JP2020520249A - 二重特異性組換えタンパク質およびその応用 - Google Patents
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Abstract
Description
[技術分野]
本発明は、生物医学の分野に属し、具体的に、組換えタンパク質およびその用途に関する。
[背景技術]
腫瘍治療の分野における研究の深化に伴い、腫瘍分子標的治療薬物の開発および応用はますます注目されている。ターゲティングが強く、副作用が小さく、治癒効果が顕著などの利点に基づいて、抗体薬物は腫瘍標的治療分野で急速に注目を集めた。現在、数十の腫瘍を標的とする抗体薬物が臨床使用のために承認されており、顕著な結果を達成した。前記抗体薬物は、例えば、CD20標的分子対するリツキサン(Rituxan)<登録商標>(リツキシマブは、癌の治療に承認された米国で最初のモノクローナル抗体であり、最初は非ホジキンリンパ腫の治療に使用された、ロシュ出品)、Zevalin<登録商標>(ibritumomab tiuxetan、最初はリツキシマブに耐性のある低分化型非ホジキンリンパ腫の治療薬として米国FDAによって承認された、IDEC Pharmaceuticals出品)、Bexxar<登録商標>(tositumomab and iodine I 131 tositumomab、GSK出品)、Arzerra<登録商標>(ofatumumab、GSK出品)など、Her2標的分子に対するハーセプチン(Herceptin)<登録商標>(トラスツズマブ(Trastuzumab)、有名な乳癌治療薬物、Genentech出品)、Perjeta<登録商標>(ペルツズマブ(Pertuzumab)モノクローナル抗体、Roche出品)、Kadcyla<登録商標>(ado−trastuzumab emtansine,Roche出品)など,VEGFまたはその受容体標的分子に対するアバスチン(Avastin)<登録商標>(ベバシズマブ(Bevacizumab)モノクローナル抗体、Genentech/Roche出品)、Cyramaza<登録商標>(ramucirumab、Eli Lilly出品)など、EGFR標的に対するエルビタックス(Erbitux)<登録商標>(セツキシマブ(Cetuximab)モノクローナル抗体、世界でトップ10の売れ筋の抗癌薬の1つ、最初は直腸癌の治療に承認され、Eli Lilly出品)、Vectibix<登録商標>(パニツムマブ(Panitumumab)、結腸直腸癌の治療薬、Amgen出品)など、PD−L1標的分子に対するTecentriq<登録商標>(atezolizumab,Roche出品)など(曹睿ら、腫瘍標的治療抗体薬物の研究進捗、《中国生化学薬ジャーナル》,2016,36(6):15−18)。
CD47に対する前記低親和性のCD47とSIRPαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質の結合親和性は、CD47に対するSIRPα細胞外トランケーションを含むモノマー融合タンパク質のホモダイマーの結合親和性より高くない。前記低親和性のCD47とSIRPαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質は、SIRPα細胞外トランケーションを含む。
ここで、高親和性の腫瘍を標的とするアームがEGFRを標的とする場合、前記高親和性の腫瘍を標的とするアームは、配列番号19と配列番号8を含み、前記低親和性のCD47とSIRPαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質は、配列番号26または配列番号27または配列番号28を含み、
ここで、高親和性の腫瘍を標的とするアームがHer2を標的とする場合、前記高親和性の腫瘍を標的とするアームは、配列番号20と配列番号21、または配列番号22と配列番号23を含み、前記低親和性のCD47とSIRPαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質は、配列番号26または配列番号27または配列番号28を含み、または、
ここで、高親和性の腫瘍を標的とするアームがPD−L1を標的とする場合、前記高親和性の腫瘍を標的とするアームは、配列番号24と配列番号13を含み、前記低親和性のCD47とSIRPαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質は、配列番号26または配列番号27または配列番号28を含む。
