UA116519C2

UA116519C2 - Моноклональне антитіло проти білка rgmа і його застосування

Info

Publication number: UA116519C2
Application number: UAA201202581A
Authority: UA
Inventors: Бернхард К. МЮЛЛЕР; Мартін Шмідт; Ів Х. Барлоу; Мері Р. Ледді; Чунг-мінг Хсієх; Філіп Д. Бардуелл
Original assignee: Еббві Дойчланд Гмбх Унд Ко. Кг; Еббві Інк.
Priority date: 2008-02-29
Filing date: 2009-02-27
Publication date: 2018-04-10

Abstract

Винахід належить до виділеного моноклонального антитіла проти RGMA, виділеної нуклеїнової кислоти, що його кодує, вектора, що містить нуклеїнову кислоту, клітини-хазяїна, яка містить вектор, способу отримання виділеного моноклонального антитіла проти RGMA, фармацевтичної композиції, що містить вказане антитіло та його застосування для отримання лікарського засобу для зниження активності RGMA у індивіда, що страждає на неврологічне захворювання.

Description

Винахід належить до виділеного моноклонального антитіла проти КОМА, виділеної нуклеїнової кислоти, що його кодує, вектора, що містить нуклеїнову кислоту, клітини-хазяїна, яка містить вектор, способу отримання виділеного моноклонального антитіла проти КОМА, фармацевтичної композиції, що містить вказане антитіло та його застосування для отримання лікарського засобу для зниження активності КОМА у індивіда, що страждає на неврологічне захворювання.

У даній заявці описані КОМ А-зв'язувальні білки, зокрема, моноклональні антитіла, і, зокрема, їх СОН-щеплені, гуманізовані варіанти, що здатні зв'язуватися з КОМ А і запобігати зв'язуванню білків КОМ з рецептором КОМ А і іншими КОМ А-зв'язувальними білками і, отже, нейтралізувати функцію КОМ А. Ці антитіла можуть використовуватися для лікування деяких станів, включаючи, але ними не обмежуючись, розсіяний склероз, травму головного мозку ссавців, ушкодження спинного мозку, інсульт, нейродегенеративні захворювання і шизофренію.

Регенерація аксонів після ушкодження або після запальних уражень, або після нейродегенеративних захворювань центральної нервової системи ссавців (ЦНС) практично завжди є неможливою; результат залежить від балансу між вродженою здатністю нервових волокон ЦНС до відновлення росту і інгібувальними факторами ЦНС, розташованими в сайті ураження або ушкодження, що активно перешкоджають відновленню росту і, отже, регенерації ушкоджених шляхів нервових волокон.

Було встановлено, що мієлін ЦНС, вироблюваний олігодендроцитами, і рубцева тканина ушкодження є найбільш значимими гальмуючими структурами для росту аксонів на ранній фазі ушкодження, унаслідок колапсу конуса росту і інгібування росту нейритів іп міго, а також іп мімо, що приводить до безпосереднього інгібування росту аксонів. Були ідентифіковані білюи КЕСМ, головні інгібувальні фактори мієліну ЦНС і рубцевої тканини (Моппіег еї а!., Маїиге 419: 392-395, 2002; Зспмабр еї аї., Агсп. Мешгої!.б2: 1561-8, 2005а; 5спуаб єї а. Ек. ). Мешгозсі. 21: 1569-76, 2005 Б; Наїа 6ї а). 9). Сеї! Віої. 173:47-58, 2006; відносно оглядів див.: МиеїІег еї а!., РНйо5. Тгапв.

ЕК. бос. І опа. В Віої. сі. 361: 1513-29, 2006; Матазпйа єї а. Сит. Оріп. Меийгобріої. 17: 29-34, 2007). Білюи КОМ стимульовані в ділянках ураження або ушкодження у людей, померлих від травми головного мозку або ішемічного інсульту (Зспулаб вї аї., Агсй. Мешцгої. 62: 1561-8, 2005а) і стимульовані у щурів з ушкодженням спинного мозку (Зспулар єї аї!. Єшиг. У.Меигозбсі. 21: 1569-76, 2005 р; Наїа вї аї. У. Сеї! Віої. 173:47-58, 2006, відносно огляду див.: Миеїег еї а!., РПйЙОо5. Тгапв.

В. 5ос. І опа. В Віої. Зсі. 361: 1513-29, 2006; Матабвнйа еї аІ. Ст. Оріп. Мецгобіої!. 17: 29-34, 2007). Крім того, перші результати з використанням клінічних зразків пацієнтів з розсіяним склерозом і здоровими осіб зробили можливість припустити, що КОМ А людини стимульований у цереброспінальній рідині пацієнтів, що страждають М5 (дані не показані).

Для оцінки стимулюючого регенерацію ефекту КОМ А-специфічного поліклонального антитіла, ці антитіла вводили в помірну-важкеу модель ушкодження спинного мозку, де приблизно 6095 спинного мозку на торакальному рівні 9/10 були розсічені. Гістологічне дослідження виявило, що таке ушкодження приводило до розриву всіх дорсальних і латеральних волокон кортикоспінального шляху. КОМ А-специфічне поліклональне антитіло, що вводиться місцево за допомогою насоса протягом двох тижнів, індукувало віддалену регенерацію ушкоджених нервових волокон (Наїа еї а/., 9. Сеї! Віої. 173:47-58, 2006).

Сотні нервових волокон, розташованих за межами ділянки ушкодження, і найдовші волокна регенерували більше ніж на 10 мм за межами цього ушкодження, тоді як регенеруючі волокна не були виявлені дистально відносно цього ушкодження у оброблених контрольним антитілом тварин. Функціональне відновлення анти-КОМ А-оброблених щурів значно поліпшувалося в порівнянні з обробленими контрольним антитілом щурами зі спинномозковим ушкодженням, підтверджуючи тим самим, що КОМ А є потужним інгібітором нейрорегенерації і цінною мішенню для стимуляції відновлення в показаннях, що характеризуються ушкодженням аксонів або ушкодженням нервових волокон (Наїа еї аї., У. СеїІ Віої. 173:47-58, 2006; Куою еї аї. Вгаїп

Вез. 1186: 74-86, 2007). Крім того, нейтралізація білка КОМ А блокуючим функцію поліклональним антитілом не тільки стимулювала ріст ушкоджених нервових волокон у щурах зі спинномозковим ушкодженням, але і підсилювала утворення їх синапсу, тим самим роблячи можливими корекцію або відновлення ушкоджених нейронних ланцюгів. (Куоїо еї аї. Вгаіп Кев. 1186: 74-86, 2007).

Сімейство гдіт-генів включає три різних гени, два з яких, гдт а і р, експресуються в ЦНС ссавців, даючи початок білкам КОМ А і КОМ В, тоді як третій член, гдт с, експресується на периферії (Миеїег еї аї., Рпйо5. Тгап5. К. ос. І опа. В Віої. 5сі. 361: 1513-29, 2006), де КОМ С відіграє важливу роль у метаболізмі заліза. Іп міго, КОМ А інгібує ріст нейритів зв'язуванням з

Неогеніном, який був ідентифікований як рецептор КОМ (Каїадораїап еї аї. Маї Сеїї Віо!.: 6(8), 756-62, 2004). Неогенін уперше був описаний як нетринзв'язувальний білок (Кеіпо-Мави еї аї.

СеїІ, 87(2):175-85, 1996). Це відкриття є важливим, оскільки повідомлялося, що зв'язування

Нетрину-1ї і Неогеніну або його близькоспорідненого рецептора ОСС (делетований у колоректальному раку) скоріше стимулює, а не інгібує ріст нейритів (Вгаїєтей еї аї. У. Мешговсі. 20: 5792-801, 2000). Таким чином, блокування КОМ А запускає КОМ-опосередковане інгібування росту, забезпечуючи зв'язування неогеніну з його стимулюючим ріст нейритів бо лігандом Нетрином. На основі цих спостережень, можна зробити припущення, що нейтралізація

КОМ А перевершує нейтралізацію неогеніну на моделях ушкодження спинного мозку людини.

Крім зв'язування КОМ А з Неогеніном і індукції інгібування росту нейритів, зв'язування КОМ А або В з морфогенетичними білками кістки ВМР-2 і ВМР-4 може перешкоджати успішній нейрорегенерації і функціональному відновленню (МиепПег еї аї., Рпйо5. Тгап5. К. 5ос. ГІ опа. В.

Віо!. сі. 361: 1513-29,2006).

У даній галузі існує необхідність у поліпшених антитілах, здатних зв'язувати КОМ А, переважно, у моноклональному антитілі, яке блокує ЕОМ А і перешкоджає взаємодії КОМ А і його рецептора, і/або зв'язувальних білків, тобто Неогеніну і ВМР-2, ВМР-4.

Дана заявка стосується (а) одержання нейтралізуючого моноклонального антитіла проти

КОМ А, яке селективно інгібує зв'язування КОМ А і рецептора, Неогеніну і морфогенетичних білків кістки 2 і 4 (ВМР-2, ВМР-4), і (б) одержання нейтралізуючого моноклонального антитіла проти КСМ А, яке селективно інгібує зв'язування КОМ А з морфогенетичними білками кістки 2 і 4 (ВМР-2, ВМР-4). Вважають, що ці нейтралізуючі моноклональні антитіла за даним винаходом стимулюють ріст уражених або ушкоджених нервових волокон і формування функціональних синапсів регенеруючих нервових волокон, оскільки одне з нейтралізуючих моноклональних антитіл за даним винаходом, очевидно, перетворює інгібіторну природу КОМ А у стан, при якому нервові клітини віддають перевагу мігруванню і росту на КОМ А-субстраті, а не на пермісивному субстраті, такому як Колаген І. Крім того, антитіло здатне індукувати віддалену регенерацію на моделі іп мімо ушкодження зорового нерва щурів, а також підсилює мієлінізацію ушкоджених і регенеруючих нервових волокон.

Таким чином, було зроблене припущення, що нейтралізуючі моноклональні антитіла за даним винаходом стимулюють регенерацію нейронів і ріст ушкоджених або зруйнованих нейронних сполук в ушкодженій або запаленій ЦНС людини, наприклад, при розсіяному склерозі, після гострого ушкодження спинного мозку, травми головного мозку або при нейродегенеративних захворюваннях, таких як, наприклад, хорея Хантінгтона, хвороба

Паркінсона, хвороба Альцгеймера.

Відповідно до одного з аспектів даний винахід стосується зв'язувального білка, який дисоціює з ВОМ А людини (ПЕСМ А) зі значенням Ко, що дорівнює 1 х 107 М або менше, і константою швидкості дисоціації Кої), що дорівнює 1 х 102 с! або менше, причому обидві

Зо константи визначають способом резонансу поверхневих плазмонів.

Відповідно до іншого аспекту винахід стосується зв'язувального білка, наприклад зв'язувального білка, що має вищевказані кінетичні властивості, який зв'язується з КОМ А людини і нейтралізує активність, що інгібує розростання нейритів КОМ А людини, як визначено стандартним аналізом іп міго, наприклад аналізом нейронного росту Мега, наведеним як приклад З нижче.

Даний винахід також стосується зв'язувального білка, як визначено вище, який має щонайменше одну з наступних додаткових функціональних характеристик: здатності зв'язувати КОМ А щура, здатності зв'язувати КОМ С людини, і здатності зв'язувати КОМ С щура.

Зокрема, описаний у даному документі зв'язувальний білок модулює здатність КОМ зв'язуватися щонайменше з одним з його рецепторів.

Такий зв'язувальний білок, зокрема, зв'язується з рецепторзв'язувальним доменом КОМ А людини. Були ідентифіковані М- ї С-кінцеві рецепторзв'язувальні домени. Конкретні варіанти зв'язувальних білків за винаходом здатні зв'язуватися з М-кінцевим рецепторзв'язувальним доменом КОМ А, як показано за допомогою інгібування зв'язування М-кінцевого фрагмента

ЯКОМ А, наприклад, 47-168, і молекул рецептора, таких як Неогенін і ВМР-4. Зазначений М- кінцевий фрагмент ЯПКОМ А може мати загальну довжину від приблизно 30 до приблизно 150 амінокислотних залишків або від приблизно 30 до приблизно 122 амінокислотних залишків. Як необмежувальний приклад, можна указати Фрагмент 0 (відповідний М-кінцевим залишкам 47- 168) КОМ А, як описано в даному документі, або будь-який більш короткий рецепторзв'язувальний фрагмент.

Зокрема, зазначений зв'язувальний білок модулює, переважно інгібує, щонайменше одну з наступних взаємодій: зв'язування КОМ А людини з ВМР-4 людини, зв'язування НКОМ А з Неогеніном людини, зв'язування пНКОМ С з Неогеніном людини, зв'язування КОМ А людини з ВМР-2 людини.

Відповідно до одного з конкретних варіантів здійснення, зв'язувальний білок, визначений у 60 даному документі, є гуманізованим антитілом.

Описаний вище зв'язувальний білок може мати антигензв'язувальний домен, причому зазначений антигензв'язувальний домен здатний зв'язувати епітоп молекули КОМ і зазначений антигензв'язувальний домен містить щонайменше один СОК, що місти амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з сСТтРОУ (ЗЕО ІЮ МО: 59),

ЕОАТНОРІТ (ЗЕО ІЮ МО: 62),

АВАМЕУМавзЗЕври (ЗЕО І МО: 65),

ГОСМІРРАТ (ЗЕО ІО МО: 68), і модифікованих амінокислотних послідовностей СОК, послідовність яких щонайменше на 5095 ідентична одній з зазначених послідовностей. В іншому варіанті здійснення винахід стосується зв'язувального білка, що містить антигензв'язувальний домен, причому зазначений зв'язувальний домен здатний зв'язувати епітоп молекули КОМ, причому зазначений антигензв'язувальний домен містить щонайменше один СОЖК, що містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з: сСТтРОУ (ЗЕО ІЮ МО: 59),

ЕОАТНОРІТ (ЗЕО ІЮ МО: 62),

АВАМЕУМавзЗЕври (ЗЕО І МО: 65),

ГОСМІРРАТ (ЗЕО ІО МО: 68), і модифікованих амінокислотних послідовностей СОК, послідовність яких щонайменше на 50 95 ідентична, наприклад, щонайменше на 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 95 ідентична одній з зазначених послідовностей.

Наприклад, зазначений зв'язувальний білок може містити два з зазначених СОК, наприклад

ЗЕО ІО МО: 59 і 62 або 5ЕО ІО МО: 65 і 68; де щонайменше один із зазначених СОК може бути модифікованим і мати послідовність, що щонайменше на 50 95, наприклад, щонайменше на 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 95 ідентична одній з зазначених послідовностей.

Зазначений зв'язувальний білок може також містити щонайменше один СОЖК, що містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з 5ЕО ІЮО МО: 57, 58, 60, 61, 63, 64, 66, 67 і модифікованих амінокислотних послідовностей СОК, що щонайменше на 50 965, наприклад, щонайменше на 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 95 ідентичні одній з зазначених послідовностей.

Інший варіант здійснення стосується зв'язувального білка, у якому зазначений щонайменше один СОК містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з: о Залишки 99-104 5ЕО ІЮ нини , Залишки 94-102 5ЕО ІЮ нини о Залишки 97-110 5ЕО ІЮ нини

В одному з конкретних варіантів здійснення, зазначений зв'язувальний білок містить щонайменше З СОК, які вибрані з набору СОК варіабельних доменів, що складається з:

Наборумі5гяїдГ///СССССССТГ

НаборумнвсїЇ д/г

НаборуміврїїдГ//ССССССТГ або набору варіабельних доменів, у яких щонайменше один із зазначених З СОМ є модифікованою амінокислотною послідовністю СОЖК, що щонайменше на 50 95, наприклад, щонайменше на 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 95 ідентична вихідній послідовності.

Зокрема, кожна з вищевказаних модифікацій може бути одержана додаванням, делецією або, зокрема, заміною однієї амінокислоти або декількох амінокислот або їх комбінаціями.

В іншому з варіантів здійснення, зв'язувальний білок містить щонайменше два набори СОР варіабельних доменів.

Зокрема, зазначені щонайменше два набори СОК вибрані з групи, що складається з:

МН 5Е9-набору і МІ. 5Е9-набору; і

МН 801-набору і МІ. 801-набору.

Зв'язувальний білок за даним винаходом додатково містить акцепторну каркасну ділянку людини.

Зазначена акцепторна каркасна ділянка людини може містити щонайменше одну амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з 5ЕО ІЮО МО: 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26,27, 28, 29, 30, 31, 32 і 33.

Зв'язувальний білок за винаходом може, зокрема, містити щонайменше один з наборів каркасних послідовностей, вибраних із групи, що складається з наборів: (1) Набір МНЗ-48 (ЗЕО ІЮ МО:15, 16 і 17),

Набір МНЗ-33 (ЗЕО ІО МО:21, 22 і 23),

Набір МНЗ-23 (ЗЕО ІО МО:24, 25 і 26), кожний з який комбінований з додатковою каркасною послідовністю, вибраною з

УНЗ(ЗЕОІЮМО:18),

УНА (ЗЕО ІЮ МО 19),

УНб (5ЕО І МО:20); або (2) вибраних із групи, що складається з наборів

А18-набір: (5ЕО ІО МО: 27, 28 і 29),

А17-набір: (ЗЕО ІО МО: 31, 32 і 33), кожний з який об'єднаний з додатковою каркасною послідовністю, вибраною з групи, що складається з УК2 (ЗЕО ІЮ МО:2).

Відповідно до конкретних варіантів здійснення, зв'язувальний білок будь-якого варіанта, описаного вище, містить щонайменше один СОМК-щеплений варіабельний домен важкого ланцюга, вибраний з ЗЕО ІЮО МО: 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42 і 43; або щонайменше один СОК- щеплений варіабельний домен легкого ланцюга, вибраний з 5ЕО ІЮ МО: 44, 45 і 46.

Більш конкретно, зв'язувальний білок за винаходом містить комбінацію двох варіабельних доменів, де зазначені два варіабельні домени мають амінокислотні послідовності, вибрані 3:

ЗЕО ІЮ МО: 35 і 44; 36 і 44; 37 і 44; 38 і 44; 39 і 44; 40 і 44; А1 і 44; 42 і 44; 4З і 44;

ЗЕОІЮ МО: 35145: 36145;37145;38145;39145:40145541145;421 45; 43 і 45;

ЗЕО ІЮ МО: 35 і 46; 36 і 46; 37 і 46; 38 і 46; 39 і 46; 40 і 46; 41 і 46; 42 і 46; 43 і 46;

В іншому варіанті здійснення за винаходом, зазначена акцепторна каркасна ділянка людини зв'язувального білка містить щонайменше одну амінокислотну заміну каркасної ділянки в ключовому залишку, причому зазначений ключовий залишок вибраний із групи, що складається залишку, суміжного з СОК; залишку сайта глікозилування; рідкого залишку; залишку, здатного взаємодіяти з епітопом КОМ; залишку, здатного взаємодіяти з СОК; канонічного залишку; контактного залишку між варіабельною областю важкого ланцюга і варіабельною областю легкого ланцюга; залишку в зоні Мегпіег;

М-кінцевого залишку, здатного утворювати параглутамат, і залишку в області перекриття СОКІ варіабельної області важкого ланцюга по Хотія і першою каркасною ділянкою важкого ланцюга по Кебату.

Зокрема, зазначені ключові залишки вибрані з групи, що складається з (положення в послідовності важкого ланцюга) 1, 5, 37, 48, 49, 88, 98, (положення в послідовності легкого ланцюга): 2, 4, 41, 51.

В одному з конкретних варіантів здійснення зв'язувальний білок за винаходом є консенсусним варіабельним доменом людини або містить консенсусний варіабельний домен людини.

Відповідно до іншого варіанта здійснення зв'язувальний білок за винаходом, зазначена акцепторна каркасна ділянка людини містить щонайменше одну амінокислотну заміну каркасної області, де амінокислотна послідовність каркасної ділянки щонайменше на 65 95, наприклад, щонайменше на 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 або 99 95 ідентична послідовності зазначеної акцепторної каркасної ділянки людини і містить щонайменше 70 амінокислотних залишків, наприклад, щонайменше 75, 80 або 85 залишків, ідентичних зазначеній акцепторній каркасній ділянці людини.

Відповідно до конкретного варіанта здійснення, зв'язувальний білок за винаходом містить щонайменше один варіабельний домен з мутованою каркасною ділянкою, що має

Зо амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається 3:

ЗЕО ІО МО: 47, 48,49, 50 (МН-домен), і/або вибрану з групи, що складається 3:

ЗЕО ІЮ МО: 51, 52, 53 і 54 (МІ -домен).

Зокрема, зазначений зв'язувальний білок містить два необов'язково мутовані у каркасній ділянці варіабельні домени, де зазначені два варіабельні домени мають амінокислотні послідовності, вибрані з груп, що складаються з:

ЗЕОІЮ МО: 47 1і44:47145;47146:547151;47 152; 47 і 53; 47 і 54;

ЗЕОІЮ МО: 48144:48145;48146; 48151; 48 і 52; 48 і 53; 48 і 54;

ЗЕО ІЮО МО: 49 і 44; 49145; 49 і 46; 49 і 51; 49 і 52; 49 і 53; 49 і 54;

ЗЕОІЮ МО: 50144; 50145; 50146; 50151; 501 52; 50 1 53; 50 і 54;

Зв'язувальні білки за винаходом, описані в даному описі, здатні зв'язувати щонайменше одну мішень, вибрану з молекул КОМ.

Зокрема, білки здатні зв'язувати КОМ А людини і, необов'язково, одну додаткову молекулу

ЕОМ людини або собакоподібних мавп, щура, курки, жаби і риби.

Наприклад, білки можуть додатково зв'язуватися з КОМ А щура, КОМ С людини і/або ЕСМ

С щура.

Зокрема, зв'язувальний білок за винаходом здатний модулювати, зокрема, здатний нейтралізувати або інгібувати біологічну функцію мішені, вибраної з молекул КОМ, визначених вище.

Зокрема, зв'язувальний білок за винаходом модулює, зокрема, інгібує здатність КОМ зв'язуватися щонайменше з одним з його рецепторів, наприклад Неогеніном і ВМР, таким як

ВМР-2 і ВМР-4.

Наприклад, зазначений зв'язувальний білок модулює, зокрема, зменшує і, переважно, інгібує щонайменше одну з наступних взаємодій: зв'язування КОМ А людини з ВМР-4 людини, зв'язування НКОМ А з Неогеніном людини, зв'язування НКОМ С з Неогеніном людини, зв'язування КОМ А людини з ВМР-2 людини.

Зв'язувальні білки з різними комбінаціями функціональних ознак і, отже, демонструючі різні функціональні характеристики, як описано в даному описі, входять у рамки даного винаходу.

Необмежувальні приклади таких характеристик наведені в списку нижче. 00000000 Характеристики./////7777771111111111С

Ознака (11213141 51617|8|9 ог 12113114 |15116|17|18|19 20121 | 22

Зв'язування з КОМ А вва ТТ ня ня в ня ня ня ня ня ня ня ня щура

Зв'язування з КОМ С пд

Зв'язування з КОМ С ше

Інгібування зв'язування НКОМ А зі -- нин не и и Не Ше Не чи ес М М В В ВТ ВТ В В В ВО В

Неогеніном людини

Інгібування зв'язування НКОМ С зі -- ня ІІІ

Неогеніном людини

Інгібування зв'язування ПКОМА зі | | | | я

ВМР-2 людини

Інгібування зв'язування ПКОМА зі | | | | я

ВМР-4 людини

Наприклад, характеристика 1 зустрічається у випадку антитіла 5Е9, описаного в даному винаході, і його похідних, описаних у даному описі.

Наприклад, характеристика 2 зустрічається у випадку антитіла 801, описаного в даному винаході, і його похідних, описаних у даному описі.

Зокрема, зв'язувальний білок за винаходом здатний інгібувати щонайменше одну біологічну активність КОМ, зокрема КОМ А, де зазначений КОМ А вибраний з КОМ А людини, собакоподібних мавп, щура, курки, жаби і риби.

Відповідно до іншого варіанта здійснення, зв'язувальний білок за винаходом має одну або декілька з наступних кінетичних ознак: (а) константу швидкості асоціації (Кол) для зазначеної мішені, вибрану з групи, що складається 3: щонайменше приблизно 102М"с!; щонайменше приблизно 1093М'"с7; щонайменше приблизно 10"М"с"; щонайменше приблизно 105М7"с"; щонайменше приблизно 106М7с7, ї щонайменше приблизно 107М"с", як виміряно способом резонансу поверхневих плазмонів; (Б) константу швидкості дисоціації (Ко для зазначеної мішені, вибрану з групи, що складається з: найбільше приблизно 102с7"; найбільше приблизно 103с7; найбільше приблизно 10207; найбільше приблизно 10507, найбільше приблизно 10507, як виміряно способом резонансу поверхневих плазмонів; або (с) константу дисоціації (Ко) для зазначеної мішені, вибрану з групи, що складається з: найбільше приблизно 10- М; найбільше приблизно 108 М; найбільше приблизно 109 М; найбільше приблизно 1079 М; найбільше приблизно 107! М; найбільше приблизно 1072 М і найбільше приблизно 10-13 М.

Відповідно до додаткового аспекту, винахід стосується конструкції антитіла, що містить вищеописаний зв'язувальний білок, причому зазначена конструкція антитіла містить лінкерний

Зо поліпептид або константний домен імуноглобуліну.

Зазначена конструкція антитіла або зв'язувальний білок за винаходом можуть бути вибрані з групи, що складається з: молекули імуноглобуліну, моноклонального антитіла, химерного антитіла, СОК-щепленого антитіла, гуманізованого антитіла, Бар, Бар, (ав)», Бм, дисульфідзв'язаного Ем, 5сЕм, однодоменного антитіла, діатіла, мультиспецифічного антитіла, антитіла з подвійною специфічністю, імуноглобуліну з двома варіабельними доменами і біспецифічного антитіла.

У конструкції антитіла за винаходом зазначений зв'язувальний білок містить константний домен важкого ланцюга імуноглобуліну, вибраний із групи, що складається з:

константного домену ІДМ людини, константного домену дО людини, константного домену ІдДО2 людини, константного домену ДОЗ людини, константного домену ІдОш4 людини, константного домену ІДЕ людини, константного домену ІдО людини, константного домену ІдАЇ людини, константного домену ІдА2 людини, константного домену ІдХУ людини і відповідних мутованих константних доменів.

Зокрема, конструкція антитіла за винаходом містить константний домен імуноглобуліну з амінокислотною послідовністю, вибраною з групи, що складається з 5ЕО ІЮО МО: 11, 12, 13 і 14.

Відповідно до іншого аспекту даний винахід стосується кон'югата антитіла, що містить описану в даному документі конструкцію антитіла, причому зазначене антитіло додатково містить засіб, вибраний із групи, що складається з: молекули імуноадгезії, засобу візуалізації, терапевтичного засобу і цитотоксичного засобу, причому кожен засіб є кон'югованим, наприклад ковалентно зв'язаним, із зазначеним зв'язувальним білком.

Наприклад, зазначеним засобом є засіб візуалізації, вибраний із групи, що складається з радіоактивної мітки, ферменту, флуоресцентної мітки, люмінесцентної мітки, біолюмінесцентної мітки, магнітної мітки і біотину. Зокрема, зазначеним засобом візуалізації є радіоактивна мітка, вибрана з групи, що складається з: ЗН, 17С, 355, 50, 99То, 11, 125|, 191, 177| у, 1686Но і 1535т.

Наприклад, зазначений засіб є терапевтичним або цитотоксичним засобом, вибраним із групи, що складається з: антиметаболіту, алкілувального засобу, антибіотика, фактора росту, цитокіну, антиангіогенного засобу, антимітотичного засобу, антрацикліну, токсину й апоптотичного засобу.

Відповідно до іншого варіанта здійснення, зазначений зв'язувальний білок за винаходом, як визначено в даному описі, має характер глікозилування, характерний для людини.

Крім того, зв'язувальні білки, конструкції антитіл і кон'югат антитіла за винаходом можуть

Зо знаходитися у вигляді кристала (у кристалічній формі), переважно, зі збереженням біологічної активності.

Зокрема, зазначений кристал являє собою фармацевтичний кристал, який не містить носія з контрольованим вивільненням. Завдяки зазначеній кристалічній формі зв'язувальний білок, конструкція антитіла або кон'югат антитіла може мати більший час напівжиття іп мімо, ніж відповідна розчинна копія.

В іншому аспекті винахід стосується виділеної нуклеїнової кислоти, що кодує амінокислотну послідовність зв'язувального білка, амінокислотну послідовність конструкції антитіла й амінокислотну послідовність кон'югата антитіла, як визначено в даному описі.

Даний винахід також стосується вектора, що містить виділену нуклеїнову кислоту, описану в даному розкритті. Зокрема, вектор вибраний із групи, що складається з рсОМА, ртТт, рт,

РЕЕВО5, рВУ, рум і рВу.

Винахід також стосується клітини-хазяїна, що містить такий вектор. Зокрема, зазначена клітина-хазяїн є прокаріотичною клітиною, наприклад Е.соїї, або еукаріотичною клітиною і може бути вибрана з групи, що складається з клітини одноклітинного організму, клітини тварини, клітини рослини і грибної клітини. Зокрема, зазначеною еукаріотичною клітиною є клітина тварини, вибрана з групи, що складається з: клітини ссавця, клітини птаха і клітини комахи.

Переважно, зазначена клітина-хазяїн вибрана із клітин НЕК, клітин СНО, клітин СОЗ5 і клітин дріжджів. Клітиною дріжджів може бути Засспаготусез сегемізіає, а клітиною комахи може бути клітина 509.

Винахід також стосується способу одержання білка, здатного зв'язувати КОМ, який передбачає культивування клітини-хазяїна, визначеної в даному описі, у культуральному середовищі при умовах, достатніх для одержання зв'язувального білка, здатного зв'язувати вам.

Винахід також стосується білка, одержуваного відповідно до зазначеного способу.

Винахід також стосується композиції для вивільнення зв'язувального білка, причому зазначена композиція містить (а) композицію, де зазначена композиція містить кристалізований продукт-білок, визначений у даному описі, і інгредієнт; і (Б) щонайменше один полімерний носій.

Зазначеним полімерним носієм може бути полімер, вибраний із групи, що складається з: полі(акрилової кислоти), полі(ціаноакрилатів), полі(амінокислот), полі(ангідридів), полі(депсипептиду), полі(ефірів), полі(молочної кислоти), полі(співполімеру молочної і гліколевої кислот) або РІ СА, полі(Ь-гідроксибутирату), полі(капролактону), полі(діоксанону); полі(етиленгліколю), полі(гідроксипропіл)метакрилату, поліКкоргано)фосфазену), полі(ортоефірів), полівінілового спирту), полі(вінілпіролідону), співполімерів малеїнового ангідриду й алкілвінілового ефіру, плюронікових поліолів, альбуміну, альгінату, целюлози і похідних целюлози, колагену, фібрину, желатину, гіалуронової кислоти, олігосахаридів, глікаміногліканів, сульфатованих полісахаридів, їх сумішей і співполімерів.

Зазначений інгредієнт може бути вибраний із групи, що складається з альбуміну, сахарози, трегалози, лактиту, желатину, гідроксипропіл-В-циклодекстрину, метоксиполіетиленгліколю і поліетиленгліколю.

Відповідно до іншого аспекту, винахід стосується способу лікування ссавця, який передбачає стадію введення ссавцю ефективної кількості композиції, визначеної в даному описі.

Відповідно до іншого аспекту, винахід стосується фармацевтичної композиції, що містить продукт (зокрема зв'язувальний білок, конструкцію або кон'югат, описані вище) і фармацевтично прийнятний носій.

Зазначений фармацевтично прийнятний носій може функціонувати як ад'ювант, який можна використовувати для збільшення абсорбції або дисперсії зазначеного зв'язувального білка.

Наприклад, зазначеним ад'ювантом є гіалуронідаза.

Відповідно до іншого варіанта здійснення, зазначений фармацевтичний препарат додатково містить щонайменше один додатковий терапевтичний засіб для лікування порушення, у якому активність КОМ діє негативно. Наприклад, зазначений засіб вибраний із групи, що складається з терапевтичного засобу, засобу візуалізації, цитотоксичного засобу, інгібіторів ангіогенезу; інгібіторів кінази; блокаторів молекул костимуляції; блокаторів молекул адгезії; анти-цитокін- антитіла або його функціонального фрагмента; метотрексату; циклоспорину; рапаміцину;

ЕК5БОб; детектованої мітки або репортера; антагоніста ТМЕ; протиревматичного засобу; міорелаксанту, наркотичного засобу, нестероїдного протизапального лікарського засобу

Зо (МЗАІЮ), аналгезуючого засобу, анестетичного засобу, седативного засобу, місцевого анестетика, нейром'язового блокатора, протимікробного засобу, антипсоріатичного засобу, кортикостероїду, анаболічного стероїду, еритропоетину, імунізуючого засобу, імуноглобуліну, імуносупресивного засобу, гормону росту, засобу замісної гормональної терапії, радіофармацевтичного препарату, антидепресанту, антипсихотичного засобу, стимулятора, протиастматичного засобу, бета-агоніста, інгальовного стероїду, епінефрину або його аналога, цитокіну й антагоніста цитокіну.

Даний винахід також стосується способу зменшення активності КОМ А людини, який передбачає контактування КОМ А людини щонайменше з одним продуктом (зокрема зв'язувальним білком, конструкцією або кон'югатом, описаними в даному описі вище) так, що зменшується щонайменше одна активність КОМ А людини.

Даний винахід також стосується способу зменшення зв'язування ПЕОМ А з рецептором

Неогеніном у індивіда, за необхідності, який передбачає стадію введення індивіду продукту за винаходом (зокрема зв'язувального білка, конструкції або кон'югата, описаних у даному описі вище).

Даний винахід також стосується способу зменшення зв'язування ПКОМ А з морфогенетичним білком кістки 2 і/або морфогенетичним білком кістки 4 (ВМР-2 і ВМР-4) у індивіда, за необхідності, який передбачає стадію введення індивіду продукту за винаходом (зокрема зв'язувального білка, конструкції або кон'югата, описаних у даному описі вище).

Даний винахід також стосується способу лікування порушення, пов'язаного з активністю

БО КОМ А у індивіда, який передбачає стадію введення одного або в комбінації з іншими терапевтичними засобами продукту за винаходом (зокрема зв'язувального білка, конструкції або кон'югата, описаних у даному описі вище).

Даний винахід також стосується способу зменшення активності КОМ А у індивіда, що страждає порушенням, при якому активність КОМ А здійснює негативний вплив, який передбачає введення індивіду продукту за винаходом (зокрема зв'язувального білка, конструкції або кон'югата, описаних у даному описі вище), одного або в комбінації з іншими терапевтичними засобами.

Зазначене порушення переважно включає неврологічні захворювання, вибрані з групи, що складається з бічного аміотрофічного склерозу, ушкодження плечового сплетіння, ушкодження 60 головного мозку, у тому числі травматичного ушкодження головного мозку, церебрального паралічу, хвороби Гійєна-Барре, лейкодистрофій, розсіяного склерозу, поствакцинального поліомієліту, 5ріпа Бійда (щілини хребта), ушкодження спинного мозку, спінально-м'язової атрофії, спінальних пухлин, інсульту, поперечного мієліту; деменції, сенільної деменції, легкого когнітивного порушення, пов'язаної з хворобою Альцгеймера деменції, хореї Хантінітона, пізньої дискінезії, гіперкінезій, маній, хвороби Паркінсона, синдрому Стіла-Річардсона, синдрому Дауна, важкої псевдопаралітичної міастенії, травми нерва, судинного амілоїдозу, крововиливу І у головний мозок з амілоїдозом, запалення головного мозку, гострого порушення зі сплутаністю свідомості, бічного аміотрофічного склерозу, глаукоми і хвороби Альцгеймера.

Інші конкретні варіанти за винаходом визначені нижче: виділений зв'язувальний білок, який специфічно взаємодіє щонайменше з одним епітопом білка НЕБОМ А; зазначений виділений білок, який є моноклональним нейтралізуючим антитілом або його антигензв'язувальним фрагментом; зазначений антигензв'язувальний фрагмент, що містить домен МН і Мі; зазначене нейтралізуюче антитіло, яке зменшує здатність ПКОМ А зв'язуватися з його рецептором; зазначене нейтралізуюче антитіло, здатне інгібувати біологічну активність ПЕОМ А; зазначене антитіло, яке розпізнає рецептор КОМ А, вибраний з рецептора КОМ А людини, собакоподібних мавп, щура, курки, жаби і риби; зазначене антитіло, яке розпізнає білок КОМ А, амінокислотна послідовність якого на 90 95 гомологічна амінокислотній послідовності ЗЕО ІЮ МО:2; зазначене антитіло, де білк КОМ А кодує нуклеїнова кислота, яка на 90 95 гомологічна послідовності нуклеїнової кислоти ЗЕО ІЮ МО:1; зазначене антитіло, яке щонайменше на 90 95 ідентичне амінокислотній послідовності з послідовністю, яка містить варіабельну область важкого ланцюга (область МН), що містить послідовність ЗЕО ІЮ МО:9 або 34, або гуманізовану, необов'язково, додатково мутовану версію зазначеної області МН; зазначене антитіло, яке щонайменше на 90 95 ідентичне амінокислотній послідовності з послідовністю, яка містить варіабельну область легкого ланцюга (область МІ), що містить

Ко) послідовність ЗЕО ІЮ МО:10, або гуманізовану, необов'язково, додатково мутовану версію зазначеної області МІ, зазначене антитіло, яке зв'язується з ПКОМ А, де це антитіло є глікозилованим; зазначене антитіло або антигензв'язувальний фрагмент, де зазначене антитіло або антигензв'язувальний фрагмент є мишачим антитілом, гуманізованим антитілом, повністю людським антитілом, химерним антитілом, антигензв'язувальним фрагментом гуманізованого антитіла або антигензв'язувальним фрагментом химерного антитіла; зазначене антитіло або антигензв'язувальний фрагмент, де зазначене антитіло або антигензв'язувальний фрагмент є антигензв'язувальним фрагментом, вибраним із групи, що складається з Гар-фрагмента, Бар'-фрагмента, Е(ар)2-фрагмента і Ем-фрагмента; зазначене моноклональне антитіло, яке специфічно зв'язується щонайменше з одним епітопом КОМ А, де зазначене моноклональне антитіло є моноклональним антитілом, секретованим гібридомною клітинною лінією, описаною в даному документі; зазначене моноклональне антитіло, зв'язування з яким приводить до інактивації взаємодії

КОМ А з його рецептором; зазначена гібридомна клітинна лінія, яка продукує моноклональне антитіло, що специфічно зв'язується щонайменше з одним епітопом ЯНКОМ А; зазначена гібридомна клітинна лінія, де гібридома вибрана з групи, що складається з гібридоми людини, миші, щура, вівці, свині, великої рогатої худоби, кози і коня; зазначене моноклональне антитіло, зв'язування з яким приводить до інактивації ПКОМ А; зазначена гібридомна клітинна лінія, яка продукує моноклональне антитіло, що специфічно зв'язується щонайменше з одним епітопом ЯНКОМ А; зазначена гібридомна клітинна лінія, де гібридома вибрана з групи, що складається з гібридоми людини, миші, щура, вівці, свині, великої рогатої худоби, кози і коня; зазначене моноклональне нейтралізуюче антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, що має щонайменше одну характеристику, вибрану з групи, яка складається 3: а) зв'язування з КОМ А ссавця з афінністю в діапазоні нМ або менше; р) функціональної протидії активності КОМ А іп міїго в аналізі росту нейритів з ефективністю

МКМ, НМ або меншою; с) індукції іп мімо спрутингу (росту нервових волокон) у моделі роздавлювання зорового

Гс10) нерва;

а) індукції іп мімо спрутингу в моделі ушкодження спинного мозку; є) полегшення іп мімо експериментального ушкодження спинного мозку посиленням регенеративного росту ушкоджених нервових волокон, або

Ї) полегшення іп мімо експериментального ушкодження спинного мозку посиленням утворення синапсів; виділена нуклеїнова кислота, що кодує зазначене моноклональне нейтралізуюче антитіло або антигензв'язувальний фрагмент; вектор, що містить зазначену виділену нуклеїнову кислоту; зазначений вектор, вибраний із групи, що складається з рсоМА; ртТТт; рТТ3; рРЕЕВО5; рвУ; руУМ; РНУБЕ і рву; клітина-хазяїн, трансформована зазначеним вектором, де клітина-хазяїн вибрана із групи, що складається з клітини одноклітинного організму, клітини тварини, клітини рослини і грибної клітини; зазначена клітина-хазяїн, де клітиною тварини є клітина ссавця, вибрана з групи, що складається з НЕК293, СНО і СО5; клітина-хазяїн, трансформована вектором, де клітиною-хазяїном є еукаріотична клітина; спосіб одержання зв'язувального білка, що зв'язує ПЕОМ А, який передбачає культивування клітини-хазяїна в культуральному середовищі при умовах, достатніх для одержання зв'язувального білка, що зв'язує ПЕОМ А; фармацевтична композиція, яка містить зазначене моноклональне антитіло або антигензв'язувальну частину і фармацевтично прийнятний носій; спосіб зменшення зв'язування ПЕСМ А з рецептором Неогеніном у індивіда, за необхідності, який передбачає стадію введення індивіду зазначеного антитіла; спосіб зменшення зв'язування ПКОМ А з оморфогенетичним білком кістки 2 і морфогенетичним білком кістки 4 (ВМР-2 і ВМР-4) у індивіда, за необхідності, який передбачає стадію введення індивіду зазначеного антитіла; спосіб лікування порушення, пов'язаного з активністю КОМ А індивіда, який передбачає стадію введення зазначеного антитіла, одного або в комбінації з іншими терапевтичними засобами;

Зо спосіб зменшення активності КОМ А у індивіда, що страждає порушенням, при якому активність КОМ А здійснює негативний вплив, який передбачає введення індивіду зазначеного антитіла, одного або в комбінації з іншими терапевтичними засобами; зазначене антитіло, яке містить щонайменше одну область МН, що містить амінокислотну послідовність, вибрану з БЕО ІЮ МО: 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42 і 43; зазначене антитіло, яке містить щонайменше одну область Мі, що містить амінокислотну послідовність, вибрану з 5БЕО ІЮ МО: 44, 45 і 46; зазначене антитіло, додатково модифіковане 1-5 мутаціями в послідовності МН або Мі; зазначене антитіло, де ці мутації вибрані зі зворотних мутацій каркасної ділянки і мутацій

Мепіег і МНЛ/І -суміжних залишків.

Будь-яке указання на 5ЕО ІО МО: 34 або будь-яке посилання на 5ЕО ІЮ МО: 34, описане в даному документі, також стосується 5ЕО ІЮ МО:9.

На фігурі 1А показане зв'язування моноклональних антитіл з НКОМ А в аналізі ЕГ ІА.

На фігурі 18 зображене зв'язування моноклональних антитіл з ПКОМ А, експресованим у клітинах НЕК 293.

На фігурі 1С зображене зв'язування моноклональних антитіл з КОМ А щура, експресованим у клітинах НЕК 293.

На фігурі 2 показане зв'язування повнорозмірного ЕОМ А з Неогеніном. МАВ 5БРЕ9 інгібує зв'язування повнорозмірного їс-зв'язаного ПКОМ А з Неогеніном.

На фігурі З зображене зв'язування повнорозмірного КСМ А з ВМР-4. МАВ 5Б9 інгібує зв'язування їс-зв'язаного фрагмента (47-422) повнорозмірного НКОМ А з ВМР-4.

На фігурі 4 зображене зв'язування фрагмента 0 КОМ А з ВМР-4. МАВ 5Б9 інгібує зв'язування їс-зв'язаного фрагмента 0 (47-168) з ВМР-4.

На фігурі 5 показане зв'язування повнорозмірного ЕОМ А з ВМР-2. МАВ 5Б9 інгібує зв'язування їс-зв'язаного фрагмента повнорозмірного НКОМ А (47-422) з ВМР-2.

На фігурі 6 представлене об'єднання мікрофотографій, що показують тАЬ5РоО-нейтралізацію фрагмента КОМ А в аналізі росту нейритів клітин Мега. МАВ 5Е9 нейтралізує інгібуючу ріст активність їс-кон'югованого, сильного інгібувального фрагмента ПКОМ А в аналізах росту нейритів з агрегатами Мега людини. А. Контрольна культура, ріст нейронів Мега на ламініні В, на субстраті ламінін-фФрагмент ЯКОМ А (47-168), С-Е, на субстраті ламінін-фрагмент НИКОМ А бо (47-168) у присутності ОД мкг/мл МАВ 5РЗ9 (С), 1 мкг/мл МАВ 5Е9 (0), 10 мкг/мл МАВ 5Е9 (Е).

На фігурі 7 показаний кількісний аналіз результатів аналізу Мега-2. МАВ 5Е9 нейтралізує залежним від дози чином інгібуючу ріст активність їс-кон'югованого, сильного інгібувального фрагмента НКОМ А (фрагмента 0, 47-168) в аналізах росту нейритів з агрегатами Міега людини.

На фігурі 8 показаний кількісний аналіз тесту зі смугами 5Н-5У5У. МАВ 5Е9 нейтралізує відштовхування, індуковане смугами, що складаються з повнорозмірного КОМ А людини нейронних клітин ЗН-5У5У людини в смугастих покриттях мембран. За відсутності МАВ 5Е9 (А) або в присутності низьких концентрацій МАВ нейрони ЗН-5У5У віддають перевагу уникненню

КОМ А-смуг. Ця поведінка приводить до збільшення концентрацій МАВ 59. (8-0). При найвищій концентрації МАВ (10 мкг/мл) (Е), нейрони ЗН-5У5У виявляють сильну перевагу відносно смуг КОМ А в порівнянні зі смугами Колагену І.

На фігурі 9 підсумований кількісний аналіз характеристик зв'язування тАВ:5 5Е9 і 801. МАВ 5Е9 ії 801 оцінювали в аналізах зв'язування ПКОМ А - неогенін, НКОМ А - ВМР-2 і НКОМ А -

ВМР-4 при різних концентраціях.

На фігурі 10 показана нейтралізуюча активність відносно хемовідштовхувальної активності гуманізованих антитіл 5Е9 (п5Е9.21, п5Е9.23, П5Е9.25) в аналізі хемотаксису БН-5У5У.

На фігурі 11 показана іп мімо нейрорегенеративна активність локального нанесення 5Е9 на моделі ушкодження зорового нерва тварини. Локальне нанесення МАВ 5Е9 нейтралізує КОМА і стимулює регенеративний ріст аксонів ушкодженого зорового нерва в моделі роздавлювання зорового нерва тварини (щура). В оброблених 5Е9 тваринах (А), багато які САР-43-позитивні волокна подовжуються за межі ділянки роздавлювання на відміну від контрольного МАВ 801 (В), що не зв'язується з КОМ А щура.

Фігури 12А і 128 показаний кількісний аналіз локального нанесення 5Е9 у моделі ушкодження зорового нерва тварини. (А) 5Е9, але не контрольне МАВ 801, значно збільшувало кількість ЗАР-43-позитивних волокон, що регенеруються. Значимо більше волокон (р«0,05) спостерігали у тварин, оброблених 5Е9, при відстанях 200 мкм, 400 мкм і 600 мкм, а при 1200 мкм волокна виявляли тільки в 5РО-оброблених тварин, але не у контрольних тварин. (В) 5Е9 значно збільшувало (СЗАР-43-позитивну площу в ділянці ушкодження зорового нерва в порівнянні з контрольним антитілом 801 і контролем-носієм ЗФР. Площу регенеративного росту (САР-43-позитивну площу) вимірювали з використанням програмного забезпечення Ахіомівіоп боїмаге (76155).

На фігурі 13 показана іп мімо нейрорегенеративна активність системного застосування 5Е9 на моделі ушкодження зорового нерва тварини. Тварин обробляли 5Е9 на день 0 і день 21 з використанням 2 мг/кг і 10 мг/кг, відповідно. Антитіло або носій вводили внутрішньоочеревинно або внутрішньовенно. Показані об'єднані зображення зорових нервів щурів. В оброблених 5Е9 тваринах (А), численні ЗСАР-43-волокна подовжувалися за межі ділянки руйнування на відміну від контрольних тварин, оброблених ЗФР (В). Ділянка роздавлювання локалізована в лівому краї і регенеруючі волокна забарвлені антитілом проти (САР-43. Численні волокна спостерігаються у верхньому і нижньому краї зорового нерва в оброблених 5Е9 тваринах, але не в оброблених ЗФР тваринах.

На фігурі 14А ї на фігурі 14В показаний кількісний аналіз системного застосування 5Е9 у моделі ушкодження зорового нерва тварини.

На фігурі 15 показана активність повторної мієлінізації (ремієлінізації) іп ммо системного застосування 59 на моделі ушкодження зорового нерва тварини. Тварин обробляли 5Е9 на день 0 їі день 21 з використанням 2 мг/кг ії 10 мг/кг, відповідно. Антитіло або носій вводили внутрішньоочеревинно або внутрішньовенно. Показані об'єднані зображення зорових нервів щурів. Мієлінізацію візуалізують з використанням антитіла, спрямованого проти маркера мієліну, базального білка мієліну МВР. Ділянки роздавлювання розташовані в середині оброблених нервів і ця зона є вільною в оброблених носієм контрольних тваринах (А і В). В оброблених 5РЕ9 тваринах (С і ОЮ), спостерігаються численні МВР-позитивні структури в середній зоні (центрі роздавлювання) зорових нервів.

На фігурі 16 показана кількісна дія ремієлінізації системного застосування 5Е9 на моделі ушкодження зорового нерва тварини.

Даний винахід стосується КОМ А-зв'язувальних білків, більш конкретно, моноклональних

КОМ А-антитіл, зокрема гуманізованих моноклональних КОМ А-антитіл, або їх антигензв'язувальних частин, що зв'язують КОМ А. Різні аспекти цієї заявки стосуються антитіл і фрагментів антитіл і їх фармацевтичних композицій, а також нуклеїнових кислот, рекомбінантних експресуючих векторів і клітин-хазяїнів для одержання таких антитіл і фрагментів. Способи застосування антитіл за винаходом для детектування КОМ А людини; для нейтралізації КОМ людини і/або активності КОМ А людини, іп мімо або іп міїго, і для регуляції 60 експресії генів також включені в даний винахід.

1. Загальні визначення.

Якщо немає іншого визначення, наукові і технічні терміни, використовувані в даному винаході, будуть мати значення, які відомі фахівцям зі звичайною кваліфікацією в даній галузі.

Значення й обсяг цих термінів зрозумілі, однак, у випадку будь-якої невизначеності, визначення, представлені в даному описі, повинні враховуватися в першу чергу в порівнянні зі словниковим або іншими визначеннями. Крім того, якщо контекст не вимагає іншого, терміни в однині повинні включати і множину, а терміни в множині включають і однину. У цій заявці, використання слова "або" означає "і/або", якщо немає іншої вказівки. Крім того, використання терміна "який включає", а також інших форм, таких як "включає" і "включені", не є обмежувальним. Терміни, такі як "елемент" або "компонент", включають як елементи і компоненти, що містять одну одиницю, так і елементи і компоненти, що містять більше однієї субодиниці, якщо немає іншої вказівки.

Звичайно, номенклатура і способи, використовувані відносно культури клітин і тканини, молекулярної біології, імунології, мікробіології, генетики і хімії білків і нуклеїнових кислот і гібридизації, використовувані в даному описі, є добре відомі і звичайно використовуваними в даній галузі Методи і способи за винаходом звичайно здійснюють відповідно до загальноприйнятих способів, добре відомих в даній галузі й описаних в різних загальних і більш конкретних посиланнях, які цитуються й розкриті в описі, якщо немає інших вказівок.

Ферментативні реакції і способи очищення проводять відповідно до описів виготовлювача, як звичайно здійснюється в даній галузі або як представлено в даному описі. Лабораторні процедури і способи аналітичної хімії, синтетичної органічної хімії і медичної і фармацевтичної хімії, використовувані в даному описі, і номенклатури, використовувані в зв'язку з ними, добре відомі і звичайно використовуються в даній галузі. Стандартні способи використовуються для хімічних синтезів, хімічних аналізів, одержання фармацевтичних засобів, одержання композицій і їх доставки і лікування пацієнтів.

Для більшої ясності даного винаходу вибрані терміни визначені нижче.

Термін "поліпептид" стосується в контексті даного опису полімерного ланцюга амінокислот.

Терміни "пептид" і "білок" використовуються взаємозамінно з терміном поліпептид і також стосуються полімерного ланцюга амінокислот. Термін "поліпептид" включає природні або штучні

Ко) білки, фрагменти білків і поліпептидні аналоги білкової послідовності. Поліпептид може бути мономерним або полімерним.

Термін "виділений білок" або "виділений поліпептид" означає білок або поліпептид, який внаслідок його походження або джерела одержання не зв'язаний з компонентами, що зустрічаються в природі, які оточують його в природному стані; по суті вільний від інших білків того ж виду; експресується клітиною іншого виду або не зустрічається в природі. Таким чином, поліпептид, який хімічно синтезований або синтезований у клітинній системі, що відрізняється від клітини, з якої він природно походить, буде "виділеним" з його природних компонентів. Білок може бути також одержаний по суті вільним від його природних компонентів за допомогою виділення з використанням способів очищення білків, добре відомих у даній галузі.

Термін "виділення" стосується в контексті даного опису способу одержання хімічної молекули, такої як поліпептид, по суті вільної від природних компонентів за допомогою виділення, наприклад, з використанням способів очищення білків, добре відомих у даній галузі.

Термін "КОМ А людини" (скорочуваний в даному описі як ПЛКОМ А), що стосується з'єднаного з глікозилфосфатидилінозитом (дрі) глікопротеїну з 450 амінокислотами, був вперше описаний як репелент росту нейритів або інгібітор росту нейритів під час розвитку топографічних виступів (виростів) (е2Фапі еї а. Мешигоп 5: 735-43, 1990; МиеїІег, іп МоіІесшаг Вавів ої Ахоп Сто апа Мег/е Райегп Еоптаїйоп, Едієйа Бу Н. Ецііззамжа, дарап Зсієпійіс Босієїіє5

Рге55, 215-229, 1997). Сімейство генів гдт включає три різних гени, два з них, дтайїь, експресуються в ЦНС ссавців, тоді як третій член, гдт с, експресується в периферії (МиеїІег еї аІ.,, Рпйо5. Тгап5. К. об. Г опа. В Віої. 5сі. 361:1513-29, 2006), де він відіграє важливу роль у метаболізмі заліза. Біл. ЕОМ людини мають ідентичність послідовності 43-50 95; гомологія амінокислот КОМ А людини і щура дорівнює 8995. Білюи КОМ людини не мають значної гомології з послідовністю інших відомих білків. Вони є багатими проліном білками, що містять область КОЮ, і мають структурну гомологію з доменом фактора Фон-Віллебранда і розщеплюються при М-кінцевій амінокислоті 168 невідомою опротеазою з утворенням функціонально активного білка (Миеїег єї аї., Рпйо5. Тгап5. К. боб. І опа. В Віої. сі. 361: 1513- 29, 2006).

Іп міго КОМ А інгібує ріст нейриту (аксона) при пікомолярних концентраціях за допомогою зв'язування з Неогеніном, який був ідентифікований як рецептор КОМ (Каїіадораїап еї аї. Маї 60 Сеї! Вісі: 6(8), 756-62,2004). Неогенін був спочатку описаний як нетринзв'язувальний білок

(Кеіпо-Ма:зи еї аї. СеїІ, 87(2): 175-85, 1996), але його афінність відносно Нетрину (Ко 2 нМ) є на порядок величин більш низкою, ніж відносно КОМ (Ко 0,2 нМ) (Каіадораїйап еї аї. Маї Сеї! Віої.: 6(8), 756-62, 2004). Це є важливим відкриттям, оскільки повідомлялося, що зв'язування

Нетрину-1 з Неогеніном або з його близькоспорідненим рецептором ССС (делетованим у колоректальному раку) стимулювало, а не інгібувало ріст нейритів (Вгаїєтей еї аї. У). Меншговбоі. 20: 5792-801, 2000).

Поряд зі зв'язуванням КОМ А з Неогеніном і індукцією інгібування росту нейритів, зв'язування КОМ А або В з морфогенетичними білками кістки ВМР-2 і ВМР-4 могло представляти іншу перешкоду успішній нейрорегенерації і функціональному відновленню (МиепПег еї аїІ., Рийо5, Тгап5. К. бос. Г опа. В Віої. сі. 361:1513-29, 2006). Повідомлялося, що обидва класи білків (Неогенін і ВМР) трансдукують інгібуючий ріст нейритів сигнал КОМ А через зовсім різні і незалежні шляхи трансдукції сигналів. Звичайно, експресія цих білків ВМР є відносно низкою в більшості областей ЦНС дорослих, але повідомлялося, що вона швидко збільшується в експресії і накопиченні деяких ВМР (наприклад, ВМР-2, ВМР-б, ВМР-7) у відповідь на ушкодження й інсульт (і аї еї аї., Меигогерогі 8: 2691-94, 1997; Мапіпе? сеї аї. Вгаїп

Вез. 894: 1-11, 2001; НаїЇ апа МіПег, у. Мешговсі. Нев. 76: 1-8, 2004; Зеюдисні єї а!., Ехр. Меийгої. 189: 33-44, 2004). Крім того, на моделі розсіяного склерозу, моделі експериментального аутоїмунного енцефаломієліту (ЕАЕ), ВМР-4, ВМР-б і ВМР-7/ підвищувальним чином регулювалися в спинному мозку миші (Ага еї аїЇ., 9. Меийгозсі. Ке5. 86: 125-35, 2008).

Повідомлялося, що ВМР-2 інгібував ріст нейритів зв'язуванням із клітинною поверхнею КОМ А,

ВМР-рецепторів І ї І ї прямою активацією І ІМ-кінази (Маїбзицига еї а. Віоспет Віорпу5 Кев

Соттип., 360: 868-73, 2007), і, отже, вважають, що блокування взаємодії ЕОМ А-ВМР-2 буде додатково збільшувати функціональне відновлення після ушкодження ЦНе.

