WO1980001039A1 - Fibrinolytic material and process for producing same - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to a novel substance having a fibrinolytic action in mammals obtained from the snake venom of a viper, which is taxonomically classified into the genus Hab, a process for producing the same, and application to pharmaceutical use.
- Animal toxins such as snake venom generally contain a variety of proteinaceous toxic agents, among which the presence of substances having various biological effects has been observed, such as hemorrhagic venom, It is known that factors such as neurotoxicity, hemolytic components, and blood coagulation components exist. Although biochemical research on these animal toxins has been actively conducted in recent years, the present inventor is often feared of causing fatal damage to humans and animals.
- the gist of the present invention is based on a so-called molecular sieve chromatography, which uses a crude hub venom solution as a stationary phase with a substance having a molecular sieve effect as a stationary phase. Fractionation is performed by using ion-exchange chromatography with an ion-exchanger as the stationary phase, and in each case, the fraction with the strongest fibrinolytic activity is obtained.
- the present invention relates to a novel substance which is isolated by fractionation, a method for producing the same, and application of the substance to pharmaceutical use.
- the embodiment will be described in detail.
- the crude hub venom used as a raw material in the present invention refers to a toxin obtained from the snake force which belongs to the genus Crotalidae and the genus Tri-meresurus.
- the snakes belonging to this group include, for example, hub (Trimere-surus f1 avov iri dis), tokaranob (rimeresurus tokarensis), and Taiwanese snake (rimeresurus mucr o squama tus).
- G-1 DQ or a suitable gel-permeating agent such as Piogel (trade name) to be absorbed and permeated, and then a suitable electrolyte of about 6 to 0.8
- a suitable gel-permeating agent such as Piogel (trade name)
- fractions ⁇ - ⁇ having a fibrinolytic action are obtained by standard fibrin plate method.
- This II-I fraction is dialyzed against distilled water, and the dialysate is freeze-dried.
- the freeze-dried fraction ⁇ —I is dissolved in the buffer solution before and after ⁇ ⁇ , for example, sodium acetate buffer, etc., and ion-exchanged chromatography is performed. Fractionation by '1'. That is, G M which is a positive ion exchanger at low temperature
- the fraction with the strongest fibrinolytic action is collected and freeze-dried. Since this fraction contains one or two impurities in SDS electrophoresis, it is further subjected to molecular sieve chromatography as a purification procedure. That is, the lyophilized fraction obtained by ion-exchange chromatography is dissolved in a buffer in the range of ⁇ 6 to 88, and separated by Sephadex (G -50) is adsorbed to a packed column, and eluted with the same buffer to isolate the desired fibrinolytic substance.
- iirroo « And can be done.
- This substance was confirmed to be a single compound by SDS electrophoresis.
- substances having a molecular sieve effect include polysaccharide gel absorbents such as Sephadex and Piogel, but other gel sieves having a molecular sieve effect equivalent thereto are also used. It can be used for
- the ion exchanger is not limited to CM cellulose, but an appropriate one can be selected and used according to the liquid properties of the eluate to be used.
- Preferred buffers include, for example, sodium phosphate buffer, acetate buffer, phosphate buffer and borate buffer. Note that the above operation can be performed at room temperature (room temperature).
- the substance having a fibrinolytic activity obtained in this way can be directly dissolved in physiological saline as an injection, but if necessary, Drug
- the physical properties of the substance according to the present invention are soluble in distilled water, sugar is recognized according to the Anthrone method, and the absorption spectrum is
- Tables 1 and 4 show the amino acid composition of the substance of the present invention obtained by the amino acid analyzer.
- the pharmacological effect of the substance of the present invention was assayed by the in vitro method of measuring the dissolution area of fibrin plates as a general method and the Chandler loop method by Chandler,., Lab.
- the novel substance having a fibrinolytic action disclosed in the present application activates plasminogen to form plasmin and dissolves fibrin. Through the effects, clinical effects are expected in the following cases. . WFO
- fibrin converted from fibrinogen by enzymes is one of the important causes of thrombosis and embolism.
