TWI816673B - 雙特異性重組蛋白及其應用 - Google Patents
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Abstract
本發明揭示一種雙特異性重組蛋白,其包含高親和標靶腫瘤的臂及低親和阻斷CD47與SIRPα相互作用的融合蛋白,其中高親和標靶腫瘤的臂所對應的抗體不結合CD47,其對腫瘤細胞上標靶抗原的結合親和力係低親和阻斷CD47與SIRPα相互作用的融合蛋白所對應的單體融合蛋白同型二聚體對腫瘤細胞上CD47結合親和力的至少6倍,其中低親和阻斷CD47與SIRPα相互作用的融合蛋白包含SIRPα胞外截斷體。本發明更揭示公開一種編碼重組蛋白的核酸分子及所述重組蛋白及核酸分子在製備治療腫瘤的藥物中的用途。本發明的雙特異性重組蛋白顯著提高具有調節巨噬細胞功能重組蛋白的腫瘤標靶飽和結合豐度並且降低非腫瘤標靶的副作用,在臨床上有很大的應用價值。
Description
本申請要求申請日為2017年5月8日的中國專利申請CN201710317926.7與申請日為2017年12月5日的中國專利申請CN201711269620.5的優先權。本申請引用上述中國專利申請的全文。
本發明屬於生物醫藥領域,尤其關於一種重組蛋白及其用途。
隨著對腫瘤治療領域研究的深入,腫瘤分子標靶性治療藥物的研發與應用受到了越來越廣泛的關注。基於標靶性強、副作用小、療效顯著等優點,抗體藥物迅速成為腫瘤標靶治療領域的熱門藥物。目前已有數十種標靶腫瘤的抗體藥物經過批准應用於臨床,並取得了顯著的療效,所述抗體藥物例如針對CD20標靶分子的美羅華Rituxan®(利妥昔單抗,美國第一個被允許用於治療癌症的單抗,最初用於治療非何杰金氏淋巴瘤,Roche出品)、Zevalin®(ibritumomab tiuxetan,其最初被美國FDA批准用於治療對美羅華具耐藥性的低分化非何傑金氏淋巴瘤,IDEC Pharmaceuticals出品)、Bexxar®(tositumomab and iodine I 131 tositumomab,GSK出品)、Arzerra®(ofatumumab,GSK出品)等,針對Her2標靶分子的赫塞汀Herceptin®(曲妥珠單抗,著名的治療乳腺癌的藥物,Genentech出品)、Perjeta®(帕妥珠單抗,Roche出品)、Kadcyla®(ado-trastuzumab emtansine,Roche出品)等,針對VEGF或其受體標靶分子的阿瓦斯汀Avastin®(貝伐單抗,Genentech/Roche出品)、Cyramaza®(ramucirumab,Eli Lilly出品)等,針對EGFR標靶目標的愛必妥Erbitux®(西妥昔單抗,全球十大暢銷抗癌藥之一,最初批准用於治療直腸癌,Eli Lilly出品)、Vectibix®(帕尼單抗,治療結直腸癌的藥物,Amgen出品)等,針對PD-L1標靶分子的Tecentriq®(atezolizumab,Roche出品)等(曹睿等,腫瘤標靶治療抗體藥物的研究進展,《中國生化藥物雜誌》,2016,36(6):15-18)。
臨床上應用的標靶腫瘤細胞的抗腫瘤抗體藥物(未偶聯的裸抗體),其抗腫瘤作用機制主要藉由抗體的兩種功能實現。首先,抗體的第一種功能是親和性,亦即抗體與腫瘤表面標靶抗原特異性結合後發揮其效應功能,殺傷腫瘤細胞。抗體分子藉由與標靶抗原結合,而能阻斷腫瘤生長因子訊息路徑、誘導細胞凋亡或抑制腫瘤微環境中新生血管的形成。其次,抗體的第二種功能是借助於免疫系統實現的,亦即對腫瘤細胞的殺傷作用也可藉由免疫系統媒介細胞死亡,如抗體恆定區媒介的抗體依賴性細胞媒介的細胞毒性作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)、補體依賴性細胞毒性作用(complement dependent cytotoxicity,CDC)以及抗體依賴性細胞吞噬作用(Antibody dependent cellular phagocytosis,ADCP)。越來越多的數據顯示,抗體媒介的免疫殺傷活性為抗體發揮抗腫瘤功效的重要作用機制(有關綜述可參見 Barnhart BC, el al. Role of Fc-FcγR interactions in the antitumor activity of therapeutic antibodies. Immunology and Cell Biology,2017,95:340–346)
近年來研究證實,腫瘤細胞可藉由例如對自身表面抗原修飾及改變腫瘤組織周圍微環境等途徑來逃避自體免疫系統的監控、辨識與攻擊而繼續分裂生長,亦即所謂的腫瘤免疫逃脫(tumor immune escape)。例如腫瘤細胞藉由高表現CD47,與巨噬細胞表面的抑制性受體訊息調節蛋白α(signal regulatory protein α,SIRPα)相互結合抑制巨噬細胞的免疫功能,顯著地抑制免疫細胞活性。同時,腫瘤細胞高表現CD47抑制Fc受體媒介的吞噬作用,最終影響抗體藥物的腫瘤標靶治療效果(Willingham SB, et al. The CD47-signal regulatory protein Alpha (SIRPα) interaction is a therapeutic target for human solid tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2012,109(17):6662-6667)。
CD47為一種廣泛表現的膜醣蛋白,其與SIRPα互為受體及配體,並可形成CD47-SIRPα訊息複合體,媒介凋亡、增殖、免疫等一系列的反應。2000年,Oldenborg等人證實CD47為細胞表面調節巨噬細胞吞噬作用的一個重要訊息(Oldenborg PA, et al. Role of CD47 as a marker of self on red blood cells. Science,2000,288(5473):2051-2054)。CD47藉由釋放「別吃我」的訊息,而可與巨噬細胞表面SIRPα結合,磷酸化其免疫受體酪胺酸抑制模體(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif,ITIM),隨後招募含有SH2的蛋白酪胺酸磷酸酶SHP1(SH2-containing protein tyrosine phosphatase 1)蛋白,產生一系列的級聯反應(cascade reaction)抑制巨噬細胞的吞噬作用。年輕的紅血球表現較高的CD47向巨噬細胞釋放「自己人,別吃我」的訊息,而衰老的紅血球CD47表現下降,最終被巨噬細胞所清除。
因CD47廣泛表現於各類癌細胞表面,因此該標靶目標可以用於治療各類癌症,且小鼠異體腫瘤移植模式已說明了CD47阻斷的有效性,因此CD47已成為癌症免疫檢查點療法的新型標靶目標(Vonderheide R H. CD47 blockade as another immune checkpoint therapy for cancer. Nature Medicine, 2015, 21(10):1122-1123)。抗CD47抗體、SIRPα-Fc融合蛋白等研究中藥物,透過阻斷CD47-SIRPα訊息路徑,解除CD47對免疫細胞的抑制作用,展現出一定的抗腫瘤活性。但是,因為紅血球也大量表現CD47蛋白,所以與CD47蛋白高親和力結合的抗CD47抗體治療會產生紅血球凝集、貧血等毒性副作用(Mccracken M N, et al. Molecular Pathways: Activating T Cells after Cancer Cell Phagocytosis from Blockade of CD47 “Don't Eat Me” Signals. Clinical Cancer Research, 2015, 21(16):3597-3601),此導致抗CD47抗體藥物的臨床開發難度極大,迄今尚無抗CD47抗體藥物進入第III期臨床;而野生型SIRPα-Fc融合蛋白則由於其與CD47的親和力低,因此藥效不顯著;也有研究者對野生型SIRPα進行高親和力突變,並獲得了親和力增強上千倍的SIRPα突變體,並展現出較好的抗腫瘤藥效(Weiskopf K, et al. Engineered SIRPα variants as immunotherapeutic adjuvants to anticancer antibodies. Science,2013, 341(6141): 88-91),但多點突變是否對融合蛋白在人體的安全性、免疫原性、穩定性乃至標靶目標特異性等方面產生影響都還有待臨床觀察考證。
另一方面,研究顯示,抗CD47抗體透過與其他腫瘤標靶治療抗體聯合使用,能顯著提高抗腫瘤藥效,如CD47+CD20、CD47+Her2聯合用藥(Chao MP, et al. Anti-CD47 antibody synergizes with rituximab to promote phagocytosis and eradicate non-Hodgkin lymphoma. Cell, 2010, 142(5):699-713;Zhao XW, et al. CD47–signal regulatory protein-α (SIRPα) interactions form a barrier for antibody-mediated tumor cell destruction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2011,108(45):18342-18347)。但是,抗CD47抗體能否上市、何時能上市具有很大的不確定性;上市後,腫瘤標靶抗體藥物聯合使用也導致患者難以承受其非常昂貴的聯合治療費用。
因此,需要開發新的腫瘤標靶藥物,該腫瘤標靶藥物能夠特異性的標靶治療腫瘤,同時激活並增強患者體內的免疫功能,在保證安全性的前提下顯著提高腫瘤治療的效果,同時降低患者用藥成本。
此外,有鑑於標靶CD47的單價或多價的抗體或重組蛋白存在潛在的安全性風險(如貧血、紅血球凝集、CD47陽性的非腫瘤靶細胞殺傷等),同時,由於人源SIRPα與人源CD47的結合存在物種特異性,而人血的使用受到了倫理、遺傳資源等限制,因此極待開發一種早期體內/體外的免疫安全性評價方法,用於評價標靶CD47的抗體或重組蛋白的免疫安全性。
本發明提供一種雙特異性重組蛋白及其應用,其顯著提高具有調節巨噬細胞功能重組蛋白的腫瘤標靶飽和結合豐度,並且能顯著降低非腫瘤標靶的副作用。
另一方面,本發明提供一種雙特異性重組蛋白,其中所述雙特異性重組蛋白包含高親和標靶腫瘤的臂以及低親和阻斷CD47與SIRPα相互作用的融合蛋白。
在一個實施方案中,所述高親和標靶腫瘤的臂不結合CD47,且所述高親和標靶腫瘤的臂對應的抗體對腫瘤細胞上標靶抗原的結合親和力為低親和阻斷CD47與SIRPα相互作用的融合蛋白所對應的單體融合蛋白同型二聚體(homodimers)對腫瘤細胞上CD47結合親和力的至少6倍,且可任選自6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍,或更高的倍數值,或其間的任意數值;
所述低親和阻斷CD47與SIRPα相互作用的融合蛋白對CD47的結合親和力不高於含SIRPα胞外截斷體(SIRPα extracellular truncation)的單體融合蛋白同型二聚體對CD47的結合親和力。所述低親和阻斷CD47與SIRPα相互作用的融合蛋白包含SIRPα胞外截斷體。
在一實施方案中,SIRPα胞外截斷體包含人源SIRPα(野生型或CD47非高親和突變體)的胞外胺基酸序列的部分或全部。
在另一實施方案中,SIRPα胞外截斷體為人源SIRPα胞外截斷體。在具體的實施方案中,SIRPα胞外截斷體包含選自如下a1)~a4)任一種的胺基酸序列:a1)SEQ ID No:30;a2)SEQ ID No:31;a3)SEQ ID No:32;a4)上述胺基酸序列中任一種胺基酸序列經過加成、缺失、修飾及/或保留式取代至少一個胺基酸殘基例如1~5個胺基酸殘基所獲得的胺基酸序列,其單體具有對CD47蛋白的結合親和力並且該結合親和力不高於a1)、a2)或a3)單體對CD47蛋白的結合親和力的胺基酸序列。
在一實施方案中,所述雙特異性重組蛋白具有相對設置的左、右兩臂結構,其中所述的高親和標靶腫瘤的臂位於左臂的位置,所述的低親和阻斷CD47與SIRPα相互作用的融合蛋白位於右臂的位置;較佳為所述左臂為免疫球蛋白的Fab或Fab’形式,所述右臂為SIRPα胞外截斷體。其中,本發明所述的「具有相對設置的左、右兩臂結構」係參照免疫球蛋白的通常「Y」型結構的描述,此種情形下,本發明雙特異性重組蛋白的左、右兩側具有不同標靶的特異性功能蛋白;該結構描述主要是區別於兩個特異性功能蛋白可以透過C端與N端連接形成上、下結構。因此,本發明所述左、右臂的空間位置並非具體限定雙特異性重組蛋白結構,僅是為了將雙特異性重組蛋白的兩個臂結構與上述C端與N端連接形成的上、下結構進行區分,當一個位於一側時,另一個相應地位於相對的另一側;顯然二者左、右空間位置可以互換。
在另一實施方案中,所述右臂的長度與左臂需結合的抗原空間表位(spatial epitope of antigen)距離靶細胞膜表面的遠近相適配。較佳地,當所述高親和標靶腫瘤的臂需結合靶細胞近膜端的表位時,所述SIRPα胞外截斷體選擇含a1)~a4)中較短的胺基酸序列。
在一實施方案中,所述高親和標靶腫瘤的臂標靶選自下列的標靶目標:5T4、AGS-16、ALK1、ANG-2、B7-H3、B7-H4、c-fms、c-Met、CA6、CD123、CD19、CD20、CD22、EpCAM、CD30、CD32b、CD37、CD38、CD40、CD52、CD70、CD74、CD79b、CD98、CEA、CEACAM5、CLDN18.2、CLDN6、CS1、CXCR4、DLL-4、EGFR、EGP-1、ENPP3、EphA3、ETBR、FGFR2、FN、FR-α、GCC、GD2、GPC-3、GPNMB、HER2、HER3、HLA-DR、ICAM-1、IGF-1R、IL-3R、LIV-1、MSLN、MUC16、MUC1、NaPi2b、結合素-4、Notch 2、Notch 1、PD-L1、PD-L2、PDGFR-α、PS、PSMA、SLTRK6、STEAP1、TEM1、VEGFR、CD25、CD27L、DKK-1、CSF-1R、MSB0010718C、BCMA、CD138。
較佳地,當所述標靶目標為CD20、EGFR或PD-L1時,所述SIRPα胞外截斷體選擇a1);當所述標靶目標為HER2時,所述SIRPα胞外截斷體選擇a1)或a2)。
在一實施方案中,高親和標靶腫瘤的臂以及低親和阻斷CD47與SIRPα相互作用的融合蛋白藉由分子間作用力結合,或藉由共價鍵例如鏈間雙硫鍵(interchain disulfide bond)結合,或藉由鹽鍵結合,或藉由上述結合方式中的兩種或三種的組合而結合。
在又一實施方案中,高親和標靶腫瘤的臂以及低親和阻斷CD47與SIRPα相互作用的融合蛋白更包含Fc區域。通常,本發明的Fc區域包含Fc區域天然序列。然而,本發明的Fc區域可以在Fc區域天然序列中具有一個或多個已存在的胺基酸序列改變或修飾,例如,Fc區域的C1q結合活性得到改變的胺基酸序列改變或修飾。
在另一實施方案中,低親和阻斷CD47與SIRPα相互作用的融合蛋白為包含SIRPα胞外截斷體及用於結合所述臂的結合序列的融合蛋白,SIRPα胞外截斷體及用於結合所述臂的結合序列任選藉由接合子(adapter)連接,所述用於結合所述臂的結合序列任選地包含Fc區域。
在另一實施方案中,本發明的Fc區域為概念性,亦即雖然它實際上可能並不存在,但可根據所需Fc區域變體的胺基酸序列實施抗體工程改造,產生含此序列的多肽或融合蛋白或編碼所需Fc區域變體胺基酸序列的DNA。
在另一實施方案中,所述Fc區域可為Fc區域變體。本文所使用的「Fc區域變體」係指對Fc天然胺基酸序列進行一個或多個胺基酸殘基的修飾所獲得的Fc區域。修飾的方法為本領域技術人員所熟知,包括但不限於對編碼Fc區域的DNA序列進行定點突變,例如使用PCR突變及盒式突變(cassette mutagenesis)來製備Fc區域變體。例如,為了提高與FcR的結合,可以缺失Fc區域的一個或多個胺基酸殘基。例如,在一個實施方案中,為了改變Fc區域的效應功能,可以製備胺基酸插入型Fc區域變體。
在一實施方案中,例如可以在一個或多個鑑定為影響FcR結合的Fc區域位點附近引入至少一個胺基酸殘基(例如1~2個胺基酸殘基,通常不超過10個胺基酸殘基)。「附近」係指距離在所鑑定之影響FcR結合的Fc區域位點的1~2個胺基酸殘基之內。此種Fc區域變體可呈現增強或降低的FcR結合及/或ADCC活性。為了製備此種插入型變體,可藉由評估含FcR結合區(例如,標靶FcR的細胞外區域(extracellular domain))的多肽與待插入胺基酸殘基的Fc區域的共結晶結構,而便於涉及具有例如增強的FcR結合能力的Fc區域變體。此種插入通常被置於Fc區域的環中。
在一實施方案中,藉由在天然Fc區域中引入適當的胺基酸序列修飾,而能製備在人類效應細胞存在的條件下,較含有天然Fc區域的重組蛋白更有效地媒介抗體依賴性細胞媒介的細胞毒性作用(ADCC)及/或以更強地親和力結合Fcγ受體(FcγR)的Fc區域變體。本發明的Fc區域變體通常在Fc區域中包括至少一個胺基酸修飾。較佳為組合多個胺基酸修飾。例如,Fc區域變體可包括2、3、4、5個或更多個胺基酸殘基的取代,如在所鑑定的特異性FcR結合位點中。
所述天然Fc區域較佳為人類Fc區域,例如人類IgG1(A或非A同種型)、IgG2、IgG3或IgG4的Fc區域天然序列。
在另一實施方案中,所述高親和標靶腫瘤的臂以及低親和阻斷CD47與SIRPα相互作用的融合蛋白的結合係藉由knobs-into-holes結合。例如,所述knobs-into-holes為由T366W突變形成突出的「knobs」型,及一個胺基酸突變(Y407V)形成凹陷的「holes」型或三個胺基酸突變(T366S,L368A及Y407V)形成凹陷的「holes」型。突變根據Kabat編號方案[Eu numbering scheme of Kabat et al. (1991)],其從左至右分別顯示為原胺基酸殘基、突變位點及取代胺基酸殘基,例如T366W中,T為原胺基酸殘基、366為突變位點及W為取代T的胺基酸殘基。
在一實施方案中,所述高親和標靶腫瘤的臂標靶選自下列標靶目標的半抗體(half-antibody):5T4、AGS-16、ALK1、ANG-2、B7-H3、B7-H4、c-fms、c-Met、CA6、CD123、CD19、CD20、CD22、EpCAM、CD30、CD32b、CD37、CD38、CD40、CD52、CD70、CD74、CD79b、CD98、CEA、CEACAM5、CLDN18.2、CLDN6、CS1、CXCR4、DLL-4、EGFR、EGP-1、ENPP3、EphA3、ETBR、FGFR2、FN、FR-α、GCC、GD2、GPC-3、GPNMB、HER2、HER3、HLA-DR、ICAM-1、IGF-1R、IL-3R、LIV-1、MSLN、MUC16、MUC1、NaPi2b、結合素-4、Notch 2、Notch 1、PD-L1、PD-L2、PDGFR-α、PS、PSMA、SLTRK6、STEAP1、TEM1、VEGFR、CD25、CD27L、DKK-1、CSF-1R、MSB0010718C、BCMA、CD138;較佳為IgG1抗體的半抗體,可任選自人鼠嵌合的半抗體、人源化(humanized)的半抗體、全人源(human)的半抗體;更佳為人源化或全人源的IgG1抗體的半抗體。
在一實施方案中,低親和阻斷CD47與SIRPα相互作用的融合蛋白包含選自如下b1)~b4)任一種的胺基酸序列:b1)SEQ ID No:26;b2)SEQ ID No:27;b3)SEQ ID No:28;b4)上述胺基酸序列中任一種胺基酸序列經過加成、缺失、修飾及/或保留式取代至少一個胺基酸殘基例如1~5個胺基酸殘基所獲得的胺基酸序列,其同型二聚體具有對CD47蛋白的結合親和力並且該結合親和力不高於b1)、b2)或b3)同型二聚體對CD47蛋白的結合親和力的胺基酸序列。上述序列中所包含的訊息肽區域序列可根據本領域技術人員所熟知的方式或常用訊息肽序列任意替換。
在另一實施方案中,所述雙特異性重組蛋白包含以下序列:
其中高親和標靶腫瘤的臂標靶CD20時,所述高親和標靶腫瘤的臂包含SEQ ID No:16與SEQ ID No:17,所述低親和阻斷CD47與SIRPα相互作用的融合蛋白包含SEQ ID No:26、SEQ ID No:27或SEQ ID No:28;
其中高親和標靶腫瘤的臂標靶EGFR時,所述高親和標靶腫瘤的臂包含SEQ ID No:19與SEQ ID No:8,所述低親和阻斷CD47與SIRPα相互作用的融合蛋白包含SEQ ID No:26、SEQ ID No:27或SEQ ID No:28;