Як згадувалося вище, у щурів з ушкодженням спинного мозку і людей з ушкодженням головного мозку були виявлені масивні накопичення клітинного КОМ у ділянці ушкодження, і характер забарвлення КОМ А у щурів у ділянці спинномозкового ушкодження дуже подібний з забарвленням рап КОМ-антитілом у людей, що передбачає, що велика частина рап КОМ- забарвлення у людей пов'язана з локалізацією КОМ А, а не з локалізацією КОМ В (Зспмаь єї а!., Агсп.

Зо Мештго!.б62: 1561-8, 2005а; 5спуаб єї аї. Єиг. У. Мешговсі. 21:1569-76, 2005 р; Наїа еї аї. 9. Сеї

Віої. 173:47-58, 2006). У головному мозку здорової людини, рап КОоМ-забарвлення (імунореактивність КОМ А і В) детектували на волокнах білої речовини, олігодендроцитах, перикаріонах деяких нейронів, деяких гладких м'язах судин і деяких ендотеліальних клітинах.

Забарвлення астроцитів не спостерігали. Характер забарвлення КОМ у головному мозку дорослих людей дуже подібний з характером забарвлення, спостережуваним в спинному мозку дорослого щура (Зспугар еї а. Еншг. у). Мешиговсі. 21:1569-76, 2005 р; Наїа 6вї а. 9. Сеї! Віої. 173:47- 58, 2006).

На основі накопичення КОМ А у ділянках ушкоджень в ушкодженні в головному мозку і спинному мозку внаслідок інгібуючої ріст клітинних нейритів активності, вважають, що цей білок виявляє інгібуючу ріст нейритів активність, і нейтралізація її антитілами або їх антигензв'язувальним фрагментом, що зв'язується щонайменше з одним епітопом КОМ А людини, може привести до поліпшеного повторного росту ушкоджених нервових волокон і до посилення функціонального відновлення в показаннях, характеризованих ушкодженням нервових волокон і накопиченням КОМ.

Якщо немає інших вказівок, термін "КОМ А" включає також молекули КОМ А, виділені або одержані з інших видів, наприклад гризунів, таких як миші або щури; конкретно, одержану з щура молекулу називають у даному описі "КОМ А щура".

Таблиця 1

СПИСОК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ МОЛЕКУЛ, ПОДІБНИХ З ВОМ А послідовності

ЗЕОІЮО МО: 1 послідовність ВОМ А людини

ЗЕОІО МО: З послідовність ВОМ А-їс людини

Таблиця 1

НВСМА ЗЕОІЮО МО: 6 людини ! !

ЗЕО ІЮО МО:5 Нуклеотидна послідовність ПКОМ А-легкого ланцюга-їс

ЗЕО ІЮ МО:7 послідовність КОМ А щура "Біологічна активність" стосується в контексті даного опису всіх невід'ємних біологічних властивостей КОМ А, визначених у даному описі.

Терміни "специфічне зв'язування" або "які специфічно зв'язуються", у контексті даного опису, при посиланні на взаємодію антитіла, білка або пептиду з другою хімічною молекулою, означають, що ця взаємодія залежить від присутності конкретної структури (наприклад, "антигенної детермінанти" або "епітопа", визначених нижче) на цій хімічній молекулі; наприклад, антитіло розпізнає специфічну структуру білка і зв'язується зі специфічною структурою білка, а не з білками взагалі. Якщо антитіло є специфічним відносно епітопа "А", присутність молекули, що містить епітоп А (або вільного, неміченого А), у реакції, що містить мічений "А" і це антитіло, буде зменшувати кількість міченого А, зв'язаного з цим антитілом.

Термін "антитіло", у контексті даного опису, у широкому розумінні стосується будь-якої молекули імуноглобуліну (Ід), що складається з чотирьох поліпептидних ланцюгів, двох важких (Н) ланцюгів і двох легких (І) ланцюгів, або її будь-якого функціонального фрагмента, мутанта, варіанта або похідного, котрі зберігають основні ознаки зв'язування епітопа молекули Ід. Такі мутантні, варіантні або похідні варіанти відомі в даній галузі. їх не обмежуючі винахід варіанти описані нижче. Говорять, що антитіло "здатне зв'язувати" молекулу, якщо воно здатне специфічно реагувати з цією молекулою зі зв'язуванням за допомогою цього даної молекули з цим антитілом.

Термін "моноклональне антитіло" означає в контексті даного опису препарат молекул антитіла, що мають загальну амінокислотну послідовність важкого ланцюга і загальну амінокислотну послідовність легкого ланцюга, на відміну від препаратів "поліклонального" антитіла, що містять суміш різних антитіл. Моноклональні антитіла можуть бути одержані декількома новими технологіями, такими як фаговий, бактеріальний, дріжджовий або рибосомний дисплей, а також класичними способами, прикладами яких є одержані з гібридом антитіла (наприклад, антитіло, секретоване гібридомою, одержаною гібридомною технологією, такою як стандартна гібридомна технологія Копіег апа Міїсїеіп пубгідота тейШодоїоду (1975)

Маїиге 256:495-497).

Зо У повнорозмірному антитілі, кожен важкий ланцюг складається з варіабельної області важкого ланцюга (скорочуваного в даному описі як НСМЕК або УН) і константної області важкого ланцюга. Константна область важкого ланцюга складається з трьох доменів, СНІ, СН2 і СНЗ.

Кожен легкий ланцюг складається з варіабельної області легкого ланцюга (скорочуваного в даному описі як ЇСМК або МІ) і константної області легкого ланцюга. Константна область легкого ланцюга складається з одного домену, СІ. Ці МН- і МІ-області можуть бути додатково підрозділені на області гіперваріабельності, називані областями, що визначають комплементарність (СОК), що чергуються з областями, які є більш консервативними, названими каркасними ділянками (ЕК). Кожна з МН і Мі складається з трьох СОК і чотирьох ЕК, розташованих від амінокінця до карбоксикінця в наступному порядку: ЕКТ, СОКІ, ЕК2, СОК2,

ЕКЗ, СОКЗ, ЕК4. Молекули імуноглобулінів можуть бути будь-якого типу (наприклад, Іде, ІДЕ,

І9М, Ід, ІдА і Ід), класу (наприклад, Іде, Ідса2, доз, Ідс4, ІдА1 і ІдДАг) або підкласу.

Термін "антигензв'язувальна частина" або " антигензв'язувальний фрагмент" антитіла (або просто "частина антитіла" або "фрагмент антитіла"), у контексті даного опису, стосується одного або декількох фрагментів антитіла, які зберігають здатність специфічно зв'язуватися з антигеном (наприклад, ПКОМ А). Було показано, що антигензв'язувальну функцію антитіл можуть виконувати фрагменти повнорозмірного антитіла. Такі варіанти антитіл можуть бути також біспецифічними, подвійно специфічними або мультиспецифічними форматами; можуть специфічно зв'язуватися з двома або більше різними антигенами. Приклади зв'язувальних фрагментів, охоплюваних терміном "антигензв'язувальна частина" антитіла включають (ії) Рар- фрагмент, моновалентний фрагмент, що складається з доменів МІ, МН, СІ. і СНІ; (ії) Р(ар)2- фрагмент, бівалентний фрагмент, що містить два ЕРабр-фрагменти, зв'язані дисульфідним містком у шарнірній області; (ії) Ба-фрагмент, що складається з МН- і СНІ-доменів; (їм) Ем- фрагмент, що складається з МІ- і МН-доменів антитіла з єдиним плечем, (м) аАрБ-фрагмент (Уага єї а!., (1989) Маїште 341:544-546, Уміпіег еї аі., РСТ-публікація УМО 90/05144 АТ, включені в даному описі за допомогою посилання), що містить єдиний варіабельний домен; і (мі) виділена область, що визначає комплементарність (СОК). Крім того, хоча ці два домени Ем-фрагмента,

МІ ї МН, кодуються роздільними генами; вони можуть бути з'єднані, з використанням рекомбінантних способів, синтетичним лінкером, що дозволяє їм бути одержаними у вигляді єдиного білкового ланцюга, у якому М- і МН-області з'єднуються з утворенням моновалентних молекул (відомих як одноланцюжкові Ем (зсЕм); див., наприклад, Віга еї аїЇ. (1988) Зсієпсе 242:423-426 і Низюп еї аї. (1988) Ргос. Май. Асад. Зсі ЮО5А 85:5879-5883). Передбачається, що такі одноланцюжкові антитіла також включені в термін "антигензв'язувальна частина" антитіла.

Інші форми одноланцюжкових антитіл, такі як діатіла, також входять у рамки цього терміна.

Діатіла є двовалентними, біспецифічними антитілами, у яких УН- і МІ -домени експресуються на єдиному поліпептидному ланцюзі, але використовують такий короткий лінкер, який є занадто коротким для можливості спарювання між двома цими доменами на одному і тому ж ланцюзі, змушуючи тим самим ці домени з'єднуватися з комплементарними доменами на іншому ланцюзі і створюючи два антигензв'язувальних сайти (див., наприклад, Ноїїїдег, Р, еї а. (1993) Ргос. Май.

Асад. сі ОБА 90:6444-6448; РоЦак, Ау., єї аїЇ. (1994) Зігписіше 2:1121-1123). Такі антигензв'язувальні частини відомі в даній галузі (Копіегптапп апа Юибеї еаз., Апіїбоду

Епдіпеетіпд (2001) 5ргіпдег!-Мегіад. Мем Могк. 790 рр. (ІЗВМ 3-540-41354-5).

Термін "конструкція антитіла" стосується в контексті даного опису поліпептиду, що містить одну або декілька антигензв'язувальних частин за винаходом, зв'язаних з лінкерним поліпептидом або константним доменом імуноглобуліну. Лінкерні поліпептиди містять два амінокислотні залишки або більше амінокислотних залишків, з'єднаних пептидними зв'язками, і використовуються для зв'язування однієї або декількох антигензв'язувальних частин. Такі лінкерні поліпептиди добре відомі в даній галузі (див., наприклад, Ноїїїдег, Р, еї аї!. (1993) Ргос.

Коо) Май. Асад. 5сі ОБА 90:6444-6448; Ро|ак, В.у., еї а. (1994) Бігисіцге 2:11121-1123). Константним доменом імуноглобуліну називають константний домен важкого ланцюга або константний домен легкого ланцюга. Амінокислотні послідовності константного домену важкого ланцюга і константного домену легкого ланцюга дос людини відомі в даній галузі і представлені в таблиці 2.

Таблиця 2

Послідовність константного домену важкого ланцюга і константного домену легкого ланцюга дО людини послідовності 11111111 123456789012345678901234567890

АЧІКОРБУКАРХВКХ ТТ А

НУК

БУКВУ ГУМА ТЬОМУНТЕ

РАУВ .

СБУ У ТУР ТК ЖІ

4 УМНКрУ

Константна область гамма 5ЕО Ір МО Мі 9 МТК УРОК СС

АВ ЯЮ

ВЕУ РРЕРКЮОТЕ МО КИТРЕУТС тУучмУв

НЕБРЕУКЕВУУУОСУКУНМАК

Таблиця 2

Послідовність константного домену важкого ланцюга і константного домену легкого ланцюга дО людини послідовності еВ У ТУ ККОКЕУ

МУКА

ПЕАМЧЕЕТІЗК АКССНЧЦВВСТУУТ

РРЕКНЕ

МТКМСУ ВІ УКОКУВІНАМЕ

У І

СУМКУ ОКУ ВК,

ТУВКОКТУ

СОУСУ МНЕАСНМИ ТОК

ЗБІРОК

АХТКОРХУКРЕ АРК ОТООСТАА

МУК птреБрвУу ТУ НА ТУТ

ВАХ

Був ЕееКве У МЕ Те

УКУПУух

НЕОрРСУКЕМУТ УСНУ ВУНКАК

ТКРЕБВЧУЄМ

ЗО ачУмур ОС

Мутант константної , МІКУЮККУКРКОСОКТНТСР . ЗЕО ІЮ МО:12 області гамма-1 Ід АКА

ЗГУКУУВУ ТУ СЕУ

СЕУ

ГРАРЕК ТКА ВЕРО УТ,

ВРАНЕК

СОМ УКаСУУ МЕНСАТНМЕН УК

БНО К

МІК КТСУКИОГТРММАХЕ

Кам

БМК КТТРРУ ОО КЕ

ТУ

Таблиця 2

Послідовність константного домену важкого ланцюга і константного домену легкого ланцюга дО людини . Ідентифікато . .

Білок дент! ф р Послідовність послідовності

ТАРУ КИТА У чл

БУТ КАКУСЖУКУПЙВМАЦОВОМКОИ

Константна область

ЗЕОІО МО: 13 ГУТІ

Каппа Ід й кчетек сетрті ке кер

КПТ АСПЕК АСТЕКНКУ

ТАСБУТН

ССП У ГРКЗЕНИОВС

МРКАЛЕЖУ ПЕ ТРОХБЕЕК ОАМКА

Та

ПКУ У ТАК АНУ КАСТУ

Константна область квт

ЗЕОІОМО:14 ЕТЕТРЕКО

Лямбда Ід зікпичих ху сі птоз

ХМК ТАКУ СТРЕС КУНЕХ

УСВА ТИ

ПОЗУ ТУАРТЕСЬ

Крім того, антитіло або його антигензв'язувальна частина можуть бути частиною більш великих молекул імуноадгезії, утворених ковалентним або нековалентним зв'язком цього антитіла або частини антитіла з одним або декілька іншими білками або пептидами. Приклади таких молекул імуноадгезії включають використання корової області стрептавідину для одержання тетрамерної молекули 5сЕм (Кіргіуапом, 5. М., еї аІ. (1995) Нитап Апііродіє5 апа

Нубгідота5 6:93-101) і використання залишку цистеїну, маркерного пептиду і С-кінцевої полігістидинової мітки для одержання бівалентних і біотинільованих молекул 5сЕм (Кіргіуапом,

З.М., еї а. (1994) Мої. Іттипої. 31:1047-1058). Частини антитіл, такі як Раб- і Е(ар')2-фрагменти, можуть бути одержані з повнорозмірних антитіл з використанням загальноприйнятих способів, таких як розщеплення папаїном або пепсином, відповідно, повнорозмірних антитіл. Крім того, антитіла, частини антитіл і молекули імуноадгезії можуть бути одержані з використанням стандартних способів рекомбінантних ДНК, описаних у даному документі. "Виділене антитіло", у контексті даного опису, являє собою антитіло, яке по суті вільне від інших антитіл, що мають відмінні антигенні специфічності (наприклад, виділене антитіло, що специфічно зв'язується з ПКОМ А, є по суті вільним від антитіл, що специфічно зв'язують антигени, інші ніж НИКОМ А). Однак, виділене антитіло, що специфічно зв'язується з ПКОМ А, може мати перехресну реактивність відносно інших антигенів, таких як молекули КОМ А інших видів. Крім того, виділене антитіло може бути по суті вільним від іншого клітинного матеріалу і/або від інших хімікалій.

Термін "антитіло людини", у контексті даного винаходу, включає антитіла, що мають варіабельні і константні області, одержані з послідовностей імуноглобуліну зародкової лінії людини. Ці антитіла людини за винаходом можуть включати амінокислотні залишки, не кодовані послідовностями імуноглобуліну зародкової лінії людини (наприклад, мутації, введені випадковим або сайт-специфічним мутагенезом іп мйго або соматичною мутацією іп мімо), наприклад, у СОК і, зокрема, СОКЗ. Однак, термін "антитіло людини", у контексті даного опису, не включає антитіла, у яких СОК - послідовності, одержані з іншого виду ссавця, такого як миша, були щеплені на каркасні послідовності людини.

Термін "рекомбінантне антитіло людини", у контексті даного винаходу, включає всі антитіла людини, які одержують, експресують або виділяють рекомбінантними способами, такі як антитіла, експресовані з використанням рекомбінантного експресуючого вектора, трансфікованого в клітину-хазяїна (описаного додатково нижче), антитіла, виділені з рекомбінантної, комбінаторної бібліотеки антитіл людини (Ноодепроот Н. К., (1997) ТІВ Тесп. 15:62-70; Аглау Н. апа Ніднетіїй М/.Е., (2002) Сііп. Віоспет. 35:425-445; Саміопао ..М., апа

Гатек МУ. (2002) ВіоТеснпіднев 29:128-145; Ноодепроот Н., апа Снатез Р. (2000) ІттипоЇоду

Тодау 21: 371-378), антитіла, виділені з тварини (наприклад, миші), яка є трансгенною відносно генів імуноглобуліну людини (див., наприклад, Тауїог, Г.. О., еї аІ. (1992) Мисі. Асід5 Кев5. 20:6287- 6295; КеїІПегтапп 5-А., апа Стееп Г.І. (2002) Ситепі Оріпіоп іп Віоїесппоіоду 13:593-597; І Ше М. еї а! (2000) Іттипоіоду Тодау 21: 364-370), або антитіла, одержані, експресовані, створені або виділені будь-якими іншими способами, які включають сплайсинг послідовностей гена імуноглобуліну людини в інші ДНК-послідовності. Такі рекомбінантні антитіла людини мають варіабельні і константні області, одержані з послідовностей імуноглобуліну зародкової лінії людини. Однак, у деяких варіантах здійснення, такі рекомбінантні антитіла людини піддають мутагенезу іп міго (або, при використанні тварини, трансгенної відносно послідовностей Ід людини, соматичному мутагенезу іп мімо), і, отже, амінокислотні послідовності МН- і Мі -областей цих рекомбінантних антитіл є послідовностями, які, хоча й одержані з МН- і МІ -послідовностей зародкової лінії людини і споріднені з ними, не можуть існувати в природі в репертуарі (спектрі) зародкової лінії антитіла людини іп мімо.

Термін "химерне антитіло" стосується антитіл, які містять послідовності варіабельної області важкого ланцюга і легкого ланцюга одного виду і послідовності константної області іншого виду, такі як антитіла, що мають варіабельні області важкого ланцюга і легкого ланцюга миші, зв'язані з константними областями людини. Це химерне антитіло може бути одержане рекомбінантними молекулярно-біологічними способами або може бути одержане фізичною кон'югацією зазначених областей.

Термін "СОК-щеплене антитіло" стосується антитіл, які містять послідовності варіабельної області важкого ланцюга і легкого ланцюга одного виду, але в яких послідовності одного або декількох з цих СОК області МН і/або МІ. замінені СОК-послідовностями іншого виду, таким як антитіла, що мають варіабельні області важкого ланцюга і легкого ланцюга миші, у яких один або декілька СОК миші (наприклад, СОКЗ) були замінені послідовностями СОК людини.

Терміни "нумерація Кебата", "визначення по Кебату" і "мічення по Кебату" використовуються в даному описі взаємозамінно. Ці терміни, які є добре відомими в даній галузі, стосуються

Зо системи нумерації амінокислотних залишків, що є більш варіабельними (тобто гіперваріабельними), ніж інші амінокислотні залишки, у варіабельних областях важкого ланцюга і легкого ланцюга антитіла або його антигензв'язувальної частини (КаБбаї еї аї. (1971) Апп. МУ

Асад, сі. 190: 382-391 і Кабаї, Е.А., еї а. (1991) Зедиепсез ої Ргоїеїп5 ої Іттипоїодісаї Іпіегеві,

Ей Еайоп, 0.5. Оерайтепі ої Неайй апа Нитап бегмісе5, МІН Рибіїсайоп Мо. 91-3242). Для варіабельної області важкого ланцюга, ця гіперваріабельна область знаходиться в діапазоні положень амінокислот 31-35 для СОК1І, положень амінокислот 50-65 для СОК2 і положень амінокислот 95-102 для СОКЗ. Для варіабельної області легкого ланцюга, ця гіперваріабельна область знаходиться в діапазоні положень амінокислот 24-34 для СОК1, положень амінокислот 50-56 для СОК2 і положень амінокислот 89-97 для СОКЗ.

У контексті даного опису, терміни "акцептор" і "акцепторне антитіло" стосуються послідовності антитіла або послідовності нуклеїнової кислоти, що забезпечує або кодує щонайменше 80 95, щонайменше 85 95, щонайменше 90 95, щонайменше 95 9565, щонайменше 9895 або 100 95 амінокислотних послідовностей однієї або декількох каркасних ділянок. У деяких варіантах здійснення, термін "акцептор" стосується амінокислотної послідовності або послідовності нуклеїнової кислоти, що забезпечує або кодує константну область (константні області. Ще в одному варіанті здійснення, термін "акцептор" стосується амінокислотної послідовності або послідовності нуклеїнової кислоти, що забезпечує або кодує одну або декілька каркасних ділянок і константних областей. В одному конкретному варіанті здійснення, термін "акцептор" стосується амінокислотної послідовності або послідовності нуклеїнової кислоти антитіла людини, що забезпечує або кодує щонайменше 80 95, переважно щонайменше 8595, щонайменше 90 956, щонайменше 9595, щонайменше 98 95 або 100 95 амінокислотних послідовностей однієї або декількох каркасних областей. Відповідно до цього варіанта здійснення, акцептор може містити щонайменше 1, щонайменше 2, щонайменше 3, щонайменше 4, щонайменше 5 або щонайменше 10 амінокислотних залишків, які не зустрічаються в одному або декількох конкретних положеннях антитіла людини. Акцепторна каркасна область і/або акцепторні константні області можуть бути одержані з гена антитіла зародкової лінії, гена дозрілого антитіла, функціонального антитіла (наприклад, антитіл, добре відомих у даній галузі, антитіл у розвитку або антитіл, комерційно доступних).

У контексті даного опису, термін "СОК" стосується області, що визначає комплементарність, 60 у варіабельних послідовностях антитіл. Є три СОК у кожній з варіабельних областей важкого ланцюга і легкого ланцюга, які позначають СОМКІ, СОК2 і СОКЗ, для кожної з цих варіабельних областей. Термін "набір СОР" стосується в цьому контексті групи з трьох СОК, які знаходяться в єдиній варіабельній області, здатній зв'язувати антиген. Точні границі цих СОК визначалися по- різному відповідно до різних систем. Ця система, описана Кебатом (КарБбаї еї аїЇ., Зедоепсев ої

Ргоївїп5 ої Іттипоїодіса! Іпіеге5і (Майопа! Іпзійшев ої Неайп, ВеШезаа, Ма. (1987) ї (1991)), забезпечує не тільки недвозначну систему нумерації залишків, яку можна використовувати в будь-якій варіабельній області антитіла, але забезпечує також точні границі залишків, що визначають ці три СОМ. Ці СОМ можуть називатися СОК по Кебату. У статті Споїйпіа єї аї. (СпоїШіа 5 ГевзК, 9). Мої. ВіоІ. 196:901-917 (1987) і СпоШіа єї аї., Маїште 342:877-883 (1989)) виявили, що деякі підчастини в СОК по Кебату приймають майже ідентичні конформації пептидного кістяка, незважаючи на наявність великого різноманіття на рівні амінокислотної послідовності. Ці підчастини були названі!1,І2і13 або НІ, Н?2 ї НЗ, де "І" ї "Н" позначають області легкого ланцюга і важкого ланцюга, відповідно. Ці області можуть називатися СОК

Хотія, які мають границі, що перекриваються з СОК Кебата. Інші границі, що визначають СОК, були описані Радіап (ЕАЗЕВ У. 9:133-139 (1995)) апа МасСаїйПшт (У Мої Віо! 262(5):732-45 (1996)).

Інші визначення областей СОМ можуть також не відповідати строго одній з цих систем, але проте будуть перекриватися з СОК Кебата, хоча вони можуть бути укороченими або подовженими у світлі передбачення або експериментальних відкриттів того, що конкретні залишки або групи залишків, або навіть усі СОК не впливають значно на зв'язування антигену.

Використовувані в даному описі способи можуть застосовувати СОК, визначені відповідно до кожної з цих систем, хоча переважні варіанти здійснення використовують СОК, визначені по

Кебату або Хотія.

У контексті даного опису, термін "канонічний" залишок стосується залишку в СОК або каркасної області, яка визначає конкретну канонічну структуру СОК, визначену Споїпіа еї аї...

Мої. Віо!. 196:901-907 (1987); Споїіа еї аї., У. Мої. ВіоїІ. 227:799 (1992), обидві статті включені в даний опис за допомогою посилання. Згідно з Споїпіа еї аї., критичні частини СОК багатьох антитіл мають майже ідентичні конформації пептидного кістяка цих СОК незважаючи на велику різноманітність на рівні амінокислотної послідовності. Кожна канонічна структура точно визначає первинно набір торсійних кутів пептидного кістяка для суміжного сегмента

Зо амінокислотних залишків, що утворює петлю.

У контексті даного опису, терміни "донор" і "донорне антитіло" стосуються антитіла, що забезпечує один або декілька СОК. У переважному варіанті здійснення, донорним антитілом є антитіло виду, відмінного від виду, з якого одержане антитіло, з якого одержані або вироблені каркасні області. У контексті гуманізованого антитіла, термін "донорне антитіло" стосується антитіла не людини, що забезпечує один або декілька СОК.

У контексті даного опису, термін "каркасна ділянка" або "каркасна послідовність" стосується послідовностей варіабельної області, що залишилися, мінус ці СОК (тобто після віднімання

СОМ). Оскільки точне визначення СОК-послідовності може визначатися різними системами, значення каркасної послідовності є об'єктом відповідно різних інтерпретацій. Ці шість СОК (СОВ-І 1, -12 ї -3 легкого ланцюга і СОБ-НІ, -Н2 ії -«НЗ важкого ланцюга) також поділяють каркасні області на легкому ланцюзі і важкому ланцюзі на чотири субобласті (ЕК1, ЕК2, ЕКЗ і

ЕК4) на кожному ланцюзі, у якому СОКІ розташований між ЕК1 і ЕК2, СОК2 між ЕКЗ їі ЕКЗ і

СОКЗ між ЕКЗ ї ЕК4. Без точного визначення конкретних субобластей як ЕК1, ЕК2, ЕКЗ або

ЕК4, каркасна область, називана іншими авторами, представляє об'єднані ЕК у варіабельній області єдиного ланцюга імуноглобуліну, що зустрічається природно. У контексті даного опису, один ЕК представляє одну з чотирьох субобластей і ЕЕ у множині представляють дві або більше з чотирьох субобластей, що складають каркасну область.

У даній галузі відомі акцепторні послідовності важкого ланцюга і легкого ланцюга людини. В одному варіанті здійснення за винаходом акцепторні послідовності важкого ланцюга і легкого ланцюга людини вибрані з послідовностей, описаних у таблиці З і таблиці 4. У зазначених таблицях описані різні комбінації відносно каркасних послідовностей ЕК1-ЕК4 людини.

Таблиця З

Акцепторні послідовності важкого ланцюга людини 5ЕО ІЮ МО 112345678901234567890123456789012

УНЗ-48//НЗ ЕВ БУС УВК ОВО ЯСААВСТТЕВ

УнЗ-48/НЗ ЕН2

ВЕК ОМАКМБУКОММН КОВО АУУТО

17 МНЗ-48/НЗ ЕВЗ І

АВ

МНЗ-48/ІНЗ ЕВНА

МНЗ-48/ІНА ЕВ КУСТНОУПЕСОКИ ЛИ РОЮ ВОАС

УнЗ-48/ІН4 ЕВ2 КАПОАРОКОТІАВ

ЕТНО МАВМЕСУСОМЧЕНОВОТАУТТЄ

17 МНЗ-48/ІН4 ЕВЗ це і

УНЗ-48/ІН4 НА Оу ТУ

УнЗ-авіІНе ЕВ!

МНЗ-48/)Н6 ЕВ2 ФУВОАРОКОГ ТУЯ

ЕРПОВОМАКММ ТОМ КОВО АУТУЄ

17 МНЗ-48/Н6 ЕВЗ їй вк

МНЗ-48/)Н6 ЕВА УТ ГУВх

УНЗ-3ЗЛІНЗ ЕВ! ОСІ У У АСВ ТС ААНОТЕВ

УНЗ-З3/НЗ ЕВ2

ВЕТЧАОМУКМТ КОМИ ВАСУ ТАЖТУЄ

23 МНЗ-33/НЗ ЕВЗ це

МНЗ-33НЗ ВА |Мназана єв

МНЗ-33/ІНА ЕВ УКОАРОВОМО УА

ВРПЧВОМаКМИ ОМ МАВОТАУТН 23 МНЗ-33/ІНА4 ЕВЗ цк

СИХ

МНЗ-33/НА ЕВА ОСТ ТУВЕ

МНЗ-33/)Н6 ЕВ ОУСУ БОС ОУУСТРОК КОСААМОКТЕХ

УНЗ-33/)Н6 ЕВ2 УУВОАННН НЕК Уд

ЕРЕВАН ОМ ВАТ АТС

23 МНЗ-33/ІН6 ЕВЗ «в

Я

МНЗ-33/Нв ВА

МНЗ-23/ІН3 ЕВ УСВА ОЗ САДОК

УНЗ 2ЗЛІНЗ ЕВ

ПРПЕНОМОКМІ КОМИ КАТА УКТЄ

26 МНЗ-23/ІН3 ЕВЗ ХК

МНЗ-23/ІНЗ ЕВА СІ МУТУВИ

МНЗ-23/ІНА ЕВ БУСЬК ОВО В СААВОБТЕ ун 2ЗІНа ЕН

БРГТаККНУ Мт ВЗА АМУ 26 МНЗ-23/ІН4 ЕВЗ хЕ

УНЗ-2З/УНа НА

МНЗ-23/ІНб ЕВ БАЛ ЕКОСЮУЄРОСЮ ЧІ ВІЯСААВСИТЕЕ

УНЗ 2ЗлІНе ЕВ

ВРИЖВОМУКМІСУ ОММе ВАВ АУКТЄ 26 МНЗ-23/ІН6 ЕВЗ це

УНЗ-23/ІН6 ЕНА

Таблиця 4

АКЦЕПТОРНІ ПОСЛІДОВНОСТІ ЛЕГКОГО ЛАНЦЮГА ЛЮДИНИ

11111111 123456789012345678901234567890120.://.Н.:С:(С3:|/Д/

Урок ПО КУКА СТУ

КИ

РВЕ ОК еКУКАКУСУ

У контексті даного опису, термін "ген антитіла зародкової лінії" або "фрагмент гена" стосується послідовності імуноглобуліну, кодованої нелімфоїдними клітинами, що не були піддані процесу дозрівання, який приводить до генетичного реаранжирування і мутації для експресії конкретного імуноглобуліну (Див., наприклад, Зпаріго еї аї!., Стйї. Кем. Іттипої. 22(3): 183-200 (2002); МагспаІопіб5 єї аї., Адм Ехр Мей Віої. 484:13-30 (2001)) Одна з переваг, забезпечуваних різними варіантами здійснення даного винаходу, виникає з визнання того, що гени антитіл зародкової лінії з більшою імовірністю, ніж гени дозрілих антитіл, зберігають незамінні структури амінокислотних послідовностей, характерні для індивідуумів у цих видах, отже, з меншою імовірністю упізнаються як гени з чужорідного джерела при використанні терапевтично в цих видах.

У контексті даного опису, термін "ключові" залишки стосується визначених залишків у варіабельній області, які мають більший вплив на специфічність зв'язування і/або афінність антитіла, зокрема гуманізованого антитіла. Ключовий залишок включає, але не обмежується ними, один або декілька з наступних залишків: залишок, що є суміжним з СОК, потенційний сайт глікозилування (може бути сайтом або М-, або О-глікозилування), рідкий залишок, залишок, здатний взаємодіяти з антигеном, залишок, здатний взаємодіяти з СОЕ, канонічний залишок, контактний залишок між варіабельною областю важкого ланцюга і варіабельною областю легкого ланцюга, залишок у зоні Мегпіег і залишок в області перекриття СОКІ варіабельної області важкого ланцюга по Хотія і першої каркасної ділянки важкого ланцюга по Кебату.

Термін "гуманізоване антитіло" звичайно стосується антитіл, що містять послідовності варіабельної області важкого і легкого ланцюга з видів, що не є людиною (наприклад, миші), але в яких щонайменше частина УН- і/або МІ -послідовності була змінена таким чином, що вона стала більш "людиноподібною", тобто більш подібною з варіабельними послідовностями зародкової лінії людини. Одним типом гуманізованого антитіла є СОК-щеплене антитіло, у якому послідовності СОК людини введені в послідовності УН і МІ. для заміни відповідних СОК- послідовностей не людини.

Зокрема, термін "гуманізоване антитіло" у контексті даного опису означає антитіло або його варіант, похідне, аналог або фрагмент, які імуноспецифічно зв'язуються з антигеном, що

Зо представляє інтерес, і які містять каркасну (ЕК) область, що має по суті амінокислотну послідовність антитіла людини, і область, що визначає комплементарність (СОК), яка має по суті амінокислотну послідовність антитіла, що не належить до людини. У контексті даного опису, термін "по суті" у контексті з СОК стосується СОК, що має амінокислотну послідовність, щонайменше на 50, 55, 60, 65, 70, 75 або 80 95, переважно щонайменше на 85 95, щонайменше на 9095, щонайменше на 9595, щонайменше на 9895 або щонайменше на 99 95 ідентичну амінокислотній послідовності СОК антитіла не людини. Гуманізоване антитіло містить по суті усі з щонайменше одного, звичайно двох варіабельних доменів (Раб, Раб", Е(аб)», Бар, Ем), у яких усі або по суті усі з областей СОК відповідають областям СОК імуноглобуліну не людини (тобто донорного антитіла), і всі або по суті усі з каркасних областей є каркасними областями консенсусної послідовності імуноглобуліну людини. Переважно, гуманізоване антитіло містить щонайменше частину константної області імуноглобуліну (Ес), звичайно частину константної області імуноглобуліну людини. У деяких варіантах здійснення, гуманізоване антитіло містить як легкий ланцюг, так і щонайменше варіабельний домен важкого ланцюга. Це антитіло може включати також області СНІ, шарнірну область, області СН2, СНЗ ії СН4 важкого ланцюга. У деяких варіантах здійснення, гуманізоване антитіло містить тільки гуманізований легкий ланцюг.

У деяких варіантах здійснення, гуманізоване антитіло містить тільки гуманізований важкий ланцюг. У конкретних варіантах здійснення, гуманізоване антитіло містить тільки гуманізований варіабельний домен легкого ланцюга і/або гуманізований важкий ланцюг.

Гуманізоване антитіло може бути вибране з будь-якого класу імуноглобулінів, у тому числі

ІЗ, ЗМ, до, дО, ІдА і ІдЧЕ, і будь-якого ізотипу, у тому числі, без обмеження, ІдА1, ІдА2г, Ід,

ІЧО2, ІдОЗ і Ідс4. Гуманізоване антитіло може містити послідовності з більше ніж одного класу або ізотипу і конкретні константні домени можуть бути вибрані для оптимізації бажаних ефекторних функцій з використанням способів, добре відомих у даній галузі.

Каркасні і СОБ-області гуманізованого антитіла не повинні точно відповідати вихідним (батьківським) послідовностям, наприклад, СОК або консенсусна каркасна ділянка донорного антитіла можуть бути мутагенізовані заміною, інсерцією і/або делецією щонайменше одного амінокислотного залишку так, що залишок СОМ або каркасний залишок у цьому сайті не відповідає ні донорному антитілу, ні консенсусній каркасній ділянці. Однак, у переважному варіанті здійснення, такі мутації не будуть екстенсивними. Звичайно щонайменше 50, 55, 60, 65, 70, 75 або 80 95, переважно щонайменше 85 95, більш переважно щонайменше 90 95 і найбільш переважно щонайменше 95 95 залишків гуманізованого антитіла будуть відповідати залишкам у вихідних послідовностях ЕК і СОЖК. У контексті даного опису, термін "консенсусна каркасна ділянка" стосується каркасної області в консенсусній послідовності імуноглобуліну. У контексті даного опису, термін "консенсусна послідовність імуноглобуліну" стосується послідовності, утвореної з амінокислот (або нуклеотидів), що найбільш часто зустрічаються, у сімействі споріднених послідовностей імуноглобулінів (Див., наприклад, М/ІппаКег, Егот Сепез то Сіопе5 (Мегіадздезеїїзспай, Умеіппеїйт, Сегтапу 1987). У сімействі імуноглобулінів, кожне положення в консенсусній послідовності зайняте амінокислотою, що зустрічається найбільш часто в цьому положенні в цьому сімействі. Якщо дві амінокислоти зустрічаються з однаковою частотою, кожна може бути включена в цю консенсусну послідовність.

У контексті даного опису, зоною "Мегпієг" називають субнабір каркасних залишків, які можуть

Зо коректувати структуру СОК і здійснювати тонке настроювання відповідності антигену, як описано в статті Рооїе апа Уміпіег (1992, 9. Мої. Вісі. 224:487-499), яка включена в даний опис за допомогою посилання. Залишки зони Мегпіег утворюють підстилаючий шар СОК, і можуть впливати на структуру СОК і афінність цього антитіла.

Термін "інгібування зв'язування" КОМ з одним з його рецепторів, використовуваних у даному описі, включає часткове (наприклад, приблизно на 20 95, 40 95, 60 95, 80 Фо, 85 о, 90 Об, 9595 або більше) або повне зменшення активності зв'язування зазначеного рецептора.

Зазначене "інгібування зв'язування" може бути визначене будь-яким придатним способом, доступним у даній галузі, переважно будь-яким способом, наведеним у даному описі як приклад, таким як, наприклад, аналізи зв'язування на основі ЕГІЗА.

У контексті даного опису, термін "нейтралізація" стосується нейтралізації біологічної активності білка-мішені при специфічному зв'язуванні зв'язувальним білком білка-мішені.

Нейтралізація може бути результатом різних шляхів зв'язування зазначеного зв'язувального білка з мішенню. Наприклад, нейтралізація може бути обумовлена зв'язуванням зв'язувального білка в області мішені, яка не впливає на зв'язування рецептора з молекулою-мішенню.

Альтернативно, зв'язування зв'язувального білка може приводити до блокади зв'язування цього рецептора з мішенню, і ця блокада зрештою нейтралізує активність білка-мішені. Відповідно до цього винаходу, може зустрічатися кожний із зазначених різних механізмів. Переважно нейтралізуючий зв'язувальний білок є нейтралізуючим антитілом, зв'язування якого з ПЕОМ А приводить до нейтралізації біологічної активності ЛПКОМ А. Переважно цей нейтралізуючий зв'язувальний білок зв'язує ПКОМ А і зменшує біологічну активність НИКОМ А щонайменше приблизно на 20 95, 40 95, 60 У», 80 95, 85 96 або більше. Нейтралізація біологічної активності

ЯКОМ А нейтралізуючим зв'язувальним білююм може оцінюватися вимірюванням одного або декількох індикаторів біологічної активності НИКОМ А, добре відомих у даній галузі. Наприклад, нейтралізація ЯНКОМ А перетворює інгібування в аналізі нейронного росту в Мега (див. приклад

З нижче). Аналіз росту нейритів Мега визначає інгібування росту нейритів. За відсутності інгібувального білка або фрагмента КОМ А і в присутності стимулюючого ріст нейритів субстрату ламініну нейронні агрегати Мега виявляють екстенсивну і щільну мережу зростаючих нейритів. КОМ А або фрагменти КОМ А інгібують ріст нейритів, приводячи до зменшеної довжини і зменшених кількостей нейритів. Блокуючі функцію КОМ А антагоністи або МАВ, такі бо як тАб 5Е9, нейтралізували інгібуючу ріст нейритів активність сильного фрагмента легкого ланцюга (амінокислоти 47-168) їс-кон'югованого ПЕОМ А білка КОМ А людини в аналізах росту нейритів з агрегатами диференційованих нейронів Мега людини, приводячи до сильного збільшення довжини і кількості нейритів. "Нейтралізуюче моноклональне антитіло" стосується в контексті даного опису препарату молекул антитіл, які після зв'язування зі специфічним антигеном здатні конкурувати за зв'язування і інгібувати зв'язування природного ліганду для зазначеного антигену. В одному конкретному варіанті даної заявки нейтралізуючі антитіла даного винаходу здатні конкурувати з

ЕОМ А за зв'язування з Неогеніном і/або з ВМР-2 і/або ВМР-4 і запобігати біологічній активності або функції ЕОМ А. Зокрема, нейтралізуючі антитіла даного винаходу здатні зв'язуватися з

КОМ А і запобігати зв'язуванню з Неогеніном і/або з ВМР-2 і/або ВМР-4 і запобігати біологічній активності або функції КОМ А. Термін "активність" включає такі активності, як специфічність/афінність зв'язування антитіла відносно антигену, наприклад анти-пкОоМ А- антитіла, що зв'язується з антигеном КОМ А, і/або нейтралізуючу силу антитіла, наприклад анти-пКОМ А-антитіла, зв'язування якого з ПКОМ А інгібує біологічну активність НКОМ А, наприклад, як визначено в аналізі зв'язування НІКОМ А-Неогеніну, аналізі зв'язування НІКОМ А-

ВМР-2 або аналізі зв'язування ПЕОМ А-ВМР-4, як описано нижче в експериментальному розділі.

Біологічна активність КОМ А може бути описана як регуляція клітинної міграції. Особливим прикладом клітинної міграції є ріст нейритів, який затримується або інгібується білками КОМ А.

Крім того, було показано, що біли КОМ модулюють активність ВМР-білків. Опубліковані в даному описі приклади описують синергічну, підсилюючу активність білків КОМ на ВМР- шляху, з одного боку, і інгібувальну активність білків КОМ на ВМР-шляху, який є важливим для регуляції метаболізму заліза, регенерації кісток і хрящів і в ЦНС для ремієлінізації і регенерації.

Термін "епітоп" або "антигенна детермінанта" включає будь-яку поліпептидну детермінанту, здатну специфічно зв'язуватися з імуноглобуліном або Т-клітисним рецептором. У деяких варіантах здійснення, епітопні детермінанти включають хімічно активні поверхневі угруповання молекул, таких як амінокислоти, цукрові бічні ланцюги, фосфорил або сульфоніл, і, у деяких варіантах здійснення, можуть мати специфічні тривимірні структурні характеристики і/або характеристики специфічного заряду. Епітоп є областю антигену, яка зв'язується антитілом. У деяких варіантах здійснення, говорять, що антитіло специфічно зв'язує антиген, коли воно

Зо переважно упізнає його антиген-мішень у комплексній суміші білків і/або макромолекул.

Термін "резонанс поверхневих плазмонів" стосується в контексті даного опису оптичного феномена, який дозволяє аналізувати біоспецифічні взаємодії реального часу детектуванням змін концентрацій білка в біосенсорному матриксі, наприклад, з використанням системи ВіАсоге (Рпагтасіа Віозепзог АВ, Оррзаїа, 5у/едеп апа Різсаїажау, МУ). Відносно додаткових описів,

З5 див. чУопз5зоп, Ш., еї аїЇ. (1993) Апп. ВіоїЇ. Сіп. 51:19-26; доп55оп, М., еї аї. (1991) Віоїесппідне5 11:620-627; Хдопп55оп, В., еї а!І. (1995) 9. Мої. Кесодпії. 8:125-131; апа допгтзоп, В., еї аїЇ. (1991)

Апа!. Віоспет. 198:268-277.

Термін "Коп" у контексті даного опису стосується константи швидкості для асоціації антитіла з антигеном для утворення комплексу антитіло/антиген, як відомо в даній галузі.

Термін "Кок" стосується в контексті даного опису константи швидкості для дисоціації антитіла від комплексу антитіло/антиген, як відомо в даній галузі.

Термін "Ко" стосується в контексті даного опису константи дисоціації конкретної взаємодії антитіло/антиген, як відомо в даній галузі.

Термін "мічений зв'язувальний білок" стосується в контексті даного опису білка з включеною міткою, яка забезпечує ідентифікацію зв'язувального білка. Переважно, міткою є детектований маркер, наприклад, включення радіоактивно міченої амінокислоти або приєднання до поліпептиду біотинільованих частин молекули, що можуть бути детектовані міченим авідином (наприклад, стрептавідином, що містить флуоресцентний маркер або ферментативну активність, які можуть бути детектовані оптичним або колориметричним способами). Приклади міток для поліпептидів включають, але не обмежуються ними, наступні мітки: радіоіїзотопи або радіонукліди (наприклад, ЗН, "С, 555, 90, 99Тс, 1, 725), 191, 177 у, 766но або "зЗ5т); флуоресцентні мітки (наприклад, РІТС, родамін, лантанідні люмінофори), ферментні мітки (наприклад, пероксидаза хрону, люцифераза, лужна фосфатаза); хемілюмінесцентні маркери; біотинільовані групи; попередньо визначені поліпептидні епітопи, упізнавані вторинним репортером (наприклад, пари послідовностей лейцинової блискавки, сайти зв'язування для вторинних антитіл, металзв'язувальні домени, епітопні мітки (теги)); і магнітні агенти, такі як хелати гадолінію.

Термін "кон'югат антитіла" стосується зв'язувального білка, такого як антитіло, хімічно зв'язаного з другою хімічною частиною молекули, такою як терапевтичний або цитотоксичний бо агент. Термін "агент" використовується в даному описі для позначення хімічної сполуки, суміші хімічних сполук, біологічної макромолекули або екстракту, приготовленого з біологічних матеріалів. Переважно, ці терапевтичні або цитотоксичні засоби включають, але не обмежуються ними, токсин коклюшу, таксол, цитохалазин В, граміцидин О, бромід етидію, еметин, мітоміцин, етопозид, тенопозид, вінкристин, вінбластин, колхіцин, доксорубіцин, даунорубіцин, дигідроксіантрациндіон, мітоксантрон, мітраміцин, актиноміцин Ю, 1- дегідротестостерон, глюкокортикоїди, прокаїн, тетракаїн, лідокаїн, пропанолол і пуроміцин і їх аналоги або гомологи.

Терміни "кристал" і "кристалізований" стосуються в даному аспекті антитіла або його антигензв'язувальної частини, що існує у формі кристала. Кристали є однією формою твердого стану речовини, яка відрізняється від інших форм, таких як аморфний твердий стан або рідкокристалічний стан. Кристали складаються з регулярних, повторюваних, тривимірних упорядкованих рядів атомів, іонів, молекул (наприклад, білків, таких як антитіла) або молекулярних комплексів (наприклад, комплексів антиген/антитіло). Ці тривимірні упорядковані ряди вибудовані відповідно до конкретних математичних взаємозв'язків, які добре зрозумілі в даній галузі. Фундаментальну ланку, або елемент структури, який є повторюваним у кристалі, називають асиметричною ланкою. Повторення цієї асиметричної ланки в розташуванні, яке відповідає конкретній, добре визначеній кристалографічній симетрії, забезпечує "елементарну комірку" цього кристала.

Повторення цієї елементарної комірки за допомогою регулярних трансляцій (перенесень) у всіх трьох вимірах забезпечує кристал. Див. Сіведе, В. апа Юистиїх, А. Ваїтей, СтгузіаїІгайоп ої

Мисівєїс Асід5 апа Ргоївіп5, а Ргасіїса! Арргоаси, 2па ва., рр. 20 1-16, Охіога Опімегейу Ргев55, Мем/

УОК, Мем МОїК, (1999).

Термін "полінуклеотид" у контексті даного опису означає полімерну форму двох або більше нуклеотидів або рибонуклеотидів, або дезоксинуклеотидів, або модифікованої форми будь- якого типу нуклеотиду. Цей термін включає одноланцюжкові і дволанцюжкові форми ДНК, але переважно дволанцюжкову ДНК.

Термін "виділений полінуклеотид" у контексті даного опису буде означати полінуклеотид (наприклад, геномний, кКДНК або полінуклеотид синтетичного походження або деякі їх комбінації), який, унаслідок його походження як "виділеного полінуклеотиду": не зв'язаний з усім полінуклеотидом або частиною полінуклеотиду, з якими цей "виділений полінуклеотид" виявляється в природі; функціонально зв'язаний з полінуклеотидом, що не є зв'язаним з ним у природі; або не зустрічається в природі як частина більшої послідовності.

Термін "вектор", у контексті даного опису, стосується молекули нуклеїнової кислоти, здатної транспортувати іншу нуклеїнову кислоту, з якою вона зв'язана. Одним типом вектора є "плазміда", що є кільцевою дволанцюжковою петлею ДНК, у яку можуть бути ліговані додаткові

ДНК-сегменти. Іншим типом вектора є вірусний вектор, причому в цей вірусний геном можуть бути ліговані додаткові ДНК-сегменти. Деякі вектори здатні до автономної реплікації в клітині- хазяїні, у яку їх вводять (наприклад, бактеріальні вектори, що мають бактеріальний сайт ініціації реплікації (ориджин реплікації), і епісомні вектори ссавців). Інші вектори (наприклад, неепісомні вектори ссавців) можуть бути інтегровані в геном клітини-хазяїна і за допомогою цього реплікуються разом з геномом хазяїна. Крім того, деякі вектори здатні керувати експресією генів, з якими вони функціонально зв'язані. Такі вектори називають "рекомбінантними експресуючими векторами" (або просто "експресуючими векторами"). Звичайно, експресуючі вектори, застосовні в способах рекомбінантних ДНК, часто знаходяться у формі плазмід. У даному описі, терміни "плазміда" і "вектор" можуть використовуватися взаємозамінно, оскільки плазміда є найбільш часто використовуваною формою вектора. Однак, передбачається, що цей винахід включає такі інші форми експресуючих векторів, як вірусні вектори (наприклад, ретровіруси з дефектною реплікацією, аденовіруси й аденоасоційовані віруси), які виконують еквівалентні функції.

Термін "функціонально зв'язані" стосується безпосереднього сусідства, у якому описані компоненти знаходяться в зв'язку, який дозволяє їм функціонувати передбачуваним для них чином. Регуляторну послідовність, "функціонально зв'язану" з кодуючою послідовністю, лігують таким чином, що експресія цієї кодуючої послідовності досягається при умовах, сумісних з цими регуляторними послідовностями. "Функціонально зв'язані" послідовності включають як регуляторні послідовності експресії, які є суміжними з геном, що представляє інтерес, так і регуляторні послідовності експресії, які діють у транс-положенні або на відстані для регуляції гена, що представляє інтерес. Термін "регуляторна послідовність експресії" стосується в контексті даного опису полінуклеотидної послідовності, яка є необхідною для здійснення експресії і процесингу кодуючих послідовностей, з якими вони лиіговані. Регуляторні бо послідовності експресії включають придатні послідовності ініціації, термінації транскрипції,

промоторні і енхансерні послідовності; ефективні сигнали процесингу РНК, такі як сигнали сплайсингу і поліаденілювання; послідовності, що стабілізують цитоплазматичну мРНК; послідовності, що збільшують ефективність трансляції (тобто консенсусну послідовність

Козака); послідовності, що збільшують стабільність білка; і, коли бажано, послідовності, що збільшують секрецію білка. Природа таких регуляторних послідовностей розрізняється залежно від організму-хазяїна; у прокаріотах, такі регуляторні послідовності звичайно включають промотор, сайт зв'язування рибосом і послідовність термінації транскрипції. Передбачається, що термін "регуляторні послідовності" включає компоненти, присутність яких є важливою для експресії і процесингу, і може також включати додаткові компоненти, присутність яких є вигідною, наприклад лідерні послідовності і послідовності партнера злиття. "Трансформація", визначена в даному описі, стосується будь-якого процесу, за допомогою якого екзогенна ДНК входить у клітину-хазяїна. Трансформація може відбуватися при природних або штучних умовах з використанням різних способів, добре відомих у даній галузі.

Трансформація може основуватися на будь-якому відомому способі для введення чужорідних послідовностей нуклеїнових кислот у прокаріотичну або еукаріотичну клітину-хазяїна. Цей спосіб вибирають на основі клітини-хазяїна, що підлягає трансформації, і може включати, без обмеження, вірусну інфекцію, електропорацію, ліпофекцію і бомбардування частинками. Такі "трансформовані" клітини включають стабільно трансформовані клітини, у яких введена ДНК, здатна до реплікації або у вигляді автономно реплікованої плазміди, або у вигляді частини хромосоми хазяїна. Вони також включають клітини, які транзиторно експресують інсертовану

ДНК або РНК протягом обмежених періодів часу.

Термін "рекомбінантна клітина-хазяїн" (або просто "клітина-хазяїн") стосується в контексті даного опису клітини, у яку була введена екзогенна ДНК. Повинно бути зрозуміло, що такі терміни стосуються не тільки конкретної розглянутої клітини, але і потомства такої клітини.

Оскільки деякі модифікації можуть зустрічатися в подальших генераціях внаслідок мутації або впливів навколишнього середовища, такі нащадки можуть фактично не бути ідентичними батьківській клітині, але усе ще включаються в обсяг терміна "клітина-хазяїн" у контексті даного опису. Переважно клітини-хазяїни включають прокаріотичні і еукаріотичні клітини, вибрані з кожного з царств рослин або тварин. Переважні еукаріотичні клітини включають клітини

Зо одноклітинних організмів (протистів), клітини грибів, рослин і тварин. Найбільш переважно клітини-хазяїни включають, але не обмежуються ними, прокаріотичну клітинну лінію Е. соїїЇ, лінії клітин ссавців СНО, НЕК 293 і СО5; лінію клітин комах 519 і клітини грибів Засспаготусев5 сегемівіає.

Для рекомбінантних ДНК, синтезу олігонуклеотидів і культури тканини і трансформації (наприклад, електропорації, ліпофекції) можуть бути використані стандартні способи.

Ферментативні реакції і способи очищення можуть виконуватися відповідно до описів виготовлювача або відповідно до того, як вони звичайно виконуються в даній галузі або як описано в даному описі. Попередні способи і процедури можуть звичайно виконуватися відповідно до загальноприйнятих способів, добре відомих в даній галузі, описаних в різних загальних і більш конкретних посиланнях, які цитуються й обговорюються в даному описі. Див., наприклад, керівництво ЗатбгооК еї аІ. МоІесшаг Сіопіпд: А І абогаїогу Мапиа! (2а єд., Соїй зргіпд Нагброг І абогагогу Рге55, Соїа 5ргіпд Нагрог, М.У. (1989)), яке включене в даний опис за допомогою посилання для будь-якої мети.

Термін "трансгенний організм", відомий у даній галузі і використовуваний у даному описі, стосується організму, що має клітини, які містять трансген, де цей трансген, введений в організм (або в організм предка цього організму), експресує поліпептид, що не експресується у природі в цьому організмі. "Трансген" є ДНК-конструкцією, яка стабільно і функціонально інтегрована в геном клітини, з якої розвивається трансгенний організм, і яка керує експресією продукту кодованого гена в одному або декількох типах клітин або тканин цього трансгенного організму.

Терміни "регулюють" і "модулюють" використовуються взаємозамінно і, у контексті даного опису, стосуються зміни або зміщення активності молекули, що представляє інтерес (наприклад, біологічної активності ПКСМ А). Модуляція може бути збільшенням або зменшенням величини визначеної активності або функції молекули, що представляє інтерес.

Приклади активностей і функцій молекули включають, але не обмежуються ними, характеристики зв'язування, ферментативну активність, активацію клітинних рецепторів і трансдукцію сигналів.

Відповідно, термін "модулятор" означає в контексті даного опису сполуку, здатну змінювати або зміщати активність або функцію молекули, що представляє інтерес (наприклад, біологічну бо активність ПКОМ А). Наприклад, модулятор може викликати збільшення або зменшення величини визначеної активності або функції молекули в порівнянні з величиною цієї активності або функції, спостережуваною за відсутності модулятора. Термін "агоніст" стосується в контексті даного опису модулятора, який, при контакті з молекулою, що представляє інтерес, викликає збільшення величини цієї активності або функції, спостережуваної за відсутності цього агоніста. Конкретні агоністик, що представляють інтерес, можуть включати, але не обмежуються ними, поліпептиди ПКОМ А або поліпептиди, нуклеїнові кислоти, вуглеводи або будь-які інші молекули, що зв'язуються з ЯНКОМ А. Термін "антагоніст" стосується в контексті даного опису модулятора, який, при контакті з молекулою, що представляє інтерес, викликає зменшення величини активності або функції молекули, спостережуваних за відсутності цього антагоніста.

Приклади антагоністів включають, але не обмежуються ними, білки, пептиди, антитіла, пептитіла, вуглеводи або малі органічні молекули. Пептитіла описані, наприклад, у УМО 01/83525.

Конкретні антагоністи, що представляють інтерес, включають антагоністи, які блокують або модулюють біологічну або імунологічну активність ПКСМ А. Антагоністи ПКОМ А можуть включати, але не обмежуються ними, білки, нуклеїнові кислоти, вуглеводи або інші молекули, що зв'язуються з ПНКОМ А, такі як моноклональні антитіла, які взаємодіють з молекулою КОМ А.

Слід зазначити, що взаємодія з КОМ А може приводити до зв'язування і нейтралізації інших лігандів/компонентів клітинної мембрани і може бути корисною для адитивного або синергічного функціонування проти численних захворювань.

У контексті даного опису, термін "ефективна кількість" стосується кількості терапевтичного засобу, яка є достатньою для зменшення або ослаблення тяжкості і/або тривалості порушення або одного або декількох симптомів порушення, запобігання рецидиву, розвитку, початку прогресування одного або декількох симптомів, асоційованих з порушенням, детектування порушення або збільшення або поліпшення профілактичних або терапевтичних ефектів іншого терапевтичного засобу (наприклад, профілактичного або терапевтичного засобу).

Термін "зразок" використовується в контексті даного опису в його найширшому розумінні. "Біологічний зразок", у контексті даного опису, включає, але не обмежується цим, будь-яку кількість речовини з живої істоти або раніше живої істоти. Такі живі істоти включають, але не обмежуються ними, людей, мишей, щурів, мавп, собак, кроликів і інших тварин. Такі речовини

Зо включають, але не обмежуються ними, кров, сироватку, сечу, синовіальну рідину, клітини, органи, тканини, кістковий мозок, лімфатичні вузли і селезінку. 2. Поліпептиди, які зв'язують ПКОМ А

Основний варіант даної заявки включає виділені білки або поліпептиди, які специфічно зв'язуються щонайменше з одним епітопом білка КОМ А. Виділені білки або поліпептиди, які специфічно зв'язуються щонайменше з одним епітопом білка КОМ А, здатні інгібувати зв'язування КОМ А ії рецептора, Неогеніну і/або морфогенетичних білків кістки 2 і 4 (ВМР-2,

ВМР-4).