本明細書で使用される場合、用語「組換えタンパク質」とは、天然に存在するタンパク質ではなく、設計/構築されたタンパク質を指す。本発明の「組換えタンパク質」における「組換え」は、その生産方法を意味するものではなく、単に「組換えタンパク質」が自然に存在しないことを示すために使用される。本発明の組換えタンパク質は、発現タンパク質であってもよく、組み立てタンパク質であってもよい。
本明細書で使用される場合、用語「抗体」または「免疫グロブリン」は、2つの同じ軽鎖(L)および2つの同じ重鎖(H)からなる、同じ構造的特徴を有する約150000ダルトンのアイソテトラマー糖タンパク質である。各軽鎖は、一つの共有結合のジスルフィド結合によって重鎖に連結され、異なる免疫グロブリンのアイソタイプの重鎖間のジスルフィド結合の数は異なる。各重鎖と軽鎖には、一定の間隔で鎖内ジスルフィド結合がある。各重鎖の一端には可変領域(VH)があり、その後には複数の定常領域がある。各軽鎖の一端には可変領域(VL)があり、他端には定常領域があり、軽鎖の定常領域と重鎖の最初の定常領域は対向し、軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域は対向し。特定のアミノ酸残基は、軽鎖と重鎖の可変領域間に界面を形成する。
本明細書で使用される場合、用語「腫瘍を標的とするアーム」または「不完全抗体」または「左アーム」または「不完全抗体構造」または「Ig分子モノマー」は、抗体の一つの軽鎖(L)および一つの重鎖(H)からなるヘテロ二糖類タンパク質であり、免疫グロブリン分子を形成する基本構造であり、本発明において互換的に使用することができ、その分子量は、抗体分子量の半分に対応し、約75000ダルトンであり、ここで、軽鎖は、一つの共有結合のジスルフィド結合によって重鎖に結合される。重鎖と軽鎖にも一定の間隔で鎖内ジスルフィド結合を有する。各重鎖の一端には、可変領域(VH)があり、その後には複数の定常領域がある。各軽鎖の一端には可変領域(VL)があり、他端には定常領域があり、軽鎖の定常領域と重鎖の最初の定常領域は対向し、軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域は対向し。特定のアミノ酸残基は、軽鎖と重鎖の可変領域間に界面を形成する。
本明細書で使用される場合、用語「CD47を標的とするアーム」または「右アーム」または「シグナル調節タンパク質αトランケーション−Fc融合タンパク質」または「SIRPα−Fc」または「CD47とSIRPαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質」は、本発明において交換可能に使用することができる。当業者に知られているように、前記「CD47を標的とするアーム」または「右アーム」または「シグナル調節タンパク質αトランケーション−Fc融合タンパク質」または「SIRPα−Fc」または「CD47とSIRPαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質」分子の長さは変えられる。選択的に、SIRPα(ヒトSIRPα野生型および非高親和性変異体を含む)の細胞外トランケーションをIgG1抗体のヒンジ領域およびFc領域に連結することにより、複数の分子長さの異なる「CD47を標的とするアーム」または「右アーム」または「シグナル調節タンパク質αトランケーション−Fc融合タンパク質」または「SIRPα−Fc」または「CD47とSIRPαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質」を形成することができる。IgG1は、ヒトIgG1であることができる。
本明細書で使用される場合、用語「knobs−into−holes技術」または「杵臼」技術または「突起−入り−空洞」技術または「ボタン」技術は、遺伝子工学技術を使用して、重鎖の二つのCH3ドメインに異なる突然変異を導入して、重鎖のヘテロ二量体化を引き起こし、一つの重鎖に一つのノブ(knob)を作り、他方の重鎖にホール(hole)を作り、その後二つが優先的に咬合して、非対称抗体を形成する(Ridgway JB, et al. ’Knobs−into−holes’ engineering of antibody CH3 domains for heavy chain heterodimerization. Protein Engineering, 1996, 9(7):617−621)。当業者に知られているように、一つの重鎖に複数のノブ(knob)および/またはホール(hole)を作りことができ、対応的に、他方の重鎖に複数のホール(hole)および/またはノブ(knob)を作ることができる。
