UA45362C2

UA45362C2 - Нуклеозиди з модифікованими цукрами та олігонуклеотиди

Info

Publication number: UA45362C2
Application number: UA97041994A
Authority: UA
Inventors: Гуанжі Ванг; Кандасамі Рамасамі; Уілфрід Зайферт
Original assignee: Ай-Сі-Ен Фармасьютикалз
Priority date: 1994-11-02
Filing date: 1995-11-02
Publication date: 2002-04-15
Also published as: AU4152596A; WO1996014329A1; US5712378A; PL184378B1; AU690394B2; EP0789706A4; KR100274331B1; CZ129197A3; CN1170412A; EP0789706A1; US5681940A; CN1122040C; JPH10506915A; MX9703192A; CA2202280A1; SK54897A3; PL319944A1; CZ293731B6; RU2145964C1; HUT77516A

Abstract

Описано ряд модифікованих нуклеозидів, які містять модифіковані вуглеводні групи. Модифікація полягає в наявності замісників в положеннях С1 та С4 або розгалужених замісників в положеннях С3 та С5 дезоксирибози або рибози. Кожний нуклеозид перетворюють у відповідний фосфорамідит безпосередньо або після необхідного захисту. Одержані фосфорамідити використовують для синтезу олігонуклеотидів, які містять хоча б один згаданий вище нуклеозид. Ці олігонуклеотиди з модифікованими вуглеводними залишками можуть використовуватись як засоби антизмістової терапії, оскільки очікується, що вони є більш стійкими до нуклеаз і краще проникають до клітини, зберігаючи при цьому специфічність і афінність зв’язування з відповідними послідовностями нуклеїнових кислот, що є мішенями їхньої дії in vitro або in vivo.

Description

Опис винаходу

Настоящее изобретение относится к аналогам полинуклеотидов, содержащим модифицированньсєе сахара. 2 Мспользование олигонуклеотидов в качестве терапевтических средств - очень важная область деятельности, описанная, например, в (1| атеспік, Р.С. апа Зіерпепзоп, М.Ї. Ргос. Май. Асай. Зсі. О.5.А. 1978, 75, 280, 285; ІД) ОпІтапп, Е. апа Реутап, А. Спетіса| Кеміемув, 1990, 90, 543 - 584; |З| Соосабсніїй, 9.

Віосопіцдайе сПпептівігу, 1990, 1, 165 - 187, и (4| СтооКе, 5.Т. апа Геріе), В. "Апіїзепзе Кезеагспй апа

Арріїсайопе", СКС Ргезз (1993). Специфическое связьівание антисмьісловьїх полинуклеотидов с заданньми РНК 70 или ДНК может привести к инактивации функций, связанньїй с ДНК и РНК, таких как репликация, транскрипция или трансляция, тем самь!м обеспечивая механизм лечения таких заболеваний, как рак или вирусная инфекция.

Позтому связьівание антисмьслового олигонуклеотида с мишенью может бьіть использовано для изменения зкспрессии генов в различньїх условиях, например, для нарушения жизненного цикла вирусов или роста раковьїх клеток (5Зіеіп, С.А., Спепо, М.С. Зсіепсе, 1993, 261, 1004 - 1012). Кроме зтого, некоторне нуклеотидь! т прочно связьшваются также с белкюовьіми мишенями, т.е. действуют как ингибиторьі ферментов. ВосК и др. описьівают олигонуклеотидь,, іп міго ингибирующие образование фибриновьїх сгустков, катализатором которого служит человеческий тромбин (ВосК, І.С., сзгітйп, Ї.С., Гайат, у). А., Мегтаав, Б.Н., Тооіе, 9.9. Майшге, 1992, 355, 564 - 566). ЕсКег и др. описьвают ряд олигонуклеотидов, в концентрациях до 1,0мкмоль ингибирующих человеческий вирус простого герпеса. Полинуклеотидьі, способнье ингибировать ферменть, можно легко получить при помощи комбинаторного метода (ЕскКег, О.)., Міскегв, Т.А., Напесак, К., Огімег, М., Апаегзоп, К.

Мисіеїс Асідз Кез. 1993, 21, 1853 - 1856).

Сообщалось, что олигонуклеотид, содержащий разветвленньій 5'і-С-метил нуклеозид, обладает повьішенной устойчивостью по отношению к нуклеазам (Зайа, А.К. ей аіЇ., стенд на 206-й конференции Американского сч ре химического общества, Чикаго, 1993). Сообщали также, что олигонуклеотидьі, содержащие 2'-О-метил-нуклеозидь, более устойчивьі к воздействию нуклеаз и обладают повьішенной аффинностью (о) связьівания с РНК да. Іпоце, Н., Науазе, у., Ітига, А., маі, 5., Міга, К., Опівика, Е., Мисівїс Асідз Кев. 1987, 15, 6131; в. 5пірапага, 5., МикКаї, 5., Могізажа, Н., Маказпіта, Н., Сорауавзні, 5., Мататоїйо, М. Мисіеїс Асідв

Кевз. 1989, 17, 239). Отмечалось, что олигонуклеотид, содержащий 1-замещенньй нуклеозид, обладает с зо некоторой устойчивостью по отношению к нуклеазам (Опо, А., Оап, А., Маїзида, А. Віосопідайе Спетівігу, 1993, 4, 499 - 508). іс),

Антисмьісловне олигонуклеотидь! должньі! не только обладать специфической аффинностью связьвания с со заданньми комплементарньми последовательностями в полинуклеотидах, но и соответствовать требованиям терапевтического применения: обладать мощньм действием, бьіть биологически доступньми, малотоксичньми т) з5 М дешевьми. Поскольку олигонуклеотидьі с природньми фосфодизфирньми скелетами неустойчивь! по « отношению к нуклеазам и с трудом проникают сквозь клеточнье мембрань, исследователи пьітались вьіпОоЛнНить модификации в скелетах полинуклеотидов, которне увеличили бьі устойчивость по отношению к нуклеазам и облегчили бьі проникновение в клетку. Главньій недостаток аналогов олигонуклеотидов, используемьсх для антисмьіслового управления, заключается в том, что модифицированнье межнуклеотиднье связи препятствуют « 70 Вктивации антисмьсловьми олигонуклеотидами рибонуклеазьі Н, что приводит к деградации нити РНК, с 73 с которой связьшваєтся аналог олигонуклеотида. Позтому нужно создать аналоги полинуклеотидов с более вьісокой устойчивостью по отношению к нуклеазам и более сильной способностью проникать в клетку, при зтом :з» не лишая их способности активировать рибонуклеазу Н.

Настоящим изобретением предложеньї новье разнообразнье нуклеозидь! с модифицированньіми сахарами

М соответствующие олигонуклеотидь с модифицированньми сахарами, превосходящие по свойствам їз природнье РНК и ДНК при использований для антисмьіслового управления, диагностики и др.

В число соединений, предложенньїх настоящим изобретением, входят различнье нуклеозидь с о замещениями в позициях СТ", С3, СА или С5' сахарной групп. о Другой аспект настоящего изобретения - олигонуклеотидьі, содержащие один или несколько нуклеозидов с модифицированньїми сахарами, предложенньїх настоящим изобретением. (22) Еще один аспект настоящего изобретения - коньюгать! к олигонуклеотидам, содержащим один или несколько

ГК нуклеозидов с модифицированньїми сахарами, предложенньїх настоящим изобретением.

На фиг. 1 представлень! варианть! олигонуклеотидов, соответствующих настоящему изобретению, в которьїх компоненть! нуклеозидов замещеньї положительно заряженной группой.

На фиг. 2 приведена схема 1 реакции синтеза 3-С-разветвленного тимидина.

На фиг. З приведена схема 2 реакции синтеза 3-С-разветвленного тимидина. (Ф) На фиг. 4 приведена схема З реакции синтеза 4"-С-разветвленного тимидина.

ГІ На фиг. 5 приведень! дополнения к схеме З реакции синтеза 4"-С-разветвленного тимидина.

На фиг. 6 приведена схема 4 реакции синтеза 4-С-разветвленного тимидина. во На фиг. 7 приведена схема 5 реакции синтеза 5-С-разветвленного тимидина.

На фиг. 8 приведена схема 6 реакции синтеза 5-С-разветвленного тимидина.

На фиг. 9 приведень дополнения к схеме 6 реакции синтеза 5-С-разветвленного тимидина.

На фиг. 10 приведена схема 7 реакции синтеза 5-С-разветвленного тимидина.

На фиг. 11 приведена схема 8 реакции синтеза 5-С-разветвленного тимидина. 65 Фиг. 12 - зто схема, иллюстрирующая стереохимические свойства соединения 44 и других.

На фиг. 13 приведена схема 9 реакции синтеза 1-С-разветвленного тимидина.

На фиг. 14 приведена схема 1Ореакции синтеза 1"-С-разветвленного тимидина.

Сокращения и определения

ОМтТт - 4,4-диметокситритил

СЕРА : 2-цианзтил-(М,М'--миизопропил)-фосфорамид твоОмМ5 - трет-бутилдиметилсилил

Ас - ацетил

ТВвОМ5М - трет-бутилдиметилсилоксиметил

М3 - азидо 70 СЕзЗСО - трифторацетил

ТрЕ трифторметансульфонил

ТНР :- тетрагидропиранил

Ов - тосил

Термин "нуклеозид' в настоящем документе обозначает соединение, содержащее пуриновое или 7/5 пиримидиновое основание (или его производноеє), ковалентно связанноеє с циклическим сахаром из 5 атомов углерода (фуранозой), например, рибозой, 2'і-дезоксирибозой и 2",3'і-дидезоксирибозой. Термин "нуклеозид" используется в широком смьсле и относится также к нуклеозидам с модифицированньми сахарами, предложенньім настоящим изобретением.

Термин "полинуклеотид' в настоящем документе обозначает полимерь, состоящие из двух и более Нуклеозидньх единиц, каждая из которьїх связана с одной (конечной) или двумя (внутренними) другими нуклеозидньіми единицами при помощи межнуклеозидньх связей, таких как фосфодизфирньсе связи, пептиднье связи, фосфонатнье связи, фосфоротисатнье связи и т.п. Примерами полинуклеотидов служат РНК и ДНК.

Термин "полинуклеотид" в настоящем документе используется (если не указано иное) в широком смьісле и относится к полинуклеотидам с модифицированньіми сахарами, предложенньім настоящим изобретением. с

Термин "олигонуклеотид" в настоящем документе обозначает сравнительно небольшие полинуклеотидьі, т.е. полинуклеотидьії, содержащие от 2 до около 5Опар оснований; однако, олигонуклеотид может бьіть значительно о длиннее.

Термин "гидроксил-блокирующая группа", используемьйй в настоящем документе, будет понятен среднему специалисту в области органической химии. Примерь! гидроксил-блокирующих групп и других блокирующих су групп можно найти (кроме всего прочего) в Сгеепе апа МУців, Ргоїесіїме Сгоимрз іп Огдапіс Зупіневів" дойп Уміїеу

Зопв, МУ, МУ (1991). о

Термин "основание" и "нуклеозидное основание" в настоящем документе обозначают гетероциклические со нуклеотиднье основания, содержащиеся в природньїх нуклеийновьїх кислотах, такие как аденин, цитозин, гипоксантин, урацил, тимин, гуанин, и их аналоги, в том числе основания, не встречающиеся в природе, которьіе о способнь! спариваться с природньіми основаниями. К таким не встречающимся в природе гетероциклическим « основаниям относятся следующие, но не исключительно следующие: аза- и деаза-аналоги пиримидина, аза- и деаза-аналоги пурина, а также другие гетероциклические аналоги оснований, в которьїх один или несколько атомов углерода и азота пуриновьїх и пиримидиновьїх колец замещень! гетероатомами, например, атомами кислорода, серьі, селена, фосфора й т.п. «

Настоящим изобретением предложень! новьіе нуклеозидьій и олигонуклеотидьії, обладающие свойствами, 8 с желательньми для использования их в ходе антисмьіслового управления, диагностики и в других процессах, где й применяются олигонуклеотидь. В число соединений, предложенньїх настоящим изобретением, входят «» различнье нуклеозидьії с модификациями-замещениями в позициях СТ, СУ, С4 и С5 сахарной группь! нуклеозида. Нуклеозидь), предложеннье настоящим изобретением, могут содержать одно или несколько

Замещений, облегчающих у частие нуклеозида в твердофазном синтезе, например, упомянутьй нуклеозид ї» может образовать фосфорамидитное производное с 5-диметокситритилом или другими протекторньми группами. Настоящее изобретение также обеспечиваєт создание олигонуклеотидов, содержащих один или і-й несколько нуклеозидов с модифицированньїми сахарами, соединенньх в виде нити нуклеийновой кислоть.

Ге) Помещение подходящего заместителя в позицию СУ или С5 нуклеозида изменяет среду, окружающую 5о фосфодизфирньй скелет олигонуклеотида, содержащего зти нуклеозидьі с модифицированньми сахарами. В б предпочтительньїх случаях в позициях СЗ' или С5' используются громоздкие заместители, чтобь! предотвратить

ГЯ6) нежелательное взайимодействие с ферментами или их активньми у частками. Зти заместители в позициях С3" или С5 делают фосфодизфирньй скелет олигонуклеотидов недоступньм для многих ферментов. За счет присутствия зтих заместителей олигонуклеотидьі, содержащие зти С3- или С5'-разветвленнье нуклеозидь, могут бьіть более устойчивьіми по отношению к нуклеазам, чем ДНК или РНК. Заместители в позициях Ст и

С4" нуклеозидов могут давать те же благоприятнье зффекть, что и заместители в позициях СЗ и С5. о В тех вариантах осуществления изобретения, в которьїх олигонуклеотидьі содержат сахара, іме) модифицированнье положительно заряженньми аминоалкилами, суммарньй отрицательньй заряд олигонуклеотидов в физиологических условиях уменьшается, так что двойная спираль, образованная хотя бь бо одной онитью озтих олигонуклеотидов, может оказаться более устойчивой, чем соответствующий немодифицированньй олигонуклеотид (см. Фиг. 1). Таким образом, в вариантах осуществления изобретения, в которьїх олигонуклеотидьі! содержат сахара, модифицированнье аминоалкилами или подобньми положительно заряженньми заместителями, зтот положительньй заряд может способствовать повьішению аффинности связьвания олигонуклеотидов с полинуклеотидами-гибридизационньми мишенями. Средний специалист в 65 данной области поймет, что хотя изложеннье вьіше теоретические соображения и служат отправной точкой для разработки и использования дополнительньїх вариантов осуществления настоящего изобретения, они не должньї обязательно оправдьїваться при его осуществлении.