- the substance of the present invention is peripheral arteriovenous thrombosis, pulmonary embolism, coronary artery occlusion, myocardial infarction. It is expected to have preventive and therapeutic effects.
- the combined use with anticancer drugs can be expected to have a combined effect on cancer, and as an anticoagulant at the time of blood transfusion, and to prevent embolization of sutures in vascular surgery, or hemodialysis. It is also expected to be effective in maintaining the long-term function of arteriovenous shunts in Japan.
- administration methods include intravenous injection and local perfusion.
- the dosage varies depending on the disease and the administration method, and also includes the age, weight, and disease of the patient. Depending on the shape and condition of the condition, administration of 0.1 to 80 times per adult can be expected to provide a sufficient therapeutic effect.
- the substance of the present invention was dissolved in a Tris buffer solution, and a solution prepared at a protein concentration of 5709 was applied to a standard fibrin plate, and the diameter of the dissolved ring after 2 ⁇ hours was measured.
- Table 4 shows the results. Table 4
- FIG. 1 shows an ultraviolet absorption spectrum of the substance of the present invention.
- Fig. 2 is a graph showing the effect of the substance of the present application on plasma minogen.
- Fig. 5 shows the infrared absorption spectrum of the substance of the present application.
- Fig. 4 is a chart of an amino acid analyzer showing the amino acid composition of the substance of the present invention. In Fig. 4
- the fraction eluted with (H7.5) and having a fibrinolytic activity is collected, dialyzed against distilled water, and the dialysis solution is lyophilized.
- This 10 was dissolved in 0.05 ⁇ sodium acetate buffer 4a of ⁇ ⁇ ⁇ . ⁇ and filled with CM cell mouth at 5 ° C. 1.5 X 4 C3 « adsorbed on the column, elute the sodium acetate buffer with gradually increasing the sodium chloride concentration to 0.5 ⁇ , and fractionate and freeze the fraction with the strongest fibrinolytic activity. dry .