本明細書で使用される場合、用語「SIRPα」は、シグナル調節タンパク質α(Signal Regulatory Protein α)であり、CD172aとも称される。シグナル調節タンパク質(SIRP)は、三つのファミリーメンバ、SIRPα(CD172a)、SIRPβ(CD172b)、およびSIRPγ(CD172g)を含む膜貫通糖タンパク質である。これらの三つのメンバーは、外膜の端が似ているが、内膜の領域が異なる。膜の外端には三つの免疫グロブリン(Ig)様領域が含まれ、その第1領域はIgV領域に属し、第2と第3領域はIgC領域に属する。SIRPα(CD172a)の膜内領域には、阻害シグナルを伝達し、細胞の対応する機能を阻害する二つの阻害シグナルドメインが含まれる。SIRPβ(CD172b)およびSIRPγ(CD172g)の細胞内領域は短く、シグナル伝達領域はないが、SIRPβ(CD172b)はアダプタータンパク質(Adaptor protein、DAP12など)を介して活性化シグナルを伝達することができる。SIRPタンパク質は、主にマクロファージ(Mφ)、樹状細胞(DC)、および神経細胞で発現する。本明細書は、特に、ヒトSIRPα野生型とそのCD47非高親和性変異体を指す。
「細胞外トランケーション」は、膜貫通機能を有するタンパク質を指す。本明細書で使用される「SIRPα細胞外トランケーション」は、細胞膜の外側空間に全体的または部分的に位置するアミノ酸配列を選択的にトランケーションするヒトSIRPα野生型およびそのCD47非高親和性変異体を指す。
本明細書で使用される場合、用語「SIRPα−Fc融合タンパク質」は、SIRPα細胞外トランケーション、リンカー配列およびFc領域を含む融合タンパク質を指す。前記配列に含まれるリンカー配列および/またはFc領域は、当業者に周知の方法または従来のリンカー配列および/またはFc領域に従って任意に置換することができる。
本明細書で使用されるように、用語「リンカー配列」は、SIRPα細胞外トランケーションと結合配列を連結するアミノ酸配列を指し、選択的に、IgG抗体のヒンジ領域であり、選択的に、ヒンジ領域とIgG重鎖CH1ドメインを含む。前記配列に含まれるリンカー配列またはヒンジ領域配列は、当業者に周知の方法または従来のリンカー配列またはヒンジ領域配列に従って任意に置換することができる。
本明細書で使用されるように、用語「結合配列」は、高親和性の腫瘍を標的とするアームと、低親和性のCD47とSIRPαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質を結合させる配列を指し、選択的に、前記結合配列は、ヒンジ領域とFc領域を含み、より選択的に、前記Fc領域は、knobまたはknobsおよび/またはholeまたはholes突然変異を含む。前記配列に含まれる結合配列またはヒンジ領域またはFc領域配列は、当業者に周知の方法または従来の結合配列またはヒンジ領域またはFc領域配列に従って任意に置換することができる。
CD47は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する膜貫通糖タンパク質であり、赤血球を含むほぼすべての細胞表面に発現する。CD47のリガンドには、接着因子(インテグリン)、トロンボスポンジン1(thrombospondin−1)、およびシグナル調節タンパク質(SIRP)を含む。CD47は、細胞移動、T細胞、樹状細胞の活性化、軸索の発達などを含むさまざまな生物学的機能を有する。さらに、CD47はSIRPαと相互作用することによりマクロファージの食作用を阻害する。CD47は、このような方法でいわゆる「食べないでください」(「Don’t eat me」)信号を送信し、赤血球、B細胞、T細胞などの正常細胞をマクロファージによる食作用から保護する。
本明細書で使用される場合、用語「Ofa」、「Ofatumumab」、「Anti−CD20(Ofatumumab)」は、本発明で交換的に使用することができ、抗CD20抗体Ofatumumabを示す。
本明細書で使用されるように、用語「Obi」、「Obinutuzumab」、「Anti−CD20(Obinutuzumab)」は、本発明で交換的に使用することができ、抗CD20抗体Obinutuzumabを示す。