Один из вариантов осуществления настоящего изобретения - зто нуклеозидьї с модифицированньіми сахарами, соответствующие формуле: по ; (45)

В, Б, где КК. - зто алкил, аралкил, арил, замещенньй алкил, замещенньй аралкил или замещенньй арил, а заместители МО», СМ, Мз, СООБЕЇ, ОН, ЗН, СОМН»о, СОМНЕ, СОМ», СООН, ОАС, МН», МНАс, ММе», СЕЗСОМН,

ОБ, 5Е, 505СН», СЕ», Е, СІ, ВВ, І, ОТв, "ММез, СНАСНЕ, С-СВ, где В - зто алкил; Б» - зто Н, ОН, алкоксил или арилоксил; Кз - ОН или О-СЕРА; Ку) - ОН или гидроксил-блокирующая группа; В - зто гетероциклическое нуклеозидное основание; Х - зто О, 5, МН или СН».

Гетероциклическое нуклеозидное основание В нуклеозидов с модифицированньми /сахарами, предложенньїх настоящим изобретением, представленное в формулах 45, 46, 47, 48, 49, 50, может бьіть любьм гетероциклическим нуклеозидньм основанием, природньм или синтетическим. Так, гетероциклические нуклеозиднье основания, которье могут служить основаниями в нуклеозидах с модифицированньїми сахарами, предложенньїх настоящим изобретением, могут относиться к пуринам (например, аденин, гуанин или ксантин), пиримидинам (например, тимин, урацил, цитозин) и их гетероциклическим аналогам и таутомерам.

Подходящими гетероциклическими основаниями, которье могут служить основаниями в нуклеозидньмх соединениях, предложенньїх настоящим изобретением, являются те, которне можно включить в одну из нитей двухнитевого полинуклеотида с возможностью спаривания с природньім основанием в комплементарной нити полинуклеотида. Кроме того, основания нуклеозидньїх соединений, предложенньїх настоящим изобретением, се соединяются с сахарньми группами такими своими частями, что соединение не препятствует спариванию о основания, упомянутому вьіше.

Еще один вариант осуществления настоящего изобретения - зто нуклеотидьі, сосответствующие формуле:

В, В сч

Кк, Х.

Ко, (в) о к5 Ге) юю где КК. - зто алкил, аралкил, арил, замещенньій алкил, замещенньій аралкил или замещенньй арил, а « заместители МО», СМ, Мз, СООБЕЇ, ОН, ЗН, СОМН»о, СОМНЕ, СОМ», СООН, ОАС, МН», МНАс, ММе», СЕЗСОМН,

ОК, ЗЕ, ЗО»Ме, СЕ», Е, СІ, ВЕ, І, ОТв, "ММез, СНАСНЕ, С-СЕ, где К - зто алкил; Ко -зто Н, ОН, алкоксил или арилоксил; Кз - ОН, О--ВОМ5, О-СЕРА; К, - ОН, СНО или гидроксил-блокирующая группа; В - зто гетероциклическое нуклеозидное основание; Х - зто О, 5, МН или СН», а углерод, присоединенньй к К. и Ку, «

Ммеет конфигурацию К или 5. з с Еще один вариант осуществления настоящего изобретения - зто нуклеозидьі, сосответствующие формуле: хз» в х в и (47) г; Кк, ве где КК. - зто алкил, аралкил, арил, замещенньй алкил, замещенньй аралкил или замещенньй арил, а с заместители МО», СМ, Мз, СООБЕЇ, ОН, ЗН, СОМН»о, СОМНЕ, СОМ», СООН, ОАС, МН», МНАс, ММе», СЕЗСОМН,

ОК, ЗЕ, ЗО»Ме, СЕ», Е, СІ, ВЕ, І, ОТв, "ММез, СНАСНЕ, С-СЕ, где К - зто алкил; Ко -зто Н, ОН, алкоксил или о арилоксил; Кз - ОН, ОТВОМ5, О-СЕРА; Ку; - зто ОН или гидроксил-блокирующая группа; В - зто

Ге») 20 гетероциклическое нуклеозидное основание; Х - зто О, 5, МН или СН». "з Еще один вариант осуществления настоящего изобретения - зто нуклеотидьі, сосответствующие формуле:

Кк, Х в

Кк, (48) о бе, о где Кі - зто алкил, аралкил, арил, замещенньй алкил, замещенньй аралкил, замещенньій арил, а заместители МО», СМ, Мз, СООЕЇ, ОН, ЗН, СОМН», СОМНЕ, СОМК», СООН, ОАС, МН», МНАс, ММе», СЕЗСОМН, бо ОБ, 5, 50»Ме, СЕ», Е, СІ, ВЕ, І, ОТв, "ММез, СНАСНЕ, СУ-СВЕ, где В - зто алкил; БК» -зто Н, ОН, алкоксил или арилоксил; Кз - ОН, О-МВп, О-СЕРА; КЕ, - зто ОН или гидроксил-блокирующая группа; В - зто гетероциклическое нуклеозидное основание; Х - зто О, 5, МН или СН».

Другой аспект настоящего изобретения предусматриваєт различнье зпоксиднье производнье от нуклеозидов с модифицированньми сахарами, предложенньх настоящим изобретением, производньє, бо соответствующие формулам:

т ж 2 ок,

Ов х ке, где К вьібирают из группьї, состоящей из СНЬОН, СНо, ОЮОМТТт, СНО, СООН, СООКЇ, а Х вьібирают из группь, состоящей из О и СН». Зпоксидь! могут иметь любую из возможньїх стереохимических конфигураций.

Нуклеозидьі с модифицированньми сахарами, предложеннье настоящим изобретением, можно синтезировать в соответствии с примерами, приведенньіми в соответствующем разделе зтой заявки. Средний специалист в области органической химии может, руководствуясь зтими примерами, синтезировать различнье соединения, соответствующие настоящему изобретению, процедурь! синтеза которьїх не описань.

Олигонуклеотидьі, содержащие нуклеозидьі с модифицированньіми сахарами

Полинуклеотидьі, соответствующие настоящему изобретению, содержат один или несколько нуклеозидов с модифицированньми сахарами, соответствующих настоящему изобретению, причем нуклеозид с модифицированньм сахаром, соответствующий настоящему изобретению, соединен либо со вторьм нуклеозидом с модифицированньм сахаром, либо с немодифицированньм нуклеозидом, и соединень нуклеозидь! межнуклеозидньми связями. К нуклеозидам с модифицированньми сахарами, пригодньім для с об Включения в олигонуклеотидь, относятся соединения, описаннье формулами 45, 46, 47 и 48.

Полинуклеотидь-аналоги, предложеннье настоящим изобретением, не ограниченьі в смьісле числа і) нуклеозидов-субьединиц в отдельном полинуклеотиде-аналоге; однако, как привило, удобнее синтезировать короткие полинуклеотидьі-аналоги, например, полинуклеотидь-аналоги, содержащие не более 5боснований.

Отдельнье нуклеозидьі, предложеннье настоящим изобретением, можно соединить при помощи с зо межнуклеозидньх связей таким образом, чтобьі ополучить новье олигонуклеотидьі с заданньми последовательностями нуклеозидньїх оснований. Межнуклеозидньсе связи - зто связи типа С3У-С5 или С2-С5. со

Термин "межнуклеозиднье связи" в настоящем документе относится не только к фосфодизфирному скелету, за с счет которого образуются межнуклеозиднье связи в ДНК (дезоксирибонуклеийновьїх кислотах) и РНК (рибонуклеиновьїх кислотах), но и к ряду других групп, виіполняющих ту же структурную функцию, что и о фосфодизфирньсе связи в ДНК и РНК. Примерами других межнуклеозидньх связей, приемлемьїх для включения «Е в олигонуклеотидь, соответствующие настоящему изобретению, могут служить фосфоротисать, метилфосфонатьі, фосфородитисать!, борофосфонать!ї, селенофосфонатьі, фосфорамидать, ацетамидать и т.п. Описание синтеза и применения различньїх межнуклеозидньїх связей можно найти, помимо других источников, в патенте США 5256775, международной публикации УУ093/24507, международной публикации «

УМО92/05186, патенте США 5264562, международной публикации УУ092/02534, международной публикации (З с МУ/094/06811, международной публикации УУ093/17717, патенте США 5212295, патенте США 5292875, патенте

США 5218103, патенте США 5166387, патенте США 5151516, патенте США 4814448, патенте США 4814451, з патенте США 4096210, патенте США 4094873, патенте США 4092312, патенте США 4016225, патенте США 4007197.

Полинуклеотидьі, соответствующие настоящему изобретению, с заданной последовательностью оснований ї5» могут бьіть полученьї, при помощи методов синтеза полимеров нуклеиновьїх кислот, хорошо известньїх средним специалистам в области органической химии. В предпочтительном случає полинуклеотидь!і, соответствующие о настоящему изобретению, синтезируют в соответствии с принципами фосфорамидитной химии для включения оо одного или нескольких новьіїх нуклеозидов, предложенньїх настоящему изобретению, в полинуклеотид-аналог. 5р Разветвленнье заместители в позициях СУ или С5 нуклеозидов могут снизить скорость соединения. Зтот

Ме. зффект зависит от размера заместителей. Позтому для нуклеозидов с громоздкими заместителями бьівает

Із необходимо увеличить время соединения даже в 1Ораз. При необходимости для увеличения скорости реакции соединения можно проводить повторнье реакциий со свежими реактивами или использовать более вьісокие концентрации реагентов. По окончаниий синтеза олигонуклеотидьі обрабатьвают так же, как стандартнье немодифицированнье олигонуклеотидьі, т.е. отщепляют от твердьїх подложек при помощи 3095 аммиака, удаляют протекторнье группьі в течение 8 часов при 557"С и очищают посредством обращенно-фазной

Ф) жидкостной хроматографиий вьісокого разрешения (ЖХВР). ка Для проверки чистотьі олигонуклеотидов и о присутствия в них требуемьмх нуклеозидов с модифицированньіми сахарами, очищеннье олигонуклеотидьі можно исследовать путем анализа продуктов их бр переваривания ферментами, например, такими как фосфодизстераза из змеиного яда или бактериальная щелочная фосфатаза. Продуктьі деградации можно подвергнуть хроматографическому (ЖХВР) анализу или проанализировать другим способом и сравнить с образцами исходньїх нуклеозидов. Структуру очищенньх олигонуклеотидов можно определить при помощи масс-спектроскопии, например, с злектрораспьілением.

Другой аспект настоящего изобретения предусматривает коньюгать! с олигонуклеотидами, содержащими 65 Модифицированньє сахара. Чтобьї создать площадку для коньюгации требуемой группь! с олигонуклеотидом, в позициях СТ, СУ, Сб4 и СУ входящих в него нуклеозидов можно присоединить аминнье, гидроксильньє,

тиоловьне и карбоксиалкиловье линкерьі. Линкерьі, присоединяемьсе в позициях СТ и С3", можно использовать для того, чтобьї направлять коньюгированную группу в малую бороздку двухнитевой нуклеийновой кислоти, а линкерьі, присоединяемье в позиции С", - чтобьї направлять коньюгированную группу в большую бороздку. Линкерьі, присоединяемне в позиции С5, направляют коньюгированную группу либо в большую, либо в малую бороздку двухнитевой нуклеийновой кислоть!: в зависимости от стереохимии самого линкера в позиции С5". При помощи линкеров можно присоединять и размещать в нужньїх позициях разнообразнье функциональнье группьі, такие как искусственная нуклеаза, перекрестно-связьвающие агентьї, интеркаляторь! и репортернье молекуль!. 70 Поскольку олигонуклеотидьї, предложеннье настоящим изобретением, ообладают значительной связьвающей активностью по отношению к одно- и двухнитевьім нуклеиновьм кислотам-мишеням и образуют устойчивье двойнье, тройнье и другие структурь с природньмми полинуклеотидами и их структурньіми аналогами, олигонуклеотидьї, предложеннье настоящим изобретением, могут бьть использовань! в большинстве процессов, в которьїх используются обьчнье олигонуклеотидь». Так, олигонуклеотидь, 7/5 Соответствующие настоящему изобретению, могут бьіть использованьі, например, как зондь! гибридизации полинуклеотидов, затравки для полимеразной цепной реакции и подобньїх циклических реакций амплификации, затравки для секвенирования и др. Олигонуклеотидьі, предложеннье настоящим изобретением, также могут бьіть использованьії для диагностики и лечения заболеваний. Терапевтическое применение олигонуклеотидов, соответствующих настоящему изобретению, предусматривает специфическое подавление зкспрессии генов го (или подавление трансляции последовательностей РНК, закодированньх зтими генами), связанньх с возникновением и развитием патологических состояний, при помощи антисмьісловьїх олигонуклеотидов.

Олигонуклеотидьі, соответствующие настоящему изобретению, могут бьіть использованьі для опосредования антисмьіслового подавления целого ряда генньїх мишеней. Примерами генов или РНК, закодированньїх зтими генами, которье могут бьіть мишенями антисмьслового подавления при помощи олигонуклеотидов, могут с ов служить гень/РНК, кодирующие ферменть, гормонь, сьвороточнье белки, трансмембраннье белки, адгезионнье молекуль (І ЕА-1, ОРІБЛІа, ЕСАМ-1, МАСМ-1, ІСАМ-1, Е-веіесіоп и т.д.), молекуль! рецепторов, в (8) том числе цитокиновьіх рецепторов, цитокинь! (1-1, 1/-2, 1-3, 11 -4, 1-6 и др.), онкогеньі, факторь! роста и интерлейкиньі. Зти геньії или РНК могут бьіть связань! с любьіми патологическими состояниями, вьізванньіми воспалением, сердечно-сосудистьіми заболеваниями, иммунньми реакциями, раком, вирусньіми инфекциями, с бактериальньми инфекциями, грибковьіми инфекциями, паразитарньми инвазиями и др.

Олигонуклеотидьі, предложеннье настоящим изобретением, пригоднь! для терапевтического применения ікс, как іп мімо, так и ех мімо. К показаниям для применения ех мімо относится необходимость обработки клеток, со таких как костньій мозг или периферийная кровь, при таких состояниях как лейкоз (хронический миелолейкоз, острьій лимфолейкоз) или вирусная инфекция. К генам или РНК, кодируемьм зтими генами, которье могут о

Зз5 спужить мишенями при лечений рака, относятся онкогень), такие как гав, К-гав, БсіІ-2, с-тубр, Бсг, с-тус, с-абі, «Е или сверхсинтезированнье последовательности, такие как тат2, онкостатин М, 1-6 (саркома Капоши), НЕК-2, и транслокации, такие как бБсі-арі. Подходящими мишенями являются также вируснье геннье последовательности или РНК, закодированнье соответствующими генами, такие как геньі полимераз или обратньїх транскриптаз герпетических вирусов, таких как цитомегаловирус и вирусь! простого герпеса 1 и 2; « Бетровирусов, таких как вирус человеческого Т-клеточного лейкоза-ї, ВИЧ-1, ВИЧ-2; или других ДНК- или ств) с РНК-вирусов, таких как НВМ, НРМ, МАМ, вирус гриппа, аденовирусьі, флавивирусьі, риновирус и др.