- this fraction 50 was dissolved in 0,02 2 borate buffer solution ( ⁇ 7.5) 2 and filled with Sephadex (G-5D). 5. Elute with 0.02 M borate buffer at 5 ° G through a column of 5X9 ⁇ «3 ⁇ 4, and collect the fraction with the strongest fibrinolytic activity. This is done by SDS electrophoresis. ⁇ : .0
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Description
明 細 線維素溶解活性物質及びその製造方法 技術分野
本発明は、 分類学上ハ ブ属に分類さ れてい る毒蛇の 蛇毒か ら得 られる 哺乳類の線維素溶解作用を有する新 規物質及びその製法並びに医薬用途への応用に関する も のであ る 。
背景技術
蛇毒な どの動物毒素は、 一般に種々 の蛋白性有毒因 子を含んでお り 、 これ ら の中には様々.な生 学的作用 を示す物質の存在が認め られ、 た と えば、 出血毒 ， 神 経毒 ， 溶血成分 ， 血液凝固成分等々の因子の存在が知 られている 。 これら動物毒素の生化学的研究は、 近年 盛んに行なわれる よ う にな つ たが、 本願発明者は しば しば人畜に対して致命的な被害を及ぼす も の と して恐 れ られてい る ハ ブの毒素に注目 し、 血液凝固系 ， 線溶 系及び血小板機能等に対する蛋白性有毒因子の作用に ついて研究していた際、 粗ハ プ毒に一定の処理を施こ し て得 られる物質が、 著しい線維素溶解作用を有する こ と を発見し、 更に検討を重ねた結果、 こ の物質の単 離に成功し、 しか も こ の 質が線維素溶解活性剤と し て、 臨床上広範な用途を有する こ と を見い出 した も の であ る 。
( 一 C:,'PI
発明の開示
本願発明の要旨は、 粗ハブ毒溶液を分子篩効果を有 する物質を固定相と'して用いる 、 いわゆ る分子篩ク ロ マ ト グ .ラ フ ィ 一 を主体と し て 、 こ れに ィ オ ン交換体を 固定相とする イ オ ン交換ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ーを併用す る こ と によ り 分画し、 それぞれの場合において線維素 溶解活性の最 も 強い画分を分取してい く こ と に よ り 単 離さ れる新規物質及びその製造方法並びに こ の物質の 医薬用途への応用にあ る。 以下実施例を中心にして 詳細に説明する 。
本願発明において原料と して使用さ れる粗ハブ毒と は、 分類学上マ ム シ科 （ Crotal idae ) ハ ブ属 （ Tr i— meresurus ) に属す.る蛇力 > ら得られる毒素を意味し、 これに属する蛇と しては、 た と えばハ ブ （ Tr imere- surus f 1 avov i r i di s ) , ト カ ラ ノヽ ブ ( r imeresurus tokarensis ) ， 台湾ノヽブ ( r imeresurus mucr o squama t u s ) ， ヒ メ ノヽブ ( Tr imere surus okinavens i s ) サ キ シ マ ノヽ ブ ( Tr imeresurus elegans ) ， ァ オ ノ、 ブ ( r ime r e surus s t e jnegs i ) ， ク メ ジ マ ノヽ ： ( Tri— meresurus t ι nkami ) ， ャ マ ノヽ フ ( Tr imere surus mo— t i co 1 a ) , キ ク チ ノヽブ ( Tr ime resur s gracil is )等- があ る 。 これ ら毒蛇の一種ま た は二種以上か ら得 ら れた粗ハ ブ毒の凍結乾燥粉末を適当な溶媒、 た と えば 蒸留水 ， 生理食塩水 ， あ る いは Ρ Η ό 〜 8 の範囲にあ る緩衝液等に溶解する。 次にこ の粗ハブ毒溶液を、