其中高親和標靶腫瘤的臂標靶Her2時,所述高親和標靶腫瘤的臂包含SEQ ID No:20與SEQ ID No:21,或SEQ ID No:22與SEQ ID No:23,所述低親和阻斷CD47與SIRPα相互作用的融合蛋白包含SEQ ID No:26、SEQ ID No:27或SEQ ID No:28;或,
其中高親和標靶腫瘤的臂標靶PD-L1時,所述高親和標靶腫瘤的臂包含SEQ ID No:24與SEQ ID No: 13,所述低親和阻斷CD47與SIRPα相互作用的融合蛋白包含SEQ ID No:26、SEQ ID No:27或SEQ ID No:28。
另一方面,本發明提供編碼雙特異性重組蛋白的核酸分子。較佳為,其中編碼所述高親和標靶腫瘤的臂之核酸分子以及編碼所述低親和阻斷CD47與SIRPα相互作用的融合蛋白之核酸位在同一條DNA鏈中,或編碼所述高親和標靶腫瘤的臂之核酸分子與編碼所述低親和阻斷CD47與SIRPα相互作用的融合蛋白之核酸位在不同的DNA鏈中。
另一方面,本發明提供包含核酸分子的表現載體。
另一方面,本發明提供包含表現載體的細胞。
另一方面,本發明還提供製備雙特異性重組蛋白的方法,其包括:1)提供高親和標靶腫瘤的臂;2)提供低親和阻斷CD47與SIRPα相互作用的融合蛋白;3)使高親和標靶腫瘤的臂以及低親和阻斷CD47與SIRPα相互作用的融合蛋白接觸形成所述重組蛋白。
在一實施方案中,製備重組蛋白的方法包括使包含表現載體的宿主細胞表現該重組蛋白,所述表現載體包含編碼重組蛋白的核酸分子。
另一方面,本發明更提供腫瘤標靶治療的方法。
在一實施方案中,腫瘤選自乳腺癌、結腸直腸癌、肺癌、胰腺癌、食道癌、子宮內膜癌、卵巢癌、胃癌、前列腺癌、腎癌、子子宮頸癌、骨髓瘤、淋巴瘤、白血病、甲狀腺癌、子宮癌、膀胱癌、神經內分泌癌、頭頸癌、肝癌、鼻咽癌、睪丸癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、黑色素瘤、基底細胞皮膚癌、鱗狀細胞皮膚癌、隆突性皮膚纖維肉瘤(Dermatofibrosarcoma protuberans)、Merkel氏細胞癌、神經膠質母細胞瘤、神經膠質瘤、肉瘤、間皮瘤或骨髓增生異常綜合徵(Myelodysplastic syndromes)等血液腫瘤及實體瘤。
另一方面,本發明更提供一種藥物組合物,其包含本發明的重組蛋白或融合蛋白以及任選的佐劑、賦形劑或藥學上可接受的載體。組合物可以含有藥學上可接受的載體。組合物能以任意形式的藥物製劑存在,包括但不限於注射劑、粉劑、冷凍乾燥粉末等。該藥物製劑形式的藥物組合物,可按照製劑學的通常技術製備,包括將藥物活性成分、本發明的重組蛋白或融合蛋白與藥物載體融合,按照製劑學的通常技術製成所需要的劑型。
在一實施方案中,本發明更提供一種藥物組合物,包含編碼本發明重組蛋白或融合蛋白的核酸分子的表現載體及任選的可藥用的載體。
另一個方面,本發明更提供一種治療腫瘤的方法,包括向患者或受試者施用治療有效量的本發明所述藥物組合物。所述腫瘤表現額外的標靶目標分子,所述標靶目標包括但不限於5T4、AGS-16、ALK1、ANG-2、B7-H3、B7-H4、c-fms、c-Met、CA6、CD123、CD19、CD20、CD22、EpCAM、CD30、CD32b、CD37、CD38、CD40、CD52、CD70、CD74、CD79b、CD98、CEA、CEACAM5、CLDN18.2、CLDN6、CS1、CXCR4、DLL-4、EGFR、EGP-1、ENPP3、EphA3、ETBR、FGFR2、FN、FR-α、GCC、GD2、GPC-3、GPNMB、HER2、HER3、HLA-DR、ICAM-1、IGF-1R、IL-3R、LIV-1、MSLN、MUC16、MUC1、NaPi2b、結合素-4、Notch 2、Notch 1、PD-L1、PD-L2、PDGFR-α、PS、PSMA、SLTRK6、STEAP1、TEM1、VEGFR、CD25、CD27L、DKK-1、CSF-1R、MSB0010718C、BCMA、CD138。
另一方面,本發明更提供一種體內基因療法,包括向患者或受試者引入治療有效量之編碼本發明重組蛋白或融合蛋白的核酸分子或其衍生物。
另一方面,本發明更提供一種用於體外評價標靶CD47且具有ADCC活性的重組蛋白/抗體的早期免疫安全性的方法,該方法包括:a)提供標靶且具有ADCC活性的重組蛋白/抗體(包括單價或多價);b)檢測所述重組蛋白/抗體的ADCC活性;c)評價所述重組蛋白/抗體(包括單價或多價)的早期免疫安全性。
在一實施方案中,本發明提供用於體外評價標靶CD47且具有ADCC活性的重組蛋白/抗體的早期免疫安全性的方法,包括:a)製備效應細胞,例如但不限於人類NK92MI-CD16a效應細胞;b)使效應細胞與重組蛋白/抗體接觸;c)檢測重組蛋白/抗體的ADCC活性;d)根據ADCC活性結果,評價重組蛋白/抗體的早期免疫安全性。
在另一實施方案中,本發明提供用於體外評價標靶CD47且具有ADCC活性的重組蛋白/抗體的早期免疫安全性的方法,包括:a)收獲生長良好的人類NK92MI-CD16a效應細胞,將收獲的效應細胞重新懸浮至細胞密度為1×105
個細胞/ml至5×106
個細胞/ml;b)將梯度稀釋的重組蛋白/抗體與a)中所製備獲得的效應細胞進行培養,培養時間為0.5~5h;c)培養完成後,測定LDH活性,計算細胞溶解(cell lysis)率;d)根據細胞溶解率評價重組蛋白/抗體的早期免疫安全性,其中導致較低細胞溶解率的重組蛋白/抗體的免疫安全性高。
另一方面,本發明更提供一種用於體內評價標靶CD47的重組蛋白/抗體(包括單價或多價)的早期免疫安全性的方法,該方法包括:a)提供標靶CD47重組蛋白/抗體(包括單價或多價);b)提供Hu-NSG鼠;c)將所述重組蛋白/抗體與Hu-NSG鼠接觸;d)評價所述重組蛋白/抗體在所述Hu-NSG鼠中的早期免疫安全性。
在一實施方案中,本發明提供一種用於體內評價標靶CD47的重組蛋白/抗體(包括單價或多價)的早期免疫安全性的方法,該方法包括:a)提供Hu-NSG小鼠;b)施用重組蛋白/抗體(包括單價或多價);c)施用24~96h後,取小鼠靜脈血液,溶解紅血球,其餘細胞用螢光標記的抗人類CD45、抗人類CD19或抗人類CD3的抗體共同培養15~60min,進行流式細胞儀檢測;d)根據細胞清除率評價重組蛋白/抗體的早期免疫安全性,其中導致較低免疫細胞(靶細胞除外)清除率的重組蛋白/抗體的免疫安全性高。
本發明的有益效果:
本發明藉由低親和阻斷CD47與SIRPα相互作用的融合蛋白,而減少本發明的重組蛋白與非腫瘤細胞(如紅血球、NK細胞、T細胞等)上的CD47標靶目標的結合,從而提高本發明所述重組蛋白的安全性(如避免抗CD47抗體/重組蛋白,如Hu5F9-G4,所引起的貧血、紅血球凝集、CD47陽性的非腫瘤靶細胞殺傷,降低由高親和突變的SIRPα-Fc融合蛋白引起的潛在安全性、免疫原性、穩定性等不確定因素所帶來的風險等)。
在本發明中意外發現,藉由高親和標靶腫瘤細胞的臂與低親和阻斷CD47與SIRPα相互作用,可非常顯著地提高本發明的重組蛋白與腫瘤細胞的結合親和力,從而媒介高效殺傷腫瘤細胞的作用(包括但不限於抗體與腫瘤表面標靶抗原特異性結合後發揮的效應功能、巨噬細胞的標靶吞噬作用)。
本發明的重組蛋白藉由高親和標靶腫瘤的臂(例如不限於半抗體)與低親和阻斷CD47與SIRPα相互作用的融合蛋白實現雙標靶目標作用,並且本發明的結果顯示,本發明的重組蛋白借助於高親和標靶腫瘤的臂以及低親和阻斷CD47與SIRPα相互作用的融合蛋白二者之間多種作用,透過多種機制發揮抗腫瘤作用,藥效更高。
相較於兩個分開的標靶抗體聯用,本發明的重組蛋白具有成本更低、使用更加方便等優勢,因而可解決在抗體聯用情況下患者順應性低、治療費過高等問題。
本發明的重組蛋白與典型的雙特異性抗體(由二個半抗體組成)相比,由於阻斷CD47與SIRPα相互作用的融合蛋白分子量小於典型雙特異性抗體的單臂(半抗體),因此,重組蛋白的組織滲透性優於典型的雙特異性抗體,藥效更高。
本發明的低親和阻斷CD47與SIRPα相互作用的融合蛋白包含不同長度的SIRPα胞外截斷體,可以與高親和標靶腫瘤的臂(例如不限於半抗體)快速進行最佳配對,避免通常雙功能抗體在同步結合兩個標靶抗原時可能受到兩個標靶抗原空間結構影響(尤其,在兩個標靶抗原的抗體辨識位點距離細胞膜的長短差異較大時,腫瘤標靶抗原與CD47抗原的同步結合難的問題)的情況,使得所獲得的重組蛋白與腫瘤細胞有更佳的結合,從而發揮更好的腫瘤殺傷效力。
本發明提供新的標靶CD47的免疫治療藥物體外安全性評價方法。通常抗CD47抗體早期安全性評價一般採用檢測藥物對紅血球凝集的作用來進行評價。然而,由於人源SIRPα與CD47的結合存在物種特異性,因此在評價標靶CD47的重組蛋白/抗體是否在人體內存在紅血球凝集的安全性問題時,必須使用人血,而人血的使用受到了倫理、遺傳資源等方面的限制。此外,紅血球凝集的實驗無法早期評價藥品的免疫安全性。本發明使用改良後的ADCC活性檢測的方法(早期體外免疫安全性評價實驗)代替傳統的人類紅血球凝集實驗,用於評價標靶CD47且具有ADCC活性的重組蛋白/抗體(包括單價或多價)的早期免疫安全性,該評價方法簡單快速且不受血液來源的限制。
本發明提供新的標靶CD47的免疫治療藥物體內安全性評價方法。臨床前的藥物體內免疫安全性評價一般使用非人類靈長類,所需樣本數量較大,增加早期樣本製備的難度及成本。其他物種尚無成熟的早期體內免疫安全性評價方法,因此導致藥品在未來臨床研究中巨大的安全隱憂,造成研發投入的浪費。本發明提供Hu-NSG鼠,其中在Hu-NSG鼠上發展的早期安全性評價實驗能模擬藥物在人體免疫系統的安全性情況,相較於臨床前或臨床研究,其製備難度及成本降低,具有檢測費用低、檢測效率高等優勢,降低腫瘤免疫治療藥物研發的風險。
本發明透過提供重組蛋白,藉由高親和標靶腫瘤的臂而實現對腫瘤的高親和力、特異性標靶,並藉由低親和阻斷CD47與SIRPα相互作用的融合蛋白而實現對CD47-SIRPα相互作用的阻斷。
本發明的重組蛋白克服通常雙功能抗體目標產物產率低、純化難的技術問題。在本發明的一實施方式中,重組蛋白其右臂(Fc knob突變)為單鏈蛋白,當左臂輕鏈、左臂重鏈(Fc hole突變)及右臂(Fc knob突變)三者在細胞中共同表現時,表現產物經蛋白A純化80%以上皆為目標蛋白,有效地提高表現產率。雖有少量左臂二聚體、右臂二聚體或左右臂單體存在,但由於此等產物的分子量、電荷分佈等差異明顯,容易藉由通常純化手段,例如離子交換層析、疏水層析法、粒徑篩析層析法、親和層析法、鹽析法(例如硫酸銨沉澱法)而去除,適用於工業化放大生產。
本發明的低親和阻斷CD47與SIRPα相互作用的融合蛋白能與高親和標靶腫瘤的臂(例如但不限於半抗體)普遍形成可拮抗CD47免疫抑制功效的重組蛋白。
本發明克服現有技術已有的缺陷,亦即SIRPα-Fc融合蛋白由於與CD47的親和力低而藥效不顯著,本發明又避免SIRPα高親和力突變體可能帶來的免疫原性高、非腫瘤標靶特異性高等諸多不利影響。同時,由於本發明的重組蛋白具有對正常細胞(比如紅血球)表面表現的CD47弱的結合親和力,從而降低或避免通常抗CD47抗體治療產生的紅血球凝集、貧血等副作用。
本領域技術人員應當理解的是,本發明所保護的範圍並不會因為本發明的某一項技術方案能夠實現某一項本發明明示或暗示的有益效果而不能實現或者完全實現另一項有益效果而被不恰當地限制。本領域技術人員應當理解的是,在本發明的保護範圍內,任一項產品、方法或者用途只要獲得了任一項本發明明示或暗示的有益效果或者任選自本發明明示或暗示的有益效果的組合,即表示其解決了本發明想要解決的技術問題,實現了相應的技術效果。
具體而言,本發明關於以下實施方案:
實施方案1. 雙特異性重組蛋白,其包含:標靶腫瘤的臂、以及阻斷CD47與SIRPα相互作用的融合蛋白。
實施方案2. 實施方案1的雙特異性重組蛋白,其中阻斷CD47與SIRPα相互作用的融合蛋白包含SIRPα胞外截斷體(包括人源SIRPα野生型胞外截斷體或CD47非高親和突變的人源SIRPα胞外截斷體)。
實施方案3. 實施方案2的雙特異性重組蛋白,其中SIRPα胞外截斷體包含SIRPα的胞外胺基酸序列的部分或全部。
實施方案4. 實施方案1~3任一項的雙特異性重組蛋白,其中高親和標靶腫瘤的臂不結合CD47,且高親和標靶腫瘤的臂對應的抗體對腫瘤細胞上標靶抗原的結合親和力係低親和阻斷CD47與SIRPα相互作用的融合蛋白所對應的單體融合蛋白同型二聚體對腫瘤細胞上CD47結合親和力的至少6倍。
實施方案5. 實施方案1~4任一項的雙特異性重組蛋白,其中SIRPα胞外截斷體包括選自如下a1)~a4)任一種的胺基酸序列: a1)SEQ ID No:30; a2)SEQ ID No:31; a3)SEQ ID No:32; a4)上述胺基酸序列中任一種胺基酸序列經過加成、缺失、修飾及/或保留式取代至少一個胺基酸殘基例如1~5個胺基酸殘基所獲得的胺基酸序列,其單體具有對CD47蛋白的結合親和力並且該結合親和力不高於a1)、a2)或a3)單體對CD47蛋白的結合親和力的胺基酸序列。
實施方案6. 實施方案1~5任一項的雙特異重組蛋白,其中雙特異性重組蛋白具有相對設置的左、右兩臂結構,高親和標靶腫瘤的臂位於左臂的位置,所述的低親和阻斷CD47與SIRPα相互作用的融合蛋白位於右臂的位置。
實施方案7. 實施方案6的雙特異重組蛋白,其左臂為免疫球蛋白的Fab或Fab’形式,右臂為SIRPα胞外截斷體。
實施方案8. 實施方案7的雙特異重組蛋白,其右臂的長度與左臂需結合的抗原空間表位距離靶細胞膜表面的遠近相適配。
實施方案9. 實施方案8的雙特異重組蛋白,其高親和標靶腫瘤的臂需結合靶細胞近膜端的表位時,SIRPα胞外截斷體選擇含a1)~a4)中較短的胺基酸序列。
實施方案10. 實施方案1~9任一項的雙特異性重組蛋白,其中標靶腫瘤的臂標靶選自下列的標靶目標:5T4、AGS-16、ALK1、ANG-2、B7-H3、B7-H4、c-fms、c-Met、CA6、CD123、CD19、CD20、CD22、EpCAM、CD30、CD32b、CD37、CD38、CD40、CD52、CD70、CD74、CD79b、CD98、CEA、CEACAM5、CLDN18.2、CLDN6、CS1、CXCR4、DLL-4、EGFR、EGP-1、ENPP3、EphA3、ETBR、FGFR2、FN、FR-α、GCC、GD2、GPC-3、GPNMB、HER2、HER3、HLA-DR、ICAM-1、IGF-1R、IL-3R、LIV-1、MSLN、MUC16、MUC1、NaPi2b、結合素-4、Notch 2、Notch 1、PD-L1、PD-L2、PDGFR-α、PS、PSMA、SLTRK6、STEAP1、TEM1、VEGFR、CD25、CD27L、DKK-1、CSF-1R、MSB0010718C、BCMA、CD138。
實施方案11. 實施方案10的雙特異性重組蛋白,其中當所述標靶目標為CD20、EGFR或PD-L1時,SIRPα胞外截斷體選擇a1);當所述標靶目標為HER2時,SIRPα胞外截斷體選擇a1或a2)。
實施方案12. 實施方案1~11任一項的雙特異性重組蛋白,其標靶腫瘤的臂以及阻斷CD47與SIRPα相互作用的融合蛋白藉由分子間作用力結合,或藉由共價鍵例如鏈間雙硫鍵結合,或藉由鹽鍵結合,或藉由上述結合方式中的兩種或三種的組合而結合。
實施方案13. 實施方案1~12任一項的雙特異性重組蛋白,其中標靶腫瘤的臂及/或阻斷CD47與SIRPα相互作用的融合蛋白更包含Fc區域。
實施方案14. 實施方案13的雙特異性重組蛋白,其Fc區域包含Fc區域天然序列或Fc非天然序列。
實施方案15. 實施方案14的雙特異性重組蛋白,其Fc區域為人類Fc區域。
實施方案16. 實施方案15的雙特異性重組蛋白,其高親和標靶腫瘤的臂以及低親和阻斷CD47與SIRPα相互作用的融合蛋白的結合係藉由knobs-into-holes結合。
實施方案17. 實施方案1~16任一項的雙特異性重組蛋白,其中標靶腫瘤的臂為標靶選自下列標靶目標的半抗體:5T4、AGS-16、ALK1、ANG-2、B7-H3、B7-H4、c-fms、c-Met、CA6、CD123、CD19、CD20、CD22、EpCAM、CD30、CD32b、CD37、CD38、CD40、CD52、CD70、CD74、CD79b、CD98、CEA、CEACAM5、CLDN18.2、CLDN6、CS1、CXCR4、DLL-4、EGFR、EGP-1、ENPP3、EphA3、ETBR、FGFR2、FN、FR-α、GCC、GD2、GPC-3、GPNMB、HER2、HER3、HLA-DR、ICAM-1、IGF-1R、IL-3R、LIV-1、MSLN、MUC16、MUC1、NaPi2b、結合素-4、Notch 2、Notch 1、PD-L1、PD-L2、PDGFR-α、PS、PSMA、SLTRK6、STEAP1、TEM1、VEGFR、CD25、CD27L、DKK-1、CSF-1R、MSB0010718C、BCMA、CD138;較佳為IgG1抗體的半抗體,任選自為人鼠嵌合的半抗體、人源化的半抗體、全人源的半抗體;更佳為人源化或全人源的IgG1抗體的半抗體。
實施方案18.實施方案1~17任一項的雙特異性重組蛋白,其中阻斷CD47與SIRPα相互作用的融合蛋白包含:SIRPα胞外截斷體、以及用於結合所述臂的結合序列的融合蛋白,SIRPα胞外截斷體以及用於結合所述臂的結合序列任選藉由接合子連接,所述用於結合所述臂的結合序列任選地為Fc區域。
實施方案19.實施方案1~18任一項的雙特異性重組蛋白,其中阻斷CD47與SIRPα相互作用的融合蛋白包括選自如下b1)~b4)任一種的胺基酸序列: b1)SEQ ID No:26; b2)SEQ ID No:27; b3)SEQ ID No:28; b4)上述胺基酸序列中任一種胺基酸序列經過加成、缺失、修飾及/或保留式取代至少一個胺基酸殘基例如1~5個胺基酸殘基所獲得的胺基酸序列,其同型二聚體具有對CD47蛋白的結合親和力並且該結合親和力不高於b1)、b2)或b3)同型二聚體對CD47蛋白的結合親和力的胺基酸序列。
實施方案20.實施方案19的雙特異性重組蛋白,其中高親和標靶腫瘤的臂標靶CD20時,所述高親和標靶腫瘤的臂包含SEQ ID No:16與SEQ ID No:17,所述低親和阻斷CD47與SIRPα相互作用的融合蛋白包含SEQ ID No:26;其中高親和標靶腫瘤的臂標靶EGFR時,所述高親和標靶腫瘤的臂包含SEQ ID No:19與SEQ ID No:8,所述低親和阻斷CD47與SIRPα相互作用的融合蛋白包含SEQ ID No:26;其中高親和標靶腫瘤的臂標靶Her2時,所述高親和標靶腫瘤的臂包含SEQ ID No:20與SEQ ID No:21,或SEQ ID No:22與SEQ ID No:23,所述低親和阻斷CD47與SIRPα相互作用的融合蛋白包含SEQ ID No:26或SEQ ID No:27;或,其中高親和標靶腫瘤的臂標靶PD-L1時,所述高親和標靶腫瘤的臂包含SEQ ID No:24與SEQ ID No:13,所述低親和阻斷CD47與SIRPα相互作用的融合蛋白包含SEQ ID No:26。
實施方案21.編碼實施方案1~20任一項的雙特異性重組蛋白的核酸分子。
實施方案22.實施方案21的核酸分子,編碼高親和標靶腫瘤的臂之核酸分子以及編碼低親和阻斷CD47與SIRPα相互作用的融合蛋白之核酸位在同一條DNA鏈中,或位在不同的DNA鏈中。
實施方案23.包含實施方案21或22的核酸分子的表現載體。
實施方案24.包含實施方案23的表現載體的細胞。
實施方案25.製備實施方案1~20任一項的雙特異性重組蛋白的方法,其包括: 1)提供標靶腫瘤的臂; 2)提供阻斷CD47與SIRPα相互作用的融合蛋白; 3)使標靶腫瘤的臂以及阻斷CD47與SIRPα相互作用的融合蛋白接觸形成所述重組蛋白。
實施方案26.實施方案25的製備方法,其中使實施方案24的細胞表現所述重組蛋白。
實施方案27.實施方案25的製備方法,其中接觸包括藉由分子間作用力結合,或藉由共價鍵例如鏈間雙硫鍵結合,或藉由鹽鍵結合,或藉由上述結合方式中的兩種或三種的組合而結合。
實施方案28.實施方案25~27任一項的製備方法,其中接觸包括藉由knobs-into-holes技術結合。
實施方案29.融合蛋白,其特徵在於,所述融合蛋白包含:SIRPα胞外截斷體、以及用於結合另一多肽的結合序列。
實施方案30.實施方案29的融合蛋白,其中用於結合另一多肽的結合序列為Fc區域;任選地,其中Fc區域包含holes突變及/或knobs突變。
實施方案31.實施方案29或30的融合蛋白,其中SIRPα胞外截斷體包含:人源SIRPα野生型、以及其非高親和突變體的胞外胺基酸序列的部分或全部。
實施方案32.實施方案31的融合蛋白,其中SIRPα胞外截斷體包括選自如下a1)~a4)任一種的胺基酸序列: a1)SEQ ID No:30; a2)SEQ ID No:31; a3)SEQ ID No:32; a4)上述胺基酸序列中任一種胺基酸序列經過加成、缺失、修飾及/或保留式取代至少一個胺基酸殘基例如1~5個胺基酸殘基所獲得的胺基酸序列,其單體具有對CD47蛋白的結合親和力並且該結合親和力不高於a1)、a2)或a3)單體對CD47蛋白的結合親和力的胺基酸序列。