本明細書で使用されるように、用語「Anti−CD47 mAb」、「抗CD47抗体」、「Hu5F9−G4」は、本発明で交換的に使用することができ、抗CD47抗体Hu5F9−G4を示す。
本明細書で使用される場合、用語「Anti−EGFR mAb」、「JMT101」は、本発明で交換的に使用することができ、抗EGFR抗体JMT101を示す。JMT101は、ヒト化抗EGFRモノクローナル抗体であり、ZL201210406288.3特許BA03を参照することができる。
本明細書で使用されるように、用語「トラスツズマブモノクローナル抗体」、「Trastuzumab」、「Anti−Her2(T) mAb」、「Herceptin」は、本発明で交換的に使用することができ、抗Her2抗体Trastuzumabを示す。
本明細書で使用されるように、用語「ペルツズマブモノクローナル抗体」、「Pertuzumab」、「Anti−Her2(P) mAb」、「Perjeta」は、本発明で交換的に使用することができ、抗Her2抗体Pertuzumabを示す。
本明細書で使用されるように、用語「Tecentriq」、「Atezolizumab」は、本発明で交換的に使用することができ、抗PD−L1抗体Atezolizumabを示す。
本明細書で使用されるように、用語「SIRPα D1−Fc」、「D1−Fc」は、本発明で交換的に使用することができ、一本鎖融合タンパク質SIRPα D1−Fcの二量体を示す。
hole突然変異を有するFc領域のOfatumumab不完全抗体を示す。
hole突然変異を有するFc領域のTranstuzumab不完全抗体を示す。
hole突然変異を有するFc領域のPertuzumab不完全抗体を示す。
hole突然変異を有するFc領域の抗EGFR不完全抗体を示す。
SIRPα D1ドメイン細胞外トランケーションとknob突然変異を有するFc領域を含む融合タンパク質を示す。
SIRPα D1およびD2ドメイン細胞外トランケーションとknob突然変異を有するFc領域を含む融合タンパク質を示す。
SIRPα D1、D2およびD3ドメイン細胞外トランケーションとknob突然変異を有するFc領域を含む融合タンパク質を示す。
本明細書で使用される場合、用語「治療」、「治療方法」および「治癒」は、交換的に使用することができる。用語「治療」は、疾患、病症、病状、および関連する症状の進行を制御すること、好ましくは、疾患、病症、病状を低減し、または疾患、病症、病状の一つまたは複数の症状の影響を緩和することを含む。この用語は、疾患の治癒または症状の完全な除去を含む。この用語は、症状の緩和を含む。この用語は、非治癒の緩和治療も含むが、これに限定されない。用語「治療する」は、疾患、病症、病状の進行、またはまたは疾患、病症、病状の一つまたは複数の症状の影響を予防または遅延、低減または緩和するために、本発明の組換えタンパク質または融合タンパク質を含む医薬組成物の治療有効量を実験対象者に投与することを含む。
本明細書で使用されるように、用語「投与」は、本発明の組換えタンパク質または融合タンパク質を含む医薬組成物の治療有効量を実験対象者へ送達することを指す。投与は、全身的投与または局所的投与であり得る。投与は、注射器などの投与装置によることができる。投与方法は、埋め込み、経鼻吸入、噴霧、注射などを含むが、これらに限定されない。投与経路は、吸入、鼻腔内、経口、静脈内、皮下または筋肉内投与などを含む。
設計された分子構造に従って、各構成部分のアミノ酸配列を前後で一緒にスプライスし、コドンに対するチャイニーズハムスター(Cricetulus griseus)の好みに従って、最適なDNAコード配列が設計され、遺伝子クローニング操作などに必要な酵素トランケーション部位を除外し、その後、当該配列5’端に順序にクローニングサイト、Kozak配列とシグナルペプチドコード配列を追加し、当該配列3’端に順序に停止コードン及びクローニングサイトを追加し、図1に示された通りである。
実施例2 発現プラスミドの製造、細胞トランスフェクションおよび標的タンパク質の発現、精製
発現プラスミドの製造
発現プラスミドを含むグリセロール細菌(発現プラスミドを含む1mLの大腸菌液に0.5mLの60%滅菌グリセロール溶液を加え、十分に混ぜる)を、液体LB培地に1:1000の比率で接種した。37℃、220rpmで16時間振盪した後、遠心分離によりバクテリアを収集した。発現プラスミドは、エンドトキシンを含まないプラスミドキット(DP117、Tiangen Biochemical Technology(Beijing)Co.,Ltd.から購入)を使用して、キットの説明書に提供された標準手順に従って、抽出することにより得た。