Найбільш переважний варіант даної заявки включає антитіла, що зв'язуються з КОМ А або його антигензв'язувальними частинами або фрагментами.

Переважно, анти-КОМ А-антитіла даного винаходу виявляють високу здатність зменшення або нейтралізації активності ЕОМ А, наприклад, оцінюваної будь-яким з декількох аналізів іп міїго і іп мімо, відомих у даній галузі або описаних нижче.

Найбільше переважно дана заявка включає нейтралізуючі моноклональні антитіла проти

КОМ А, які селективно запобігають зв'язуванню КОМ А і рецептора, Неогеніну і морфогенетичних білків кістки 2 і 4 (ВМР-2, ВМР-4), і генерування нейтралізуючого моноклонального антитіла проти КОМ А, яке селективно запобігає зв'язуванню КОМ А з його корецепторами морфогенетичними білками кістки 2 і 4 (ВМР-2, ВМР-4).

Переважно, цим моноклональним нейтралізуючим антитілом даної заявки є антитіло людини або гуманізоване антитіло. Термін "антитіло людини" стосується антитіл, які мають варіабельні і константні області, що відповідають послідовностям імуноглобуліну зародкової лінії людини, або одержані з них (наприклад, див. Кабраї еї аі. Зедцепсе5 ої Ргоїеїп5 ої

Ітітипо|одісаї Іпіегеві, ГИ Еайіоп, 0.5. Оерайтепі ої Неайй апа Нитап 5егмісевз, МІН Рибіїсайоп

Мо. 91-3242, 1991). Однак, антитіла людини даної заявки можуть включати амінокислотні залишки, що не кодуються послідовностями імуноглобуліну зародкової лінії людини (наприклад, мутації, введені випадковим або сайт-специфічним мутагенезом іп міїго, або соматичні мутації іп мімо), наприклад, у СОК і, зокрема, СОКЗ.

У різних варіантах здійснення, антитіло є рекомбінантним антитілом або моноклональним антитілом. Найбільш переважні нейтралізуючі антитіла даної заявки називають тАБ5ЕЗ і тАБВОІ і їх функціональні фрагменти, і передбачається, що інші антитіла і функціональні 60 фрагменти антитіла з еквівалентними властивостями відносно тАБ5ЕЗ9 і тАБВ8ОІ, такими як високоафінне зв'язування з КОМ А з низькою кінетикою дисоціації і високою нейтралізуючою здатністю, є частиною даного винаходу. Афінність зв'язування і швидкість дисоціації анти-ВамМ

А-антитіла даної заявки відносно імуногенного поліпептиду КОМ А або його фрагмента можуть бути визначені будь-яким способом, відомим у даній галузі. Наприклад, афінність зв'язування може бути виміряна за допомогою конкурентних аналізів ЕГІЗА, КІА, ВіАсоге або технології

КіпЕХА. Швидкість дисоціації може бути також виміряна за допомогою ВіАсоге або технології

КіпЕХА. Афінність зв'язування і швидкість дисоціації вимірюють по резонансу поверхневих плазмонів з використанням, наприклад, ВіАсоге.

Одне з переважних моноклональних антитіл даного винаходу, антитіло тАБ5Е9, має щонайменше 90 95 ідентичність амінокислотної послідовності з послідовністю, яка містить варіабельну область важкого ланцюга (МН-область), що містить послідовність ЖЕО ІЮ МО:9 або 34, і варіабельну область легкого ланцюга (Мі-область), що містить послідовність ЗЕО ІЮ

МО:10.

Передбачається також, що виділені моноклональні антитіла, які взаємодіють з ЕОМ А даної заявки, можуть бути глікозилованим зв'язувальним білком, у якому антитіло або його антигензв'язувальна частина містить один або декілька вуглеводних залишків. Одержання виникаючих іп мімо білків може піддаватися додатковому процесингу, відомому як посттрансляційна модифікація. Зокрема, цукрові (глікозильні) залишки можуть додаватися ферментативно в процесі, відомому як глікозилування. Одержані білки, що несуть ковалентно зв'язані олігосахаридні бічні ланцюги, відомі як глікозиловані білки або глікопротеїни.

Глікозилування білків залежить від амінокислотної послідовності білка, що представляє інтерес, а також від клітини-хазяїна, у якій експресується цей білок. Різні організми можуть продукувати різні ферменти глікозилування (наприклад, глікозилтрансферази і глікозидази) і мають різні доступні субстрати (нуклеотидцукри). Внаслідок таких факторів, характер глікозилування білків і склад глікозильних залишків можуть розрізнятися залежно від системи-хазяїна, у якій експресується конкретний білок. Глікозильні залишки, застосовні в цьому винаході, можуть включати, але не обмежуються ними, глюкозу, галактозу, манозу, фукозу, н-ацетилглюкозамін і сіалову кислоту. Переважно, цей глікозилований зв'язувальний білок містить такі глікозильні залишки, що характер глікозилування є характером глікозилування, властивим для людини.

Зо Антитіла даної заявки містять константну область важкого ланцюга, таку як константна область ІдС1, Ідс2, ІдО3, Ідс4, ІдА, ЧЕ, ОМ, Ід або ІдО. Крім того, це антитіло може містити константну область легкого ланцюга або константну область легкого ланцюга каппа, або константну область легкого ланцюга лямбда. Альтернативно, частиною-антитілом може бути, наприклад, Рар-фрагмент або одноланцюжковий Ем-фрагмент. Заміни амінокислотних залишків у Ес-частині для зміни ефекторної функції антитіла відомі в даній галузі (/Міпіег, еї аІ. Патенти

США Мо 5648260; 5624821). Ес-частина антитіла опосередковує декілька важливих ефекторних функцій, наприклад індукцію цитокінів, АОСС, фагоцитоз, комплементзалежну цитотоксичність (СОС) ї час напівжиття/швидкість кліренсу антитіла і комплексів антиген-антитіло. У деяких випадках ці ефекторні функції є бажаними для терапевтичного антитіла, але в інших випадках можуть бути необов'язковими або навіть шкідливими, залежно від терапевтичних цілей. Деякі ізотипи ДС людини, зокрема Ідс1ї і ІдсСЗ, опосередковують АЮСС і СОС за допомогою зв'язування з ЕсукК і комплементом Сід, відповідно. Неонатальні Ес-рецептори (ЕБсКп) є критичними компонентами, які визначають час напівжиття антитіл у кровотоці. Ще в одному варіанті здійснення щонайменше один амінокислотний залишок замінений у константній області цього антитіла, наприклад, Ес-область антитіла, так що ефекторні функції антитіла є зміненими. 3. Генерування анти-пКкОМ А-антитіл. 3.1. Загальна частина.

Антитіла цієї заявки можуть бути генеровані імунізацією придатного хазяїна (наприклад, хребетних, у тому числі людей, мишей, щурів, овець, кіз, свиней, великої рогатої худоби, коней, плазунів, риб, земноводних, і в яйцях птахів, земноводних і риб). Для генерування антитіл даної заявки хазяїна імунізують імуногенним поліпептидом КОМ А або його фрагментом за винаходом. Термін "імунізація" стосується в даному описі способу надання антигену імунному репертуару (спектру), що існує в природному не зміненому генетично організмі або трансгенному організмі у тому числі трансгенному організмі, модифікованому для представлення штучного імунного репертуару людини. Подібним чином, "імуногенний препарат" є композицією антигену, що містить ад'юванти або інші добавки, що могли б збільшувати імуногенність антигену.

Імунізація тварин може виконуватися будь-яким способом, відомим у даній галузі. Див., наприклад, Нагіож/ апа Іапе, Апіїбодіеє: А ІГарогаїогу Мапиа!), Мем/ Моїк: Со Зргіпд Нагрог бо Ргез55, 1990. Способи імунізації тварин (не людини), таких як миші, щури, вівці, кози, свині,

велика рогата худоба і коні, добре відомі в даній галузі. Див., наприклад, Нагіом апа І апе і

Патент США Мо 5994619. В одному переважному варіанті здійснення, антиген КОМ А вводять з ад'ювантом для стимуляції імунної реакції. Такі ад'юванти включають повний або неповний ад'ювант Фрейнда, КІВІ (мурамілдипептиди) або ІБСОМ (імуностимулюючі комплекси). Такі ад'юванти можуть захищати цей поліпептид від швидкого розсіювання поміщенням його в локальне покриття, або вони можуть містити речовини, що стимулюють секрецію хазяїном факторів, які є хемотаксичними відносно макрофагів і інших компонентів імунної системи.

Переважно, при введенні поліпептиду, схема імунізації буде включати два або більше введень поліпептиду, що розподіляються протягом декількох тижнів.

Передбачається, що тварину-хазяїна імунізують антигеном, зв'язаним із клітинною мембраною інтактної або зруйнованої клітини, і антитіла даної заявки ідентифікують зв'язуванням з імуногенним поліпептидом за винаходом. Після імунізації хазяїна-тварини антигеном, антитіла можуть бути одержані з цієї тварини. З цієї тварини за допомогою крововитягання або умертвіння одержують сироватку, що містить антитіло. Ця сироватка може бути використана в тому вигляді, у якому вона одержана, або ці антитіла можуть бути очищені з цієї сироватки. Сироватка або імуноглобуліни, одержані таким чином, є поліклональними, отже мають гетерогенний ряд властивостей. 3.2. Моноклональні анти-КОМ А-антитіла, одержані з використанням гібридомної технології.

Моноклональні антитіла можуть бути одержані з використанням великої різноманітності способів, відомих у даній галузі, які включають гібридомну, рекомбінантну технології і технологію фагового дисплея або їх комбінацію. Наприклад, моноклональні антитіла можуть бути одержані з використанням гібридомних способів, у тому числі способів, відомих у даній галузі й описаних, наприклад, Нагіохму еї а!., Апіїроадіев: А І арогаїогу Мапиаї! (Соїд 5ргіпа Нагрог

Іарогаїогу Рге55, 2пй єед. 1988); Наттетпіпо, еї аї., іп: Мопосіопа! Апіїрбодієє апа Т-Сеї

Нубіідота5 563-681 (ЕІбземіег, М.М., 1981) (зазначені посилання включені за допомогою посилання в їх повному обсязі). Термін "моноклональне антитіло" у контексті даного опису не обмежується антитілами, одержуваними за допомогою гсгібридомної технології. Термін "моноклональне антитіло" стосується антитіла, яке одержане з єдиного клону, у тому числі еукаріотичного, прокаріотичного або фагового клону, а не способу, за допомогою якого воно одержане.

Способи одержання і скринінгу специфічних антитіл з використанням гібридомної технології є рутинними і добре відомими в даній галузі. В одному варіанті здійснення, даний винахід забезпечує способи генерування моноклональних антитіл, а також антитіла, одержані цими способами, які передбачають культивування гібридомної клітини, секретуючої антитіло за винаходом, де, переважно, гібридому генерують злиттям спленоцитів, виділених з миші, імунізованої антигеном за винаходом, з мієломними клітинами і потім виконують скринінг гібридом, одержаних з цього злиття, на гібридомні клони, що секретують антитіло, здатне зв'язувати поліпептид за винаходом. Коротко, миші можуть імунізуватися антигеном КОМ А. У переважному варіанті здійснення, антиген КОМ А вводять з ад'ювантом для стимуляції імунної реакції. Такі ад'юванти включають повний або неповний ад'ювант Фрейнда, РІВІ (мурамілдипептиди) або ІЗСОМ (імуностимулюючі комплекси). Такі ад'юванти можуть захищати поліпептид від швидкого розсіювання поміщенням його в локальне покриття, або вони можуть містити речовини, що стимулюють секрецію хазяїном факторів, які є хемотаксичними відносно макрофагів і інших компонентів імунної системи. Переважно, при введенні поліпептиду, схема імунізації буде включати два або більше введень цього поліпептиду, що розподіляються протягом декількох тижнів.

Після детектування імунної реакції, наприклад детектування антитіл, специфічних відносно антигену КОМ А, у сироватці миші, витягають селезінку миші і виділяють спленоцити. Потім спленоцити зливають добре відомими способами з будь-якими придатними клітинами мієломи, наприклад клітинами з клітинної лінії 5Р20, доступної з АТСС. Гібридоми відбирають і клонують за допомогою лімітуючого розведення. Потім гібридомні клони аналізують способами, відомими в даній галузі, на клітини, які секретують антитіла, здатні зв'язувати КОМ А. За допомогою імунізації мишей позитивними гібридомними клонами може бути генерована асцитична рідина, що звичайно містить високі рівні антитіл.

В іншому варіанті здійснення, з цієї імунізованої тварини можуть бути одержані продукуючі антитіло імморталізовані гібридоми. Після імунізації тварину умертвляють і В-клітини селезінки зливають з імморталізованими клітинами мієломи, також добре відомими в даній галузі. Див., наприклад, Нагіоу апа І апе, зирга. У переважному варіанті здійснення, ці клітини мієломи не секретують поліпептиди імуноглобуліну (несекретуюча клітинна лінія). Після злиття і відбору з бо використанням антибіотиків ці гібридоми піддають скринінгу з використанням КОМ А або його частини або клітини, експресуючої КОМ А. У переважному варіанті здійснення, виконують початковий скринінг із використанням твердофазного імуноферментного аналізу (ЕГІ5А) або радіоїмуноаналізу (КІА), переважно ЕГІЗА. Приклад скринінгу ЕГІБА забезпечений у УМО 00/37504, включеному в даний опис за допомогою посилання.

Продукуючі анти-КОМ А-антитіло гібридоми відбирають, клонують і піддають додатковому скринінгу на бажані характеристики, що включають сильний ріст гібридом, високе продукування антитіл і бажані характеристики антитіл, обговорювані додатково нижче. Гібридоми можуть культивуватися і розмножуватися іп мімо у сингенних тваринах, у тваринах, що позбавлені імунної системи, наприклад "голих" мишах, або в культурі клітин іп міго. Способи відбору, клонування і розмноження гібридом добре відомі кваліфікованим у даній галузі фахівцям.

У переважному варіанті здійснення, гібридоми є гібридомами миші, як описано вище. В іншому переважному варіанті здійснення, гібридоми одержують у видах, інших ніж людина і миша, таких як щури, вівці, свині, кози, велика рогата худоба або коні. В іншому варіанті здійснення, гібридоми є гібридомами людини, у яких несекретуюча мієлома людини злита з клітиною людини, експресуючою анти-КОМ А-антитіло.

Фрагменти антитіл, які упізнають специфічні епітопи, можуть бути генеровані відомими способами. Наприклад, фрагменти Раб і Е(абБ)» за винаходом можуть бути одержані протеолітичним розщепленням молекул імуноглобуліну з використанням ферментів, таких як папаїн (для одержання Еар-фрагментів) або пепсин (для одержання Р(ар')»-фрагментів).

Р(ав)2-фрагменти містять варіабельну область, константну область легкого ланцюга і СНІ - домен важкого ланцюга. 3.3. Анти-КОМ А-моноклональні антитіла, одержані з використанням 5ІАМ.

В іншому аспекті винаходу, рекомбінантні антитіла генерують з окремих виділених лімфоцитів з використанням процедури, називаної в даній галузі способом з відібраними на антитіла лімфоцитами (ЗАМ), описаним у Патенті США Ме 5627052, РСТ Рибіїсайоп УМО 92/02551 і Варсоск, .5. еї аЇ. (1996) Ргос. Май. Асад. 5сі ОБА 93:7843-7848. У цьому способі, окремі клітини, секретуючі антитіла, що представляють інтерес, наприклад лімфоцити, одержані з будь-якої з описаних вище імунізованих тварин, піддають скринінгу з використанням антиген- специфічного гемолітичного аналізу бляшок, де антиген КОМ А, субодиницю КОМ А або його

Зо фрагмент зв'язують з еритроцитами вівці за допомогою лінкера, такого як біотин, і використовують для ідентифікації окремих клітин, які секретують антитіла, специфічні відносно

КОМ А. Після ідентифікації секретуючих антитіло клітин, що представляють інтерес, КДНК варіабельної області важкого ланцюга і легкого ланцюга вивільняють з цих клітин за допомогою

ПЛР зі зворотною транскриптазою і ці варіабельні області можуть бути потім експресовані, у контексті придатних константних областей імуноглобуліну (наприклад, константних областей імуноглобуліну людини), у клітинах-хазяїнах ссавця, таких як клітини СО5 або СНО. Клітини- хазяїни, трансфіковані цими ампліфікованими послідовностями імуноглобуліну, одержаними з відібраних іп мімо лімфоцитів, можуть бути потім піддані додатковому аналізу і відбору іп міїго, наприклад, за допомогою пенінгу трансфікованих клітин для виділення клітин, експресуючих антитіла до КОМ А. Ці ампліфіковані послідовності імуноглобуліну можуть бути потім піддані маніпуляціям іп міго, таким як способи дозрівання афінності іп міго, такі як способи, описані в

РСТ Рибіїсабйоп УМО 97/29131 і РСТ Рибіїсайоп М/О 00/56772. 3.4. Моноклональні анти-КОМ А-антитіла, одержані з використанням трансгенних тварин.

В іншому варіанті здійснення винаходу, антитіла одержують імунізацією тварини (не людини), що містить декілька локусів або усі локуси імуноглобуліну людини, антигеном КОМ А.

У переважному варіанті здійснення, цією твариною (не людиною) є трансгенна миша

ХЕМОМОИЄЗЕ, одержаний генною інженерією штам миші, що містить великі фрагменти локусів імуноглобуліну людини і є дефектним у продукуванні антитіл миші. Див., наприклад, огееп еї аї.

Маїиге Сепеїйсв 7:13-21 (1994) і Патенти США Мо 5916771, 5939598, 5985615, 5998209, 6075181, 6091001, 6114598 і 6130364. Див., також УМО 91/10741, опублікований 25 липня 1991 року, УМО 94/02602, опублікований З лютого 1994 року, УМО 96/34096 і УМО 96/33735, обидва опубліковані 31 жовтня 1996 року, УМО 98/16654, опублікований 23 квітня 1998 року, УМО 98/24893, опублікований 11 червня 1998 року, УМО 98/50433, опублікований 12 листопада 1998 року, МО 99/45031, опублікований 10 вересня 1999 року, М/О 99/53049, опублікований 21 жовтня 1999 року, УМО 0009560, опублікований 24 лютого 2000 року і МО 00/037504, опублікований 29 червня 2000 року. Трансгеенна миша ХЕМОМОИШЗ5Е продукує подібний до репертуару дорослої людини репертуар повністю людських антитіл і генерує антигенспецифічні тАб людини.

Трансгенна миша ХЕМОМОИЗЕ містить приблизно 8095 репертуару антитіл людини за допомогою введення в розмірі мега п.н. МАС-фрагментів локусів важкого ланцюга людини х бо локусів легкого ланцюга конфігурації зародкової лінії. Див. Мепае? еї а!., Маїшге Сепеїйсз 15:146-

156 (1997), Стеєп апа даКороміїв У. Ехр. Мед. 188:483-495 (1998), описи яких включені в даний документ за допомогою посилання. 3.5. Моноклональні анти-КОМ А-антитіла, одержані з використанням бібліотек рекомбінантних антитіл. Способи іп міо можуть бути також використані для одержання антитіл за винаходом, у якому бібліотеку антитіл піддають скринінгу для ідентифікації антитіла, що має бажану специфічність зв'язування. Способи для такого скринінгу бібліотек рекомбінантних антитіл добре відомі в даній галузі і включають способи, описані, наприклад, у І адпег еї аї.

Патенті США Мо 5223409; Капо еї аї. Публікації РСТ Мо МО 92/18619; Юоуег єї а. Публікації РСТ

Мо УМО 91/17271; М/іпієг еї аЇ. Публікації Мо М/О 92/20791; МагКіапа еї аї. Публікації РСТ Мо УУО 92/15679; Вгейіпод еї аІ. Публікації РСТ Мо УУО 93/01288; МсСапнепу еї а. Публікації РСТ Мо УМО 92/01047; Сатага еї аІ. Публікації РСТ Мо УМО 92/09690; Рисп5 еї аї. (1991) Віо/ГТесппоіоду 9:1370-1372; Нау єї аїІ. (1992) Нит Апіїбод Нубгідотавз 3:81-85; Низе єї аЇ. (1989) Зсієпсе 246:1275-1281; МсСапйенпу еї аї. Майте (1990) 348:552-554; Супінйнз еї а. (1993) ЕМВО . 12:725- 734; НамкКіпз еї аї. (1992) У Мої Віої 226:889-896; Сіаскзоп еї аї. (1991) Майшге 352:624-628; Стат еї аІ. (1992) РМА5 89:3576-3580; Са!тавй еї а!. (1991) Віо/ТесппоІоду 9:1373-1377; Ноодепроот єї а. (1991) Мис Асіа Рез 19:4133-4137; і Ваграз еї аї. (1991) РМАЗ 88:7978-7982, Публікації заявки на патент США 20030186374 і Публікації РСТ Мо МО 97/29131, зміст яких включений в даний опис за допомогою посилання.

Бібліотека рекомбінантних антитіл може бути одержана у індивіда, імунізованого КОМ А або частиною КОМ А. Альтернативно, бібліотека рекомбінантних антитіл може походити від необробленого індивіда, тобто індивіда, що не був імунізований КОМ А, наприклад, бібліотека антитіл людини з індивіда-людини, що не була імунізована КОМ А людини. Антитіла за винаходом вибирають скринінгом бібліотеки рекомбінантних антитіл пептидом, що містить ЕСМ

А людини, для відбору за допомогою цього антитіл, які упазнають КОМ А. Способи проведення такого скринінгу і відбору добре відомі в даній галузі, такі як способи, описані в посиланнях у попередньому абзаці. Для відбору антитіл за винаходом, що мають конкретні афінності зв'язування відносно ПКОМ А, таких як антитіла, що дисоціюються від КОМ А людини з конкретною константою швидкістю Кої, може бути використаний відомий у даній галузі спосіб резонансу поверхневих плазмонів для відбору антитіл, що мають бажану константу швидкості

Зо Конг Для відбору антитіл за винаходом, що мають конкретну нейтралізуючу активність відносно

ЯКОМ А, таких як антитіла з конкретною ІСво, можуть бути використані стандартні способи, відомі в даній галузі, для оцінки інгібування активності ПЕОМ А.

В одному аспекті, цей винахід стосується виділеного антитіла або його антигензв'язувальної частини, які зв'язують КОМ А людини. Переважно, антитіло є нейтралізуючим антитілом. У різних варіантах здійснення, антитіло є рекомбінантним антитілом або моноклональним антитілом.

Наприклад, антитіла за даним винаходом можуть бути також генеровані з використанням різних способів фагового дисплея, відомих у даній галузі У способах фагового дисплея, функціональні домени антитіла представлені на поверхні фагових частинок, які несуть кодуючі їх полінуклеотидні послідовності. Зокрема, такий фаг може бути використаний для представлення антигензв'язувальних доменів, експресованих з репертуару або комбінованої бібліотеки антитіл (наприклад, людини або миші). Фаг, експресуючий антигензв'язувальний домен, який зв'язує антиген, що представляє інтерес, може бути відібраний або ідентифікований з використанням антигену, наприклад з використанням міченого антигену або антигену, зв'язаного з твердою поверхнею або гранулою або прикріпленого до твердої поверхні або гранули. Фаг, використовуваний у цих способах, є звичайно нитчастим фагом, що включає зв'язувальні домени ї4 і МІЗ, експресовані з фага, з доменами Рар, Ем або стабілізованого дисульфідом Ем антитіла, злитими з білком або гена І, або гена МІ фага. Приклади способів фагового дисплея, які можуть бути використані для одержання антитіл даного винаходу, включають приклади способів, описані в ВгіпКтап еї аї., У). Іттипої. Мейодз» 182:41-50 (1995);

Атевз еї аї., У. Іттипої. Меїйоа5 184:177-186 (1995); КешШерогоцдн еї аї, Єиг. у. Іттипої. 24:952- 958 (1994); Регзіс еї аї. Сепе 187 9-18 (1997); Випоп вї а). Адмапсез іп Іттипоїоду 57:191-280 (1994); Публікації РСТ Мо РСТ/5891/01134; Публікаціях РСТ Мо УМО 90/02809; УМО 9110737; УМО 92/01047; МО 92/18619; УМО 93/11236; УМО 95/15982; УМО 95/20401; і Патентах США Мо 5698426; 5223409; 5403484; 5580717; 5427908; 5750753; 5821047; 5571698; 5427908; 5516637; 5780225; 5658727; 5733743 і 5969108; зазначені посилання включені в даний опис за допомогою посилання в їх повному обсязі.

Як описано в наведених вище посиланнях, після відбору фага, кодуючі області антитіла з фага можуть бути виділені і використані для генерування повнорозмірних антитіл, у тому числі бо антитіл людини або будь-якого іншого бажаного антигензв'язувального фрагмента, і

Зо експресовані в будь-якому бажаному хазяїні, у тому числі клітинах ссавця, клітинах комахи, клітинах рослини, дріжджах і бактеріях, наприклад, як описано більш докладно нижче.

Наприклад, можуть бути також використані способи рекомбінантого одержання фрагментів Раб,

Еаб'ї Е(аб)», з використанням способів, відомих у даній галузі, таких як способи, описані в

Публікації РСТ УМО 92/22324; Миїййпах еї аї, ВіоТесппідсе5 12(6):864-869 (1992); і Замаї еї аї,

АВІ 34:26-34 (1995); і Вебег еї а). Зсівєпсе 240:1041-1043 (1988) (зазначені посилання включені в даний опис за допомогою посилання в їх повному обсязі). Приклади способів, які можуть бути використані для одержання одноланцюжкових Ем і антитіл, включають способи, описані в

Патентах СІНА 4946778 і 5258498; Нивіоп еї аї., Мешйоавз іп Еплутоїоду 203:46-88 (1991); 5пи єї аІ,, РМАБ5 90:7995-7999 (1993) і ЗКеїта еї аі., 5сіепсе 240:1038-1040 (1988).

Альтернативою скринінгу бібліотек рекомбінантних антитіл за допомогою фагового дисплея, інші методології, відомі в даній галузі для скринінгу великих комбінаторних бібліотек, можуть бути застосовані до ідентифікації антитіл за винаходом з подвійною специфічністю. Одним типом альтернативної системи експресії є тип, у якому бібліотеку рекомбінантних антитіл експресують у вигляді злиттів РНК-білок, як описано в Публікації РСТ Мо УМО 98/31700 (52051аК апа Корегів) і в Корегів5, К.МУ. апа 520о51аК, УМ. (1997) Ргос. Май. Асад. 5сі. ОБА 94:12297-12302.

У цій системі, створюється ковалентне злиття між мРНК і пептидом або білком, який вона кодує, за допомогою іп міїго трансляції синтетичних мРНК, які несуть пуроміцин, пептидил-акцепторний антибіотик, на їх 3'-кінці. Таким чином, специфічна мРНК може бути збагачена з комплексної суміші мРНК (наприклад, комбінаторної бібліотеки) на основі властивостей кодованого пептиду або білка, наприклад антитіла або його частини, таких як зв'язування цього антитіла або його частини з антигеном подвійної специфічності. Послідовності нуклеїнових кислот, кодуючі антитіла або їх частини, витягнуті зі скринінгу таких бібліотек, можуть бути експресовані рекомбінантними способами, як описано вище (наприклад, у клітинах ссавця-хазяїна), і, крім того, можуть бути піддані додатковому дозріванню афінності або додатковим раундам скринінгу злиттів МРНК-пептид, мутації що були введені в початково вибрану послідовність (початково вибрані послідовності), або іншими способами дозрівання афінності іп міго рекомбінантних антитіл, описаними вище.

В іншому підході антитіла даного винаходу можуть бути також генеровані з використанням способів дріжджового дисплея, відомих у даній галузі У способах дріжджового дисплея, використовують генетичні способи для прикріплення доменів антитіл до клітинної стінки дріжджів і представлення їх на поверхні дріжджів. Зокрема, такі дріжджі можуть бути використані для представлення антигензв'язувальних доменів, експресованих з репертуару або комбінаторної бібліотеки антитіл (наприклад, людини або миші). Приклади способів дріжджового дисплея, які можуть бути використані для одержання антитіл даного винаходу, включають способи, описані Умігігир, еї аЇ. Патент США Мо 6699658, включений у даний опис за допомогою посилання. 4. Одержання конкретних рекомбінантних КОМ А-антитіл за винаходом.

Антитіла даного винаходу можуть бути одержані будь-яким з ряду способів, відомих у даній галузі. Наприклад, може бути використана експресія з клітин-хазяїнів, де експресуючий вектор (експресуючі вектори), кодуючий важкий і легкий ланцюги, трансфікують у клітину-хазяїна стандартними способами. Передбачається, що різні форми терміна "трансфекція" включають велику різноманітність способів, звичайно використовуваних для введення екзогенної ДНК у прокаріотичну або еукаріотичну клітину-хазяїна, наприклад, електропорацію, осадження фосфатом кальцію, трансфекцію з використанням ДЕАЄЕ-декстрану і т. п. Хоча можна експресувати антитіла за винаходом в будь-яких прокаріотичних або еукаріотичних клітинах, переважною є експресія антитіл в еукаріотичних клітинах-хазяїнах і найбільш переважною є експресія в клітинах-хазяїнах ссавців, оскільки такі еукаріотичні клітини (і, зокрема, клітини ссавців) з більшою імовірністю, ніж прокаріотичні клітини, збирають і секретують правильно укладене і імунологічно активне антитіло.

Переважні клітини-хазяїни ссавців для експресії рекомбінантних антитіл за винаходом включають клітини яєчника китайського хом'ячка (клітини СНО) (у тому числі клітини ай-СНО, описані в Огпацр апа Спабвіп, (1980) Ргос. Майї. Асай. Зсі ОА 77:4216-4220, використовувані з

ОНЕВ-селектованим маркером, наприклад, як описано в К.). Кашйтап апа Р.А. Зпагр (1982)

Мої. ВіоІ. 159:601-621), клітини мієломи МО, клітини СОЗ і клітини 5Р2. При введенні рекомбінантних експресуючих векторів, кодуючих гени антитіл, у клітини-хазяїни ссавців, антитіла одержують культивуванням клітин-хазяїнів протягом періоду часу, достатнього для можливості експресії антитіла в клітинах-хазяїнах, або, більш переважно, секреції антитіла в культуральне середовище, у якому вирощуються клітини-хазяїни. Антитіла можуть бути 60 витягнуті з культурального середовища з використанням стандартних способів очищення білка.

Клітини-хазяїни можуть бути також використані для одержання функціональних фрагментів антитіл, таких як Рар-фрагменти або молекули 5сЕм. Буде зрозуміло, що варіації вищеописаної процедури знаходяться в обсязі даного винаходу. Наприклад, може бути бажаною трансфекція клітини-хазяїна ДНК, кодуючої функціональні фрагменти легкого ланцюга і/або важкого ланцюга антитіла за винаходом. Технологія рекомбінантних ДНК може бути також використана для видалення деякої частини або всієї ДНК, кодуючої будь-який з легкого ланцюга і важкого ланцюга або обидва ці ланцюги, яка не є обов'язковою для зв'язування антигенів, що представляють інтерес. Молекули, експресовані з таких укорочених молекул ДНК, також включені в антитіла за винаходом. Крім того, можуть бути одержані біфункціональні антитіла, у яких один важкий ланцюг і один легкий ланцюг є ланцюгами антитіла за винаходом, а інший важкий ланцюг і інший легкий ланцюг є специфічними відносно антигену, іншого ніж антигени, що представляють інтерес, у результаті зшивання антитіла за винаходом з другим антитілом стандартними хімічними способами зшивання.

В одній переважній системі для рекомбінантної експресії антитіла або його антигензв'язувальної частини за винаходом, рекомбінантний експресуючий вектор, що кодує як важкий ланцюг антитіла, так і легкий ланцюг антитіла, вводять у клітини апт-СснНо опосередковуваною фосфатом кальцію трансфекцією. У цьому рекомбінантному експресуючому векторі кожний з генів важкого і легкого ланцюга антитіла функціонально зв'язаний з регуляторними елементами енхансер СММ/промотор АЯМІ Р. для запуску високих рівнів транскрипції цих генів. Цей рекомбінантний експресуючий вектор несе також ген ОНЕРК, що дозволяє робити відбір клітин СНО, які були трансфіковані цим вектором, з використанням метотрексатного відбору/ампліфікації. Відібрані трансформовані клітини-хазяїни культивують для можливості експресії важкого і легкого ланцюгів цього антитіла і з культурального середовища витягають інтактне антитіло. Для одержання рекомбінантного експресуючого вектора, трансфекції клітин-хазяїнів, відбору на трансформанти, культивування клітин-хазяїнів і витягання цього антитіла з культурального середовища використовують стандартні способи молекулярної біології. Крім того, цей винахід забезпечує спосіб синтезу рекомбінантного антитіла за винаходом культивуванням клітини-хазяїна за винаходом в придатному культуральному середовищі, поки не буде синтезоване рекомбінантне антитіло за винаходом.

Ко) Спосіб може додатково передбачати виділення цього рекомбінантного антитіла з культурального середовища. 4.1. Анти-ВОМ А-антитіла є списком амінокислотних послідовностей областей МН і МІ. переважних анти-пкОМ А-антитіл за винаходом.

Таблиця 5

Список амінокислотних послідовностей областей УН і М АНТИ-пеЕОМ А-АНТИТІЛ 59 І 801

ЗБОЮ МО | Областьбілка | ://////777///0/|711111111 Послідовність: 11111111 1123456789012345678901234567890

КУССУВЯВСОСМОгРОВНК,

НУАСЕТЕВАУОМАЛИКО

АРЕКОГ КУМ УХТеВЕК 34 УН5Е9 й ще схжневи ж

НАУК ОКЕПаКОМКМ

ТУ СОММе КЕ ТАТУ У САК вч УМ У ТУ

Залишки 31-35 муза 58 МН БЕЗ СОВ-Н2 5О-66 МУКА КИ

ЗЕО О МО:34

Залишки 59 МН 5Е9 СОВ-НЗ 99-104 СТРУ

ЗЕО О МО:34

Таблиця 5

Маск Ук Ве

ОКО РОБІТТУКУКЕ

МІ БЕЗ ККТУРОНЕК СО ТРК

БУРЕ СЕ АТНве

ТЕО ЕКС КА.

Залишки

МІ 5Е9 СОВ-І1 24-39 а и Я КЗ ВК Я

ЗЕОІЮМО:10

Залишки 61 МІ. 5Е9 СОВ-І2 55-61 КуВМакь

ЗЕОІЮМО:10

Залишки 62 МІ. 5Е9 СОВ-І З 94-102 КОАТНОРСЕ

ЗЕОІЮМО:10

КУСОК УКРОТЗУКЮМ

МКС УуТМУМН В

КРОК АК РУКОК

Унеорі1 УМЕКЕКСКАТЛЮКО А

Ум ТУ УС АНИ вве ик и САНИ

Залишки 63 УНнВр1сСОоВв-НІ1 31-35 УМ

ЗЕО ІЮО МО:55

Залишки 64 ун 801 СОов-Н2 50-66 УРУМОКТЕЕЕЕ В

ЗЕО ІО МО:55

Залишки 65 ун 801 СОвВ-НЗ 97-110 АВИМЕУСаАКУЄ

ЗЕО ІЮО МО:55

ПОМ ТОХРАБЕЗАМЕВЕ УТ

ЛАВОК А У НОКІК

96 МІ.801 соті тече гуму ем

ПЗ ОР КЕ ВОНИ, с КВТ ЕС

Залишки

МІ в01СОВ-11 2-34 ОАчОВЦУЧУТА

ЗЕО ІЮ МО:56 нан

Залишки 50-56 67 М в8р1СОов-12 ЗЕО ІЮ МО:56 змі АВ

Залишки 89-97 гіцстутвивт вв МІ 801СОВ8-І 3 5ЕО ІЮ МО:56 ЗАМКІВ

Наведені вище виділені СОК-послідовності анти-КОМ А-антитіла утворюють нове сімейство

КОМ А-зв'язувальних білків, виділених відповідно до цього винаходу. Для генерування і для відбору СОК за винаходом, що мають переважну КОМ А-зв'язувальну і/або нейтралізуючу активність відносно ПКОМ А, можуть бути використані стандартні способи, відомі в даній галузі для генерування зв'язувальних білків даного винаходу й оцінки зв'язування КОМ А і/або нейтралізуючих характеристик цього зв'язувального білка, у тому числі, але не тільки, способи, конкретно описані в даному описі. 4.2. Химерні анти-КОМ А-антитіла.

Химерне антитіло є молекулою, у якій різні частини антитіла одержані з різних видів тварин, такою як антитіла, що мають варіабельну область, одержану з моноклонального антитіла миші, і константна область імуноглобуліну людини. Способи одержання химерних антитіл відомі в даній галузі. Див., наприклад, Моїтізоп, Зсіепсе 229:1202 (1985); ОЇ еї а!., ВіоТесппіднев 4:214 (1986); СіПез єї а!., (1989) 9. Іттипої. МешШодвз 125:191-202; Патенти США Мо 5807715; 4816567 і 4816397, які включені в даний опис за допомогою посилання в їх повному обсязі. Крім того, можуть бути використані способи, розроблені для одержання "химерних антитіл" (Могтізоп еї аї., 1984, Ргос. Маї). Асад. 5беї. 81:851-855; Меийибегодег" єї аї!., 1984, Маїшге 312:604-608; ТаКеда еї аї., 1985, Маїште 314:452-454, які включені в даний опис за допомогою посилання в їх повному обсязі) сплайсингом генів з молекули антитіла миші придатної антигенної специфічності разом з генами з молекули антитіла людини придатної біологічної активності.

В одному варіанті здійснення, химерні антитіла за винаходом одержують заміною константної області важкого ланцюга моноклональних антитіл миші проти КОМ А антитіл людини, описаних у даному описі, константною областю до людини. 4.3. СОВ-щеплені анти-КОМ А-антитіла.

СОВ-щеплені антитіла за винаходом містять послідовності варіабельної області важкого і легкого ланцюга антитіла людини, у яких одна або декілька СОМ -областей УН і/або МІ. замінені

СОВ-послідовностями антитіл не людини, наприклад антитіл миші за винаходом. Каркасна послідовність з будь-якого антитіла людини може служити як шаблон для трансплантації СОМ.

Однак, пряма заміна ланцюга на такій каркасній ділянці часто приводить до деякої втрати зв'язувальної афінності відносно цього антигену. Чим більш гомологічним антитіло людини є відносно вихідного антитіла миші, тим менш ймовірною є можливість того, що об'єднання СО миші з каркасною ділянкою людини буде вводити порушення в ці СОК, що можуть зменшувати афінність. Таким чином, переважно, варіабельна каркасна ділянка людини, яка вибрана для заміни варіабельної каркасної ділянки миші, має щонайменше 65 95 ідентичність послідовності з варіабельною каркасною ділянкою антитіла миші. Більш переважно, варіабельні області людини і миші, окремо від цих СОК, мають щонайменше 70 95 ідентичність послідовності.

Навіть ще більш переважно, варіабельні області людини і миші, окремо від цих СОК, мають щонайменше 7595 ідентичність послідовності. Найбільше переважно, варіабельні області людини і миші, окремо від цих СОК, мають щонайменше 80 95 ідентичність послідовності.

Способи одержання СОК-щеплених антитіл відомі в даній галузі (допез еї аї., Маїиге 321:522- 525 (1986); Патент США Мо 5225539). В одному конкретному варіанті здійснення цей винахід забезпечує СОН-щеплені антитіла з ланцюгами МН і/або Мі,, описаними в таблиці 6.

Таблиця 6

СОВ-щелепні антитіла 35 МН 5Е9.1-01. ЕМО УВО ОРОС ВІ ЯСААВ (15) (МНнЗ-48/0НЗ ЕН) ОРЕ УМКуУУКОАРОКОСЕМУУ (16) (УНЗ-48/УН3 ЕВ2) ЗМУ ПЕК НУАпЛеУКСВРТКО (17) (МНЗ-48/9Н3 ЕВЗ) МАКМУВ ЛГ ОММН КОБІТАУТСА (18) (МНЗІ-48/9НЗ ЕН) КОСТТРВУЖСОСТМУТУВЬ

Таблиця 6

СОВ-щелепні антитіла 36 МН 5Е9.2-01. ЕМО УВС Моро ВГ ОСААЯ (15) (МНЗ-48/УНАЕВІ) СЕТ КСМАУУКОАРОКОГЕММ (16) (МНЗ-48/ІН4 ЕВ) ЗМІ У пЗЕКнКАВБУКОКЕПЬКО (17) (МНЗ-48/)НА ЕВЗ) МАКМЗІИОММОІКОБВТАУТ СА (19) (МнЗІ-яВЮНЯ ЕНЯ) КОТРЕ мусу Ту 37 МН 5Е9.3-01. ЕМО УЕБССОТМОРОСВІ КІ СА АВ (15) (МНЗ-48/9Н6 ЕВ) СЕТЕБМУ СМ У У КОАРОКИ ЕЖУУ (16) (МНнЗ-48/ОН6 ЕНг) «МІУ О5Б5БЕКНУАПЛЗУКСОСКЕТІВКО (17) (уНЗ-48/УН6 ЕВЗ) МАКМО У ОММБІКЖОЕОТАМУУУСА (20) (МНЗ-48/0Нб6 ЕНа) КСОТТРІУ МсСООТТУТУ55 38 МН 5Е9.4-ОІ. ОМОГУЕБОСОСУМОРОКВІ КГ 5СА АВ (21) (МНЗ-33/УНЗ ЕВ) СЕТЕБЕМК МІУ УКОА РОКИ ЕММ (22) (МНЗ-33/ОНЗ ЕНг) АМІУХхО5бЕКНУАрЗУКСЕ ЕТІЗКО (23) (УНЗ-33/УНЗ ЕВЗ) МКМ УТ ОММ5ІКАЕОТАМУУТСА (18) (МНЗІ-33/9НЗ ЕН) КОТТРОУ УСОСТМУТУ В 39 МН 5Е9.5-0І. ОУОСУБоасУУСО Рак ОСА (21) (унЗ-ЗзНаРВІ) | ОЕТЕЗМУЄМУЖУКОАРОКОГЕЖУ (22) (унЗ-33/ІНА Аг) 00 АМГУУЮЯЕКИУАОВУКСЕЕТІхВО (23) (МНЗ-33/9Н4 ЕВЗ) МеКМПЛУОММВІКАВОТАМУ СА (19) (МНЗ-33/0На На) ВОТТРОУ СОС УТУВВ 40 МН 5Е9.6-01. ОМОГУЕБОООСУМОРОКВІКІ БСААБ (21) (МНЗ-33/ІН6 ЕВ) СЕТАМ УСММ МУ УКОАРОКОГЕМУ (22) (МНЗ-33/ІН6 ЕВ) АМІУУО55ЕКНКУАОЗУКСКЕТІЗКО (23) (МНЗ-33/ІН6 ЕВЗ) МЗКМІГУТОММБІКАЕВТАУХ СА (20) (МНЗ-33/ІН6 ЕВ4) КОТТРОУМСОСТТУТУ5о ді МН 5Е9.7-01. ЕМО ЕБСССТІМОРОСВІКІ СА (24) (МНЗ-23/ІН3 ЕВ) СЕТЕБМУСМАУУКОАРОКОТЕМУ (25) (МНнЗ-23/9НЗ ЕНг) ЗМУ О5зЕКНУ АВ КСКЕТІВКО (26) (МНЗ-23/ІН3 ЕВЗ) МКМ ОММВІКАЕПТАУТУСА (18) (МНЗ-23/9Н3 ЕВ4) КОТІРОУУСОСТМУТУ55 42 МН 5Е9.8-СІ. ЕУМОТ ГЕБОСОГУОРСОВІ КІ 5САА В (24) (МнЗ-23/9НангнІ) сСЕТЕЄМ КОМУ УУКОАРОКОГЕЖУ (25) (МнЗ-23/9На гНг) 5МУхО55ЕКНУАРБУКСЕВТІВКО (26) (МмнЗі-г3/оНа ВЗ) МКМ ОММІКАВЕОТАУХУСА (19) (МНЗ-23/9НА ЕВ) КОТТРОУ МУСОСТІУТУБЬ

Таблиця 6

СОВ-щелепні антитіла

ЗЕОИЮ МО

43 МН 5Е9.9-01. ЕМО ЕБСОСТУОРОСВІ КІ БСААВ (24) (мнЗ-гЗ Не) ОГТЕБМКОММУУКОАРОКОТГЕМУ (25) (МнЗ-г3Не гг) «МІХ О5Б5БЕКНКА ОМ КСКЕТІЗКО (26) (МНЗ-23/ІН6 ЕВЗ) МКМ У ОММВІКАЕОТАМУХУСА (20) (МнЗ-23/9Нб На) КСТТРОУМСОСТТУТУ55 44 МІ. БЕ9.1-О1. ПУМТОТРІБІГ ЗУТРООРАБІЗСКВЬ (27) (АТ18//К2ЕВІ) О5БГ'ЄУЗОСУТЕСЕМУТОКРООБРО (28) (АТ8//К2ЕВ) ІЛІХЕУЗМКЕБОУРОКЕБОИОИВИТОЕ (29) (АТ8/ІК2 ЕВЗ) ТІКІЗКУЕАЕВУСУУУСЕОАТНОР (30) (А18//К2ЕВА) І ТЕСОсТКІ ВІКК 45 МІ 5Е9.2-01. ОУУМтТО5РІ БІ РУТІ СОРАВІБСКВ (31) (А17//К2ЕВІ) О5БГКУ5БОСУТКЕМУКООКРООБРЕ (32) (А17/9)К2 ЕВ) ЕІХЕУЗМКЕБОСУРОКЕВБО5О5ОТОЕ (33) (А17/К2ЕВЗ) ЛІКІЗКУЕАЕОВУСУХУУСЕОАТНОР (30) (АТ7/КагНа) ІГ/.ТЕСОСТКІ ЕІКК 46 МІ 5Е9.3-01. оУУМТОВРІЯЕУТ СООРАЯНВСНВВ (31) (А17/УК2ЕВІ) суму ГгОКРООВБГО (28) (АТ8/УК2ЕНг) 1ЛУЄУЄМКЕВСУРОКЕВОБО5ОТОЕ (29) (АТВ/Кг РНЗ) ПНЕТВБКУБАБОУСУУУСЕОАТНОР (30) (Д18/К2ЕНАІ) СТтЕООСТКТ ЕК

СОВ-послідовності, одержані з тАБб 5Е9, зазначені жирним, шрифтом, робиться також посилання на конкретні каркасні послідовності (ЕК1-ЕК4) за допомогою указання відповідних

ЗЕО ІЮ МО: (див. також таблиці З і 4). 4.4. Гуманізовані анти-КОМ А-антитіла.

Гуманізовані антитіла є молекулами антитіл з антитіла виду не людини, що зв'язує бажаний антиген, який має одну або декілька областей, що визначають компліментарність (СОК), з виду не людини і каркасні області з молекули імуноглобуліну людини. Відомі послідовності Їд людини описані, наприклад, у ммм.пебрі.піт.піпй.дом/епіге2-/диегу.їсді; мли. аїсс.огу/рпаде/пар.піті; 10. мм. всідоевісоту/; жммм.арсат.соту/; мумм.апііродугезоцсе.сот/опіпесотр. піті; мм. рибіїс.іазіаіє. еди/.ароцї. реаго/гезеагсі іооів5.піті; мулу. тдеп.ипінеідеІрего.авє/5ОЛТ/Т.Іті; мм м пітеетап.сот/іттипоіоаду/СнН-ОБ/КиБуоБ. піт; мм Ліргагу ІіпКадневі.огу/12429/Лттипе/Апіїбоду.піті; мм. пАті.огу/дгапізЛесіигев/1996/иаб/; мм. раї.сат.ас.ик/.ароші. тс /тікеітадев.пІті; мумм.апііродугезошигсе.соту/; тер.Нагмага.еди/Віої іпк5/ттипо!і оду. пПіті.мумлму. іттипоодуїїпК.осот/; раїйброх мивії.еди/.ароцї.псепіег/Іпаех.-пІті; мимли.ріотесп. ші .еди/.ароші. пеі1/; мимли.реріо.сот/ра/340913/340913.йПіті-; мумлиу.па!. зда. дом/аміс/риб5/апіроду/; -м/млу.т.епіте- и.асір/.арош.уазинйо-/ЕїЇїза.піті; мимли.ріодезідп.сот/абіе.азр; мм спе иК/ахр/Ласз/дамівезЛіпкво.піті; / мумлу.Біотесн. ші. еди/.ароші Тосі/ргоїосої!.піті; мм. ізас- пеї.огд/5іе5з део.піті; ахіті ті ипі-тагрига.де/арбоцітек/"АЕР-СТан.йіті; разегу.исі.Кип.пі/.ароші.|гааїзЛіпкві.Ріті; /-м/млиу.гесар.ипі-на.де/Ллттипо.Бте.пуи.ейи/; мл. тгс- сре.сат.ас.ик/ті-дос/рибіс/МТвоО.Нліті; 0 милу Ір ипат.тх/миіг/У тісе.Ніті; ітді.спивс. 81047; мимли.ріоспет.исі.ас.иК/.ароці. тапіп/арз/Іпаех.піті; апіїроду.раїн.ас.ик/; ардеп.смт.ати.еди/Ларлумугардеп.піті;. м/млу. ипі2и.сп/.ароції.попедде/АНОзет-іпаг/5іїде01.піті;

Зб мимли.сгувірЬкК.ас.ик/.арош.ирса075/; мм. піт. тгс.ас.ик/Сб/ссаємд/ссаєма. піт; мимли.раш.сат.ас.ик/.арош. тис7/п-итапізайоп/ТАННР.ПпІті; мли. ЇБі. ипат. тх/міг/вігисіиге/віаї аіт.піті; мимли.ріозсі. тівзошШшгті.еди/5тіпар/іпаєх.піті; мимли.сгуві.ріос.сат. ас.ик/.арош.тоїїпа/Л/ер-радез/Рерузронесп.піті; мумли |егіпі.делЛи роодисів.піт; м/млу.раїепів.Ірт.сот/Юрт.пІті. Кабаї еї а!., Зедиепсев ої Ргоївїп5 ої Іттипо|одісаї

Іп'єге5і, 0.5. Оері. Неанп (1983), кожна з який включена повністю за допомогою посилання. Такі послідовності, що вводяться, можуть бути використані для зменшення імуногенності або зменшення, збільшення або модифікації зв'язування, афінності, швидкості асоціації, швидкості дисоціації, авідності, специфічності, часу на півжиття або будь-якої іншої придатної характеристики, як відомо в даній галузі. Каркасні залишки в каркасних областях людини можуть бути замінені відповідним залишком з антитіла-донора СОК для зміни, переважно поліпшення, зв'язування антигену. Ці каркасні заміни ідентифікують способами, добре відомими в даній галузі, наприклад моделюванням взаємодій СОК і каркасних залишків для ідентифікації каркасних залишків, важливих для зв'язування антигену, і ідентифікацією незвичайних каркасних залишків у конкретних положеннях (Див., наприклад, Оцееп еї аІ., Патент США Мо 5585089; Кіесптапп еї аїЇ., Маїшге 332:323 (1988), які включені в даний опис за допомогою посилання в їх повному обсязі). Тривимірні моделі імуноглобуліну звичайно є доступними і відомі кваліфікованим у даній галузі фахівцям. Доступні комп'ютерні програми, які ілюструють і показують можливі тривимірні конфірмаційні структури відібраних кандидатних послідовностей імуноглобуліну. Дослідження цих дисплеїв дозволяє аналізувати ймовірну роль цих залишків у функціонуванні такої кандидатної послідовності імуноглобуліну, тобто аналізувати залишки, що впливають на здатність цього кандидатного імуноглобуліну зв'язувати його антиген. Таким чином, залишки ЕК можуть бути відібрані з консенсусної послідовності і послідовності, що вводиться (імпортована), і об'єднані так, що одержують бажану характеристику антитіла, таку як збільшена афінність відносно антигену-мішені (антигенів-мішеней). Звичайно, ці залишки СОМ прямо і найбільш суттєво беруть участь у впливі на зв'язування антигену. Антитіла можуть бути гуманізовані з використанням способів, відомих у даній галузі, таких як, але ними не обмежуючи, способи, описані в Уопев5 еї аїЇ., Майте 321:522 (1986); Метоеуеєп еї аї., Зсієпсе 239:1534 (1988)), бітв еї аї, У. Іттипої. 151: 2296 (1993); Споїпіа апа І е5К, 9. Мої. Віо!. 196:901 (1987), Сапег вї аї, Ргос. Маї). Асад. сі. 0О.5.А. 89:4285 (1992); Ргезіа вї аї, 9. Іттипої. 151:2623 (1993), Радіап, Моїесшіаг Іттипоіоду 28(4/5):489-498 (1991); 5щшапісКа єї аї. Ргоївєїп Епдіпеєегіпд 7(6):805-814 (1994); ВодизкКа. єї ам, РМАБ 91:969-973 (1994); Публікації РСТ УМО 91/09967, РСТ/.

О5О8/16280, И5Об/18978, 0О5О1/09630, 0591/05939, 0594/01234, 1В89/01334, СсВ91/01134, авог/01755; МО 90/14443, МО 90/14424, МО 90/14430, ЕР 229246, ЕР 592106; ЕР 519596, ЕР 239400, Патенти США Мо 5565332, 5723323, 5976862, 5824514, 5817483, 5814476, 5763192, 5723323, 5766886, 5714352, 6204023, 6180370, 5693762, 5530101, 5585089, 5225539; 4816567, кожне з цих посилань включене в даний опис за допомогою посилання в повному обсязі, що включає цитовані в них посилання. 5. Додаткові варіанти антитіл за винаходом. 5.1. Злиті антитіла і імуноадгезини.

Дана заявка описує також злите антитіло або імуноадгезин, яке може бути одержане і яке містить все ЕОМ А-антитіло або частину КОМ А-антитіла даного винаходу, зв'язані з іншим поліпептидом. У деяких варіантах здійснення, тільки варіабельна область КОМ А-антитіла зв'язана з цим поліпептидом. В інших варіантах здійснення, МН-домен КОМ А-антитіла цієї заявки зв'язаний з першим поліпептидом, тоді як Мі -домен антитіла зв'язаний із другим поліпептидом, який асоціюється з першим поліпептидом таким чином, що це дозволяє МН- і МІ - доменам взаємодіяти одному з одним з утворенням антигензв'язувального сайта. В інших варіантах здійснення, МН-домен відділений від Мі -домену лінкером, що дозволяє МН- і Мі - доменам взаємодіяти одному з одним (див. нижче в розділі під заголовком Одноланцюжкові

Антитіла). Потім антитіло МН-лінкер-МІ. зв'язують з поліпептидом, що представляє інтерес. Це злите антитіло застосовне в напрямку поліпептиду в клітину або тканину, що експресує КОМ А.

Поліпептидом, що представляє інтерес, може бути терапевтичний засіб, такий як токсин, або може бути діагностичний засіб, такий як фермент; який може бути легко візуалізований, наприклад, такий як пероксидаза хрону. Крім того, можуть бути створені злиті антитіла, у яких два (або більше) одноланцюжкових антитіл зв'язані одне з одним. Це застосовно, якщо бажаним є створення двовалентного або полівалентного антитіла на єдиному поліпептидному ланцюзі або якщо бажаним є створення біспецифічного антитіла.

Один варіант забезпечує мічений зв'язувальний білок, у якому антитіло або частина антитіла даної заявки дериватизоване або зв'язане з іншою функціональною молекулою 60 (наприклад, іншим пептидом або білком). Наприклад, мічений зв'язувальний білок даної заявки може бути одержаний функціональним зв'язуванням антитіла або частини антитіла даної заявки (хімічним зв'язуванням, генетичним злиттям, нековалентним зв'язком або іншим чином) з однією або декількома іншими молекулярними частинками, такими як нуклеїнова кислота, інше антитіло (наприклад, біспецифічне антитіло або діатіло), детектований агент, цитотоксичний агент, фармацевтичний агент і/або білок або пептид, який може опосередковувати асоціацію цього антитіла або частини антитіла з іншою молекулою (такою як область кору (серцевини) стрептавідину або полігістидинова мітка).

Застосовні детектовані агенти, якими можуть бути дериватизовані антитіло або частина антитіла даної заявки, включають флуоресцентні сполуки. Приклади флуоресцентних детектованих агентів включають флуоресцеїн, флуоресцеїнізотіоціанат, родамін, 5- диметиламін-1-нафталінсульфанілхлорид, фікоеритрин і т. п. Антитіло може бути також дериватизоване детектованими ферментами, такими як лужна фосфатаза, пероксидаза хрону, глюкозооксидаза і т. п. При дериватизації антитіла детектованим ферментом, його детектують додаванням додаткових реагентів, які цей фермент використовує для утворення детектованого продукту реакції. Наприклад, коли є присутнім пероксидаза хрону як детектований агент, додавання пероксиду водню і діамінобензидину приводить до забарвленого продукту реакції, який є детектованим. Антитіло може бути також дериватизоване нуклеїновою кислотою, біотином і детектоване за допомогою опосередкованого вимірювання зв'язування авідину або стрептавідину. 5.2. Одноланцюжкові антитіла.