實施方案33.實施方案29~32任一項的融合蛋白,其包括選自如下b1)~b4)任一種的胺基酸序列: b1)SEQ ID No:26; b2)SEQ ID No:27; b3)SEQ ID No:28; b4)上述胺基酸序列中任一種胺基酸序列經過加成、缺失、修飾及/或保留式取代至少一個胺基酸殘基例如1~5個胺基酸殘基所獲得的胺基酸序列,其同型二聚體具有對CD47蛋白的結合親和力並且該結合親和力不高於b1)、b2)或b3)同型二聚體對CD47蛋白的結合親和力的胺基酸序列。
實施方案34.編碼實施方案29~33任一項的融合蛋白的核酸分子。
實施方案35.包含實施方案34的核酸分子的表現載體。
實施方案36.包含實施方案35的表現載體的細胞。
實施方案37.製備實施方案29~33任一項的融合蛋白的方法,其包括: 1)提供SIRPα胞外截斷體; 2)提供用於結合另一多肽的結合序列; 3)使SIRPα胞外截斷體以及用於結合另一多肽的結合序列接觸形成所述融合蛋白。
實施方案38.製備實施方案29~33任一項的融合蛋白的方法,其中使實施方案32的細胞表現所述融合蛋白。
實施方案39.藥物組合物,其包含實施方案1~20任一項的重組蛋白或實施方案29~33任一項的融合蛋白,以及任選的佐劑、賦形劑或藥學上可接受的載體。
實施方案40.實施方案39的藥物組合物,其為注射劑或凍乾粉末形式。
實施方案41.藥物組合物,其包含編碼實施方案1~20任一項的重組蛋白或實施方案29~33任一項的融合蛋白的核酸分子,以及任選的可藥用的載體。
實施方案42.實施方案29~33任一項的融合蛋白在用於製備實施方案1~20任一項的重組蛋白中的用途。
實施方案43.實施方案1~20任一項的重組蛋白或實施方案29~33任一項的融合蛋白在用於製備治療腫瘤的藥物中的用途。
實施方案44.實施方案43的用途,其中腫瘤選自乳腺癌、結腸直腸癌、肺癌、胰腺癌、食道癌、子宮內膜癌、卵巢癌、胃癌、前列腺癌、腎癌、子宮頸癌、骨髓瘤、淋巴瘤、白血病、甲狀腺癌、子宮癌、膀胱癌、神經內分泌癌、頭頸癌、肝癌、鼻咽癌、睪丸癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、黑色素瘤、基底細胞皮膚癌、鱗狀細胞皮膚癌、隆突性皮膚纖維肉瘤、Merkel氏細胞癌、神經膠質母細胞瘤、神經膠質瘤、肉瘤、間皮瘤或骨髓增生異常綜合徵等血液腫瘤以及實體瘤。
實施方案45.編碼實施方案1~20任一項的重組蛋白或實施方案29~33任一項的融合蛋白的核酸分子或其衍生物在製備用於體內基因療法的藥物中的用途。
實施方案46.用於體外評價標靶CD47且具有ADCC活性的重組蛋白/抗體的早期免疫安全性的方法,該方法包括: a)提供標靶且具有ADCC活性的重組蛋白/抗體(包括單價或多價); b)檢測所述重組蛋白/抗體的ADCC活性; c)評價所述重組蛋白/抗體的早期免疫安全性。
實施方案47.用於體外評價標靶CD47且具有ADCC活性的重組蛋白/抗體的早期免疫安全性的方法,該方法包括: a)製備效應細胞,例如但不限於人NK92MI-CD16a效應細胞; b)使效應細胞與重組蛋白/抗體(包括單價或多價)接觸; c)檢測所述重組蛋白/抗體的ADCC活性; d)根據ADCC活性結果,評價所述重組蛋白/抗體的早期免疫安全性。
實施方案48.實施方案47的評價方法,包括: a)收獲生長良好的人類NK92MI-CD16a效應細胞,將收獲的效應細胞重新懸浮至細胞密度為1×105
個細胞/ml至5×106
個細胞/ml; b)將梯度稀釋的重組蛋白/抗體與a)中所製備獲得的效應細胞進行培養,培養時間為0.5~5h; c)培養完成後,測定LDH活性,計算細胞溶解率; d)根據細胞溶解率評價重組蛋白/抗體的早期免疫安全性,其中導致較低細胞溶解率的重組蛋白/抗體的免疫安全性高。
實施方案49.用於體內評價標靶CD47的重組蛋白/抗體(包括單價或多價)的早期免疫安全性的方法,該方法包括: a)提供標靶CD47重組蛋白/抗體(包括單價或多價); b)提供Hu-NSG鼠; c)將所述重組蛋白/抗體與Hu-NSG鼠接觸; d)評價所述重組蛋白/抗體在所述Hu-NSG鼠中的早期免疫安全性。
實施方案50.用於體內評價標靶CD47的重組蛋白/抗體(包括單價或多價)的早期免疫安全性的方法,該方法包括: a)提供Hu-NSG小鼠; b)施用重組蛋白/抗體(包括單價或多價); c)施用24~96h後,取小鼠靜脈血液,溶解紅血球,剩餘細胞用螢光標記的抗人類CD45、抗人類CD19或抗人類CD3的抗體共同培養15~60min,進行流式細胞儀檢測; d)根據細胞清除率評價重組蛋白/抗體的早期免疫安全性,其中導致較低免疫細胞清除率(靶細胞除外)的重組蛋白/抗體的免疫安全性高。
為了促進對本發明的理解,以下將參考某些實施方式,並且將使用特定語言來描述本發明。然而,應當理解的是,這些具體實施方式不意圖限制本發明的範圍。所描述的實施方式中的任何改變與進一步的修改,以及本發明的任何進一步應用,皆為本領域技術人員通常會想到的。
重組蛋白
如本文所用,術語「重組蛋白」係指人工設計/構建的蛋白,而不是天然存在的蛋白質。本發明的「重組蛋白」中的「重組」不代表其生產方式,其僅用於表示「重組蛋白」並不天然存在。本發明的重組蛋白可為表現的蛋白,亦可為組裝的蛋白。
任選地,本發明的重組蛋白包含:高親和標靶腫瘤的臂、以及低親和阻斷CD47與SIRPα相互作用的融合蛋白。
本文所使用的「高親和標靶腫瘤」係指本發明的重組蛋白對腫瘤的結合親和力高於或大致相當於現有技術中結合腫瘤的抗體類藥物對腫瘤的結合親和力,現有技術中結合腫瘤的抗體類藥物對腫瘤的結合親和力通常EC50在nM或pM等級。較佳地,本發明的重組蛋白中,高親和標靶腫瘤的臂所對應之抗體對腫瘤細胞上標靶抗原的結合親和力係低親和阻斷CD47與SIRPα相互作用的融合蛋白所對應之單體融合蛋白同型二聚體對腫瘤細胞上CD47結合親和力的至少6倍,任選地6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍,或更高的倍數值,或其間的任意數值。任選地,本發明的重組蛋白中,高親和標靶腫瘤的臂所對應之抗體對腫瘤細胞上標靶抗原的結合親和力係低親和阻斷CD47與SIRPα相互作用的融合蛋白所對應之SIRPα-Fc同型二聚體對腫瘤細胞上CD47結合親和力的至少6倍,任選地6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍,或更高的倍數值,或其間的任意數值。
本文所使用的「低親和阻斷CD47與SIRPα相互作用」係指本發明的重組蛋白能以較低的親和力阻斷CD47與SIRPα相互作用。較佳地,本發明的重組蛋白中低親和阻斷CD47與SIRPα相互作用的融合蛋白對CD47的結合親和力不高於含SIRPα胞外截斷體的單體融合蛋白的同型二聚體對CD47的結合親和力。更佳地,不高於人源SIRPα-Fc融合蛋白對CD47的結合親和力。
本文所述雙特異性重組蛋白,當其高親和標靶腫瘤的臂所對應之抗體對腫瘤細胞上標靶抗原的結合親和力係其阻斷CD47與SIRPα相互作用的融合蛋白的臂所對應之單體融合蛋白同型二聚體對腫瘤細胞上CD47結合親和力的至少6倍時,即可實現顯著提高具有調節巨噬細胞功能重組蛋白的腫瘤標靶飽和結合豐度及降低非腫瘤標靶的副作用的缺陷。
本文所使用的結合親和力的測定方法為本領域技術人員所熟知,包括例如但不限於ELISA法及/或流式細胞儀。
任選地,本發明所述訊息調節蛋白α胞外截斷體(含野生型胞外截斷體及其非高親和突變體胞外截斷體)-Fc融合蛋白與半抗體可以藉由改造抗體重鏈使形成異源二聚體,具體地,例如可以藉由Knobs-into-holes連接及/或鏈間雙硫鍵及/或鹽鍵媒介而得到重組蛋白。
任選地,當「標靶腫瘤的臂」、「半抗體」、「左臂」、「半抗體結構」或「Ig分子單體」與「標靶CD47的臂」、「右臂」、「訊息調節蛋白α截斷體-Fc融合蛋白」或「SIRPα-Fc」藉由knobs-into-holes連接而得到重組蛋白時,所得重組蛋白的結構如圖3所示。其中,左臂為腫瘤標靶的半抗體,包括但不限於抗5T4半抗體、抗AGS-16半抗體、抗ALK1半抗體、抗ANG-2半抗體、抗B7-H3半抗體、抗B7-H4半抗體、抗c-fms半抗體、抗c-Met半抗體、抗CA6半抗體、抗CD123半抗體、抗CD19半抗體、抗CD20半抗體、抗CD22半抗體、抗EpCAM半抗體、抗CD30半抗體、抗CD32b半抗體、抗CD37半抗體、抗CD38半抗體、抗CD40半抗體、抗CD52半抗體、抗CD70半抗體、抗CD74半抗體、抗CD79b半抗體、抗CD98半抗體、抗CEA半抗體、抗CEACAM5半抗體、抗CLDN18.2半抗體、抗CLDN6半抗體、抗CS1半抗體、抗CXCR4半抗體、抗DLL-4半抗體、抗EGFR半抗體、抗EGP-1半抗體、抗ENPP3半抗體、抗EphA3半抗體、抗ETBR半抗體、抗FGFR2半抗體、抗FN半抗體、抗FR-α半抗體、抗GCC半抗體、抗GD2半抗體、抗GPC-3半抗體、抗GPNMB半抗體、抗HER2半抗體、抗HER3半抗體、抗HLA-DR半抗體、抗ICAM-1半抗體、抗IGF-1R半抗體、抗IL-3R半抗體、抗LIV-1半抗體、抗MSLN半抗體、抗MUC16半抗體、抗MUC1半抗體、抗NaPi2b半抗體、抗結合素-4半抗體、抗Notch 2半抗體、抗Notch 1半抗體、抗PD-L1半抗體、抗PD-L2半抗體、抗PDGFR-α半抗體、抗PS半抗體、抗PSMA半抗體、抗SLTRK6半抗體、抗STEAP1半抗體、抗TEM1半抗體、抗VEGFR半抗體、抗CD25半抗體、抗CD27L半抗體、抗DKK-1半抗體、抗CSF-1R半抗體、抗MSB0010718C半抗體、抗BCMA半抗體、抗CD138半抗體。右臂為SIRPα(包括人源SIRPα野生型及其非高親和突變體)胞外截斷體藉由與IgG抗體的鉸鏈區而與Fc區域連接形成的融合蛋白。其中右臂Fc區域為hole突變體時,對應左臂Fc區域為knob突變體;右臂為knob突變體時,對應左臂Fc區域為hole突變體。如本領域技術人員所知,Fc區域更可同時做多個holes及/或knobs突變。
下表1為重組蛋白的示例性分子結構。
表1. 重組蛋白的分子結構示例
D1m
表示SIRPα胞外截斷體D1的高親和突變體;D1表示人源SIRPα野生型及其非高親和突變體的胞外D1區域;Fc表示野生型Fc區域、Fc1表示具有hole或holes突變的Fc區域、Fc2表示具有knob或knobs突變的Fc區域。
本發明重組蛋白的相應胺基酸序列與DNA序列揭示於圖17A~E並揭示於本發明的序列表文件。
抗體
如本文所用,術語「抗體」或「免疫球蛋白」係有相同結構特徵的約150000道爾頓的異四聚醣蛋白,其由兩個相同的輕鏈(L)及兩個相同的重鏈(H)組成。每條輕鏈藉由一個共價雙硫鍵與重鏈相連,而不同免疫球蛋白同種型之重鏈間的雙硫鍵數目不同。每條重鏈及輕鏈亦有規則間隔的鏈內雙硫鍵。每條重鏈的一端有可變區(VH),其後係多個恆定區。每條輕鏈的一端有可變區(VL),另一端有恆定區;輕鏈的恆定區與重鏈的第一個恆定區相對,輕鏈的可變區與重鏈的可變區相對。特殊的胺基酸殘基在輕鏈及重鏈的可變區之間形成界面。
標靶腫瘤的臂
如本文所用,術語「標靶腫瘤的臂」、「半抗體」、「左臂」、「半抗體結構」或「Ig分子單體」係指由抗體的一條輕鏈(L)及一條重鏈(H)組成的異二聚醣蛋白,係構成免疫球蛋白分子的基本結構,在本發明中可以互換使用;其分子量為對應抗體分子量的一半,約75000道爾頓,其中輕鏈藉由一個共價雙硫鍵與重鏈相連。重鏈及輕鏈亦有規則間隔的鏈內雙硫鍵。每條重鏈的一端有可變區(VH),其後為多個恆定區。每條輕鏈的一端有可變區(VL),另一端有恆定區;輕鏈的恆定區與重鏈的第一個恆定區相對,輕鏈的可變區與重鏈的可變區相對。特殊的胺基酸殘基在輕鏈及重鏈的可變區之間形成界面。
如本文所用,術語「標靶腫瘤的臂」、「半抗體」、「左臂」、「半抗體結構」或「Ig分子單體」可為各種腫瘤標靶的IgG蛋白。腫瘤標靶目標分子包括但不限於5T4、AGS-16、ALK1、ANG-2、B7-H3、B7-H4、c-fms、c-Met、CA6、CD123、CD19、CD20、CD22、EpCAM、CD30、CD32b、CD37、CD38、CD40、CD52、CD70、CD74、CD79b、CD98、CEA、CEACAM5、CLDN18.2、CLDN6、CS1、CXCR4、DLL-4、EGFR、EGP-1、ENPP3、EphA3、ETBR、FGFR2、FN、FR-α、GCC、GD2、GPC-3、GPNMB、HER2、HER3、HLA-DR、ICAM-1、IGF-1R、IL-3R、LIV-1、MSLN、MUC16、MUC1、NaPi2b、結合素-4、Notch 2、Notch 1、PD-L1、PD-L2、PDGFR-α、PS、PSMA、SLTRK6、STEAP1、TEM1、VEGFR、CD25、CD27L、DKK-1、CSF-1R、MSB0010718C、BCMA、CD138。
「標靶腫瘤的臂」、「半抗體」、「左臂」、「半抗體結構」或「Ig分子單體」的Fc序列可採用hole或holes突變體及/或knob或knobs突變體。
標靶CD47的臂
如本文所用,術語「標靶CD47的臂」、「右臂」、「訊息調節蛋白α截斷體-Fc融合蛋白」、「SIRPα-Fc」或「阻斷CD47與SIRPα相互作用的融合蛋白」在本發明中可以互換使用。如本領域技術人員所知曉地,所述「標靶CD47的臂」、「右臂」、「訊息調節蛋白α截斷體-Fc融合蛋白」、「SIRPα-Fc」或「阻斷CD47與SIRPα相互作用的融合蛋白」分子長度可變。任選地,可藉由SIRPα(包括人源SIRPα野生型及其非高親和突變體)的胞外截斷體與IgG1抗體的鉸鏈區及Fc區域連接,從而形成的多種分子長度不同的「標靶CD47的臂」、「右臂」、「訊息調節蛋白α截斷體-Fc融合蛋白」、「SIRPα-Fc」或「阻斷CD47與SIRPα相互作用的融合蛋白」。IgG1可為人源IgG1。
「標靶CD47的臂」、「右臂」、「訊息調節蛋白α截斷體-Fc融合蛋白」、「SIRPα-Fc」或「阻斷CD47與SIRPα相互作用的融合蛋白」的Fc可採用knob或knobs突變體及/或hole或holes突變體。
「標靶腫瘤的臂」、「半抗體」、「左臂」、「半抗體結構」或「Ig分子單體」與「標靶CD47的臂」、「右臂」、「訊息調節蛋白α截斷體-Fc融合蛋白」、「SIRPα-Fc」或「阻斷CD47與SIRPα相互作用的融合蛋白」如本領域技術人員所知,可以藉由改造Fc片段(區)而使形成異源二聚體重組蛋白。具體地,本發明的重組蛋白,可藉由分子間作用力而獲得,亦可藉由共價鍵例如鏈間雙硫鍵而獲得,亦可藉由鹽鍵媒介而獲得,亦可藉由上述三種技術中的兩種或三種的任意組合而獲得。任選地,本發明的重組蛋白係藉由knobs-into-holes技術而結合。
knobs-into-holes技術
如本文所用,術語「knobs-into-holes技術」、「杵臼」技術、「隆突-入-空穴」技術或「紐扣」技術,係利用基因工程技術,在重鏈兩個CH3區域引入不同的突變以促使重鏈發生異源二聚化,一條重鏈上做一個鈕(knob),在另一條重鏈上做一個扣(hole),然後兩者優先咬合在一起形成非對稱抗體(Ridgway JB, et al. 'Knobs-into-holes' engineering of antibody CH3 domains for heavy chain heterodimerization. Protein Engineering, 1996, 9(7):617-621)。如本領域技術人員所知,一條重鏈上可做多個鈕(knob)及/或扣(hole),對應的,另一條重鏈上可做多個扣(hole)及/或鈕(knob)。
SIRPα
如本文所用,術語「SIRPα」為訊息調節蛋白α(Signal Regulatory Protein α),亦稱作CD172a。訊息調節蛋白(SIRP)為一種穿膜醣蛋白,包括三個家族成員,SIRPα(CD172a)、SIRPβ(CD172b)、SIRPγ(CD172g)。這三個成員具有相似的膜外端,但不同的膜內區。膜外端皆含有三個類免疫球蛋白(Ig)區域,其中第一個區域屬於IgV區,第二、三個區域屬於IgC區。SIRPα(CD172a)的膜內區含有兩個抑制性訊息區,可傳遞抑制訊息,抑制細胞的相應功能。SIRPβ(CD172b)及SIRPγ(CD172g)膜內區很短,沒有訊息傳遞區域,但SIRPβ(CD172b)可透過轉接蛋白(Adaptor protein,如DAP12)傳遞激活訊息。SIRP蛋白主要表現在巨噬細胞(Mφ)、樹突狀細胞(DC)、及神經元細胞。本文特指人源SIRPα野生型及其CD47非高親和突變體。
SIRPα胞外截斷體
「胞外截斷體」係指針對具有跨膜功能的蛋白質。「SIRPα胞外截斷體」,如本文所用,指人源SIRPα野生型及其CD47非高親和突變體,選擇性地截選其全部或部分位於細胞膜外部空間的胺基酸序列。
如本文所用,術語「D1、D2、D3」指SIRPα胞外的三個類Ig區域(immunoglobulin-like domains),從蛋白質的胺基端開始依次為D1區域(類Ig可變區的區域,IgV區)、D2區域(類Ig恆定區的區域,IgC區)以及D3結構域(類Ig恆定區區域,IgC區)(Lee WY, et al. The Role of cis Dimerization of Signal Regulatory Protein α (SIRPα) in Binding to CD47. J Biol Chem,2010,285 (49):37953-37963)。
SIRPα-Fc融合蛋白
如本文所用,術語「SIRPα-Fc融合蛋白」指包含SIRPα胞外截斷體、接合子以及Fc區域的融合蛋白。
為了避免醣基化的影響,本發明對D1進行了由天冬醯胺到丙胺酸的突變(參考文獻:Lee W Y, et al. Novel Structural Determinants on SIRP α that Mediate Binding to CD47. Journal of Immunology, 2007, 179(11):7741-7750)。
本發明的D1、D2、D3更包括相應的接合子。
接合子
如本文所用,術語「接合子」係指連接SIRPα胞外截斷體與結合序列的胺基酸序列,任選地,為IgG抗體的鉸鏈區,任選地,包含鉸鏈區與IgG重鏈CH1區域。
結合序列
如本文所用,術語「結合序列」係指使高親和標靶腫瘤的臂以及低親和阻斷CD47與SIRPα相互作用的融合蛋白相結合的序列,任選地,所述結合序列包含鉸鏈區及Fc區域,更任選地,所述Fc區域包含knob或knobs及/或hole或holes突變。
CD47
CD47為一種穿膜醣蛋白,屬於免疫球蛋白超家族成員,在包括紅血球在內的幾乎所有細胞表面表現。CD47的配體包括:整聯蛋白(integrin)、血小板反應素1(thrombospondin-1)、以及訊息調節蛋白(SIRP)。CD47具有多種生物學功能,包括:細胞遷移、T細胞、樹突狀細胞活化、軸突發育等。除此之外,CD47藉由與SIRPα相互作用而可抑制巨噬細胞的吞噬作用。CD47以這種方式傳遞一種所謂的「不要吃我」(「Don’t eat me」)訊息,可以保護紅血球、B細胞、T細胞等正常細胞不被巨噬細胞吞噬。
Ofa
如本文所用,術語「Ofa」、「Ofatumumab」(奧法木單抗)、「Anti-CD20(Ofatumumab)」在本發明中可以互換使用,表示抗CD20抗體Ofatumumab。
Obi
如本文所用,術語「Obi」、「Obinutuzumab」、「Anti-CD20(Obinutuzumab)」在本發明中可以互換使用,表示抗CD20抗體Obinutuzumab。
Hu5F9-G4
如本文所用,術語「Anti-CD47 mAb」、「抗CD47抗體」、「Hu5F9-G4」在本發明中可以互換使用,表示抗CD47抗體Hu5F9-G4。
Anti-EGFR mAb
如本文所用,術語「Anti-EGFR mAb」、「JMT101」在本發明中可以互換使用,表示抗EGFR抗體JMT101。JMT101為人源化抗EGFR單株抗體,參見ZL201210406288.3專利BA03。
曲妥珠單抗
如本文所用,術語「曲妥珠單抗」、「Trastuzumab」、「Anti-Her2(T) mAb」、「Herceptin」在本發明中可以互換使用,表示抗Her2抗體Trastuzumab。
帕妥珠單抗
如本文所用,術語「帕妥珠單抗」、「Pertuzumab」、「Anti-Her2(P) mAb」、「Perjeta」在本發明中可以互換使用,表示抗Her2抗體Pertuzumab。
Atezolizumab
如本文所用,術語「Tecentriq」(癌自禦)、「Atezolizumab」(阿特珠單抗)在本發明中可以互換使用,表示抗PD-L1抗體Atezolizumab。
SIRPα D1-Fc
如本文所用,術語「SIRPα D1-Fc」、「D1-Fc」在本發明中可以互換使用,表示單鏈融合蛋白SIRPα D1-Fc的二聚體。
Ofa-Fc1
表示具有hole突變的Fc區域之Ofatumumab半抗體。
Anti-Her2(T)-Fc1
表示具有hole突變的Fc區域之Transtuzumab半抗體。
Anti-Her2(P)-Fc1
表示具有hole突變的Fc區域之Pertuzumab半抗體。
Anti-EGFR-Fc1