Специфически связьвающиеся олигонуклеотидь! могут бьть использованьій в сочетаний с другими ;» терапевтическими средствами. К другим областям терапевтического применения олигонуклеотидов, предложенньїх настоящим изобретением, относятся (1) модуляция воспалительньїх реакций за счет модуляции Зкспрессии генов, таких как геньї рецептора 1І--1, 1-1, ІСАМ или г-зеїесіоп, которне играют определенную роль ї» в опосредований воспаления (2) модуляция пролиферации клеток в таких состояниях как закупорка артерии (рестеноз) после ангиопластики за счет модуляции зкспрессии (а) факторов роста или деления клеток, таких как іні немьішечньй миозин, тує, ох, РСМА, РОСЕ или РОБ или их рецепторов или (б) факторов пролиферации клеток, г) таких как с-тур. При лечении псориаза и других состояний мишенями могут служить другие факторь пролиферации или факторь! передачи сигналов, такие как ТоОгГа, 1І--6, дІМЕ, протеин киназа С, тирозин киназь

Фо (такие как р210 и р190). Кроме того, при аутоиммунньїх заболеваниях мишенями могут служить аллели главного з комплекса гистосовместимости, ТОРа или рецептора ЕСЕ.

Олигонуклеотидьії, предложеннье настоящим изобретением, могут с успехом заменить обьічнье

Олигонуклеотидьі во многих нетерапевтических процессах, таких как гибридизация с целью обнаружения последовательностей нуклеийновой кислотьі, полимеразная цепная реакция и т.п. Зти нетерапевтические процессь! хорошо известнь! средним специалистам в области молекулярной биологии и описаньї, например, у іФ) затргоок еї аіІ. МоІесшаг Сіопіпд Тесппіднез 2пй Едіоп Сіса 5ргіпд Нагрог (1989). ко Зфофективность доставки олигонуклеотидов, предложенньїх настоящим изобретением, в клетки можно повьісить любьім подходящим способом, в том числе путем трансфекции при помощи фосфата кальция, бо деметилсульфоксида, глицерина или декстрана, путем злектропорации или при помощи катионньх, анионньх и/или нейтральньхх липидньїх соединений или липосом, как описано в международньїхх публикациях Мо УМО 90/14074, МО 91/16024, МО 91/17424 и в патенте США 4897355. Олигонуклеотидьі можно вводить в клетки в виде комплексов с катионньмми липидами, такими как СОТМА (которье могут образовьвать липосомь! или не образовьвать их); введенньій комплекс затем взаймодействуеєт с клеткой. В неисчерпьвающий перечень б5 приемлемьх катионньїх липидов входят М-(2,3-ди(9-(27)-октадеценилоксил))-проп-1-ил-М,М,М-триметиламмоний (ООТМА) и его соли, 1-О-олейл-2-О-олейл-З-диметиламинопропил-р-гидроксизтиламмоний и его соли и

2,2-бис-«(олеилокси)-3--триметиламмоний)-пропан и его соли.

Повьісить зффективность доставки олигонуклеотидов, предложенньїх настоящим изобретением, можно также при помощи (ії) вирусов, таких как вирус Сендай (Вагілай, К., ВіоФесппо! Аррі Віоспет., 1989, 11, 133 - 135) или аденовирус (УУадпег, Е. еї аії, Ргос Майї! Асай Зсі. ОБА, 1992, 89, 6099 - 6013); (її) полиаминньх или поликатионньіїх коньюгатов, таких как полилизин, протамин или Ма, М415-бис (зтил) спермин (У/адпег, Е. еї аї,

Ргос Ма Асай Зсі. ОБА, 1991, 88, 4255 - 4259; 7епКе, М., еї аіІ, Ргос Май Асай сі. ОБА, 1990, 87, 3655 - 3659; Спапк, В.К., еї аіЇ, Віоспет Віорпуз Кез Соттип., 1988, 157, 264 - 270; Патент США 5138045); (ії) липополиаминньїх комплексов с такими соединениями, как липоспермин (Венпйг, .-Р. еї а), Ргос Маї! Асай 5сі. 70 БА, 1989, 86, 6982 - 6986; Іоетшег, У.Р., еї аї, 9. Мецйгоспет., 1990, 54, 1812 - 1815); (ім) анионньх, нейтральньх или чувствительньїх к рН липидов, с использованием соединений, в число которьїх входят анионньюе фосфолипидь, такие как фосфатидилглицерин, кардиолипин, фосфатидная кислота или фосфатидилотаноламин (І ее, К.-О. еї аі, Віоспет Віорпуз АСТА, 1992, 1103, 185 - 197; Спеадаг, 0. еї аїЇ, Агсп

Віоспет Віорпуз, 1992, 294, 188 - 192; Мовпітига, Т., еф а), Віоспет пі, 1990, 20, 697 - 706); (м) /5 Коньюгации с такими соединениями, как трансферрин или биотин, или (мії) коньюгации с белками (в том числе альбумином или антителами), гликопротеинами или полимерами (в том числе, полизтиленгликолем), которье улучшают фармакокинетические свойства олигонуклеотидов, о которьїх идет речь. В настоящем документе под трансфекцией подразумевается любой способ, приемлемьй для доставки олигонуклеотидов в клетки. Любое вещество, такое как липид, или любой агент, такой как вирус, которьій может бьть использован для 2о осуществления трансфекции, в общем случає мь будем назьвать "агентом, повнішающим проникающую способность". Доставка олигонуклеотидов в клетки может бьїть осуществлена посредством котрансфекции с другими нуклеийновьми кислотами, такими как (ї) зкспрессируемье фрагменть! ДНК, кодирующие белок/белки или фрагмент белка, или (ії) транслируемье РНК, кодирующие белок/белки или фрагменть! белка.

Таким образом, олигонуклеотидьі, предложеннье настоящим изобретением, могут бьіть включень! в любой с подходящий состав, повнішающий зффективность их доставки в клетки. К подходящим фармацевтическим составам относятся также те, которне обьічно используются, когда доставка соединения в клетки или ткани і) происходит за счет наружного применения состава. В препаратах для наружного применения, содержащих олигонуклеотидь!, могут бьіть использовань! такие соединения как полизтиленгликоль, пропиленгликоль, азон, ноноксил-9, олеиновая кислота, диметилсульфоксид, полиаминь!ї или липополиаминь. с зо Синтез 3-С-разветвленньїх нуклеозидов

Замещение гидроксильной группьі в позиции С3 нуклеозидов другими функциональньми группами с ікс, сохранением водорода в позиции С3 описано, помимо других источников, у ЮОе Сіегсд, Е., Апіїміга! Кев. 1989, с 12, 1 - 20. Замещение водорода в позиции С3 нуклеозидов другими функциональньми группами описано у

Редогом, І.І., Калтіпа, Б.М., Момісом, М.А., СигеКауа, с.М., ВоспиКагем, А.М., дазКо, М.М., Місюгома, /.5., Щео, КипКкапома, М.К., Ваїгагіпі, уУ., Ое СіІегсд, Е. У. Мед. Спет. 1992, 35, 4567 - 4575. Настоящим изобретением «І предусмотрень! процедурь! приготовления большого числа разнообразньїх 3-С-разветвленньїх нуклеозидов.

Примерьї методик приготовления 3'-С-разветвленньїх тимидинов приведень на схемах реакций 1 и 2 (Фиг. 2 и 3, соответственно). Зти процедурь! можно легко адаптировать для синтеза других нуклеозидов, соответствующих настоящему изобретению, в том числе соответствующих тем вариантам осуществления изобретения, в которьїх « Ннуклеозидь! содержат основания, отличнье от тимина. Соединение 4 бьло приготовлено из тимидина в три с зтапа, как описано у догдепзеп, Р.М., Тигапе, Н., МУепдеї, У. У. Ат. Спет. Бос. 1994, 116, 2231. Обработка й соединения 4 тосил хлоридом в пиридине дала тосилат, соединение 5. Реакция соединения 5 с цианидом калия и? в М.М-биметилформамиде дала 3-С-цианметилтимидиновое производное, соединение 6. Реакция соединения 5 с азидом натрия в М,М- бхиметилформамиде дала 3-С-азидометилтимидиновое производноеє, соединение 7.

Подобньм образом, реакции соединения 5 с различньми нуклеофильньми реагентами дают разнообразнье ї 3-С-разветвленнье тимидиновье производньсе, в которьїх ориентация 3'-С-гидроксильной группь! остается той сл же, что и в тимидине. Обработка соединения б 2-цианзтил-М,М-диизопропилхлорфосфорамидитом и диизопропилатиламином в дихлорметане дала фосфорамидит, соединение 8 - строительную единицу для (95) синтеза олигонуклеотидов. Соединение 7 подвергли такой же обработке и получили соединение 9. Подобньм б» 50 образом можно преобразовать и другие 3-С-разветвленнье тимидиновье производнье в соответствующие фосфорамидить. Зта стандартная процедура описана у Р. ЕсКвіеїп, "ОІідописієойде Зупіпевів", Ожхіога що) Мпімегзйу Ргезз (1991). Обработка соединения 5 гидридом натрия в тетрагидрофуране дала зпоксидное производное, соединение 10. Реакция соединения 10 с алюмогидридом лития в тетрагидрофуране дала 3-С-метилтимидиновое производноє, соединение 11, которое бьло преобразовано в фосфорамидит, соединение 12. Реакция соединения 10 с аммиаком в метаноле дала 3-С-аминометилтимидиновое производное, соединение 13, которое обработали зтилтиотрифторацетатом в тетрагидрофуране и получили о защищенное аминопроизводное, соединение 14. Соединение 14 преобразовали в фосфорамидит, соединение іме) 15. Подобньм же образом, реакции соединения 710с разнообразньми нуклеофильньми реагентами дают различнье 3-С-разветвленнье тимидиновье производнье, в которьїх ориентация 3'-С-гидроксильной группь! бо остаєется той же, что и в тимидине, так как нуклеофиль! атакуют найменее закрьїтьй углерод зпоксидного кольца. Так, реакции соединения 10со спиртами в присутствиий оснований дают алкоксиметилтимидинь!. Для приготовления 3-С-(замещенньй алкоксиметил)-тимидинов можно использовать спиртьї с замещениями. В неисчерпьвающий перечень заместителей входят МО 5», СМ, СООЕЇ и защищеннье аминогруппьі. Реакции соединения 10 с двухатомньми спиртами дают 3-С-гидроксиалкоксиметилтимидиньі, которье можно легко 65 преобразовать в 3'-С-галогеналкоксиметилтимидинь». Реакция соединения 10 с нитрометаном дает 3-С-нитрозтилтимидин. Восстановление 3-С-нитроалкилтимидинов дает 3-С-аминоалкилтимидиньі. Реакции соединения 10с циан-замещенньми кадмий-органическими соединениями дает 3-С-цианалкилтимидинь.

Реакции соединения 10 с зтоксикарбонилалкилцинковьми реагентами дают 3'-С-зтоксикарбонилалкилтимидь, которье легко гидролизуются в 3'-С-карбоксиалкилтимидинь! в щелочной среде.

Для некоторьїх реакций, в которьїх у частвуют литиевье медь-органические реагентьі, бьівает необходимо защитить амидную группу тимидина. В качестве протекторной группьі предпочтительньмм является трет-бутилдиметилсилоксиметил (ТВОМ5М), так как его можно легко удалить при помощи тетрабутиламмония фторида (ТВАР) по окончании необходимьїх преобразований. Группу М-ТВОМеМ можно ввести при помощи реакции 3,5-диацилированного тимидина с трет-бутилдиметилсилоксиметил хлоридом в пиридине. М-ТВОМЗМ 7/0 Тимидин подвергают обработке, описанной для тимидина, и получают тосилат, производное соединения 5, и зпоксид, производное соединения 10, соответственно, которше можно использовать для приготовления 3-С-алкилтимидинов и 0 3-С-алкенилтимидинов при помощи о реакций с о литиевьми реагентами.

Гидроборированиеє или окислительное расщепление полученньїх 3-С-(5-алкенил)-тимидинов /дает гидроксиалкилтимидинь!, где гидроксил можно преобразовать в различнье функциональнье группьї, такие как 75. МН», ОК, БК, ЗНИ Х, где К - зто Н или алкил, а Х - зто Р, СІ, Вг, І, Ов.

Синтез 4-С-разветвленньїх нуклеозидов

Имеются сообщения о 4"-С-разветвленньїх нуклеозидах О-Мапуд С., Ми, Н. у., Егазег-Зті(й, Е.В., Умаїкег,

К.А.М. Теїгапедгоп І ей.5, 1992, 33, 37 - 40. Настоящим изобретением предусмотрень!ї процедурь! приготовления многих новьіїх 4-С-разветвленньїх нуклеозидов. Приготовление 4-С-разветвленньїх тимидинов показано на 2о схемах реакций 3, 4 и 5 (Фиг. 4, 5, 6 и 7, соответственно). Зти процедурьі можно легко адаптировать для синтеза других нуклеозидов, соответствующих настоящему изобретению, в том числе соответствующих тем вариантам осуществления изобретения, в которьїх нуклеозидьі содержат основания, отличнье от тимина.

Соединение 16, приготовленное из тимидина, обработали диметокситритилхлоридом и получили соединение 17. Группу трет-бутилдиметилсилил (ТВОМ5) соединения 17 удалили посредством обработки ТВАЕБ и получили су соединение 18, которое окислили до альдегида, соединение 19, за счет обработки диметилсульфоксидом, ОСС, трифторуксусной кислотой и пиридином. Соединение 19 преобразовали в соединение 20, і) 4-С-гидроксиметилтимидиновое производное, при помощи процедурьї, подобной описанной у а) о-Мапа С., ММи,

Н.У., ЕРгазег-Зті(ф, Е.В., УМаїКег, К.А.М. Теїгапедгоп Іейв, 1992, 33, 37 - 40; В) допев, 0. Н., Тапідиснпі, М.,

Тездо, О., Мопан, 9.0. 9У. Огд. Спет. 1979, 44, 1309 - 17). Диметокситритиловую группу соединения 2б0удалили с при помощи 8095 уксусной кислотьї и получили соединение 21, 4-С-гидроксиметилтимидин. Избирательное со бензоилирование соединения 21 бензоильньм ангидридом дает соединение 22, 3- и 5'і-гидроксильньсе группь! которого защитили тетрагидропиранилом (ТНР) в ходе реакции соєдинения 22 с дигидропираном в присутствим. СО толуолсульфокислотьі! в дихлорметане. Полученное соединение 23 обработали водньім гидроксидом натрия и ю получили соединение 24, которое, реагируя с метил йодидом в присутствии гидроксида натрия при 0"С, дало 4-С-метоксиметилтимидиновое производное, соединение 25. Удаление протекторньїх групп ТНР соединения 25 «І дало соединение 26, 4-С-метоксиметилтимидин. В некоторьхх реакциях вместо протекторной группьі ТНР желательно использовать группу ТВОМ5, так как присутствие группьі ТНР оприводит к образованию диастереомеров. Таким образом, обработка осоединения 22 трет-бутилдиметилхлорсиланом дает « 3,5-О-(бис-ТВОМ5)-производное тимидина, соединение 27. Удаление бензоила при помощи зтилендиамина при 50"С, дало соединение 28, которое, реагируя, с трифторметансульфоновьимм ангидридом и пиридином в - с дихлорметане, дает трифлат (ІгШа(е), соединение 29. Реакция соединения 29 с аммиаком в диоксане дала и 4-С-аминометилтимидиновое производное, соединение 30. Реакция соединения 29 с азидом натрия в -» М,М-диметилформамиде дала 4-С-азидометилтимидиновое производноеєе, соединение 31. Удаление протекторньїх групп ТВОМ5 соединений 30 и 31 дало соединения 32 и 33, 4-С-аминометилтимидин и 4-С-азидометилтимидин, соответственно. Аминогруппу соединения 33 защитили трифторацетилом и получили ве соединение 34. Реакции соединений 32 и 34 с диметокситритилхлоридом в пиридине дали соединения 35 и 36, с соответственно. Соединения 35 и 36 преобразовали в соответствующие фосфорамитидь!, соединения 37 и 38, соответственно, посредством обработки 2-цианзтил-М,М-диизопропилхлорфосфорамидитом. і Реакции соединения 29 с реактивами Гриньяра (Огідпага) дают 4-С-алкилтимидинь и

Ф 20 4-С-алкенилтимидинь!. Гидроборирование или окислительное расщепление полученньх 4-С-(о-алкенил)-тимидинов дает гидроксиалкилтимидиньі, гидроксил которьїх можно преобразовать в ряд їз функциональньїх групп, таких как МН», ОК, ЗК, ЗН и Х, где К - зто Н или алкил, а Х - зто НЕ, СІ, Вг, І, Ов.