Дана заявка включає одноланцюжкове антитіло (5сЕм), яке зв'язує імуногенний КОМ А за винаходом. Для одержання 5сЕм МН- і М-кодуючу ДНК функціонально зв'язують із ДНК, що кодує гнучкий лінкер, наприклад, що кодує амінокислотну послідовність (сіІу4-зег), так що ці МН- ії МІ - послідовності можуть експресуватися у вигляді суміжного одноланцюжкового білка, з МІ- і МН- областями, з'єднаними цим гнучким лінкером (див., наприклад, Віга еї аї. (1988) 5сіепсе 242:423-426; Нивіоп еї аї. (1988) Ргос. Маї). Асай. сі. ОБА 85:5879-5883; МсеСапйепу еї аї., 30

Маїште (1990) 34 8:552-554). Це одноланцюжкове антитіло може бути моновалентним, якщо використовують тільки єдині МН і МІ, бівалентним, якщо використовують два МН і МІ, або полівалентним, якщо використовують більше двох МН і МІ. Два з зазначених 5сЕм-фрагментів,

Зо зв'язані через лінкер, називають "діатілом", причому ця форма також включена в даний винахід. 5.3. Біспецифічні антитіла.

Дана заявка включає далі біспецифічне антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, у якому одна специфічність є специфічністю відносно імуногенного КОМ А-поліпептиду даної заявки. Наприклад, може бути генероване біспецифічне антитіло, яке специфічно зв'язується з імуногенним поліпептидом КОМ А за винаходом через один зв'язувальний домен і з другою молекулою через другий зв'язувальний домен. Крім того, може бути генероване одноланцюжкове антитіло, що містить більше одного МН і Мі, яке зв'язується специфічно з імуногенним поліпептидом за винаходом і з іншою молекулою, яка зв'язана з ослабленням опосередкованого мієліном колапсу конуса росту і інгібуванням росту нейритів (аксонів) і спрутингу (росту нервових волокон). Такі біспецифічні антитіла можуть бути генеровані з використанням способів, які добре відомі, наприклад, Рапдег еї аї. Іттипої Меїйоа5 4:72-81 (1994) і Мугідні апа Наїгті, 20 (зирга).

У деяких варіантах здійснення, біспецифічні антитіла одержують з використанням однієї або декількох варіабельних областей з антитіла за винаходом. В іншому варіанті здійснення, це біспецифічне антитіло одержують з використанням однієї або декількох областей СОМ із зазначеного антитіла. 5.4. Дериватизовані і мічені антитіла.

Антитіло або антигензв'язувальний фрагмент даної заявки можуть бути дериватизовані або зв'язані з іншою молекулою (наприклад, іншим пептидом або білком). Звичайно, антитіло або антигензв'язувальний фрагмент дериватизують таким чином, що ця дериватизація або це мічення не діє негативно на зв'язування з імуногенним поліпептидом за винаходом.

Наприклад, антитіло або частина антитіла даної заявки можуть бути функціонально зв'язані (хімічним зв'язуванням, генетичним злиттям, нековалентним зв'язком або іншим чином) з однією або декількома іншими молекулярними частинками, такими як нуклеїнова кислота, інше антитіло (наприклад, біспецифічне антитіло або діатіло), детектований агент, цитотоксичний агент, фармацевтичний агент і/або білок або пептид, який може опосередковувати асоціацію антитіла або частини антитіла з іншою молекулою (такою як область кору (серцевини) стрептавідину або полігістидинова мітка). Крім того, антитіло або його антигензв'язувальна частина можуть бути частиною більш великої молекули імуноадгезії, утвореної ковалентним або 60 нековалентним зв'язком цього антитіла або частини антитіла з одним або декількома іншими білками або пептидами. Приклади таких молекул імуноадгезії включають використання серцевинної області (кору) стрептавідину для одержання тетрамерної молекули 5сЕм (Кірпуапом, 5. М., еї аі. (1995) Нитап Апіїродіеєє апа Нубріідотав 6:93-101) і використання залишку цистеїну, маркерного пептиду і С-кінцевої полігістидинової мітки для одержання бівалентних і біотинільованих молекул 5сЕм (Кіргіуапом, 5.М., еї аІ. (1994) Мої. Ітттипої. 31:1047- 1058). Частини антитіл, такі як Раб- і Е(аб)2-фрагменти, можуть бути одержані з повнорозмірних антитіл з використанням загальноприйнятих способів, таких як розщеплення папаїном або пепсином, відповідно, повнорозмірних антитіл. Крім того, антитіла, частини антитіл і молекули імуноадгезії можуть бути одержані з використанням стандартних способів рекомбінантних ДНК.

Дериватизоване антитіло може бути одержане зшиванням двох або більше антитіл (одного і того ж типу або різних типів, наприклад, для створення біспецифічних антитіл). Придатні зшивальні лінкери включають лінкери, що є гетеробіфункціональними, які мають дві по-різному реакційноздатні групи, розділені придатним спейсером (наприклад, складним ефіром м- малеїдобензоїл-М-гідроксисукциніміду), або гомофункціональні лінкери (наприклад, дисукцинімідилсуберат). Такі лінкери доступні з Ріегсе Спетіса! Сотрапу, Косітога, ПІ.

Дериватизоване антитіло може також бути міченим антитілом. Наприклад, агентами детектування, якими можуть бути дериватизовані антитіло або частина антитіла за винаходом, є флуоресцентні сполуки, що включають флуоресцеїн, флуоресцеїнізотіоціанат, родамін, 5- диметиламін-1-нафталінсульфонілхлорид, фікоеритрин, лантанідні люмінофори і т. п. Антитіло може бути також помічене ферментами, що застосовні для детектування, такими пероксидаза хрону, галактозидаза, люцифераза, лужна фосфатаза, глюкозооксидаза і т. п. У варіантах, які мітяться детектованим ферментом, антитіло детектують додаванням додаткових реагентів, які цей фермент використовує для утворення детектованого продукту реакції. Наприклад, коли є присутньою пероксидаза хрону як детектований агент, додають пероксид водню і діамінобензидин. Антитіло може бути також помічене біотином і детектоване за допомогою опосередкованого вимірювання зв'язування авідину або стрептавідину. Антитіло може бути також помічене попередньо визначеним поліпептидним епітопом, пізнаваним вторинним репортером (наприклад, парою послідовностей лейцинової блискавки, сайтами зв'язування для вторинних антитіл, металзв'язувальними доменами, епітопними мітками (тегами)). КОМ А-

Зо антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент можуть бути також помічені радіоактивно міченою амінокислотою. Ця радіоактивна мітка може бути використана як для діагностичних, так і для терапевтичних цілей. Радіоактивно мічене КОМ А-антитіло може використовуватися діагностично, наприклад, для визначення рівнів рецептора КОМ А у індивіда. Крім того, радіоактивно мічене КОМ А-антитіло може використовуватися терапевтично для лікування ушкодження спинного мозку.

Приклади міток для поліпептидів включають, але не обмежуються ними, наступні радіоїзотопи або радіонукліди: 79М, 595, 90, 99Тс, 111, 125, 191|, 177 у, 166Но, 1535т. КОМ А- антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент можуть бути також дериватизовані хімічною групою, такою як поліетиленгліколь (РЕС), метильна або етильна група або вуглеводна група.

Ці групи можуть бути застосовні для поліпшення біологічних характеристик антитіла, наприклад для збільшення часу на півжиття в сироватці або для збільшення зв'язування тканини. Крім того, мітка для поліпептидів може включати нуклеїнову кислоту, наприклад, ДНК для детектування за допомогою ПЛР або збільшення експресії генів 5іКМА або для супресії експресії генів у клітинах або тканинах, що несуть КОМ А.

Клас і підклас КОМ А-антитіл може бути визначений будь-яким способом, відомим у даній галузі. Звичайно, клас і підклас антитіла можуть бути визначені з використанням антитіл, які є специфічними відносно конкретного класу і підкласу антитіла. Такі антитіла комерційно доступні. Клас і підклас антитіл можуть бути визначені за допомогою ЕГІЗА, Вестерн-блотингу, а також інших способів. Альтернативно, клас і підклас можуть бути визначені секвенуванням усіх або частини константних доменів важкого і/або легкого ланцюгів цих антитіл, порівнянням їх амінокислотних послідовностей із відомими амінокислотними послідовностями різних класів і підкласів імуноглобулінів і визначенням класу і підкласу цих антитіл. 5.5. Імуноглобуліни з подвійним варіабельним доменом.

Зв'язувальні білки або імуноглобуліни з подвійним варіабельним доменом (МО), використовувані в даному описі, є зв'язувальними білками, які містять два або більше антигензв'язувальних сайтів і є мультивалентними білками, наприклад мультивалентними зв'язувальними білками, наприклад двовалентними і тетравалентними. Термін "мультивалентний зв'язувальний білок" використовується в даній заявці для позначення зв'язувального білка, що містить два або більше антигензв'язувальних сайтів. Цей бо мультивалентний зв'язувальний білок переважно конструюють таким чином, що він має два або більше антигензв'язувальних сайтів і звичайно є антитілом, що не зустрічається в природі.

Термін "мультиспецифічний зв'язувальний білок" стосується зв'язувального білка, здатного зв'язувати дві або більше мішеней, або не зв'язувати. Такі ОМО можуть бути моноспецифічними, тобто здатними зв'язувати один антиген, або мультиспецифічними, тобто здатними зв'язувати два або більше антигенів. Зв'язувальні ОМО-білки, що містять два поліпептиди важкого ланцюга

ОМО і два поліпептиди легкого ланцюга ЮМО, називають ЮМО-Ід. Кожна половина ЮМО-Ід містить ЮМО-поліпептид важкого ланцюга і ОМО-поліпептид легкого ланцюга і два антигензв'язувальні сайти. Кожен зв'язувальний сайт містить варіабельний домен важкого ланцюга і варіабельний домен легкого ланцюга, тобто має загалом 6 СОК, що беруть участь у зв'язуванні антигену, на один антигензв'язувальний сайт. Зв'язувальні ЮОМО-білки і способи одержання зв'язувальних ОМО-білків описані в заявці на патент США Мо 11/507050 і включені в даний опис за допомогою посилання. Передбачається, що даний винахід включає зв'язувальний ЮМО-білок, що містить білки, здатні зв'язувати КОМ А. Переважно, цей зв'язувальний ОМО-білок здатний зв'язувати КОМ А і другу мішень. Ця друга мішень вибрана з групи, що складається з протизапальних МАВ-активностей (ІІ -1, І -6, 11 -8, 11-11, 11-12, 11-17, 1 - 18, 1-23, ТМЕ альфа/бета, ІЄМ-бета, гамма, ГІР, ОМ, СМТЕ, РЕ-4, лужного білка тромбоцитів (РВР), МАР-2, бета-ТО, МІР-1, МСОСР2/3, КАМТЕ5З, лімфотактину), що опосередковують транспорт білків (рецептора інсуліну, рецептора траснферину, рецептора тромбіну, рецептора лептину, рецептора І 0), інших нейрорегенеративних МАВ (МОК, Гіпдо, р75, СРО (наприклад,

Ма-2, нейрокану, бревікану, версикану, агрекану) гіалуронової кислоти, тАс, тенасцину, М1-35,

М1-250, ІМР, перлекану, нейрокану, фосфакану, подо-А, ОМОР, 5ета 40, 5ета ЗА, ефрину В3, ефрину А2, ефрину А5, МАС, Ерп4, плексину В1, ТАОУ, м/пів, гук тес, ВМР-2, ВМР-4, ВМР-7), нейропротективних активностей МАВ (ЕСЕ, ЕСЕК, бета 3), антиамілоїдних бета-МАВ (наприклад, т266, 306 (бапінейцумаб), антиглобулярних МАВ 7С6), локалізованих у. ЦНС рецепторів і транспортерів (рецепторів серотоніну, рецепторів допаміну, ПАТ, Авсо-1, СПУТІ). 5.6. Антитіла з подвійною специфічністю.

Дана заявка описує також технологію "антитіл з подвійною специфічністю". Антитіла з подвійною специфічністю можуть служити як агоністи, антагоністів або обидва у різних комбінаціях. Антитіла з подвійною специфічністю є антитілами, у яких МН-ланцюг зв'язується з

Зо першим антигеном і Мі-ланцюг зв'язується з другим антигеном, як наведено в прикладах УМО 2008082651. 5.7. Кристалізовані антитіла.

Інший варіант даної заявки забезпечує кристалізований зв'язувальний білок. Термін "кристалізовані" стосується в даному контексті антитіла або його антигензв'язувальної частини, які існують у вигляді кристала. Кристали є однією формою твердого стану речовини, що відрізняється від інших форм, таких як аморфний твердий стан або рідкокристалічний стан.

Кристали складаються з регулярних, повторюваних тривимірних упорядкованих рядів атомів, іонів, молекул (наприклад, білків, таких як антитіла) або молекулярних комплексів (наприклад, комплексів антиген/антитіло). Ці тривимірні упорядковані ряди вибудувані згідно зі специфічними математичними рівняннями, які добре відомі в даній галузі. Фундаментальна одиниця, або елементарна ланка молекули, яка повторюється в кристалі, називають асиметричною ланкою. Повторення асиметричної ланки в кристалі в розташуванні, що відповідає конкретній, добре визначеній кристалографічній симетрії, забезпечує "елементарну комірку" кристала. Повторення цієї комірки кристала за допомогою регулярних трансляцій (перенесень) у всіх трьох напрямках забезпечує кристал. Див. Сіеде, К. апа Юисгиїх, А. Вагтей,

СтувіаїІй2айоп ої Мисієїс Асід5 апа Ргоївєїп5, а Ргасіїса! Арргоаси, 279 єйд., рр. 201-16, Охіога

ОпіметзПу Ргев55, Мем МОоїК, Мем мок, (1999).

Переважно дана заявка описує кристали повнорозмірних КОМ А-антитіл і їх фрагментів, описаних у даному документі, і готові сполуки і композиції, що містять такі кристали. В одному варіанті здійснення, кристалізований зв'язувальний білок має більш високий час на півжиття іп мімо, ніж розчинна копія цього зв'язувального білка. В іншому варіанті здійснення цей зв'язувальний білок зберігає біологічну активність після кристалізації.

Кристалізований зв'язувальний білок за винаходом може бути одержаний згідно зі способами, відомими в даній галузі, такими як способи, описані в МО 02072636, включеному в даний опис за допомогою посилання. 5.8. Глікозиловані антитіла.

Інший варіант здійснення за винаходом забезпечує глікозилований зв'язувальний білок, де антитіло або його антигензв'язувальна частина містить один або декілька вуглеводних залишків.

Продукція білка, що формується іп мімо, може піддаватися додатковому процесингу, відомому як бо посттрансляційна модифікація. Зокрема, цукрові (глікозильні) залишки можуть додаватися ферментативно в процесі, відомому як глікозилування. Одержані білки, що несуть ковалентно зв'язані олігосахаридні бічні ланцюги, відомі як глікозиловані білки або глікопротеїни. Антитіла є глікопротетнами з одним або декількома вуглеводними залишками в Ес-домені, а також варіабельному домені. Вуглеводні залишки в Ес-домені чинять важливу дію на ефекторну функцію Ес-домену з мінімальною дією на зв'язування антигену або час на півжиття цього антитіла (К. УеПегі5, Віоїесппої. Ргод. 21 (2005), рр. 11-16). На противагу цьому, глікозилування варіабельного домену може чинити дію на антигензв'язувальну активність цього антитіла.

Глікозилування у варіабельному домені може негативно діяти на афінність зв'язування антитіла, імовірно, внаслідок просторового утруднення (стеричної перешкоди) (Со, М.5., еї аї.,

Мої. Іттипої. (1993) 30:1361-1367), або приводити до збільшеного афінності відносно цього антигену (уМаїїсК, 5.С., еї аіІ., Ехр. Мей. (1988) 168:1099-1109; М/гідні, А., еіа!., ЕМВО .. (1991) 10:2717 2723).

Один аспект даного винаходу спрямований на одержання мутантів сайта глікозилування, у яких був омутований О- або М-зв'язаний сайт глікозилування зв'язувального білка.

Кваліфікований у даній галузі фахівець може генерувати такі мутанти з використанням стандартних добре відомих технологій. Мутанти сайтів глікозилування, що зберігають біологічну активність, але мають збільшену або зменшену зв'язувальну активність, є наступним об'єктом даного винаходу.

Ще в одному варіанті здійснення, глікозилування антитіла або його антигензв'язувальної частини за винаходом є модифікованим. Наприклад, може бути одержане аглікозильоване антитіло (тобто антитіло, позбавлене глікозилування). Глікозилування може бути змінене, наприклад, для збільшення афінності цього антитіла відносно антигену. Такі вуглеводні модифікації можуть виконуватися, наприклад, зміною одного або декількох сайтів глікозилування в послідовності цього антитіла. Наприклад, можуть бути одержані одна або декілька амінокислотних замін, що приводять до елімінації одного або декількох сайтів глікозилування варіабельної області для елімінації за допомогою цього глікозилування в цьому сайті. Таке аглікозилування може збільшувати афінність цього антитіла відносно антигену.

Такий підхід описаний більш докладно в Публікації РСТ УМО 2003016466А2 і Патентах США Мо 5714350 і 6350861, усі посилання включені в даний опис за допомогою посилання в повному

Зо обсязі.

Додатково або альтернативно, може бути одержане модифіковане антитіло за винаходом, що має змінений тип глікозилування, яке є гіпофукозильованим антитілом, що має зменшену кількість фукозильних залишків, або антитілом, що має збільшену кількість структур С1СМАс, що поділяють навпіл. Було показано, що такі змінені розподіли (патерни) глікозилування збільшують АЮСС-здатність антитіл. Такі вуглеводні модифікації можуть здійснюватися, наприклад, експресією цього антитіла в клітині-хазяїні зі зміненим апаратом глікозилування.

Клітини зі зміненим апаратом глікозилування були описані в даній галузі і можуть бути використані як клітини-хазяїни для експресії в них рекомбінантних антитіл за винаходом для одержання за допомогою цього антитіла зі зміненим глікозилуванням. Див., наприклад, Зпівїав5,

В. КС. єї аї. (2002) 9. ВіоІї. Спет. 277:26733-26740; Отапа еї аї. (1999) Маї. Віоїесп. 17:1764, а також Еигореап Раїепі Мо: ЕР 1176195; Публікації РСТ УМО 03/035835; УМО 99/5434280, усі ці посилання включені в даний опис за допомогою посилання в їх повному обсязі.

Глікозилування білків залежить від амінокислотної послідовності білка, що представляє інтерес, а також від клітини-хазяїна, у якій експресується цей білок. Різні організми можуть продукувати різні ферменти глікозилування (наприклад, глікозилтрансферази і глікозидази) і мають різні доступні субстрати (нуклеотидцукри). Внаслідок таких факторів, характер глікозилування білків і склад глікозильних залишків можуть розрізнятися залежно від системи- хазяїна, у якій експресується конкретний білок. Глікозильні залишки, застосовні у винаході, можуть включати, але не обмежуються ними, глюкозу, галактозу, манозу, фукозу, н- ацетилглюкозамін і сіалову кислоту. Переважно, цей глікозилований зв'язувальний білок містить такі глікозильні залишки, що характер глікозилування є характером глікозилування, властивим для людини.

Кваліфікованому в даній галузі фахівцю відомо, що відмінне глікозилування білків може приводити до відмінних характеристик білків. Наприклад, ефективність терапевтичного білка, одержаного з мікроорганізму-хазяїна, такого як дріжджі, ії глікозилованого з використанням ендогенного шляху дріжджів, може бути зменшеною у порівнянні з ефективністю того ж самого білка, експресованого в клітині ссавця, такій як клітинна лінія СНО. Такі глікопротеїни можуть бути також імуногенними в людях і виявляти зменшений час життя іп мімо після введення.

Специфічні рецептори в людях і інших тваринах можуть упізнавати специфічні глікозильні бо залишки і стимулювати швидкий кліренс цього білка з кровотоку. Інші негативні ефекти можуть включати зміни у фолдингу білків, розчинності, чутливості до протеаз, спрямованій міграції, транспорті, компартменталізації, секреції, упізнаванні інших білків або факторів, антигенності або алергенності. Таким чином, практикуючий лікар може віддати перевагу терапевтичному білку з конкретним складом і характером глікозилування, наприклад, складом і розподілом глікозилування, ідентичним, або щонайменше подібним, зі складом і розподілом глікозилування, одержуваним у клітинах людини або у видоспецифічних клітинах передбачуваного індивіда- тварини.

Експресія глікозилованих білків, відмінних від глікозилованих білків клітини-хазяїна, може бути досягнута генетичною модифікацією клітини-хазяїна для експресії гетерологічних ферментів глікозилування. За допомогою способів, відомих у даній галузі, практикуючий лікар може генерувати антитіла або їх антигензв'язувальні частини, що виявляють глікозилування білків людини. Наприклад, штами дріжджів були генетично модифіковані для експресії ферментів глікозилування, що не зустрічаються в природі, так що глікозиловані білки (глікопротеїни), продуковані цими штамами дріжджів, виявляють глікозилування білків, ідентичне з глікозилуванням білків клітин тварин, зокрема клітин людини (Заявки на патент США 20040018590 і 20020137134 і Публікація РСТ УМО 2005100584 АЗ2).

Крім того, кваліфікованому в даній галузі фахівцю буде зрозуміло, що білок, що представляє інтерес, може бути експресований з використанням бібліотеки клітин-хазяїнів, генетично сконструйованої для експресії різних ферментів глікозилування, так що клітини-хазяїни, що є членами цієї бібліотеки, продукують білок, що представляє інтерес, з конкретними новими розподілами глікозилування. Переважно, білок, який має конкретно відібраний новий розподіл глікозилування, виявляє поліпшені або змінені біологічні властивості. 5.9. Антиідіотипічні антитіла.

Крім цих зв'язувальних білків, даний винахід також стосується антиідіотипічного (анти-1а) антитіла, специфічного відносно таких зв'язувальних білків за винаходом. Анти-Ід-антитіло є антитілом, яке упізнає унікальні детермінанти, звичайно зв'язані з антигензв'язувальною областю іншого антитіла. Це анти-іЯ може бути одержане імунізацією тварини цим зв'язувальним білююм або його СОК-вмісною областю. Імунізована тварина буде упізнавати ідіотипічні детермінанти імунізуючого антитіла і відповідати на них і продукувати анти-1а-

Зо антитіло. Анти-Ід-антитіло може бути також використане як "імуноген" для індукції імунної реакції ще в одній тварині з одержанням так званого анти-анти-Іа-антитіла. 6. Застосування антитіл.

Внаслідок їх здатності зв'язуватися з КОМ А людини, нейтралізуючі антитіла даного винаходу, або їх частини, можуть бути використані для детектування КОМ А людини (наприклад, у біологічному зразку, такому як сироватка або плазма), з використанням загальноприйнятого імуноаналізу, такого як твердофазні імуноферментні аналізи (ЕГІ5А), радіоїмуноаналіз (КІА) або імуногістохімія тканини. Дана заявка забезпечує спосіб детектування

КОМ А людини в біологічному зразку, який передбачає контактування біологічного зразка з антитілом або частиною антитіла за винаходом і детектування або антитіла (або частини антитіла), зв'язаного з КОМ А людини, або незв'язаного антитіла (або частини антитіла) для детектування за допомогою цього КОМ А людини в біологічному зразку. Це антитіло пряме або опосередковано мітять детектованою речовиною для полегшення детектування зв'язаного або незв'язаного антитіла. Придатні детектовані речовини включають різні ферменти, простетичні групи, флуоресцентні речовини, люмінесцентні речовини і радіоактивні речовини. Приклади придатних ферментів включають пероксидазу хрону, лужну фосфатазу, бета-галактозидазу або ацетилхолінестеразу; приклади придатних комплексів простетичних груп включають стрептавідин/біотин і авідин/біотин; приклади придатних флуоресцентних речовин включають умбеліферон, флуоресцеїн, флуоресцеїнізотіоціанат, родамін, дихлортриазиніламінфлуоресцеїн, дансилхлорид або фікоеритрин; приклади люмінесцентної речовини включають люмінол і приклади придатного радіоактивного матеріалу включають ЗН, 1455 во 99, 111, 125), 191), 177) у, 166Но, 153511.

Антитіла і частини антитіл даної заявки переважно здатні нейтралізувати активність КОМ А людини як іп міїго, так і іп мімо. Таким чином, такі антитіла і частини антитіл за винаходом можуть бути використані для інгібування зв'язування КОМ А з його рецептором Неогеніном, з ВМР-2 або ВМ-4, і, отже, інгібувати одержану активність.

В іншому варіанті здійснення, дана заявка забезпечує спосіб зменшення активності КОМ А у індивіда, переважно у індивіда, що страждає від захворювання або порушення, у якому одержана активність КОМ А здійснює негативний вплив. Дана заявка забезпечує способи зменшення активності КОМ А у індивіда, що страждає від такого захворювання або порушення, 60 запобіганням зв'язування КОМ А і рецептора, Неогеніну, і/або з ВМР-2 і/або ВМ-4, за допомогою застосування моноклональних антитіл даної заявки. Антитіла даного винаходу, зокрема гуманізовані антитіла, описані в даному описі, можуть бути введені індивіду-людині для терапевтичних цілей. Крім того, антитіла даної заявки можуть бути введені ссавцю не людині, експресуючому КОМ А, з яким це антитіло здатне зв'язуватися, для ветеринарних цілей або тварині, використовуваній як модель захворювання людини. Що стосується останнього застосування, такі тварини-моделі можуть бути застосовні для оцінки терапевтичної ефективності антитіл за винаходом (наприклад, випробування доз і часових схем введення).

У контексті даного опису, термін "порушення, у якому активність КОМ А здійснює негативний вплив", включає захворювання й інші порушення, у яких, як було показано, присутність КОМ А або його одержана активність у індивіда, що страждає від цього порушення, є або передбачувано є відповідальною за патофізіологію цього порушення, або є фактором, який сприяє погіршенню цього порушення. Таким чином, вважають, що порушення, у якому активність КОМ А здійснює негативний вилив, є порушенням, у якому зменшення активності

КОМ А ослабляє симптоми і/або прогресування цього порушення. Не обмежуючі винахід приклади порушень, які можуть лікуватися антитілами за винаходом, включають порушення, обговорювані в розділі нижче, що стосується фармацевтичних композицій антитіл за винаходом.

Визнається, що КОМ А відіграє важливу роль у патології, асоційованій з різними захворюваннями, у тому числі неврологічними захворюваннями, асоційованими з нейродегенерацією або інгібуванням нейрорегенеративних процесів, що приводять до паралічу.

Вона включає деменцію, сенільну деменцію, помірний когнітивний розлад, деменцію, пов'язану з хворобою Альцгеймера, хорею Хангтінгтона, пізню дискінезію, гіперкінезії, манії, хворобу

Паркінсона, синдром Стіла-Річардсона, синдром Дауна, важку псевдопаралітичну міастенію, ушкодження нерва, васкулярний амілоїдоз, внутрішньомозковий крововилив | з амілоїдозом, запалення головного мозку, спадкову атаксію Фрідрейха, гостре порушення з дезорієнтацією в часі і просторі, глаукому, хворобу Альцгеймера, бічний аміотрофічний склероз, ушкодження плечового сплетіння, ушкодження головного мозку, у тому числі травматичне ушкодження головного мозку, дитячий церебральний параліч, хворобу Гійєна-Барре, лейкодистрофії, розсіяний склероз, поствакцинальний поліомієліт, Зріпа Віда ("ущелину хребта), ушкодження

Зо спинного мозку, атрофію м'язів хребта, пухлини хребта, інсульт і поперечний мієліт.

Крім того, як обговорювалося раніше, між будь-якими з описаних вище партнерів можуть використовуватися ЮМО-імуноглобуліни, або антитіла з подвійною специфічністю. Такі препарати антитіл, як описані вище, можуть бути застосовні для лікування хвороби

Альцгеймера, хвороби Паркінсона, ушкодження спинного мозку, травматичного ушкодження головного мозку, розсіяного склерозу, ушкодження периферичних нервів, шизофренії, депресії, тривоги, а також будь-якої пластичності і росту нейритів і пов'язаного з нейротоксичністю захворювання, зазначеного вище.

Антитіла даної заявки можуть також об'єднуватися з пептидами, роблячи можливим трансмембранне перенесення для включення націлювання на внутрішньоклітинні білки-мішені.

Такі пептидні послідовності можуть включати, але не обмежуються ними, їаї, апіеппаредіа, поліаргініни, деякі антимікробні пептиди. Такі пептиди можуть робити можливим перенесення через мембрани, у тому числі клітинні плазматичні мембрани, але також епітеліальні і ендотеліальні мембрани, у тому числі гематоенцефалічний бар'єр, слизову оболонку кишечнику, мозкову оболонку й інші.

Антитіло або частина антитіла даної заявки може також вводитися з одним або декількома додатковими агентами з малими молекулами, застосовними в лікуванні порушень, у яких бере участь активність КОМ А, як обговорювалося в попередніх абзацах. Повинно бути зрозуміло, що антитіла даної заявки або їх антигензв'язувальні частини можуть бути використані окремо або в комбінації з додатковим засобом, наприклад терапевтичним засобом, причому зазначений додатковий засіб вибирається кваліфікованим фахівцем для передбачуваної для нього мети.

Наприклад, цим додатковим засобом може бути терапевтичний засіб, що визнається в даній галузі як засіб, який застосовний для лікування захворювання або стану, що підлягає лікуванню антитілом даного винаходу. Цей додатковий засіб може бути також засобом, який надає вигідну ознаку цій терапевтичній композиції, наприклад, засобом, який впливає на в'язкість цієї композиції. 7. Фармацевтичні композиції.

Цей винахід забезпечує також фармацевтичні композиції, які містять антитіло або його антигензв'язувальну частину за винаходом і фармацевтично прийнятний носій. Фармацевтичні композиції, які містять антитіла за винаходом, застосовні, але не обмежуються ними, у бо діагностиці, детектуванні або моніторингу порушення, у запобіганні, лікуванні, контролюванні або зменшенні інтенсивності порушення або одного або декількох його симптомів і/або в дослідженні. У конкретному варіанті здійснення, композиція містить одне або декілька антитіл за винаходом. В іншому варіанті здійснення, ця фармацевтична композиція містить одне або декілька антитіл за винаходом й один або декілька профілактичних або терапевтичних засобів, інших ніж антитіла за винаходом, для лікування порушення, у якому активність КОМ А здійснює негативний вплив. Переважно, відомо, що ці профілактичні або терапевтичні засоби є застосовними або використовувалися або використовуються в даний час у попередженні, лікуванні, контролюванні або зменшенні інтенсивності порушення або одного або декількох його симптомів. Відповідно до цих варіантів здійснення, ця композиція може додатково містити носій, розріджувач або ексципієнт.

Антитіла і частини антитіл за винаходом можуть бути включені у фармацевтичні композиції, які придатні для введення індивіду. Звичайно, ця фармацевтична композиція містить антитіло або частину антитіла за винаходом і фармацевтично прийнятний носій. У контексті даного опису, термін "фармацевтично прийнятний носій" включає будь-який або усі з розчинників, диспергуючих середовищ, покриттів, антибактеріальних і протигрибкових агентів, ізотонічних і затримуючих абсорбцію агентів і т. п., які Є фізіологічно сумісними. Приклади фармацевтично прийнятних носіїв включають один або декілька компонентів з води, сольового розчину, забуференого фосфатом сольового розчину, декстрози, гліцерину, етанолу і т. п., а також їх комбінацій. У багатьох випадках буде переважним включення ізотонічних агентів, наприклад цукрів, поліспиртів, таких як маніт, сорбіт або хлорид натрію, у цій композиції. Фармацевтично прийнятні носії можуть додатково містити мінорні кількості допоміжних речовин, таких як зволожуючі або емульгуючі агенти, консерванти або буфери, які збільшують термін зберігання або ефективність цього антитіла або частини антитіла.

Відомі різні системи доставки, і вони можуть бути використані для введення одного або декількох антитіл за винаходом або комбінації одного або декількох антитіл за винаходом і профілактичного засобу або терапевтичного засобу, застосовного для запобігання, контролювання, лікування або зменшення інтенсивності порушення або одного або декількох його симптомів, наприклад, інкапсулювання в ліпосомах, мікрочастинках, мікрокапсулах, рекомбінантні клітини, здатні експресувати антитіло або фрагмент антитіла, опосередкований рецептором ендоцитоз (див., наприклад, УМи апа УМи, У. Віої. Спет. 262:4429-4432 (1987), конструювання нуклеїнової кислоти як частини ретровірусного або іншого вектора і т.д.

Способи введення профілактичного або терапевтичного агента за винаходом включають, але не обмежуються ними, парентеральне введення (наприклад, внутрішньошкірне, внутрішньом'язове, інтраперитонеальне, внутрішньовенне і підшкірне), епідуральне введення, внутрішньо пухлинне введення і введення в слизову оболонку (наприклад, введення в ніс і в порожнину рота). Крім того, може бути використане легеневе введення, наприклад, з використанням інгалятора або розпилювача і композиції з аерозольним агентом. Див, наприклад, Патенти США Мо 6019968, 5985320, 5985309, 5934272, 5874064, 5855913, 5290540 і 4880078; і Публікації РСТ Мо УМО 92/19244, УМО 97/32572, МО 97/44013, МО 98/31346 і УМО 99/66903, усі з який включені в даний опис за допомогою посилання в їх повному обсязі. В одному варіанті здійснення, антитіло за винаходом, комбінований терапевтичний засіб або композицію за винаходом вводять з використанням технології легеневої доставки лікарського засобу АЇКептпе5 АЇКФ (АЇКептев, Іпс., Сатбгідде, Ма55.). В одному конкретному варіанті здійснення, профілактичні або терапевтичні засоби за винаходом вводять внутрішньом'язово, внутрішньовенно, усередину пухлини, перорально, інтраназально, легеневим шляхом або підшкірно. Ці профілактичні або терапевтичні засоби можуть вводитися будь-яким зручним способом, наприклад інфузією або болісною ін'єкцією, абсорбцією через епітеліальні або шкірно-слизові вистілки (наприклад, через слизову оболонку порожнини рота, ректально або через кишкову слизову оболонку і т. д.) і можуть вводитися разом з іншими біологічно активними засобами. Введення може бути системним або місцевим.

У конкретному варіанті здійснення, може бути бажаним введення профілактичних або терапевтичних агентів за винаходом локально в зону, в якій потрібне лікування; це може бути досягнуто, наприклад, без обмеження, локальною інфузією, ін'єкцією або за допомогою імплантату, причому зазначений імплантат є пористим або непористим матеріалом, що включає мембрани і матрикси, такі як мембрани із силастику, полімери, волокнисті матрикси (наприклад,

Тівзеект) або колагенові матрикси. В одному варіанті здійснення, ефективну кількість одного або декількох антитіл антагоністів за винаходом вводять локально в уражену зону індивіду для попередження, лікування, контролювання і/або зменшення інтенсивності порушення або його симптому. В іншому варіанті здійснення, ефективну кількість одного або декількох антитіл бо антагоністів за винаходом вводять локально в уражену зону в комбінації з ефективною кількістю одного або декількох терапевтичних засобів (наприклад, одного або декількох профілактичних або терапевтичних засобів), інших ніж антитіло за винаходом, для попередження, лікування, контролювання і/або зменшення інтенсивності порушення або одного або декількох його симптомів.

В іншому варіанті здійснення, цей профілактичний або терапевтичний засіб може бути доставлений в системі регульованого або пролонгованого вивільнення. В одному варіанті здійснення, для досягнення регульованого або пролонгованого вивільнення терапевтичних засобів за винаходом може бути використаний насос (див. І апдег, зирга; 5ейоп, 1987, СЕС Стії.

Веї. Віотеєйд. Епд. 14:20; Виспмаїа еї аї!., 1980, Зигдегу 88:507; Зацаек еї аї!., 1989, М. Епаї. У.

Меа. 321:574). В іншому варіанті здійснення, для досягнення регульованого або пролонгованого вивільнення терапевтичних засобів за винаходом можуть бути використані полімерні матеріали (див., наприклад, Меаїсаї! Арріїсайоп5 ої СопігоПей Кеїеазе, І апдег апа Му/ізе (єдз.), СВО Ргев.,

Воса Раїйоп, Ріа. (1974); СопітоПей Огид Віоамаїйарійу, Огид Ргодисі Оевзідп апіа Репоптапсе,

Зтоїеп апа Ваї (єдв.), ММПеу, Мем Хоїк (1984); Вапдег апа Рерра;в, 1983, у). Масгтотої. 5сі. Веу.

Масготої. Спет. 23:61; див. також І ему 6ї аї!., 1985, бсіепсе 228:190; Юигіпа єї аї!., 1989, Апп.

Меигої. 25:351; Ноумага еї аї., 1989, У. Меигозиго. 71:105); Патенти США Мо 5679377; Патент США

Мо 5916597; Патент США Мо 5912015; Патент США Мо 5989463; Патент США Мо 5128326;

Публікацію РСТ Мо УМО 99/15154 і Публікацію РСТ Мо УМО 99/20253. Приклади полімерів, використовуваних у формах пролонгованого вивільнення, включають, але не обмежуються ними, полі(2-гідроксіетилметакрилат), полі(метилметакрилат), полі(акрилову кислоту), співполімер(етилен-вінілацетат), полі(метакрилову кислоту), полігліколіди (РІ С), поліангідриди, полі(М-вінілпіролідон), полі(вініловий спирт), поліакриламід, полі(етиленгліколь), полілактиди (РГА), співполімери (лактидів і гліколідів) (РІЗА) і поліортоефіри. В одному переважному варіанті здійснення, полімер, використовуваний у формі пролонгованої дії, є інертним, вільним від вилуговуваних домішок, стабільним при зберіганні, стерильним і біодеградовним. В іншому варіанті здійснення, система регульованого або пролонгованого вивільнення може бути поміщена поблизу профілактичної або терапевтичної мішені, що дозволяє вводити тільки малу частину системної дози (див., наприклад, сооазоп, іп Меадіса! Арріїсайоп5 ої Сопігоїїей Кеїеазе, зирга, мої. 2, рр. 115-138 (1984)).

Зо Системи регульованого вивільнення описані в огляді І апдег (1990, 5сіепсе 249:1527-1533).

Будь-який спосіб, відомий кваліфікованому у даній галузі фахівцю, може бути використаний для одержання композиції пролонгованого вивільнення, що містить один або більше терапевтичних засобів за винаходом. Див. наприклад, Патент США Мо 4526938, Публікацію РСТ УМО 91/05548,

Публікацію РСТ УМО 96/20698, Міпод еї аї., 1996, "Іпігаштогаї! Каадіоїттипоїпегарпу ої а Нитап СоЇоп Сапсег Хеподгай Овіпд а бЗивіаіпед-ВеІєазе Сі", Вадіоштегару 5 Опсоіоду 39:179-189, опо вї аї!., 1995, "Апіїроду Меадіаїей І ипа Тагоеїіпоу ої І опд-Сіксцайпа Етиївіопв", РОА ЧЧоштаї ої

Рпагтасешіїса! Зсіепсе 5 Тесппоіоду 50:372-397, СієекК еї аї., 1997, "Віодедгадабіє Роїутетгіс

Сатегїв тої а РО Апііїроду їог Сагаіомазсшціаг Арріїсайоп", Рго. ІІ. Зутр. Сопігої. Неї. Віоасі.

Маїег. 24:853-854 і ат еї аї., 1997, "Місгоепсарзцшіайоп ої Кесотбіпапі Нитапігей Мопосіопаї

Апіїроду ог І оса! Оєїїмегу", Ргос. ІпгІ. Бутр. Сопіго! Неї. Віоасі. Маїег. 24:759-760, кожне з цих посилань включене в даний опис за допомогою посилання в його повному обсязі.

В одному конкретному варіанті здійснення, де композиція за винаходом є нуклеїновою кислотою, що кодує профілактичний або терапевтичний засіб, нуклеїнова кислота може вводитися іп мімо для стимуляції експресії кодованого нею профілактичного або терапевтичного засобу конструюванням її у вигляді частини придатного експресуючого вектора нуклеїнової кислоти і введенням її таким чином, що вона стає внутрішньоклітинною, наприклад, з використанням ретровірусного вектора (див. Патент США Мо 4980286), або прямою ін'єкцією, або з використанням бомбардування мікрочастинками (наприклад, генного пістолета; Віоїїеєтіс,

Биропі), або покривання ліпідами або рецепторами поверхні клітин або трансфікуючими агентами, або введенням її в зв'язку з гомеобоксподібним пептидом, який, як відомо, входить у ядро (див. Чоїйої еї аї., 1991, Ргос. Маїй!. Асад. сі. ОБА 88:1864-1868). Альтернативно, нуклеїнова кислота може бути введена внутрішньоклітинно і включена в ДНК клітини-хазяїна для експресії гомологічною рекомбінацією.

Фармацевтичну композицію за винаходом готують таким чином, що вона сумісна з передбачуваним способом введення. Приклади способів введення включають, але не обмежуються ними, парентеральне, наприклад внутрішньовенне, внутрішньошкірне, підшкірне, пероральне, інтраназальне (наприклад, інгаляцією), черезшкірне (наприклад, місцеве), трансмукозне і ректальне введення. В одному конкретному варіанті здійснення, цю композицію готують відповідно до рутинних процедур у вигляді фармацевтичної композиції, адаптованої бо для внутрішньовенного, підшкірного, внутрішньом'язового, перорального, інтраназального або місцевого введення людям. Звичайно, композиції для внутрішньовенного введення є розчинами в стерильному ізотонічному водному буфері. У разі потреби, ця композиція може також включати солюбілізуючий агент і місцевий анестетик, такий як лідокаїн, для полегшення болю в місці ін'єкції.

Якщо композиції за винаходом повинні вводитися місцево, ці композиції можуть бути приготовлені у формі мазі, крему, трансдермального пластиру, лосьйону, гелю, шампуню, спрею, аерозолю, розчину, емульсії або іншої форми, добре відомої кваліфікованому у даній галузі фахівцю. Див., наприклад, Кетіпдіоп'є РІаптасешіса! Зсіепсе5 апа Іпігодисіоп

Рпаптасешіса! Оозаде Еогт5, 191п ей., Маск Риб. Со., Еазіюоп, Ра. (1995). Для непридатних для аерозолів місцевих лікарських форм звичайно використовують в'язкі - напівтверді або тверді форми, які містять носій або один або декілька ексципієнтів, сумісних з місцевим застосуванням, і мають динамічну в'язкість, переважно більш високу, ніж в'язкість води.

Придатні готові форми включають, без обмеження, розчини, суспензії, емульсії, креми, мазі, порошки, лініменти (рідкі мазі), цілющі мазі і т. п., які, якщо бажано, стерилізують або змішують з допоміжними агентами (наприклад, консервантами, стабілізаторами, зволожувальними агентами, буферами або солями) для впливу на різні властивості, такі як, наприклад, осмотичний тиск. Інші придатні лікарські форми для місцевого застосування включають розбризкуванні аерозольні препарати, у яких активний інгредієнт, переважно в комбінації з твердим або рідким інертним носієм, упакований у суміші з летким (наприклад, газоподібним) пропелентом, що знаходиться під тиском, таким як фреон, або в стискуваному флаконі. Якщо бажано, до фармацевтичних композицій і лікарських форм можуть бути також додані зволожувачі або змочувальні засоби. Приклади таких додаткових інгредієнтів добре відомі в даній галузі.

Якщо спосіб за винаходом передбачає інтраназальне введення композиції, ця композиція може бути приготовлена в аерозольній формі, у вигляді спрею, туману або у формі крапель.

Зокрема, профілактичні або терапевтичні засоби для застосування відповідно до даного винаходу можуть зручним чином доставлятися у формі надання аерозольного спрею з упаковок, що знаходяться під тиском, або розпилювача, з використанням придатного пропеленту (наприклад, дихлордифторметану, трихлорфторметану, дихлортетрафторетану,

Зо діоксиду вуглецю або іншого придатного газу). У випадку аерозолю, що знаходиться під тиском, одиниця дози може бути визначена забезпеченням клапана для доставки відміряної кількості.

Для застосування в інгаляторі або інсуфляторі можуть бути приготовлені капсули і картриджі (касети) (що складаються, наприклад, з желатину), які містять порошкоподібну суміш розглянутої сполуки і придатної порошкоподібної основи, такий як лактоза або крохмаль.

Якщо спосіб за винаходом передбачає пероральне введення, композиції можуть бути приготовлені для перорального введення у формі таблеток, капсул, крохмальних облаток (капсул), гелевих желатинових капсул, розчинів, суспензій і т. п. Таблетки або капсули можуть бути приготовлені загальноприйнятими способами з фармацевтично прийнятними ексципієнтами, такими як зв'язувальні агенти (наприклад, попередньо клейстеризований кукурудзяний крохмаль, полівінілпіролідон або гідроксипропілметилцелюлоза); наповнювачі (наприклад, лактоза, мікрокристалічна целюлоза або гідрофосфат кальцію); мастильні агенти (наприклад, стеарат магнію, тальк або діоксид кремнію); дезінтегруючі агенти (наприклад, картопляний крохмаль або натрію крохмалю гліколат)у або зволожуючі агенти (наприклад, лаурилсульфат натрію). Ці таблетки можуть мати покриття, нанесене способами, добре відомими в даній галузі. Рідкі препарати для перорального введення можуть мати (але не обмежуються ними) форму розчинів, сиропів або суспензій, або вони можуть бути представлені у вигляді сухого продукту для відновлення водою або іншим придатним носієм перед використанням. Такі рідкі препарати можуть бути приготовлені загальноприйнятими способами з фармацевтично прийнятними добавками, такими як суспендуючі агенти (наприклад, сироп із сорбіту, похідні целюлози або гідрогенізовані придатні для їжі жири); емульгуючі агенти (наприклад, лецитин або аравійська камедь); неводні носії (наприклад, мигдальна олія, масляні ефіри, етиловий спирт або фракціоновані рослинні олії) і консерванти (наприклад, метил-або пропіл-п-гідроксибензоати або сорбінова кислота). Ці препарати можуть також містити необов'язково буферні солі, ароматизуючі, барвні і підсолоджувальні агенти. Препарати для перорального введення можуть бути зручним чином приготовлені для повільного вивільнення, регульованого вивільнення або пролонгованого вивільнення профілактичного або терапевтичного засобу (профілактичних або терапевтичних засобів).

Спосіб за винаходом може передбачати легеневе введення, наприклад, з використанням інгалятора або розпилювача, композиції, приготовленої з утворюючим аерозоль агентом. Див., 60 наприклад, Патенти США Мо 6019968, 5985320, 5985309, 5934272, 5874064, 5855913, 5290540 і

4880078; і Публікації РСТ Мо УМО 92/19244, УМО 97/32572, МО 97/44013, МО 98/31346 і УУО 99/66903, кожне з цих посилань включене в даний опис за допомогою посилання в його повному обсязі. В одному конкретному варіанті здійснення, антитіло за винаходом, засіб комбінованої терапії і/або композицію за винаходом вводять з використанням технології легеневої доставки лікарського засобу АІКегтез АЇКФ (АІКептпев, Іпс., Сатргідде, Маз55).

Спосіб за винаходом може передбачати введення композиції, приготовленої для парентерального введення, ін'єкцією (наприклад, болісною ін'єкцією або безупинною інфузією).

Композиції для ін'єкції можуть бути приготовлені у формі уніфікованої (стандартної) дози (наприклад, у ампулах або багатодозових контейнерах) з доданим консервантом. Ці композиції можуть мати такі форми, як суспензії, розчини або емульсії в масляних або водних носіях і можуть містити сприятливі для приготування агенти, такі як суспендуючі, стабілізуючі і/або диспергуючі агенти. Альтернативно, активний інгредієнт може знаходитися у формі порошку для відновлення придатним носієм (наприклад, стерильною апірогенною водою) перед використанням. Способи за винаходом можуть додатково передбачати введення композицій, приготовлених у вигляді депо-препаратів. Такі форми тривалої дії можуть вводитися імплантацією (наприклад, підшкірно або внутрішньом'язово) або внутрішньом'язовою ін'єкцією.

Таким чином, ці композиції можуть бути, наприклад, приготовлені з придатними полімерними або гідрофобними речовинами (наприклад, у вигляді емульсії в прийнятній олії) або з іонообмінними смолами, або з помірно розчинними похідними (наприклад, з помірно розчинною сіллю).

Способи за винаходом передбачають введення композицій, приготовлених у вигляді нейтральних або сольових форм. Фармацевтично прийнятні солі включають солі, утворені з аніонами, такими як аніони, одержані з хлористоводневої, фосфорної, оцтової, щавлевої, винної кислот і т. д., і солі, утворені з катіонами, такими як катіони, одержані з натрію, калію, амонію, кальцію, гідроксидів тривалентного заліза, ізопропіламіну, триетиламіну, 2-етиламіноетанолу, гістидину, прокаїну і т. д.

Звичайно, інгредієнти композицій поставляються або роздільно, або змішаними разом у вигляді уніфікованої (стандартної) лікарської форми, наприклад, у вигляді сухого ліофілізованого порошку, або в безводному концентраті в герметичному контейнері, такому як

Зо ампула або пакетик, з указанням кількості активного агента. Коли способом введення є інфузія, може бути забезпечена ампула стерильної води для ін'єкції, щоб ці інгредієнти могли бути змішані перед введенням.

Зокрема, цей винахід забезпечує також упакування одного або декількох профілактичних або терапевтичних засобів або фармацевтичних композицій за винаходом в герметичному контейнері, такому як ампула або пакетик, з указанням кількості цього засобу. В одному варіанті здійснення, один або декілька профілактичних або терапевтичних засобів або фармацевтичних композицій за винаходом поставляються у вигляді сухого стерилізованого ліофілізованого порошку або безводного концентрату в герметичному контейнері і можуть бути відновлені (наприклад, водою або сольовим розчином) до придатної концентрації для введення індивіду.

Переважно, один або декілька профілактичних або терапевтичних засобів або фармацевтичних композицій за винаходом поставляються у вигляді сухого стерилізованого ліофілізованого порошку в герметичному контейнері при уніфікованій дозі щонайменше 5 мг, більш переважно щонайменше 10 мг, щонайменше 15 мг, щонайменше 25 мг, щонайменше 35 мг, щонайменше мг, щонайменше 50 мг, щонайменше 75 мг або щонайменше 100 мг. Ці ліофілізовані 45 профілактичні або терапевтичні засоби або фармацевтичні композиції за винаходом повинні зберігатися при 2-8 С у їх первісному контейнері і ці профілактичні або терапевтичні засоби або фармацевтичні композиції за винаходом повинні вводитися в межах 1 тижня, переважно в межах 5 днів, у межах 72 годин, у межах 48 годин, у межах 24 годин, у межах 12 годин, у межах б годин, у межах 5 годин, у межах З годин або у межах 1 години після їх відновлення. В альтернативному варіанті здійснення, один або декілька профілактичних або терапевтичних засобів або фармацевтичних композицій за винаходом поставляються в рідкій формі в герметичному контейнері з указанням кількості і концентрації цього засобу. Переважно, рідка форма композиції, що вводиться, поставляється в герметичному контейнері при щонайменше 0,25 мг/мл, більш переважно щонайменше 0,5 мг/мл, щонайменше 1 мг/мл, щонайменше 2,5 мг/мл, щонайменше 5 мг/мл, щонайменше 8 мг/мл, щонайменше 10 мг/мл, щонайменше 15 мг/мл, щонайменше 25 мг/мл, щонайменше 50 мг/мл, щонайменше 75 мг/мл або щонайменше 100 мг/мл. Ця рідка форма повинна зберігатися при 2-8 "С у її первісному контейнері.

Антитіла і частини антитіл за винаходом можуть бути включені у фармацевтичну композицію, придатну для парентерального введення. Переважно, ці антитіла або частини бо антитіл готують у вигляді ін'єкційного розчину, який містить 0,1-250 мг/мл антитіла. Цей ін'єкційний розчин може складатися з рідкої або ліофілізованої дозованої лікарської форми у флаконі з кварцу або янтарю, ампулі або попередньо наповненому шприці. Буфером може бути

І-гістидин 1-50 мМ (оптимально 5-10 мМ), при рН 5,0-7,0 (оптимально рн 6,0). Інші придатні буфери включають, але не обмежуються ними, сукцинат натрію, цитрат натрію, фосфат натрію або фосфат калію. Для модифікації токсичності цього розчину може бути використаний хлорид натрію в концентрації 0-300 мМ (оптимально 150 мМ для рідкої лікарської форми). Для ліофілізованої лікарської форми можуть бути включені кріопротектори, переважно 0-10 95 сахароза (оптимально 0,5-1,0 90). Інші придатні кріопротектори включають трегалозу і лактозу.

Для ліофілізованої лікарської форми можуть бути включені наповнювачі, переважно 1-10 95 маніт (оптимально 2-4 95). Як для рідкої, так і для ліофілізованої лікарської форми можуть бути використані стабілізатори, переважно 1-50 мМ ГІ -метіонін (оптимально 5-10 мМ). Інші придатні наповнювачі включають гліцин, аргінін, і можуть бути включені у вигляді 0-0,05 95 полісорбату- 80 (оптимально 0,005-0,01 95). Додаткові поверхнево-активні речовини включають, але не обмежуються ними, полісорбат-20 і поверхнево-активні речовини ВК). Фармацевтична композиція, що містить антитіла і частини антитіл за винаходом, приготовлена у вигляді ін'єкційного розчину для парентерального введення, може додатково містити агент, застосовний як ад'ювант, такий як агенти, використовувані для збільшення абсорбції або диспергування терапевтичного білка (наприклад, антитіла). Особливо застосовним ад'ювантом є гіалуронідаза, така як Нуіїепех? (рекомбінантна гіалуронідаза людини). Додавання гіалуронідази в ін'єкційний розчин поліпшує біодоступність для людини після парентерального введення, зокрема підшкірного введення. Воно дозволяє також використовувати більш високі об'єми для ділянок ін'єкції (тобто перевищуючі 1 мл) з меншим болем і меншим дискомфортом і одержувати мінімальну кількість реакцій у ділянці ін'єкції (див. МО 2004078140, 005 2006104968, включені в даний опис за допомогою посилання).

Композиції за винаходом можуть знаходитися в різних формах. Вони включають, наприклад, рідкі, напівтверді і тверді лікарські форми, такі як рідкі розчини (наприклад, ін'єкційні і інфузійні розчини), дисперсії або суспензії, таблетки, пігулки, порошки, ліпосоми і супозиторії. Переважна форма залежить від передбачуваного способу введення і терапевтичного застосування. Типові переважні композиції знаходяться у формі ін'єкційних або інфузійних розчинів, таких як

Зо композиції, подібні з композиціями, використовуваними для пасивної імунізації людей іншими антитілами. Переважним способом введення є парентеральний спосіб (наприклад, внутрішньовенний, підшкірний, внутрішньоочеревинний, внутрішньом'язовий). В одному переважному варіанті здійснення, це антитіло вводять внутрішньовенною інфузією або ін'єкцією. В іншому переважному варіанті здійснення, це антитіло вводять внутрішньом'язовим або підшкірним введенням.

Звичайно терапевтичні композиції повинні бути стерильними і стабільними в умовах приготування і зберігання. Ця композиція може бути приготовлена у вигляді розчину, мікроемульсії, дисперсії, ліпосоми або іншої упорядкованої структури, яка придатна для високої концентрації лікарського засобу. Стерильні ін'єкційні розчини можуть бути приготовлені включенням цієї активної сполуки (тобто антитіла або частини антитіла) у необхідній кількості в придатному розчиннику з одним інгредієнтом або комбінацією інгредієнтів, перерахованих вище, якщо потрібно, з наступною стерилізацією за допомогою стерилізаційного фільтра.

Звичайно, дисперсії готують включенням цієї активної сполуки в стерильний носій, що містить базове дисперсійне середовище й інші потрібні інгредієнти з інгредієнтів, перерахованих вище.

У випадку стерильних, ліофілізованих порошків для приготування стерильних ін'єкційних розчинів, переважними способами приготування є вакуумне сушіння і розпилювальне сушіння, які дають порошок активного інгредієнта плюс будь-який додатковий бажаний інгредієнт із його попередньо профільтрованого через стерилізаційний фільтр розчину. Належна плинність розчину може підтримуватися, наприклад, за допомогою покриття, такого як лецитин, підтриманням необхідного розміру частинок у випадку дисперсії і за допомогою поверхнево- активних речовин. Пролонгована абсорбція ін'єкгованих композицій може здійснюватися включенням у цю композицію агента, що затримує абсорбцію, наприклад моностеаратних солей і желатину.

Антитіла і частини антитіл даного винаходу можуть вводитися різними способами, відомими в даній галузі, хоча для багатьох терапевтичних застосувань переважним способом/методом введення є підшкірна ін'єкція, внутрішньовенна ін'єкція або інфузія. Як буде зрозуміло кваліфікованому в даній галузі фахівцю, цей спосіб і/або метод введення буде варіюватися залежно від бажаних результатів. У деяких варіантах здійснення, активна сполука може бути приготовлена з носієм, який буде захищати цю сполуку від швидкого вивільнення, наприклад, у бо вигляді форми регульованого вивільнення, що включає імплантати, трансдермальні пластири і мікроіїінкапсульовані системи доставки. Можуть бути використані біодеградовні, біосумісні полімери, такі як етилен-вінілацетат, поліангідриди, полігліколева кислота, колаген, поліортоефіри і полімолочна кислота. Багато які зі способів приготування таких готових форм запатентовані або звичайно відомі кваліфікованим в даній галузі фахівцям. Див., наприклад, Бивіаіпед апа Сопігоєй Реїіеазе Огид Оеєїїмегу Зувієтв, .). В. Вобіпзоп, єд., Магсе! Реккег, Іпс.,

Мем Могк, 1978.

У деяких варіантах здійснення, антитіло або частина антитіла за винаходом може вводитися перорально, наприклад, з інертним розріджувачем або асимільованим їстівним носієм. Ці сполуки (і інші інгредієнти, якщо бажано) можуть бути також поміщені в желатинову капсулу з твердою або м'якою оболонкою, спресовані в таблетки або включені безпосередньо в раціон індивіда. Для перорального терапевтичного введення, ці сполуки можуть бути включені з ексципієнтами і використані у формі придатних для проковтування таблеток, трансбукальних таблеток, пастилок, капсул, еліксирів, суспензій, сиропів, облаток і т. п. Для введення сполуки за винаходом іншим способом, ніж парентеральне введення, може бути необхідним покривання цієї сполуки матеріалом для запобігання її інактивації або спільне введення цієї сполуки з таким матеріалом.