表示具有hole突變的Fc區域之抗EGFR半抗體。
D1-Fc2
表示包含SIRPα D1區域胞外截斷體與具有knob突變的Fc區域之融合蛋白。
D1-D2-Fc2
表示包含SIRPα D1及D2區域胞外截斷體與具有knob突變的Fc區域之融合蛋白。
D1-D2-D3-Fc2
表示包含SIRPα D1、D2及D3區域胞外截斷體與具有knob突變的Fc區域之融合蛋白。
治療
如本文所用,術語「治療」、「療法」與「醫治」可以互換使用。術語「治療」包括:控制疾病、病症、病況的進展及相關症狀,較佳為減少疾病、病症、病況或減輕疾病、病症、病況的一種或多種症狀的影響。此術語包括治癒疾病或完全消除症狀。此術語包括症狀得到緩解。此術語更包括但不限於非治癒性的緩解性療法(palliative therapy)。術語「治療」包括給受試者施用治療有效量之包含本發明的重組蛋白或融合蛋白的藥物組合物,以預防或延遲、減輕或緩解疾病、病症、病況的進展或疾病、病症、病況的一種或多種症狀的影響。
施用
如本文所用,術語「施用」係指將治療有效量之包含本發明的重組蛋白或融合蛋白的藥物組合物遞送至受試者。施用可全身施用亦可局部施用。施用可藉由施用裝置進行,例如注射器。施用方式包括但不限於包埋、鼻吸、噴霧、注射等。施用途徑包括吸入、鼻內、口服、靜脈內、皮下或肌內施用等。
表2-1. 序列名稱與序列編號的對應關係
表2-2. 重組蛋白與序列的對應關係
實施例1. 表現載體的構建
按照所設計的分子結構,將各組成部分胺基酸序列前後拼接在一起,根據中國倉鼠(Cricetulus griseus)對密碼子的偏愛性,設計得到最佳DNA編碼序列,排除基因選殖操作等需要使用的酶切位點,然後在該序列5’端依次添加選殖位點、Kozak序列及訊息肽編碼序列,在該序列3’端依次添加終止密碼子(terminal codon)及選殖位點,如圖1所示。
進行全基因合成,利用5’端與3’端選殖位點將全基因定向選殖到表現載體pCHO-TE2(購自Thermo Fisher)相應的選殖位點之間,經測序驗證正確之後,即可獲得表現質體。5’端及3’端所使用的選殖位點皆為EcoRV與PacI位點。圖2為表現載體pCHO-TE2的質體圖譜。
實施例2. 表現質體的製備、細胞轉染以及標靶蛋白的表現、純化
表現質體的製備
將含有表現質體的甘油菌(在1 mL之含有表現質體的大腸桿菌菌液中加入0.5mL之60%的無菌甘油溶液充分混勻),以1:1000的比例接種至液體LB培養基中。在37℃、220rpm、震盪培養16小時後離心收集菌體。使用無內毒素質體大包裝套組(DP117,購自天根生化科技(北京)有限公司),依照套組說明書提供的標準流程進行萃取而得到表現質體。
細胞轉染、蛋白表現
將所得表現質體用0.22μm濾膜過濾後,吸取3mg質體(其中,產物為典型抗體分子,其輕鏈、重鏈表現質體比例為1:1(莫耳比);產物為重組蛋白,其輕鏈、重鏈、右臂表現質體的比例為1:1:1(莫耳比),具體見表3)加入到50mL Opti MEM I Reduced Serum Medium(購自GIBCO)中混勻。吸取6mg轉染試劑聚醚醯亞胺(Polyetherimide,PEI,購自Polysciences,以1mg/mL濃度溶於無菌超純水中)加入到50mL Opti MEM I Reduced Serum Medium中混勻。將得到的PEI溶液加入含有質體的Opti MEM I Reduced Serum Medium溶液中,進行混勻。室溫靜置15分鐘後將質體與PEI的混合物緩慢均勻加入體積為1L且細胞密度為3×106
個細胞/mL的宿主細胞CHO-S(購自Thermo Fisher)懸浮液中,置於37℃、5%CO2
培養箱培養中進行培養。4小時後,加入相當於初始體積7%的饋料培養基(該饋料培養基配方為每公升水中溶解有80g CD Efficient FeedC AGT(購自Gibco)、75g 5×00483(購自Kerry))。將培養溫度降低至33℃,培養6天後收獲。將細胞懸浮液在10000g、10℃條件下離心30分鐘,將離心所得之上清,亦即細胞培養收獲液,用於目的蛋白純化。
蛋白純化
以下方法以Ofa-Fc1-D1-Fc2為例,蛋白A親和捕獲。
將上述細胞培養收獲液在10000rpm條件下離心30min去除細胞以及其碎片,然後投入蛋白A親和管柱(貨號:17-5438-02,GE Healthcare),溶析收獲目標蛋白。SDS-PAGE檢測蛋白純度。
蛋白A純化方法為本領域技術人員熟知的通常蛋白純化方法,具體試驗方法可參考GE Healthcare 蛋白A產品使用說明及GE抗體純化手冊。
SIRPα D1-Fc、Ofa-Fc1-D1-Fc2、Ofa-Fc1-D1-D2-Fc2、Ofa-Fc1-D1-D2-D3-Fc2四種蛋白的理論分子量分別為:37.8kD、110.7kD、121.7kD及131.4kD。SDS-PAGE蛋白質電泳檢測結果如圖4A與圖4B所示。
蛋白質電泳(SDS-PAGE):結果顯示(圖4A與圖4B),各泳道的目標蛋白都得到了有效表現及純化,其中Ofa-Fc1-D1-Fc2(圖4A泳道11)、Ofa-Fc1-D1-D2-Fc2(圖4B泳道1)、Ofa-Fc1-D1-D2-D3-Fc2(圖4A泳道12)可見不同程度的左臂二聚體(Ofa-Fc1-Ofa-Fc1)、右臂二聚體(SIRPα-Fc2)及/或多聚體。
表3. 表現質體比例
備註:D1m
表示SIRPα胞外截斷體D1的高親和突變體;D1表示人源SIRPα野生型及其非高親和突變體的胞外D1結構域;Fc為野生型Fc區域、Fc1為具有hole或holes突變的Fc區域、Fc2為具有knob或knobs突變的Fc區域
實施例3. 標靶目標親和力、標靶目標競爭結合活性檢測
1. CD47、CD20、EGFR、Her2標靶目標親和力檢測方法
重組蛋白Ofa-Fc1-D1-Fc2、Ofa-Fc1-D1m
-Fc2、Ofa-Fc1-D1-D2-Fc2、Ofa-Fc1-D1m
-D2-Fc2、Ofa-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Obi-Fc1-D1-Fc2、Obi-Fc1-D1m
-Fc2、Obi-Fc1-D1-D2-Fc2、Obi-Fc1-D1m
-D2-Fc2、Obi-Fc1-D1-D2-D3-Fc2對標靶目標CD47以及CD20的結合親和力係藉由ELISA法及/或流式細胞儀進行測定。以下方法以Ofa-Fc1-D1-Fc2為例,適用於左臂為CD20標靶目標之重組蛋白的檢測。
重組蛋白Anti-Her2(P)-Fc1-D1-Fc2、Anti-Her2(P)-Fc1-D1m
-Fc2、Anti-Her2(P)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-Her2(P)-Fc1-D1m
-D2-Fc2、Anti-Her2(P)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-Her2(P)-Fc1-D1-Fc2、Anti-Her2(P)-Fc1-D1m
-Fc2、Anti-Her2(P)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-Her2(P)-Fc1-D1m
-D2-Fc2、Anti-Her2(P)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2、Anti-Her2(T)-Fc1-D1m
-Fc2、Anti-Her2(T)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-Her2(T)-Fc1-D1m
-D2-Fc2、Anti-Her2(T)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2、Anti-Her2(T)-Fc1-D1m
-Fc2、Anti-Her2(T)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-Her2(T)-Fc1-D1m
-D2-Fc2、Anti-Her2(T)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2對標靶目標CD47以及Her2的結合親和力係藉由ELISA法及/或流式細胞儀進行測定。以下方法以Anti-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2為例,適用於左臂為Her2標靶目標之重組蛋白的檢測。
重組蛋白Anti-EGFR-Fc1-D1-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1m
-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1m
-D2-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2對標靶目標CD47以及EGFR的結合親和力係藉由ELISA法及/或流式細胞儀進行測定。以下方法以Anti-EGFR-Fc1-D1-Fc為例,適用於左臂為EGFR標靶目標的重組蛋白為例而進行檢測。
重組蛋白Anti-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-Fc2、Anti-PD-L1(Ate)-Fc1-D1m
-Fc2、Anti-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-PD-L1(Ate)-Fc1-D1m
-D2-Fc2、Anti-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-Fc2、Anti-PD-L1(13G4)-Fc1-D1m
-Fc2、Anti-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-PD-L1(13G4)-Fc1-D1m
-D2-Fc2、Anti-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-Fc2、Anti-PD-L1(12A4)-Fc1-D1m
-Fc2、Anti-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-PD-L1(12A4)-Fc1-D1m
-D2-Fc2、Anti-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2對標靶目標CD47以及PD-L1的結合親和力係藉由ELISA法及/或進行測定。以下方法以Anti-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-Fc2為例,適用於左臂為PD-L1標靶目標的重組蛋白為例而進行檢測。
ELISA檢測Ofa-Fc1-D1-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-Fc2對標靶目標CD47的親和力: 利用100μl 1μg/ml CD47-His(12283-H08H-200,Sino Biological)吸附(coating)微量滴定盤(ELISA plate)(貨號:9018,Corning)並4℃放置過夜;PBST溶液(含0.1%濃度之Tween20的PBS)清洗後,用PBS+1%BSA對微量滴定盤室溫密封2小時;清洗後,在吸附板中分別加入稀釋的Ofa-Fc1-D1-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-Fc2(1000ng/ml起始,2.5倍稀釋,共11個點),每孔100μl,25℃培養1小時;去除樣本並用PBST溶液清洗三次;加入100μl之經稀釋的小鼠抗人類IgG Fc-HRP(1:10000)(Ab7499,abcam)後,25℃培養1小時;去除溶液並用PBST溶液清洗三次;加入TMB(P0209,beyotime)避光呈色約20分鐘後,用H2
SO4
終止反應,在微量滴定儀上讀取OD(450~650nm)值。
試驗結果顯示,抗CD47抗體Hu5F9-G4、SIRPα D1-Fc、Ofa-Fc1-D1-Fc2、Ofa-Fc1-D1m
-Fc2、Ofa-Fc1-D1-D2-Fc2、Ofa-Fc1-D1m
-D2-Fc2、Ofa-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Obi-Fc1-D1-Fc2、Obi-Fc1-D1m
-Fc2、Obi-Fc1-D1-D2-Fc2、Obi-Fc1-D1m
-D2-Fc2、Obi-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1m
-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1m
-D2-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2皆分別能與CD47結合;Ofa-Fc1-D1-Fc2、Ofa-Fc1-D1-D2-Fc2、Ofa-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Obi-Fc1-D1-Fc2、Obi-Fc1-D1-D2-Fc2、Obi-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2對CD47的結合親和力略弱於抗CD47抗體Hu5F9-G4及/或SIRPα D1-Fc對CD47的結合親和力。
以上試驗數據證明,本發明的重組蛋白在蛋白質等級能特異性標靶腫瘤細胞CD47抗原,且與CD47的結合親和力不高於SIRPα D1-Fc融合蛋白對CD47蛋白的結合親和力;本發明的重組蛋白能降低或避免抗CD47抗體治療產生的紅血球凝集、貧血及/或SIRPα高親和突變體治療產生的非腫瘤靶細胞殺傷等副作用(Petrova PS, et al. TTI-621 (SIRPαFc): A CD47-Blocking Innate Immune Checkpoint Inhibitor with Broad Antitumor Activity and Minimal Erythrocyte Binding.Clin Cancer Res
,2017,23(4):1068-1079)。
例如,如圖5所示,除了抗CD20抗體Ofatumumab以及抗EGFR抗體JMT101不能結合CD47以外,抗CD47抗體Hu5F9-G4、SIRPα D1-Fc、Ofa-Fc1-D1-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-Fc2皆能與CD47結合,但由於Ofa-Fc1-D1-Fc2與Anti-EGFR-Fc1-D1-Fc2僅有右臂能與CD47抗原結合等原因,其親和力(EC50
=52.57ng/mL/ EC50
=93.86ng/mL)弱於抗CD47抗體(EC50
=5.439ng/mL)及/SIRPα D1-Fc(EC50
=6.118ng/mL)。
流式細胞儀檢測Ofa-Fc1-D1-Fc2對標靶目標CD47的親和力: A431細胞(人類表皮癌細胞),收集生長良好的細胞並計數,進行離心並使用PBS+2%FBS(購自Gibco)重新懸浮細胞成3×106
個細胞/ml的濃度。將細胞以100μl/孔加入到96孔盤U型盤(貨號:3799,Corning),靜置至少15分鐘;進行離心且吸出上清,並分別加入9個稀釋度的Ofa-Fc1-D1-Fc2(從15000ng/ml起始,5倍梯度稀釋,共9個濃度),並將96孔盤在冰箱中4℃培養1小時;用PBS+2%FBS清洗後,加入山羊抗人類IgG Fc-FITC(F9512-2ML,Sigma)4℃培養1小時;用PBS+2%FBS清洗並重新懸浮後,利用流式細胞儀(Accuri C6,BD)檢測螢光值。
由於A431細胞不表現CD20抗原,不能與Ofatumumab、Obinutuzumab結合,因此可以在細胞等級上用A431細胞評價Ofa-Fc1-D1-Fc2、Ofa-Fc1-D1m
-Fc2、Ofa-Fc1-D1-D2-Fc2、Ofa-Fc1-D1m
-D2-Fc2、Ofa-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Obi-Fc1-D1-Fc2、Obi-Fc1-D1m
-Fc2、Obi-Fc1-D1-D2-Fc2、Obi-Fc1-D1m
-D2-Fc2、Obi-Fc1-D1-D2-D3-Fc2與CD47的結合親和力。
試驗結果顯示,除了抗CD20抗體Ofatumumab、Obinutuzumab不能結合A431以外,抗CD47抗體Hu5F9-G4、SIRPα D1-Fc、Ofa-Fc1-D1-Fc2、Ofa-Fc1-D1m
-Fc2、Ofa-Fc1-D1-D2-Fc2、Ofa-Fc1-D1m
-D2-Fc2、Ofa-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Obi-Fc1-D1-Fc2、Obi-Fc1-D1m
-Fc2、Obi-Fc1-D1-D2-Fc2、Obi-Fc1-D1m
-D2-Fc2、Obi-Fc1-D1-D2-D3-Fc2皆能與A431細胞結合;Ofa-Fc1-D1-Fc2、Ofa-Fc1-D1-D2-Fc2、Ofa-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Obi-Fc1-D1-Fc2、Obi-Fc1-D1-D2-Fc2、Obi-Fc1-D1-D2-D3-Fc2對CD47的結合親和力略弱於抗CD47抗體及/或SIRPα D1-Fc對CD47的結合親和力,與ELISA的數據趨勢相一致。
以上試驗數據證明,本發明的重組蛋白在細胞等級能特異性標靶腫瘤細胞CD47抗原,且與CD47的結合親和力不高於SIRPα D1-Fc融合蛋白對CD47的結合親和力;本發明的重組蛋白能降低或避免抗CD47抗體治療產生的紅血球凝集、貧血及/或SIRPα高親和突變體治療產生的非腫瘤靶細胞殺傷等副作用。
例如,如圖6所示,抗CD47抗體Hu5F9-G4、SIRPα D1-Fc及Ofa-Fc1-D1-Fc2皆能與A431細胞結合。具體地,Ofa-Fc1-D1-Fc2的親和力略弱於抗CD47抗體及/或SIRPα D1-Fc,與ELISA的數據趨勢相一致。
流式細胞儀檢測Ofa-Fc1-D1-Fc2對標靶目標CD20的親和力: Raji細胞(人類B細胞淋巴瘤)(購自上海中科院細胞庫),收集生長良好的細胞並計數,進行離心並使用PBS+2%FBS重新懸浮細胞成3×106
個細胞/ml的濃度。將細胞以100μl/孔加入到96孔盤U型盤(貨號:3799,Corning),靜置至少15分鐘;進行離心且吸出上清,並加入100μL PBS+2%FBS(對照組)或1.5μg/mL的抗CD47抗體Hu5F9-G4(Fab)2(實驗組)(經胃蛋白酶切除Fc,套組:Thermo Fisher,44988),4℃培養1小時;PBS+2%FBS清洗後,分別加入7個稀釋度的Ofa-Fc1-D1-Fc2、Hu5F9-G4、SIRPα D1-Fc(從6250ng/ml起始,4倍梯度稀釋,共7個濃度,圖7中為轉化後的莫耳濃度),4℃培養1小時;PBS+2%FBS清洗後,加入山羊抗人類IgG Fc-FITC(F9512-2ML,Sigma)4℃培養1小時;用PBS+2%FBS清洗並重新懸浮後,利用流式細胞儀(Accuri C6,BD)檢測螢光值。
試驗結果顯示,抗CD47抗體Hu5F9-G4(Fab)2可有效地阻斷抗CD47抗體Hu5F9-G4及/或SIRPα D1-Fc與Raji細胞上的CD47的結合;但Hu5F9-G4(Fab)2對CD47抗原的阻斷作用並沒有顯著抑制Ofa-Fc1-D1-Fc2、Ofa-Fc1-D1-D2-Fc2、Ofa-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Obi-Fc1-D1-Fc2、Obi Fc1-D1-D2-Fc2、Obi-Fc1-D1-D2-D3-Fc2與Raji細胞的結合。
以上試驗數據證明,在腫瘤細胞表面CD47抗原被阻斷、SIRPα-CD47相互結合被阻斷的情況下,本發明的重組蛋白仍然能依靠其左臂與腫瘤細胞上對應的抗原特異性結合,且左臂親和力並未因右臂結合被阻斷而受到顯著影響。
例如,如圖7所示,抗CD47抗體Hu5F9-G4(Fab)2可有效地阻斷抗CD47抗體Hu5F9-G4及/或SIRPα D1-Fc與Raji細胞上的CD47的結合,但Hu5F9-G4(Fab)2對CD47抗原的阻斷作用並沒有顯著抑制Ofa-Fc1-D1-Fc2與Raji細胞的結合,表明Ofa-Fc1-D1-Fc2在SIRPα-CD47相互結合被阻斷後,仍然能依靠其左臂(抗CD20半抗體)與Raji細胞上的CD20抗原特異性結合,且親和力並未因右臂結合被阻斷而受到顯著影響。