分子篩効果を有する物質を固定相と する 、 いわゆ る分 子篩ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ーによ り 分画する。 た と えば、 カ ラ ム充填剤と し て セ フ ア デッ ク ス （ G — 7 5 または
G— 1 D Q ) (商品名 ） あ る い は ピ オ ゲル （ 商品名 ） な どの適当なゲル沪過剤を用いて吸着浸透せ しめ、 つ いで Ρ Η 6 〜. 8 程度の適当な電解質か ら な る緩衝液で 溶出する こ と によ り 、 四 つ の画分 Ρ — I , Ρ - I , Ρ — I , P — に分画する こ と がで き る 。
これ ら の各画分につ いて、 標準フ イ ブ リ ン平板法に よ り 線維素溶解作用を有する画分 Ρ — Η を得る 。
こ の Ρ — I 画分を蒸留水に対して透析し、 透析内液を 凍結乾燥する 。 次に こ の凍結乾燥を施こ し た画分 Ρ — I を Ρ Η ό 前後の緩衝液た と えば酢酸ナ ト リ ゥ ム緩 衝液等に溶解し ィ オ ン交換ク ロ マ ト グ ラ フ ィ 一に よ り' 分画する 。 即ち、 低温にて陽イ オ ン交換体であ る G M
セ ル 口 一 ス を充填した 力 ラ ム に吸着さ せ、 緩衝液中の 塩濃度を徐々 に高めて溶出 させ、 線維素溶解作用の最 も 強い画分を分取し凍結乾燥する 。 こ の画分は S D S 電気泳動において 1 〜 2 の不純物を含むので、 精製 操作と して これを更に分子篩ク ロ マ ト グラ フ ィ 一にか け る 。 即ち、 イ オ ン交換ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー に よ り 得 た凍結乾燥した画分を Ρ Η 6 〜 8 の範囲にあ る緩衝液 に溶解し、 セ フ アデ ッ ク ス （ G — 5 0 ) を充填した 力 ラ ム に吸着さ せ、 同様の緩衝液で溶出する こ と に よ り 目的と する線維素溶解作用を有する物質を単離する こ
ΟΙΛ?Ι w v;iirroo «
と がで き る 。 こ の物質は S D S 電気泳動によ り 単一の 化合物であ る こ とが確認された。 - 上記分子篩効果を有する物質については、 セ フ アデ ッ ク ス ， ピオ ゲルな どの多糖質ゲル沪過剤を例示した が、 この他これ ら に相当する分子篩効果を有するゲル 沪過剤も 、 同様に使用する こ と ができ る 。 又イ オ ン交 換体も C Mセ ル ロ ース に限られる のではな く 、 使用す る溶出液の液性にあわせて、 適当な も のを選択使用す る こ と がで き る 。 好ま しい緩衝液を例示すれば、 ク ェ ン酸ナ ト リ ゥ ム緩衝液、 酢酸緩衝液、 リ ン酸緩衝液' ホ ウ酸緩衝液等を あげ る こ と がで き る 。 なお上記操作 は常温 （室温 ） で も 可能であ る が、 低温た と えば 5
前後で行う のが最適であ る 。 又上記においては、 粗 ハブ毒についてセ フ アデ ッ ク ス . （ G — 1 D Q ) を用い る分子篩ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ーによ る分画を 、 ついで ィ オ ン交換ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ーによ る分画を、 更に精製 操作と してセ フ アデ ッ ク ス （ G — 5 Q ：) を用い る分子 篩ク ロ マ ト グ ラ フ ィ 一によ る分画を こ の順序に行っ て いる が、 これはあ く まで一実施例であ り イ オ ン交渙ク 口 マ ト グ ラ フ ィ 一を最初に行っ て も 、 あ る いは精製橾 作と して最後に用いて も 同様に目的を達成する こ と が で き る 。
こ の よ う に して得られた線維素溶解活性作用を有す る物質は、 これをそのま 、生理食塩水に溶解して注射 薬と する こ と も可能であ るが、 必要に応じて薬剤と し
C?.iFI
て使用する ための公知の処理が施こ さ れる 。
本発明に係る物質の物性は、 蒸留水に可溶で、 ア ン ス ロ ン法によれば糖が認め られ、 吸収ス ペ ク ト ル は 、