У ці композиції можуть бути також включені додаткові активні сполуки. У деяких варіантах здійснення, антитіло або частину антитіла за винаходом готують спільно і/або вводять разом з одним або декількома додатковими терапевтичними засобами, що застосовні для лікування порушень, у яких активність КОМ А здійснює негативний вплив. Наприклад, анти-КОМ А- антитіло або частина антитіла за винаходом може бути спільно приготовлене і/або спільно введене з одним або декількома додатковими антитілами, що зв'язують інші мішені (наприклад, антитілами, які зв'язують цитокіни або які зв'язують молекули клітинної поверхні). Крім того, одне або декілька антитіл за винаходом можуть бути використані в комбінації з двома або більше з попередніх терапевтичних засобів. Такі комбіновані терапії можуть вигідним чином використовувати більш низькі дози терапевтичних засобів, що вводяться, що дозволяє уникнути можливих токсичностей або ускладнень, пов'язаних з різними монотерапіями.

У деяких варіантах здійснення, антитіло до КОМ А або його фрагмент зв'язаний із носієм, що подовжує час на півжиття, відомим у даній галузі. Такі носії включають, але не обмежуються ними, Ес-домен, поліетиленгліколь і декстран. Такі носії описані, наприклад, у Заявці США Мо 09/428082 і опублікованій Заявці РСТ Мо УМО 99/25044, що включені в даний опис за допомогою посилання для будь-якої мети.

В одному конкретному варіанті здійснення, вводять послідовності нуклеїнових кислот, що містять нуклеотидні послідовності, які кодують антитіло за винаходом або інший профілактичний або терапевтичний засіб за винаходом для лікування, попередження, контролювання або зменшення інтенсивності порушення або його одного або декількох симптомів за допомогою генної терапії. Генною терапією називають терапію, виконувану введенням індивіду експресованої або здатної експресуватися нуклеїнової кислоти. У цьому варіанті здійснення даного винаходу, ці нуклеїнові кислоти продукують кодоване ними антитіло або профілактичний або терапевтичний засіб за винаходом, який опосередковує профілактичну або терапевтичну дію.

Будь-який зі способів генної терапії, доступних у даній галузі, може бути використаний відповідно до даного винаходу. Відносно оглядів способів генної терапії, див. соїа5рієї еї аї., 1993, Сііпіса! Рнаптасу 12:488-505; Ми апа Ми, 1991, Віоштегару 3:87-95; ТоІвіозПем, 1993, Апп.

Веу. РНаптасої. Тохісої. 32:573-596; Миїїїдап, Зсіеєпсе 260:926-932 (1993); і Могдап апа Апаегзхоп, 1993, Апп. ВНеу. Віоспет. 62:191-217; Мау, 1993, ТІВТЕСН 11(5):1155-215. Способи, звичайно відомі в галузі технології рекомбінантних ДНК, які можуть бути використані, описані в А!йз5ибеї еї аІ. (еаз.), Ситепі РгоїосоЇ5 іп МоїІесшаг Віоіоду, допп УМієу 5 Боп5, МУ (1993) ї КгієедіІег, Сепе

Тгапетег апа Ехргеззіоп, А І абогаїогу Мапиаї, 5іосКіоп Ргевз5, МУ (1990). Докладний опис різних способів генної терапії описаний в 05 20050042664 Аї, який включений у даний опис за допомогою посилання.

КОМ А відіграє критичну роль у патології, пов'язаній з різними визначеними вище захворюваннями. Було описано, що КОМ А і білюи КОМ є підвищувальним чином регульованими в ділянках ушкоджень у людей, що страждають від травматичного ушкодження головного мозку (Зспулар еї аїЇ., Агой. Меигої. 62:1561-8, 2005а), у ділянках півтіні і кору ушкодженого інсультом головного мозку людини (Зспугаб еї аї., Агсп. Меигої. 62:1561-8, 2005а), у субстанції нігра пацієнтів, що страждають від хвороби Паркінсона (Во55егз5 еї а). Вгаіп Райоіоду мої. 19:91-107, 2008). Таким чином, КОМ А-антитіла є придатними агентами для комбінованої терапії внутрішньомозкового інсульту, травматичного ушкодження головного мозку, хвороби бо Альцгеймера й інших нейродегенеративних порушень нервової системи людини. У випадку пацієнтів з інсультом лікування в межах перших трьох годин складається з доставки тканинного активатора плазміногену для лізису згустків крові (Гіапд еї а. Агосп. Меийгої. 65:1429-33, 2008), і таке лікування могло б у принципі комбінуватися з доставкою КОМ А-антитіла, яка надає підхід з використанням відмінного лікування і набагато більш розширеного вікна терапії. У випадку хвороби Альцгеймера, комбінування лікарських засобів з КОМ А-антитілами можливе зі схваленими підсилювачами пізнавальної здатності, Донепезилом, Мемантином, і такий підхід може суттєво сповільнювати прогресуючу невропатологію. Інтраназальна доставка інсуліну здійснює позитивні дії на увагу і пам'ять (Напхоп апа Егеу, ВМС Меишгозсі. 9:55, 2008) ї є можливим способом введення для КОМ А-антитіл, що дозволяє обходити гематоенцефалічний бар'єр. У пацієнтів із хворобою Паркінсона (РО), наявне на даний час лікування основане головним чином на допамінергічних агентах, подібних леводопі, пролікам допаміну (Кпог апа

Неги, Ст. Сііп. Рнаптасої. 2:234-43, 2007), ропінролу, неерголінічному агоністу допаміну (дові еї аІ. У. Мешгої. 255 Зиррі. 5:60-63, 2008), інгібіторам моноаміноксидази В Расагіліну і Селегіліну (ЕіІтег апа Вепопі, Ехреп Оріп. Рнаптасоїнег. 9:2759-72, 2008). Незважаючи на їх сприятливі дії у випадку ранньої і помірної хвороби Паркінсона (РО), жодний з цих лікарських засобів не здатний попереджати прогресуючу дегенерацію субстанції нігра й асоційованих субкортикальних і кортикальних ділянок головного мозку, і, отже, комбінована терапія зі стимулюючими регенерацію КОМ А-антитілами могла б сповільнювати процес цього захворювання.

Будь-який нейропротективний засіб, будь то антиоксидант, акцептори радикалів, протисудомний лікарський засіб, такий як Фенітоїн, або лікарський засіб Еритропоетин, є придатним для комбінованої терапії з прорегенеративними КОМ А-антитілами, розширюючи за допомогою цього звичайно дуже вузьке вікно терапевтичного лікування нейропротекторів.

Антитіла і частини антитіл за винаходом можуть бути використані для лікування людей, що страждають від таких захворювань.

Повинно бути зрозуміло, що антитіла за винаходом або їх антигензв'язувальні частини можуть бути використані окремо або в комбінації з додатковим засобом, наприклад терапевтичним засобом, причому зазначений додатковий засіб вибирається кваліфікованим фахівцем для його передбачуваної мети. Наприклад, додатковим засобом може бути

Зо терапевтичний засіб, що визнаний в даній галузі як застосовний засіб для лікування захворювання або стану, що підлягає лікуванню антитілом даного винаходу. Цим додатковим засобом може бути також засіб, який надає переважну ознаку цій терапевтичній композиції, наприклад засіб, що діє на в'язкість цієї композиції.

Крім того, повинно бути зрозуміло, що комбінаціями, які повинні бути включені в цей винахід, є комбінації, застосовні для передбачуваної для них мети. Агенти, представлені нижче, є ілюстративними для такої мети, але не призначені для обмеження. Комбінаціями, які є частиною за винаходом, можуть бути антитіла даного винаходу і щонайменше один додатковий засіб, вибраний зі списків, наведених нижче. Комбінація може також включати більше одного додаткового засобу, наприклад два або три додаткові засоби, якщо ця комбінація є такою, що може виконуватися її передбачувана функція.

Необмежувальні приклади терапевтичних засобів для розсіяного склерозу, з якими антитіло або частина антитіла за винаходом можуть бути об'єднані, включають наступне: кортикостероїди; преднізолон; метилпреднізолон; азатіоприн; циклофосфамід; циклоспорин; метотрексат; 4-амінопіридин; тізанідин; інтерферон-ВТа (АМОМЕХ; Віодеп); інтерферон-В1Б (ВЕТАБЕКОМ); Спігоп/Вепгіех); інтерферон а-п3) (Іпегегоп Зсіепсез/Еціітоїо), інтерферон-а (Ага умаззептапп/9ув.)), інтерферон ВІТА-ІЕ (ЗегопоЛппаіе Тпегарешіс5), Пегінтерферон аг2р (Еп2оп/5спегіпд-Ріоцоі), Співполімер 1 (Сор-1; СОРАХОМЕ; Тема РНаптасеціїсаї! Іпаивійіев, Іпс.); гіпербаричний кисень; внутрішньовенний імуноглобулін; кладрибін; антитіла до інших цитокінів людини, факторів росту і їх рецепторів або антагоністи інших цитокінів людини, факторів росту і їх рецепторів, наприклад, ТМЕ, ГТ, 1-1, 1-2, 1-6, 1-7, 11 -8, 1-23, 1-15, 11-16, І/-18, ЕМАР-І,

СМ-С5Б, РОБ і РОСР. Антитіла за винаходом або їх антигензв'язувальні частини можуть комбінуватися з антитілами до молекул клітинної поверхні, таких як СО2, СОЗ, 204, СО8, СО 19,

Сорго, срг5, 6ргв, Сбрзо, 26040, 0045, 26069, 6080, 2086, СОО9О, або їх лігандів. Антитіла за винаходом або їх антигензв'язувальні частини можуть також комбінуватися з засобами, такими як метотрексат, циклоспорин, ЕК5Об, рапаміцин, мікофенолат-мофетил, лефлуномід, МЗАЇО, наприклад, ібупрофен, кортикостероїди, такі як преднізолон, інгібітори фосфодіестерази, агоністи аденозину, антитромботичні агенти, інгібітори комплементу, адренергічні агенти, агенти, що перешкоджають передачі сигналу прозапальних цитокінів, таких як ТМЕс або 1-1 (наприклад, ІКАК, МІК, ІКК, р38 або інгібітори МАР-кінази), інгібітори І--18-перетворюючого 60 ферменту, інгібітори ТАСЕ, інгібітори передачі сигналу Т-клітин, такі як інгібітори кінази,

інгібітори металопротеїнази, сульфасалазин, азатіоприн, б-меркаптопурини, інгібітори перетворюючого ангіотензин ферменту, розчинні рецептори цитокінів і їх похідні (наприклад, розчинні рецептори роб або р75 ТМЕ, 511 -ІВІ, 51-18, 511/-6К) і протизапальні цитокіни (наприклад, 1І--4, 1-10, 1-13 Тор).

Переважні приклади терапевтичних засобів для розсіяного склерозу, з якими може комбінуватися це антитіло або його антигензв'язувальна частина, включають інтерферон-р, наприклад ІЄМВТа і ІРМВ1р; копаксон, кортикостероїди, інгібітори каспази, наприклад інгібітори каспази-1, інгібітори 1-1, інгібітори ТМЕ і антитіла до ліганду СО40 і СО80.

Антитіла за винаходом або їх антигензв'язувальні частини можуть також комбінуватися з засобами, такими як алемтуцумаб, дронабінол, Унімед, дакліцумаб, мітоксантрон, ксаліпродену гідрохлорид, фампридин, глатирамеру ацетат, наталіцумаб, синабідол, а-імунокін ММЗОЗ, АВЕ- 215062, Апегдіх.М5, антагоністи рецепторів хемокінів, ВВК-2778, калаквалін, СРІ-1189, ІЕМ (інкапсульований у ліпосомі мітоксантрон), ТНССВО (агоніст канабіноїду) МВР-8298, мезопрам (інгібітор РОЕ4), ММА-715, анти-ІІЇ -6Є-рецептор-антитело, нейровакс, пірфенідон-алотрап 1258 (ВОР-1258), 5ТМЕ-К1, талампанел, терифлуномід, ТОЕ-бетаг2, типлімотид, антагоністи МІ А-4 (наприклад, ТК-14035, МІ А4 ОПганацег, Апівдгап-ЕГАМ/Віодеп), антагоністи інтерферону гамма, агоністи 1-4.

Фармацевтичні композиції за винаходом можуть включати "терапевтично ефективну кількість" або "профілактично ефективну кількість" антитіла або частини антитіла за винаходом. "Терапевтично ефективною кількістю" називають кількість, ефективну, при необхідних дозах і протягом необхідних періодів часу, для досягнення бажаного терапевтичного результату.

Терапевтично ефективна кількість антитіла або частини антитіла може бути визначена кваліфікованим у даній галузі фахівцем і може варіюватися відповідно до таких факторів, як стан захворювання, вік, стать і маса індивідуума і здатність цього антитіла або цієї частини антитіла індукувати бажану реакцію в цьому індивідуумі. Терапевтично ефективною кількістю є також кількість, у якій терапевтично сприятливі дії перевищують будь-які токсичні або шкідливі для здоров'я дії цього антитіла або частини антитіла. "Профілактично ефективною кількістю" називають кількість, ефективну, при необхідних дозах і протягом необхідних періодів часу, для досягнення бажаного профілактичного результату. Звичайно, оскільки профілактичну дозу

Зо використовують у індивідах до або на ранніх стадіях захворювання, профілактично ефективна кількість буде меншою, ніж терапевтично ефективна кількість.

Схеми введення доз можуть коректуватися для забезпечення оптимальної бажаної реакції (наприклад, терапевтичної або профілактичної реакції). Наприклад, може вводитися єдиний болюс, можуть вводитися декілька розділених доз протягом часу або ця доза може бути пропорційно зменшена або збільшена у випадку нагальної потреби терапевтичної ситуації.

Особливо переважним є приготування парентеральних композицій у формі дози на один прийом для легкості введення й однорідності дози. Формою уніфікованої (стандартної) дози (дози на один прийом) називають фізично дискретні одиниці, що придатні як уніфіковані (стандартні) дози для підлягаючих лікуванню індивідів-ссавців; кожна уніфікована (стандартна) доза містить попередньо визначену кількість активної сполуки, розраховану для одержання бажаного терапевтичного ефекту, з урахуванням необхідного фармацевтичного носія.

Специфікація відносно уніфікованих (стандартних) форм за винаходом диктується (а) унікальними характеристиками активної сполуки і конкретним терапевтичним або профілактичним ефектом, що повинен бути досягнутий, і (б) недоліками, властивими в даній галузі компаундуванню такої активної сполуки, відносно впливу на чутливість індивідуума, і безпосередньо залежить від них.

Зразковим, необмежувальним діапазоном для терапевтично або профілактично ефективної кількості антитіла або частини антитіла за винаходом є 0,1-20 мг/кг, більш переважно 1-10 мг/кг.

Слід зазначити, що величини доз можуть варіюватися залежно від типу і тяжкості стану, симптоми якого повинні бути зменшені. Крім того, повинно бути зрозуміло, що для будь-якого конкретного індивіда, конкретні схеми введення доз повинні коректуватися протягом часу відповідно до потреби індивідуума і професійної думки особи, що вводить ці композиції або контролює введення цих композицій, і що діапазони доз, встановлені в даному описі, є тільки зразковими і не призначені для обмеження обсягу або практики заявленої композиції.

Для кваліфікованих у даній галузі фахівців буде легко зрозумілим, що інші придатні модифікації й адаптації способів описаного в даному описі винаходу є очевидними і можуть бути одержані з використанням придатних еквівалентів без відхилення від обсягу винаходу або описаних у даному описі варіантів. Після докладного опису даного винаходу, цей винахід буде більш зрозумілим при посиланні на наступні приклади, що включені тільки для цілей ілюстрації і 60 не призначені для обмеження винаходу.

Приклади

Способи

Наступні способи описують докладно експериментальні процедури, використовувані в розділі Приклади. () ЕСІЗА-планшети для прямого зв'язування покривали ПКОМ А (КО) у концентрації 2 мкг/мл у карбонатному буфері. Потім ямки блокували 2 95 блокувальним розчином (Віо-Вад) протягом 1 години при кімнатній температурі. Біотинільовані антитіла серійно розводили з фактором розведення 1:5 у 0,1 95 БСА/ЗФР уздовж по планшету і інкубували протягом 1 години при кімнатній температурі. Детектуючим реагентом було розведення 1:10000 страптавідину-

НЕР у 0,1 95 БСА/ЗФР. Детектування виконували з реагентом ТМВ, яке зупиняли 2н Но5бох і зчитували ОО при 450 нм. (ї) ГАС5-аналіз. Стабільні трансфектанти клітин НЕК293, надекспресуючі ПЕОМ А, або клітин ВАЕЗ, надекспресуючі гаїОМ А, піддавали забарвленню неміченими МАВ 5Е9 або 801 протягом більше 15 хвилин при 4 "С в 0,195 буфері БСА/ЗФР. Детектування проводили з антитілом РЕ миші проти дос щура. (ії) Твердофазні аналізи ЕГІЗБА для оцінки МАВ 5Е9 в аналізах зв'язування ЯНКОМ А - неогенін.

Планшети ЕГІЗА (Іпттипо Ріасе Сеп. Махі зогр. 96 МОМС, 439454) покривали протягом 1 години при 37 "С концентрацією 2,5 мкг/мл позаклітинного домену Ніб-міченого білка Неогеніну людини (концентрація вихідного розчину: 30 мкг/мл). Після інгібування, незв'язаний Неогенін видаляли в З окремих стадіях промивань з використанням ЗФР, що містить 0,02 95 Твін-20.

Блокування покритих Неогеніном планшетів виконували додаванням 200 мкл на ямку блокувального розчину З 95 бичачого сироваткового альбуміну (БСА), ЗФР, Твін-20 (0,02 Об).

Після інгібування протягом 1 години при 37 "С, цей блокувальний розчин видаляли і додавали фрагменти КОМ А або повнорозмірний білок, кон'югований з їс-міткою (тегом) людини, з антитілом або без антитіла. У деяких варіантах здійснення антитіла попередньо інкубували з їс- кон'югованими білками ПКСМ А протягом 1 години при кімнатній температурі. Покриті

Неогеніном планшети інкубували з НКОМ А з антитілами або без антитіл протягом 1 години при 37 "С. Після З стадій промивання ЗФР/Твін-20 (0,02 95), планшети інкубували з міченим біотином антитілом проти їс людини (1 мг/мл, розведений 1:200 у ЗФР, що містить 0,6 95 БСА, 0,02 95 Твін-20), номери за каталогом ЧУаскзоп ІттипоНезеагїсі: 709-065-149, протягом 1 години при 37 "С. Незв'язане антитіло видаляли З стадіями промивань з використанням ЗФР/Івін-20 (0,02 95). Для візуалізації міченого біотином їс-антитіла, додавали комплекс, що складається зі стрептавідину-пероксидази (Коспе, саї. Ж 11089153001), розведений 1:5000 ЗФР, що містить 0,6 Зо В5А, 0,02 95 Твін-20, з наступним інгібуванням при 37 "С протягом 1 години. Незв'язаний комплекс пероксидази видаляли в З послідовних стадіях промивань (ЗФР/Івін-20 (0,02 95)) перед додаванням субстрату пероксидази (Іттипо Риге ТМВ, Рієегсе й 34021). Реакцію субстрату зупиняли через 1-30 хвилин після його додавання до ямок з використанням 2,5 М

На5О0»5. Планшети аналізували (визначенням ОБО) при довжині хвилі 450 нм із використанням фотометра Апіпов. (м) Твердофазні аналізи ЕГІ5А для оцінки МАВ 5Е9 в аналізах зв'язування ПКОМ А - ВМР-4.

Планшети ЕГІЗА (Іпттипо Ріасе Сеп. Махі зогр. 96 МОМС, 439454) покривали протягом 1 години при 37 "С розчином, що містить концентрацію 2,5 мкг/мл рекомбінантного білка ВМР-4 людини (КО БЗузіет5, й 314-ВР, Гої Ж ВЕМ316061). Після інкубування, незв'язаний ВМР-4 видаляли в З окремих стадіях промивань з використанням ЗФР, що містить 0,02 95 Твін-20.

Блокування покритих ВМР-4 планшетів виконували додаванням 200 мкл на ямку блокувального розчину З 95 бичачого сироваткового альбуміну (БСА), ЗФР, Твіну-20 (0,02 95). Після інкубування протягом 1 години при 37 "С, цей блокувальний розчин видаляли і додавали фрагменти КОМ А або повнорозмірний білок, кон'югований з їс-міткою (тегом) людини, з антитілом або без антитіла. У деяких варіантах здійснення антитіла попередньо інкубували з їс-кон'югованими більками ПЕОМ А протягом 1 години при кімнатній температурі. Покриті ВМР-4 планшети інкубували з ЯНКОМ А з антитілами або без антитіл протягом 1 години при 37 "С. Після З стадій промивання ЗФР/Івін-20О (0,02 95), планшети інкубували з міченим біотином антитілом проти їс людини (1 мг/мл, розведений 1:200 у ЗФР, що містить 0,6 95 БСА, 0,02 95 Твін-20), номери за каталогом Часкзоп ІттипоКезеагси: 709-065-149, протягом 1 години при 37 С. Незв'язане антитіло видаляли З стадіями промивань з використанням ЗФР/Івін-20 (0,02 Фо). Для візуалізації міченого біотином їс-антитіла, додавали комплекс, що складається зі стрептавідину- пероксидази (Коспе, саї. 2 11089153001), розведений 1:5000 ЗФР, що містить 0,6 95 В5А, 0,02 96

Твін-20, з наступним інгібуванням при 37 С протягом 1 години. Незв'язаний комплекс 60 пероксидази видаляли в З послідовних стадіях промивань (ЗФР/Твін-20 (0,02 90)) перед додаванням субстрату пероксидази (Іттипо Риге ТМВ, Рієегсе Ж 34021). Реакцію субстрату зупиняли через 1-30 хвилин після його додавання до ямок з використанням 2,5 М Не»5Ох.

Планшети аналізували (визначенням ОО) при довжині хвилі 450 нм із використанням фотометра Апіпов5. (м) Твердофазні аналізи ЕГІЗА для оцінки МАВ 5Е9 в аналізах зв'язування ПКОМ А - ВМР-2.

Планшети ЕГІЗА (Іпттипо Ріасе Сеп. Махі зогр. 96 МОМС, 439454) покривали протягом 1 години при 37 "С розчином, що містить концентрацію 2,5 мкг/мл рекомбінантного білка ВМР-2 людини (КО Зузіетв5, Ж 355-ВМ, І ої 24 М5АО4). Після інкубування, незв'язаний ВМР-2 видаляли в З окремих стадіях промивань з використанням ЗФР, що містить 0,02 95 Твін-20. Блокування покритих ВМР-4 планшетів виконували додаванням 200 мкл на ямку блокувального розчину З 95 бичачого сироваткового альбуміну (БСА), ЗФР, Твіну-20 (0,02 95). Після інкубування протягом 1 години при 37 "С, цей блокувальний розчин видаляли і додавали фрагменти КОМ А або повнорозмірний білок, кон'югований з їс-міткою (тегом) людини, з антитілом або без антитіла. У деяких варіантах здійснення антитіла попередньо інкубували з їс-кон'югованими білюеами ПЕОМ

А протягом 1 години при кімнатній температурі. Покриті ВМР-2 планшети інкубували з ПЕОМ А з антитілами або без антитіл протягом 1 години при 37 "С. Після З стадій промивання ЗФР/Івін-20 (0,02 95), планшети інкубували з міченим біотином антитілом проти їс людини (1 мг/мл, розведений 1:200 у ЗФР, що містить 0,6 95 БСА, 0,02 95 Твін-20), номери за каталогом Часкхоп

ІттипоВезвєагсі: 709-065-149, протягом 1 години при 37 "С. Незв'язане антитіло видаляли З стадіями промивань з використанням ЗФР/Івін-2О (0,02 95). Для візуалізації міченого біотином їс-антитіла, додавали комплекс, що складається зі стрептавідину-пероксидази (Коспе, саї. Ж 11089153001), розведений 1:5000 ЗФР, що містить 0,695 В5БА, 0,02 95 Твін-20, з наступним інгібуванням при 37 "С протягом 1 години. Незв'язаний комплекс пероксидази видаляли в З послідовних стадіях промивань (ЗФР/Твін-20 (0,02 95)) перед додаванням субстрату пероксидази (Іттипо Риге ТМВ, Ріегсе Ж 34021). Реакцію субстрату зупиняли через 1-30 хвилин після його додавання до ямок з використанням 2,5 М Н25О»х. Планшети аналізували (визначенням ОБ) при довжині хвилі 450 нм із використанням фотометра Апійов5. (м) Культура клітин Мега-2.

Клітини людини Міега-2 одержували з Сегтап СоїІесійоп ої Місгоогдапізт5 апа СеїЇ Сийигев5

Зо (0М57, Вгайпзспмеїд). Заморожені вихідні розчини недиференційованих клітин Мега-2 розморожували в середовищі ОМЕМ, що містить 10 95 фетальну телячу сироватку (ФТС; УКкн

Віозсіепсе, Капзав5, ОА) і 5 95 кінську сироватку (Н5; Зідта, Септапу). Клітини вирощували в колбах для культивування (Огеіпег, Сегтапу), поки вони не досягали конфлюентності 80 95.

Для диференціювання нейронів, клітини Мега-2 висівали при густині 2,5х105 клітин/175 см? у середовищі для диференціювання (середовищі ОМЕМ, що містить 1095 ФТС, 595 Н5Б, 1 95 пеніцилін-стрептоміцин, ретиноєву кислоту 10 мкМ). Клітини диференціювалися протягом З тижнів і це середовище заміняли два рази на тиждень.

Після диференціювання клітини відділяли з використанням трипсину-ЕДТА ії розділяли при співвідношенні 1:6. Через 48 годин нейронні клітини відділяли постукуванням від підстилаючих клітин. Зміщені клітини переносили для агрегації в новому середовищі в нові струшуванні колби для культивування (Согпіпд, ОБА). Диференційованим клітинам Міега-2 давали агрегуватися в умовах однорідного горизонтального струшування при 37 "С протягом 24 годин у базальному середовищі для нейронів (Меигобазаї) (сірсо), доповненому В27 (бібсо), глутаміном (85ірсо) і пеніциліном-стрептоміцином. Агрегати Мега-2 висівали при густині приблизно 20-30 агрегатів на покривне скло в 24-ямкових чашках. Покриті попередньо полілізином покривні стекла покривали ламініном (20 мкг/мл, Зідта) і рекомбінантним їс-зв'язаним фрагментом Ме786 (амінокислоти 47-1686) КОМ А людини в концентрації 10 мкг/мл. Після висівання культури обробляли МАВ 5Е9, що додається при трьох різних концентраціях (0,1 мкг/мл; 1 мкг/мл; 10 мкг/мл) до культурального середовища, і додатково інкубували протягом 24 годин при 37 "С у базальному середовищі для нейронів (Меигобаза!). Потім агрегати фіксували в 495 параформальдегіді (2 години, кімнатна температура) і підвищували проникність клітин додаванням 0,195 Тритону Х-100 у ЗФР (20 хвилин, кімнатна температура). Для флуоресцентного забарвлення культури блокували ЗФР, що містить 195 БСА, протягом 1 години при кімнатній температурі. Після блокування клітини Мега інкубували з моноклональним антитілом миші проти ізотипу З Д-тубуліну (клони 5013010, Зідта Ж 8660) протягом 2 годин при кімнатній температурі. Незв'язане антитіло видаляли З різними стадіями промивань (5-15 хв кожна) і клітини Мега інкубували з Су-3-кон'юЮгованим ослиним антитілом проти мишачого Ід (дЧаскзоп ІттипоКезеагсіп Гої 62597), розведеним 1:350-кратно в ЗФР/О,5 95 БСА і 0,5 мкг/мл бісбензиміду. Після інкубування протягом 1 години культури промивали З рази для видалення незв'язаного вторинного антитіла. Для флуоресцентної мікроскопії, покривні стекла заливали в

Ріноготоишпі С (ЗошНетп Віоїеси, Еспіпа).

Зображення агрегатів Міега-2 одержували з використанням флуоресцентного мікроскопа 2ві55 Ахіомегі 200 і ріст нейритів цих культур автоматично аналізували з використанням власної системи одержання зображення і системи аналізу. Автоматичний аналіз росту нейритів виконували з використанням Ітаде Рго Ріиз 4.5 і статистичний аналіз цих даних виконували з використанням Сгарп Рай Ргізхт 4. Зростання нейритів нормалізували відносно контрольних культур, вирощуваних за відсутності фрагмента 2786 КОМ А людини. (мі) Культура ЗН-5У5У.

Клітини 5Н-5У5М (АТСС, СІ -2266) є клітинами нейробластоми людини, одержаними з метастатичної пухлини головного мозку. Ці клітини вирощували в середовищі, що складається з 50 95 збалансованого сольового розчину Ерла (Іпмігодеп І їє Тесппоіодієвз, Саї. Ж 24010-043) і 50 95 12 (Нат) живильна суміш я сішамАХ-ї1 (Іпийгодеп І їТе Тесппоіодієв, Саї. Ж 31765-027).

Це середовище додатково доповнене інактивованою нагріванням 10 95 фетальною телячою сироваткою (ФТС, УКН Віозсіепсе5, Капза5 Саї. Ж 12107-1000М), 1 95 МЕАА (розчин замінних амінокислот МЕМ (Зідта-Аїагісп Саї. Ж М 1745) і 1 95 пеніциліном (10000 Од/мл)у/стрептоміцином (10000 мкг/мл) (Іпмігодеп І їе Тесппоіодіє5, Саї. Ж 15140-122). Для стимуляції диференціювання нейронів і росту нейронних виступів, клітини зН-5У5У культивували в середовищі, доповненому 10 мкМ ретиноєвою кислотою (КА, Зідта-Аїагісн Саї. 2 В2625-050М05), протягом декількох днів.

Диференційовані клітини ЗН-5У5У вирощували в колбах для культури тканини і видаляли обережною трипсинізацією і висівали на скляні покривні стекла, покриті смугастим малюнком (патерном) білка КОМ А або його фрагмента і Колагеном І. (мії) Одержання смугастих покривних стекол.

Модифіковану версію аналізу смуг на покривних стеклах виконували злегка відмінним шляхом, як описано раніше (КпоеїЇ еї а. Маїшйге Ргоїосої5 2:1216-1224, 2007) і підсумовано нижче.

Стерильні кремнієві матрикси для одержання смужок очищених білків спресовували на поверхні чашок Петрі із шорсткою стороною, повернутою догори. Промиті етанолом, чисті покривні стекла укладали на цей матрикс і кути цього матриксу помічали кульковою ручкою з

Зо чорнилом на зворотній стороні покривного скла. Матрикс, що несе це покривне скло, обережно перевертали догори дном з покривним склом, повернутим до дна цієї чашки Петрі. Ес- кон'юговане повнорозмірне інгібувальне антитіло КОМ А або його їс-фрагменти або рекомбінантний КОМ А людини (850 бБувієт5 Саї. Ж 2459 РМ) змішували з 10 мкл антимишачого ЕІТС-міченого антитіла (Гар-специфічного козячого антитіла проти мишачого

Іс, бідта-АІдисни Саї. й Е-4018) для візуалізації смужок КОМ А. З використанням шприца

Гамільтона, 50 мкл КОМ А-РІТО-антитіла обережно ін'єккгували через вхідний канал.

Надлишкова рідина залишала цей матрикс через вихідний канал і видалялася тканиною

КІеепех. Після інкубування цього матриксу-покривного скла при 37 "С протягом 2 годин, перший покриваючий розчин (що містить КОМ А), вимивали 200 мкл ЗФР. На наступній стадії, покривне скло зі смужками КОМ А переносили в 24-ямкову чашку, покриту 500 мкл Колагену І (Колаген хвоста щура, Весіоп РісКіпзоп Віозсіепсе5 Саї. Ж 354236), для заповнення порожніх просторів між смугами КОМ А ії інкубували при 37 "С протягом 2 годин. Зрештою одержували малюнок почергових смуг КОМ А і Колагену на цьому покривному склі. Після інкубування, незв'язаний

Колаген І вимивали трьома окремими стадіями промивань з використанням ЗФР і диференційовані клітини ЗН-5У5У висівали на ці покривні стекла. Інкубування клітин ЗН-5У5У на цьому субстраті, що має малюнок (патерн), продовжували при 37 "С протягом 20-24 годин у присутності або за відсутності моноклональних антитіл, спрямованих проти ЕОМ А людини.

Для аналізу імунофлуоресценції клітини фіксували в 4 95 параформальдегіді протягом 2 годин при кімнатній температурі або протягом ночі при 4 "С і проникність клітин збільшували інкубуванням з ЗФР, що містить 0,195 Тритон Х-100, протягом 10-20 хвилин при кімнатній температурі. Після блокування З 95 БСА протягом 60 хвилин клітини інкубували з первинним антитілом (моноклональним антитілом проти клону ізотипу З р-тубуліну 50 30 10, бідта-

Аїдгіспй Саї Ж Т8660) протягом 2 годин при кімнатній температурі і після декількох стадій промивань із вторинним антитілом (ослиним антимишачим антитілом Су-3 Часквопіттипо

Кезеагсі І о:62597), розведеним у ЗФР із 0,1 95 БСА, протягом 1 години. Ядра контрастували з використанням бісбензиміду НЗ3258 (КівдеІ-Ое-Наєп, Саї. Ж А-0207). Нарешті, клітини заливали в Ріпоготоипі с (Зоцїйпегп Віоїесппоїоду Авзосіасев Іпс.: Саї. Ж 010001). Клітини аналізували з використанням флуоресцентного мікроскопа Ахіоріапаг (7 еїів55). (їх) Конструювання й експресія рекомбінантних анти-КОМ А-антитіл.

ДНК, кодуючу КДНК-фрагменти варіабельної області важкого ланцюга антитіл щура проти моноклональних антитіл проти КОМ А людини 5Е9 і 801, клонували в експресуючий вектор

РНУБЕ, що містить константну область їдДО1 людини, 7гбд містить 2 амінокислотні мутації шарнірної області, гомологічної рекомбінацією в бактеріях. Цими мутаціями є заміна лейцину на аланін у положеннях 234 і 235 (БО питбегіпо, Її ипа еї аї., 1991, 9. Іттипої., 147:2657).

Варіабельну область легкого ланцюга моноклональних антитіл 5Е9 і 801 клонували у вектор

РНУБЕ, що містить константну область каппа людини. Приклади векторів рНур-Е включають

РНУБЕ-пСК ї РНУБЕ-НСЯ1,7, поп-а (див. Заявку на патент США Мо 61/021282). Повнорозмірні антитіла транзиторно експресували в клітинах 293 Е котрансфекцією химерних кКДНК важкого ланцюга і легкого ланцюга, лігованих у експресійну плазміду рРНуБЕ. Супернатанти клітин, що містять рекомбінантне антитіло, очищали хроматографією на протеїн А-сефарозі і зв'язане антитіло елюювали додаванням кислого буфера. Антитіла нейтралізували і діалізували в ЗФР.

Потім ці очищені моноклональні антитіла проти КОМ А людини випробували на їх здатність зв'язувати КОМ А за допомогою ЕГІЗБА, описаного в Прикладі 1, і конкурентного ЕГІЗА, описаного в Прикладі 7.

Приклад 1: Генерування моноклональних антитіл проти КОМ А людини.

Моноклональні антитіла щура проти КОМ А людини одержували наступним чином:

Приклад 14А: Імунізація щурів антигеном КОМ А людини.

Двадцять п'ять мікрограмів рекомбінантного очищеного КОМ А людини (К85О 5бузіет5

Сатше459-ЕМ Іої МКНО2511А), змішаного з повним ад'ювантом Фрейнда (Зідта), ін'єктували підшкірно чотирьом 6-8-т-ижневим щурам Нагіап Зргадие Оам/еєу у день 1. У дні 21, 42 ї 63, двадцять п'ять мікрограмів рекомбінантного очищеного КОМ А людини, змішаного з неповним ад'ювантом Фрейнда (5ідта), ін'єктували підшкірно тим же самим 4 щурам Нагіап 5ргадие

Баулеу. У день 144 або день 165 щурів ін'єктували внутрішньовенно 10 мкг рекомбінантного очищеного КОМ А людини.

Приклад 1В: Генерування гібридоми.

Спленоцити, одержані з імунізованих щурів, описані в прикладі 1.2.А, зливали з 5Р2/О- клітинами при співвідношенні 2:1 відповідно до встановленого способу, описаному у КопПіег, о. апа Міїбївіп 1975, Маїшге, 256:495, для генерування гібридом. Продукти злиття висівали в

Зо селективні середовища, що містять азасерин і гіпоксантин, у 96-ямкових планшетах при густині 1,5х105 клітин селезінки на ямку. Через сім-десять днів після злиття, спостерігали макроскопічні гібридомні колонії. Супернатант із кожної ямки, що містить колонії гібридом, випробували прямим ЕГІЗА (див. приклад 2) на присутність антитіла до КОМ А людини. ЕГІЗА-позитивні клітинні лінії тестували в ЕАС5 проти стабільно трансфікованих клітин НЕК293, експресуючих

КОМ А людини або щура. Лінії гібридомних клітин щурів потім тестували в прямому ЕГІЗА на перехресну реактивність із щурячим КОМ А ії ЕГІЗА-зв'язування зі злитим білююм НИКОМ А 47- 168.

Таблиця 7

Зв'язування щурячих моноклональних антитіл проти КОМ А

ІНиВаМ А пваМА гМагєєам А 168/Ни СЕС

Приклад 2. Пряме ЕГІЗА-зв'язування тА 59 і 801.

Як показано на фігурі ТА, тАб 5Е9 їі 801 зв'язуються з ЯНКОМ А з подібними титрами, як описано вище в розділі (ї). Було також показано, що тАр 5Е9 зв'язується з щурячим КОМ А у

ЕГПІЗА, тоді як 801 не здатне зв'язуватися з щурячим КОМ А (дані не показані). Фігура 18 показує, що тАбБ 5Е9 і 801 зв'язуються з клітинами НЕК293, надекспресуючими ПКОМ А, у

ЕАС5. Фігура 1С показує, що 5Е9, але не 801, було здатне зв'язувати клітини ВАЕЗ, надекспресуючі щурячий КОМ А, у ЕАС5. ЕАС5 проводили, як описано в розділі (ії).

Для оцінки зв'язування тар 5Е9 у конкурентних аналізах зв'язування ПЯКОМ А-неогенін, використовували твердофазні аналізи ЕГІЗА. Готували планшети ЕГІЗА і використовували їх, як описано в розділі (ії) даної заявки. ПНКОМ А додавали в концентрації 0,5 мкг/мл з антитілами 5Е9 протягом 1 години при 37 "С. тАбБ 5Е9 використовували в наступних концентраціях: 1,25 мкг/мл; 0,63 мкг/мл; 0,32 мкг/мл; 0,16 мкг/мл; 0,08 мкг/мл; 0,04 мкг/мл; 0,02 мкг/мл; 0,01 мкг/мл.

Зв'язування КОМ А візуалізували з використанням міченого біотином анти-їс-антитіла і комплексу стрептавідин-пероксидаза. Планшети аналізували (визначення ОО) при довжині хвилі 450 нм із використанням фотометра Апіпйо5. Як показано на фігурі 2, три найвищі концентрації антитіл інгібували залежним від дози чином зв'язування повнорозмірного КОМ А людини з неогеніном.

Твердофазні аналізи ЕГІЗБА використовували також для оцінки тАр 5Е9 у конкурентних аналізах зв'язування ПКОМ А - ВМР-4. Готували планшети ЕГІБЗА і використовували їх, як описано в розділі (ім) даної заявки. ПКОМ А додавали в концентрації 0,5 мкг/мл з антитілами 5Е9 протягом 1 години при 37 "С. тАБ 5Е9 використовували в наступних концентраціях: 1,25 мкг/мл; 0,63 мкг/мл; 0,32 мкг/мл; 0,16 мкг/мл; 0,08 мкг/мл; 0,04 мкг/мл; 0,02 мкг/мл; 0,01 мкг/мл.

Зв'язування ПКОМ А візуалізували з використанням міченого біотином анти-їс-антитіла і комплексу стрептавідин-пероксидаза. Планшети аналізували (визначення ОО) при довжині хвилі 450 нм із використанням фотометра Апіпо5. Як показано на фігурі 3, чотири найвищі концентрації антитіл інгібували залежним від дози чином зв'язування повнорозмірного КОМ А людини з ВМР-4.

Твердофазні аналізи ЕГІЗА використовували також для оцінки інгібування зв'язування таб 5Е9 фрагмента 0 (47-168) НКОМ А з ВМР-4. Планшети ЕГІЗА покривали протягом 1 години при 37 "С концентрацією 2,5 мкг/мл рекомбінантного білка ВМР-4 людини. Легкий ланцюг ПЕОМ А (фрагмент 0, 47-168) додавали в концентрації 0,5 мкг/мл з антитілами 5Е9 протягом 1 години при 37 "С. тАБб 5Е9 використовували в наступних концентраціях: 1,25 мкг/мл; 0,63 мкг/мл; 0,32 мкг/мл; 0,16 мкг/мл; 0,08 мкг/мл; 0,04 мкг/мл; 0,02 мкг/мл; 0,01 мкг/мл. Зв'язування НКОМ А візуалізували з використанням міченого біотином анти-їс-антитіла і комплексу стрептавідин- пероксидаза. Планшети аналізували (визначення ОО) при довжині хвилі 450 нм із використанням фотометра Апіпо5. Фігура 4 зображує концентрації антитіла 1,25 мкл/мл, 0,63 мкл/мл і 0,32 мкг/мл, інгібуючі залежним від дози чином зв'язування легкого ланцюга КОМ А людини з ВМР-4.

Твердофазні аналізи ЕГІЗБА використовували також для оцінки тАр 59 у конкурентних аналізах зв'язування ПКОМ А - ВМР-2. Готували планшети ЕГІБЗА і використовували їх, як описано в розділі (м) даної заявки. Повнорозмірний НИКОМ А додавали в концентрації 0,5 мкг/мл

Зо з антитілами 59 протягом 1 години при 37 "С. тАБбБ 59 використовували в наступних концентраціях: 5 мкг/мл; 2,5 мкг/мл; 1,25 мкг/мл; 0,63 мкг/мл; 0,32 мкг/мл; 0,16 мкг/мл.

Зв'язування ПКОМ А візуалізували з використанням міченого біотином анти-їс-антитіла і комплексу стрептавідин-пероксидаза. Планшети аналізували (визначення ОО) при довжині хвилі 450 нм із використанням фотометра Апійпо5. Фігура 5 зображує концентрації антитіла 5 мкг/мл, 2,5 мкг/мл, 1,25 мкг/мл, 0,63 мкг/мл, інгібуючі зв'язування повнорозмірного КОМ А людини з ВМР-2.

Твердофазні аналізи ЕГІЗА використовували також для оцінки тАр 5Е9 і 801 в аналізах зв'язування ЯНКОМ А - неогенін, ПНКОМ А - ВМР-2 і КОМ А - ВМР-4 (фігура 9). Як описано, планшети ЕГІЗБА покривали протягом 1 години при 37 "С концентрацією 2,5 мкг/мл позаклітинного домену Нів-міченого білка Неогеніну людини або 2,5 мкг/мл ВМР-2 або ВМР-4.

Додавали повнорозмірний їс-кон'югований ПКОМ А у концентрації 0,5 мкг/мл з антитілами протягом 1 години при 37 "С. тАбБ 5Е9 і 801 використовували при наступних концентраціях: 5 мкг/мл; 2,5 мкг/мл; 1,25 мкг/мл; 0,63 мкг/мл; 0,32 мкг/мл; 0,16 мкг/мл; 0,08 мкг/мл. Зв'язування

КОМ А візуалізували з використанням міченого біотином анти-їс-антитіла і комплексу стрептавідин-пероксидаза. Планшети аналізували (визначення ОО) при довжині хвилі 450 нм із використанням фотометра Апіпйо5. Як показано на фігурі 9, щуряче моноклональне антитіло 801 інгібує або зменшує зв'язування КОМ А людини з ВМР-2 і ВМР-4, але не здатне інгібувати його зв'язування з Неогеніном.

Приклад 3. Активність тАб 5РЕ9 в аналізах росту нейритів з агрегатами диференційованих нейронів Мега людини.

Клітини Мега одержували і культивували, як описано в розділі (м) Способів даної заявки. тАБ 5Е9 нейтралізував інгібуючу ріст нейритів активність сильного їс-кон'югованого легкого ланцюга (амінокислоти 47-168) білка КОМ А людини в аналізах росту нейритів з агрегатами диференційованих нейронів Мега людини. Як показано на фігурі 6, за відсутності інгібуючого

КОМ А білка або фрагмента й у присутності стимулюючого ріст нейритів субстрату ламініну, нейронні агрегати Мега виявляють екстенсивну і щільну мережу зростаючих нейритів (А). На фігурі 6 також показано, що присутність легкого ланцюга ПКОМ А разюче зменшує кількість, щільність і довжину нейритів Мега, підтверджуючи сильну інгібувальну активність цього фрагмента ПКОМ А. Не багато які нейрити, що залишають агрегат, є короткими і міцно бо зв'язаними (В). Частини С-Е фігури 6 показують, що збільшувані концентрації тАб 5Е9, що додаються до культур, нейтралізували або дерепресували залежним від дози чином інгібуючу ріст нейритів активність фрагмента легкого ланцюга ПКОМ А. Зі збільшенням концентрацій

ТАБ, ріст нейронних агрегатів Мега повністю руйнується, незважаючи на присутність інгібітору

КОМ А (С: 0,1 мкг/мл тАбБ 5Е9; 0: 1 мкг/мл тАбБ 5Е9; Е: 10 мкг/мл тАб 5Е9).

Кількісний аналіз нейтралізуючої активності тАб 59 в аналізах росту нейритів з агрегатами

Мега людини виконували для тестування сильного їс-кон'югованого інгібувального фрагмента легкого ланцюга (амінокислоти 47-168) білка КОМ А людини. Зростання цих культур автоматично аналізували по наявності агрегатів, забарвлених бісбензимідом, і потім фотографували. Це забарвлення мітило тільки агрегати, але не зростаючі нейрити. Однак вони забарвлювалися антитілом до ВЗ-тубулину і міченим флуорофором вторинним антитілом.

Зростання нейритів автоматично визначали розрахунком індексу росту нейритів, індексу, що визначається відніманням площі клітинних тіл (протопластів) з забарвленої ВЗ-тубулином площі цього агрегату і його виступів. Потім цей фактор ділять на площу клітинних тіл, як описано в

Мпоог еї аї. У. Мештоспет. 103:181-189, 2007. Фігура 7 показує, що тАБб 5Е9 залежним від дози чином (0,1-10,0 мкг) нейтралізував інгібуючу ріст нейритів активність їс-кон'югованого, сильного інгібувального фрагмента ЯКОМ А (фрагмента 0, 47-168; 10 мкг) в аналізах росту нейритів з агрегатами Міега людини.

Приклад 4. Активність тАб 5Е9 у смугах НИКОМ АЖолаген І Клітини 5Н-5У5У культивували і використовували, як описано в розділі (мії) даної заявки. Покривні стекла зі смугами КОМ А і

Колагену І на склі готували, як описано в розділі (мії) даної заявки. Покриття з почерговими смугами ПКОМ А/Колаген І і Колагену | одержували для цих експериментів відповідно до протоколу, описаного в літературі (КпоеїЇ еї аЇ. Маїшгте Ргоїосоїв 2: 1216-1224, 2007). За відсутності тАр 5Е9 (А), нейронні клітини ЗН-5У5У виявляють явну перевагу відносно смуги

Колагену І з більше 90 95 цих клітин, що віддають перевагу смугам Колагену І, а не смугам

ЯКОМ А. Зі збільшуваними концентраціями тАбБ 59 нейронні клітини ЗН-5У5У віддають перевагу смугам ПКОМ А, а не смугам Колагену І (В-Е). При найвищій використовуваній концентрації тАб (Е), нейрони 5Н-5У5У виявляють сильну перевагу відносно смуг ПНКОМ А у порівнянні зі смугами Колагену І (див. фігуру 8). Це може інтерпретуватися як унікальна характеристика тАбБ 5Е9, тому що вона перетворила інгібувальну природу ЕОМ А у привабливу

Зо активність. У присутності збільшуваних концентрацій 5Е9, нейронні клітини віддають перевагу міграції і росту на КОМ А-субстраті, а не на пермісивному субстраті, такому як Колаген І. Така унікальна ознака ніколи не описувалася раніше для моноклонального антитіла.

Приклад 5: Конструювання СОК-щеплених антитіл.

З застосуванням стандартних способів, добре відомих у даній галузі, СОБ-послідовності ланцюгів УН і МІ. моноклонального антитіла 5Е9 (див. таблицю 5 вище) трансплантували в різні акцепторні послідовності важкого і легкого ланцюга людини. На основі зіставлень послідовностей МН і МІ з послідовностями МН і М моноклонального антитіла 5Е9 даного винаходу відібрані наступні відомі послідовності людини: а) МНЗ-48, МНЗ-33 і МНЗ-23, а також сполучні послідовності ПОНЗ, пУН4А ї пОНб для конструювання акцепторних послідовностей важкого ланцюга (відповідно до наведеної вище таблиці 3); р) А17 їі А18, а також пуУК2 для конструювання акцепторних послідовностей легкого ланцюга (відповідно до наведеної вище таблиці 4).

Трансплантацією відповідних СОМ МН і МІ. 5Е9 у зазначені акцепторні послідовності були одержані наступні СОК-щеплені, гуманізовані, модифіковані послідовності МН і МІ. (див. також таблицю б вище): МН 5Е9.1-С41, МН 592-201, МН 5Е9.3-41Ї, МН 5Е9.4-с51Ї, МН 5Е9.5-0Ї,. УНН

БЕ9.6-БІ, МН 5Е9.7-61 ії МН 5Е9.8-СІ; МІ 5Е9.1-41, МІ 5Е9.2-01 і МІ 5Е9.3-С1.

Приклад 6: Конструювання каркасних зворотних мутацій у СОВ-щеплених антитілах

Для генерування каркасних зворотних мутацій гуманізованого антитіла, мутації вводять у послідовності СОК-щеплених антитіл, одержаних відповідно до прикладу 5, за допомогою синтезу де помо цього варіабельного домену і/або з використанням мутагенних праймерів і ПЛР, і способами, добре відомими в даній галузі. Різні комбінації зворотних мутацій і інших мутацій конструюють для кожного з СОК-трансплантатів наступним чином.

Для важких ланцюгів МН 5Е9.1-с21, МН 5Е9.2-01ї. ії МН 5ГЕ9.3-СїЇ. один або декілька наступних суміжних із зоною Мегпіег і МНЛ/І. залишків зворотно мутують наступним чином: М37--!, М48--1, 549--6 і/або КУ8--К.

Для важких ланцюгів МН 5Е9.4-с31, МН 5Е9.5-0ї. ії МН 5Е9.6-СїЇ. один або декілька наступних суміжних із зоною Мегпіег і МНЛ/І. залишків зворотно мутують наступним чином: М37--і!, М48--1,

А49--0, К98-К.

Для важких ланцюгів МН 5Е9.7-с1, МН 5Е9.8-Сї. ії МН 5Е9.9-Сї|. один або декілька наступних суміжних із зоною Мегпіег і МНЛ/І. залишків зворотно мутують наступним чином: М37--іІ, М48--1, 549--56.

Додаткові мутації включають наступні: для важких ланцюгів МН 5Е9.1-СЇ, МН 5Е9.2-0І ії МН 5Е9.3-6І: 088-А, для важких ланцюгів МН 5Е9.4-СЇ, МН 5Е9.5-0І. ї МН 5Е9.6-61: 91-Е, і для важких ланцюгів МН 5Е9.7-СІ, МН 5Е9.8-О1. ії МН 5Е9.9-С1: 1 5-- М.

Для легкого ланцюга МІ 5Е9.1-СЇ. один або декілька наступних суміжних із зоною Мепптієг" і

МНЛ/І. залишків зворотно мутують наступним чином: 12--М, М4--ї, У41--.

Для легкого ланцюга МІ. 5Е9.2-0Ї один або декілька наступних суміжних із зоною Мегпіег і

МНЛ/Л/. залишків зворотно мутують наступним чином: М4--ї, К51--ї.

Для легкого ланцюга МІ 5Е9.3-СЇ. один або декілька наступних суміжних із зоною Меппієг" і

МНЛ/. залишків зворотно мутують наступним чином: М4--ї,, У41-.

Приклад 7: Конструювання й експресія рекомбінантних гуманізованих анти-КОМ А-антитіл

Експресуючі вектори рНубБЕ, що несуть важкі і легені ланцюги, які містять каркасні зворотні мутації, котрансфікували в клітини 293-6ЄЕ для транзиторного одержання повнорозмірних гуманізованих антитіл, як описано в розділі (їх) вище. Мутації вводили в послідовності СОК- щеплених антитіл, одержаних відповідно до прикладу 5, за допомогою синтезу де помо цього варіабельного домену і/або з використанням мутагенних праймерів і ПЛР і способами, добре відомими в даній галузі. Амінокислотні послідовності областей МН і Мі. гуманізованих антитіл описані в таблиці 8.

Конкретно, для важких ланцюгів:

МН 59.1, МН 59.5 ії МН 5Е9.9 містять МН 5Е9.4-ОЇ. з мутацією О1--Е.

МН 59.2, МН 59.6, МН 5Е9.10, МН 59.19, МН 59.20, МН 5БЕ9.21 ї МН 5Е9.22 містять УН

БЕ9.4-5| з мутацією 01-Е і наступними зворотними мутаціями суміжних із зоною Мегпіег і

МНЛ/І. залишків: М37--І, М48--|Ї, А49--0, К98--К.

МН 5Е9.3, МН 5Е9.7 ії МН 5Е9.11 містять МН 5Е9.7-0І. з мутацією І 5--У. МН 5Е9.4, МН 5Е9.8,

МН 5Е9.12, МН 59.23, МН 59.24, МН 59.25 і МН 59.26 містять МН 5Е9.7-0І. з мутацією І 5--М і наступними зворотними мутаціями суміжних із зоною Мегпіег і МН//. залишків: М37--!І, М48--1, 549--0.

Для легких ланцюгів:

МІ. 59.1, МІ 59.2, МІ. 5Е9.3 і МІ. 5Е9.4 є ідентичними МІ. 5Е9.1-С1.

МІ 59.5, МІ 59.6, МІ 5Е9.7 і МІ 5Е9.8 є ідентичними МІ. 5Е9.2-С1.

МІ. 59.9, МІ 529.10, МІ. 529.11 ї МІ. 5Е9.12 є ідентичними МІ. 5Е9.3-(1.

МІ. 59.19 ії МІ. 569.23 містять МІ. 5Е9.2-0Ї з наступними зворотними мутаціями суміжних із зоною Мепіег і МНЛ/. залишків: М4--Ї., К51--їЇ.

МІ. 59.20 і МІ 59.24 містять МІ 5Е9.2-5І з наступною зворотною мутацією суміжного з зоною Мепіег ії МН//І. залишку: М4--..

МІ. 5Е9.21 ї МІ. 5Е9.25 містять МІ. 5Е9.3-5Ї з наступними зворотними мутаціями суміжних із зоною Мепіег і МНЛ/. залишків: М4--ї., У41--.

МІ. 59.22 і МІ 59.26 містять МІ 5Е9.3-5Ї з наступною зворотною мутацією суміжного з зоною Мепіег ії МН//І. залишку: М4--..

Таблиця 8

Експресія гуманізованих антитіл 11111111 123456789012345678901234567890.:К Е.:СКУ).:З

ЕУОГЇ УЕВОССОСУМУОРСОКВІКІ ВСАА В

СЕТЕЄМУСЄМІ МУ УКОАРОКОГ ЕММА

47 МН п5Е9.1 МІУХО55ЕКНУАОЗУКСКЕТІВКОМ

ЗЕМ ГОММ5ІКАЕОТАУТУСАКО

ТТРОУХУОСОСТМУТУ55

Таблиця 8

Експресія гуманізованих антитіл

ІЛУМТОТРІБІЗУТРООГАВІЗСЕВ5О

ЕС УТЕ КАК ОКРООБРОСІ

44 Мі в5гал1 о | ЕМ ККВСУРОКЕВОВОВОТОРК

ІБЕУВАВЕВУСУТУСЕОАТНОРІТЕС

ОСТ СЕЖКЕ. етос М УРОК Кі ВСААВ

СЕТЕМ КОМА МУК ОАРОКОСЕМОМ

48 УнНиБг92 | У ОЗЕКНУАОЗУКОСКР ТІК ОМ

МІХ ГОММВЕКАВОТАУТУУСАКО

ТРИ КСООСТМУТУ БВ

РІУМТОТРІ.5І 5УТРООРАВІЗСКВО

ЗЕУЗОІСУТЕСЕМУГОКРООБРОМІ

44 Мі п5г92 | УЕУВМКЕВОУРОКЕВОБОЗСТОЕТІК

ІЗЖКУЕАЕПУОУУУСЕОАТНОРІТЕО

ОСТКІБІКК

ЕМО УЕБОССІМОРОСВБІКІ БСА АБО

ЕТЕВЄМУМУУУКОАРОКОТЕМУЗМ

49 МН и5г93 | ТК ОЗ5ЕКНУ АОБУКСКЕТІЗКОМК

МІАЛОММ5ІКАЕПТАУТУСАКОТ

ТРОУМУСОСТМУТУ 55

РІУМТОТРІ БІ 5БУТРООРАБІБСК55О

ЗКУ УТЕГЕМУГОКРООБРОГІ

44 МІ п5Е943 | УЕМБМКЕБОУРОКЕЗОВОВСТОКІК

ІБКУгЕАЕВУСУУУСЕОАТНОРІТЕС

ОСТКІВІКЕ

БО

Таблиця 8

Експресія гуманізованих антитіл

ЕМОІЇУЕБОССІУОРОСВІКІ БСААВО ше: 5О УНпБг94 | УУОЮ55ЕКНУ А ВЗУКОСКЕТІЗКОМОК

МІУ ОММБІКАЕОТАУУУСАКСТ

ТРОУУСОСТМУТУВ5

ПІУМтТОТРІ5І5УТРООРАБІЗСКВО 5ЕУЗОСУТЕКЕМУГТОКРООЗРОГІ 44 МІ п5г944 | УЕМ5МКЕВОСУРОКЕВОВО5СТОКІК

ІБКУЕАЕОУСУТ УСЕОАТНОРІТЕС оон ЕЕ ку УББОоОСсСю УМОРОКВ КТ ВСАА

СКЕТЕБМ СМ У УКОАРОКСОТЕУУА

47 МНиб5г95 | МУК рОЕКНКАВВУКОКЕТУКОМ зм ОММеН КАВА УСАКО

ТІРОУУОСОСТМУТУВЬ

ПУУМТО5РЕ ЗСУ ТП ОСОРАТОСКВЕ

ОЧЕУВСУТЕ ЕМО ОКРООБРЕК мі п5ге5 | ЦУЕУЗМЕКВОУРОКЕВСЬСВОС ТОВ,

КІЗКУВА ВУС У ХУ УСЕОАТНОРЕТЕ

ООСТКЕКЕ

ЕУОГМЕБОСО У МОРС КІ ЗСАА В вил ТМОМАМ МК АРОКОСЕМОМ 48 УНпзге6 |У АВВУКОИКЕПеКОМаК

МІУСОММЧКАБОТАМУУТСАКОСТ

ТРОУЖОСОСТМУТУ55 бо

Таблиця 8

Експресія гуманізованих антитіл

РУУМТО5РІБІРМТІСОРАБВІЗСКЬО

ОБІГУ СУТЕЕМВООКРООБРЕК мі йБг96 / ШшжЕУВМЕЕЗСУРІОКЕЗО5О5ОСТОЕТІ.