流式細胞儀檢測與標靶目標CD20與CD47的雙特異性結合情況: Raji細胞(人類B細胞淋巴瘤)(購自上海中科院細胞庫),收集生長良好的細胞並計數,進行離心並使用PBS+2%FBS重新懸浮細胞成3×106
個細胞/ml的濃度。將細胞以100μl/孔加入到96孔盤U型盤(貨號:3799,Corning),靜置至少15分鐘;進行離心且吸出上清,並分別加入12個稀釋度的Ofa-Fc1-D1-Fc2、Ofatumumab、Hu5F9-G4、SIRPα D1-Fc(50000ng/ml、25000ng/ml、6250ng/ml,然後4倍梯度稀釋,共12個濃度,圖8A中為轉化後的莫耳濃度),4℃培養1小時;PBS+2%FBS清洗後,加入山羊抗人類IgG Fc-FITC(F9512-2ML,Sigma)4℃培養1小時;使用PBS+2%FBS清洗並重新懸浮後,利用流式細胞儀(Accuri C6,BD)檢測螢光值。
由於Raji細胞表面同時表現CD20及CD47抗原,因此,抗CD20抗體Ofatumumab、Obinutuzumab、抗CD47抗體Hu5F9-G4及SIRPα D1-Fc皆能與Raji細胞特異性結合,但所能達到的最大平均螢光強度各不相同。
試驗結果顯示,Ofa-Fc1-D1-Fc2、Ofa-Fc1-D1m
-Fc2、Ofa-Fc1-D1-D2-Fc2、Ofa-Fc1-D1m
-D2-Fc2、Ofa-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Obi-Fc1-D1-Fc2、Obi-Fc1-D1m
-Fc2、Obi-Fc1-D1-D2-Fc2、Obi-Fc1-D1m
-D2-Fc2、Obi-Fc1-D1-D2-D3-Fc2亦能與Raji細胞結合,且具有更高的最大平均螢光強度。
以上試驗數據證明,在相同的過飽和蛋白樣本濃度環境下,相較於抗CD20抗體Ofatumumab、Obinutuzumab及/或抗CD47抗體Hu5F9-G4及/或SIRPα D1-Fc,本發明的重組蛋白能與腫瘤細胞特異性結合,且表現出顯著的分子數量優勢。較佳地,在相同的過飽和蛋白樣本濃度環境下,本發明的重組蛋白與腫瘤細胞的飽和結合豐度大於抗CD20抗體及SIRPα D1-Fc與腫瘤細胞飽和結合豐度之和。
表4. 抗體/重組蛋白與Raji細胞結合的最大平均螢光強度及EC50(nM)
例如,如圖8A及表4所示,抗CD20抗體Ofatumumab、抗CD47抗體Hu5F9-G4及SIRPα D1-Fc皆能與Raji細胞特異性結合,但所能達到的最大平均螢光強度各不相同;同時Ofa-Fc1-D1-Fc2亦能與Raji細胞結合,且具有更高的最大平均螢光強度,提示Raji細胞在相同的過飽和蛋白樣本濃度環境下,能特異性結合的Ofa-Fc1-D1-Fc2蛋白分子數量分別顯著高於抗CD20抗體Ofatumumab、抗CD47抗體Hu5F9-G4或SIRPα D1-Fc的分子數量,高於抗CD20抗體Ofatumumab與抗CD47抗體Hu5F9-G4分子數量之和,以及高於抗CD20抗體Ofatumumab與SIRPα D1-Fc分子數量之和。
如本領域技術人員所知,以上試驗結果提示,相較於抗CD47抗體或SIRPα D1-Fc與其他抗腫瘤標靶治療抗體的聯合使用,使用本發明能與腫瘤標靶抗原及CD47抗原同步結合的重組蛋白可以更多地結合到腫瘤細胞,從而獲得更顯著的抗腫瘤功效。
流式細胞儀檢測與標靶目標Her2及CD47的雙特異性結合情況: SKBR-3細胞(人類乳腺癌細胞)(購自上海中科院細胞庫),收集生長良好的細胞並計數,進行離心並使用PBS+2%FBS重新懸浮細胞成2×106
個細胞/ml的濃度。將細胞以100μl/孔加入到96孔盤U型盤(貨號:3799,Corning),靜置至少15分鐘;進行離心且吸出上清,並分別加入各自10個稀釋度的Anti-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2、Trastuzumab及Hu5F9-G4(433.2nM起始,4倍梯度稀釋,共10個點),4℃培養1小時;PBS+2%FBS清洗後,加入山羊抗人類IgG Fc-FITC(F9512-2ML,Sigma)4℃培養1小時;用PBS+2%FBS清洗並重新懸浮後,利用流式細胞儀(Accuri C6,BD)檢測螢光值。
由於SKBR-3細胞表面同時表現Her2及CD47抗原,因此,抗Her2抗體Trastuzumab、Pertuzumab、抗CD47抗體Hu5F9-G4及SIRPα D1-Fc皆能與SKBR-3細胞特異性結合,但所能達到的最大平均螢光強度各不相同。
試驗結果顯示,Anti-Her2(P)-Fc1-D1-Fc2、Anti-Her2(P)-Fc1-D1m
-Fc2、Anti-Her2(P)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-Her2(P)-Fc1-D1m
-D2-Fc2、Anti-Her2(P)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-Her2(P)-Fc1-D1-Fc2、Anti-Her2(P)-Fc1-D1m
-Fc2、Anti-Her2(P)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-Her2(P)-Fc1-D1m
-D2-Fc2、Anti-Her2(P)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2、Anti-Her2(T)-Fc1-D1m
-Fc2、Anti-Her2(T)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-Her2(T)-Fc1-D1m
-D2-Fc2、Anti-Her2(T)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2、Anti-Her2(T)-Fc1-D1m
-Fc2、Anti-Her2(T)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-Her2(T)-Fc1-D1m
-D2-Fc2、Anti-Her2(T)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2亦能與SKBR-3細胞結合,且具有更高的最大平均螢光強度。
以上試驗數據證明,在相同的過飽和蛋白樣本濃度環境下,相較於抗Her2抗體Trastuzumab、Pertuzumab及/或抗CD47抗體Hu5F9-G4及/或SIRPα D1-Fc,本發明的重組蛋白能與腫瘤細胞特異性結合,且表現出顯著的分子數量優勢。較佳地,在相同的過飽和蛋白樣本濃度環境下,本發明的重組蛋白與腫瘤細胞的飽和結合豐度大於對應抗Her2抗體及SIRPα D1-Fc與腫瘤細胞飽和結合豐度之和。
表5. 抗體/重組蛋白及SKBR-3細胞結合的最大平均螢光強度及EC50(nM)
例如,如圖8B及表5所示,抗Her2抗體Trastuzumab及抗CD47抗體Hu5F9-G4皆能與SKBR-3細胞特異性結合,但所能達到的最大平均螢光強度各不相同;同時Anti-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2亦能與SKBR-3細胞結合,且具有更高的最大平均螢光強度,提示SKBR-3細胞在相同的過飽和蛋白樣本濃度環境下,能特異性結合的Anti-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2蛋白分子數量分別顯著高於抗Her2抗體Trastuzumab或抗CD47抗體Hu5F9-G4的分子數量,且高於抗Her2抗體Trastuzumab及抗CD47抗體Hu5F9-G4分子數量之和。
如本領域技術人員所知,以上試驗結果提示,相較於抗CD47抗體或SIRPα D1-Fc與其他抗腫瘤標靶治療抗體的聯合使用,使用本發明之能與腫瘤標靶抗原及CD47抗原同步結合的重組蛋白可更多地結合到腫瘤細胞,從而獲得更顯著的抗腫瘤功效。
流式細胞儀檢測與標靶目標EGFR及CD47的雙特異性結合情況: A431細胞(人類表皮癌細胞)(購自中國醫學科學院基礎醫學研究所),收集生長良好的細胞並計數,進行離心並使用PBS+2%FBS重新懸浮細胞成2×106
個細胞/ml的濃度。將細胞以100μl/孔加入到96孔盤U型盤(貨號:3799,Corning),靜置至少15分鐘;進行離心且吸出上清,並分別加入各自11個稀釋度的Anti-EGFR-Fc1-D1-Fc2、JMT101、SIRPαD1-Fc及Hu5F9-G4(216.6nM起始,4倍梯度稀釋,共11個濃度),4℃培養1小時;PBS+2%FBS清洗後,加入山羊抗人類IgG Fc-FITC(F9512-2ML,Sigma)4℃培養1小時;使用PBS+2%FBS清洗並重新懸浮後,利用流式細胞儀(Accuri C6,BD)檢測螢光值。
由於A431細胞表面同時表現EGFR及CD47抗原,因此,抗EGFR抗體JMT101、抗CD47抗體Hu5F9-G4、SIRPα D1-Fc皆能與A431細胞特異性結合,但所能達到的最大平均螢光強度各不相同。
試驗結果顯示,Anti-EGFR-Fc1-D1-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1m
-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1m
-D2-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2亦能與A431細胞結合,且具有更高的最大平均螢光強度。
以上試驗數據證明,在相同的過飽和蛋白樣本濃度環境下,相較於抗EGFR抗體JMT101及/或抗CD47抗體Hu5F9-G4及/或 SIRPα D1-Fc,本發明的重組蛋白能與腫瘤細胞特異性結合,且表現出顯著的分子數量優勢。較佳為,在相同的過飽和蛋白樣本濃度環境下,本發明的重組蛋白與腫瘤細胞的飽和結合豐度大於對應抗EGFR抗體及SIRPα D1-Fc與腫瘤細胞飽和結合豐度之和。
表6. 抗體/重組蛋白及A431細胞結合的最大平均螢光強度及EC50(nM)
例如,如圖8C及表6所述,抗EGFR抗體JMT101、抗CD47抗體Hu5F9-G4、SIRPα D1-Fc皆能與A431細胞特異性結合,但所能達到的最大平均螢光強度各不相同,且EC50
分別為EC50
(JMT101)=0.598nM、EC50
(SIRPα D1-Fc)=3.677 nM、 EC50
(Hu5F9-G4)=0.865 nM,可見JMT101與A431細胞的結合親和力係SIRPα D1-Fc與A431細胞的結合親和力6倍以上;同時Anti-EGFR-Fc1-D1-Fc2亦能與A431細胞結合,且具有更高的最大平均螢光強度,提示A431細胞在相同的過飽和蛋白樣本濃度環境下,能特異性結合的Anti-EGFR-Fc1-D1-Fc2蛋白分子數量分別顯著高於抗EGFR抗體JMT101或SIRPα D1-Fc或抗CD47抗體Hu5F9-G4的分子數量,且高於抗EGFR抗體JMT101及SIRPα D1-Fc的分子數量之和。
如本領域技術人員所知,以上試驗結果提示,相較於抗CD47抗體或SIRPα D1-Fc與其他抗腫瘤標靶治療抗體的聯合使用,使用本發明之能與腫瘤標靶抗原及CD47抗原同步結合的重組蛋白可更多地結合到腫瘤細胞,從而獲得更顯著的抗腫瘤功效。
流式細胞儀檢測與標靶目標PD-L1及CD47的雙特異性結合情況: NCI-H441細胞(人類肺腺癌細胞)(購自北京北納創聯生物技術研究院),使用10ng/ml hIFN-γ(BD,貨號:554616)刺激2×107
個細胞18h,消化且收集細胞,並計數,進行離心並使用PBS+2%FBS重新懸浮細胞成3×106
個細胞/ml的濃度。將細胞以100μl/孔加入到96孔盤U型盤(貨號:3799,Corning),靜置至少15分鐘;進行離心且吸出上清,並分別加入各自12個稀釋度的Anti-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-Fc2及Atezolizumab(433.2nM、216.6nM,然後4倍梯度稀釋,共12個濃度),4℃培養1小時;PBS+2%FBS清洗後,加入山羊抗人類IgG Fc-FITC(F9512-2ML,Sigma)4℃培養1小時;使用PBS+2%FBS清洗並重新懸浮後,利用流式細胞儀(Accuri C6,BD)檢測螢光值。
由於NCI-H441細胞表面同時表現PD-L1及CD47抗原,因此,抗PD-L1抗體Atezolizumab、13G4、12A4、抗CD47抗體Hu5F9-G4、SIRPαD1-Fc能與NCI-H441細胞特異性結合。
試驗結果顯示,Anti-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-Fc2、Anti-PD-L1(Ate)-Fc1-D1m
-Fc2、Anti-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-PD-L1(Ate)-Fc1-D1m
-D2-Fc2、Anti-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-Fc2、Anti-PD-L1(13G4)-Fc1-D1m
-Fc2、Anti-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-PD-L1(13G4)-Fc1-D1m
-D2-Fc2、Anti-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-Fc2、Anti-PD-L1(12A4)-Fc1-D1m
-Fc2、Anti-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-PD-L1(12A4)-Fc1-D1m
-D2-Fc2、Anti-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2亦皆能與NCI-H441細胞結合,且具有更高的最大平均螢光強度。
以上試驗數據證明,在相同的過飽和蛋白樣本濃度環境下,相較於抗PD-L1抗體Atezolizumab、13G4、12A4,本發明的重組蛋白能與腫瘤細胞特異性結合,且表現出一定的分子數量優勢。例如,在相同的過飽和蛋白樣本濃度環境下,相較於抗PD-L1抗體Atezolizumab,本發明的重組蛋白能更多地結合到腫瘤細胞,表現出顯著的分子數量優勢。
表7. 抗體/重組蛋白及NCI-H441細胞結合的最大平均螢光強度及EC50(nM)
例如,如圖8D及表7所示,抗PD-L1抗體Atezolizumab能與NCI-H441細胞特異性結合;同時Anti-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-Fc2亦能與NCI-H441細胞結合,且具有更高的最大平均螢光強度,提示NCI-H441細胞在相同的過飽和蛋白樣本濃度環境下,能特異性結合的Anti-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-Fc2蛋白分子數量高於抗PD-L1抗體Atezolizumab的分子數量。EC50
分別為EC50
(Atezolizumab)=0.2006 nM、EC50
(SIRPα D1-Fc)=1.643 nM、EC50
(Hu5F9-G4)=0.3865 nM,可見Atezolizumab與NCI-H441細胞的結合親和力係SIRPα D1-Fc與NCI-H441細胞的結合親和力6倍以上。
如本領域技術人員所知,以上試驗結果提示,相較於抗CD47抗體與其他抗腫瘤標靶治療抗體的聯合使用,使用本發明的能與腫瘤標靶抗原及CD47抗原同步結合的重組蛋白可更多地結合到腫瘤細胞,從而獲得更顯著的抗腫瘤功效。
2. 標靶目標競爭結合活性檢測
以下方法以Ofa-Fc1-D1-Fc2或Anti-EGFR-Fc1-D1-Fc2為例,藉由ELISA法對標靶目標CD47與SIRPα結合的競爭結合活性進行測定。
ELISA檢測Ofa-Fc1-D1-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-Fc2的競爭結合活性: 使用100μl 1μg/ml CD47-His(12283-H08H-200,Sino Biological)吸附微量滴定盤(9018,Corning)並4℃放置過夜;PBST清洗後,使用PBS+1%BSA對微量滴定盤室溫密封2h;清洗後,在吸附板中分別加入稀釋的不同濃度(1000ng/ml起始,3倍梯度稀釋,共11個濃度)的Ofa-Fc1-D1-Fc2或Anti-EGFR-Fc1-D1-Fc2及生物素標記的SIRPα D1-Fc(生物素標記套組,21925,Thermo,加入樣本的濃度為100ng/ml)混合液,每孔100μl,25℃培養1小時;去除樣本並使用PBST溶液清洗三次;加入100μl之經稀釋的鏈霉親和素(streptavidin)-HRP(1:10000)(ML-0437P-HRP,ZI501-1研域化學試劑)後,25℃培養1小時;去除溶液並使用PBST溶液清洗三次;加入TMB(P0209,beyotime)避光呈色約20分鐘後,用H2
SO4
終止反應,在微量滴定儀上讀取OD(450~650nm)值。
試驗結果顯示,抗CD47抗體Hu5F9-G4、SIRPα D1-Fc、Ofa-Fc1-D1-Fc2、Ofa-Fc1-D1-D2-Fc2、Ofa-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Obi-Fc1-D1-Fc2、Obi-Fc1-D1-D2-Fc2、Obi-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-Her2(P)-Fc1-D1-Fc2、Anti-Her2(P)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-Her2(P)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2、Anti-Her2(T)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-Her2(T)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-Fc2、Anti-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-Fc2、Anti-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-Fc2、Anti-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2皆能不同程度地與生物素標記的SIRPα D1-Fc競爭性結合CD47抗原,發揮競爭結合活性。
例如,如圖9所示,抗CD47抗體Hu5F9-G4、SIRPα D1-Fc、Ofa-Fc1-D1-Fc2及Anti-EGFR-Fc1-D1-Fc2皆能不同程度地與生物素標記的SIRPα D1-Fc競爭性結合CD47抗原,發揮競爭結合活性;Ofa-Fc1-D1-Fc2或Anti-EGFR-Fc1-D1-Fc2與CD47的競爭性結合力分別弱於抗CD47抗體Hu5F9-G4或SIRPα D1-Fc,這與本實施例上文所述的親和力結果相一致。
實施例4
重組蛋白早期體外免疫安全性評價實驗
重組蛋白:Ofa-Fc1-D1m
-Fc2、Ofa-Fc1-D1m
-D2-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1m
-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1m
-D2-Fc2、Anti-Her2(T)-Fc1-D1m
-Fc2、Anti-Her2(T)-Fc1-D1m
-D2-Fc2、Anti-Her2(P)-Fc1-D1m
-Fc2、Anti-Her2(P)-Fc1-D1m
-D2-Fc2、Anti-PD-L1(Ate)-Fc1-D1m
-Fc2、Anti-PD-L1(Ate)-Fc1-D1m
-D2-Fc2、Anti-PD-L1(13G4)-Fc1-D1m
-Fc2、Anti-PD-L1(13G4)-Fc1-D1m
-D2-Fc2、Anti-PD-L1(12A4)-Fc1-D1m
-Fc2、Anti-PD-L1(12A4)-Fc1-D1m
-D2-Fc2早期體外免疫安全性評價實驗,以下方法以Ofa-Fc1-D1m
-Fc2為例,適用於右臂含SIRPα胞外截斷體高親和突變體的重組蛋白的檢測。