6 2 0 〜 ό 4 0 nra に極大吸収を も つ糖蛋白質であ ¾ セ フ ア デ ッ ク ス （ G — 5 0 ：) ゲ ル沪過法及びデ ス ク電 気泳動法によ る分子量は 2 8 Q Q 0 〜 5 2 0 0 0 と推 定さ れ、 総窒素量は 1 2. 4 ± 1 %であ る 。 又本物質は 紫外部領域に吸収を有し （ 第 1 図参照 ） 、 極大波長は 2 7 8 n mであ る 。 本願物質の赤外線吸収ス ぺ ク ト ル ( KB r 錠剤法 ） は第 3 図に示されるが、 およ その姣数 で、 5 4 0 0 、 1 4 5 5 ， 1 5 5 0 付近に大き な極大 吸収が、 又 1 6 4 0 , 1 1 0 0 , 9 2 5 付近に中程度 の極大吸収が、 そ しておよ そ 1 2.5 Q ， 1 0 2 5 及び
7 8 0 付近に小規模の吸収極大が認め られる 。 更に又 ア ミ ノ 酸分析計によ って得られた本願物質のア ミ ノ 酸 組成を第 1 表及び第 4 図に示す。
第 1 表
ΟΚίΡΙ - \VIPO~ ^
Invest., 7 , 110 (1958); Conner 'W. E. & Poole, J. C, F. ， Quart. J. Exp. Physiol. 46, 1 (1961 ) ) に よ る人工血栓溶解効果と によ つ て検討さ れた。. 前者は 基質と しての フ ィ ブ リ ン平板に対する検体の線維素溶 解作用によ る フ ィ ブ リ ン平板の溶解面積を測定する こ と によ り 、 検体の線維素溶解作用を観察する こ と を測 定原理と する 。 一方後者はチ ュ ーブ内に人工的に形成 した血栓に対する検体の溶解能を測定する も のであ る。 本願において フ イ ブ リ ン平板は 、 プ ラ ス ミ ノ ゲ ン （ プ ラ ス ミ ン の前駆体 ） を含まない も のを用いてい る。
先ず本願物質のみ を フ ィ プ リ ン平板に作用 さ せて も フ ィ ブ リ ン平板の溶解は認め ら れずした力 つ て本願物 質に は プ ラ ス ミ ン作用は な い。 次 に精製プ ラ ス ミ ノ ゲ ン と本願物質と の混合溶液を フ ィ リ ン平板に作用 さ せた場合、 対照 （ プ ラ ス ミ ノ ゲ ン の み を含む溶液を注 入した も の ） と比較して著明な線維素溶解活性を認め た。 （ 第 2 図参照 ） 。 確認のた め に 、 本物質を標準フ イ ブ リ ン平板に作用 させる と 、 明 ら かに平板の溶解が 認め られ、 従って本願物質の作用機序はァ ク チベータ 様作用 と 断定し う る。 本願物質は又チ ャ ン ド ラ ール —プテ ス ト に おいて も 顕著な血栓溶解効果を示した。
上記薬理試験結果に示すよ う に、 本願に開示された 線維素溶解作用を有する新規物質はプ ラ ス ミ ノ ゲ ン を 活性化して プ ラ ス ミ ン と し フ イ ブ リ ン を溶解する効果 を通して次の如 き場合に臨床効果が期待さ れる 。 . WFO
一般に酵素によ り 線維素原か ら転化された線維素は 血栓症及び塞栓症発症の重要な原因の一つであ る。
本願物質は、 上にのべた作用によ り 末梢動静脈血栓症、 肺塞栓症、 冠動脈閉塞症、 心筋硬塞症.、 脳血管閉塞症、 網膜動静脈血栓症、 硝子体出血、 前房出血等の予防な ら び に治療効果が期待される。 更に制癌剤と の併用に よ り 癌に対する併用効果 も期待で き る と共に、 輸血の 際の抗凝固剤と して、 又血管手術におけ る縫合線の塞 栓形成防止、 あ る い は血液透析におけ る動静脈 シ ャ ン 卜 の長期機能維持に も効果が期待さ れる 。
本願物質を治療に応用する場合、 投与法と し ては静 脈注射や局所灌流法が考え られ、 投与量は疾患によ り 又投与法によ つて異なる ほか、 患者の年令、 体重、 症 状の軽重によ つ て も異なるが通常成人 1 回 0. 1 〜 8 0 の投与によ り 十分な治療効果が期待で き る も のであ る 。 以下に薬理実験例を掲げる 。 実験例 1
本願物質の急性毒性試験を d 系雄性マ ウ ス （ 体 重 2 1 ± 2 ) 1 群 1 0 匹を用いて本願物質を静脈注 射した場合の 7 2 時間後の L D 5。 値を リ ッチフ ィ — ル ' ド ， ゥ ィ リレ コ ク ソ ン法 ( Li tchf ield & " i l coxon， s method ：) で算出する と 2 (2 W Z で あ っ た。
実験例 2
Ο" ίΡΙ ff、 WIPO