得られた発現プラスミドを0.22μmフィルターで濾過した後、3mgのプラスミド(ここで、生成物は典型的な抗体分子であり、その軽鎖と重鎖の発現プラスミドの比は1:1(モル比)であり、生成物は組換えタンパク質であり、その軽鎖、重鎖、右アーム発現プラスミドの発現プラスミドの比率は1:1:1(モル比)であり、具体的に表3を参照)を吸引し、50mLのOpti MEM I Reduced Serum Medium(GIBCOから購入)に加え、均一に混合した。6mgのトランスフェクション試薬ポリエーテルイミド(Polyetherimide、PEI、Polysciencesから購入し、1mg/mLの濃度で滅菌超純水に溶解)を吸引し、50mLのOpti MEM I Reduced Serum Mediumに加え、均一に混合した。得られたPEI溶液を、プラスミドを含むOpti MEM I Reduced Serum Medium溶液に加え、均一に混合した。室温で15分間放置した後、プラスミドとPEIの混合物を、1Lの体積と3×106細胞/mLの細胞密度を有する宿主細胞CHO−S(Thermo Fisherから購入)の懸濁液にゆっくりと均一に加え、37℃に置き、5%のCO2インキュベーターで培養した。4時間後、初期容量の7%に相当するフィード培地を添加(当該フィード培地は、水1リットルあたりに80gのCD Efficient Feed C AGT(Gibcoから購入)、75gの5×00483(Kerryから購入)を溶解した)した。培養温度を33℃に下げ、6日間の培養後に収穫した。細胞懸濁液を10℃で10000gで30分間遠心分離し、遠心分離によって得られた上清、すなわち細胞培養回収溶液を標的タンパク質の精製に使用した。
以下の方法では、Ofa−Fc1−D1−Fc2を例として、プロテインAをアフィニティキャプチャした。
実施例3 標的親和性、標的競合結合活性の検出
1、CD47、CD20、EGFR、Her2標的親和性の検出方法
標的CD47およびCD20に対する組換えタンパク質Ofa−Fc1−D1−Fc2、Ofa−Fc1−D1m−Fc2、Ofa−Fc1−D1−D2−Fc2、Ofa−Fc1−D1m−D2−Fc2、Ofa−Fc1−D1−D2−D3−Fc2、Obi−Fc1−D1−Fc2、Obi−Fc1−D1m−Fc2、Obi−Fc1−D1−D2−Fc2、Obi−Fc1−D1m−D2−Fc2、Obi−Fc1−D1−D2−D3−Fc2の結合親和性は、ELISAおよび/またはフローサイトメトリーにより測定した。以下の方法では、Ofa−Fc1−D1−Fc2を例とし、左アームがCD20標的である組換えタンパク質の検出に適用される。
酵素プレートを100μlの1μg/mlのCD47−His(12283−H08H−200、Sino Biological)でコーティングし、4℃で一晩放置し、PBST溶液(0.1%Tween 20を含むPBS)で洗浄した後、PBS+1%BSAで室温で2時間ブロックし、洗浄した後、コーティングされた酵素プレートに希釈されたOfa−Fc1−D1−Fc2、Anti−EGFR−Fc1−D1−Fc2(1000ng/mlから、2.5倍希釈、合計11ポイント)をウェルあたり100μlにそれぞれ加え、25℃で1時間インキュベートし、サンプルを捨てて、PBST溶液で3回洗浄し、100μlの希釈マウス抗ヒトIgG Fc−HRP(1:10000)(Ab7499、abcam)を加え、25℃で1時間インキュベートし、溶液を捨ててPBST溶液で3回洗浄し、TMB(P0209、beyotime)を加えて約20分間遮光して発色させた後、H2SO4で反応を停止し、マイクロプレートリーダーでOD(450−650nm)値を読み取った。
A431細胞(ヒト表皮癌細胞)、成長が良好な細胞を収集し、カウントし、遠心分離し、PBS+2%FBS(Gibcoから購入)で3×106個の細胞/mlの濃度に再懸濁した。細胞を100μl/ウェルで96ウェルプレートUプレート(商品番号:3799、Corning)に加え、少なくとも15分間放置し、遠心して上清を吸引し、9希釈度のOfa−Fc1−D1−Fc2(15000ng/mlから開始、5倍勾配希釈、合計9濃度)をそれぞれ加え、96ウェルプレートを4℃の冷蔵庫で1時間インキュベートし、PBS+2%FBSで洗浄した後、ヤギ抗ヒトIgG Fc−FITC(F9512−2ML、Sigma)を加え、4℃で1時間インキュベートし、PBS+2%FBSで洗浄および再懸濁した後、フローサイトメーター(Accuri C6、BD)により蛍光値を測定した。