Ofa-Fc1-D1-Fc2、Ofa-Fc1-D1-D2-Fc2、Ofa-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Obi-Fc1-D1-Fc2、Obi-Fc1-D1-D2-Fc2、Obi-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-Her2(P)-Fc1-D1-Fc2、Anti-Her2(P)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-Her2(P)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2、Anti-Her2(T)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-Her2(T)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-Fc2、Anti-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-Fc2、Anti-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-Fc2、Anti-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2早期體外免疫安全性評價實驗,以下方法以Ofa-Fc1-D1-Fc2為例,適用於右臂含SIRPα胞外截斷體的重組蛋白的檢測。
流式細胞儀檢測雙抗特異性右臂突變前後與CD47的特異性結合情況: NCI-H441細胞(人類肺腺癌細胞)(購自北京北納創聯生物技術研究院),進行消化且收集細胞,並計數,進行離心並使用PBS+2%FBS重新懸浮細胞成3×106
個細胞/ml的濃度。將細胞以100μl/孔加入到96孔盤U型盤(貨號:3799,Corning),靜置至少15分鐘;進行離心且吸出上清,並分別加入各自12個稀釋度的Ofa-Fc1-D1-Fc2、Ofa-Fc1-D1m
-Fc2、Hu5F9-G4、Ofatumumab(433.2nM、216.6nM,然後4倍梯度稀釋,共12個濃度),4℃培養1小時;PBS+2%FBS清洗後,加入山羊抗人類IgG Fc-FITC(F9512-2ML,Sigma)4℃培養1小時;使用PBS+2%FBS清洗並重新懸浮後,利用流式細胞儀(Accuri C6,BD)檢測螢光值。
表8. 流式細胞儀檢測雙抗特異性右臂突變前後與CD47的特異性結合情況
例如,如圖10及表8所示,除了抗CD20抗體Ofatumumab不能結合CD47以外,抗CD47抗體Hu5F9-G4、Ofa-Fc1-D1-Fc2、Ofa-Fc1-D1m
-Fc2皆能與CD47結合,且Ofa-Fc1-D1m
-Fc2(EC50
=0.529nM)與NCI-H441細胞的結合親和力高於Ofa-Fc1-D1-Fc2(EC50
=8.68nM),其中D1m
為SIRPα在D1區域的高親和突變體(亦即CN106519036A的Seq ID No:10)。
重組蛋白早期體外免疫安全性評價實驗
(1)製備人類效應細胞懸浮液: 取生長良好的穩定高表現CD16a的人類NK92MI-CD16a效應細胞(購於華博生物),離心(201g,5min)去除上清,重新懸浮在5ml MEM(無酚紅)基礎培養基(購自Gibco,51200-038)中,計數後,使用MEM(無酚紅)基礎培養基調整靶細胞密度至2.4×106
個細胞/ml,用作人效應細胞懸浮液。
(2)效應細胞與抗體的培養: 將MEM(無酚紅)基礎培養基50μl/孔分液至96孔黑色透明底培養盤的對應孔中,加入經稀釋的Ofa-Fc1-D1-Fc2或Ofa-Fc1-D1m
-Fc2雙特異性抗體稀釋梯度各25μl/孔,並設置多孔。加入(1)中所製備之人類效應細胞懸浮液25μl(60000個細胞/孔)。混勻後Ofa-Fc1-D1-Fc2或Ofa-Fc1-D1m
-Fc2雙特異性抗體達到最終濃度梯度(433.2nM起始,4倍梯度稀釋,共十個濃度),然後在37℃反應5.5小時,加入溶解緩衝液(來源於Promega的套組,G7891)至對照組培養0.5h。
(3)檢測ADCC活性: 培養完成後,將培養盤置於安全櫃中,開蓋自然冷卻至室溫約15min。將室溫平衡30min的LDH基質反應液(源自於Promega的套組,G7891)加入培養盤,每孔100μl,輕輕混勻後室溫培養15min後,立刻加入終止液(源自於Promega的套組,G7891)50μl/孔,混勻後,於微量滴定儀上讀取螢光值。
試驗結果顯示,由於NK細胞上有CD47抗原的表現,因此具有ADCC活性的標靶CD47的重組蛋白及/或抗體會導致NK細胞的相互殺傷作用。因此,相較於含SIRPα胞外截斷體高親和突變體的Ofa-Fc1-D1m
-Fc2、Ofa-Fc1-D1m
-D2-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1m
-Fc2、Anti-EGFR -Fc1-D1m
-D2-Fc2、Anti-Her2(T)-Fc1-D1m
-Fc2、Anti-Her2(T)-Fc1-D1m
-D2-Fc2、Anti-Her2(P)-Fc1-D1m
-Fc2、Anti-Her2(P)-Fc1-D1m
-D2-Fc2、Anti-PD-L1(Ate)-Fc1-D1m
-Fc2、Anti-PD-L1(Ate)-Fc1-D1m
-D2-Fc2、Anti-PD-L1(13G4)-Fc1-D1m
-Fc2、Anti-PD-L1(13G4)-Fc1-D1m
-D2-Fc2、Anti-PD-L1(12A4)-Fc1-D1m
-Fc2、Anti-PD-L1(12A4)-Fc1-D1m
-D2-Fc2,Ofa-Fc1-D1-Fc2、Ofa-Fc1-D1-D2-Fc2、Ofa-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Obi-Fc1-D1-Fc2、Obi-Fc1-D1-D2-Fc2、Obi-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-Her2(P)-Fc1-D1-Fc2、Anti-Her2(P)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-Her2(P)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2、Anti-Her2(T)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-Her2(T)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-Fc2、Anti-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-Fc2、Anti-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-Fc2、Anti-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-Fc2或Anti-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2因其與CD47抗原的弱親和作用,明顯降低NK細胞所導致的毒性副作用,毒性副作用至少降低1000倍。
例如,如圖11所示,當抗體/重組蛋白濃度達到10-1
nM時,Ofa-Fc1-D1m
-Fc2已開始出現細胞溶解,當抗體/重組蛋白濃度達到103
nM時,Ofa-Fc1-D1m
-Fc2其細胞溶解率已達到15.25%,而Ofa-Fc1-D1-Fc2在103
nM時尚未觀察到細胞溶解的情況。
如本領域技術人員所知,以上試驗結果提示,本發明所述的具有ADCC活性且低親和標靶CD47抗原的重組蛋白具有更高的免疫安全性。
如本領域技術人員所知,以上試驗結果提示,使用本發明所述的改良後的ADCC活性檢測的方法(亦即早期體外免疫安全性評價實驗),可用於評價標靶CD47且具有ADCC活性的重組蛋白(含單價或多價)或抗體(含單價或多價)的早期免疫安全性,該評價方法簡單快速且不受血液來源的限制。
實施例5
重組蛋白體內抑制腫瘤細胞生長實驗
重組蛋白:Ofa-Fc1-D1-Fc2、Ofa-Fc1-D1-D2-Fc2、Ofa-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Obi-Fc1-D1-Fc2、Obi-Fc1-D1-D2-Fc2、Obi-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-Her2(P)-Fc1-D1-Fc2、Anti-Her2(P)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-Her2(P)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2、Anti-Her2(T)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-Her2(T)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-Fc2、Anti-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-Fc2、Anti-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-Fc2、Anti-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2體內抑制腫瘤細胞生長實驗,以下方法以Ofa-Fc1-D1-Fc2為例,適用於右臂含SIRPα胞外截斷體的重組蛋白的檢測。
以人類B細胞淋巴瘤Raji細胞皮下接種雄性NSG小鼠(購自艾德摩),在接種腫瘤細胞後待腫瘤組織達到80mm3
~150mm3
,分成以下2組(每組6隻小鼠,每組按照標示量分別進行腹腔注射):1)溶劑對照組(Tris-檸檬酸鹽,pH 6.5);2)Ofa-Fc1-D1-Fc2組(150μg/隻);每週給藥2次,共給藥2週。分別在給藥前(0天)、給藥後第3天、第5天、第7天、第10天、第12天、第14天觀察腫瘤生長情況,測量腫瘤大小以評價Ofa-Fc1-D1-Fc2的抑制腫瘤作用。
試驗結果顯示,在Raji淋巴瘤皮下移植的NSG小鼠模式上,重組蛋白Ofa-Fc1-D1-Fc2、Ofa-Fc1-D1-D2-Fc2、Ofa-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Obi-Fc1-D1-Fc2、Obi-Fc1-D1-D2-Fc2、Obi-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-Her2(P)-Fc1-D1-Fc2、Anti-Her2(P)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-Her2(P)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2、Anti-Her2(T)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-Her2(T)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-Fc2、Anti-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-Fc2、Anti-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-Fc2、Anti-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2藉由阻斷CD47-SIRPα訊息路徑,而激活巨噬細胞的標靶吞噬作用及/或巨噬細胞媒介的抗體依賴性細胞吞噬作用(Antibody dependent cellular phagocytosis,ADCP),從而顯示出顯著的腫瘤抑制效果。
例如,如圖12所示,橫座標為Raji淋巴瘤皮下移植的NSG小鼠接受藥物處理的時間(天),縱座標為腫瘤體積(mm3
)。圖12表明經過一段時間的藥物Ofa-Fc1-D1-Fc2治療後,相較於溶劑對照組,Ofa-Fc1-D1-Fc2組顯示出顯著的腫瘤抑制趨勢,其中,第14天時Ofa-Fc1-D1-Fc2組的抑制腫瘤率可達到63.14%。
如本領域技術人員所知,以上試驗結果提示,本發明所述之可與腫瘤標靶抗原及CD47抗原同步結合的重組蛋白在腫瘤細胞皮下移植的NSG小鼠體內可獲得顯著抑制腫瘤功效。
實施例6
重組蛋白體內早期免疫安全性評價實驗
重組蛋白Ofa-Fc1-D1m
-Fc2、Ofa-Fc1-D1m
-D2-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1m
-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1m
-D2-Fc2、Anti-Her2(T)-Fc1-D1m
-Fc2、Anti-Her2(T)-Fc1-D1m
-D2-Fc2、Anti-Her2(P)-Fc1-D1m
-Fc2、Anti-Her2(P)-Fc1-D1m
-D2-Fc2、Anti-PD-L1(Ate)-Fc1-D1m
-Fc2、Anti-PD-L1(Ate)-Fc1-D1m
-D2-Fc2、Anti-PD-L1(13G4)-Fc1-D1m
-Fc2、Anti-PD-L1(13G4)-Fc1-D1m
-D2-Fc2、Anti-PD-L1(12A4)-Fc1-D1m
-Fc2、Anti-PD-L1(12A4)-Fc1-D1m
-D2-Fc2體內早期免疫安全性評價,以下方法以Ofa-Fc1-D1m
-Fc2為例,適用於右臂含SIRPα胞外截斷體高親和突變體的重組蛋白的檢測。
重組蛋白Ofa-Fc1-D1-Fc2、Ofa-Fc1-D1-D2-Fc2、Ofa-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Obi-Fc1-D1-Fc2、Obi-Fc1-D1-D2-Fc2、Obi-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-Her2(P)-Fc1-D1-Fc2、Anti-Her2(P)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-Her2(P)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2、Anti-Her2(T)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-Her2(T)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-Fc2、Anti-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-Fc2、Anti-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-Fc2、Anti-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2體內早期免疫安全性評價,以下方法以Ofa-Fc1-D1-Fc2為例,適用於右臂含SIRPα胞外截斷體的重組蛋白的檢測。
因B細胞上高表現CD20抗原,本實驗藉由B細胞含量測定,代表腫瘤細胞殺傷情況。測定標靶其他腫瘤抗原及CD47抗原的重組蛋白體內早期免疫安全性評價時,需在本實施例所述實驗小鼠皮下移植對應的腫瘤細胞。
腫瘤特異性標靶作用: 選擇人類CD34+
HSC移植NSG(Hu-NSG)雌性小鼠(購自艾德摩),分成以下3組(每組3隻小鼠,每組按照標示量分別進行靜脈注射):1)0.9%生理鹽水對照組;2)Hu5F9-G4(6.7μg/隻)組;3)Ofa-Fc1-D1-Fc2(5μg/隻)組,給藥1次,給藥後96h,小鼠尾靜脈採血80μl於含肝素鈉的抗凝管中,採用新鮮配製的紅血球溶解液溶解紅血球(其中紅血球溶解液為溶解液(BD Pharm LyseTM
,貨號:555899):再蒸餾水等體積混合配製),剩餘細胞使用PBS+2%FBS清洗重新懸浮,螢光抗體(PE anti-human CD45(貨號:304039)/FITC anti-human CD19(貨號:302206)/APC anti-human CD3(貨號:300312),皆購自BioLegend)與細胞共同培養30min,PBS+2%FBS清洗並重新懸浮後,利用流式細胞儀(AccuriTM
C6,BD)檢測。
試驗結果顯示,在Hu-NSG小鼠模式使用同劑量的Ofa-Fc1-D1-Fc2及抗CD47抗體Hu5F9-G4,用藥96小時後,Ofa-Fc1-D1-Fc2優先清除表現CD20抗原的B細胞(亦即靶細胞),而抗CD47抗體Hu5F9-G4因其與CD47抗原的高親和作用則優先清除CD47表現豐度較高的非靶細胞,如T細胞等。
例如,如圖13所示,抗CD47抗體 Hu5F9-G4(圖13B)相較於0.9%生理鹽水(圖13A),CD47表現豐度較高的非靶細胞(如T細胞)顯著被清除(B細胞,亦即CD20抗原靶細胞,在所有被檢測細胞中所佔的比例由用藥前的40.9%上升至用藥96小時後的73.5%);而重組蛋白Ofa-Fc1-D1-Fc2(圖13C)相較於0.9%生理鹽水(圖13A),B細胞(亦即CD20抗原靶細胞)被顯著清除,亦即用藥後96小時,Ofa-Fc1-D1-Fc2優先清除B細胞(B細胞在所有被檢測細胞中所佔的比例由用藥前的40.9%下降至用藥96小時後的3.7%)。
如本領域技術人員所知,以上試驗結果提示,本發明所述之可與腫瘤標靶抗原及CD47抗原同步結合的重組蛋白在同劑量條件下優先清除腫瘤標靶抗原所在細胞及/或腫瘤細胞。
低劑量下的免疫安全性: 選擇人類CD34+
HSC移植NSG(Hu-NSG)雌性小鼠(購自艾德摩),分成以下2組(每組3隻小鼠,每組按照標示量分別進行靜脈注射):1)Ofa-Fc1-D1-Fc2(1μg/隻)組;2)Ofa-Fc1-D1m
-Fc2(1μg/隻)組,給藥1次,給藥後72h,小鼠尾靜脈採血80μl於含肝素鈉的抗凝管中,採用新鮮配製的紅血球溶解液溶解紅血球(其中紅血球溶解液為溶解液(BD Pharm LyseTM
,貨號:555899):再蒸餾水等體積混合配製),剩餘細胞使用PBS+2%FBS清洗並重新懸浮,螢光抗體(PE anti-human CD45(貨號:304039)/FITC anti-human CD19(貨號:302206)/APC anti-human CD3(貨號:300312),皆購自BioLegend)與細胞共同培養30min,PBS+2%FBS清洗並重新懸浮後,Ofa-Fc1-D1-Fc2(1μg/隻)組樣本利用流式細胞儀(AccuriTM
C6,BD)檢測,Ofa-Fc1-D1m
-Fc2(1μg/隻)組樣本利用流式細胞儀(NovoCyteTM
3130,ACEA)檢測。
試驗結果顯示,在Hu-NSG小鼠模式使用低劑量的重組蛋白,當Ofa-Fc1-D1-Fc2、Ofa-Fc1-D1-D2-Fc2、Ofa-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Obi-Fc1-D1-Fc2、Obi-Fc1-D1-D2-Fc2、Obi-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-Her2(P)-Fc1-D1-Fc2、Anti-Her2(P)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-Her2(P)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2、Anti-Her2(T)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-Her2(T)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-Fc2、Anti-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-Fc2、Anti-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-Fc2、Anti-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2單次用藥72小時後,表現左臂抗原的靶細胞(如腫瘤細胞)被顯著清除,而不表現左臂抗原的細胞(如T細胞、其他免疫細胞)則未見明顯影響;而含SIRPα胞外截斷體高親和突變體的Ofa-Fc1-D1m
-D2-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1m