КІЗХКХЕАЕОУСУУУСЕОАТНОРІТЕ

СООТКІЕІКК

ЕУОГУЕЗОСОГДУОРОСВІ ВІ ЗСААБО

КГЕБМУОМА У УКОАРОКОКЕУУВМ

49 МНи5г97 УУВеЧЕКНУАрьУКСКПЬКОМьК

МИЛОМ МЕСВАВОТАУХУСАКС

ТРОКАСОСІТМУТУЬ

РУУМТО5БРІБІРУТІ СОРАБІБСК55

О5Г.ЕУ5ОСУТЕСЕМЕООКРООБРКЕ. 45 МІ п5Е9.7 | ІПУЕУ5МВЕБСУРОКЕЗОИ5ОИВСТОЕТІ,

КІЗКУЕАЕРУСУУ УСЕОАТНОРІ.ТЕ

СОСТКІЕІКК

ЕУОГ МЕС МОРОК СА АБО

ЕТЕЕМУ СМАК ОАРОКОСЕМСМИІ

5О УнНиБг98 | УУОБЕКНУАПЕУКОКЕТІЗКОМВК.

МІИЛЕеОММВІКАКВТАУХУСАКЄТ

ТРОУМСОСТМУТУ

ОРУУМтТО5РІБІРУТІСОРАБІБСЕК5Є

ОБІУБОСУТЕСЕМУВООКРООЗРЕК

45 Мі й5Е9.8 | ШУЕУВМКЕБОУРОКЕЗО5О5ОТОЕТІ.

КІЗБКУЕАЕВУОУУУСКЕОАТНОРІТЕ

СООТКІЕІКК

Таблиця 8

Експресія гуманізованих антитіл

ЕМО УВС МОРОК КІ БСААВ

СОСКТЕЗМУСМАУУКОАРСОКИОИГЕМУА

47 УНи5г9.9 | НУК КАПУУКОКЕТІКОМ

ЗМК ОМММКАБОТАУУТСАКС

ТІРОУУСОСТМУТУЄ

РУУМТОБ5РІ5ІРУТІСОРАБІВСК55

О5ІГЕУ5ОСУТЕСЕМУГОКРООБРОЇ, 46 МІ. пБЕ9.9 ІУЕУЗМВЕЗОСУРОВКЕ5О5О5ОТОЕТІ,

КІЗЕУЕАЕВОУ СУХУ УСЕОАТНОРІТЕ

ШЕ

ЕМСТЛЕБОСЮУ МОРОК ВГ КІ ВСАА вл ЕМуОММ МК ОАРОКОТ ЕМЛОМ 48 Ммнизгело Коен АВУКОКЕТВКТНяК

МПЛАГОММУ КАБОТАУХУУСАКОТ

ТРИ МОЮСТМУТУВЬ Й

ПУУМТОБРІ ЗІ РУТІ СОРАБІБСКВВ

О5БСЕУБрОХ ТКУ У ГОКРООВБРОЇ. 46 міопбгзло | Ге УБМК КО УРОК ВОБОТОЕТ

КІЗЖКЕУВАЕВУСУХ УСЕОАТНОРСТЕ

ОСОСТКСЕКА. вусі Уа УОРОпВ ВГ ЯСААВО

ЕЕБМУСММ У УКОАРОКОСЕМУЗМ

43 УНИ5ЕЗлЛ1 ТУУВВЗЕКНКАВУУКСЕКЕТІЗКОМОК

МЛСОММОСКАВОТАУтУСАКОТ

ТРЕК КАСЦОСТМУТУ В

Таблиця 8

Експресія гуманізованих антитіл

ПУУМТОЗРІЗІРУТІСОРАВІЗСКЯЯ

ОБІЕУБОСУТЕЕМУЇОКРООЗРОЇ. 46 Мі п5гел1 | ТЖЕУВМЕВЕОУРОКЕВОСВОВОТОЕТ,

КБЕУЕАВЕВУСУ У УСЕПАТНОРБТЕ

СОСТКІ ВІКА

ЕМУОГУЕЗООСІ МОРОЗІ ВІЗСААВО

ЕТЕЕМ ОМА МІКОАРОКСТЕМЮМИ

50 МНни5гол2 | УУВБУЕКН КАПУ КОКОН К

МТІУБОММЗІВАБрТАХУУСАКСТ

ТРОЖ УСОСТМУТУВВ

ПУУМТОБРІЗРУТ СОРАНЬСКУХ

О5ІЕУЗОСУТЕВЕМЖУ!Т ОКРООЗРОЇ, 46 МіопБгал2 ПЛУВУЗМККВОСМУРОВЕВОВОВО ТОК,

КІЗЕУБАВВУСУУ УСЕСОАТНОВТЕ

СОСТКІ.ВІКА.

ЕКОГУБВ5ОСОУМУОРОКВЗІ ЛІ ЗСААВ

СОЕТЕЕМУО МУ МЕ ОАРОКИЇ ЕМЮМ

48 Мни5голо УОЗ ЕКНИ КАВУ КСАРТВКОНЬК

МИЛИ ОММО КАЕОТАУУУСАКОСТ

ТРІИГУСОСТМУТУ 5

РУУГТО5РІ5ГРУТІСОРАБІЗСН55О

ЕУБОСУТЕЕМКООКРООБРКІ ТІ

Б МІ пБ5г9419. | УЕУ5МКЕЗОУРОКЕВОСЬОВОТОВТІК

ІБЖКУЕАЕОУ СУ У УСЕОАТНОРІТЕС

ШЕ

Таблиця 8

Експресія гуманізованих антитіл

ЕУОСГ УВО УОРОКВ КГ ЯСААВ

СЕТ ОСМА МУЕОАРОКИ ЕМО М

48 УНи5г920 УХОЗ5ЕКНУАПВУКСКЕТІВКОМЕ.

МПЛГОММВ КАВА УСАКОТ

ТРОЖЖУСОСТМУТУЄВ

БУУГЛТОУРІЗІРУТІОСОРАВІЗСВ550

ШЕ

Б2 МІ п5г9.20. | МЕУ5МК КОСУ РІОКЕБОВО5СТОЕТІК

ІЗКЕУМЕАЕВУСУ У УСЕОАТНОРІТЕС

ОСТКІВБІКВ.

ЕМО УВБИапЙО МУ ОРОВВГК ВСАА

СЕТЕОМ КОМА МІКОАВОКОИГЕМИМ

48 МН Б5г921 | ТК ХВ5ЕКНЕАВВУКСКРТІКОМОК

МПЛУОММОКАВОТАУТУСАКОСТ

ТРОЄ ОЮЄСТМУТУ ВВ

БУУГЛОЗРІБЕРУТ СОРАНОСКЯВО

ЕХО ТЕС ОКРООВГРОМА

53 МІ 59.21 | МЕУХМКЕКВОУРОКЕВОВБОВОИТОВЕТК

ІЗВУБАВЕПУСУУУСЕОАТНОРІЛТЕО

ТКС КЕ

ЕУОСУЕВОСОУУОРаКН КГ ОСА

СЕТЕБМКСМАММІКОАРОКОСТ ЕМО М

48 УНниБ5г922 УУВЗЕКНУАОВУВСКЕТІЗКОМВК

МІ ОММ ВАТА УУСАКСТ

ТРОУУСОСТМУТУВЬ ва

Таблиця 8

Експресія гуманізованих антитіл

ВУУГТОБРІСЯ РУТ СОРАНІБСКОВО

5БІЕУБООСУТКЕУОКРООВЗРОГТІ

БА Мі пБг922 | УЕМУМКЕБСУРОКЕВОВОБОТОВТІК

ІБКУВАЕОВУСУТУСЕОАТНЮРЕТЕСО

ЗТКІВІКА.

ЕМО МЕБОСОСІ МОРООСВІКІЗСА АБО

ЕТЕЕМК СМІХ УМІКОАРОКОТЕ МІОМІ

МІМОММ5ІКАВОТАУТУСАКОТ

ТРОУ УСОСТМУТУ 55

ПУМІ.ТО5РІ Я РУТІСОРАВІЗСВЕ55О

ЗБЕ ЛУК ООКРОСВРКТЦІЇ

51 Мі п5г923 | УВУ МКЕСУРОБЕВОВОТОКГИЖК

ІБКУВАЕПУСУУУСЕДОАТНОРІТЕО

ОСТКІБІКВ.

ЕМО Уа УОРОСН КГ ЗСАЛВО

ЕТЕБМУ СМАК МІК ОАРОКОГЕУОМІ

5О МН5г924 | У ВБЕКНУ АПУ КСКЕТІК ОМ

МЛ ОММБВАВОТАУХУСАКСТ

ТРОУМЖСОСТМУТУ55

ПУМСТОЗРЕЗ РУТ СОРАБІВСЬКЯКО

СЕУ УТЕЦЕМВООКРООБРВЕКТІ

52 Мі п5гяа24 ГУБУ КОМУ РОКЕБОВОБа ТОК

ІЗКУКАЕВУСУ ХУ УСТОАТНОРЕСТЕО

ОСТКТ ЕК

Таблиця 8

Експресія гуманізованих антитіл

ЕМОГУЕЗСОСТ УОРООЗІ КІЗСААВО

ЕТЕБМУ ОМА МК ОА РОКОМ

БО МНиБг925 | КО ЕКНХАрУКСОВЕТВКОМеК

М УГТОММУ КАЕПТАУТУСАКОТ

ТРОУХУСОСТМУТУ 85

ВУГОР СЕУ ТТ ООРАН СВО

ВЕУ ЕЕ ЖК ОКРООВБРОСЬ

53 Мі п5г925 | УЄУЗМКЕЕБОУРІОЖЕВСОСВЗСОТОЕТК

ІБАУВЕАЕОУСУ У УСЕОАТНоРГТЕС

ОСТКІБІКК

ЕМО МУОРОССЯ КГ ЗСААВО

ГТЕЗМУСЄМАИ МІК ЛАРОКОГ ЕУЛОМІ

50 ун 5г926 | УХОЗЗЕКНХ АПУ КСКЕТВКОМаК

МИЛОМ КАБПТАУТУСАКС

ТРОМУОООСТМУТУВ

ВУУСТОБРІ ЗВУ ПООРАВІУСКВО

ЗЕ ТКУ ОКРООЗРОСІІ

БА МІ пБЕг9.26 | У ЕУМКЕЗСУРОКЕБОСОСЗОТОЕТІ ЖК

ВЕКУВАКОУСК У УСЕОАТНОРСТЕО

ОСТКІ ВІКА

Приклад 8: Характеристика гуманізованих антитіл 59 з використанням конкурентного

ЕПЗА.

Планшети ЕГІЗА (Созіаг 3369) покривали протягом ночі при 4 "С 50 мкл на ямку 0,25 мкг/мл

КОМА у 0,2 М натрійкарбонатному-бікарбонатному буфері, рН 9,4, промивали промивальним буфером (ЗФР, що містить 0,195 Твін-20) і блокували протягом 1 години при кімнатній температурі 200 мкл на ямку 295 знежиреним сухим молоком у ЗФР. Після промивання промивальним буфером додавали в двох повторностях суміш біотинільованого химерного антитіла 59 (кінцева концентрація 0,1 мкг/мл) і неміченого конкурентного тест-антитіла (починаючи при кінцевій концентрації 50 мг/мл і серійно розведеного в 5 разів) у 50 мкл на ямку буфера ЕГІЗА. Після інкубування цих планшетів протягом 1 години при кімнатній температурі і промивання промивальним буфером, зв'язані антитіла детектували з використанням 100 мкл на ямку розведення 1:10000 кон'югованого з НЕР стрептавідину (Рйгдегаїа) у буфері ЕГІ5А. Після інкубування протягом 1 години при кімнатній температурі і промивання промивальним буфером розвиток забарвлення виконували додаванням 100 мкл на ямку буфера ТМВ (7утед). Після інкубування протягом 15 хвилин при кімнатній температурі розвиток забарвлення зупиняли додаванням 50 мкл на ямку 1н хлористоводневої кислоти. Оптичну густину зчитували при 490 нм.

Таблиця 9 показує величини ІС5О гуманізованих антитіл 59, одержані з використанням комп'ютерної програми сгарпРаа Ргізт (СтарпРай 5оймаге Іпс., Зап Рієдо, СА).

Таблиця 9

Величини ІСво гуманізованих антитіл 5Е9 у конкурентних аналізах ЕГІЗА 593 | 77777770 | 7777 п5Р9.21 | 060771 115947 | 77777770 | 7777 п5Р9.25 | -( 066 г щ 5989 Їмо ЇЇ пит: ж ТЯ ПО ТОНЯ ПОЛОН КО пит: Ж КН ПО ТОНЯ ПОЛОН КО

Го в5Белма ЇЇ 7777мо ЇЇ

Приклад 9: Визначення афінності химерних і гуманізованих антитіл з використанням технології ВІАСОКЕ.

Аналіз ВІАСОКЕ (Віасоге, Іпс, Різсаїажау, МУ) визначає афінність антитіл кінетичними вимірюваннями констант швидкості асоціації, швидкості дисоціації. Зв'язування антитіл з рекомбінантним очищеним КОМ А людини визначали вимірюваннями, основаними на резонансі поверхневих плазмонів, приладом ВіасогеФ 3000 (Віасогеб АВ, ОМррзаїа, буедеп) з використанням пропускання НВ5З-ЕР (10 мМ НЕРЕЗ |рН 7,4, 150 мМ Масі, З мм ЕДТА і 0,005 Фо поверхнево-активна речовина Р20) при 25 "С. Усі хімікалії одержували з ВіасогеФ АВ (Оррзаїа,

Змедеп). Приблизно 5000 одиниць КИ козячого антитіла проти (ДО людини, (Есу), фрагмента специфічного поліклонального антитіла (Ріегсе Віоїесппоіоду Іпс., КоскКога, І, розведеного в 10 мм ацетаті натрію (рН 4,5), іммобілізували безпосередньо через біосенсорний чип СМ5 з категорією, достатньою для досліджень, з використанням стандартного набору для зв'язування аміну відповідно до інструкцій і процедур виготовлювача при 25 мкг/мл. Частини молекул, що не прореагували, на біосенсорній поверхні блокували етаноламіном. Як поверхню реакції використовували поверхню модифікованого карбоксиметилдекстрану в проточній комірці 2 і 4.

Немодифікований карбоксиметилдекстран без козячого антитіла проти /дс людини використовували в проточній комірці 1 і З як посилальну поверхню. Очищені антитіла розводили в забуференому НЕРЕ5 сольовому розчині для захоплення при проходженні через поверхні реакції, специфічні відносно козячих антитіл проти ЇдДО людини. Антитіла людини, що підлягають захопленню як ліганд (25 мкг/мл), ін'єктували на матрикси реакції при швидкості потоку 5 мкл/хв.

Константи швидкості асоціації і дисоціації, Коп (одиниці М" с") ї Кок (одиниці с"), визначали при безупинній швидкості потоку 25 мкл/мл. Константи швидкості одержували виконанням кінетичних вимірювань при десяти різних концентраціях антигену в діапазоні від 0,30 до 50 нМ.

Для кінетичного аналізу, рівняння швидкості, одержані з моделі зв'язування 1:1 І апдтиїіг підганяли одночасно до фаз асоціації і дисоціації усіх восьми ін'єкцій (з використанням аналізу глобальної підгонки) з використанням програми Віаєма|Ічайоп 4.0.1. Потім рівноважну константу дисоціації (ипії М) реакції між гуманізованими антитілами і рекомбінантним очищеним КОМ А людини розраховували з кінетичних констант швидкості з використанням формули:

Кв - Кон /Коп й

Таблиця 9

Афінність химерних і гуманізованих моноклональних антитіл проти КОМ А

Приклад 10: Гуманізовані антитіла 5Е9 нейтралізують хемовідштовхувальну активність КОМ

А людини в аналізі хемотаксису нейронних клітин 5Н-5У5У.

Аналіз хемотаксису вимірює поведінку клітин у реакції на дифундовані фактори, що можуть виявляти хемоатрагуючу або хемовідштовхувальну активність. КОМ А був описаний як білок, що діє як у мембранозв'язаній (у залежному від контакту відштовхуванні), так і в розчинній дифундованій формі (хемовідштовхувальній), і, отже, оцінювався в аналізі хемотаксису ПКОМ

А. Для цієї мети використовували КОМ А-чутливі клітини 5Н-5У5У нейробластоми людини, що несуть КОМ-рецептор Неогенін (Зспапйаг еї аїІ. 9У. Меигоспетівігу: 107:418-431, 2008). Клітини

ЗН-5У5У вирощували в середовищі збалансованого сольового розчину Ерла/Р12 (ЕВЗЗ/Е12), доповненому 1095 фетальною телячою сироваткою і 1 95 замінними амінокислотами (МЕМ-

МЕАА). Для індукції росту нейритів клітини культивували в середовищі, доповненому 10 мкМ ретиноєвою кислотою (КА). Через 5-6 годин, клітини трипсинізували і рахували для висівання в 24-ямкові камери Бойдена (ВО РаїЇсоп 351185, НТ5 Мийуеї! Зувзіет). 500 мкл суспензії клітин (відповідних 1х105 клітин) додавали у внутрішній кружок кожної ямки. Цей внутрішній кружок відділений від більшого зовнішнього кружка кожної ямки РЕТ-мембраною з діаметром пор 8 мкм. 600 мкл середовища -/- ВОМ А -/-антитіла піпетували в зовнішній кружок і ці клітини культивували в мультиямкових камерах Бойдена протягом ночі при 37 "С. Після інкубування середовище аспірували і заміняли фіксатором (2595 параформальдегідом). Фіксацію продовжували протягом 2 годин при кімнатній температурі і після декількох стадій промивання

ЗФР виконували збільшення проникності з використанням ЗФР, що містить 0,1 95 Тритон Х-100 (15 хв, к.т.). Забарвлення клітин виконували інкубуванням їх протягом 1 години в темряві в розчині АІеха Ріцог 488 РНаїйоіїаїп 1:100 (Іпмігодеп А12379) і бісбензиміду (НЗ32456) 1:100. Після 2 стадій промивання ЗФР, культури заливали ЗФР, зароблювали парафілмом і зберігали в темряві для аналізу з використанням флуоресцентного мікроскопа (7еї55 Ахіомег|).

За відсутності НИКОМ А клітини мігрують через пори мембран і можуть бути підраховані після фіксації і забарвлення. Рахують тільки ті клітини, що прикріплені до нижньої частини мембрани, оскільки ці клітини мігрували через мембрану РЕТ. Клітини на верхній стороні цієї мембрани

Зо можуть бути обережно вилучені перед процедурою фіксації. Цей аналіз хемотаксису довів, що присутність ПНКОМ А значно зменшує кількість клітин 5ЗН-5У5У, що мігрують через мембрану, більше ніж на 80 95. Щуряче моноклональне антитіло 5Е9, химерне "людина-щур" антитіло 5Е9, але не ізотипічно подібне контрольне щуряче моноклональне антитіло (р21), частково або повністю нейтралізували хемовідштовхувальну активність при 10 мкг/мл, що виявлялося у вигляді великих кількостей клітин, які виявляються на дні цієї мембрани (фігура 10).

Приклад 11: 5Е9 індукує регенерацію роздавлених, ушкоджених аксонів зорового нерва в щурячій моделі ушкодження зорового нерва

Модель роздавлювання зорового нерва (або ушкодження зорового нерва) забезпечує модель тварини для тестування різних речовин, що стимулюють регенерацію волокон зорового нерва і зменшують масивну загибель клітин ретинального ганглія.

Експерименти проводили на дорослих самцях щурів зргадне Оаулеу і самцях щурів Умізіаг, одержаних з Спагіє5 Кімег (0) І арогаїогіе5 (септапу). Тварин утримують в окремих клітинах при циклі світло/темрява 12:12 годин з доступом до корму і води ай Прішт. Роздавлювання зорового нерва виконують тільки в лівому оці за допомогою мінімальної хірургії передньої камери очного яблука. Цей спосіб є мінімально інвазивним способом ушкодження зорового нерва і був розроблений авторами винаходу відповідно до хірургічних способів для передньої частини зорового нерва людини. Перед процедурою операції і під час процедури операції тварин анестезують інгаляційною анестезією з використанням Севофлурану (Аррой Зтр Со. 85 КО,

ОеїКеппеїт, Сегтапу) і фіксують на операційному столі за допомогою щелепного затискача і лейкопластиру для кінцівок. Падінню температури тіла запобігають поміщенням тварин на грілку-подушку. Для роздавлювальної хірургії зорового нерва щура в передній камері очного яблука, ліве око обережно звільняють від зв'язки і сполучної тканини. Як першу стадію, виконують мікрохірургічний розріз (2-3 мм) суміжної тканини в зовнішньому куті цього ока. Потім зоровий нерв оголюють за допомогою пари пінцетів для зсуву убік м'язів ока і слізної залози для їх збереження. У наступній стадії, мозкові оболонки розкривають подовжньо з використанням мікроножиць для експонування зорового нерва.

Це приводить до більшої рухливості ока й робить можливим латеральне обертання ока і доступ до його лівого зорового нерва. Зоровий нерв ушкоджують на відстані приблизно 1-3 мм за оком з використанням пари затискачів, установлюваних для забезпечення фіксованого максимального тиску протягом 20-30 секунд. Додержуються особливої обережності, щоб уникнути ушкодження васкулярного постачання цього ока.

Локальне введення антитіл і буферного розчину.

Після ушкодження роздавлюванням зорового нерва самців щурів Зргадоие Оаулеу обробляли локально антитілом 5Е9 (п-10 тварин), контрольним антитілом 801 (п-10 тварин) або контролем-носієм ЗФР (п-10 тварин). Експериментаторам не були відомі групи різної обробки (сліпий експеримент). Для локального застосування антитіл невеликі шматочки желатинової губки, що розсмоктується (довжина: 2,5 мм, ширина: 2,5 мм, висота: 2,5 мм), просочували 20 мкл розчину антитіла 10 мг/мл або 20 мкл ЗФР і поміщали безпосередньо поруч з ділянкою ушкодження зорового нерва. Після мінімальної інвазивної хірургії і нанесення антитіл тварин поміщали на паперові рушники в чистій клітці, установленій на грілку (нагрівальний прилад) для контролю температури тіла, поки вони не починали рухатися. На це око наносили мазь, що містить антибіотик (Сепіатуйтех, Ог. Мапп РІПагта), щоб уникнути бактеріальної інфекції і висихання склери. Внутрішньоочеревинно вводили карпрофен (Римадил, 5 мг/кг,

Ріїгег сть, Кагізгипе) для терапії післяопераційного болю безпосередньо після операції і потім двічі на день протягом З-денного періоду. Тварин спостерігали і контролювали регулярно кілька годин безпосередньо після операції й у наступні дні, щоб бути упевненими, що всі ці тварини виживали і відновлювалися від анестезії і хірургії. Через 5 тижнів після хірургії і застосування антитіла/носія, тварин анестезували надлишковою дозою Наркорену (40-60 мг/кг) і перфузували ін'єкцією 4 96 розчину параформальдегіду в серце. Зорові нерви виділяли і переносили в 4 95 розчин параформальдегіду і залишали протягом 1 години при кімнатній температурі для

Зо гарантії належної фіксації цієї тканини. Після постфіксації, зорові нерви витримували протягом ночі в 30 95 розчині сахарози (4 7С). Наступного дня зорові нерви заливали в Тіз5це Тек, заморожували і робили подовжні зрізи з товщиною 16 мкм за допомогою Кріостата.

Для імунозабарвлень (з імунною міткою) зрізи зорових нервів фіксували холодним ацетоном (10 хвилин), промивали Зх (5 хвилин) забуференим Трісом розчином (ТВ5, РіиКа 93312) і блокували і їх проникність збільшували з використанням ТВ5, що містить 595 бичачий сироватковий альбумін і 195 Тритон Х-100 (30 хвилин) при кімнатній температурі. БСА і детергент, що залишилися, видаляли 2 окремими стадіями промивання (5 хвилин кожне) з використанням ТВ5. Зрізи інкубували протягом 1 години при кімнатній температурі з поліклональним кролячим антитілом проти анти-сСАР-43-антитіла (Ареат, ар 7562), розведеним 1:100 у 5 95 розчині БСА/ТВ5. Після З стадій промивання ТВ5, 0,1 95 Твіном, зрізи інкубували протягом 1 години при кімнатній температурі з АІеха Рійог 488-кон'югованим козячим вторинним антитілом проти дос кролика (МоїІесшаг Ргобе5 А11034), розведеним 1:1000 у 5 96 ВБА/ТВ5, що містить розведення 1:100 бісбензаміду (НЗ3258, 50 мкг/мл), для візуалізації клітинних ядер.

Перед заливанням, забарвлені зрізи промивали З рази ТВ5, 0,1 95 Твіном (кожна стадія 5 хвилин) і дистильованою водою. Зрізи заливали в Ріпоготоишпі с, покривали покривним склом і зберігали в темряві для мікроскопічної документації.

Одержані з використанням флуоресцентного мікроскопа 7еї55 зображення (фігура 11) забарвлених подовжніх зрізів зберігали за допомогою програмного забезпечення 7еїі55

Ахіомізоп. Окремі знімки кожного нерва встановлювали для аналізу з використанням програми

Ріпоїо5пор Ітаде Апаїузіз (Адобе). Кількісний аналіз виконували двома різними способами з використанням комбінованих зображень цих зорових нервів. ЗАР-43-позитивну площу в кожній ділянці ушкодження вимірювали з використанням програми Ахіомізіоп (фігура 128). Незалежно від цього першого кількісного аналізу окремі регенеруючі волокна (САР-43-позитивні) рахували в 4 різних зонах: 0-200 мкм, 200-400 мкм, 400-600 мкм і 600-1200 мкм за межами ділянки роздавлювання. Аналіз даних і статистичну оцінку даних виконували з використанням програмного забезпечення Ссгарпраай Ргізт (фігура 12А).

Системне введення антитіл і буферного розчину.

Для системної доставки антитіл самців щурів М/ієїаг обробляли системно (внутрішньочеревинно, ір або внутрішньовенно ім) антитілом 5Е9 (п-10 тварин) або контролем- бо носієм ЗФР (п-10 тварин). Тварин ін'єктували два рази й ін'єкції виконували в день 0, незабаром після роздавлювання нерва й у день 21 після роздавлювання. Дози наданого антитіла дорівнювали 2 мг/кг у день 0 і 10 мг/кг у день 21. Тварин убивали через п'ять тижнів після ушкодження роздавлюванням і виділення тканини, приготування зрізів, забарвлення і кількісний аналіз виконували, як описано вище. Як і раніше, експериментаторам не були відомі ці дві різні групи обробки. Комбіновані зображення зорових нервів щурів показані на фігурі 13. У оброблених 5Е9 тварин (А), багато САР-43-позитивних волокон простиралися за межі ділянки роздавлювання на відміну від контрольних тварин, оброблених ЗФР (В). Ділянка роздавлювання розташована на лівій границі і волокна, що регенеруються, забарвлені антитілом до САР-43. Численні волокна спостерігаються на верхньому і нижньому краї зорового нерва в 5РО-оброблених тварин, але не у тварин, що одержували ЗФР. 5Е9, але не контроль-носій ЗФР, значно збільшував кількість ЗАР-43-позитивних волокон, що регенеруються. Значимо більше волокон (р«0,001) було виявлено у тварин, оброблених 5Е9, при відстанях 300 мкм - 1800 мкм, ніж у оброблених носієм тварин. Тварин обробляли 5Е9 у день 0 і день 21 з використанням 2 мг/кг і 10 мг/кг, відповідно. Антитіло або носій вводили внутрішньоочеревинно або внутрішньовенно. Дані наведені з аналізу 9 тварин на групу.

Аналізували З серії кріостатних зрізів на одну тварину (фігура 14 А).

В другому варіанті здійснення, самців щурів Умізїаг обробляли після ушкодження зорового нерва системно (ім) антитілом 5Е9 (п-10 тварин), контрольним антитілом 801 (п-10 тварин) або контролем-носієм ЗФР (п-10 тварин). Щурів ін'єктували один раз на тиждень 2 мг/кг антитіла, що вводиться ім, і ін'єкції починали негайно після роздавлювання зорового нерва. Усі щури одержували 4 ін'єкції і тварин евтаназували через 5 тижнів після роздавлювання нерва.

Експериментаторам не були відомі варіанти (сліпий експеримент), і обробку тканини і кількісний аналіз виконували, як описано раніше. 59, але не контроль-носій ЗФР, значно збільшував кількість ЗАР-43-позитивних волокон, що регенеруються. Значимо більше волокон (р«0,001) було виявлено у тварин, оброблених 5Е9, при відстанях 200 мкм - 1400 мкм, ніж у оброблених носієм або контрольних тварин. Тварин обробляли ім один раз на тиждень протягом 4 тижнів, починаючи з дня 0, антитілом 5ЕЗ9 (2 мг/кг на дозу), контрольним антитілом 801 (2 мг/кг на дозу) або ЗФР (фігура 148).

Приклад 11: 5Е9 індукує ремієлінізацію аксонів роздавлених зорових нервів у щурячій

Зо моделі ушкодження зорового нерва.

Маркером для олігодендроцитів і мієліну є базальний білок мієліну (МВР). Для відповіді на питання, чи мають місце відмінності в ремієлінізації в різних групах обробки, використовували антитіло, спрямоване проти МВР. Даля візуалізації процесу ремієлінізації, зрізи зорового нерва тварин, оброблених системно, фіксували охолодженням (-20 С) ацетоном (10 хвилин), промивали Зх (5 хвилин) забуференим Трісом сольовим розчином (ТВ5, Ріка 93312) і блокували і збільшували проникність ТВ5, що містить 5 95 бичачий сироватковий альбумін і 1 95

Тритон Х-100 (30 хвилин), при кімнатній температурі. БСА і детергент, що залишилися, видаляли 2 окремими стадіями промивання (5 хвилин кожна) з використанням ТВ5. Зрізи інкубували протягом З годин або протягом ночі при 4 "С з поліклональним кролячим антитілом проти анти-МВР-антитіла (Абеат, аб 2404), розведеним 1:100 у 5 95 розчині БСА/ТВ5. Після З стадій промивання ТВ5, 0,195 Твіном, зрізи інкубували протягом 1 години при кімнатній температурі з АІеха Рійог 488-кон'юЮгованим козячим вторинним антитілом проти дс кролика (МоІесшаг Ргобе5 А11034), розведеним 1:1000 у 5 956 ВБА/ТВ5, що містить розведення 1:100 бісбензиміду (НЗ3258, 50 мкг/мл), для візуалізації клітинних ядер. Перед заливанням, забарвлені зрізи промивали З рази ТВ5, 0,1 95 Твіном (кожна стадія 5 хвилин) і дистильованою водою. Зрізи заливали в Ріпоготоипі С, покривали покривним склом і зберігали в темряві для мікроскопічної документації.

Одержані з використанням флуоресцентного мікроскопа 7еї55 зображення забарвлених подовжніх зрізів зберігали за допомогою програмного забезпечення 2еї55 Ахіомівоп. Окремі знімки кожного нерва встановлювали для аналізу з використанням програми Рпоїозпор Ітаде

Апаїузіє (Адоре). Кількісний аналіз виконували двома різними способами з використанням об'єднаних зображень цих зорових нервів. МВР-позитивну площу в кожній ділянці ушкодження вимірювали з використанням програми Ахіомізіоп. Аналіз даних і статистичну оцінку даних виконували з використанням програмного забезпечення сгарпраа Ргіхт.

Тварин обробляли 5РЕ9 у день 0 і день 21 з використанням 2 мг/кг і 10 мг/кг, відповідно.

Антитіло або носій вводили внутрішньоочеревинно або внутрішньовенно. Одержували об'єднані зображення зорових нервів щурів.

Мієлінізацію візуалізували з використанням антитіла, спрямованого проти маркера мієліну, базального білка мієліну МВР. Ділянки роздавлювання розташовані в середині цих 60 комбінованих нервів, і ця зона є вільною у оброблених носієм контрольних тварин (А і В). У оброблених антитілом 5Е9 тварин (С і 2), спостерігали численні МВР-позитивні структури в цій середній зоні (центрі роздавлювання) зорових нервів (фігура 15).

Мієлінізацію візуалізували з використанням антитіла, спрямованого проти маркера мієліну, базального білка мієліну МВР. Площу МВР вимірювали з використанням програми 7еї55

Ахіомізоп. МІ ії М2 є двома незалежними вимірюваннями і М є середньою виміряною МРВ- позитивною площею. 59 збільшує значно (р«0,001 у порівнянні з контролем-носієм). МВР- площу ділянки роздавлювання зорового нерва (у 3,5 разу) (фігура 16).

Перелік послідовностей «110» ЕББОТТ ГМБХ УНД КО. КГ «120» Моноклональні антитіла проти білка КОМ А і їх застосування -1305» М/49229-РСТ -160» 68 «170» Раїепіп мегзіоп 3.3 «2105 1 «2115 1353 «2125» ДНК «213» Ното зарієп5 «220» «2215 Сб05 «222» (1)..41353) «4005» 1 за зач спец сса за заз вач са че ча во се спа Зо се Ко ж

Мах зів Боз Бко ко піз дуб Їж Уві тві ТБ і дк вів чіх ТКо

У 5 Я 3 ак час ва зЗащ зом ще Чо са дмро Мена фо се о Зева Бо Бо со 8

Меж Зір Меб КУ дю пі Лю РУ дк беж Аа деб ву Вне Тов ко посоп обсєе зе КК с осо бус зд Сб сос чоЗ дос об по ос Це ї435

Ти їжмх Віа Ве їж БеносСев ех ве о Бко Діаз Жь ТМ Бах Вжо Сук ча вис ос ау БУЄ ЗВО ке ще Со Сором оф Ве оо сор оте МЕ їж Щі їй Бе Сево Аж йевЖж Фіч Бе ТЕ ЩВшЖ Бій тах йеж КУ Важ о пе о сво зЗес сив зе пов озво пав вес еко чайок сзЗБ Зеа чес ох соцо ав нів лів Ехо ів Бек Вер Авро тн Бжо сій вае СУ Аів Ав ба Би 5 ЕЕ ТЕ о азс бай дес сб бус зоч сещ оз оз що сощо о смх ус «кру Фу М ке век отТУю Жіш бе) Су Тв же Аха ТВ Зі ка Тв Суд Ак Фу ДІМо я зе з5 су щес ас свес божу че що Се пос аа су ас се со по ву че їм вій рек Мін Беж дів Уві Ні ру ів ЗіБ бак бе Ме беж є зай 105 її «мо вао ас БоЄ авзвч зас зас соб асо 5 сечу сов сут Се є о ЗЕ нів дай Суз бек цу Явр Ф1У ко тв ВЕ Чі) ке Вк Та МУЗ ВЕ ї5 Щи Б сте спа сб озчос оче зво Заст св че соЧе об час зо обоє су Во: ЕжУ ївцн Вже БВжо Вів оїму Зо Ве СХ М ДЕ саж Аюро Щек Бі СМ Мія с-ще см МІ бач вач чо КК свое змму сб оз се ви ОС ВВ СаЄ 55 сСев нів ТУЮ із уж бек ВБе Ні Му Нів жк Дів ТНж Вко Аве є зщ сови Бе чек стю БК Фу щас со се скоб зящ ас ЄСЄ вк про вия

Те нів СуУув СІ їде ВВЕ осіу ВщЮ Вко Мала ої АЖка ТВО Бе ль ер 155 17 ІВ гне Крос со вЗес Се» ні ЗБ зму еко во їм сб сб в ас ва БКУ дк Епе «Ма ТБ сСУую БУ вк ман ом За сх шко ява Хе де; дав ї5о ї85 ізо вай же са аб Зої саф со вес за во соб че сг осо зУш св ЖЕ взе о ТУ бе) ба Уві Зі БМіЗз во вза стик Біо вл їмо Ве Бі дек

З аа 5 пф ою ес ую ос в ме сво зоб ово ак Ес вач вах ме жу ях

Віз ія Ох ів тах бек БУ зей ТВ ів їіе5 вне Був вах Вб сди о Б: вче ча сЯБ чо ше пад веж ЧО мх сСеч сою ща чо пас час оси шо то зів Сув Уві йво» Зів був Уві ТУуг Зіз діа Зім Мек йвю СЛ їжа Бра те 238 ах 340 уми ем МІ їуїхУх осжлрі туєуєх Базі: зок Зх же дозі худу ще їзда т бро ІІ ЕВ вииКм щи де ие ще щем мук са ВМ Яче «вну ше Ве оса че чо ва

ВЗіж вазі Бе У Аврошім беж бУв дав опа СруУу вро був Нів 5 У Ата мас ос За вва ас вик зеч Вас с жов по сова ово ор озо м ВЕ дане ек їні буУБ жа ТЕ ЗО цуУуз Ві бек швУ За нів сві бе ув ве меж те свЗ сх ввч баб віє щЗцо вс веж ее со Ер се сао зе ще ке пах «хів вів БУ ЖТУХ іс ді ТВХ ТЕ 16 бай У дк сСавоЗві сі Акз

Х З І З : в 5 ца 5

Мас кох асо т зоб зош сс ер соз Яач аа ще що НВ ЧК щі ЗК

ТУух бЗвМи жВвЕ Це АїЗ Уа вх МеЄ Бо а тв Заі Маї дв ОАЛ УЗ йо си ке щен час со Зазо ве свя ча се вс се Бас обе ро с бує сю зо шіч Ашво їкв дею Бек оці ЗТУ їж о ТжТужЖ Бео бу їм; Вуж се Су БЕ п ЗО ЗВ за «о вас сба358 св віз бас шт со зи Бр Сас зо вах Ва еще мав ем Ваз св М Хо аю КДде щи Алла де Кф тах ва озла сім Ж я 30 зх восос обу дос «со зу се са мех ще Замов в се яса шо «м зе

ТВе і вів Ак дек бе» дів Вів Аз Ше жо діа Ехо Твх Аза шко й З ук зи часа вс Мшсх сов аж о феач всв ще ОКУ чес зму Беж яму ЗВ мм ша ча хв вла вЕО ТУЖ Ли ТВ ів бві віз БбУБ СуУув був шва був їжи

З з з55 с-с нку чач ее сте вас ЕВ саФф ше БФфсе БЕ со ес Бс сс оВеє Ва

Вже Уві ЗКо дю обо ТУЮ ЖУжЖ ЗА Аів Ск УК ВІ ме фа Бе ТИЖ аа ВО зв асхт час пає Фе снма Є зовосбр фем ня Жнно Ба о ро бі оче зах КК

ТЕЖ ЗІТУ дар оУщі вжите ВВе ТВх їжа Віз Ва ук Тк ів бем 33 дво

ЗУ зо ЗБЕ Я чис вад в сс сво сс за ал одас ава су сбаєз сту пас засл ох з

Уві цуФб мес їж Зі бек дам Був дев Був бе НЯ бед Тую Зан Аея 5 05 ЕЕ з45 рн ни ни нн НИ НН НК В и ВН НН ук суду зиск осях час осі спе ЧУ Ва щи чи оре ех сірою сиром ее їхах ни и Ж ж я ет. - Ко щи й я а ж ж -е сія Мет Му Кок Жуан Мр що ру т фр Ух а и не Учити

ЖК УК УК КАМ пк піУ Бий Ка дів лів КЕ х Її жк сіна ліа Вже ах рок Ех Си

СУС и ЕК чужих чик вч ни нн в Не в и В НН, НН и НН дурікфн ких золи шана ке СН ОМ а щиКУ кю п Ошу ОошЕш шЖщрошен крою ах ск БІ Нх ї м

ТРИ ПЕ я ох па нан НАШ хо тутич см Ух че по Жлужи є им хх ака вхо Бей обев ОЗіу Бій пев Уві вУб імп; Перо ві їм ен Вже б

С Безе БЕЗ яку Е гукх г их ЗСУ

ЕЕ Я «щі ПК ушу гук

МЕНЕ Щ ГУ я -21052 «2115 450 «213» Ното зарієп5 «40052 дві гУтає їхучку Же о Мустю Кз Моск Жуля Мк 03 х» буфтуж Мову Й я ря мев шіз БЕЗ Бгто вх ім Аже Беюв о Увл Маї ТвВе бі У бр Вів о лу Кр не ще ах «ве х м еще У

Хе ж ря лк узд ки ШУ дО хво Хе Є муж Ту р То гу су чех,

МО КК Ж мМж кА АЮ меоКу Ак у мк мех я їв Бе ш вЕМа КЖЕО ОК ж В з

ЗНримо ох ов ши НН Я йо хе че ни В ИН сом Ж уче тай стат тиж ої Аїа бе би їн) СУщ о їн Ве Мо із вів Ме чеж Еко є У

Ук а КЕ ше чи ожк тож ІК лог Хе ЇХ ки Куда оо Не а ен НК А КН я

БУ Кіа ав пу сСув двп беж БАЧ кає СЕ пех дів Так беж збу Бех чі щі о жу А у духа щу Зуахум ічсех фаху 33 КУМ бу Щи Або Хом З чаш Вів вБКОо віз шеК АЩор нм Бе оБжхо Са Бцєе Су: дід ВЕ огБев Кс міх ККУ Ух -хк 5 хо Ен во

У а о о о и тху Зріз й оч Мету Урі Ж о атух ЗМІ ках Меет ав щу веж жУжх плов мем сСжВ жах виш мЖже І МЕ УК УК Ос Б Я У мМ ве за ТК и. хх Я зу еча ЯК г маю Мп ж А чо ние ше и ких Ж слі Ж й ни У

Її Ада Уучгонпаш вия Вів щі мів У М Жі-е ії бак бю бе беж іт спо ха КЕ

Ея оно м жо пс рожа диких Ма стухаумо ру бак в КК ж ку усу КН пуску ТКз щи

Ні йш Ств Бех Буш вв піт Біт Тв дек опа ко Вже Бей ка цу 5 їх В

Же Фуко тки Ж ях ск уни Кому сХнулих ми ю у Жоусиу екв Жду Фе Ж кю зей вЕй Же ЛОВ ОКУ А ЖмеК сЕ сМ Ке шеж мух шеЖж Ж М А ср п зм 135 їз з пхю хи Ж в сумує КІ Стою де луле Жіок ЖД мн Уже лм дить Жах чтвеує туз м фак бука

ЕКО ГУХ АН МУБООКАТЕ тім мл Бех БЖ ОмесЕ Вів те дух) ЕВ ЖЕ

ВУ Я ЖЕ о «фак КЕ хх жу й М жом тк Ма Жук ЖИ є сем ЩА тре ТУ их Уч ко ЛВ шк

Тс нів був я їн Він бу Бех Ск нів їеб зуб ТВ Бе ТВ БЮ ї5 Мте 75 ие м ет о Уж ха Ж жо Ве тус зи КУ ЕМ яю ур Ме подо Та їж білу дю т юч Фк ту ї Е Тіз ДВ ХЕ

Аж Бе піз оте був оцев уві Зі обу вало жо Віз ей їфє АВо Ат т че коди ха ве З їн ї5 їз ч « і : в р шва жожкя пух У де ки м Уучю аж Ж ож хошуч дм ге Доу ру кож пива Біете Я том руч У ме ЖК

ЛЕТ Ух іївн вн Ущі щі дів тн акти бух щі тТиМма вже і зу запа скги ша М я -; ем -е щ Ощ Фо жу кое З шу

СУ У ух В: ру ши ут. Ж умі. Мф г кх Тео Ж. Жоит дат МЕ КН лів Вів ХвВк Віа ЖвВи веж БУ Зм ТЕЖ бле їі Біне Му Да шре б т лютих а а шк

КОВІ ХЕ : - я й я ме чн и еще ун ходах Ло тує Ху бух гії Те КО ОМ, І НЕК ОНи

НАНЕяЕ Е КОДИ Ерос МУ У ЖЖ КАЛУ ЛКК МЕМ щОСААХ ХУ М й пусту хм хх Кк геї сут т гу Бу шле З к- Б ї і Я зи о К вач ав ж Фе

Я КУ пос Жміео Зйщо б їх их Тлгш ще БУ ли 3 хх Макро Буххі А З іс дід вів 5ів Ева Ме даю сфе Шею БУЖ Ам Ех КВ ІН Був МУ жа дае

Би нчя туї суще м а ща ХОМ : й ; й . рі дя но у Ач Ач с ун ож СКЛ и Мр КАТЯ СК хз ее Ком коїіе Я є їх р ах дим обех дей ст Кі Тв с був Уві йех бу (і Мія У сан жує й сю Б «ма ще ме кОш хі МУ ке хх ол я с х з САН соусах т 53 Теж ку жі у фі пд сти їв. тк ку ВХ ці АК о дучх ше Азії пуш Тек Тіз БУ ТВ Тк бів аб ба дещо пл ме лу дКе суУхтх зум зах

В ее ща 4 - сус х У -ехл клю ке пуд ложі з хх

Зкудх ж міх ЧК жур ЩІ: ХК факту МЕ ШУ Тех У. Ки 2 даже А її

ЖЕ їжи Жаж вав АзщЩа УВО ще МЕС БЕск зКаЯ с жа Її очав дат АВ МВ ; рве ех ша ха 5 Не н - с . ж сок р о НН

Уках Тв Мн Ту бю ЇХ у УТ Яях біди ру Ск оку їжи окт й о ПУХ еко КОЖ

ЗІ ЕК кЖО со юею аю су БВ ОЖУЖ ди Су вБем Кф пу СУ ї дк з ІВ ка за КО А ск

З сг я ех зе па Са Мох Су ау р хх теза Зону пачу Трач ре шу Хром і їй одіЗ Ім Мало гтик пап Лів сл щі

Тем дам зів Ла із Зшю Бе Се ва Бе Бі тих дев А ІВ у

І и туї Ел

Ук З ам ч а я Финий КОКО функ ЗК Кр жену ту у код В Жоюку СК мч У и на А ОН ННЯ ем тз ЕОМ: кту ївх сіє вів Вжз йхзч їв Аза вів віз Шек Вже Лів Вже Тк біса БЖ й п зх му зак ЗА з

Ж й НхЖ У А ч с - их, с я с Ся жах сія їх ши сум Мк Кк УЖ Се мох ке Се сек (хо ик ях тик Тем піз Тех ве ско тує віч ТБ діб УВБЮ Вів Був Сув о був 3 був о пов Зш а ц 5 з 55 х - А о їх я КУ . ес Ук чи ее и НО а іх оку хур хр у Ву бі ка За: дат Тим би ТБ шо УВУ ща да і Ме ЖК КУ Х Зів вів Є ЖЕО УА ЖЖ ЗУБІ а КМ АТХ чу гу ще

ЗУ 75 яв щ . 2 що «г кю хх Мох ства у кю В ве Ж ушу СУХЕ ме ве На І НН НН НЕ Я пек щі ТИ 223 - с тиж З МУ хм о ях Му пе с їнпЕш мем хів Еш кої ЖЖ Олю ла МК ЯМ в: : й с зе пк гра зв 355 ай АК ЗУ чень то Міша ої (35 65 хм ххх 7 дих бух Тож Ії 5 «оо Т хіх ту У Б Аж

Ма ув а в хм са ж МОЖ муту ТИЧ АУЖІМ ВжЕМЖ МБ лакНА КУ КАХ КУ

І аг я. зії

У ока А тЖ У і В кн хх щас ОК Щі ам хм Там ЗА ШИ Ще т І тв оч Аво імна ко бі Ака вів Хі Вів у Лимі вЖО бе вів Ко

Ажч Бко іх й ЗМУ Вів бен УВА БжО їх бі Ві пе; їж вже В й а 5

НЕ СУв «2105 3 «2115 1929 «212» ДНК «213» Штучна «220» «223» НВОМА. їс «220» «2215 Сб05 «222» (1)..01929) «220» «221» 5ід пептид «222» (1).102) «220» «221» тівзс їєаште «222» (103)... (1230) «223» ПКОМА фрагмент 47-422 «220» «221» тівзс їєаште «да» (1231)..(1929) «223» Іс-частина «4005 З що помі зов Зао зо ого січ оса со за ся соч шо бе що о Я

Мет сх ТВ зво жах Теха їви Ми Тїжв УЩе їм їжч їед тТкр ов Ко ії ї о 5

Ус же єм ЧЕ зас об ше су ссср щем всю кр сих су ве Зо 1 Вед Тс о Зіу Авродів дів Зі Бо із дтзЗз ви вв ди жа ЖЕ жа ошЕ сшщ пес му зм се заз сзо авое беЄ ЗВщЩа пе Беж че пою ах пдв їнч Шк Су Буш Ті їм мук пре деп обек За ОоВБа Тюю Бех Дів о КК соч Б вас аце сВвсе ЗЄС соб о соб чес чає воб сбоФ сечо ще аа твк жен пшіє бак Нів Вів буо бів ек де» Авео тиж Бико біс Вбеоссбуюв

З ца 5 пив Здсе б оЗос аоо їас о с соа ас зоб серу є ор одкнх кум оо тай віз вів Пен лкз пек отурю діа їв бра ТЕ Бех Ал; Твх діа Хе ск ех то ТВ З зи сечо Фе че сі ким їн со їж «о Ще сві є же ща ощау 258

Сув дже ЗІ Аюо бео дів бух Мів йех діа Уві нів біб Зв М; дао як з за шко т ачс св се не вс сс вач со фр сс вссо боб свз сов аа пев мес ех ів Ні вай Су Чек оПцев бвросьу Віш бвж беж ОМ Бко

МО 15 тка щи ж сяс оч ско со ше Кк сук Вс Вос са ЗВ со Бо ВИ ак

ЛюЧ же Дкч ХВ беб Вк ко АЛЕ СТУ МеВ бек ів сх Акт о йеж вер

КК її ха вому ше Фах вос сс се сах жах му) му БЕ ЄВ (еху сна Бер оз Іа бек Вус Чім діє Ста нів Тек Яіч БУ Бек Ві Мів МЗуз Вій Деу Ві зв єс ес ка вл сах Бек зо со бо З час оса сао со вод жо

Жах бує Ат тує ТЕЖ нів СУ фу їх ББе о бтфУ дво» орко Нів їні ВЕУ 1 їв жо про фею их щдечих тири жчжутт Боби м о жхтуту зичимо смолі в о и п НК ЕЕ ЯК ати ож

УК ХИККХ МІ ІМ БИиДМ Бех ему ями бароовеу чт сЕеч чес чо бор сс ЕВ

ЖК ве о тве даю дк Ве ЗіБ так Су їв і Ба Зі іа тир ВЕ «5 ашо час я ва сво сБаї6 зас Ззбч са чо вдос асо ВсоФ оо че МІК по жів БЮ ви дев отТУюЮ Мей два УВІ зва Уа тТИпк во ЩЕ о бкКОЇ Уда ії їн Мо ше со бус сов озов зоб ас ос воє зуб заз обо вос вп ай ке ва їжа риб пу Беж ВВ хв тах дів Тв цею Муз бе ук іа Се Бе 155 за па вач айс ШЕФ сво сс ше ЗО бо ба вач ду ВО Єв с і во 5 бтє й Бе ЗМ ОЗ СУ УЖ МеВ ОО; Бую Уфі уж бім Мі ща Мей

КН В Зио час за сн ше «ки ка хо Зі ЗВ що фо вав ва очЧУ ЗЗ ча тай дар ші ве Кко ЗВ діє Бє Ві вав БіЄ дек пев век Ялу ЗКУ Ви

В за аа во зас сви щчж Щес ас вас со зах вк оасс са зб со їм чо се тав

Пуво нів ЗУ Ал Ав деко їжа; Був Же ТЕ Бі цу Уві шк У св

МЕТ ке; св «сво щої чач ас св очос аз сво вс зас або асо ак ру рову дк нів УЩі бі їі (1 Дів лев о жУє Ті пу твк ТВ її бві Уві до я ВЕ ен: «веж ЗЕ Фк шо Са ск вес КЕ соб ЗК со Зк се зе ря ЗУ яка чів Ущі бі дк тек бео отих Бе Зі б йха Ме вро шжм іч ді шк 8 а чБлозввь зи іму задово їх Час ос свя За сво бас обо бас осо ве чаї дав Ат ла сля аю Туб дою йек зів слу фев ТУЮ Ба ОсСуд тех аз КУ Зо се ще жор сну ес ма Єв еф є фр БК о ємму Чем бує с не шо

Акз су Суюд Бо мав Ам бле сх 11 во Бе зн овал Бе же о тТве аа очи За щшеово мо ее щозе ук му фо ее ро ЖИ ох ж щи жа де) дів біз ЗМУ тТВвх Зі Бі вКЯ АК їх Ал ів АК Бек о Бко 23 що чо зо се ово зЗсес Ко оов тає щву вез осо че ще яр пає аце вхо тах дів Вуз Ба Тв де Бк жеж ЗЕ тн вів Узі із пев СУв зна щас век скор осхох чо Фа час ссФ ще бчЄ овес бат ояво Ко 0

ПувосМма Мув їж хо Уді ЗЧій Мао ев Тух ТУЮ Пів Аза Сув сві БеБе

МБ зо за5

ФМ ос с вес ВО; че час ж ав Бис вога сб ср зує сво во МАУ бер оїєюв Без; Тих ТВе БіУу йо Заі да Бе ТВ Без вів Аза рук Чжежх

Ччеч а свер яв с смиу ач бос осяє сов ззо за дах ва б сао хВов

Кіа бец Зів Ар ові змта Меб їз Нів бек бами цей Аню їуев Їм Міх зв ща 5 зи с ВЕ сно зе вс» осче чо з со зас Її да сої дов щас во їжи і-й) Тую бю вка вк Ах дер їни вке сі бен ой пек аз ложе зе А ща зп ек сне су без осо о сс Ба со су ср оцкра їпч5

Па пі БЕЯ Меї вавроБа вхо Су Бжо лів Бус бі ер їмх Пі іх ка оч сх: БЕ спо Її пий бо аеаосмо ай мно аск ст аб ве їз йпкосжех УВі рБєе фмаи ЕЕ ОВжО РУС Мув а ЗУБ дЕЮ ЖВЖ іш Меж де ай Б А обоє ово сс се сс во осСуе чо ЗСЗ з Час за вс само св ВУ пес Ах Жах Вк» із НІ ЛЛьк осв Ма ові вл дю юю Жмею Ве Що зх сої оз Зсс же Боб аво ож о шао чбЗ ас зоб з аз ЗО са 1440 бро бхл) с У МУБВ Бе ем жк бУж Мао Зервопіх Зв бі ові омяв зх ай БЯМКя во ва ОС зу св вар осот жа ех чає ян Баю вас зе вла но псує 1583 аа вів ув ТВ МеВ вхо Вже МР Зі зв Кух бввосеж Три тТух ВХ ря УКВ, 5

Чіп Ех вом о Яо о ко ее дір саєс сворочає Фор сто ак ру. ії сві чаї Беж чаї їм) ТВ Мада Її Нів БІБ Вво сбхюроїеи Алю сіу Буж аа БИК УТо ча бас ває я мм) ре бе ваФф очей ем со баме ру УК ВС щу 1555

Пів тую БУ Су Був уві ек Ає) БУВ діа Бех Ржше АТА Вжо ЖАБ ЩО

І БО 5 «ул лрихих ж фу тує ух кт у зужечех свв евулух СХОВУ Х вчи Іх веж ту хе мік ее Ме п

За нос ЗСЖ ЖехХ мае ср ее сов мМ є Є ща що оса че Во ке

Шпув ТВЕ хів баб Ба віз Буш сім сів Вб зюкч бім вхо МЕ УВУ Тух пе роз ем: схе ке соду зва сн аКЧчоаес ваеабф вас стр оо о су зав

ТвЕ ЩЦео Бко БкоО Зевк дос сх пі Ме ТЕ був Бе бів Узі Бек пед су жук К м я з с ч т я хто ке са сестру ния тре с що ск чис за се ше КВК шим о ачос см водо с зе Соч жк

Твк СУ веб Уві ув Зір Бе Тук бсо Бех дав Ті Аів зі ба тТкр

Ж вла ЗУБ чах ох же: чу сач поз заз засо зас бас аб озос воея соб оснех оц МІУте си бех оди ЩіУ Щіпв хо Біб бай дю тТук бю ЖНе ТБ бо Ве ях