本願物質の線維素溶解現象に対する作用を検索する た め に 、 フ イ ブ リ ン平板 （ プ ラ ス ミ ノ ゲ ン フ リ ーの フ ィ ブ リ ン平板、 興和株式会社製、' 以下同じ ） に蛋白濃 度 4 5 0 μ9 / nl の.本願物質のみを作用 さ せて も 、 こ れを溶解しない。 し.たカ つて本願物質には プ ラ ス ミ ン 作用はない。 実験例 5
生理-食塩水で、 精製プ ラ ス ミ ノ ゲ ン （ Κ Α Β I 社製） の 5 cu 溶液 を 作成 し 、 こ の溶液 5 0 . と 、 本 ¾物質を 0. α 5 Μの Τ.Γ is-HCl 緩衝液 （ P H 7. 4 ) に 溶解し蛋白濃度 4 0 , 1 2 0 , 5 7 0 , 9 5 0 ， 及び 1 9 0 D ^に夫々調製した溶液の 1 0 0 と を 混和し、 その 5 ；" を フ イ ブ リ ン平板上の穴に注入し て作用 させ、 5 7 °C で 2 G 時間静置後の フ イ ブ リ ン平 板溶解面積を測-定する こ と によ り 本物質のァ ク チべ一 タ 作用を検索した。 本実験に使用した フ ィ プ リ ン平板 は線溶活性に応じて境界の明瞭な溶解 リ ングを形成す る 。 そ の リ ン グの直径は線維素溶解活性 （ 濃度 ） の対 数と 直線的な比例関係にあ る ので、 直径を測定する こ と によ り 本頹物質の ァ ク チベータ 活性を検討した。
その結果を第 2 表およ び第 2 図に示す。 · 第 2 表によれば、 本願物質のァ ク チベータ 作用は、 対照 （ プ ラ ス ミ ノ ゲ ン のみ ） に比較して著明な活性を 示し、 ァ ク チべ一タ 活性は dose dependent である こ
と が認め られた 第 2 表
水冷下、 試験管中に本願物質を ト リ ス緩衝液に溶解 し蛋白濃度 1 1 2 5 , 2 2 5 , 1 5 0 /^ ^ に 夫 々 調製した溶液各々 a. 5 ， ヒ ト の精製プ ラ ス ミ ノ ゲ ン を 1 5 0 T A ひ n i t / « に調製した溶液 0. 0 5 及び ト ロ ン ビ ン 一 Ca ( 5 0 uni - 0. 1 M /ml ) 溶液の 0· 1 «?を混和し、 こ の混和液に精製 ヒ ト フ イ ブ リ ノ 一 ゲ ン の 2. ό %液を 0. 0 5 加え、 5 7 °C の温浴中に入 れて フ イ ブ リ ン塊を形成さ せ、 フ イ ブ リ ノ 一ゲ ン溶液 を加えて力 ら フ イ ブ リ ン塊の溶解する までの時間を測 定した。 そ の結果を第 5 表に示す。 一方、 本物質溶液 の代 り に生理食塩水を用いた対照は ό 時間以上放置し
V vvvi iPrO
て も 溶解しな力 >つ た。
第 5 表
本願物質を ト リ ス緩衝液に溶解し、 蛋白濃度 5 7 0 9ノ に調製した溶液を標準フ ィ ブ リ ン平板に作用 さ せ 2 α 時間後の溶解 リ ングの径を測定した。 その結果 を第 4 表に示す。 第 4 表
実験例 ό
ク ェ ン酸加 ヒ ト新鲜血 1 ηί ヒ、 Q. 2 5 Μ の Ca C l 2 溶液 を内径 5 薦 ， 長さ 2 7 0 の プ ラ ス チ ッ ク チ ュ ーブに入れチュ -ブの両端を接合してループと した
の ち、 S 7 °C で 5 0 分回転させ、 血栓の形成を完成さ せた 。 血栓形成後、 本願物質を ヒ ト新鮮血に溶解し、 蛋白濃度 0. 2 4 Z m〗 及び 1. 4 mgノ ml に調製した も のを夫々加え、 5 7 °Cで 4 時間回転して溶解せし め た後、 残 った血栓をチ ュ ーブか ら取 り 出し血栓を蒸留 水と共にホ モ ジナ イ ズし溶解させる。 ぞの血色素量を 波長 5 4 0 n m において比色分析 に よ り.測定を行い線 溶能を検定した。 結果を第 5 表に'示す。 ^ 5 ^
第 1 図は、 本願物質の紫外線吸収ス ぺ ク ト ルで あ る。 第 2 図は本願物質のプ ラ ス ミ ノ ゲ ン に対する作用を示 すグ ラ フであ る 。 第 5 図は本願物質の赤外線吸収ス ぺ ク ト ルであ る 。 第 4 図は本願物質のァ ミ ノ 酸組成を示 すア ミ ノ 酸分析計のチ ャ ー ト であ る 。 第 4 図において
1 … ァ ス パ ラ ギ ン酸 ， 2 … ト リ プ シ ン ， 5 … セ リ ン ，
4 … グル タ ミ ン酸 ， 5 … プ ロ リ ン ， ό … グ リ シ ン ，
7 … ァ ラ ニ ン ， 8 … シ ス チ ン ， 9 …ノ リ ン ， 1 0 … メ チ ォ ニ ン ， 1 1 … イ ソ ロ イ シ ン ， 1 2 … ロ イ シ ン ， 1 5 -··
Ά wi?