-Fc2、Anti-EGFR -Fc1-D1m
-D2-Fc2、Anti-Her2(T)-Fc1-D1m
-Fc2、Anti-Her2(T)-Fc1-D1m
-D2-Fc2、Anti-Her2(P)-Fc1-D1m
-Fc2、Anti-Her2(P)-Fc1-D1m
-D2-Fc2、Anti-PD-L1(Ate)-Fc1-D1m
-Fc2、Anti-PD-L1(Ate)-Fc1-D1m
-D2-Fc2、Anti-PD-L1(13G4)-Fc1-D1m
-Fc2、Anti-PD-L1(13G4)-Fc1-D1m
-D2-Fc2、Anti-PD-L1(12A4)-Fc1-D1m
-Fc2或Anti-PD-L1(12A4)-Fc1-D1m
-D2-Fc2單次用藥72小時後,儘管表現左臂抗原的靶細胞(如腫瘤細胞)被顯著清除,但不表現左臂抗原的細胞(如T細胞、其他免疫細胞)亦皆有明顯程度的清除。
例如,如圖14所示,Ofa-Fc1-D1-Fc2單次給藥後72小時(圖14C、圖14D)相較於給藥前(圖14A、圖14B),B細胞(CD20抗原靶細胞)被顯著清除(幾乎完全被清除),而不表現CD20抗原的細胞(如T細胞、其他免疫細胞)則未見明顯影響。Ofa-Fc1-D1m
-Fc2單次給藥後72小時(圖14G、圖14H)相較於給藥前(圖14E、圖14F),儘管B細胞(CD20抗原靶細胞)被顯著清除,但不表現CD20抗原的細胞(如T細胞、其他免疫細胞)亦皆有明顯程度的清除。
如本領域技術人員所知,以上試驗結果提示,右臂含SIRPα胞外截斷體的重組蛋白,在同劑量條件下,較右臂含SIRPα胞外截斷體高親和突變體的重組蛋白具有更高腫瘤特異性標靶作用,表現出更高的免疫安全性。
高劑量下的免疫恢復作用: 選擇人類CD34+
HSC移植NSG(Hu-NSG)雌性小鼠(購自艾德摩),分成以下2組(每組3隻小鼠,每組按照標示量分別進行靜脈注射):1)Hu5F9-G4(200μg/隻)組;2)Ofa-Fc1-D1-Fc2(150μg/隻)組,給藥1次,給藥後4天及給藥後14天,小鼠尾靜脈採血80μl置於含肝素鈉的抗凝管中,採用新鮮配製的紅血球溶解液溶解紅血球(其中紅血球溶解液為溶解液(BD Pharm LyseTM
,貨號:555899):再蒸餾水等體積混合配製),剩餘細胞使用PBS+2%FBS清洗並重新懸浮,螢光抗體(PE anti-human CD45(貨號:304039)/FITC anti-human CD19(貨號:302206)/APC anti-human CD3(貨號:300312),皆購自BioLegend)與細胞共同培養30min,PBS+2%FBS清洗並重新懸浮後,利用流式細胞儀(AccuriTM
C6,BD)檢測。
試驗結果顯示,在Hu-NSG小鼠模型使用高劑量的Ofa-Fc1-D1-Fc2、Ofa-Fc1-D1-D2-Fc2、Ofa-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Obi-Fc1-D1-Fc2、Obi-Fc1-D1-D2-Fc2、Obi-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-Her2(P)-Fc1-D1-Fc2、Anti-Her2(P)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-Her2(P)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2、Anti-Her2(T)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-Her2(T)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-Fc2、Anti-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-Fc2、Anti-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-Fc2、Anti-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-Fc2或Anti-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2及抗CD47抗體Hu5F9-G4,單次給藥96小時後,Ofa-Fc1-D1-Fc2、Ofa-Fc1-D1-D2-Fc2、Ofa-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Obi-Fc1-D1-Fc2、Obi-Fc1-D1-D2-Fc2、Obi-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-Her2(P)-Fc1-D1-Fc2、Anti-Her2(P)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-Her2(P)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2、Anti-Her2(T)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-Her2(T)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-Fc2、Anti-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-Fc2、Anti-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-Fc2、Anti-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2及抗CD47抗體Hu5F9-G4皆可見B細胞(CD20抗原靶細胞)及非靶細胞(如T細胞及其他免疫細胞)被較大程度的清除現象。14天後,Ofa-Fc1-D1-Fc2、Ofa-Fc1-D1-D2-Fc2、Ofa-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Obi-Fc1-D1-Fc2、Obi-Fc1-D1-D2-Fc2、Obi-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-Her2(P)-Fc1-D1-Fc2、Anti-Her2(P)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-Her2(P)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2、Anti-Her2(T)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-Her2(T)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-Fc2、Anti-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-Fc2、Anti-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-Fc2、Anti-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-Fc2或Anti-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2組的小鼠,其B細胞(CD20抗原靶細胞)仍然處於被清除的狀態,而表現CD47的其他非靶細胞(如T細胞)則顯著得到恢復;而抗CD47抗體Hu5F9-G4組的小鼠,無論是B細胞(CD20抗原靶細胞)還是表現CD47的非靶細胞皆未恢復。
例如,如圖15所示,高劑量的抗CD47抗體 Hu5F9-G4(圖15A)及Ofa-Fc1-D1-Fc2(圖15B)雖在給藥後96小時皆出現了B細胞(CD20抗原靶細胞)及表現CD47的非靶細胞(如T細胞)的大量清除,但14天後,Ofa-Fc1-D1-Fc2(圖15D)組小鼠雖B細胞(CD20抗原靶細胞)仍處於被清除的狀態,但B細胞(CD20抗原靶細胞)以外表現CD47的非靶細胞(如T細胞)顯著得到恢復,而抗CD47抗體 Hu5F9-G4(圖15C)組小鼠,其B細胞(CD20抗原靶細胞)、表現CD47的非靶細胞(如T細胞)皆未有恢復跡象。
如本領域技術人員所知,以上試驗結果提示,本發明所述之可與腫瘤標靶抗原及CD47抗原同步結合的重組蛋白,其表現CD47的非靶細胞(如T細胞等免疫細胞)在高劑量給藥條件下具有可恢復性,該重組蛋白具有更高的免疫安全性。
如本領域技術人員所知,以上試驗結果提示,使用本發明所述的體內早期免疫安全性評價方法,可用於評價標靶CD47重組蛋白(含單價或多價)或抗體(含單價或多價)的早期免疫安全性。
實施例7
不同截斷體對標靶目標親和力結合活性的影響
重組蛋白Ofa-Fc1-D1-Fc2、Ofa-Fc1-D1-D2-Fc2、Ofa-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Obi-Fc1-D1-Fc2、Obi-Fc1-D1-D2-Fc2、Obi-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-Her2(P)-Fc1-D1-Fc2、Anti-Her2(P)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-Her2(P)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2、Anti-Her2(T)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-Her2(T)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-Fc2、Anti-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-Fc2、Anti-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-Fc2、Anti-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2以Anti-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2、Anti-Her2(T)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-Her2(P)-Fc1-D1-Fc2及Anti-Her2(P)-Fc1-D1-D2-Fc2為例,適用於左臂相同,右臂採用不同長度的SIRPα胞外截斷體的重組蛋白。
流式細胞儀檢測與標靶目標Her2及CD47的雙特異性結合情況: SKBR-3細胞(人類乳腺癌細胞)(購自上海中科院細胞庫),收集生長良好的細胞並計數,進行離心並使用PBS+2%FBS重新懸浮細胞成2×106
個細胞/ml的濃度。將細胞以100μl/孔加入到96孔盤U型盤(貨號:3799,Corning),靜置至少15分鐘;進行離心且吸出上清,並分別加入各自11個稀釋度的Anti-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2、Anti-Her2(T)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-Her2(P)-Fc1-D1-Fc2及Anti-Her2(P)-Fc1-D1-D2-Fc2(433.2nM起始,4倍梯度連續稀釋,共11個濃度),4℃培養1小時;PBS+2%FBS清洗後,加入山羊抗人類IgG Fc-FITC(F9512-2ML,Sigma)4℃培養1小時;使用PBS+2%FBS清洗並重新懸浮後,利用流式細胞儀(Accuri C6,BD)檢測螢光值。
由於Trastuzumab及Pertuzumab分別作用於Her2抗原的不同表位,且2個抗原表位與細胞膜間距離存在較大差異,因此,重組蛋白Anti-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2、Anti-Her2(T)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-Her2(P)-Fc1-D1-Fc2、Anti-Her2(P)-Fc1-D1-D2-Fc2皆能與SKBR-3細胞特異性結合,但結合親和力以及所能達到的最大平均螢光強度各不相同。
試驗結果顯示,由於Trastuzumab與Her2抗原表位(Pedersen M W, et al. Targeting Three Distinct HER2 Domains with a Recombinant Antibody Mixture Overcomes Trastuzumab Resistance.Molecular Cancer Therapeutics
, 2015, 14(3):669-680)距離細胞膜表面更近,因此Anti-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2與SKBR-3細胞親和力優於Anti-Her2(T)-Fc1-D1-D2-Fc2。Pertuzumab與Her2抗原表位(Her2胞外第二區域)距離細胞膜表面較遠,因此Anti-Her2(P)-Fc1-D1-Fc2較Anti-Her2(P)-Fc1-D1-D2-Fc2與SKBR-3細胞親和力相當。
以上試驗數據證明,右臂不同長度截斷體組成的重組蛋白會影響重組蛋白與靶細胞的親和力。對於結合近膜端表位的左臂,當右臂選擇較短的SIRPα截斷體時,能大大提高重組蛋白結合雙標靶目標的能力。但對於結合遠膜端表位的左臂,右臂選擇較短的SIRPα截斷體就失去了優勢,左臂抗原標靶目標距離細胞膜越遠,右臂的SIRPα截斷體就應該越長才能達到最佳匹配。
例如,如圖16所示,Anti-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2(EC50
=2.04nM)結合SKBR-3細胞的能力明顯優於Anti-Her2(T)-Fc1-D1-D2-Fc2(EC50
=25.95nM)(圖16A)。而Anti-Her2(P)-Fc1-D1-Fc2結合SKBR-3細胞的能力(EC50
=15.22nM)則與Anti-Her2(P)-Fc1-D1-D2-Fc2(EC50
=11.03nM)相當(圖16B)。
如本領域技術人員所知,以上試驗結果提示,根據標靶抗原空間表位與靶細胞膜表面的距離,右臂適配性的選擇合適長度的人類SIRPα胞外截斷體,可有效提高重組蛋白與靶細胞的結合能力。
實施例8. 重組蛋白急性毒性試驗
重組蛋白:Ofa-Fc1-D1-Fc2、Ofa-Fc1-D1-D2-Fc2、Ofa-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Obi-Fc1-D1-Fc2、Obi-Fc1-D1-D2-Fc2、Obi-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-Her2(P)-Fc1-D1-Fc2、Anti-Her2(P)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-Her2(P)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2、Anti-Her2(T)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-Her2(T)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-Fc2、Anti-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-Fc2、Anti-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-Fc2、Anti-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2的急性毒性試驗,以下方法以Ofa-Fc1-D1-Fc2為例,適用於右臂含SIRPα胞外截斷體的重組蛋白的檢測。
取適量的Ofa-Fc1-D1-Fc2溶液(4.02 mg/mL),使用注射用Ofa-Fc1-D1-Fc2緩衝液(Tris-檸檬酸鹽,pH 6.5)將其分別稀釋至0.25及2.5 mg/mL,分別用於實驗動物第1組及第2組的給藥。
4隻健康雌性食蟹猴,購於廣西桂東靈長類開發實驗有限公司,年齡為4歲,由廣西壯族自治區科學技術廳許可上述實驗動物的生產,實驗動物生產許可證編號為SCXK桂2016-0001。給藥前進行一次詳細臨床觀察及秤重,皆未見異常。體重範圍在給藥當天為2.47~2.85 kg。
表9. 實驗設計
將4隻雌性食蟹猴分為兩組,每組兩隻,藉由靜脈注射給藥,給藥劑量為0.5mg/kg、5mg/kg,給藥體積為2 mL/kg。實驗設計見上表9。給藥當天給藥一次,給藥結束後連續觀察28天。食蟹猴飼養於不銹鋼移動籠中,每籠1隻。每天提供大約各12小時的明暗交替照明。實驗猴配合飼料購於北京科澳協力飼料有限公司,試驗期間動物自由進食,特定禁食除外。該批飼料由上海譜尼測試技術有限公司(PONY)對其中特定的微生物、重金屬及農藥殘留進行檢測。試驗期間所有動物透過水瓶自由飲水,所用飲用水為反滲透系統過濾除菌的純化水,由計量人員對飲用水的pH、硬度、重金屬及微生物進行檢測。
試驗期間所有試驗動物每天進行兩次(上、下午各一次)籠邊觀察,觀察內容包括但不限於發病、損害、死亡及供食供水情況。所有受試動物試驗前進行1次詳細臨床觀察。試驗過程中所有實驗動物給藥後每天至少1次進行詳細臨床觀察。觀察內容包括但不限於發病、死亡率、損害及供食供水情況,皮膚,毛,眼,耳,鼻,口腔,胸部,腹部,外生殖器,四肢,呼吸及循環系統,自主效應(如流涎),神經系統(如震顫、抽搐、壓力反應以及反常行為)。分別於D-1(給藥前),D1,D4,D8,D11,D15,D18,D22,D25及解剖前,測定動物體重。分別於D2,D4,D8,D11,D15,D18,D22,D25測定動物24 h內(24h±1h)耗食量。D-1,D2,D14,D28進行心電圖測定,採用標準II導極(8個導極)進行記錄,記錄速度50 mm/秒鐘。
分別在給藥前(D-1)、給藥後D2、D7、D14及D28進行臨床病理學樣本採集及血液學、凝血、血液生化及淋巴細胞分型檢測;於給藥前、給藥後第28天採集尿液樣本並進行尿液分析。
樣本採集前所有動物禁食過夜(至少10小時)但不禁水。股靜脈採集血液樣本(4.5~6mL),其中大約1.8mL全血於含有檸檬酸鈉的抗凝管中用於凝血分析;大約1mL全血置於含有K3-EDTA的抗凝管用於血液學分析;大約2mL全血置於分離膠採血管(無抗凝劑)用於血液生化學分析,根據標準作業程序要求離心分離血清。同時,對給藥前D-1、給藥後D2分離後的血清樣本採用流式細胞儀進行T/B細胞分型檢測。
在D29對動物進行安樂死,採集並保存心臟、肝臟、脾臟、肺及腎組織,並對肝臟、肺(含主支氣管)、腎臟、脾臟、心臟、腎上腺、腦下垂體、甲狀腺及副甲狀腺、胸腺、卵巢、子宮(包括子宮頸)、腦等組織進行秤重。
結果顯示,單次靜脈注射給予Ofa-Fc1-D1-Fc2,給藥劑量分別為0.5、5 mg/kg時,給藥後連續觀察28天,動物未見明顯藥物作用相關異常,且此期間動物耗食量、體重皆在正常範圍內波動;給藥後與給藥前相比,動物凝血、尿液及心電圖相關檢測數據與給藥前相比無顯著性變化;動物進行解剖後,所有臟器大體觀察皆在正常範圍內,動物臟器重量、臟體係數(內臟體重係數)、臟腦比亦在正常範圍內。
給藥後D2,低、高劑量組動物淋巴細胞的計數及淋巴細胞百分比皆出現明顯下降,D7之後恢復至正常水平,此變化可能與藥物作用相關。
重組蛋白Ofa-Fc1-D1-D2-Fc2、Ofa-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Obi-Fc1-D1-Fc2、Obi-Fc1-D1-D2-Fc2、Obi-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-Her2(P)-Fc1-D1-Fc2、Anti-Her2(P)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-Her2(P)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2、Anti-Her2(T)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-Her2(T)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-Fc2、Anti-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-Fc2、Anti-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-Fc2、Anti-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2在同等劑量下與Ofa-Fc1-D1-Fc2上述結果情況類似。