Б 55 БУ сі ох би має два б БМ їі со ве ве у Кк ою ре за зва їж; аю беж йеросжу ЗЧаж Бве Же Тима уж Ееж бу имя Ж МАЯ ЕВ

«Ууц ШЕ т пи ЗМУ ль аа оче ач пеФфосмну се ще ах щих ке аа ше ес ЗК а пах ЇВ їтусемо КІЗ щас жк З КТ. СХ я Те то ТУ Фо б ти. (де їжу ща чу

МаУшо ем Я КЕ Міо са У МацпоУуда Беле Кочх СлЕЛЬ КВ ОМ пі меж на

Ас Бе ко склі стик их фею о отуєх дру фею фею су ких сх стих? я ким уч ких селфи ххх

За шено ст сову дає сс о сас шо са ее ще Бо іме ку се су хи

Ул кб тов; Ж Щмук ві дю ЧмеУ ММазх ет нм им: й їх Сік» міт са АВ їні Каш ма ів ска Кия ів МЕМ ючи ше ж ле меж БК хх ЗО Зх БВ

Фк вищ сх їз пера тюки

КАК Кз АК о «2105 4 «2115 642 «220» «400» 4 ке т кумі ух Муух См ЖІ Бох Ж ху ЗІ хх дв Томзї сб ДЯ 0 жук

Ме біс Хо лю Вк Мей іїеч ей те УА Ха щей бе КЕ Ва БК - чех ч ї Х и ке. їж жж о ому Уч Ж хх ТІ сх ЩО УЛ ї5ех 3 ле Фр Зочнаж Ж я тег М хиу У я зі щек жнж міт дво вів із зів бгхБ віз джу жа вів дЕщ АкУ ВЕ за 28 3 тка Тижтх кер ух уч Жив Лак их Жожий йти Мк т з а чу теха ЗКУ

АЛЕЖУ пече БЖ С Воду щ М з мук Кох УМО Ж Ам пе те КУ ек КН

ЧЕ я інею бу ХМ ох ЖАЛЬ -- ие іа САІхУ Минко Хе их ІУї ЇМ ХЕ

Твх дак пі бек Ні Аза Вк дів Ве Аврохаю Зх ке Зі Кбе СУБ в З и и не в КК ВЧ ОН А Не дів бів Їм ду її ЖЕЖ Ух даю іїмм Се Ср ЗюЖ ОККО ве жі ще МОМ ше ек «и х 55 ТО ТВ 53 гчзддуж Млини жк мому Код СЯ бхеню М о й ж їх сих ЕТ булку

СУ АК КА У ОД їм ВЛА УЕ ів Мщавх Бій щі мох КАЛУ А їж ЗО дух її

ЩЕ За МУ ве Мих зоре на я ож ту ЯК о они НЯ он иа хе а НА ги їм Ме бек сій ів Авкв о сСув ВаК Му зв осууУ БЕ Тех Баж 10 вк чорт вк де ща тс МЕ учучуюу км ек Кум ЖЕ лучче ее чна оса оду МЕ ее и о НН ННЯ

Вкч бе Аже Слх ім; БкОо Буб Айфа ЗУ ле) веж Зах зах вжЖу ех зно що я ху: яд 5 Ма Тх5 як Же аа нь не ЖІ жо стю ж Тож с куче Кия Я Ж ке ТЯ го Сл я

КЕ же дк ж СУ Б УЖ ОЗ о МО МЖК зв о НІ еВ нев об лід

Мія дю дих су пре ТЯ мо жах ад Стих сік важ и фіачиу ЗМ ом току бу

То вВкЕб Ав отТУжх ЖОх аа Сув с-ру БМ ле піт Ав Бо Ніж Бей деф ж їх ку Зк зе

Її Я їни має спе ую о Меч Жуан г рах рак лек ри гало вм ше ою пух студ

ТЕ вне тТвжх дев зе бе сів тиж Су Її; Ууш Мах с о сбіУ Аа ЖЕО ВЕ

Ма та КО ок жк ОО щ буті щокем суми студ Жодухи музу Ть 0 й ее нини нь в ХК оо я

ЯМ БОБАК ЯМІ ММ ЗХ Її В и За ОН Я УА ЗМК У МИ Са Кашу ЗЕщі 150 55 во фо ее на Не в НИ: Я стік ТО я Єр ж Сиве Ж оту тку зу ТУ це яко Ера

Ж ЗК с ЗНЯВ ОК ід діяв в дів СВ Яке ії їв ТВХ Кі тре Бе я р мех сттут хх кі ХМ

ЯЗ лиме Мат баки (ЛУ гії їв 3 дохих Ж жі Мк хх сраку ух Во Елу 2334 ду

Між хр ьАМЕ им Б Сх їі С Ум МУ Ії це В чу Тук шоу ськ ким Мах пут дк ше ких 15 КВ

Ффесуж КХ х. Ту Ми хв 1 - С хх Фе ТА ду Тухужи егкщч Ж же фл ях буку

МКК А МАЮ КЕ ів Дів ББе У МЕ Ку ех Ух ОМ Б ККУ ОБЖ за Зх тюль тудї хх ХХ «М КУ ХУ ХХ. «ХХ

Же ВУ ею їм С еах Ком лак пошук ЖЖ Ж хх тує Ха: КТ хуєгу хх йахує (Ах та у

МУ МУ су Аа дав Беж їн ев бе Ва тра БУВ о Ущ ї ЕК ЛИ Кк ща ВО КІМ

ШЕ ОН тра т жу ЮТЬ тд чує Ж и хо р ух Ж шк КО у Жах аа Уві Зі) Те біо вв ба ТУЮ ЖЕ ФУ ЖЕ Жви тів УБЕ мМаї ДЕ

ЕК ЕК джут оо ко о ім Ж ук Же Умия Ко о нак нн и Я Не и Чи Ки жу Ех ух КК ї

МАХ МІВ Ху ж КУ К МНН Х ВЕ кіна вів Уві Ак у еф: Бу А Б чук я дек

В ВЕ ж хо кашу МО лі гу Я 34 іх оди тк Ж ЕК у Три ок бака Жокхтх блю бом щи АХ ід ов сли де ОК АН ее Я СТЬ хо АВМ КУ АЮ жук о ах зи

Мои В Ж тю Фу ох бю ти УЖ чну ж Ти ТАРУ жо Тр ме 3 Фк бе вжи щі Сев Бує їж вшюЕ сію ів бі дв Бе ПЕ Аївб БВжЖ о Вів ЖИ

ОО Я Е Е тт рух лаз ц КЖеЖЗІ

З 15 дО ху Ж що парах Ак трлн г хх й 1 ду с янежо стик о Жоехіч оз Ку Ж др ки их ДК

Авро Бі с Ух Мк ог МО ЖМА АЖ ЖЕ БНО Я і хів АіЗвз екс БО В сут Ки же

ЗУ 53 35

Кк мя кю х ше ер СК з ат рі ря Ж ян. тю тд ку

Ве Щи вів жо Сова жилах вва сво Щек м Тек у аж аю Бу су є зе вч

Бе ХЕ а ув мії сфави кону Фуянях хх йо ик Ж су ме смузе КРУ о М би ха шПмхх

Був ЦІ бу ль БЖ ді са р їв Теж УЮ ба мів С ях ха овал

ЖЕХ зва вже

Феехи Ст а "хи Ср м ря ах ую ЖХежки Же фа Ук хі їдЕ Х що я Тих а бен їв ТВ ТВж ЗІ Ваю Ущі ем ін Те ев ові Лів Жух Тух ств дич мм аа 75 щу з Ходи. ка сом, ее оо ик тах». г ЖЕ жо ся У вух оку, хо шах Форм йог Ук

Ат Бей Я Бах бек бук МеБї бебер нів беж лЕх Му Хе ОНУК ВКА

КУ Х З З З ща т сефде ще

За ва ЗВ в ЯН

Фохзі ху кУЖач щен ін Жир СЕ зі. Жри М Уа Темі; едя сту МЛ ум ех бе фе ша Аж ТК СЕ КЕ ожмх шко КУ Мей люХь хмаХ кни Ме КАЖЕ іп ВН УНК

СЕУ ЗО ЕК паї еко жемочу Вдехяю мух Жідчиу туз га гу чию Ах кам и "ода жу ран тку пабу Ажфе Мекодр Бко Вк Су фо щі хе СКМ лема Зм лі су ї Ку вх дише у с ка х о ААУ У як жк реч СК об «ди З ЯН току Ух уч Тут; ока ж тбккх браму МОБ Бод Міді СТО Кк ко Бех УВІ це рей Ба їх ре чав ЕКО бе на АХ ем Мет Хе іх чад чі

На и У АН як о Утуяис су ую ту жк Кв Жосжмх щ Ше ВА р У ач

Щйаж Ажке ссСМмйхш Вже (в ЗАКО Є УВО св су МУ У ща Ем Мав ля зах дин

МК а

Фахах Ше ал хкУ жука ЖЕ; бі о уж рахує хау щує ура чт вшехх ххщ СІ ух вввоБто Зв) Таж Був Бе Заг отр о ТУХ УВЗЕ Ар Зі Са бів Ук мів зах ча У ак

Джус лм дек бук Щонгр р х Кррк т ух рун Как шу Ку Мр уче

ТУХН Аж УуВ Ячути ЕКО УК вх А Фо З с а у жЖКОЖМИ меж ою УК Я хо ух вогухх во

ЗЕ ЩО их ча а бе Чаї ем ЖЕ ЗВі їм Ніж ФР ва шОКЖЮ бяМмх Ашке шу М АК пом п ях

ЗО ах УНК тая хз Ж ху жав жу ХМ ЗІ дм хо тома Мк КТ КОЖ ж шум ТУЮ Був Су Був УЗ: дек дав БУ ІЗ ба ВЖо дів БЕЗ се щи кг дткк шок

Уї5 КЕ дае стою ру цу А дуг У. шо ув е й, дим Мои ЖЖ я ким М 42щ Мах

Бу - ЖВЕ Хі ж Її, МХ до МУ і У АТ Вже Ук Б пІЖ ЖЖ Са б КУ ХХ кїк ва що

З МЛ йо зн чи фу Клин ші Мих Кан КУ пулу Ходи Фоумеую Ж ух м пост Кози пе о Бцеб Бюоз Бо щех ЕФ БТ ЗІ) Меб тах муз зем аж а век бжих 55 МЕ в ЕХ

ЗКУ фхзух ЗД; їм фа є ях у ак хау фер «стиму КУ Ж Ах ФК ах темну

МЖК ях му шежлу ків Сух ВЕЖ сех де Бомлж вас А АНА ЖЕ

ЛУ Я ЗУ

Ух стук чи Те Кл и м Жужних КМ Ж му тк чути фо Фр ті о Тут сраки Хо пі шжж ВНІ у мм лк Се АН АМС УЖ ОКУ СМ б оте вже Кр У Е ке п ек

Тр ЩЕ З че Хан Му (Зах Жде Мч іш Том уз «іш Тоня Хо шу Му дих Ух їн Авробех Авросдуу Бех БВЕМе Біо бе; Жук Бех чув Бех Тпх З ЛЮ

В БО 5

Жок Жак Мох трі КАТ ж ПИ Кк тих аж Жим. Жук тк Оу ТЕ сли Ж

Ббев мех вже тТке паз сю ЗЕ два а Бра бек був бак ува Мек нів мк ма ще

ЕК вій їй

ЕН кл. дз па смт А суч ся КУ бом суч у ошх ялах о Жошу сх Ж пій лів їжа Мі фена Вив о жУю ЖЖ ЗКОоО пе йеж бер беж бе їж ВБио

Би За Ба У яхт ж Уж шу 5 «21055 «2115 1167 «220» «223» НВОМА І С с

«2215 Сб05 «Род» (1).1167) «220» «221» 5ід пептид «Род (1).(102) «220» «221» тівзс їєаште «Р22» (103)..(468) «223» ПКОМА фрагмент 47-168 «220» «221» тівзс їєаште «Р22» (469)... (1167) «223» Іс-частина «4005 5 зго щит во са всем є ска спав бе зга сн пе ско ер с смій Як

Меб сю Так аею таж део Геи їн Ткр Уві Фей бе їма ТЕЮ Уа вхо

Чак що вої ча час Зоб ФеФ са се по Фобос че сою оч ясч ВЕ 1 Бех ТВЕ біу бер вів в. М рхо вів дкя аку дів вк АкЗ ТЕ що М Ки щеаєфроєМ о зх ее що «се вар ве вих фо ву З по во оре а

Був ої) БКо Су Був їі Бе Бев о Сте Маю Беж Бім Бе Туройеє Аа

ЗБ ча зе вич псеЗ ЗЗС вс сет ос св зас Зв 'пав саб зп оЄсс ва пе ОБ 135 тв дек пі бек Нів дія Без ві век Ажр Азю Тих Бут Ор; вце Су.

Ба 5 о жов я ре сфе дено чено ша См Вих кож У ВМО ХМ ВУХ За

Віа віз їм дхо йех Тукх Аів їй СУув Те та бра ЖМжЕ Вт Ак ЖЕ 5 | та 75 ко їз соеп аує себ сроцес мас сво бо чос о са ще іа ча що не су Ач КУ во іжн мів ТУЮ НІВ ЗБК Віз У Мів сії ща ОО ДБр сш ові зЗс сво сами за очо Боб оВваФб ЯЗ чзчо пес ВО гіІЖ Са еВ За їн Меї бек са мів дав Се бах Бу Агро у Вис Таж бек Зіх ржке ло МУ Мо таз зму па все сб спа сом оо св озвих «має сзщщроднаєр ут ор мо зва

Вкт їни вже бви Баем о вже вхо» вів зе ЕВ оОВеж 3 да вк ех АБО 1135 та ших все сс осееу збе Би сцай ем Ємму ву Ві БЕ «ті вар ошас баку що жи

Зек о Бто Зіз Хі був нів Ту бана бот Же виє Вів МУ оМів беж МАВ 335 5 4 вис со аа о бзжозосЯ сс с щас спо ях ому що с ав Бек «Ка зна

ЇБк Біо дво ТУух ТВх Щів ста пу їн ге осіу Ан Бей дев беж Ат ча ах дееж щу сча аз час соя осе ос сс зе бос за мує сх ЕВ

Б-єею іє М бі» бхч Ме Авр о Бко бко бе ко Аіїз бує ль бе їжа пОеасб ее жу Бсвобкое ке сб Є ехо ємов ва сем» аеро зо. сто З

Пам су жк ех Ук гне їм о ББе Боб Без БУ Бо Був дероко бе їв 185 189 зужчею сук пуд жи пре фе суттю гріб Іх рухів сік ен НН ет зЕч Зо бос ззЗ оо шої чвах жо вов се зЕй ЗиЗ ЗУ спи сі ово їх

Чи 0-х пу Мом струм ру (і В ст кх за хх є, яру ие зм що их

Ме хів Бех Ака лок Бко зм ува тах Сув Уві Уві Укі Аво ові шву ж Уго тудУ

Ка о МОХ сах шт оре о НН а и с НН НК жу ти ужити сажею пли ку ж

Кк ній ча ід ВОК З Я ТІ МОСК ще КАХ що гос Б Ка Ко Е троем ЕК ФК Я ех 114 сх чут Можу дл ху У я ИНА Ж лим ТУ оМ Мужух о Мт грами мя ум т хм жі мА чів 'зЗіч Вжшю те км Ува бух Бе дат оКЕ мож Уа вшвоМт МВА є Ти 3 Зк ху 1 МЕ Ж ге ж рух сутуйе сити сутуєр суч лудюує охихих хитух круто ужікук кл -лює чу пруфкх цу еких суху чи сви аЩк щен аемж ЗевомнІ сс осн она сни оз БА ВІ КОКО ТО зе хі шо мон щи гіехрухо Ху фо вче Жоден ж УЖ у Муежио М оимчни шу ТУ ж

Ух МЕ ОРЕЛ Ві МУ АЖ МУ ОКХ ХХ М їх ї що алю БІЛЬ ЕК лк ОК СХ ПЕ че ву я ер жа ай ХВ КО фскдотю теж тіж жіно суєти фік фі оду вв пф о нн нн ни НИ НК у ас с Зч чзи: вчу чл оо до Зх КУ шес осо щас кащ Кор я ЛЕ КУ

Фі ж ЕМ ї1їщ о лу ді тая прим 1283 колу шк МУ ше см амьч селу У опужу Ж я

МУЖИК м оче к Бек ЗА о їжл Тк Уа ої. Нв Оси Вер гЖжу» ем дам «чаша прищ и ск коки о єю сок ПУ Сежутю ух дж ж 0 Уч. ких схем 135 чех ав Заст ас вач сте ач че Сос йаам ве ою Є шов Чо СК ие

ТЛ жу пою зи у Ж ую уУМхУМ Так т Ж для уче Боже ТУ я ж ач ши сухих сіб Беж о Зіч Тек МУ СУБ оБув Ущі Беж баб тя йіз бїяні Во Бів ко че кт мук

КК «ІМ я КА ів феод з ажуц дуг суч сбуйок о еРАК сі СТИК сім «ЧИМ ев. зичу узех жі си ех ща во ще аВва о х вме ж ав е вма я мВ МКК КІВ ОМ суд СО МО

Фо Ех Кожні Мн Ж рам хи змо соди Ж КМ о Жуатиу с жехж Й жи Же Тож

Же Ки ще кКЕ ті веж УЖЕ ОАЮКТЬ Тест По іх ж дич ОМ о БЕкО сх ке о чн НН о пек сижижиу Ссмкжутх жваві узи риф ласк жУцую куй тр та

ЕК В ї ОМ Ох еЕ со см р пед дата де ян м ха ерких Ах ях. був уч ох фіни у Жруух сбдуу Луч Ж кю ЖЖ дю Мун Флдедю Магрю Уа ху

Уві тую ЖЖ їжа БВхо Кко йек й б пів Ме то бує Бак Зп У ва З Зб керие шик о сут ся фрею Ве чі жом сфер Вих Морі нчемехо ефе СК КК си ит ст зас сря вссбор: «С чав чЗо БеЄ Ве ємо вес час зе оо ро ЗМ

Сх. Же Се онук. ЕК жк Мн КК: тях ТУжєум Ху ос ую ті Кк що ту

Зею дв) Тк Су іЇя ді ГБ ТУ Врео тех вже же де Хі Бі УВА 305 УМО ЗУ Ба січ вк о о а о п и я Уч мулу жук хе сціщя о ляпукхм сут СМ сце почи. дн а е

З У «ча чо з сир св ос щащ щас ем п Ва ою Во КК ЖОВ мет таж у РМ жмут Маму КІ вх я Жан У: с схту с ехту ре ою МУ юю Кр Дня

КА МК ХК Ух нт лю ав жо ім Аве веюї жому Ах КК Ка

ККУ ЗО ее сейм сс чає соб зас чо ос Кс БЕ оо баб ває аа спмх що МНЕ духи хи Жіивіх духам Ук Момул Сі хх шт кочио Ума Ухьусх Жосх «ака сич Божі Ж охутя р

Ккхо баз Бей вар о Зеж Блю спаму век Бе БО се Тую аж БУ Бе НЕ

БЕЖ Зах 35 божі. упра сіло піерим о луиуєт фе стру сежлуєт уч ж жур ж пали ух ою сви г нер а и ззЗзч4 зЕз зас вас вас заз Бо миу зах сх аво чі пово Кс вс ес у 1154 жк жо али Хо Ми Ху ЖЖ ую ун тку му ХК Яфічех ох ж їв ох КЗ б7аі дев цу бек Вущ тв іл піз Біу аж Мві Кпе ойеж був шеюк Уві ак ао ЛЕ чн нн и НН и НН НН НН НН НН НО НН псвщо

ВІ й с о Б'Є «свое йо ба бл Зоб схе айс яс сок с ІК ДОМОВ АХ як ТА нах чеше тофу хг кош Жорж ния Ж МЛ Ж душ паж Кущ пак м ще: із Бу Мі ве) Вів два пів ТУЮ ЩфВЖж БаК Буд ех Мел маю ММ

ЗМ ЛЯ БУВ

ФК роутері ох Мох чочоичу ше оса ща паза Ся Ма беж обу В Щур «21056 -2115» 388 «212» Білок «220» «4005» 6 піди ж Ме Мкух УВУ ря дух сич и оо ст Поу те позаяк жу умію

Ме Ам о жмЕж ЕЕ ХЕ Кам їв жна ЖЕ щі їн Зм ба шо УВО Бе

КУ ух На ЖЕ щі кю Аа що ї що і ЖК Ж я Те вух ах Мекку ем рух ма шик ЖБК АЖ ХІМ сука а Ам ЖК Я ЗК Укр ск Же ВК СІК: пт, У ж

КУ Же у АХ

Хожух. Жду пули, б поки т : Ж осжтч т хх ек 2 ще ДЛ кн ке УЖ ку піде дж за

УЖ ЗКУ ле У КЖ Ух Зх з їз мих ТОМ Таких рим їх 1 Ти і .. Ка

МЖК ЖК КК КУ им Же це МмушО утво ее ж кала ЖЕНЕ УЖ ЧЕ т ж: БЖ Уч

КД за з

Злам шу Фр Кю ек ух Уа «у. їю ї З їм СЛ сек усу по те з Живоє яхти. ЖИМ й тт ОК Я, п ї хо КУ наро Тл роза хх р люту тр См» кс пт щех са шек вів вії Бо лів ех хво АвО ТБУ шЖкО сала ре ув я ХУ ноя чим мм Му М т суч хідно ТКУ дет у Мчеухю МУК ую ХЛ Що торі учи дів ДІА іме ДЕ ОЗ КУЖК Фв лУвІ БМ ОБЖ ху ми Бра дя Кк ГЕ їчУшУ бе ху Тоді А чу їх хе ХО хх їх 3 КАЛЬХ тріа ж А аж о бущух

СУК М КУ АБ ЧОМ М Я Я ЖК щи ЯК УВК БЮ У ЛОКК жа ВО

І М Х ЕК В: : З З а5 зо зв

Б йхое без а Ку Хі хо щауму ххх Ха Ток СМ ут ос шумих ія дк а ану без оМеї век оба Нів дж о сжв дек Був вер о шу ВкОо тв Бех оп КУ рик чи «чк то а Ек боутея Су Жктуч уч то іх ХК ше ТУ ху ле кан КА СУ за М усижо ба М дЕщш БЯща Аа КО їдма БЖ КО ІВ с АК ОБ сіл лю ВЕ ОМ Е «АТМ зр ж я туру У-ц ї35 щ-О Ме

Фк сус Ку шу їх дум ДЖ шо аск ту т хх Фени Ж єх ок Ж оусх ОМ ко біду ЛК щих Блез МО ОБОВ УК КАВА УЖ МІЛЬ лм с КІМ ЛО їсть ці дах Лід суах, Жду зрнуєу ех ру Ха (ах їх зи бихуї бМуєх гак дує Ж овхії Можу шу М

МЕ хо ЖК УК у м ВХ с СО і У мм опе Оу ОДУ ЗЕМ ЗиЖх КА чо ал ее тк Зокху кВ зи ї5х БО

Фі СК що й я Кри ння КО Мо шем Же їм иу жи нн Р Ж; їх жо Сток

ЖМБЖК ДЖ КІ ха Кя М ок Ме АК ШОК кЖЕ Се БЖ яю КАЖЕ ОКХ Її За Ме м пт су

МБ У ОКУ пожнеш ши ни а НИ Гек ода їв ую Жудемх. Ж о не НН НО Не пту ЗА Ес беж У ВББе фена Біне У ЖЕ МУ МОЖУ ВОМ ТК ва чик я ви дос зо 185 123 ее ние ке а а НН НАКОНЕЧНИЙ щу 32 уче мех дів Бех джкз ТВ руб віз ті Тв о Сув Уві ща Ма вер МВ ее лу У ТЕР реж кх. Що ХА

Уч зм т зо ек Біде ТАК хяп во я хе р но не НН НК оч НН лак о БЮ ЕЕ ЛЬ УВІ ев Ба Маь Я ПОМ ШЕ МІХ А МЕ СК

Ву Е З йОМЕК я зи МИ пулюгу віС ОА дк саї ців ваоО Дів бавовна їде бі» дует ас жа ср мжую ми ть ча ці Аа АіВв о МО Ми ші ож вжЖФт са сплю сеАЮ о жУЮ Ба ЕЕ ЛУ тру туз лют за км У ка М ша тТУК Ат Ві сві беж щі Тждю веж щі їм Мі бю Дю спе Тих ох

МУЖА Я ши Ж СУМ ЯМ СУМ УМ Ба вв АВ ЯАВНЮОСТЮ КО ки ем их аа 255 хх фа ИХТ. бич фожаку Жбеуєу фол жумо З 0 штам ух фоужачо Жомуд Ж с чн МАЧО ск буУуВосзвВ СУК Буш СКУВ чу ЧУЩЬ Бек дак ПУБ ДіЗ їмща Ви ЗВ вх дит ск ж ши хаї т

Чт Ку фут СТЯА ун СКС ху ФЧауує б мух ЩО я помах КУ жа Ж шо тру хом вк я уфлних Я у а УК м АБО ЯКО КУМ В еВ КМ АХ ККУ БЖ с ЇБисУ ФЛ «усу ду г туги

ГО ї МУ 5 В ке

Щи рю рун Ж су мети, у рлис Уго М мамо У крах ВО Му тшо ода СИ хх я

Уа бек би бен Кхмз Їй) ж Х ОК ях ї Го Між: ОСС Тл; ВОКАЛ Тв Я

ЯЗ ст му і; жо Її ЦІ Бдев її Шуех бо Вр ак ет Ті ща ЗА

ЕК а СКЛО ж меш ЖУК. мук мм МАМУ АЮ ЖАХ СИХ КО ОА тя МКМ чи тік ту Й дючю к: ери

М а ЗІ Зо

Кене тн Сік Шен у Жан Я у Крани КУ Мом сему Жук Ж дже уми ЖИ Мф

МАМОЮ БМ ЗЕ АХ ме НА Бо сі оби дамо УЖЕ Кихе ОККО КК КК

ЗК ху чу гу

Зх а 335

Фунт ох ож теж Мох му ббуух ФУюрих. ХХІХ поема тім у ум жк то зі хе

Еко ТВі Без юю ек дар бр Бек вне Бе без обек о зеж Бе ік ЖЕ 380 ла5 ЗО чиї Мету тд фе бояр кі ан НА ШЕ Ка ШК ї І Кк ах р гати іх хі

МЖК ФО АХЯМВ км ФАХ МЖК КАКЯМ хар А ВКА СУ капи сом жЖ КУуш мк оч

З 3559 ав дж Ел м Ж КЕ же ех Уа ме Мф г лих ие Ж нку ока ох щей оно ОЗ Аза іа Ніж ба щі жк ВХ о зАв У шеК БМ БЕХ кг

Зв ЕВ ни шк о біжт І ж їх

НН КОС КВ НЕ КК

«2105 7 «2115 1431 213» Найциз 5р. «220» «2215 Сб05 «222 (1).1431) «4005» 7 «ую мк пуск о жим ум фс и гемо умах феиуку ж фе му сжквиж о ун ую хім Зесучуу ості че акт ща во с Зо ою о см о жЕвовоЗц ще щ ЯМ яки Фопл Кч КО «см кун їх ту уз сх сті ох Фото ох Мхучу у тек СХ ох тот Ся жк Жде мес соалю тах боро МЕЖ Ява їй ба СКК їз Уві Мем Бей їам отр оч Би ч С за 15 у У А ММ че жо ВИК ЯМ ЗВО сег же свя сс Ффос ва сс са а сс щу ЗЕ ре жж юю Му ВМ р хх ху Же дю ЗИ Шо шо Мр ут т они пт ТИ мо лу сек Жвке ЗКУ Ав Аз дів са Ксо Дія Аж лЛюз Аз Ах вк ке о хх а дике ж ЖІЖжеКО дет джу ги джежі тку оце сдуг о хуй Ежен си вух Ай ач шк хр СМ шим со фра мпімк хсло ему олив ще пор ст авт Б вЯН

Фк бок: ФА ву ах Колтун мух Вузтує мк: на Чи щу бешо обро жМХу ща їм їі Жех блкЕ о бехє шко щі ФК Ку ЕМ ех

ЛУ И щу схоже пуф суичлу свути и Но чех шах «хек Фіз нини злими сват о Мих пох зв пас йасс аа вес СК сао зав аа чив Км «Мир оМазш верохно ай

Ж лю дику ик Мн ех Жогуі. ЗЧхяує То шуєх бом А 2 ск хх. ФА Студ чу как Ед йо их КІ ЖЕ На Х Ким СК УЖ МмУВ бж АД ВО ї МО хМВЖУ МЕ КлеХ мух КА па ек г

ХК же вим міч сук фер фі фан фюдит виє ет сзхрих сг щу чу фунт емо кікфих сохутихо уже ЕК бук заз се во Ко ва КС ск Врм о ЩА ЖЖ Ба со о ЕН шт ну ш О Н нн нн в и и НИ НН

Мем був сжва Авиа дмеж са вве о сбкю бек віз г Бе мах піб мех онів як «че гюії пе бух ТИ ТЕ МІ три и пи ок он НН НН НН они НН Но тех «З3ма мс си щу КК ра рми му сх ее У Бо ЯК ШНМ а ВО жим

Мо Ж ще мч хе Кн и тя тою их ОК ПЛ ск осі Межі ух їв Бко Ай шек лес АВ УА Вуо піз ББе Су Аа лів їж; Жеж Те ва Ж п

Коха суху ушу. фумуч сту тчАУмМмО ут худу Саул пит я реж герою схо сій Фу З

НИ фвОмо пщаму Кх св си «Не м рою со АН БУХ сор що МАМО 335 в У Ше Ен а Ше о о но НН ие хін она в ее о НЯ

МЕ їз Ти УЖЕ С КлМ ж Ус ж аа ва АК СУ УЗ ПУ ТУ їжа то БОБ 1 син не ни А НИ НН НН паю У їв кт цпреку тре ф грі ка ча о імщ сс Се ЖИ ми шо що ВК ЩЕ ща сю З ЕК НЯ Со ка

ТЕ: трасу з еко ША Не я НН НАНУ шу ох ех. а кине ШШНК Я зів Тух нів о век дів УВА НВ ш3У жі ІБ Авробжем мес век а нів

Те УЖ ве срирето есяух жеучух. дві прщ смефи сіхутух сих уч. уеці Не фев ду тійтиу зи ех ер д бух ша шщЩж ллє зл зас «ес ше вот їла се сб особа Зк сг асо со 3

Мету (Ма Хе оз жу ту у ТУ Ура (ше ЕХ їх фун Щі 1 ку рн т давши Сув ех ув дво СУ Бко жбок беб Біп о бко Аз о тві дю Жах ЗБ

НЕК Її Ки очежи низ М гмужужо дують. лужх то о сла дити ЗМ слу. зрАких оси сте у ух я я ут поч сс щсК ще ас Вес са Зам ех ех ЛУ Зону ема лм» боро М тудех туиу От Ж п сажу у Ку можу «чую ач був ни фа жах гук

Ж тххУ АВ ААУ БЮ дах схАЖЬ щем АХ ОК ЛЕ сах БК ОО іш іє Є У яд чол ак «лІх ке 353 ї55 5 ких у по чн и НН вч НН п а ЗИ НО п п т м В М кт сах ем Фровея ЯК о мсмх пи деку Сех Бе «рах щем ло емо СВО шк ва кн и нн ен НН і НК НН а А На

МУ МЕ їлллі Мудш су Бі Мж У В Ві йежх йівн Від БЕЖ й ШУ ЖК ОАТЕК їА ії у вн нн НН НН НН НН Не НН НН НЯ що п МІ ще ск Ки оче ЗАКО ЧК шо в зок око ака о ща ЄВ ав

Уж ж Ко ж Мод з и ху. А ах Жучхх Же: том Же ін Шах само Жанну Вл ЖК

Нішв о сСув Бі їжз Ва слу дм Бжо ій ем Джч та ке ТЕ о БЕЕ нев

Іо ща їщО сн ЧК у а Не пеачу сем ете (е о слві Мф гущі в св кт

КкЕс савч асо з дач чи свв ччс Зо о сс ол Ве ем ЗЛУ ле вих зле сб ть фак хе В вах ди То Траєжі Же памаф Я Мячі Бах ЗУ іме С ТЕ СуюоЗуа УВА шив пу лів у ЖЕК ОБЖ юна Ов ВК МТА з-д ут жи

МІХ чо АК вом фа сок (ж Воре. уми фе сват душ щи до й уд клан НН НЯ шт пев о ста ас Фо ся ЧК ви ва Все сс є щоку ре вхо НУ ТЕ о чн ее о Не АТ сел шах ЖИ жен ХО жо с булям ЖЖ Км «ши КТ бук Бе вав Уві ле Ма ж Ав тах бує Май Сем оБжо слу Беж ОАТв зум зак дев

ХО ки «ий уча ху о вжехих причеч пре спрлро ет ства січ. тв ких щив щи. Вих шоці сх за щич зе см зи ще ее смс лих пише виє ти зач охево пос кла ча хо жом. су КТ сміє но жде тоже То ню Ж їх: ле Мем ЖЕКу: бі Ах хів Тв іа їх дШек був ССО ТВ Жіє їв Бе був вва бе ФА сс

ЗХ З ка ха пужйє фе ше фл мо. суть скжЕо фу де прту г ТЖІУХТ ЖК ж Ух ЕК ФМ же дже тк

УК щи ща сему Ва ча сао са о сою му З пас Ба сс соеЗ бос 255 рухи Ж Жук аю рт сх Чбчум др хв т НН нн І я жах ку леж УМ Вир Аж БУВ ві ї Ух їй о АїЇа очам ех бю са бе вус шнах ша ЗИ БО чн ни а и і і пп а а а п і А а п у СК КИ С ех ВУЖ ств дих шл

За КК ях ОХ ру пек ще щеВХ ЗАКО сі ща Ва с НК зе Б пла ше жі Зугх ЖК ож Жде ем ст Тк йеуу токкху. Бі ск сіл чу Віта Аж

А ЖЕ сеКИю МІВ лу ща МЕМ ММ КУ и ЗНО ОХ В В ВК В ЕЕ КО су сек. стІгкхх ши ПУ кн: он и А НН укр и НИ сут ям; міх. шжіче ик Фр жук кита зас ст вай ато зов зас нач З св одеол су саст че се Бе см цех

Є Тов Ту СТ ях Же з Сб оувх. ХА єс ху фу ТЯ о т пк хм да у

Же гц АЖ УДО БУК їла МЕ МКК ЕКО шк КАХ Нів УВ 3 сх 3 ч тів ук «тм те і ВИ ВЕ пе дам Ба ще пом цім вро їси Ех КЕ див сл Бех о сти КЗ зі шко я аж шн фра не ЯК В ще Бк ака єзлаб КУ Яся со Ах

Мі ше на АН вн У а я о ни вн ни ів Буш Теж аю над Я Ви Те тів Уві кі Аг с осаАюв Уа 4 У АК ТУХ ко з ав

МИ ОМ «ЇМ

Ук рим й ший ЖЕ сижусю бффеих;Е сечею дім ЩІМ УЖ Фі нн НН Аня крим

ТМ оп Ка ще УМХ КМ БОШ ї: що ОДА тат жа КО ВИ КУ КК ШК БЕН 5

Фо сух пряна ВР ж суми Машу Удляну кр я чин ин Не КУТ мезо жає ве дів бві дез Ме рез бЗім З У Уві Аечиа іш Уа я же зах МЕ до ок ЗНА ЧИ о и ЧК С а КИ я ПК и а и КЕ В пт час сЗ ос ащсе сав опе ско баФ се Емі сх хору що БО соФф ос В певує джу гу пі каю М Ж Каже рих Ж оку тк од хх ХЛ имя фррхуєи од вав ов ЗаОв ож са па ме ЩЕ бем же Бема ж ша шУЮО БЕ Деу ко ЗУЄ 355 тей Є меМу з ші Село Беж ходи пи. СКК м БЮ фути мем ФЖжИизИ жжщея щури МКУ, Кан чаФ сво є вс час Сб се яс ке ше сш ва бик а НН КК ЖОВ баку ПУБ Ал Ск дує ЗЗР с А Ху лютих САС; Свою А щу ож їх:

ЯМІ УМ са АЖ ЯКЕ кА ЛА малю ІМ ЖУК ЯМА ЯКІВ БАЗ КОМ КО КО лай КОЖ ши ухУчих о примі Ж уче: ин в нн НН а НН НН и НН НН НИ а чноня аю гра пе вуУ шо Фе зом щем ВН я. ТЯМ сх; ЗБч чо со «(р ве Бек за и чу пою Же лу да Ухчеку дим їулим КАЛУ пу кла я сім Др люк вто Бе пів Аїз дів беат Бо Ше Буб во Уві ее 333 ТВЮ Ба се щохня вач

ЗУ зо ак с ни нн и НН НН ин о а о В Но о о НН и НН НО НН ще ож чо ц «кп бно ще вВвоВощеб що що заз сце фмь ОЗ нн ста Є ча ох МАЕ ур Тчи Т. теє щу С у стояк й жіхо б джтю Жофхех ех Феичм шу 1 ди ОО УУК ск зв Ттвнх та тУвВЕ Віз му Му мук шах мух мм ЕК УщА АК ла Ким зай ть КЗ в

Уж ЗОМ му фури змлудх. пжучаияє Же о слух Мами смщ и моих мою ра ж пуд вже межам от щас Ж жо сл ци КЗ оЗКо Кто За сс жо Вс ср ра Ка хх с зх ситу рак Сх бух Мк - е зд «за емричх Ух кі ох бурж см у р іх бує ЗКУ с а ОКО томі бра бер р Дух

За їм жежЖ ТУЮ бе аа був УЗ Бе Або ей б тво ТЕ жу Я зв 30 пак СУ геї прафриа ди шк пуучую ккйеєю жави жиих воли Бета тихо вен суку у яхту є сут жи о совіж Кох тсуУд У щі ас Кс вишу с бе и бас ба оче з да чзе Зає ваЗ5 ВК їхав ху Мои ЖИВУ СС СК омухя ще Хе суди. ЖУК и КЕ ЗД тя Мк ГА жу У ж лом сао лою СТЕ іме йків ке УК ЛУК іа Бема Біла лце ПММ и М дж дже як зи ЕВ. а

Кжр их сміх фбузІМ сщоюи сут БЕ піпуєт о сир чин На НН урУжіж ІІ схе Уха кг

Пе сх пос вдо Вам ув я ик мм сер КТ смьа вера Аме ще Хв

Тех УЖ УМ у ня ки Ше пші Жощу а ВУ до ід оо ПО лю Ма доутию МЛК

Мем о НЕшЖ Бех й Буш ЗВ Був мем Наш іа ВВФе сах АК МУК КУ БУВ

ТЗ ка КА смій вчи жу ен ее че о с зпжфах дже тж дусі Жечух лудрето рез кв ву чт ск си КА пи що сс КМ Ж длих що км ве бю хх ос ср Ка тині жуехя Можу ДА, ва тм о БоАЗЯ чи т хшу вх ди и АК Курка а ше ЕХО МИ жа ваз БЕ ж АЖ МУ У АК ОМА ши ВК ЛУ ВЕ чо ме ох мово ее ских М ся вва зим ви сс ща ша Ак ВХ

Хол що АВ саомуч вх вх тах хіх фл М я жі Ж су Мих дУкує ТЗ у вч: Мтк ва віз вів шт Ку См БамО КУ її А аж Ю МЕМ АФК віч в АН -5а Я Яка ше иу хиф сви вриких фін ум. жує тр. симуйе суто сту а. жуУую ссср укщ ча жкЗ я Зо ско Фіви щимІ са ос с сшвЕ баб осн З 133 соку Мезху дич А 2) пе Ж ух у сх фі ку Ж дм вом Ах їні Ба ВЕЖ дів УВА АВ Нм ОХ НІВ МУ Вин х зх 475 а клем Ж Рух пра ає мохуї Пат жк Тоді. Жоюху МУжсну ХУ ЖХощшую Ж бат Жриу, ач ня

Вч плн ТК ойзВ Тв Сей ем Бею» Жхо» УВА їй Бем їн бжю ал. БКоО 4 ш щорх - ї КУ ЇВ їх

Ух 5 МУ хе х, о ої ср К- щ н . з й шо

Гл а ух у т тує 7 ї Дол ие я КО Ж ем Тбоусеко Х де Мюею 0 М жи Уж зЗру шеж Хв оСьу юр дів А спі су» дів бреа дкоу віч бо Ех тех

ЗЕ БУ зу

КУ У ща таж тоаву. Кр Ьри біу боцір сію ую Уміє «ера Же Зп енух сах ку У

Му хе сля ТЕЖ бів ем БуУ Бех Ту Бех шкО ув) жжюЮ 5 зай впех 3 Б 5 ре оду яр одо Втім Ж ує К хмуг Ту вх Там МО лю ми ум уки паж Ко нь мав ка з; З я ЗЕ Ва СІ З я КТ А ЗВ ЗІ У ЗМ З СЯ Та 1 г Жак Вже ШУуВ бо фо

В: З 4 ду р; в пом ок пк А Фк Сум суку біхжем даух СО їх Мр М св см ЇМ жу пах Ж мем У В МКул жМмМмх сииж ЗАЙ ЕМ ЛЕ ох дів АК Аж ша У жа МАЮ -- сук ху ке

ЗУ ЕК їх а жлоу ожічнию Що лює Мох Мах ХУ Ж я ка че Же дея юну МИ

ОБЖ г см КЕ ВО МІК мжЖК сх 3 БЕ Оу Кі Аза бец дк тах зо ще пишу АТ тод «здеїмо аю Ссфем Ж тугу щ мих сем вмре Коло жо зх че тову ех мер сш а швиан нН н нв на Н Н Н дк

ГУК віз фо Сув ТВ: ДКЗ до Тих Вів вко тп осСУв Аа ПКУ вав ЦЦез

І пи (Яни пул що ке КО;

Фо фр ж а Ше ча очи не зе о НШАчю З тних зе ВА: А Яя дів тТух Ну щЩеЖ лів аю нів У їі піс дер озна МКМ Зек даю иа я кое чок хх КІ нення жа: КО М

Міху їх заз ех Кохуєу Міхум ЕХ хх буде ЗУкюмо Ж Ме фіжн МЖчу ку кт ЛЬ жі авий сСув ек Був во» бБіУ БЖжОо Гах цех бі Бхо дж ах дя ЖВЖ бе зав те ти 130 МУ хе

Тесс» ау ую. їх З еї ї 35 ее Мои Шен о га 35 ї1Я3ї фокту ШЕ уї дудукі о мг я яти її Т жу т Мо йхуУху жо КО са у ваюЮ БЖ Оса ОА МІ ЕХ МЕМ о ОеЖ КУ Аа да СУ 85 ї5о 155 Бо 4 чи у Феосясидт. АХ ніжне Ж Ж Ж дак І ож на нь в а Но На Ха пла дух її аж ше Ва них АУМЕВ ХКЕ НК АН О ЯКА жи АБІС УЖ СХ чех уч ч кдд и М УЖ лах ви ХК щурі ХІМуду а ак омімухє Ух М шо пам дев СуМфуує КМ ср Мому ох хх Зк ож що вуду КУ ХО фу пофчи З О Фм її з ШУ». п Хо уз нів Су І ем рве щі Аве БжЖо вів без З тах вне тТБе Вав вла док зак ке 18 іде СО

Зм ко нан нШК І и Ен Не он я ННЯ ї о МУхеюку ау флихх яд ТІ Хо ахух

ВН зі жнНЕ СВ о цУВ УЮ бу ше із тїЖЕВ Вже Без ожіє ЗЕ вах; АНА «ке вч ги їЗ5 ЕХ 5 тека ок хнх хр ач піч чи ффоехму ЛЕ зе лу т фо Жуля юю ку Кк

ТУЖ їєма Беж Вл са Уві ТвЖ о Аше Тв Бу» Мал їн БВко сіу ек КЕ «ум пк сут с ї щи ян. 5 КК пе хр чи Х гу меч ам Сроклум Сну фу о шо Ж их ТМ С ких Акта Мк Ж м я йізв ТтТВж дів ОотТвЕж дек бущ їни ТЕ Ше щі Бе Бе о Ати ВБе с ЗО

З В ож Й тек 172 Ффху ї зх и чкху ті За МЛ Що деку Ач т. ся дм ТЕХ шуш их ВК ОбАХ му жк МЖК СКЛОМ хм ВкЄ М пе їхнМХ КК кмеХ я ха Кая

ТУ її 73 бух їіяк Км Том сук Три тр яю тіж Ж ДЯ у у МЛ шо сіху із Без ліз ДЕ МОЖКАТ НЕК ОО МУК ЛА Хе МУ се УМХ АУБ ВО КА Заіщ духи

Бена си кут

КУН хЕЕК Ка

Є Ж дм Б га бю КА пох тк Анна нен У ШО Ум

Зак Бей це Її ТЕКУ пу о Ууді Бех обфУ б1Б Нів Уві Зфо сіє с шт во хна

ТА ї ому Му жчи и. х хр ж и СИ хУпюї 1х-- Може АТ сх ху КА ск Ман ха ди

МИ Її воду же г МО ШВЕ ЖК Ах ло жі УК БАЗ У 51 М Ку МУ Х

КН хом за

М «КАХ ЗИ жо аз слу Мр т Золеете ВЯші ру пері фильяя ЯКАСЬ УЖ ну зн їз кору їж ЖпЖ Він: Бі чаї ВХ що МН шко блю су ув УЗА М ЛАВ ОМ пелі су ТУЖе зр ке ср зОо5 о ЗА ЗО

С ож КУ аня А де ОКЯ Кк ще МУ жає ве т еко о їх Уж я ат КУ УМ ас Же дЕшюв Ак Ав бек Філ бу Бе Тек Бенц Сбев бен Ак СКУ був Вже Ти 35 ВК 335 хо Кт У у ксхч си М п - ооо НН Не о МО НИ Єбдусух Де ви бю їла Ж Аж ЗМІЮ ВУв зЗіз йщів Бі Ак Обл ЯМУ Аіж біз Бех кеш зо ау 5 кож Ж чу Ки лу ие ен ою Ж ЄЄегах о Жим Ек І сю оку Тур жи а ажч да Во ів Аза Лів Бек о бБкО Бшх БкОо ду ва БбкєОм са жах БОє 355 зви зе кує стяг 21 кур у рах и ОТУТ я обжмио ких Кам Зохеше. Жоєхід Жату Ж хх

ГЕ жо Я У Зі Тве Вів Саії вів Гу ЖОДЕН Мх 5.3. У Хв БЖ УА ЗХ о ЗЕ БЖ вх ок сад тм сом ху, сь Ко Фаза ому т офц Мкуми а Ту Можу: даю цей жує тую ім ві Св Зі Ве ду їж лена ТВ Таж Бу Ди з аа ла що та Ви» вне Ти їй ів вів тую ЖУК вія ре осіо АВ ЗКУ Був омМек

НЯ о С тож, УЕойх Фа ах й «Ж МА Поожхю. отут і З поки УТ г КМ дж З чн описи т - їшмх Наш ше дат Не х у мух їжн ОВ о фена бе БР ЖЕ З Їх ге 53 Не

Жолкзя Та дож фухии Ж у Жука Жах же дж КУМ стаю ємо аку Мою т ем ото Бер око дів Ка о бем тує Буш А ЗВ Ку сеЖж БЕХ ЖлХ МІ ен Ло не чНЯ чу ПУ км пк их и ж тони Ж ах у г ТЕ ко ух с

Вів із Вів Ах у СЕУ БЕ І ЗМО МУш дп Ж Бек ов сша ЛяЮ

МИ 55 зе

Зк М Її ку Ем вх Зї4 ж: її 45 МО хм. ЩЕЗ -х Ж я ТІ їм Зах цех Во ча Ями ВОНО БЕ НМ я Нлх ж о ря «2105 9 «2115 115 «212» Білок 213» Штучний «220» «2235» МН 59 «220» «221» тівс Тїєаште «222» (62)..(62) «223» Хаа може бути будь-якою амінокислотою, що зустрічається у природі «400» 9

Ух КЕ ТЗ жо 12 пе Ки КЛ Гасичя ЛЕ З -кУ вч КМТ жк ЛЕ Си сіб чаї зіЗз ей Уві за Бех важ ві бу ем У са ежЖО пу ех

Х І 10 15 ех обо Пул о їжа Шек бух Уві Аз шех ську Бі бах Бе ее бе тТуУух о й КІ пу Мер ода ЖжюЮ Ті ВеФф па іа вхо БЕ Був Шу жи б ЖК я

Су МеБ їз тек ТУЮ Ав беж пек ім Бе о Вів бує Вів Ха ех зу що Бе Ба

БУ о сіуУу БкЗ ве ТЕ діє бЕех АКа одЕр см пах Бе вай Яга УК

БЕ ТВ ау що я НА НН Сич Жосх Ка ОН Тустиюаи о Зфчдх СТ не кн На ча яка: Меб дае пежє Їжа» Вк меж і юю ТНЖ Аза іє ТУк буж Суд вк за ку

Сан хг паж и ння ня бурею ММ шле Зрючуих Ср В ж Ж ще ЇХ ху 1. дм ху сур дію був «БУ ЗБЖ ТВ Вже вжо БУХ ЖЕжЕ ФУ сив шк УВУ меш УВО жщЕ їай ща Мо

Ма ї дек дек їЖ5 «210510 «2115113 «212» Білок «213» Штучний «220» «223» МІ 5Е9 «4005 10 ч З. М у-я т х т га ща Гак нву сир сдя Син АНІ Ту сон сек ВН бу их трос ххх

Яанх щі Уві іїзм Ти ша тТвж Ба Уві шеК бе; беж УВа ТМ Бей осгу

Ма» аїів Мія пех Ме Бех був АЖе дех щеє сь шех ТУБм сій ТУЄ Ех

Ваш осле ТУЮ ТВЖ Ба б пій хе бБе ої 3 пу Вк су а Веш

Бо сі бом ії жів Ту 016 УВаю пЕжх лаз бхз Бе Бех шк МВ во 5 5 5 дею вх Вів Ті цПіу бек Біє Кеж бі Жве Вер о Бе вх ій) їлю Те

Шек о дже Уві пана Бо сх вер Бер оу ві Тую ТУЮ Сув о Бім Ей дів 5 за з тТвк нів дир БЕ їм: тах Бе Бу Мех Фі БЕ сама їж БА Же дух 155 МОБ ке

Аг9 -2105 11 -2115 330 «212» Білок «213» Штучний «220» «223» Константна ділянка Ід гамма-1 «4005 11

СН «ха ТЕ. Ж жук Є жк фрьки своя таж Суб а Сто ложку ку ха Тк

Віз ех бак бу є Мо ба же ЕОМ ІМ вМшжш джмх ЯК жк» меж се БУВ з й і-ї як ке х Ки Ом

Ух су СК ня Кк Ка КТ жи рю М Жов ач схо зах ши и чШЬ ач У ху Ммуу чує їтвк їх ек зі пі їх Віа Зі бен о Бере Су Бей уза ме Ар оУЄк ми «ре ох

Ку й Кк їхічак Ж уУ гак Юм ДН Мф ЗТ Як сту их Сила ж щу жд СВ ук вае Вко Са В Ущі Те о Ущі шШех Жжр АВТ; ОВК ек Віа фен жпж ше пе г да

Б ви й хт ж ех че нн Ж МЛ дю ЗА та їжу иа Мр ТЯ юю шля Трюмує Ку щу ві хе ЇВ БОбЄє ху Баш Мао їжа см ек сх ж Бен тек ен ще моде шо

КЗ: ХО -х см (Же у ДЕ ки Чи зму Тучіих Еровує сви ик Ж ошув, Ка шк рт В, х

Бач дех нак УА У ЯжМЕ ВІЛ мЖжю шк ШЕ ЖЕК ЯМ АХ ж БАЗ ЖЖ ОКХ

Я тег вх за

З ЕК б їм тую ЛТ ТМ: ЖЖ хи Уж я ам Ху уж Фтишсюи ому ПЛІХМ хе чоти лу бик Стохкти

Тк тів Суд АВ ві зва пз БУВ КО Беж АВ оСТВО був зва вою УК ка хх ке Зц

ЇЙ ме по ож ик вч Си руку Соя ких о іє жука іх Є охжху МТюуяе Зі ХО УМ Мк. Жим Кк

ПЕ ОКе НН щі ща вх УКЛ ЗЕ МК Х КЗ ому А потнІіщвВ пе З вою КК СУ В ти «ем «чу

МОЗ КАХ Іо

Тегі іще (13: Там Тихі: їЗ Зах їх кт брюк їх щі ве и кім Ба їлухУ

ЖЕ ля БЖ шу фа УМ МУ Ма ЕК ж У Ж ж КНУ ЮК ху дом'же шк доежк:

МА їх їи5

Ж дух уч Тобекх огУЄ ця Же Лиш сих ух бух. рух ми г З чо лу тк Ук

Був Бус БУЄ АВБ ТМНжЖ Пе) мес міш бек п лйас ВкО аа У дах ув ям ла Фо що М МЕ хв ху г сх І фам см (я ху Тл її І; ча ле 3 Я лем ЖМнио ому сх

Уві чі У да Уві пек бів іо ев еко са Уі був Бе одавоОтхо в іо 155 о біт ат ож. ГІ БЖ Кт и 12325 лох нн вн в НО НО

АМХ ОВ ОАЕ Ах Ех ш щі МАО ЖИМ МБ схе «ех ЛУ АВК му БЖ АЖ її що щу шоу

ККУ што КЯКБ

Тр і жк суху дк ауу сш Ж Трах фут ху Ес рух ху і окт че ВЕ 3 и

Ма Б Ух вк мех бнУ жк вк Уві Уа Бек ов і бле Уві км

Ті ч о у Мву Ж юшка г Ух Тс ух Мі фут ек тони «Хиккх стік

М Ед ТІ АК Ми АМІЛК 1 м ук АМОАКЮ ГУ щОАУЮ ау КА ЖЕ а п з вт г тут ях о Ох

ЧФовю Лях оехх те ЩО у ж яти І чех фу слуху божу ПУ ую Кожух мА жу

Було Мі їм БЮ Віз БЕе Те бе Бущ ле тів шах МеВ о ді Ст шу ер як тут

КАМ ші ких М

Тл ую Ту бус єю ОБУ перо Хр Же оку Фужни Же (ух Меею КУ ЇМ лів бо вх сіл вхо баб оче тую жвж бей вкОо ко пек вже св оса

Ук зай з зай як кл кое ма

Маск. Уж М охукУ су ХА я тлі шк Томат сИМає мем томат т баси, Єбрях З Чпмує зве ждпх МУ бли с Уа БЖ ба ЩІК СУМЩ їжид УВА Мух КУ КУ ДУХ

Мч Керн «Ка я и ха

Кжо ек йде» їі Віз З ЗО жквол)м о бек дав ЗУ ів Бжо ах вва вай вав в'я дж Тех Буш Ж Тв ВЕОМ бує Уві Ошу дв Бет дероєк У мех БК пив

МУ зва вай та сег с. де Ж рим пос с нн Фе З ча ток сви ем р аа ж гр де ещхи

Те Тук дек їн о жи ТК УВА АВОо фу ех ка Тв бів оса ОКУ геть а 35 аа у. Що Як ж. ях. Ж Я КУ ух . т. ух. ух Том жо їх ту т я ке Кх тра ких. хже зу твА Мі: бек осСую бек дю МеЄ Цівосій із бен Нош мМ Не ТбУХ ЖИ ет у моди ах дн п ж в Му ру тях сте їв му как М КшХ НМ КК КЕ Ам Ту ІЗ за5 3 «210512 «2115» 330 «212» Білок 213» Штучний «220» «223» Мутант константної ділянки Ід гамма-1 «400» 12 ч Вч с -к- иа Ж окоюи 7 2 ау ех пш пе ло ах т ох Ак; ня веж я Ге ох кожи ів Зеж Жах Цут су ЕКО щеЖ УВА ше бюо ії ВІВ жо Щек ех Бе ї І 1 Б си су ех ум ря МУ ди Хе хх Умх ХА ле тхххсв о Жихіх що жк Му Мах аж 3 Бех ше ку СКК ОА ВЬ да щем шву МУШУ БЕЖ ДАЕ ї УЖ и я зе

ТУ прлиу. Бен їни Ху хпвуую р мо СПЕ дк фату дим Кр М 3 хх щк хтефучю. М

ЕР Бо Зав вже УВІ ТИЖ Маї ех тбко бах беж щіу Дія їм) Теж бех 3 о 5

Ул ж мус ОУдок лууию Мдам 0 Ху ше сх томах СХ хе сажки ак ту Пи ик ах

ЗіУу Уві Ні Твке ве рко діа Уві їжа бів бек Беж і БбевотбУую Бех щи пе О щ- м Те. ще Му аж о ана и КУ же Ст ще жк ж Є жили КАЧА я на в учи чНн ни - пух ж іши Вех ех Уві Узі ЖЕ УВУ Бхб Бек снах їж лим ую Та сх Но: те ЖЕ Су Вшю Уа АВ ів му ВХ Мех Ав ТУ Був та ЗЕ о Пув ще що | 5 оду У и ле для уд М де МА ту. ох ха и я ни и тка пу м ке їв ма шк леж МУухь ОшЕ Оу Ар Ух Таж ОА вом СУ МУ ж кіх Ж жи чу я 11 05 МО вт ЗУ ЛК кютх о ня ще рю ук кухни Фо Му теж Ж Стіна ШУМ суку Как

Бко ВЛ БВжО ЗР Аів дов шу З3Уу Вр ех Уа БОБ Сея Ве бу вКе зх У я

ККУ Кен ак това Жду тож и Ж овдкує пвх ток Мих ЗДУ ЧУ рук Жузес В Я хх Тк М жкох

Ту ЖЖ му ЗЕ вк бо Мекотїів дек де ре Тл вс са Уві ах Є КУ не МУ її

ХЕ А См ше ТУ жк ЕХ умо ХО КК уся ГЗАЖННКІ чт тож їзічню стоку СТ ча У М, дощ Чай Бек Щі и Да Мо БЖе ФА УА м вІУНЕ ММ ЖЕ