Реакции соединения 29 с зтоксикарбонилалкилцинковьми реагентами дают 4-С-зтоксикарбонилалкилтимидиньі, которье можно гидролизовать в 4"-С-карбоксиалкилтимидиньі. Реакции 52 соединения 29 с алкоксидами натрия дают 4-С-алкоксиметилтимидиньї. Для приготовления 4"-С-(замещенньй

ГФ) алкоксиметил)тимидинов можно использовать спирть! и феноль! с замещениями. В числе заместителей могут бьть МО», СМ, СООБЇ ОАс или защищеннье аминогруппь». В готовьїх 4-С-разветвленньїх тимидинах о 5-гидроксильньье группьї защищают диметокситритилом, а З-гидроксильнье группьі преобразуют в фосфорамидить! для синтеза олигонуклеотидов, которьій проводят в соответствии со стандартной процедурой 60 (Р. ЕсКевеїп, "ОЇїдописіеоїіде зупіпевіз" Охтога Опімегейу Ргезз (1991)).

Синтез 5-С-разветвленньїх нуклеозидов

Настоящее изобретение предусматривает процедурь! приготовления большого числа 5-С-разветвленньх нуклеозидов. Примерь! методик приготовления 5'-С-разветвленньїх тимидинов представлень! на схемах в, 1 и 8 (Фиг. 8, 9 и 10, соответственно). Зти процедурьї можно легко адаптировать для синтеза других нуклеозидов, бо соответствующих настоящему изобретению, в том числе для осуществления тех вариантов изобретения, в которьїх нуклеозидьі содержат основания, отличнье от тимина. Соединение 42 приготовили в три зтапа в соответствии с известной процедурой (0-Мапуд С., Ми, Н.у., Егазег-Зті(, Е.В., УМаїКег, К.А.М. Теїгапеадгоп

Ї енв, 1992, 33, 37 - 40). В соответствии с другой процедурой соединение 42 получили в результате реакции 8090 уксусной кислотьі с соединением 41, 3,5-О-(бис-трет-бутилдиметилсилил)-тимидином, приготовленньм при помощи реакции тимидина с избьттком трет-бутилдиметилхлорсилана и имидазола в пиридине Реакция Виттига между соединением 42 и илидом фосфора, приготовленньім из метилтрифенилфосфония бромида и гидрида натрия в диметилсульфоксиде (ДМСО), дала олефиновое производное, соединение 43. Зпоксидирование соединения 43 т-хлорпероксибензольной кислотой в дихлорметане дало 5-(5)-зпоксидное производное, 7/0 соединение 44 (основной продукт) и 5-(К)-зпоксидное производное (примесь). Стереохимические свойства соединения 44 и других представлень на диаграмме 1 (Фиг. 12). Реакция соединения 44 с аммиаком в метаноле дала 5-(5)-С-аминометилтимидин, которьій защитили трифторацетилом и получили соединение 46. Реакция соединения 44 с цианидом калия в М,М- зиметилформамиде дала 5-(5)-С-цианметилтимидин, соединение 47. 5-г-гидроксильнье группьі соединений 45-47 защитили диметокситритилом при помощи реакций с 75 диметокситритилхлоридом и трифторметансульфонатом серебра в пиридине. Получили соединения 48-50, соответственно. Группьї ТВОМ5 соединений 48-50удалили при помощи ТВАЕ в тетрагидрофуране и получили соединения 51 - 53, соответственно. Соединения 51 - 53 преобразовали в соответствующие фосфорамидить, соединения 54 - 56, соответственно. Реакция Гриньяра между соединением 42 и аллилбромидом магния дала смесь изомерньх 5'-(К)-(С)-аллилтимидиновьїх и 5'-(5)-С-аллилтимидиновьїх производньїхх, соединений 57 и 58, Ккоторье бьіли разделеньі посредством хроматографии на силикагеле. Группьі ТВОМО5 соединений 57 и 58 удалили путем обработки ТВАЕ в тетрагидрофуране и получили 5-(К)- и 5-(5)-С-аллилтимидиньї, соединения 59 и 60, соответственно. Соединения 59 - 60 преобразовали в соответствующие фосфорамидить, соединения 61 - 62, соответственно. Подобньім образом, реакции соединения 42 с различньіми реактивами Гриньяра дают различньсе 5-(5 или К)-С-алкилтимидинь и 5-(5 или К)-С-алкенилтимидинь. Га

Гидроборированиє или окислительное расщепление полученньїх 5-С-(соалкенил)-тимидинов дает гидроксиалкилтимидинь, гидроксил которьїх можно преобразовать в различнье функциональньсе группь, такие о как МН», ОК, ЗК, ЗН и Х, где К - зто Н или алкил, а Х - зто Р, СІ, Вг, І, Ої85. Реакции соединения 44 с разнообразньми нуклеофильньіми реагентами дают цельїй ряд 5'-С-разветвленньїх тимидиновьїх производньх.

Так, реакции соединения 44 со спиртами в присутствий основания дают 5-С-алюксиметилтимидиньі. Для сі приготовления 5-С-(замещенньй алкокси)--имидинов можно использовать спиртьі с замещениями. В неисчерпьвающий перечень заместителей входят МО 5», СМ, СООЕЇ и защищеннье аминогруппьі. Реакции іш соединения 44 с двухатомньми спиртами дают 5-С-гидроксиалкоксиметилтимидиньі, которье можно легко со преобразовать в 5'-С-галогеналкилтимидиньі. Реакция соединения 44 с нитрометаном дает 5-С-нитрозтил тимидин. Восстановление 5-С-нитроалкилтимидинов дает 5-С-аминоалкилтимидинь!ї. Реакции соединения 44 с о цианалкилкадмиевьіми реагентами дает 5-С-цианалкил тимидинь. Реакции соединения 44 с «І зтоксикарбонилалкилцинковьіми реагентами дают о 5-С-зтоксикарбонилалкилтимидинь!, которье легко гидролизуются в 5'-С-карбоксиалкилтимидиньії в щелочньїх условиях. Все преобразования, вьіполняемье с 5-(5)-изомерами, возможнь и для 5-(К)-изомеров. И, наконец, реакции 5-С-разветвленньїх тимидинов с « диметокситритил хлоридом и трифлатом серебра в пиридине дают 5-О-ЮОМТт-5'--С-разветвленнье тимидинь, которне преобразуют в соответствующие фосфорамидитьї при помощи стандартной процедурь (БЕ. Есквівїй, й с "ОіідописіІеоїіде зупіпевзів", Охіога Опімегейу Ргезз (1991)). Для определения конфигурации в позиции С ц 5-С-разветвленньїх тимидинов использовали увеличение МОЕ пространственно замкнутьїх протонов. Поскольку "» жесткая ориентация заместителей в позициий С5 очень важна для зкспериментов с МОЕ, в тимидиновье производнье между 3-О- и 5-О-ввели кольцо ТІРОЗ (схема 8, Фиг. 11), где 5'-протоньі ориентировань! либо по направлению к 3'--протонам, либо от них. Когда 3'-протоньі насьіщеньії, можно легко пронаблюдать наличие или ьч отсутствие увеличения МОЄ б5-протонов (диаграмма 1, Фиг. 12). Для 5-С-аллилтимидинов изомер с увеличением МОЕ на 4,895 - зто определенно 5-(К)-изомер, а другой, без увеличения МОЕ, - 5-(5)-изомер. Без о помощи рентгеновской кристаллографии непосредственное определение стереохимии 5'-зпоксидной группь! 9) затруднительно. Однако, преобразование зпоксидов в продукть! размькания колец не изменяет хиральность в позиции С5. Если стереохимия одной парьі таких продуктов размькания кольца определена, то можно

Ф определить и стереохимию зпоксидной парь. Так, аналогично 5-С-аллилтимидинам, из зпоксидов бьла з приготовлена пара продуктов размькания кольца, 5-С-дцианметилтимидинов, и преобразована в продукть! с

ТІРОЗ-кольцами. При насьщенном состоянии З'і-протонов один из изомеров продемонстрировал увеличение

МОЕ на 6,395. Следовательно, зто 5-(К)-изомер, а другой 5-(5)-изомер.

Синтез 1-С-разветвленньїх нуклеозидов

Ммеются сообщения о ряде 1-С-разветвленньїх нуклеозидов (а) Шіела, М., Спеп, -К., Тиоїі, У.Г.0.,

Ф, Оезсоїез, (0., Репеї, В., ОгоцШег, А. Тейанпедгоп, 1993, 49, 8579 - 8588; Б). Агпауем, А., бСоигаєм, А., ко Номіпеп, 9., А2пауема, Е., Гоппрего, Н. Тейгапедгоп І ейв5. 1993, 34, 6435 - 6438). Настоящим изобретением предусмотрень! процедурь! приготовления большого числа 1"-С-разветвленньїх нуклеозидов. Приготовление 60 1-С-разветвленньїх нуклеозидов проиллюстрировано схемами 9 и 10 (Фиг. 13 и 14, соответственно).

Соединение 63 получают в соответствии с известной процедурой (Шелга, М., Спеп, О-К., Тиої, 9У.Г.0., ЮОезсоїез, б., Репеї, В., СгоціШег, А. Тейапейдгтоп, 1993, 49, 8579 - 8588). 5-С-гидроксильную группу соединения 63 защищают диметокситритилом и получают соединение 64, которое обрабатьвают трет-бутилдиметилхлорсиланом и получают соединение 65. 65 Обработка соединения 65 трет-бутилдиметилсилоксиметил хлоридом дает соединение 66. Обработка соединения 66 тризтоксиаллюмогидридом лития в зфире дает альдегид, соединение 67. Восстановление соединения 67 боргидридом натрия с последующей обработкой трифторметансульфоновьм ангидридом дает трифлатное производное, соединение 68. Обработка соединения 68 различньмми нуклеофильньми реагентами дает цельй ряд новьїх 1-С-разветвленньїх тимидинов, соединений 69. Так, обработка соединения 68 цианидом, вт нитритом или азидом натрия дает соответствующие 1-С-цианметил-, 1-С-нитрометил- и 1-С-азидометилтимидиньі, соответственно. Обработка соединения 68 нитрометаном дает 1"-С-нитрозтил тимидин. Обработка соединения 68 алкоксидом натрия дает 1-С-алкоксиметил тимидин. Обработка соединения 68 литий-медь-органическими реагентами дает 1-С-алкил- и 1"-С-алкенилтимидинь». Для приготовления 1-С-(замещенньй алкил)- и 1-С-(замещенньй алкенил)-тимидинов можно использовать алкил- или /о алкенилцинковьіе или кадмиевье реагентьі с замещениями. В числе заместителей могут бьіть СООБЕЇ, СМ,

МО». Гидроборирование или окислительное расщепление полученньїх 1'-С-(5-алкенил)утимидинов дает гидроксиалкилтимидинь, гидроксил которьїх можно преобразовать в различнье функциональньсе группь, такие как МН», ОК, ЗК, ЗН и Х, где К - зто Н или алкил, а Х - зто РЕ, СІ, ВГ, І, Ої85. Для приготовления 1-С-алкоксиметил- и 1-С-феноксиметилтимидинов можно использовать спиртьї и феноль! с замещениями. В 75 чИисле заместителей могут бьіть МО», СМ, СООЕЇ или Оас. 1-С-нитроалкилтимидиньї можно восстановить до соответствующих аминоалкилтимидинов. Соединение 69 обрабатьвают ТВАБЕ и получают незащищеннье соединения 70, которне преобразуют в соответствующие фосфорамидить, соединения 71.

Соединение 63 полностью защищают р-метоксибензилом (МРМ) и получают соединение 72. Гидролиз соединения 72 в присутствий перекиси водорода и основания дает соединение 73, которое подвергают го перегруппировке Гофмана и получают амин, которьій при помощи метилбромида можно преобразовать в четвертичное производное аммония, соединение 74. Триметиламин можно заменить различньми нуклеофилами. Обработка соединения 74 алкоксидом натрия дает 1'-С-алюкситимидиньі. Обработка соединения 74 натрия алкилсульфидом дает 1-С-алкилтиотимидиньі. При нагреваний с бромидом натрия соединение 74 преобразуется 1-С-бромтимидин, которьй обрабатьввают азидом натрия, нитритом натрия или с

Ннитрометаном и получают соответствующие 1"-С-замещеннье тимидиньі. Соединения 75 обрабатьввают церия аммония нитратом и получают незащищеннье соединения 76. 5і-гидроксил защищают диметокситритилом, а о полученньсе продукть!ї, соединения 77, преобразуют в соответствующие фосфорамидить, соединения 78.