表10. 重組蛋白對食蟹猴紅血球數量(1012
個細胞/L)的影響
如圖18A及表10所示,0.5mg/kg及5mg/kg兩種劑量的Ofa-Fc1-D1-Fc2皆未對食蟹猴紅血球數量產生影響;如圖18B及表11所示,0.5mg/kg及5mg/kg兩種劑量的Ofa-Fc1-D1-Fc2,皆未對食蟹猴血紅素產生影響。
重組蛋白Ofa-Fc1-D1-D2-Fc2、Ofa-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Obi-Fc1-D1-Fc2、Obi-Fc1-D1-D2-Fc2、Obi-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-Her2(P)-Fc1-D1-Fc2、Anti-Her2(P)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-Her2(P)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2、Anti-Her2(T)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-Her2(T)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-Fc2、Anti-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-Fc2、Anti-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-Fc2、Anti-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2在同等劑量下對食蟹猴紅血球數量以及血紅素的影響與Ofa-Fc1-D1-Fc2上述結果情況類似。
如圖19所示,根據T/B細胞分型檢測結果顯示,0.5mg/kg及5 mg/kg兩種劑量的Ofa-Fc1-D1-Fc2,可導致動物的B細胞(CD20抗原靶細胞)被顯著清除。
如本領域技術人員所知,以上試驗結果提示,本發明所述之可與腫瘤標靶抗原及CD47抗原同步結合的重組蛋白,單次給藥後動物未見明顯藥物作用相關異常,且此期間動物耗食量、體重皆在正常範圍內波動;給藥後與給藥前相比,動物凝血、尿液及心電圖相關檢測數據與給藥前相比無顯著性變化;動物進行解剖後,所有臟器大體觀察皆在正常範圍內,動物臟器重量、臟體係數、臟腦比亦在正常範圍內。
如本領域技術人員所知,以上試驗結果提示,本發明所述之可與腫瘤標靶抗原及CD47抗原同步結合的重組蛋白,單次給藥後,未對動物紅血球數量及血紅素數量產生影響。
如本領域技術人員所知,以上試驗結果提示,本發明所述之可與腫瘤標靶抗原及CD47抗原同步結合的重組蛋白在同等劑量條件下優先清除腫瘤標靶抗原所在細胞及/或腫瘤細胞。
實施例9. 重組蛋白體內抑制腫瘤生長實驗
重組蛋白:Ofa-Fc1-D1-Fc2、Ofa-Fc1-D1-D2-Fc2、Ofa-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Obi-Fc1-D1-Fc2、Obi-Fc1-D1-D2-Fc2、Obi-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-Her2(P)-Fc1-D1-Fc2、Anti-Her2(P)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-Her2(P)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2、Anti-Her2(T)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-Her2(T)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-Fc2、Anti-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-Fc2、Anti-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-Fc2、Anti-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2體內抑制腫瘤生長實驗,以下方法以Ofa-Fc1-D1-Fc2為例,適用於右臂含SIRPα胞外截斷體的重組蛋白的檢測。
Ofa-Fc1-D1-Fc2:無色澄清液體,濃度1.14~4.02 mg/ml,-80℃分裝保存;美羅華® (利妥昔單抗注射液): 無色澄清液體,規格100mg/10ml,批號H0205,2~8℃避光保存。製劑緩衝液(Tris-檸檬酸鹽,pH 6.5):無色澄清液體,2~8℃保存。配製方法:Ofa-Fc1-D1-Fc2、美羅華®皆用製劑緩衝液稀釋;製劑緩衝液作為溶劑直接給藥。
細胞:CD20陽性人類B細胞淋巴瘤Daudi細胞購自中國科學院細胞庫。培養條件為RPMI 1640培養基中加10%胎牛血清以及青、鏈黴素,於37℃、含5%CO2空氣的培養箱中培養。一週繼代培養二次,當細胞呈指數生長期時,收集細胞,計數,進行接種。
實驗動物:雌性NOD-SCID小鼠,6~7週,購自上海靈暢生物科技有限公司。生產許可證號:SCXK(滬)2013-0018;動物合格證號2013001829463、2013001827545。飼養環境:SPF級。本實驗動物的使用及福利遵照「國際實驗動物評估及認可委員會(AAALAC)」的規定執行。每天監測動物的健康狀況及死亡情況,例行檢查包括觀察受試物及藥物對動物日常行為表現的影響如行為活動、體重變化、外觀體徵等。
每隻小鼠皮下接種1.5×107
Daudi細胞,接種後第18天當平均腫瘤體積達到100~150 mm3
時,根據腫瘤體積分組並給藥(D0)。小鼠靜脈注射(IV)藥物;溶劑組注射相同體積的溶劑,注射體積0.1 mL/10g體重;給藥劑量及給藥方案參見表3。
每週二次利用遊標卡尺測量腫瘤直徑,腫瘤體積(V)計算公式為:
腫瘤體積(V)計算公式為: V=1/2×a×b2 其中 a、b分別表示長、寬。
T/C(%)=(T-T0)/(C-C0) ×100 其中T、C為實驗結束時的腫瘤體積;T0、C0為實驗開始時的腫瘤體積;T為給藥組,C為對照組。
抑瘤率(TGI)(%)=100-T/C(%)。 當腫瘤出現消退時,抑制腫瘤率(TGI)(%)=100-(T-T0)/T0×100 如果腫瘤比起始體積縮小,亦即T<T0或C<C0時,即定義為腫瘤部分消退(PR); 如果腫瘤完全消失,即定義為腫瘤完全消退(CR)。
實驗結束後,或當動物的腫瘤體積達到1500 mm3
的安樂死終點時,二氧化碳麻醉處死動物,隨後解剖取出腫瘤並秤重拍照。
兩組腫瘤體積或腫瘤重量之間的比較係採用雙尾Student’s t檢定,P<0.05定義為在統計學上有顯著差異。
Ofa-Fc1-D1-Fc2(5mg/kg,IV,每週2次,共5次)明顯抑制Daudi皮下移植腫瘤的生長,抑制腫瘤率為80.8%,1/6小鼠腫瘤部分消退;美羅華®(7mg/kg,IV,每週2次,共5次)對Daudi皮下移植腫瘤的抑制腫瘤率為24.5%。荷瘤小鼠對以上藥物總體上能有較好耐受性(表12,圖20、21、22)。
表12. Ofa-Fc1-D1-Fc2、美羅華®對人B細胞淋巴瘤Daudi細胞皮下移植瘤的療效
註:隨機分組,第一次給藥時間為D0;IV:靜脈注射。
可見,Ofa-Fc1-D1-Fc2及美羅華®對CD20陽性人類B細胞淋巴瘤Daudi細胞皮下移植腫瘤生長皆有不同程度的抑制作用,其中Ofa-Fc1-D1-Fc2顯著優於美羅華®;荷瘤小鼠對以上藥物總體上能有較好耐受性。
重組蛋白Ofa-Fc1-D1-D2-Fc2、Ofa-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Obi-Fc1-D1-Fc2、Obi-Fc1-D1-D2-Fc2、Obi-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-Her2(P)-Fc1-D1-Fc2、Anti-Her2(P)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-Her2(P)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2、 c1-D1-D2-Fc2、Anti-Her2(T)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-Fc2、Anti-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-Fc2、Anti-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2、Anti-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-Fc2、Anti-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-Fc2、Anti-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2在同等劑量下對NOD-SCID小鼠體內移植腫瘤的抑制腫瘤效果及小鼠對重組蛋白的耐受程度與Ofa-Fc1-D1-Fc2上述結果情況類似。
如本領域技術人員所知,以上試驗結果提示,本發明所述之可與腫瘤標靶抗原及CD47抗原同步結合的重組蛋白在同等劑量條件下相較於標靶腫瘤的抗體,在小鼠體內有意想不到的顯著抑瘤效果。
本實驗動物的使用及福利遵照「國際實驗動物評估及認可委員會(AAALAC)」的規定執行。每天監測動物的健康狀況及死亡情況,例行檢查包括觀察受試物及藥物對動物日常行為表現的影響如行為活動,體重變化,外觀體徵等。
本文提供的任何及所有實施例或示例性語言(例如,「諸如」)的使用僅旨在更好地說明本發明,而不對本發明的範圍構成限制,除非另有要求。說明書中的語言不應被解釋為指示任何未要求保護的元件對於實施本發明是必要的。
本說明書中引用的所有出版物及專利申請藉由引用併入本文,如同每個單獨的出版物或專利申請被具體地及單獨地指明藉由引用併入。此外,本文所述的任何理論、機制、證明或發現旨在進一步增強對本發明的理解,並且不意圖以任何方式將本發明限制到這樣的理論、機制、證明或發現。儘管已經在附圖及前面的描述中詳細地示出及描述了本發明,但是本發明應當被認為是說明性的而不是限制性的。
無。
圖1為本發明的待插入表現載體的插入物的結構示意圖; 圖2為本發明使用的示例性表現載體pCHO-TE2的質體圖譜; 圖3為作為本發明重組蛋白的示例性實施方案的結構示意圖; 圖4A~4B為重組蛋白經蛋白A純化後的SDS-PAGE電泳圖;圖4A的第1~6泳道為還原性樣本,分別為:1:Marker,2:Anti-CD20 mAb(Ofatumumab),3:Anti-CD47 mAb(Hu5F9-G4),4:SIRPα D1-Fc,5:Ofa-Fc1-D1-Fc2,6:Ofa-Fc1-D1-D2-D3-Fc2;圖4A的第7~12泳道為非還原性樣本,分別為:7:Marker,8:Anti-CD20 mAb(Ofatumumab),9:Anti-CD47 mAb(Hu5F9-G4),10:SIRPα D1-Fc,11:Ofa-Fc1-D1-Fc2,12:Ofa-Fc1-D1-D2-D3-Fc2;圖4B的泳道1為Ofa-Fc1-D1-D2-Fc2非還原性樣本,2為Marker,3為Ofa-Fc1-D1-D2-Fc2還原性樣本; 圖5為ELISA測定本發明的重組蛋白與人CD47的結合親和力結果(蛋白質層面); 圖6為流式細胞儀測定本發明的重組蛋白與人CD47的結合親和力結果(細胞層面); 圖7為流式細胞儀測定本發明的重組蛋白與對應左臂標靶目標的結合力結果;Hu5F9-G4、Ofa-Fc1-D1-Fc2、SIRPα D1-Fc對應於樣本Hu5F9-G4、Ofa-Fc1-D1-Fc2、SIRPα D1-Fc與未經過抗CD47抗體Hu5F9-G4(Fab)2阻斷的Raji細胞結合後的平均螢光強度,而Hu5F9-G4 (b)、Ofa-Fc1-D1-Fc2(b)、SIRPα D1-Fc(b)對應於樣本Hu5F9-G4、Ofa-Fc1-D1-Fc2、SIRPα D1-Fc與經過抗CD47抗體Hu5F9-G4(Fab)2阻斷的Raji細胞結合後的平均螢光強度; 圖8為流式細胞儀測定本發明的重組蛋白與CD47以及左臂標靶目標雙陽性細胞的結合親和力結果;圖8A使用的是Raji細胞(CD20+CD47);圖8B使用的是SKBR-3細胞(Her2+CD47);圖8C使用的是A431細胞(EGFR+CD47);圖8D使用的是NCI-H441細胞(PD-L1+CD47); 圖9為ELISA測定本發明的重組蛋白與SIRPα D1-Fc以及抗CD47抗體對CD47的競爭性結合結果; 圖10為流式細胞儀測定本發明的重組蛋白及其CD47高親和突變體、抗CD47抗體以及抗CD20抗體與人CD47的結合親和力結果; 圖11為本發明的重組蛋白體外免疫安全性評價實驗結果; 圖12為本發明的重組蛋白在Raji淋巴瘤皮下移植NSG小鼠模式藥效實驗結果; 圖13為相同劑量不同樣本對Hu-NSG鼠處理後96小時B細胞含量檢測結果;其中,圖13A使用的是0.9%生理鹽水;圖13B使用的是Hu5F9-G4(6.7μg/隻);圖13C使用的是Ofa-Fc1-D1-Fc2(5μg/隻); 圖14為Ofa-Fc1-D1-Fc2及Ofa-Fc1-D1m
-Fc2在Hu-NSG鼠體內早期安全性評價實驗結果(FACS免疫細胞分型檢測);圖14A~D皆使用了Ofa-Fc1-D1-Fc2(1μg/隻);其中圖14A與圖14B為用藥前的檢測結果圖;圖14C與圖14D為用藥72小時後的檢測結果圖;圖14E~H皆使用了Ofa-Fc1-D1m
-Fc2(1μg/隻);其中圖14E與圖14F為用藥前的檢測結果圖;圖14G與圖14H為用藥72小時後的檢測結果圖; 圖15為高劑量下不同樣本對Hu-NSG鼠處理後96小時FACS免疫細胞分型檢測;圖15A~B為用藥後96小時的結果;其中圖A使用Hu5F9-G4(200μg/隻);圖15B使用Ofa-Fc1-D1-Fc2高劑量(150μg/隻);圖15C~D為用藥後14天的結果;其中圖15C使用Hu5F9-G4(200μg/隻);圖15D使用Ofa-Fc1-D1-Fc2高劑量(150μg/隻); 圖16為本發明的重組蛋白在SKBR-3中與雙標靶目標(Her2、CD47)的結合情況;圖16A為Anti-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2與Anti-Her2(T)-Fc1-D1-D2-Fc2樣本檢測結果;圖16B為Anti-Her2(P)-Fc1-D1-Fc2與Anti-Her2(P)-Fc1-D1-D2-Fc2樣本檢測結果; 圖17A~E為本發明示例蛋白的相應胺基酸序列與DNA序列; 圖18A為兩種劑量的Ofa-Fc1-D1-Fc2對食蟹猴紅血球數量的影響;圖18B為兩種劑量的Ofa-Fc1-D1-Fc2對食蟹猴血紅素的影響; 圖19為兩種劑量的Ofa-Fc1-D1-Fc2對食蟹猴B細胞含量檢測結果; 圖20為Ofa-Fc1-D1-Fc2、美羅華®對人B細胞淋巴瘤Daudi皮下移植瘤生長的影響; 圖21為Ofa-Fc1-D1-Fc2、美羅華®對荷瘤小鼠體重的影響; 圖22為Ofa-Fc1-D1-Fc2、美羅華®對人B細胞淋巴瘤Daudi皮下移植瘤的療效的腫瘤照片。
Claims (12)
- 一種雙特異性重組蛋白,其中該雙特異性重組蛋白包含高親和標靶腫瘤的臂及低親和阻斷CD47與SIRPα相互作用的融合蛋白,該高親和標靶腫瘤的臂不結合CD47,且該高親和標靶腫瘤的臂對應的抗體對腫瘤細胞上標靶抗原的結合親和力係低親和阻斷CD47與SIRPα相互作用的融合蛋白所對應的單體融合蛋白同型二聚體對腫瘤細胞上CD47結合親和力的至少6倍;該低親和阻斷CD47與SIRPα相互作用的融合蛋白對CD47的結合親和力不高於含SIRPα胞外截斷體的單體融合蛋白的同型二聚體對CD47的結合親和力;該SIRPα胞外截斷體包含人源SIRPα野生型胞外截斷體或CD47非高親和突變的人源SIRPα胞外截斷體;其中該雙特異性重組蛋白具有相對設置的左、右兩臂結構,其中該高親和標靶腫瘤的臂位於左臂的位置,該低親和阻斷CD47與SIRPα相互作用的融合蛋白位於右臂的位置;該左臂為免疫球蛋白的Fab或Fab’形式,該右臂為SIRPα胞外截斷體;其中該高親和標靶腫瘤的臂標靶選自下列的標靶目標:CD20、EGFR、HER2、PD-L1;其中該低親和阻斷CD47與SIRPα相互作用的融合蛋白包含SIRPα胞外截斷體,該SIRPα胞外截斷體包含選自如下a1)~a4)任一種的胺基酸序列:a1)SEQ ID No:30;a2)SEQ ID No:31;a3)SEQ ID No:32;a4)上述胺基酸序列中任一種胺基酸序列經過A80N取代所獲得的胺基酸序列;其中該雙特異性重組蛋白包含Fc區域;其中高親和標靶腫瘤的臂標靶為CD20時,該高親和標靶腫瘤的臂包含 SEQ ID No:16及SEQ ID No:17,該低親和阻斷CD47與SIRPα相互作用的融合蛋白包含SEQ ID No:26;其中高親和標靶腫瘤的臂標靶為CD20時,該高親和標靶腫瘤的臂包含SEQ ID No:18及SEQ ID No:4,該低親和阻斷CD47與SIRPα相互作用的融合蛋白包含SEQ ID No:26;其中高親和標靶腫瘤的臂標靶為EGFR時,該高親和標靶腫瘤的臂包含SEQ ID No:19及SEQ ID No:8,該低親和阻斷CD47與SIRPα相互作用的融合蛋白包含SEQ ID No:26;其中高親和標靶腫瘤的臂標靶為Her2時,該高親和標靶腫瘤的臂包含SEQ ID No:20及SEQ ID No:21,或SEQ ID No:22及SEQ ID No:23,該低親和阻斷CD47與SIRPα相互作用的融合蛋白包含SEQ ID No:26或SEQ ID No:27;或,其中高親和標靶腫瘤的臂標靶為PD-L1時,該高親和標靶腫瘤的臂包含SEQ ID No:24及SEQ ID No:13,該低親和阻斷CD47與SIRPα相互作用的融合蛋白包含SEQ ID No:26。
- 如申請專利範圍第1項所述之雙特異性重組蛋白,其中高親和標靶腫瘤的臂及低親和阻斷CD47與SIRPα相互作用的融合蛋白藉由分子間作用力結合,或藉由共價鍵例如鏈間雙硫鍵(interchain disulfide bond)結合,或藉由鹽鍵結合,或藉由上述結合方式中的兩種或三種的組合而結合。
- 如申請專利範圍第2項所述之雙特異性重組蛋白,該Fc區域為人類Fc區域;其中高親和標靶腫瘤的臂及低親和阻斷CD47與SIRPα相互作用的融合蛋白的結合係藉由knobs-into-holes結合。
- 如申請專利範圍第3項所述之雙特異性重組蛋白,其中該高親和標靶腫瘤的臂為IgG1抗體的半抗體。
- 如申請專利範圍第4項所述之雙特異性重組蛋白,其中該高親和標靶腫瘤的臂為人源化或全人源的IgG1抗體的半抗體。
- 一種編碼如申請專利範圍第1至5項中任一項之雙特異性重組蛋白的核酸分子。
- 一種包含如申請專利範圍第6項所述之核酸分子的表現載體。
- 一種包含如申請專利範圍第7項所述之表現載體的宿主細胞。
- 一種雙特異性重組蛋白的製備方法,其使用如申請專利範圍第8項所述之細胞表現該重組蛋白。
- 一種如申請專利範圍第1至5項中任一項所述之雙特異性重組蛋白在製備治療腫瘤的藥物中的用途。
- 如申請專利範圍第10項所述之用途,該腫瘤選自乳腺癌、結腸直腸癌、肺癌、胰腺癌、食道癌、卵巢癌、胃癌、前列腺癌、腎癌、骨髓瘤、淋巴瘤、白血病、甲狀腺癌、子宮癌、膀胱癌、神經內分泌癌、頭頸癌、肝癌、鼻咽癌、睪丸癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、黑色素瘤、基底細胞皮膚癌、鱗狀細胞皮膚癌、隆突性皮膚纖維肉瘤、Merkel氏細胞癌、神經膠質母細胞瘤、神經膠質瘤、肉瘤、間皮瘤或骨髓增生異常綜合徵等血液腫瘤及實體瘤。
- 如申請專利範圍第11項所述之用途,該腫瘤選自子宮內膜癌或子宮頸癌。
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