM、 P - ヒ ドロキシ安； ¾香餒水 化^素 ¾ 3 3 0 Uに変えて、 測定液を謁簦し、 同様に ¾光度の測 定¾行った o例 5同様の^杲が得られた 0 .-

Claims

請 求 の 範 囲
(I) コ リ ンエステラーゼの作用によ j?基貧から生成した P - ヒ ドロ キ シ安息香 に補酵素ニコ チンア ミ ドテデ -ンジ ヌ ク レオチッ ドフォース フ ェー ト還元型の存在下 p - ヒ ドロ キシ安息香漦水^化酵素を作用させて鼓化し、 その 際、 違行するニコテンア ミ ドアデニンジヌク レオチッ ド フ ォスフ エ一 ト還元型のその^化型のものへの変化に斧 う ^光度の 少量、 又は反応系の中に? §存する 素の消 黉量を測定することを特徵どする一^式 CH; X一
Figure imgf000019_0001
ノ
' ,式中、 -Ki と β 2 とは水素又はそれらの^れか一方せ 、
. C i〜4 の低^了ルコキシ基 ¾表わし、 Xはハロ ゲン原 子 ¾表わす、 で示される p 一 ヒ ド π キシベ ンゾィ ル コ リ ン^ 体を ^ ¾と して便用するコ リ ンエステ ラーゼ 性 の 』定方 i£ o
(2) 尤 Sを tSi長 3 4 0 で剡定することを脊镇とする
特許請求の？ a . ( 1)の方 o
(3) 反応糸中に 存する ^素童の消 ¾ ¾ ¾を 案寬 用
. , _C V!Pi -τ8- て測定することを特徵とする特許請求の範囲 (1)の方法 ο
(4) FADの存在下で、 p - ヒ ドロ キシ安息香 ¾水漦化酵 素を作用せしめることを獰铵とする卷許請求の範 の 方法 o
(5)コ リ ンエステラーゼと δ質との反応 ¾锾¾剤の存在下
ρ Η 7 * 5〜9 . 5、 ^に 8 . 2で行う ことを獰徵とす る卷許諝求の範囲 (1)の方法 ο
(6) としての、 Ρ - ヒ ド ロ キシベンゾ.ィ ル コ リ ン，ρ- ヒ ドロ キシ安息香鼓水 ¾化 素 ，補酵素-コチン了 ミ ド アデ-ンジヌ ク レオテッ ドフォスフェー ト： ¾ ， 瑗銜 剤を含有することを脊锾とするコ リ ンエステラーゼを測 定するための試薬 ο
(7) 追加的に F AD及び Ζ又はサリチル を含有すること を 钹とする特許請求の ¾囲 (6)の試棻 ο
(8) ρ -ヒ ド ロ キシペンゾィル コ リ ン 0.2 mM〜2 0 m M ニコ チンア ミ ド了デユン ジヌ ク レオチッ ドフォスフエ— ト： S元 0 · 1〜 0 . 7 m M
p - ヒ ドロ キシ安息香 水鼓化^素 200〜5 , 00 ou ¾ F A D 0 . 1 ^-3 0 M
を含有する ことを とする^訐 豕の範 3(6)の
差換え
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