Недавно появились сообщения об олигонуклеотидах, содержащих нуклеозидьї с модифицированньіми Га сахарами (А. догдепвеп, Р.М., зівіп, Р.С., МУепдеї, У. У. Ат. Спет. Зос. 1994, 116, 2231; В. ГРепвпоїаі, 5.,

Тигапе, Н., УУепдеї, 9. Темапедгоп Іейв5. 1995, 36, 2535; С. Тигапе, Н., Репзпоїді, 9., Кедпег, М., УУепадеї, ікс,

У. Теймгапедгоп, 1995, 51, 10389; 0. Зана, А.К., СацШеїа, Т.9У., Норр5, С., Орзоп, О.А., УУауспипав, С., со

Уамжмтап, А.М. У. Огд. Спет. 1995, 60, 788; Е. Агпауем, А., боцйгаєем, А., Номіпеп, у)., Аг2гпауема, Е., І оппрега,

Н. Теїгапедгоп Гей. 1993, 34, 6435 - 6438; Р. Опо, А., Оап, А., Маївида, А. Віосопідаге Спетізігу, 1993, 4, юю 499 - 508; б. Іпоце, Н., Науазе, У., Ітига, А., Ммаї), 5., Міша, К., Опівика, Е., Мисієїс Асідз Кев. 1987, «І 15, 6131; Н. Гезпік, Е.А., Сціпозво, С.3)., Камжазакі, А.М., Зазтог, Н., 7оцпез, М., Суттіпе, Ї.Ї., ЕсКег О..,

СоокК, Р.О., апа Егеїіег, 5.М. Віоспетізігу, 1993, 32, 7832). Настоящее изобретение обеспечиваєет создание большого числа новьїх нуклеозидов с модифицированньми сахарами, которье легко можно включить в олигонуклеотидьі при помощи фосфорамидитной химии. Олигонуклеотидьії с модифицированньми сахарами « содержат хотя бь по одному нуклеозиду с модифицированньм сахаром, предложенному настоящим 8 с изобретением; они могут содержать последовательность из нескольких нуклеозидов с модифицированньми й сахарами или только нуклеозидьії с модифицированньми сахарами, предложеннье настоящим изобретением. "» Олигонуклеотидьії с модифицированньми сахарами могут содержать и другие модификации, например, в скелетах, в основаниях и другие модификации в сахарах. Очевидно, что разветвленнье заместители в позициях

СУ или С5 нуклеозидов снижают скорость соединения в зависимости от своего размера. Позтому периодь ї» соединения нуклеотидов с некоторьіми громоздкими заместителями бьли продлень». Так, при синтезе 5-С-разветвленньїх олигонуклеотидов и 4-С-разветвленньїх олигонуклеотидов на соединение отводили 2 - 5 іні минут. При синтезе 3-С-разветвленньїх олигонуклеотидов на соединение отводили 45 (З х 15) минут. Повторнье г) соединения со свежими реагентами необходимь! только при синтезе 3-С-разветвленньїх олигонуклеотидов, так 5р Как З-гидроксил является третичньм. Состав очищенньїх олигонуклеотидов с модифицированньми сахарами б проверяли посредством анализа продуктов их переваривания ферментами. з Примерь!

Изобретение, описанное вьше, станет более понятньмм при обращениий к нижеследующим примерам.

Примерьї иллюстрируют настоящее изобретение, но не ограничивают его обьем.

Пример 1

Приготовление іФ) 5-0-(4,4-диметокситритил)-3'--р-тосилоксиметилтимидина ко Раствор /5-0-(4,4-диметокситритил)-3-гидроксиметилтимидина (2,12г, З,бОммоль) приготовили в соответствии с известньмм способом (догдепзеп, Р.М., Тигапе, Н., МУепдеї, У. У. Ат. Спет. Зос. 1994, 116, 6во 2231). Р-толуолсульфонил хлорид (1,76г, 9,2Зммоль), ОМАР (0,180у, 1,4Зммоль) в безводном пиридине перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Реакционную смесь охладили до 0"С, разбавили

ЕЮАс (500мл), промьіли 1095 раствором МансСо», внісушили над Ма»ЗО) и сконцентрировали. Сьірой продукт очистили посредством хроматографии на силикагеле (590 СНЗзОН в СНоСІ») Получили 2,39г (8995) 5-0-(4,4-диметокситритил)-3'-р-тосилоксиметилтимидина в виде бесцветного порошка. 65 Пример 2

Приготовление

5-0-(4,4-диметокситритил)-3-С-цдцианметилтимидина

Суспензию 5-0-(4,4"-диметокситритил)-3 --р-толуолсульфонилоксиметилтимидина (0,50г, 0,68бммоль) и цианида калия (0,134г, 2,0бммоль) в безводном М,М- диметилформамиде (ОМЕ) (7мл) перемешивали при

Комнатной температуре в течение ночи. Реакционную смесь разбавили Е(Ас (бОмл) и промьли водой (З х 75мл), затем 1095 раствором Мансо» (З х 75мл). Органический слой вьісушили над Ма»5О), сконцентрировали, очистили посредством хроматографии на силикагеле (Е(ОАс-гексан, 1:11) и ополучили 0,386бг (97965) 5-0-(4,4-диметокситритил)-3--С-цианметилтимидина в виде бесцветного порошка.

Пример З 70 Приготовление 5-0-(4,4-диметокситритил)-3-С-азидометилтимидина

Суспензию 5-0-(4,4"-диметокситритил)-3'-р-толуол-сульфонилоксиметилтимидина (0,40г, О,55ммоль) и Мама (011г, 1,бммоль) в безводном М,М-биметилформамиде (Змл), нагревали до 50"С в течение 3 дней.

Реакционную смесь охладили до комнатной температурьї, разбавили ЕЮАс (ЗОмл) и промьілли водой (З х 4О0мл), 75 затем 1095 раствором МансСО»з (3 х 40мл). Органический слой вьісушили над Ма»5О), сконцентрировали, очистили посредством хроматографии на силикагеле (Е(ОАс-гексан, 1:1) и получили 0,3Ог (92965) 5-0-(4,4-диметокситритил)-3-С-азидометилтимидина в виде бесцветного порошка.

Пример 4

Приготовление 5-0О-(4,4"-диметокситритил)-3-С-цианметилтимидин 3-(2-цианзтил-М,М-диизопропилфосфорамидита)

К перемешиваемому раствору 5-0-(4,4'-диметокситритил)-3-С-цианметилтимидина (0,20г, 0,344ммоль) и диизопропилотиламина (0,24мл, 1,38ммоль) в безводном дихлорметане (Змл) при 0"С в атмосфере аргона добавили по каплям раствор 2'-цианзтил-М,М- виизопропилхлорфосфорамидита (17Омг, 0,715ммоль) в дихлорметане. Полученную реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов, СМ охладили до 0"С, разбавили холодньм СН»оСі» (20мл), промьіли холодньім Мансо» (3 х 40Омл). Органический о слой вьісушили над Ма»зО), сконцентрировали. Остаток очистили посредством хроматографии на силикагеле (ЕБМ-ЕЮФАс-СНОоОСІ», 05:50:45). Получили 177мг (6695) 5-0-(4,4'-диметокситритил)-3-С-цианметилтимидин 3-(2-цианзтил-М,М-диизопропилфосфорамидита) в виде пень.

Пример 5 Ге

Приготовление 5-0-(4,4"-диметокситритил)-3-С-азидометилтимидин 3-(2-цианзтил-М,М-диизопропилфосфорамидита) ї-о

К перемешиваемому раствору 5-0-(4,4"-диметокситритил)-3-С-азидометилтимидина (252мг, 0,344ммольз и «У диизопропилотиламина (0,44мл, 2,51ммоль) в безводном дихлорметане (Змл) при 0"С в атмосфере аргона добавили по каплям раствор 2'-цианзтил-М,М-диизопропилхлорфосфорамидит (296бмг, 1,25ммоль) в о дихлорметане. Полученную реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов, «Ж охладили до 0"С, разбавили в холодном СНоСі» (20мл) и промьіли холодньім МансСо» (З х 15мл). Органический слой вьісушили над Ма»ЗО»4, сконцентрировали. Остаток очистили посредством хроматографии на силикагеле (ЕБМ-ЕЮФАс-СНОоОСІ», 05:50:45). Получили 128мг (3895) 5-0-(4,4"-диметокситритил)-3-С-азидометилтимидин « 3-(2-азидометил-М,М-диизопропилфосфорамида) в виде пень.

Пример 6 - с Приготовление 5-0-(4,4-диметокситритил)-3'-С-метилентимидина а К суспензии Ман (6095 в минеральном масле, 0,18г; 7,5ммоль) в безводном тетрагидрофуране (18мл) при "» ес в атмосфере аргона добавили по каплям раствор 5-0-(4,4-диметокситритил)-3'--р-толуолсульфонилоксиметилтимидина (1,5г, 2,0бммоль) в тетрагидрофуране (1О0мл). Полученную реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов,

Її охладили до 0"С и погасили при помощи водьі. Смесь разбавили ЕЮдАс (250мл), промьіли водой (2 х 200мл), сл затем 1095 раствором МансСоО»з (2 х 200мл), вьісушили над Ма»5О) и сконцентрировали. Остаток очистили посредством хроматографии на силикагеле (596 СНзОНнН ов СНоОСІ»). Получили 0,97г (85965)

Ге) 5-0-(4,4-диметокситритил)-3-С-метилентимидина в виде пень. бо 50 Пример 7

Приготовление 5-0-(4,4"-диметокситритил)-3-С-метилтимидина що) К перемешиваемой суспензии алюмогидрида лития (58мг; 1,53ммоль) в безводном тетрагидрофуране (10мл) при 07С в атмосфере аргона добавили по каплям раствор 5'-0-(4,4"-диметокситритил)-3-С,О-метилентимидина (385мг, 0,692ммоль) в тетрагидрофуране (1Омл). Реакционную смесь перемешивали при 0"С в течение 1 часа, и реакцию погасили, медленно добавляя 1095 раствор Мансо 3. Полученную смесь разбавили ЕЮАс (ЗОмл), промьли МансСоО»з (3 х 20мл), вьісушили над Ма»зО) и сконцентрировали. Остаток очистили посредством о хроматографийи на силикагеле (590 СснНзон в СНО»). Получили ЗОбмг (7990) ко 5-0-(4,4-диметокситритил)-3-С-метилтимидина в виде пень.

Пример 8 60 Приготовление 5-0-(4,4"-диметокситритил)-3-С-метилтимидин 3-(2-цианзтил-М,М-диизопропилфосфорамидита)

К перемешиваемому раствору 5-0-(4,4"-диметокситритил)-3-С-метилтимидина (98мг, 0,17ммоль) и диизопропилотиламина (0,1Змл, 0,742ммоль) в безводном дихлорметане (2мл) при 0"С в атмосфере аргона добавляли по каплям раствор 2'-цианзтил-М,М- биизопропилхлорфосфорамидита (85мг, 0,Збммоль) в 65 дихлорметане. Полученную реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа, охладили до 0"С, разбавили холодньім СНоСі» (20мл), промьіли холодньім Мансо» (3 х 15мл). Органический слой вьісушили над Ма»зО), сконцентрировали. Остаток очистили посредством хроматографии на силикагеле (ЕамМ-ЕФАс-гексан о 5:50:45). Получили 117мг (88965) 5-0-(4,4-диметокситритил)-3-С-метилтимидин 3-(2-цианзтил-М,М-диизопропилфосфорамидита) в виде пень.

Пример 9

Приготовление 5-0-(4,4"-диметокситритил)-3-С-аминометилтимидина

К раствору 5-0-(4,4"-диметокситритил)-3-С,О-метилентимидина (901мг, 1,62МммМоль) в метаноле (Змл) добавили насьщенньій раствор аммиака в метаноле (9мл), и полученньій раствор вьідержали при комнатной температуре в течение З дней. МИзбьток аммиака и метанола вьшарили, и остаток очистили посредством 7/0 хроматографии (СНЗзОН-гексан-СНСЇІз 1:1:8). Получили 414мг (4596) 5-0-(4,4-диметокситритил)-3-С-аминометилтимидина в виде бесцветного твердого вещества.

Пример 10

Приготовление 5-0-(4,4"-диметокситритил)-3-С-трифторацетамидометилтимидина

Раствор 5-0-(4,4-диметокситритил)-3-С-аминометилтимидина (З361мг, 0О,628ммоль) и 7/5 Зтилтиотрифторацетата (490мг, 3,12мМмоль) в безводном тетрагидрофуране (бмл) перемешивали при комнатной температуре в течение 6 часов. Растворитель вьіпарили, и остаток очистили посредством хроматографии на силикагеле (590 снзОон в СНеСІ»). Получили 411мг (9890) 5-0-(4,4-диметокситритил)-3-С-трифторацетамидометилтимидина в виде бесцветного порошка.

Пример 11

Приготовление 5-0-(4,4"-диметокситритил)-3-С-трифторацетамидометил-тимидин 3-(2-цианзтил-М,М-диизопропилфосфорамидита)

К перемешиваемому раствору 5-0-(4,4"-диметокситритил)-3-С-метилтимидина (411мг, 0,614ммоль) и диизопропилотиламина (0,64мл, 3,65ммоль) в безводном дихлорметане (бмл) при 0"С в атмосфере аргона добавили по каплям раствор 2--цианзтил-М,М-диизопропилхлорфосфорамидит (410Омг, 1,83ммоль) в безводном сч дихлорметане. Полученную реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов, охладили до 0"С, разбавили холодньім СНоСі» (ЗОмл), промьіли холодньім Мансо» (3 х 20мл). Органический і) слой вьісушили над Ма»5ЗОу4 и сконцентрировали. Остаток очистили посредством хроматографии на силикагеле (ЕБМ-ЕЮАс-СНеЇ з, 5:30:65). Получили зЗабмг (7290) 5-0-(4,4-диметокситритил)-3-С-трифторацетамидометил-тимидин с зо З-(2-цианзтил-М,М-диизопропилфосфорамидита) в виде порошка.

Пример 12 ісе)

Приготовление 3-0-(4,4"-диметокситритил)-5'формилтимидина с

К перемешиваемому холодному раствору 3-0-(4,4"-диметокситритил)-тимидина (полученному из тимидина обьІчньмМ способом, дО, аг, 0,072ммоль) в безводном дМосо (0М590) добавили раствор Щео, дициклогексилкарбодиимида (ОСС) (45,86г, 0,224мол) в ДМСО (180мл). Полученньїй раствор перемешивали при «Е 5"С в течение 5 минут, добавили пиридин (2,94г, З,Омл, 0,0371ммоль) и после перемешивания в течение следующих 5 минут по каплям добавили раствор трифторуксусной кислоть (2,11г, 1,4Змл, 0,0185мол) в ДМСО (2мл). Полученную реакционную смесь перемешивали при 5"С в течение 1Оминут и при комнатной температуре в течение 6 часов. Воду (20мл) добавили по каплям при охлаждении, и смесь перемешивали при комнатной « температуре в течение 1 часа. Осадки отфильтровали и промьіли ДМСО. Обьединенньй раствор ДМСО вьілили пт) с на дробленьій лед (4л) при перемешивании. Осадки вьідержали в течение часа, отфильтровали и обильно промьіли водой. Фильтровальньйй осадок растворили в метиленхлориде (5 ООмл), органический слой отделили, ;» вьісушили над Ма»5О); и сконцентрировали. Сьрой остаток очистили посредством хроматографии на силикагеле (390 метанола в метиленхлориде). Получили 32,6бг (8196) 45. 3-О-(4,4-диметокситритил)-5'і-формилтимидина в виде бесцветного порошка. їх Пример 13

Приготовление 3-0-(4,4"-диметокситритил)-4-С-гидроксиметилтимидина о К перемешиваемому раствору 3-0-(4,4-диметокситритил)-50-формилтимидина (16,3г, З0О,07ммоль) в

Га диоксане (120мл) при 0"С добавили по каплям, по очереди, 3696 формальдегида (24мл) и 2М Маон (бомл). Полученньій раствор перемешивали при комнатной температуре в течение б часов. Реакционную смесь

Ме охладили до 0"С, и по каплям добавляли 1095 раствор уксусной кислоть! в воде, пока не довели рН до 7,5. з Смесь разбавили зтилацетатом (Тл), промьіли 1095 соляньім раствором (500мл, затем 2 х ЗбОмл), вьісушили (Ма»5О)) и сконцентрировали. Сьрой оостаток очистили посредством хроматографии на силикагеле (ЕФАс-гексан, 3:1). Получили 11,45г (66,390). 3-0-(4,4'-диметокситритил)-4-С-гидроксиметилтимидина в виде бесцветного порошка.