Тржуут ВЕ Щклу сади МЕ щ ха жи че Уа Товт РУ Жов Мк Же КАХ

ГУК чУві Вр біу Уві Бін Уві Ні Ба) АВ пув Жах Був Бже АуФ сах ї55 та ІЛ р ше в З в НК яку им УЮ то Му 32 Яма жен и ко ня ОК дик. бек ВЕ шк Кт У і чважк пек Уві рей бю Заі Жива

В кВ То а ние Тк я ж ожжі М Ки ст как МІ г ши нн жо у м не пів ос Ах їЗ Вк Ки вен Аве керу аж 1. ож Уж ау киУж: ау сті ех АВ грх зима зп яв АС Ме й КО. Зо Кін ие З -- Чо 1 пи ту ть ї, лет Те: Ту ря То ї сх ка ги їуув Аїа їжі БкО дів ХО їі іа Був Ти їТіє пек був Лів пув ЗКУ

ЯК щі вай хр тТжелям. бекон Ж я бхшчния Ж у и тимусу ра жк тн Фурулим; ев учи СХ сь

З ів вже Ач са Бео а маі Тек Тк бе) Вже Бхо ек бкш са КЗ я о ОХ пе си ах Ж кух Ту кож реа че щен Жид СБ. ТКУ ут пк Ко Ще Тотулх З ко ВІВ ср мес тТвк був дать Зі аю Бех їм ЖВЕ МУ Лимх в А ву па БД ух ес як чай джує конк ШИ іх хх У тру ТЯ забою Ме ххх жур пуху З и мая бхе шк вве щіе дів УВК сам жк с Щек дай спжу З10 БУЄ ша Ба

ЯКО 5 ж біжу Сех Тож М Же Тукнуу фею т ошхут А г Фев Маму Ка о жнсузо Бум РЕ

ЕН ОС УЖ БЕЖ НК жа вже БЕЖ УВА БМ а ше ЕМ Б АУ ме ке БІМЕ тохая сжжах сббом є Жодмо й с. 2ЮКюує. ХК Момю Хосхту сб3ак ух Мч схе та Ку ху Соя м КУ КО Му ТА ЖК О В В БУ жк пЕщ КжЖЕ сулЛю ма ше ДАВ що З КИ де Кткуех Хо йти и тю каже Жак ОМ Зам жк бХомуу (ра схо Тр шо

ЕК БОМ ах СЛУ КЕ кУчиК чва мк ка с ща ХУ ів ли ніх Ст З дих сег т зх соту

Зп ІВ З за

Кл с жолихх ке У Тех Фо йду Же тки Ж жк

За» му ес їм щехк ем Беж Его бу БУВ

Вк ОХ З вс М «2105 13 «2115 106 «212» Білок 213» Штучний «220» «223» Константна ділянка Ід каппа «4005 13 тра хе Вк кожи пек и Кф ЖУА пек СК то и уми фзхмимо тлу аж М ск

По ал іа вію Бо бек б Бе її Кве Бо вх бек дек БІ М ії У 10 5

Хода. орех Жим КМ ж УК я Кк шк ХК сх кмЖ ж тях Ум Ж жи Може ех рук

Ммеф бук Беж ЇМ Жах вів ВеЖ В. ТО Св осбев бе) дви лак Бім УЖ 2 25 48

Фу З М А дожив Ей у ху І Мс:зк Мк Ля їх кн

КО що см Дів МмУуш УВО ЗВ ОХКЮ ге щоМмело М МОВ ЮА ви БК хх 35 Я Я

ККУ жа Кия КЕ жу и дян М дпулих тлу гм т ко дови ЗМешат Ж жи М каже «хи ух ке піу жі Бек сплю Зіч Бек ові ТвЕ біо ста Бер Бек БУ Авжеж ВЕ туру Му ока Ск Міаум Ж то пью хх дж Ж оню ОВ гу сади КМ ач Ж ху

УК ши мим ою ЗХ КК ОБ Сх п МБ ж ух КЕН ле КУ хакі АВ а ЗЕ це реж боже Та тучр их Як гля й жо жу скул Уа ТТ я Ж ж теж ух, дж ОА ни

Мія БУш УВІ Тек дів Ст іє бві' ТМ ніз сін іє ем Бек ШЕЖ ска

Х і; і; ; В:

З З за тяж сюфах аж щу Ж жу Мох у хх тя хх

УВА ВИЖ був Бех ШЕФ дев да сфе са Су по Та «210» 14 «2115105 5 «212» Білок 213» Штучний «220» «223» Константна ділянка Ід лямбда «400» 14 аа а о ни НН ЧИ НО А Кошова. век «4 суші жу кухня хи би я піш рЕсо бе о ів Вів вхо бек так Тв їв БМе бко бю бек обдеж Згу ї х КІ ї5 ом ож Стр я ую ож М стен у их чл ех ке бок Ж ну бижя Мгх то пон ев сам Або ашакв о БУВ вла ЖжнЖ їев УВА Се Бец о фіє дек о Авро вне ках ТЕЖ тп «м Кз 5 «У Но тік ах у піку КО ее шк чИ ЧЛ юс Хочу ожкк А Зо Межа уж арх Ж

Тк Вюб бі Віз Уві ЖТВх Уві ів Сх» МУв віз Авюв Бех дах вхо Уві а В лу жук " м Ук. веж Гл Ук ня У Ге ФІ щ- з пит, Мн оси пок е Не щ- Зоюткжя К ж " пк бево ові бі ува осів ти жі ТВ Бо бекобув бід Бех бах ба Бу ще дк ях шу М З ше З ї Ж шум Ко и ет чиє ШО «У А. тс : ре. гЯ ча міх МЛ Ух МЕ леж как аМ Аня

ТУук Мін Аїв беж Бех УЮ Беб Зах їм ТВвЕ вхо З) Зі жк о Буйо ех

ЖЕ Ху ех беж Ж км КМ вч Же Су ах и: вл ху Ж М у и

МмакОоЖУ мех уж Мак МОЖ АЖ УК СХ ща КРОС АХ ХО м ма

ЖЖ ПУ сн ОА Кене х т ке сх ТАЖ їжа я; с ук тик Уві де рах св під Є ЕКОН К дк док

ЧНУ АА

«210515 «2115» 30 «212» Білок «213» Штучний

«223» МНЗ-48/УНЗ ЕН «4005 15 ші Уві Фіз без У ба бех щу пі сЗРУ б Узі сів БЖ БУЄ Ту

Щек їж дя бем Бек сбую ів дів дек ЗУ ББШне Тв вве о Бек «2105 16 «2115 14 «212» Білок 213» Штучний «220» «2235» УНЗ-48/9НЗ ЕН2 «4005 16 тТкв о Уві ка із Аів Ве пі бУв Між ев Б ЖЕ ув пвх ї їх 35 «2105 17 «2115 32 «212» Білок «213» Штучний «220» «223» МНЗ-48/9НЗ ЕНЗ «4005 17

Ага бе Тв їівз ЗезкК джу Аюо АВ Обі був баз Бек ба тую іа світ» ї 5 ТЗ ї5

Має Ар Век о цев Ач баб піз юю ТУ Ві Мі їж бух Св АВ Дол ве я 35 2105» 18 «2115 11 «212» Білок 213» Штучний «220» «223» МНЗ-49/УН3 ЕНА «4005» 18

Тув чі бів Бі» ТБ Меб ве Тих Уві пеж ех ї З хо «2105 19 «2115 11 «212» Білок «213» Штучний «220» «2235» УНЗ-48/9НА ЕН «4005» 19

Тер» Зі» ів БШіу ТМЖж Ше) Заї ТВ бві бат пек

Ко й ЕЕ -2105» 20 «2115 11 «212» Білок 213» Штучний «220» «2235» МНЗ-48/9Нб6 ЕНА «400» 20

Тк сі із бі ТВ ТтТвЕ Уві ТМ: Уві Бех Бек ї ві о «-2105 21 «2115 30 «212» Білок

213» Штучний «223» МНЗ-33/УНб ЕН «4005» 21 зіз УЖЕ ша Бей бе зЗіб Щек су бі шву Уві Уві лів БО пі Ах ї х Її ІВ

Шеж ії дж ев; беж Су МЕ Аа дексу БМпе ТтТвх ре ех р 5 БЖ «2105 22 «2115 14 «212» Білок 213» Штучний «220» «223» МНЗ-33/9Нб ЕН2 «4005» 22 тТхв ув Дюка сіл Але вжо бу Бу суку їж а Жквом Аа «2105 23 «2115 32 «212» Білок 213» Штучний «220» «223» МНЗ-33/9УНб ЕНЗ «400» 23

АюФч Бе тик Ті ек АюЕЧ о даму Бе У Ва оте пев Ту їжа се 3 М а ня

Ме АсОе пцекК їм. БК діа біб вве ТЕ дів Уувь теє Тех Сув ВІВ дер 20 25 за «2105» 24 «2115 30 «212» Білок «213» Штучний «220» «223» МНЗ-23/УНЗ ЕН «400» 24 пів очі сіб ії; їй Олю Щеж бі СУ лу без ХВ. ОХ Бі бі СКУ

Ше Зими Меч їх ек Су Вів ів сек бу ББе тех ші Є «2105 25 «2115 14 «212» Білок 213» Штучний «220» «223» МНЗ-23/9НЗ ЕН2 «4005» 25

Тхв Уяі ву Сів Аїв о рео ОКУ мув о сфУ їмму СЯ ТК о Заї цею ї 5 І «-2105» 26 «2115 32 «212» Білок 213» Штучний «220» «223» МНЗ-23/9УНЗ ЕНЗ

«400» 26

Аж бее ТВх Тіз ех бе Аво ав бек цу жаехь ТВ Бей; бую дей бів ї х їд ї5

Ме дпм дек о бБев дує АТ Ов Аве ЖК Аля Узі тує ТУЮ Сув Аа ла де ЕЕ В «2105» 27 «2115 23 «212» Білок 213» Штучний «220» «223» А18/УК2 ЕНІ1 «4005» 27

Хар ошіє Уві Меї Тбк об ТВ кб Бе» ех ії ек УВІ ТВ Вк су ї 5 ЇВ 5 бів ко вів Зеаж жі Беж СВ що -2105» 28 «211515 «212» Білок 213» Штучний «220» «223» А18/УК2 ЕН2 «400» 28

ТЕ Тех бе ЗТ Буш Бео Фу сь Бек овкО ся ії ев ші тУЕ ї е БЖ ї5 «2105» 29 «2115 32 «212» Білок 213» Штучний «220» «223» А18/УК2 ЕНЗ «400» 29

Зі Уві бко даю Ак ве беж о ЗреУ бує бе дек побу беж о Аєр він ТВ ен їжа Жіе бех йку У сім Віз іч Ав узі бі Уві тек Жук Суз -2105» 30 «2115 11 «212» Білок

Зо «213» Штучний «220» «223» А18/УК2 ЕНА «400» 30 ве сі ів сіу Тих пу бана Б3О сів Мул Ака ї 5 Ії -2105 31 «2115 23 «212» Білок «213» Штучний «220» «223» А17/УК2 ЕНВІ1 «400» 31 дно Уві Уві Мет Так бів бек бує Беву бек бен Бо Уві ЖЖ о бец па

КЗ Ех Кі ї5

Віз Бко вів Бех ів Беж був ке «-2105 32 «211515 «212» Білок «213» Штучний «220» «223» А17/УК2 ЕН2 «4005 32 жтЕВОВОЄ Фа ос Ак бу піт Сл йеж БЕ Вже ДК ін же ТУК

Х у а 5 «2105 33 «2115 32 «212» Білок 213» Штучний «220» «223» А17/УК2 ЕВЗ «400» 33 сжу чак бко Авр вся Бе Бех ЗфБу меж буУ Меюх ФМ тВж Авю Бе ТВх

Х 5 Ж 5 іш їв бі меж Аке свф сліз віз бій Або уві Зі Уві гуУую тує Сук аа МУ І «2105» 34 «2115 115 «212» Білок 213» Штучний «220» «2235» МН 59 «400» 34 іш УЖЕ сів цем Уі сів беж Зі щі сфе їжи У М Вко ді бек беж обес; бум жи Зак оСую Уві Вів йеж сіїУу Ве ТвЕ о Мбе Бек Ав отТух ди 5 ке пі МЕ дам ТхвВ її Аз б Вів мо Шев о ба фу Бейосі ТЕ жів 35 ее Ех сі ей із тую тує дво Беж пек Бій Су НОш їТУхХ Аля дві ех УВІ

Зо 25 їй їв су Ак ре тв Кіє бе БУ Ав» деюж Се бує дай Вк фа ух вКе ЗЕ во рано мес Мам беж Без вкч век піз во ТВ лів са Ту тТух Суд

Ала був су Же Тр Бе ер жук ЖЖЮЕ жу (Фа ж Ущі Ме: Охваоікк жу Ма яко 1557 мо с КА сви У

Ма ве ке «2105 35 «2115115 «212» Білок 5 «213» Штучний «220» «223» МН 5Е9.1-5І «400» 35 сх Уві бе їж) Уа осі дек су біж Бвре фа Уві б Вуж ЗКУ іх х щу з В і ке Є КУ ЖЕ

Бек оцен о дтт ва бек Сук дів хів бек Бу Це Тв о вБре бек ек тек за З5 Кт ххх ши Мох ен Се Жуан ЖЖ ж Ж ку СК Ж як кову МУ я сш КК сіу Меє два отв Узі да ба вів Ех СЕУ був о ЄдУ БЕ зі тер ЄВУ

Пежо Ме се Тк Тух Ва бек бек сім Був Мій тТрж Ал дню бек жі в лу що їж су жа Кце т їіе деж Вже вет ап лів ув вжи йек фе ВУЄ 55 та ТЕ ВО

Перо МЖеб чиї бек о бе ЗкЗ барон дню їМк одів Щі жк ж Су пе що З вів БЕз БУ ТВ ТЕ рхє АвО о тек тТЕБОШіУ схе осквУу ах М: УА ЖВе

ВН Її 1153 св сим жу зх ех ЖЕ

ІВ

-2105» 36 «2115115 «212» Білок «213» Штучний «220» «223» МН 5Е9.2-ПІ «400» 36 зі УВІ Зі їже УВО ЗіЗ Бех се бе шіУу інн чеб сам Вже пу су

Х В о 15 ек їні БЕ бе) ек був Аїа Ала ше фу БНе ЩТВЕ Бе БЮ дао тує

Зі Меї йди бкоОо Заі дю із віз бу Сі їдеш Чім бе с Кв УВІ

Я С ж

Жах Ме ТРе Брю Жук ат йеж о йех ем бує Між бек ФМ ЖнуМ ж Уві 5 5

Мт сіУ ВБхз Бе ТВ із беж дет Мер Аз оКМія був дви бек гео тую їжа: ШІію Меї Зав Шах їн Ак Аню ОВО АЮ Жах Ат Маї фекоОтеюК сСУв й що ше із ВЕщ ЗКУ ТИХ Те Бхе АврвожжЕ Жхв ЗКУ см ШУ Ж їм. МВа Ве тва шеЖ Ме її5 -2105 37 «2115115 5 «212» Білок 213» Штучний «220» «223» МН 5Е9.3-01. «400» 37 зЗіз уаї зів йо уві іч дех сїіу Зіу піу бен Уві зів рхе пі Бі ск ї - соби бек р я су Р А яке рух Кей с к у

Зек йем Аха ей Бех Сув Аза Аів бек О1іу Ре Тк Ре цех Авіа о тух 0 В 30 с1іУ Меї АввооТкр о Уві Ак бів Зі Бхо Зіу Був сі ем То Ткр Узі

Беж Меб Хіз ТУк Тук Авр Бех бек с3а цув Нів Тухк Аза Авр Бех УВА 5 55 БО

Був 51 Ак Ве ТВх Їїбе Бах Акч Авр Ав» Аза бує два о йеж Пец ТУЖ

Бей бів МебЄ АвпоЗеюк бео Аке Авробій Ав» отв АвБа Уві Тук Тухк сСув 85 Зо за віз Ахч 0іУ ТнЖ Ж Бко Дер тукх Ткв пі Біб с іу Тв Тк Уві ТнНЕ 100 ща 19 уві Бех Бехє -2105» 38 «2115115 «212» Білок «213» Штучний «220» «223» МН 5Е9.4-51 «400» 38 сао Уві Зібз їжі УВК біс век сь сію врУ Увв уві За БО сжу Ба цес їжия Бк МБец Беж Сув ліз бі пек ЗКУ Ба таж Ббз Бех дай отує ке ша Зо спот Ме даб ТЕ Уяі Ак ші Ва ко перу бу ЗУЄ сем сіє Жеюро ха

Зк а 15

Ж Меб Те тТУук ТУ дер обех пек с): Св нів ТУ Бі АвВюЮ Бех Ущі щі 55 5 їшв Су ме Бі ТВ Тіє дек дЕщ йецо Я; бек Бук ода: ТЕ Мейо бух 5 та ТВ во

Сей ойів Меб дви обеюк бо вка Вів Зі фо ТВ іль ю тТУкК уж сут в ВІ З ків йдхч ФіУ ТВ Яр бко Вавотбує ЖкробіУу ім ЗДУ Ткнх Меб Уві ТВ

КО вп м

Уущі Бек па «2105» 39 «2115115 «212» Білок 213» Штучний «220» «223» МН 5Е9.5-П1 «400» 39

КОЖ хм тт З пе че Хе хх ли їх ху жу о пу УЖ аг щу пів щі цій їмо Ущі са дю с У шу му я зі СЕ Зі а жо З У ЕЗ х ї 5 Зх

Х В о ї5 ск. хм ожечим Кох о КУ НИ ня Сумки ЖЕ ом. СВ яті Тік ах «им ау Мч ау

Пеж Без вх їед век Суз дід Віз меж бе бе же бе веж демо тух зо зв 30

З хх Зої» ечНне сх З Хдчех БА ж М лу Женя Ж жк фдхию СЕ ях шт ан ни ша Ме; зЗзо їхр» о аі ко біз Біз Еко шт бує БРуУ Сем шо ЖК ві виЯне ВУ ах

Зп БІБ яю М зу Жах там ха дк буму 3 хи М кр АТ риту сою г дів Мей жа ТУЮ Тех вве беж ех Ся Му Мі ТУх Вів Ажю бек ко 5 БО

ПУВОСМУ Аку вне ТрЕ Ті Щек Ах дво два дес був АВ ОТНК їм ТК 5 а 7 Зо боаміх Ж ку думі: че Макао Тож ну Ах па ше оч НН ЯН пу Укра Брю фун їжма СМ Ме люм Бек Без вже Вів а дев тис Вів бі тек о туж св рук с. Сак х прах га них мо ША бр туулючух КЕ не кя г их нь о тур діа Зк МУ ТИЖ ТВ БЕОУ дво отТуЄ ТхО ЗУ Фів слу ЖЖ збе УВК ЖЕ

З ух я о що МОХ МО чав Бек ак

МАХ

«210» 40 «2115115 5 «212» Білок 213» Штучний «220» «р23» МН 5Е9.6-6І. «400» 40 и пе Ся Ос тож п. дк их Зм Ок сь С їх ЩІ и за я вч я Я жен із стві сіб їжи Уві біч Зек Бім У бі У УА. бія Вк ЗКУ ДЕ ї З ії 5 ож ни Ше Я Ху ТЕ г м в НА ее пе тУмУм М я Ми Катя

Бех Мем доз їла дек Су Вів вів пЕжЖ су Бе ТВо вНе беюо АБО тех жо 5 Зо с. У щ-с дай жо УЗ Ач Б Во фо су Хрев А М А АК УЖК В аеЯ

І: 5 МО к З че я я аа хо же

Між мекв Щі ТуУух тУуКю ВДвЕ беж Бех соло бУБВ МБ Тужю Вів Ажрожшвх в

З щ- Ме

КОН Уколдисик ЖК тк я ТО ж но НН НЯ а Ше А пої сту бек хх їв су вгз Бне ТЕ Хів бек АкЯ Авюв ою Бек Був Ав ожак маю Гуз їнма Зі Мек Хана Шах їж Дюка Ж Зі йзю Жак вла УМ тує тк дув

І кх за щі

Вів дк щіУ ТБх тТвЖж бко дво жжЕ ТхройафУ Зав ОКУ Жак те ме що 05 Мо чаї Бек щеЖ «2105» 41 «2115115 «212» Білок «213» Штучний «220» «223» МН 5Е9.7-І «4005 41 я Ж й ку о бот ТТ пижмо Как ха тах тих: 425 б Хижі ях зу увк аю без лей мам Бек оз ЖЖуУ ЗУє пеєб уві 3 КЖже У БУ ї во що ї5 шу Мам М де с жовхіу пі соус. є ке Стати ра їжа м са ду Мч фа Можу Лк пек оїйем Ах їм Шекє Сев із Вів Беж сЯу Ве ТЕ біБє бек зах Тух ж вн 38 ку МеЄс дев оЖквЕ Уві дез із дів БЕ БУ Був МУ Ба ЗІ о жКв тах

ЗВ ща 5 беж Ме ше Теж Тек вав беж дек осі Бе нів Ту Аівз дю беж Маї в БУХ 0 був о БіУ БкЗз Бре Хе жів Бек Ах АБЮ Аа бек Бев Вам ТБ їжи Щух ки ня Ей жа гіда ЖК мож тс КЕ на і НН ТЕЖ ур кю Тим КК їм бій МБ Зв оїйеюк без Кз Вів (14 Ав отв дів зва тую тек ев 5 Зо ЗЕ х ях. Хі емє Мр Кук чо а но но КВ НЕ НИ ди и ПЕ

Кіш Був пу ТИЖ ТВх во юр жУХ бКЮОсУ БІБ ОЄКУ Же Ве МЕ Кх 188 їо5 М

УВА ЩХ МЕЖ

«2105» 42 «2115115 «212» Білок 213» Штучний 15 «220» «223» МН 5Е9.8-С1 «400» 42 пк г. СА т т ет се Кік чу У ря тод З (я бен, Так ЕЛ хе шля УщЖЬ сіб їм інн 10 Беж сі зе ШЕУ дме хв сів Бус ую БУу

М в З її

Бек оїнму Аж їо дек Суд о Адсе Вів беж СУ Бе Мк Бе сек Зах Ту

Ух Кук Ману сю С х пкоулиж я м що ЕК «жур ух жу як утахх УЖ Ах зх «у зі МеК лю ЖК УВА дю сію За БЕЗ оОБУ Ге Бу їжа Зі те Зв аю лих ЗХ ех фуух о СМ СМ ож Стенлі ої й «254 5 НУ з - ях КО дюм о ху нех о Мек жів Тех Тук дев Яеж век СБ Був Нів Тух ів дв Вес Узі

І БВ шО

Ж ххжх ся щрахеу Жим рах ЛЯ ду. ух дове Мащу о Момчух Си м сія Мер Хр я Тонкі Ки

МУ М ЕчЧ кіш СКК дія ке ТК вер ЗАШЕ ЮК мух М плобец хх їжею сік Меб і Беж без дк Віз сіз бЕротТах АТ УВО ТЕ рух сСув

Аз пох а жен у би ТІ яхту бфтуну Сх Ж У ях Мія п вач тех дів Буш ЗКУ ТВах тах Еко вао Тк отТтв о Бій Зі Тих їжи СВ ОББх 109 5 Ко тв Бек Бех

ККЗ

«2105 43 «2115115 «212» Білок «213» Штучний «220» «223» МН 5Е9.9-С1. «400» 43 пі Уві сію їв фжм бів беж оф Зіу іт іль Уві сх Біо ск У Ру «і, ОМ ДА с У ення зе Х ї ЕХ Хі. ах ях кА ху ї В 1 ї5

Соя Коках Зрсютеч Жскут оо нан 5-х Жов у МС О Жу у тхір: бу од ючи аеЖ о без МОЗ Їм) ЗеЖОсСУВ Ва вн сах їйу БІ Жвх ЖІН Бек СЕ ОКУ Х

ШК реч їх кА Я З

ЗУ Мас вав ожкв У ди Бі діз Бе іє Бе ОБУ бер; см. кр; Уві од они ни ше бен брчеує Мом ух пря Мк я тож Дт ск А Хо ле ек ше зе ТУЮ ЧМжЖХ Ввю пек пек бів був НЖе Тук Віа бвю щех УВА

ВО 55 о

МуУБ' ЗУ ВЕч ЕН ТЕ ЗіБ Бех Кт вав» ази бек о бує бе Же бе бух ва КК: 5 й цес їх Ме дя бек о їм БкЗ ві біо дев Те АТа аж бю Жуж СВ ке сша Я ух у о Ку А Жах М іму М хо су КК юх Ку у ли ку ру ж ур ж

Аїв Був су ЖВЖЕ жах Бо Аве тує ЖК ща ЗК ЗКУ Таж Трюе бжх ТВх о а МО

Кф ФЕМ 1 о миши ЗАМ Є ДУ «210» 44 «2115113 «212» Білок 213» Штучний

«223» МІ 5Е9.1-П8|. «400» 44 ик тую вені Фдсме МЖу ки лу Мам Ме, Коди КД сулюх богу Фе й Фу ше Ми их ж

Зав щштїе Уві Ме Так бів ТБ КО без Шек єм Шек УА Тве Бк се кл ІЗ «ЧК Я СУЯ же г Ки Щлєвж сем ик сах Ж мух ЄМ за бражки Ккуу оЕОо дів дек бів Бех Сук ве паж Бех бів ЗБ Бех іа» ГУК Чех ки 5 та поеку и ки Ж юмор Ск ож СД Фрукт Мф уинния Кок ч КМ ще хом ке ж Ех йххм ж

АвюошауУ УЖ Ви Бе ем ЩО Тез ТУук Ка чув Се жо БУ ім ек

Фукия М ах я Ж ск жд Маю Мая Уж У яЖ дал -- на о НН НО Шу УК жо ів Гец бею лі Тек БІБ Ов. бек бу вжж Бе Бек СУ Укі ко

Аво АХ бле беж щі беж піу ех Ту ТвжЖ дев оБце тв Бен був Же жк У пече не и жна не НА ух ЖЖ ж СС нь у трав Муха жМувеюк Мб. ЛЬ ЗК

Зк вка Узі біб ді с Ав оСбаї собу Уві ТУЮ Тук був ве (а о АТа муху С У ек Маємо фі тую Ту мас мл У « дек і чу У р лву ам Може

ТБУ нів ДеаровВхсо ім. ТВХ бе У Віз слу ТЕБЕ був Без З ТО був ївО ЩЕ їо 5 2105» 45 «2115113 «212» Білок «213» Штучний «220» «223» МІ 5Е9.2-081 «400» 45

Вар уаї лад мекв ТНЕ біз Бех БКо їм Бех Мей Бе ЗБК ОТ бе се ї З яз: 15

Бі Бо дів Бех іє Бе був о йке ех ек Сх йежж Бе ба тую Бех ож шт ую туту Жах Же т секс тк Кк Ж ух стих «ших ни и НА с пух дво оБХУ тую ЖВК БОБ Сей обу тЕЮ Бе біп бій дз БО ду сл Бех

В. о Ж

Жіноче тех б'юну юку лах хе ох вх зр га аж ую Кл дуеквк, рю аж Аж без фі Тук зла Уві бек Ав АкуУ ББе йеу Фі» Уві вКО ща За 5 ц с я ух со ом М че суто ск уник ЖК чо ВИ М ек о гону Кв ав» вха Біе беж сі бек Зі беж зе ТВ БВ бе ТВХ Бей Ббуз КЕ

БУ то 7 50

Сік Щюжеум жу Чом Жду лу екшен туту жо Ук б'є ут Ура С у чаш век Ак Уві сі вів зі лев чаї сі Уві ТУЮ бує СУ Бе са щу.

БВ Я

У» НЕ КУ Живе Жуже Жодне ВУ я дм шою ЖИ жЖосжжжх ое чу я тож

Тв: Ні два о Бюз» Беца ТВ Бе слу СОЮ се Твк Буш цею (За Кіє був що ЯН 115

Ж

«2105» 46 «2115 113 5 «212» Білок 213» Штучний «220» «223» МІ 5Е9.3-1 «400» 46 усу Ук м. ХЛ Сбдутих Кі ток же ННЯ спеку Іл м ж т м ЗАНЯ ер УЗВЕ Уві Меб їТвх щі бек рЕОЇ бе о щех мм) Бо чай же фам су

З ве 15 їх ою жо бум т ор ек схике Ук моєю ЖЖажаю о Жкю ЕЛ хх Фтсулюх Си. їж дя их б зі Бк дів спежЖ ів Бех Св вх беж Чек осв бек це ія Туш Беж

ЯН їй т т КУ Я нюх ее гм: Б ж Сток Пен а на Не дво сі ТЖЕ ТВх о бінбіяжм пе о тТкКю Тух ем ша му вхо су ків Бех ах що 2 рульки Тл пожежа Я шо йно ві ХА о буцчю ізу: М ші ЖНахе бочлає їх в 4 Теж

БВжоОо сів цен оїчю Те ТУуж ім ом сеж Аер олюФ вів са аж УЕО БХОе муж жошегях КІ ху ач, сою о сЖшни Й Є ем С я траси Моск іх Ма сш Я е члр

Вас Ас Ве бек і бек бі бВех ОЩіуУу ТТН Аво Ве ТУ їв о Був ів

Б Я Ту що ее ША Си ль и ша о о яв Уч ко зл Мхудах кл М я Же Ж КОЖЕН

Зак дхщ Уні Зі дів ін дер осві пі Увж тТух Тек Сув Бе 0105 лів

В Ж З

Са у СК ум ку сльсяще Ех х Ура и Жах мл ку ж и нн в НН Фк М горе

ТЕ Нів Аер Бхо бе ТЕ Бе Фу ав ошКУ Твк ому Бебобів жа бук 05 Зо Що

ЛАК

«2105» 47 «2115115 «212» Білок

«213» Штучний «223» МН пБЕ9.1 «400» 47 січ УВІ Ей о бїже УВу пі бек оске су СОУ ВЕ Уві се оСкКО сб3У де

Х 5 їй З ек без) Аха їжа» Шек Стув Аза азів бек зі БМНе Те рРВе Щек Авваотує і мес дво Тк Ук йхцч біз іа ШВко Зфу Бра ву СОевобіьн Ткв о УВІ

Зх чо 5

Вів ВЕЖ ТО тую УЮ Ми» Шеж Бек З БУВ Б бух АЛЕ Аг аж Уві. 5 па пи ув обіу а рез о ТБк ів дек ака дю дез Бех був Ава ТЕ дей тек

БА ТО 75 о їв ос Мебє Авоа ше ео Ак дів ЗІ; йжю ЖТОПУ дів ві тТук Ту сСУув

Віз Вхз Зі Жах таж вхо дев ОтТУЮ ЖюБ ОСІ сія ЗУ Те Меб Уа ве

Ок кяКе Ко зві Беж Щек 115 -2105» 48 «2115115 «212» Білок «213» Штучний «220» «223» МН пБЕ9.2 «400» 48 сіє Ме (ах бе кі Є 8еж Фі у зу ча Ма ж ко Оу жо

Беж бю Доу та Бек Су ів Дів дек біуУу Бе ТБУ БОБ бек депо жУк

Кіа Мих о моля ех Зх Мн зу о Дю: м сту З я Кок Я аорту р су вше дам оОСКЖИ да лк сів ІВ Бу ФУ мУВБ сюу їв шо жже ОК жо 5

ГК су Ж су ау Мох сісхяє «ду Їх со ша нн Но ни НН НН НН зу Мас їТіє Тек Тую йеюр чех ех із БУ Мов о Тує Аз Ам Бет ув

Ж ВЕ шо пок МУЛ аю Тит жука кру зи С че 5 Ху км, ож льне що Кок Зони Ук не ж Ук

Мув зу хе ве ЇВ ождіз Бех АК зво Ав; о сдек Був Ав ота Бей тую топ Аж Кк Уже Фищих, т кв отих ЗУ я А НЕчЕЯ їх їх руч х що їх кю ах Три. ЄХу ках іні сів мес АвО паж ви зх пів сіб Вавр Та Мі За) тую Ук ув не за я

Ж от. Коси хм -х як СТЕ ся різ п Ту уж Сетю хи Ж учи МАЛ А АТ у ХУ ди ЧАчИЕч ніж жу

Зі пу сіУ ТВ теж РКО дз оОТуюЄ Те» о Зі зб с тТву Ме ові тре 100 що ЩО

У дек пвх 135 «210» 49 «2115 115 «220» «223» МН п5Е9.3 «400» 49 як кс. я « а ль У - ем дю ті «ж кое че Я уми Ем М ях чо сало без: тва сь бек «(15 ше ЗА цеб очаї бів вм офж шу ї В Я ї5 ге нн в НН НК НЯ що У я о нав нок АННУ ШАХ сумою А ух «жук ем їмед дк їни Бек обуж Вів дів ес сдіУу Бе їМпЖжЖ БОБ Ше ви Теж же 5 ЗО іс МаЕжЖ зи Сех ба вес іт діЗ Вт і бло (ЗУ їм; рогу а спиш Ме аа ж УВА Еф АВ вв сю АЖ Му Сюу НМА МАМ ДЕ Ух жи тої

Шеж Ме Тіс ТРЕК Тух Бко Бех Беж сі му Нів Тух Зі ем) ей В т я т ж і ук рус сн У Сем Щек ШУ Маму. тику З хх М тку ох тут

Був БіУ Вк КО ТнЕ Хі йех вже дво Ве беж Ппув о бвю б іа Тух 5 а їх но 5 чех ННЯ Я шо нн в и вин нн и В НН НК ер; бій Ме дер о дек бе бен АїВ біз Аве тТвх вів МАК Оотук тую сСув в ЩЕ МІХ ще . - кр мя мя ЖЕ Кока бруд фі А тм му МУжа о жрічи Вл ДВО хе

Айва Був Ку їх ТВ ВкО дво» ТУЮ ЖК Є Ба шу Трж Меб УЖ ВХ й ко Го й в ЖЕ ти ех зла

Кк ЗК що жк Фк Ж я ча ж ке 2105 50 «2115 115

«223» МН п5Е9.4 «4005» 50 г зх 4 ту тогіч їх реч Ул Сі ух жк МУ Ух хни ач УЖ ся Фени жу Ж ша У За бе Мел За шех сКуу Фі У Сем во са Вус і Су

Х 5 19 Ії ро Ше кН НИК саме Км Ве іх и За у ку Ук СКК ан че пит ке ех ем ит ен Бек СУБ ді дів бек обу Бре їв БО беж Ага ТУ

Вр ж Ву й шк Єуткюуч ТУ сю ке й не к ук ех те ТЯ сосх ех. сту лаг ша мес АбБвиа їх іє дк сів Аве вБкО зу Бе ців їм Бім тк же 35 за з

УЖ ря вик Як СЕМ жче тТогу Жан бик поки І тям АС я хх ух Фа уїсЕї ша Ме Тіз Тухє Буж до» Шех пек ші цуд Нів о тТук ВІВ бо беж Малі

Був бі йхщ Ве Лех їі Беж Ак барв БО дех БУВ вв ТВХ ее Тух ех То ЗВ що

Іен бів Мес дбав о бек ем дже Азвосіч зво ХВ вів в) тую бек Су ав був Оу ТИЖ ТВ Бе АвеЮ тую Жхю ПЗ Же ау їх Меб Жю Ток оо щу КЕН

ЖЖ пи: - щи ча шк ни

МІВ

-2105 51 «2115 113 «212» Білок 213» Штучний «220» «223» МІ 59.19 «4005 51 х У «кож сухе ЕЛ У бух Ше Ток Се ож Еко ж ато Тік тал звю ваії За. без ТВ СЯу Бех вже Бей ошеж їм Бко а б без жу

Сів Віз ів Лек іє ех Су Аха Шех ех ів Бех бжаз Сію бух сНеж

КУ с жу ую Кк жи сан УТ ік с сю ем че дуги Зм КМ ще СУ вар ослу Жук жмлх БОйЄє бецш сь жЖжЮ БМ са се Вч Бко сьу лю щеу ж аа жене уже Кох Ж оду СК ку Хрчузо тії чт похо бхашух дю клух Ср же Кл жу клі зуль жо вкч бі їжа Же жує са Уві век дви дЕч Бе оВех Се ба хе

ЗИ 55 БО од сю на те паж о Тих 7. х М нших й я «ї.. У я У ле кру Ач ч. ЯК во Ах Ше Беж БУ бек ЗУ веж біс ТК во Бе ЖВе ей Буг ТТ

Б 7о з5 що с джеию стук дощ Мч Жаею іх т й т. ши кіс кю Тех тугу жуБкх Сх. Кия

Вех йжч укі біз вів с ваше Уві Бі Зі Тек Тек бує Бе слів А

В ЗО по їй Нів Дер оБхо ев Твх ВОе ЗКУ Ома У Тв цтво їжа Злі Се Бу

Мхеех

АК

«2105 52 «2115 113 «212» Білок 5 «213» Штучний «220» «223» МІ 59.20 «4005 52 дао Уві Маїф бен Трек осі» дех Бхо Бер Ше ев схо чай ЖК бей БІУ

А в То 5 пів Бу» 3 бек їі бек тв вк цех Бех ЗІБ бек їмо ла бук пеЕ давопіуУ бек Тв бвеБ озеро сіб ТЕроББжо сі сію Вч Сх ЗКУ шій ее

Бо Дкч ди їжа Бе Тех Зіч Узі Беж ев діб Бе Бек бфУ УМ вжО - Я де гак Ж жу Кеди А оч на тр ТК СУ У Оля хх тож дво вка Бе дех сжу Бех су Бек ЗУ ТЕЖ о Ае Бе ЖЕ ель БУВ ЖК дех йуш Май а Аїв і дао Уві ЗіУ ТВі Жух тую був Бе оОбів ЗіВ цк За я

ТнЕ нів Авр Вуз рев оТВе БВе пі лк Зі ТвЕ бу бе; зва ті Був -2105 53 «2115 113 «212» Білок 213» Штучний «220» «223» МІ п5Е9.21

«-4005 53 умуєх Жаль тло сома рф мо КК хе дж Удаках Ходжу діва СК окуєя Хікс Кохухх мал жу вашою чаї чаї їв Бе єю ех БО мі ек о беб вюкз Уві Твк Бей су

З Фея Ко хи Ж ех боку бек же Жимко ех ЕХ ну рух кі ВТ Тв кчує фехуа із хо із ех бів йек Св хе Бех Бек Зі бек беб сін Ту Бех що й за о Р, ше Ме М ху бух охж Кая Маю УК ха Ж «худ Ж Жук о ке и АЕН дух ар віт ТЕ ТвВЕ гне бео бій тТЕВобНе Мей) Зі був Вхо бу ж вх пу КУ хе Жодмаі Ж пу Ж раю ЖЖ у Кому сах їі и Ек ЩЕ ее

Ба ів Бе фо іє Теж 010 ві бех дев о вжа бів ожек Бу баб опко р; Жим тва си ямочис Ж мож дом З ско Жим М я три пху ТЕ ак ох Зх Тож а МЕЧ Коає Ж шу БеЕ ФЕ ОЖНЕ шу КЕ кр випа ож ем. мує ка

Хаммє Мнну ту тощо Км бод ЖК З жу Тс ге Ух ах ФМХ у Ук КК ум он ек оджа ув Он Аїв о двБ УВК СКУ УА бух Жух буш Бе іх ми мк оком пи подо МК є Сп сх С у БВ шу Су сей СК окхх ни и НИ нки о

ТВх Чі аю бжо Сен отв вне о БІУу Сів Чіє їх душ Бе Я ба БУВ що Мая КК

Жов

МК

ЖЕ Бі «2105» 54 «2115113 «212» Білок 213» Штучний «220» «г2З» МІ п5Е9.22 «4005» 54 дво осві Уві рев ТБж сів беж Бко Мем йек їж Буз Ув) Жах еко су ї Бу КН ХУ чл уколи счь ше дж Км си йМж жа М жах Є ка МА дж У и на че тем дю

Пів Бжо ів бек хі о юеу Став ху й ех Зі; Беж Бей о сажю Жук ех

КУН ки М

Мокик см ае са Муки Кур дя Кук Ж Фу М їх Є ху су жи ни и я У ко

Аярощіє Тек ТВЕ БО ен сім їю ТУЮ Без сів Ста рус фу ім щах 35 С З5

Кк а ЖИЛЕ ж. М жу Мох ЧЛ піхя хм МУ ку шах ххх доку Сех Ж док кт ра коза сей їжа бів Тк Зі УБі йеУ демз йеч Бе беж пі ба Бу

ЩІ пт ж зе Ве тк как м тувішх ау КУТАХ ері Мак уч й зо УМ уд фл ох, фФоюждх ТКОр даю Ак ве ех злу бек пазу Бех Зіє ТМБЕ Зерова ТВЕ їмні Був ті я сах, ее хх те В о сх суша ж ОВ ше осн ехо я ТМ Хо сфмржюлух Мф ОК Кв суку щу. Б ще БУК веж аВкч жо ба і сій вво Уа «У че бук ж Се ВОе с щі

УК ТІ Же Жеуху: ох тує Там Ех ря хат М оту Жожшух ФУ ване Фу

Теж Нв АврвоБио Без Твх о вле збе аю пі ТВ був о їеа Зі іє Був зо хх «ох я щи А. ТО ох,

ЖЕО

2105 55 «2115 121 «212» Білок 5 «213» Штучний «220» «223» МН 801 «4005 55 ща УВО а ех сбіх пів ше ба Вко сіб ем Зак Мущ Бк скку ТЕ ї ту їВ хе схе и дах Су НН НН Фоми С ТфТЬ даю птшк о и я хуя М чн ПКУ Стіну Мч сх пек щу в Мет век Кущ У ЖИ ше ТУ ТтУжЕ ТА ЕпжЖ жи очи ЖГУую ух є У ФЗіячухо р Її 0 Жожиух ФЛ ух тка уж А а Аж ав нн о А ви Ме Нів ожЕвоУДІ Пущ сій буба вуз паУ За ім Бем са те дак

ЇХ ТУ Ммуля шк ше т єх тюки я уж пошу жу СПТУ. т ем гг хи мкс Ж ух тоди Там

ЗКУ ЖУК ті іє БуО Туює ех ДВО Яви ТЕЖ о мУз Тух алу жа ема Бе 5 55 ху . тя с. ьо ях их и їх ммс Ж щу шк, хо Сол млн пд МО гару

Був слу Буш йіз ТЕ Бею ТО бак Авр о Був ех беж Бех Та до ОТЖЕ

ГУ Ж: Ще во

Ме: Сл їм Бех бек Беи Жпх Бех б дво» шек Мі ува Жук ТУуж Сув в з зв ле од Рош бок ВМ я Мк ша ВЖК бу М ре Ж Тука Му ко М дів АЖжУ ко дв ОБОаЮ дек тую ЄДу Бех бе Ве Бе яю бух тжв о шху їЕ Зп 1 сів о тв ТВкЕ їв ТВЕ о бек дае ві ОА ЖК ЯКЖ КМ ІС УМ М КО ХХ

Ах їх -2105 56 -2115108 «212» Білок

213» Штучний «223» МІ 801 «4005 56 вер лів ЗК Ме Те біз беж Бо Вів Бе» їм. Бек о Аа беж Тева СО

Сі же чі Тк іє Тв Сук був ака бек спхк бої» Хе Ви» Ажк рек вк во за іч Афао тк ТУЮ НІіВв біз БУ БЕ Фі Зуш оВек Бхо зе Бевоїва Кі

ТУуж Бі дів їТнжЖ обов о їжо Аіз вав осі УВО ВО беж ка Бвое дек шу

Бек дкя пежЖ бі тТВЕ Фів ве век їм: МУЗ Ж Аа хх Бе лама Ті16 «5 | зо т во сів вер о Бжм щі іє тех тТуж СУ їз ЗБ оку ух Бе ЕЖО бКО ДкО тах ве бі Зі іх ТВУ СУБ ер ЗМО їх БУК

КК з «2105 57 «-21155 «212» Білок 213» Штучний «220» «223» МН 5Е9 СОВ НІ «4005 57

Важ БЖ У Ме вед -2105 58 «211517 «212» Білок «213» Штучний «220» «223» МН 59 СОВ-Н2 «4005» 58

Меє Те тує Теж Авродех де Зі був нів тую вія Аврошек ува лев ії в вже З

Ох 2105 59 «-211556 «212» Білок «213» Штучний «220» «223» МН 59 СОВ-НЗ «4005» 59 сіє твх оте Бк дО ТУЄ 0) -2105» 60

«2115 16 «212» Білок 213» Штучний «220» «223» МІ 59 СОВ-Ї 1 «400» 60

Ажкез бек обюеке іх бек Зм ЗМО Тух ек Вер обіу ТУук ЖВЕ Ве оїжч ОВ 1 5 ї2 ї5 -2105 61 «21157 «212» Білок 213» Штучний «220» «223» МІ 59 СОВ-12 «400» 61 сів ві пек дав йхщ МОЄ Бех їх У -2105 62 «21159 «212» Білок 213» Штучний «220» «223» МІ 59 СОВ-І З «4005» 62 вас бів Віа Тк Мі Бер фе їж -2105» 63 «21155 «212» Білок 213» Штучний «220» 0) «223» МН 801 СОВ-НІ1 «400» 63 ек їшежк Уві Меб ніщ «2105» 64 «211517 «212» Білок 213» Штучний «220» «223» МН 801 СОов-нН2 «400» 64

Тух Ті Ії РрРуо Тук Аж Ар Ажю Те о бую Тух Ава їм був Ве ув ї 5 їо 15 -2105 65 «2115 14 «212» Білок 213» Штучний «220» «223» МН 801 СОв-НЗ «4005» 65 аїа аку акз баб оса Тух ту Бі» ех ВеК Ве Вб дев ожеЕ

Х В їй -2105» 66 «2115 11 «212» Білок

213» Штучний «223» МІ 801 СОВ-11 «400» 66 зів вів пек 2 яв Хі дво» бе о ТУХ Мем Лід ї ня Та «2105 67 «21157 «212» Білок 213» Штучний «220» «223» МІ 801 СОВ-І2 «400» 67

ЗУ дів ЖЖ Аз бе Ді АВо -2105» 68 «21159 «212» Білок 213» Штучний «220» «223» МІ 801 СОВ-І З «4005» 68 їн (А сту Ту жі вк БЕЗ Ак ТВУ

Claims

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Виділене моноклональне антитіло проти КОМА, яке містить антигензв'язувальний домен, що містить варіабельну ділянку важкого ланцюга ЗЕО ІЮ МО: 34 і варіабельну ділянку легкого ланцюга ЗЕО ІО МО: 10 або варіабельну ділянку важкого ланцюга ЗЕО ІО МО: 55 і варіабельну ділянку легкого ланцюга 5ЕО ІЮО МО: 56.

2. Виділене моноклональне антитіло проти КОМА за п. 1, де антигензв'язувальний домен Зо містить варіабельну ділянку важкого ланцюга ЗЕО ІО МО: 34 і варіабельну ділянку легкого ланцюга 5ЕО ІО МО: 10.

З. Виділене моноклональне антитіло проти КОМА за п. 1, де антигензв'язувальний домен містить варіабельну ділянку важкого ланцюга ЗЕО ІЮ МО: 55 і варіабельну ділянку легкого ланцюга 5ЕО ІЮО МО: 56.

4. Антитіло за пп. 1-3, яке додатково містить акцепторний каркас людини, де вказаний акцепторний каркас людини містить щонайменше одну амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з БЕО ІЮО МО: 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32 33.

5. Антитіло за будь-яким з пп. 1-4, де виділене моноклональне антитіло проти КОМА містить щонайменше одну (з мутаціями в каркасі) варіабельну ділянку, яка має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з: БЕО ІЮО МО: 47, 48, 49, 50 і 5ЕО ІЮ МО: 51, 52, 53 і 54.

6. Виділена нуклеїнова кислота, яка кодує молекулу антитіла за будь-яким з пп. 1-5.

7. Вектор, який містить виділену нуклеїнову кислоту за п. 6.

8. Клітина-хазяїн, яка містить вектор за п. 7.

9. Спосіб отримання білка, здатного зв'язуватися з КОМА, який включає культивування клітини- хазяїна за п. 8 у культуральному середовищі в умовах, достатніх для продукції білка, здатного зв'язуватися з КОМА.

10. Фармацевтична композиція, яка містить антитіло за будь-яким з пп. 1-5 і фармацевтично прийнятний носій.

11. Застосування антитіла за будь-яким з пп. 1-5 для отримання лікарського засобу, який використовується для а) зменшення зв'язування ПКОМА з рецептором Неогеніну у індивіда, що потребує цього; або 5) зменшення зв'язування ПКОМА з морфогенетичним білком кістки 2 і/або морфогенетичним білком кістки 4 (ВМР-2 і ВМР-4) у індивіда, що потребує цього.

12. Застосування антитіла за будь-яким з пп. 1-5 для одержання лікарського засобу, який використовується для зниження активності КОМА у індивіда, що страждає на порушення, при якому активність КОМА здійснює негативний вплив.

13. Застосування за п. 12, де порушення включає неврологічні захворювання, вибрані з групи, що складається з бічного аміотрофічного склерозу, ушкодження плечового сплетіння, ушкодження головного мозку, у тому числі травматичного ушкодження головного мозку, церебрального паралічу, хвороби Гійєна-Барре, лейкодистрофій, розсіяного склерозу, поствакцинального поліомієліту, щілини хребта, ушкодження спинного мозку, спінально-м'язової атрофії, спінальних пухлин, інсульту, поперечного мієліту; деменції, сенільної деменції, легкого когнітивного порушення, пов'язаної з хворобою Альцгеймера деменції, хореї Хантінгтона, пізньої дискінезії, гіперкінезій, маній, хвороби Паркінсона, синдрому Стіла-Річардсона, синдрому Дауна, важкої псевдопаралітичної міастенії, травми нерва, судинного амілоїдозу, крововиливу у головний мозок з амілоїдозом, запалення головного мозку, гострого порушення зі сплутаністю свідомості, глаукоми і хвороби Альцгеймера. Прямий КІ ЛЄА тАВ ме НиДОМ -- Ма і | і 1 нн МОВНЕ В, в Б ПЕ! ше ши КК ШК . ї шини ЕД Иьсе А ПИШИ ож В пінине с; ше нм пен Він й Ж НКИ шк й КН нта кн нини ви ча чини и ни нини ЖЕ нн ИЙ ! КК п НА А Мн нн в Б В це НІ: | ЩЕ ! ; Он -- К ТРК ке к -0 - сонну ДО Й : ЕЕ Иеш І ШЕ НЕе ШЕ ТА й ! БИЙ НЯ | її НН ! Турині ікони нини ИН коки ІННИ НИ шва м: ля 3 КА ТЯ СИН х Ії що ва 1 І ними Фіг А

ЕАСВ-титр: НЕК?О3-НІНОМА ц З онрретрентрене перетне ! Ду вен ненвт шижин пішенв УНН їх ЗЕ | ЇЇ. І т Ї | Ши ж Я виник Енн ШИН: Еш Пайнн - 180 ї і Її я ун: й в'ю ВЕНИ с яні ван Я вро ; мо 10000 І ними тА

Фіг. 18 ЕАСЕ стабільної клерниної іні БАКЗ-КОМ А. орра. ов и ; 4 3 в 7 з В ! Ка Т. і і ! Е ще ше шк! ою ой ЕСЛАНІ ВРУ я апітанНоо РЕ Фіг 1С

Грікмк вата зх зезечніваня зелвне ані дтненися СІРЕ ВВЯ ь З Неон І сс Й зов зннндідння ДІЯ ЯН

4.95 І в З с х й ГЕДКс Ь щ- З КО о 1009 зо ковкентраія зл гнуті

Фіг. 2 -к- МІ 88-5БЕЧаНІЮ Тева жнязх ЗВ ВКревалчя; знов ружа ГП) ВАК А з ДЛЯ РЕД з я - ц З чо 190 1 то Кенвентеня пе ікла

Фіг. З

Тисі вання зв'язування: фукичетня 8-х Я за деобомвтст кв ЯКО я ча МідВ-бБОАНІО Во! мя а У З її чо 0 109 Концев вена шани маї фіг. 1 Кагіблвукекя зів'язжевння Точне крема ловлю ерного С) ВКМ А з ВМР

1.25 ; чен БЕЗ

41. ЩО) й ; З по» ! 100 10090 10000 Котеентраткія мА Кнгмв

Фіг. 5 й. іх с. чши и ши ши шшишшишш

Фіг. 6 м з зн Я : сення КК в. - Ге а со г. х ї ї- о й е ге є г з Й о » - ш -

55. а

В. 5 я г ях

Фіг. 7

0

--. ВО І. : З ш ! я) - че і хе її и: ш Контроль (без тА

Фіг. ВА ЗО - ш т - ЖК З : Ша ЩЕ ш і ! - зе ж ща Ж ж г в Ж що х р НЕ х В їх Ей а ш М Бій В У ї ва й В ПАБ БКО ОО мкл)

Фіг. 885

1о0ч щ В -Х

Е Е. х сю. ЩЕ Е ї : ГЗ Я ж В Й о - ВЧ що як ж х шу 5 У Сх хв тА ЯРУ (О, мем) Фіг 8С ча ї | рвана я 4 Вр ШИ о, Ж Я ОХ зе янинкениья Е- шо х ; пен декенекеккнн 5 я шинок ианнни і иОня ШИ нн НИ тн ШИ КО Шк, Ід айкяка обвіовідройа ще у озз с вет сс о ВЕ МК С ВИ ЕВ - чи ЗЕ 5 вк й - а Е КЕ щ їв У З

Ж. х ;, кож 5 ри ТАВОБВОИ меми,

Фіг. ВД

Я шк Ж пожеж ЖЖ Ж пдв Кт, ЩЕ: Ко вою я й океани в нти. І: мкс м як В о ОЗ ЬьнН Вот г со Ям м юю ою К ну нео катки Ж х | ная ко вої пен в і Мина, Ко Вон Кн я- ще звикати ск в я х 7 І ак в М ВИ Х Ї ДК - «ді они В КК пат аа ка т Я Кона й В оон зн жнвиЖ я ех проваваоввоокк ся нки й А вен Коня БУ Дія ж я Ку вві З ЩЕ КК кн яв т ВЕК НАЙ КЕхм ко З ОА: КА З КОХ: кутник. її

Фр. 5 в Го пт Ж і с : КУ ЕЕ ее КО г мес МЕ: с ще й СИ т - АБ ОКО СО мкглалі

Фіг. ВЕ я З. Ж Б їх їв КЕ БУК не Кі й ж еле ї я КІ Ж ЖУК х Ж Кк п «й ЗК 4 с й УК ВІКІ їв Но МК ї я ня КЕ У

4 .абя ї- я БРУК СЕ сн шк як. дк ПС К а ве зак жк ЩЕ: 55 боя ак Я І ЕК В : донні ві В Ох БЕН х сл хЯ жи ж СТІ ОТ СОКІВ . х Зі же о Ук І: щі як МОЯ ОК ЕЖ ЗЕ М х я Х х ЗЕ Сей шк СОУ ЩІ: 55 Б 4 т ВУ ще Що. а АНЯ х ЗБ веж уже р ПІК в КТК УЕ КК ВХ Х і КК мае ване КУКЯ Кр у ЗЕ Х ке в іні не ПКУ ВОЗІ КРОК її З ЗТ: Іа ВАР зо зе ЕКО вия КЕ Я й я ЗБК та КЕ як ря, ПІЖоІК Ме КВ. Ж т Ї 3 МЕ я в МКК СУ КЕ Р З ЕЕ ВБИВ ик. ро БОКІВ ко я КК З ЗЕ ЗЕ хм х як х ще ж ВАЗИ екв нн Вк ни ще МУ Ж жи ва ТЕ КЕ Ве ЕЕ ВІ я що в Ооре ке КІ Пен; кВ жежію Я з СК Еї І як НХ ГУ. ж ЖЕ їх ку ми ваЕх і КЗ ак ок НА ЯН З ВО В Я ІСІ іх у Ї «ЕЕ ЕН Е ие жк жк а нк Вне ЯЗ о в КОМ Ж СУ КЕ ВВ БЕ; м МК Кк щх ке ВИК ЕВ вва мен Кене ОВЕН пе як ях кре мае не ВЗ БО І ЯК КНУ Ж Арени в век жу. ви ЗНИК Мне і Як Вк я ШИН ЯК ще ПЕ ЕН ОВ кВ | пе ПЕ ЗИ КК ІЗ Кк Яги Жан НКИ реак ТІК С 3 ж Ж ІЕЕ Ке с у І Кор кот ЕК Бе ВК: 5-0 Я з ЯК ВХ ВУ ЖК КУ кинь НИКИ КК НОВ ї ! ЗЕ Ор ге Вон ООН ЛЕН ЖЖ ІНК Е Снеки іх Деазї іж я: неси каві ЖБК КВ ода ВІННІ МЕ ин а вх й т 7 г. вх ши й шини й панинннни ій З З, у г г » де «є «Ф г З я ж т їх ж й її Ж зе Кк. е? ан «А а? Ки ж ге й х с я С г я Ф ЩО Мео-НіВ я ВО ве ВМЕее є КО шт ВМР ОЇ Б ВМ А КВ ЩІ ВМе-Я4 ж ВО

Фіг. 9

- БО0О0ч я То ожаж 0 т» же ж и: мч що в я вн Бо ой к вк ї да ВСЯ " рсвсввавва я Б Я зве ВО я ж шин ни віж н. пе. н - . ще - Ж т т за. є їх З щЕ 5 КУ їх а ЩЕ ОВ Б5 де З 95 ши ше ша ше ше у ше Е бе йо Бе "т чі а Гн чу ЖЕО кн Ян БОМ А о мюг/лял т ре В.о: спаКЕЗВМКВСтев ВАНН ща мкг явку ДОМИ: значимість віднюстю БВ О мель чех В ВА значимість відмесна КВ 0 МКРНЯИ

Фіг. 10 й в 3333. с

Фіг. 1