1δ
チ ロ シ ン 14 フ X ノレ ァ ニ ン ， 15 リ ジ ン ，
10 … ア ン モ ニ ア ， 17 ·'· ヒ ス チ ジ ン 18 ' ァ ノレギニ ン の ビーク を夫々示す。 発明を実施する ため の最良の形態 ·
本発明を更に明確にする ために、 本発明に係る物質 の製造実施例を以下に掲げる。
実施例 '
ノヽ ブ ( r imer es rus ±'1 a vo v i r i d i s Ha 11 owe 11 ) の 凍結乾燥粗毒 5 を常温で 0. 0 2 Mのホ ウ酸緩衝液 ( P H 7. 5 ) 1 5 ) ^ に溶解し、 こ れを セ フ ア デ ッ ク ス ( G — 7 5 ) を充填した 5 X 9 カ ラ ム に通じ、 5
°C ， 溶出速度 ό α Z hr で 0. 0 2 ホ ウ 酸緩衝液
( H 7. 5 ) によ り 溶出し、 線維素溶解活性を有する 画分を分取し、 蒸留水に対して透析し透析内液を凍結 乾燥する 。 こ の 1 0 を Ρ Η ό. α の 0. 0 5 Μ酢酸ナ ト リ ウ ム緩衝液 4 a に溶解し、 5 °C で C Mセ ル 口 一 ス を充填した 1. 5 X 4 C3 «sのカ ラ ム に吸着さ せ、 酢酸 ナ ト リ ゥ ム緩衝液の食塩濃度を 0. 5 Μ ま で徐々 に高め て溶出し、 線溶活性の最 も 強い画分を分取して凍結乾 燥す る 。 ついで こ の画分 5 0 を 0， 0 2 Μ ホ ウ酸緩衝 ' 液 （ Ρ Η 7. 5 ) 2 に溶解し、 こ れを セ フ ア デ ッ ク ス ( G - 5 D ) を充填した 5. 5 X 9 α «¾の カ ラ ム に通じ 5 °G で 0. 0 2 M ホ ウ酸緩衝液で溶出 し線溶活性の最 も 強い画分を分取する。 これは S D S 電気泳動法によ り
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Claims
請求の範囲
1 粗ハブ毒か ら単離さ れ得る物質であ っ て、 紫外部 2 7 8 nm付近と 赤外部およ そ 5 4 0 0 ( 大 ） ，
1 6 4 0 ( 中 ） ， 1 4 5 5 ca 1 ( 大 ） ， 1 5 5 0
5 cm-1 ( 大 ） ， 1 2 5 0 -1 ( 小 ） ， 1 1 0 0 "1 (中 ）， 1 0 2 5 ( 小 ） ， 9 2 5 -1 ( 中 ） ， 7 8 0
( 小 ） 付近に夫々吸収極大を有し、 分子量力 2 8 0 0 0 〜 5 2 D 0 0 の範囲にあ り 総窒素量が 1 2. 4 士 1 %の 糖蛋白質であ つ て水に可溶で顕著な線維素溶解活性を 0 示す物質。
2 粗ハブ毒溶液を分子篩効果を有する物質を固定相 - とする分子篩ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ーと イ オ ン交換体を固 定相と する ィ オ ン交換ク ロ マ ト グ ラ フ ィ 一 と によ り 分 画し、 夫々の場合に最 も 強い線維素溶解活性を有する5 画分を分取してい く こ と を特徴と する線維素溶解活性 物質の製造方法。
5 移動相 と して Ρ Η ό 〜 8 の範囲にあ る電解質か ら な る緩衝液を用いる請求の範囲第 2項記載の製造方 法
0 4 分子篩ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー と し て先ずセ フ ア デ ッ ク ス （ G — 7 5 或いは G — 1 0 0 ) 又は これと 同程度 - の分画能を有するゲル沪過剤を、 つ い で セ フ ア デ ッ ク ス （ G — 5 0 ：) 又は これと 同程度の分画能を有するゲ ル沪過剤を、 用いて行う 請求の範囲第 2 項又は第 5 項5 記載の製造方法。
Priority Applications (2)
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