Пример 14 (Ф) Приготовление 4-С-гидроксиметилтимидина ка Раствор 3-0-(4,4"-диметокситритил)-4-С-гидроксиметилтимидина (6,32г, 11,0ммоль) в 8095 водном растворе уксусной кислоть! (5О0мл) вьідержали при комнатной температуре в течение 4 часов. Растворители удалили при бо пониженном давлении, и добавили воду (200мл). Полученную непрозрачную смесь промьіли зфиром (З х 8Омл), и воду вьіпарили. Остаток растворили в метаноле и толуоле, и полученньій раствор сконцентрировали. Зтот процесс повторили дваждь. 4-С-гидроксиметилтимидин (2,72г, 91965) получили в виде пень.

Пример 15

Приготовление 4"-С-бензоилоксиметилтимидина 65 К перемешиваемому раствору 4-С-гидроксиметилтимидина (3,72г, 13,67ммоль) в безводном пиридине (1Омл) при комнатной температуре добавили раствор бензангидрида (4,64г, 5іммоль) в пиридине (1Омл).

Полученньій раствор вьідержали при 0"С в течение 1 часа и затем при комнатной температуре в течение 20 часов. Добавили воду (5мл) при 0"С, вніпарили пиридин, и остаток подвергли хроматографии на силикагеле (790 зтанол в хлороформе). Получили 2,27г (4495) 4 "С-бензоилоксиметилтимидина в виде бесцветного твердого вещества.

Пример 16

Приготовление 3',5'-0-(бис-тетрагидропиранил)-4-С-гидроксиметилтимидина

К перемешиваемому раствору 4-С-бензоилоксиметилтимидина (1,65г, 4,39ммоль) и р-толуолсульфокислоть! (5БОмг) в безводном метиленхлориде (7/Омл) при 0"С по каплям добавили дигидропиран (1,84г, 1,89мл, 7/0. 21,80ммоль). Полученньій раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. 2М Маон (2О0мл) добавили при охлаждении. Для удаления метиленхлорида полученную смесь сконцентрировали, и добавили диоксан (1Омл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 часов и зкстрагировали метиленхлоридом (3 х ЗОмл). Органический слой промьіли водой (3 х Б5Омл), вьісушили (Ма»5ЗО)) и сконцентрировали. Остаток очистили посредством фильтрации на колонке с силикагелем. Получили 75. 1,50г (77790) 35-О-(бис-тетрагидропиранил)-4-С-гидроксиметилтимидина в виде пень.

Пример 17

Приготовление 4-С-метоксиметилтимидина

К перемешиваеємому раствору /35'-О-(бис-тетрагидропиранил)-42-С-гидроксиметилтимидина (6ббомг, 1,5ммоль) и гидрида натрия (60956 в минеральном масле, 180мг, 4,5ммоль) в безводном тетрагидрофуране (15мл) при 0'С по каплям добавили йодид метила (1,06г, 0,4бмл). Полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1,5 часов. По каплям добавили воду (мл) при 0"С, и довели рН до 7 при помощи уксусной кислоть. Смесь разбавили зтилацетатом (5Омл), промьіли водой (3 х ЗОмл), вьісушили (Ма»5О)) и сконцентрировали. Остаток растворили в кислой смеси (бБмл тетрагидрофурана (ТНЕ), 1Омл

СНЗСООН и 5мл водьї)), раствор вьідержали при 50"С в течение З часов, растворители вьіпарили, остаток сч г растворили в смеси метанол-толуол, сконцентрировали и все повторили еще раз. Очистили посредством хроматографии на силикагеле (1095 зтанол в хлороформе). Получили 271 мг (63965) 4-С-метоксиметилтимидина і) в виде бесцветного твердого вещества.

Пример 18

Приготовление 5-0-(4,4"-диметокситритил)-4-С-метоксиметилтимидина с зо Раствор 4-С-метоксиметилтимидина (17Змг, О,бммоль) и диметокситритилхлорида (287мг, 0,84ммоль) в пиридине вьідержали при комнатной температуре в течение 5 часов. Пиридин вьіпарили, и остаток очистили ікс, посредством хроматографии на силикагеле (ЕоАс-гексан, 2:1). Получили 264мМг (74960) «9 5-0-(4,4-диметокситритил)-4-С-метоксиметилтимидина в виде пень.

Пример 19 о

Приготовление 5-0-(4,4"-диметокситритил)-4-С-метоксиметилтимидин «Е 3-(2-цианзтил-М,М-диизопропилфосфорамидита)

К перемешиваемому раствору 5-0-(4,4"-диметокситритил)-4-С-метоксиметилтимидина (20Омг, 0,34ммоль) и диизопропилотиламина (17бмг, 23бмкл, 1,3бммоль) в безводном метиленхлориде (Змл) при 0"С в атмосфере азота добавили по каплям раствор 2'-цианзтил-М,М- Зиизопропилхлорфосфорамидита (161мг, 152мкл, « 0,бдммоль) в метиленхлориде (мл). Полученную реакционную смесь перемешивали при комнатной с температуре в течение 30 минут, охладили до 0"С, разбавили зтилацетатом (ЗОмл). Смесь промьіли 1090 й раствором МанНсСо»з (3 х 20мл), вьісушили (Ма»5О)) и сконцентрировали. Остаток очистили посредством «» хроматографии на силикагеле (ЕБМ-Е(ОоАс-гексан, 5:45:50). Получили 190мг (71960) 5-0-(4,4-диметокситритил)-4-С-метоксиметилтимидин 3'-(2-цианзтил-М,М-диизопропилфосфорамидита) в виде пеньі. «їз» Пример 20

Приготовление 3,5(бис-трет-бутилдиметилсилил)-4-С-гидроксиметилтимидина іні К холодному перемешиваемому раствору 4-С-бензоилметилтимидина (1,14г, З, 0Зммоль) и имидазола

Ге) (985мМг, 15,15ммоль) в пиридине добавили раствор трет-бутилдиметилхлорсилана (1,37г, 9,09ммоль) в пиридине. Реакцию вьідержали при 507С в течение ночи, разбавили зтилацетатом (100мл), промьіли водой (Зх

Фо Б5Омл), сконцентрировали. Остаток растворили в зтаноле (1Омл), и добавили смесь зтилендиамина и зтанола з (111, 20мл). Раствор нагревали до 50"С в течение 2 дней. Зтанол и зтилендиамин вьіпарили при пониженном давлений, и остаток растворили в хлороформе (бОмл). Раствор промьіли водой (З х 40мл), вьісушили (М32804) и сконцентрировали. Остаток очистили посредством хроматографии на силикагеле (ЕЮАс-гексан, 1:1). Получили 5Б 78Омг (5290) 3,5'(бис-трет-бутилдиметилсилил)-42-С-гидроксиметилтимидина в виде белого твердого вещества.

Пример 21 іФ) Приготовление 3',5(бис-трет-бутилдиметилсилил)-4-С-аминометилтимидина ко К перемешиваемому раствору 3,5-(бис-трет-бутилдиметилсилил)-4-С-гидроксиметилтимидина (50Омг, 1Тммоль) и пиридина (О04мл) в безводном метиленхлориде (бмл) при 0"С добавили по каплям смесь во трифторметансульфонового ангидрида (564мг, 332мкл, 2,0ммоль) и пиридина (0,4мл) в метиленхлориде (5мл).

Полученную реакционную смесь перемешивали при 0"С в течение 30 минут, и добавили О,5мл 1095 раствора

Мансо»з при -10"С. Смесь разбавили метиленхлоридом (20мл), промьіли холодньмм 1096 МансСо»з (2 х ЗОмл), вьісушили (Ма»5ЗО)), сконцентрировали и сушили в вакууме в течение 1 часа. Сьірой остаток растворили в диоксане (ЗОмл) и подвергли сатурации газообразньм аммиаком. Раствор вьідержали при комнатной б5 температуре в течение ночи и затем держали нагретьм при 50"С в течение 2 дней. Избьток аммиака и диоксана вьіпарили, и остаток очистили посредством хроматографии на силикагеле (1956 МеоОН и 595 ЕїЗМ- в СНО»).

Получили 26бмг (53965) 3',5(бис-трет-бутилдиметилсилил)-4-С-аминометилтимидина в виде белого вещества.

Пример 22

Приготовление 3'5(бис-трет-бутилдиметилсилил)-4-С-трифторацетамидометилтимидина

Раствор 35'(бис-трет-бутилдиметилсилил)-4-С-аминометилтимидина (26Омг, 0О,52мМмоль) и зтилтиотрифторацетата (635мг, 0,52мл, 4,0ммоль) в диоксане перемешивали при комнатной температуре в течение 5 часов. Растворитель вьіпарили, и остаток очистили посредством хроматографии на силикагеле (590 метанола в хлороформе). Получили 220мМг (71960) 35'(бис-трет-бутилдиметилсилил)-4-С-трифторацетамидометилтимидина в виде белого твердого вещества. 70 Пример 23

Приготовление 4-С-трифторацетамидометилтимидина

Раствор 3'5-(бис-трет-бутилдиметилсилил)-4-С-трифторацетамидометилтимидина (215мг, 0О,З3бммоль) и

ТВАБЕ (1,0М в тетрагидрофуране, нейтрализованньй уксусной кислотой до рН - 7,5, 0,72мл) в тетрагидрофуране вьідерживали при комнатной температуре в течение 20 часов. Растворитель вьшпарили, и остаток очистили 7/5 посредством хроматографиий на силикагеле (1095 метанола в хлороформе). Получили 118мг (89905) 4-С-трифторацетамидометилтимидина в виде бесцветного твердого вещества.

Пример 24

Приготовление 5-0-(4,4"-диметокситритил)-4-С-трифторацетамидометилтимидина

Раствор «4-С-трифторацетамидометилтимидина (11Омг, О,Зммоль) и диметокситритилхлорида (152мг, О,45мМмоль) в безводном пиридине (2мл) вбідерживали при комнатной температуре в течение ночи. Пиридин вьіпарили, и остаток очистили посредством хроматографии на силикагеле (Е(Ас-гексан, 2:1). Получили 122мг (6195) 5-0-(4, 4-диметокситритил)-4-С-трифторацетамидометилтимидина в виде пень.

Пример 25

Приготовление 5-0-(4,4"-диметокситритил)-4-С-трифторацетамидометил-тимидин сч дво З-(2-цианзтил-М,М-диизопропилфосфорамидита)

К перемешиваемому раствору 5-0-(4,4"-диметокситритил)-4-С-трифторацетамидометил-тимидина (11Омг, і) 0,165ммоль) и диизопропилотиламина (129мг, 174мкл, 1,00ммоль) в безводном метиленхлориде (Змл) при ОС в атмосфере азота добавили по каплям раствор 2'-цианзтил-М,М-диизопропилхлорфосфорамидит (78мг, 74мкл,

О,ЗЗммоль) в метиленхлориде (1мл). Полученную реакционную смесь перемешивали при комнатной с зо температуре в течение ЗО минут, охладили до 0"С, разбавили зтилацетатом (2О0мл). Смесь промьіли 1095 раствором МанНсСоОз (3 х 15мл), вьісушили (Ма»5О4) и сконцентрировали. Остаток очистили посредством ісе) хроматографии на силикагеле (ЕБМ-Е(ОоАс-гексан, 5:45:50). Получили 137мг (8696) се 5-0-(4,4-диметокситритил)-4-С-трифторацетамидометил-тимидин 3-(2-цианзтил-М,М-диизопропилфосфорамидита) в виде пень. о

Пример 26 «Е

Приготовление 3',5'-О-(бис-трет-бутилдиметилсилил)-4-С-азидометилтимидина

К перемешиваемому раствору 35(бис-трет-бутилдиметилсилил)-4-С-гидроксиметилтимидина (0,95г,

О,19ммоль) и пиридина (0О,1мл) в безводном метиленхлориде (1мл) при 0"С добавили по каплям смесь трифторметансульфонового ангидрида (107мг, бЗ3мкл, 0,3в8ммоль) и пиридина (0,2мл) в метиленхлориде (2,5мМлЛ). «

Реакционную смесь перемешивали при 0"С в течение 30 минут, охладили до -107С, и добавили О,бмл 1095 ств) с раствора МансСоОз. Смесь разбавили холодньім метиленхлоридом (1Омл), промьіли холодньім 1095 раствором

Мансо» (2 х 10мл), вьісушили (Ма»5О)), сконцентрировали и сушили в вакууме в течение 1Оминут. Сьрой ;» остаток растворили в безводном М,М-5иметилформамиде (тмл), и добавили азид натрия (5Омг). Раствор держали нагретьмми при 50"С в течение 14 часов, разбавили зтилацетатом (20мл), промьіли водой (2 х 1Омл),

Вьісушили (Ма»ЗО)) и сконцентрировали. Остаток очистили посредством хроматографии на силикагеле (1095 «їз» зтилацетат в метиленхлориде). Получили 42мг 35'-О-(бис-трет-бутилдиметилсилил)-4-С-азидометилтимидина в виде пень. іні Пример 27

Ге) Приготовление 4"-С-азидометилтимидина

Раствор /35-О-(бис-трет-бутилдиметилсилил)-4-С-азидометилтимидина (25мг) и ТВАБ (10М в

Фо тетрагидрофуране, О0,бмл) в тетрагидрофуране (1мл) вьідерживали при комнатной температуре в течение 30 з минут. Растворитель вьіпарили, и остаток очистили посредством хроматографии на силикагеле (6906 Меон в

СНоСІ»). Получили 11мг 4-С-азидометилтимидина в виде бесцветного твердого вещества.

Пример 28

Приготовление 3'-О-трет-бутилдиметилсилил--5'-дезокси-5'-метилидентимидина

Суспензия гидрида натрия (6095 в минеральном масле, 2,88г, 72ммоль) в безводном ДМСО (100мл) после іФ) перемешивания при 65"С в течение 1,5 часа в атмосфере азота превратилась в прозрачньй раствор, которьй ко охладили до комнатной температурь и перенесли в холодную перемешиваемую суспензию метилтрифенилфосфония бромида (27,0г, 75,б6ммоль) в ДМСО (20мл) в атмосфере азота. Реакционную смесь бо перемешивали при комнатной температуре в течение 45 минут, с одновременньм охлаждением добавили раствор 3'-О-трет-бутилдиметилсилил-5'-дезокси-б-формилтимидина (8,50г, 24ммоль) в ДМСО (4Омл).

Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов, разбавили зтилацетатом (2л), промьіли соляньм раствором, вьісушили (Ма 5505), сконцентрировали. Сьрой остаток очистили посредством хроматографии на силикагеле (ЕЮАс-гексан, 30:70). Получили б,79г (80296) 65 3-О-трет-бутилдиметилсилил-5'-дезокси-5'-метилидентимидина в виде бесцветного твердого вещества, точка плавления 122"С (перекристаллизация из зтилацетата и гексана).

Пример 29

Приготовление 3-О-трет-бутилдиметилсилил-5і-С,О-метилентимидина

Раствор 3-О-трет-бутилдиметилсилил-5'-дезокси-5'і-метилидентимидина (6,26г, 17,78ммоль) и т-хлорнадбензойной кислоть! (4,61г, 26,6вммоль) в метиленхлориде (1б6бмл) перемешивали при комнатной температуре в течение ночи, разбавили метиленхлоридом (200мл), промьіли 1095 раствором Мансо» (2 х 24Омл) и затем соляньім раствором (1б0мл), вьісушили (Ма 2504) и сконцентрировали. Остаток очистили посредством хроматографии на силикагеле (Е(ОАс-гексан, 1:2). Получили неизмененньій исходньій материал (2,25г, 35,9905), 3-О-трет-бутилдиметилсилил-5'-(5)-С,О-метилентимидин (3,2г, 7690) и 70 3-О-трет-бутилдиметилсилил-5-(К)-С,О-метилентимидин (0,365г, 890).

Пример 30

Приготовление 3'-О-трет-бутилдиметилсилил-5'і-С-метоксиметилтимидина

Раствор 3-О-трет-бутилдиметилсилил-5'-(К)-С,О-метилентимидина (1,84г, бммоль) и безводного карбоната калия (1,38г, їОммоль) в метаноле перемешивали при комнатной температуре в течение 90 часов. Добавили /5 Зтилацетат (7/Омл), и смесь нейтрализовали уксусной кислотой до рН - 7. Растворители вьіпарили, и остаток растворили в метиленхлориде (ЗОмл). Осадки отфильтровали, и раствор сконцентрировали. Остаток очистили посредством хроматографии на силикагеле (Е(ОАс-гексан, 1:11). Получили З10мг неизмененного исходного материала и 578мг 3'-О-трет-бутилдиметилсилил-5'-С-метоксиметилтимидина в виде бесцветного твердого вещества.

Пример 31

Приготовление 3'-О-трет-бутилдиметилсилил-5'і-С-трифторацетамидометилтимидина

Раствор 3-О-трет-бутилдиметилсилил-5(К)-С,О-метилентимидина (0, 84г, 2,28мМмМоль) в метаноле перемешивали с раствором метанола, насьщенньм аммиаком (1Омл). Полученньій раствор вьідержали при комнатной температуре в течение 15 часов, и затем избьіток аммиака и метанола вьшпарили. Сухой остаток с об растворили в диоксане (10мл), и добавили зтилтиотрифторацетат (1,80г, 11,4ммоль, 1,46бмл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 6 часов, и затем растворитель вьіпарили. Остаток і) подвергли хроматографии на силикагеле (ЕоАс-гексан, 1:17). Получили 895мМг (81,896) 3-О-трет-бутилдиметилсилил-5'-С-трифторацетамидометилтимидина в виде бесцветного твердого вещества.

Пример 32 с зо Приготовление 3-О-трет-бутилдиметилсилил-5-(5)-С-цианметилтимидина

Смесь 3-О-трет-бутилдиметилсилил-5-(К)-С,О-метилентимидина (0,77г, 2,09ммоль) и цианид калия (52Омг, со 8,0ммоль) в М,М-биметилформамиде (1О0мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 40 часов, с разбавили зтилацетатом (10Омл), промьіли соляньм раствором (5 х бОмл), вьсушили (Ма 22504) и сконцентрировали. Сьурой остаток очистили посредством хроматографии на силикагеле (Е(дАс-гексан, 1:1). о

Получили 3-О-трет-бутилдиметилсилил-5'(5)-С-цианметилтимидин (580мг, 7095) в виде белого твердого «ф вещества.

Пример 33

Приготовление 3-О-трет-бутилдиметилсилил-5-(5)-С-азидометилтимидина

Смесь 3-О-трет-бутилдиметилсилил-5-(«К)-С,О-метилентимидина (3683мг, 1,0ммоль) и цианида калия « (325мг, 5,0ммоль) в М,М-биметилформамиде (Змл) вьідерживали нагретьми при 50"С в течение 16 часов, у с разбавили зтилацетатом (бОмл), промьли соляньм раствором (5х 40мл), вьсушили (Ма250О у) и ц сконцентрировали. Сьурой остаток очистили посредством хроматографии на силикагеле (Е(дАс-гексан, 1:1). "» Получили 53-О-трет-бутилдиметилсилил-5'-(5)-С-азидометилтимидин (17Змг, 4295) в виде белого твердого вещества.

Пример 34 ьч Приготовление 3-О-чтрет-бутилдиметилсилил-5'і-С-аллилтимидинов

Мн К суспензии безводного цианида меди (7,57г, 84,7ммоль) в безводном тетрагидрофуране при-5'С в о атмосфере аргона добавили по каплям аллилбромид магния (2,0М в тетрагидрофуране, 46,бмл, 93,2ммоль). Суспензию перемешивали в течение 15бминут при-5"С и по каплям добавляли холодньй раствор б 3-О-трет-бутилдиметилсилил-5'-формилтимидина (5,0г, 14,12ммоль) в тетрагидрофуране (200мл). Реакционную

ІЗ смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 6 часов, погасили, добавив 1095 раствор МансСоО»з (15Омл) при 0"С, и разбавили зтилацетатом (200мл). Органический слой промьіли 1095 раствором Мансо» (2 х 15Омл), вьісушили (Ма»ЗОд) и сконцентрировали. Получили 5,18г сьІрьх

З-О-трет-бутилдиметилсилил-5і-С-аллилтимидинов (содержащих два изомера: 5-(К) и 5-(5)). Два изомера о (соотношение 1:1) били разделеньї посредством хроматографии на силикагеле (1595 ЕЮАс в СНО»).

Пример 35 ко Приготовление 3-О-трет-бутилдиметилсилил-5'-О-(4,4"-диметокситритил)-5-(5)-С-метоксиметилтимидинов

Смесь 3-О-трет-бутилдиметилсилил-5'і-С-метоксиметилтимидина (258мг, О,645ммоль), бо диметокситритилхлорида (1,09г, 3,22ммоль) и трифторметансульфонового ангидрида серебра (835мгГ, 3,22ммоль) в безводном пиридине (Змл) вьідержали нагретой при 50"С в течение 18 часов. Пиридин вьіпарили, и остаток подвергли хроматографии на силикагеле (Е(Ас-гексан, 1:1). Получили 372мг (82965) 3-О-трет-бутилдиметилсилил-5'-0-(4,4"-диметокситритил)-5-(5)-С-метоксиметилтимидинов в виде белого твердого вещества. 65 Подобньм образом бьіли приготовлень! следующие вещества: 3-О-трет-бутилдиметилсилил-5'-0-(4,4"-диметокситритил)-5-(5)-С-дианметилтимидин бьл получен из

3-О-трет-бутилдиметилсилил-5-(5)-С-цианметилтимидина; 3-О-трет-бутилдиметилсилил-5'-0-(4,4"-диметокситритил)-5-(5)-С-азидометилтимидин бьл получен из 3-О-трет-бутилдиметилсилил-5'-(5)-С-азидометилтимидина; 3-О-трет-бутилдиметилсилил-5'-0-(4,4"-диметокситритил)-5-(5)-С-аллилметилтимидин бьл получен из 3-О-трет-бутилдиметилсилил-5-(5)-С-аллилметилтимидина; 3-О-трет-бутилдиметилсилил-5'-0-(4,4"-диметокситритил)-5(К)-С-аллилметилтимидин бьл получен из 3-О-трет-бутилдиметилсилил-5-(«К)-С-аллилметилтимидина; 3-О-трет-бутилдиметилсилил-5'-0-(4,4"-диметокситритил)-5-(5)-С-трифторацетамидометилтимидин бьл 7/0 получен из 3-О-трет-бутилдиметилсилил-5'-(5)-С-трифторацетамидометилтимидина;

Пример 36

Приготовление 5-0-(4,4"-диметокситритил)-5-(5)-С-метоксиметилтимидинов

Раствор 3-О-трет-бутилдиметилсилил-5'-О-(4,4"-диметокситритил)-5-(5)-С-метоксиметилтимидина (825мгГ, 1,17ммоль) и ТВАЕ (1,0М в тетрагидрофуране, З,бмл, З,бммоль) в тетрагидрофуране (15мл) вьідерживали при 7/5 Комнатной температуре в течение 2 часов. Тетрагидрофуран вьіпарили, и остаток подвергли хроматографии на силикагеле (ЕоАс-гексан, З3:2). Получили 551МГ (8090) 5-0-(4,4-диметокситритил)-5-(5)-С-метоксиметилтимидинов.

Подобньм образом бьіли приготовлень! следующие вещества: 5-0-(4,4-диметокситритил)-5-(5)-С-цианметилтимидин бьіл получен из 3-О-трет-бутилдиметилсилил-5'-0-(4,4"-диметокситритил)-5-(5)-С-цианметилтимидина; 5-0-(4,4-диметокситритил)-5-(5)-С-азидометилтимидин бьіл получен из 3-О-трет-бутилдиметилсилил-5'-0-(4,4"-диметокситритил)-5-(5)-С-азидометилтимидина; 5-0-(4,4-диметокситритил)-5-(5)-С-аллилметилтимидин бьіл получен из 3-О-трет-бутилдиметилсилил-5'-0-(4,4"-диметокситритил)-5-(5)-С-аллилметилтимидина; сч 5-0-(4,4-диметокситритил)-5-(К)-С-аллилметилтимидин бьіл получен из 3-О-трет-бутилдиметилсилил-5'-0-(4,4"-диметокситритил)-5-(К)-С-аллилметилтимидина; і) 5-0-(4,4-диметокситритил)-5-(5)-С-трифторацетамидометилтимидин бьіл получен из 3-О-трет-бутилдиметилсилил-5'-0-(4,4"-диметокситритил)-5-(5)-С-трифторацетамидометилтимидина.

Пример 37 с зо Приготовление 5-0-(4,4"-диметокситритил)-5-(5)-С-метоксиметилтимидин 3-(2-цианзтил-М,М-диизопропилфосфорамидитов) ісе)

К раствору 3-О-трет-бутилдиметилсилил-5'-О-(4,4"-диметокситритил)-5-(5)-С-метоксиметилтимидина (49Омг, с 0О,8Зммоль), диизопропилотиламина (64бмг, О0,87мл, 5,0ммоль) в безводном дихлорметане (бмл) при 0"С в атмосфере азота добавили мальми каплями раствор 2-цианзтил-М,М-диизопропилхлорфосфорамидита (592мг, о 2,5ммоль, 558мкл) в дихлорметане (мл). Раствор перемешали при комнатной температуре в течение 4Оминут, «Е охладили до 0"С, растворили в дихлорметане (бОмл), промьіли холодньім 590 раствором МансСо» (3 х 40Омл), внісушили (Ма»зЗО)) и сконцентрировали. Остаток подвергли хроматографии на силикагеле (ЕїаМм-ЕОАс-гексан, 5:45:50). Получили 5ВамМг (8990) 5-0-(4,4-диметокситритил)-5-(5)-С-метоксиметилтимидинь 3-(2-цианзтил-М,М-диизопропилфосфорамидита) в виде пень. «

Подобньм образом бьіли приготовлень! следующие вещества: в с 5-0-(4,4-диметокситритил)-5-(5)-С-цианметилтимидин 3'-(2-цианзтил-М,М-диизопропилфосфорамидит) бьл . приготовлен из 5-0-(4,4-диметокситритил)-5-(5)-С-цианметилтимидина; и?» 5-0-(4,4-диметокситритил)-5-(5)-С-азидометилтимидин 3-(2-цианзтил-М,М-диизопропилфосфорамидит) бьіл приготовлен из 5'-0-(4,4"-диметокситритил)-5-(5)-С-азидометилтимидина; 5-0-(4,4-диметокситритил)-5-(5)-С-аллилметилтимидин 3-(2-цианзтил-М,М-диизопропилфосфорамидит) їх бьіл приготовлен из 5-0-(4,4"-диметокситритил)-5-(5)-С-аллилметилтимидина; 5-0-(4,4-диметокситритил)-5-(К)-С-аллилметилтимидин 3'-(2-цианзтил-М,М-диизопропилфосфорамидит) о бьіл приготовлен из 5-0-(4,4-диметокситритил)-5-(К)-С-аллилметилтимидина; 2) 5-0-(4,4-диметокситритил)-5-(5)-С-трифторацетамидометилтимидин 5о 0 З-(2-цианзтил-М,М-диизопропилфосфорамидит) бьіл приготовлен из

Ме, 5-0-(4,4-диметокситритил)-5-(5)-С-трифторацетамидометилтимидина.

Ге Пример 38

Приготовление 1'-циан-3'-трет-бутилдиметилсилил-5'-(4,4"-диметокситритил)-тимидина 1-циан-5-(4,4-диметокситритил)-тимидин в безводном пиридине добавили к перемешиваемому раствору трет-бутилдиметилхлорсилана (1,5 зквивалента) и имидазола (3,5 зквивалента) в безводном пиридине при ОС.

Полученную реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Пиридин вьіпарили, (Ф, и остаток растворили в зтилацетате, промьли соляньм раствором. Сьрой продукт непосредственно ка использовали в следующей реакции.

Пример 39 во Приготовление 3'-трет-бутилдиметилсилил-5'-диметокситритил-1-формил-5-метоксибензилтимидина 3'-трет-бутилдиметилсилил-1'-циан-5'-диметокситритил-5-(р-метоксибензил)-тимидин (1,Оммоль) в тетрагидрофуране добавили к перемешиваемому раствору тризтоксиалюмогидрида лития (2,0ммоль) в тетрагидрофуране при -207"С в атмосфере азота. Реакционную смесь перемешивали при 5 - 107С в течение 1 часа, погасили водньмм раствором хлорида аммония. Смесь зкстрагировали зтилацетатом, и сьірой продукт 65 подвергли хроматографии на силикагеле.

Пример 40

Приготовление 1'-амидо-3"5',5-трис-(метоксибензил)-тимидина 1-амидо-3,5,5-трис-(метоксибензил)у-тимидин добавили к перемешиваемому водному раствору 3090 перекиси водорода и карбоната натрия при 0"С. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре

В течение 2 часов, разбавили водой, нейтрализовали, добавив соляную кислоту, зкстрагировали дихлорметаном. Сьірой продукт очистили посредством хроматографии.

Пример 41

Приготовление 1'-амино-3',5',5-трис-(метоксибензил)-тимидина

Процесс приготовления такой же, как описан в литературе (Каапакгізпипа, А.5., Рагпат, М. Е., Кідоз, К.М. 7/0 апа Гоцдоп, 5.М. У. Ог9. Спет. 1979, 44, 1746). 1-циан-3,55-трис(метоксибензил)утимидин (1,0ммоль) в безводном тетрагидрофуране добавили к перемешиваемому раствору 1,1-бис-«трифторацетоксийодбензола (2О0ммоль) в тетрагидрофуране при 0"С. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 5 часов, разбавили дихлорметаном, промьіли 595 карбонатом натрия и соляньім раствором. Сьрой продукт очистили посредством хроматографии.

Пример 42

Приготовление триметил-3,5',5-трис-(метоксибензил)-тимидин-1-ил аммония бромида 1-амино-3",5',5-трис-(метоксибензил)-тимидин добавили к перемешиваемому раствору метилбромида (10 зквивалентов) в тетрагидрофуране при 0"С. Реакционную смесь перемешивали при 50"С в течение ночи.

Растворитель вьіпарили, и сьірой продукт очистили посредством перекристаллизации.

Пример 43

Приготовление 1'-бром-3"5',5-трис-(метоксибензил)-тимидина

Процесс приготовления такой же, как описан в литературе (Оеєаду, І МУ., КогуївКу, О.Ї. Тейгапедгоп І! ей. 1979, 451). Триметил-3,5',5-трис-(метоксибензил)-тимидин-1-ил аммония бромид вьідержали нагретьм при 15072 в вакууме в течение ночи. Сьірой продукт непосредственно использовали в следующей реакции. с

Пример 44

Приготовление 1'-зтокси-3,5',5-трис-(метоксибензил)-тимидина о 1-бром-3,5',5-трис-(метоксибензил)-тимидин в зтаноле добавили к перемешиваемому раствору зтоксида натрия в зтаноле при -10"С. Полученную реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа, нейтрализовали разбавленной соляной кислотой. Зтанол вьіпарили, и оставшуюся реакционную д/с

Зо смесь зкстрагировали зтилацетатом. Сьірой остаток очистили посредством хроматографии. Получили смесь о, и Д диастереомеров. ї-оі

Подобньм образом бьіли приготовлень! следующие вещества: Го) 1-(4-нитробутокси)-3,5',5-трис-(метоксибензил)-тимидин из /1-бром-35',5-трис-(метоксибензил)-тимидина и 4-нитрибутанола-1. о 1-зтилтио-3,5',5-трис-(метоксибензил)-тимидин бьіл приготовлен из ЧЕ 1-бром-3,5',5-трис-(метоксибензил)-тимидина и тиозтоксида натрия.

Пример 45

Приготовление 1-амино-тимидина «

Суспензию 1'-амино-35',5-трис-(метоксибензил)у-тимидина и 1095 палладированного угля в зтаноле Ввстряхивали в устройстве для гидрогенизации при давлений водорода 344,7кКПа в течение ночи. Твердое - с вещество отфильтровали, и фильтрат сконцентрировали. Сьрой продукт очистили посредством ц перекристаллизации. "» Пример 46

Приготовление олигонуклеотидов с модифицированньіми сахарами

Зтот пример иллюстрирует использование соединения 55 (Фиг. 8) в ходе синтеза произвольного ї олигонуклеотида с такой последовательностью: с 5-«КАТС ТСТ ССО ст ст" тт" С)-3"

В зтой последовательности А, С, З и Т обозначают немодифицированнье дезоксирибонуклеозидь, а Т" (95) обозначает 5і--С-аминометилтимидин. В зтом примере синтез олигонуклеотидов проводили в синтезаторе ДНК б» 50 АВІ 394 (Аррієд Віозувіетв, модель 394). Все нуклеозидьї присоединяли по принципам фосфорамидитной химии. Присоединение ЯА, ас, дб и Т осуществляли при помощи стандартньїх для синтеза ДНК реагентов в

Ко) соответствии со стандартной процедурой. Из-за стерических помех, создаваемьх разветвленньім заместителем в позиций С5 тимидина присоединение Т" проийсходило дольше (5минут). По окончаниий синтеза обработку олигонуклеотида проводили стандартньм способом. Сьрой олигонуклеотид очистили на обращенно-фазной

Кколонке С18 ВесКтап посредством ЖХВР с буфером ТЕАА (рН 7,0) и ацетонитрилом в качестве подвижной фазьі. Получили очищенньй олигонуклеотид, оптическая плотность 624. о Подобньїм образом бьіли приготовленьї следующие произвольнье олигонуклеотидь! с модифицированньіми іме) сахарами. 5-С-разветвленнье олигонуклеотидьі с модифицированньїми сахарами: 60 б5

1. 5'-ТТССТОТСТОАТоССсТТо-3 2. З'-ЖЖХССТОТСТСАТоССТТо-3 й 3. 5'-ТТССТОТСХОАТоССТТо-3 4. 5'-АТСТСтТоСосСтТТсСстТтТтТо-3 70 5. 5'-АТСТСТоСОоСТТосСтТтТХС-3 б. 5'-АТСТСТССОоСТТССтТХХС-3! 7. 5'-АТСТоХССОоСсСТХССсТТТС-3 8. 5'-АТСТСТСоСОоСТТСсСтТТЕХС-3 9. 5'-АТСТСТССОСТтТССсТУХС-3" 10. 5'-АТСТСтТоСОосСтТтТСссСУТУС-З 70 11. 5'-АУстТСуССССТуССТТУуС-З! 12. 5'-АТСТСТоСсСеоСстТтІСсСстТтТас- 3 13. 5'-АТСТСТСоСОоСТТССсСТтТайсС-3 с 7 14. 5'-АТСТСТоСоСТтТоСсЯтТасС-3' о 15. 5'-АТСТСТоСОСТТССТТУС-З 16. 5'-АТСТСТоСОоСТТІССТУМС- 3 й 17. 5'-АТСТСТОоСОоСТтТоСУТУС- 3! со 18. 5'-АТСотТСсУуССсоСУТССТТТО-3 ю з5 19. 5'-Аустстососттссттто-3 « 20. 5'-АтТстТотосостТтТостТтТис-3 21. 5!-АТСТСТССоСТТССТИМС- 3" « 4022. 5'-АТСТСТОСОСТТССИТИС-З! в я 23. з'-АтстоМмоссосСситосстТтТо-3" їз 75 24. 5'-дМстТостосСостТтостттТо-3 4! Х - 51-(5)-С-метоксиметилтимидин, о ух - 51-(5)-С-аминометилтимидин, б й й - 5'-(5)-сС-цианметилтимидин, їз У -5'-(5)-С-аллилтимидин, и ря й - 5-(8)-С-аллилтимидин.

Ф) ко бо 65

4"-С-разветвленнье олигонуклеотидн с модифицированньми сахарами: 25. 5'-АТСТСТСоСОоСТТССтТТТо-3 26. 5'-АТСТСТССОСТТССТТІХС-З 27. 5'-АТСТСТССОСТТССТХХС-3 0 28. 5'-АТСТСТССсОоСстТТСсСХтТХоС-3" 29. 5'-АХСТСТССОСТТСсСТтТТОо-З 30. 5'-АТСТСХССсоСстТХСсСстТтТТо-3 31. 5'-АТСТСТоСОоСтТтТССстТтТХС-3 32. 5'-АТСТСТССОСТТССТУХС-З 33. 5'-АТСТСТССОоСТтТССУТХС-3 34. 5'-дХСстТотТоСсостТтТосХтТХс-3 35, 5'-АТСТСХССОоСтТУСсСтТТТо-3! хх - 4'-С-метоксиметилтимидин, сч

ХХ - 4'-С-аминометилтимидин. (о) 3'-С-разветвленнье олигонуклеотидь с модифицированньми сахарами: сч 3036, 5'-АТСТСТоСоСтТтТоСтТтТтТо-3 со 37. 5'-АТСТСТССОоСТтТССсТтТХС-3' со 38. 5'-АТСТОоТССОоСТТССТХХС-3 юю 39, 5'-АТСТСТССоСТТССХТХС- З! З 40. 5'-АТСТСТССОСХТССТТТС- З 41, З'-АЖХСТСТОоСОоСТтІССТТІТоС-3 ч - с 42. 5'-дАТСТСотТоСсОоСстТтТСсСстТтТУсС-3 з 43. 5'-АТСТСТССССТТоСтТУХС-3" ч 35 44. 5'-АТСТСТССССУТССТТТС-3! сл 45. 5'-АХСТСТССОСТТоСХтТХС-3 о 46. 5'-АТСТСХССОоСтТУІССсТТТо-3 (2) 7о Й 47. 5'-АТСТСТОоСОоСТІССТТаС-3

Іо 48. 5'-АТСТСТОоСОоСТтТоСстТайс-3" 19. 5'-АТСТСТоСОоСТТоСатисС-3 х 3-С-аминометилтимидин, (Ф) у в 3-Р-метилтимидин, ко 27 ЕЕ У-Р-цианметилтимидин.

Включение посредством ссьІілки во Все патентьії, патентнье заявки и публикации, упомянутье в настоящем документе, включаются в него посредством ссьІлки.

Зквиваленть

Приведенное вьіше описание считаєтся достаточньм, чтобьі специалист мог внедрить изобретение в практику. Различнье модификации описанного вьіше изобретения, очевиднье для специалистов в области 65 Оорганической химий или в родственньх областях, включаются в обьем формуль изобретения.

Claims

Формула винаходу

1. Нуклеозидьії с модифицированньіми сахарами общей формуль! Я ' 70 З

В. Е

4 Е. 1 8 3 Ко где В - нуклеозидное основание, такое, как тимин, любая арильная составляющая КК 3, Кз, Кіа и КБ представляет собой фенил, полицикл или гетероцикл; К»-Н,Х-5, 0, СН», и, если () Кз и К;ь независимо вьібраньй из группь), состоящей из ОН, 2-цианозтил-(М, М-диизопропил) фосфорамидитной или гидроксиблокирующей группь, то (А) Х представляеєт 5, СН»; КУ, Кз, К'; и К'5 независимо вьібраньі из группьі, состоящей из Н, СМ, Ма, МО», СЕз, алкила С.4-С:о, при условий, что КУ, Кз, К'; и К'5 не могут бьіть одновременно Н, а алкил может бьіть замещен одной из групп СМ, с МН», ОН, Вг, 5ОЗК, СООК, где К - ацетил, СЕЗСО, тозил; (Б) где Х представляєт 0; о КУ вьібирают из группьії, состоящей из Мз, МО», СЕз, алкила С4-Сіу, алкил может бьїть замещен одной из групп МО», Мз, СЕз, Вг; КУ, Кз, К; и К'5 все являются Н; с (В) где Х представляеєт собой 0; Кз внібран из группь, состоящей из СМ, Мз, замещенного алкила, где заместителем является СМ, М з, МН», ке, КУ, Кі и К'5 все являются Н; со (ІЇ) где Х представляеєт 0; один из радикалов Кз и К; представляет межнуклеотидную связь, а другой вьібран из группьії, состоящей из о ОН, межнуклеотидной связи и гидроксиблокирующей группь,, К' - обозначаеєт Н, а два радикала из Кз, КУ; и К'в5 «І обозначают Н, а третий модифицирован, как указано ниже: (А) Кз вьібран из группьі, состоящей из замещенного алкила С.-С3оу, аралкила С4-С:о, арила; замещенного арила, а заместитель у алкила С.4-Сі5у иной, чем ОН; (Б) К'; вьібран из группьї, состоящей из замещенного алкила С.-С39у, аралкила С4-С:о, арила, замещенного « арила, радикала с вьісокой злектроотрицательностью, СЕз или МО» и заместитель у алкила С.-С.о и арила 8 с иной, чем ОН, МН»; й (В) когда Ке5 обозначаєт межнуклеотидную связь, К' 5 вьібран из группьі, состоящей из замещенного "» алкила С41-С3о, аралкила С.4-С1ду, арила, замещенного арила и заместитель у алкила С.4-С19 иной, чем МН».

2. Соединение по п. 1, отличающееся тем, что оно соответствует группе (А).

З. Соединение по п. 2, отличающееся тем, что Кз вьібран из группьії, состоящей из алкила С 4-С.0о, «» замещенного алкила С.4-С3о, аралкила С41-С1у, арила, замещенного арила, а К", К'; и К'5 все являются Н. сл

4. Соединение по п. 2, отличающееся тем, что К'5 вьібран из группьі, состоящей из алкила, С 4-С.9о, замещенного алкила С.4-С3о, аралкила С41-С1у, арила, замещенного арила, а К", Кз и К'; все являются Н. со

5. Олигонуклеотид, содержащий нуклеозид по п. 2.

6. Олигонуклеотид, содержащий нуклеозид по п. 3. Ме

7. Олигонуклеотид, содержащий нуклеозид по п. 4. Кз

8. Соединение по п. 1, отличающееся тем, что оно соответствует группе (Б).

9. Соединение по п. 1, отличающееся тем, что оно соответствует группе (В).

10. Соединение по п. 1, отличающееся тем, что оно соответствует группе ІА).

11. Соединение по п. 10, отличающееся тем, что заместитель по меньшей мере одного замещенного алкила вьібран из группьі, содержащей МН» Ф,

12. Соединение по п. 10, отличающееся тем, что заместитель по меньшей мере одного замещенного алкила, ко замещенного арила вьібран из группьі, состоящей из СМ, М3з, галогена.

13. Соединение по п. 10, отличающееся тем, что заместитель по меньшей мере одного замещенного алкила, бо замещенного арила вьібран из группьії, состоящей из СООК, СОМЕА'К", где К и К" - низший алкил.

14. Соединение по п. 1, отличающееся тем, что оно соответствует группе (Б).

15. Олигонуклеотид по п. 14, отгличающийся тем, что заместитель по меньшей мере одного замещенного алкила вьібран из группьі, состоящей из МН, МАК", где КУ Кк", Кк" независимо вьібрань! из группь, состоящей из низшего алкила и низшего алкилкарбонила. 65

16. Олигонуклеотид по п. 14, отличающийся тем, что заместитель по меньшей мере одного замещенного алкила, замещенного арила вьібран из группьії, состоящей из СМ, МО», галогена.

17. Соединение по п. 1, отличающееся тем, что оно соответствует группе (В).

18. Олигонуклеотид по п. 17, отгличающийся тем, что заместитель по меньшей мере одного замещенного алкила, замещенного арила вьібран из группьі, состоящей из МНК, где К' - низший алкил.

19. Олигонуклеотид по п. 17, отгличающийся тем, что заместитель по меньшей мере одного замещенного алкила, замещенного арила вьібран из группьі, состоящей из СМ, МО», Ма.

20. Олигонуклеотид по п. 17, отличающийся тем, что заместитель по меньшей мере одного замещенного алкила, замещенного арила вьібирают из группьі, состоящей из СООК и СОМ", где К и К" - независимо низший алкил. се що о се (Се) Ге) І в) «

- . а т» 1 (95) (е)) ще) ко бо б5