Raji細胞(ヒトB細胞リンパ腫)(上海科学院細胞バンクから購入)、成長が良好な細胞を収集し、カウントし、遠心分離し、PBS+2%FBSで3×106個の細胞/mlの濃度に再懸濁した。細胞を100μl/ウェルで96ウェルプレートUプレート(商品番号:3799、Corning)に加え、少なくとも15分間放置し、遠心して上清を吸引し、100μLのPBS+2%FBS(対照群)または1.5μg/mLの抗CD47抗体Hu5F9−G4(Fab)2(実験群)(ペプシンによりFcを切除、キット:Thermo Fisher、44988)を加え、4℃で1時間インキュベートし、PBS+2%FBSで洗浄した後、7希釈度のOfa−Fc1−D1−Fc2、Hu5F9−G4、SIRPα D1−Fc(6250ng/mlから開始、4倍 勾配希釈、合計7濃度、図7では形質転換後のモル濃度)をそれぞれ加え、4℃で1時間インキュベートし、PBS+2%FBSで洗浄した後、ヤギ抗ヒトIgG Fc−FITC(F9512−2ML、Sigma)を加え、4℃で1時間インキュベートし、PBS+2%FBSで洗浄および再懸濁した後、フローサイトメーター(Accuri C6、BD)により蛍光値を測定した。
Raji細胞(ヒトB細胞リンパ腫)(上海科学院細胞バンクから購入)、成長が良好な細胞を収集し、カウントし、遠心分離し、PBS+2%FBSで3×106個の細胞/mlの濃度に再懸濁した。細胞を100μl/ウェルで96ウェルプレートUプレート(商品番号:3799、Corning)に加え、少なくとも15分間放置し、遠心して上清を吸引し、12希釈度のOfa−Fc1−D1−Fc2、Ofatumumab、Hu5F9−G4、SIRPα D1−Fc(50000ng/ml、25000ng/ml、6250ng/ml、4倍勾配希釈、合計12濃度、図8Aは形質転換後のモル濃度)をそれぞれ加え、4℃で1時間インキュベートし、PBS+2%FBSで洗浄した後、ヤギ抗ヒトIgG Fc−FITC(F9512−2ML、Sigma)を加え、4℃で1時間インキュベートし、PBS+2%FBSで洗浄および再懸濁した後、フローサイトメーター(Accuri C6、BD)により蛍光値を検出した。
SKBR−3細胞(ヒト乳癌細胞)(上海科学院細胞バンクから購入)、成長が良好な細胞を収集し、カウントし、遠心分離し、PBS+2%FBSで細胞を2×106個の細胞/mlの濃度に再懸濁した。細胞を100μl/ウェルで96ウェルプレートUプレート(商品番号:3799、Corning)に加え、少なくとも15分間放置し、遠心して上清を吸引し、10希釈度のAnti−Her2(T)−Fc1−D1−Fc2、TrastuzumabおよびHu5F9−G4(433.2nMから開始、4倍勾配希釈、合計10濃度)をそれぞれ加え、4℃で1時間インキュベートし、PBS+2%FBSで洗浄した後、ヤギ抗ヒトIgG Fc−FITC(F9512−2ML、Sigma)を加え、4℃で1時間インキュベートし、PBS+2%FBSで洗浄および再懸濁した後、フローサイトメーター(Accuri C6、BD)により蛍光値を検出した。
A431細胞(ヒト表皮癌細胞)(中国医学科学院の基礎医学研究所から購入)、成長が良好な細胞を収集し、カウントし、遠心分離し、PBS+2%FBSで細胞を2×106個の細胞/mlの濃度に再懸濁した。細胞を100μl/ウェルで96ウェルプレートUプレート(商品番号:3799、Corning)に加え、少なくとも15分間放置し、遠心して上清を吸引し、11希釈度のAnti−EGFR−Fc1−D1−Fc2、JMT101、SIRPαD1−FcおよびHu5F9−G4(216.6nMから開始、4倍勾配希釈、合計11個の濃度)をそれぞれ加え、4℃で1時間インキュベートし、PBS+2%FBSで洗浄した後、ヤギ抗ヒトIgG Fc−FITC(F9512−2ML、Sigma)を加え、4℃で1時間インキュベートし、PBS+2%FBSで洗浄および再懸濁した後、フローサイトメーター(Accuri C6、BD)により蛍光値を検出した。
NCI−H441細胞(ヒト肺腺癌細胞)(北京北納創聯生物技術研究院から購入)、10ng/ml hIFN−γ(BD、商品番号:554616)で2×107個の細胞を18時間刺激し、細胞を消化して収集し、且つカウントし、遠心分離し、PBS+2%FBSで細胞を3×106個の細胞/mlの濃度に再懸濁した。細胞を100μl/ウェルで96ウェルプレートUプレート(商品番号:3799、Corning)に加え、少なくとも15分間放置し、遠心して上清を吸引し、12希釈度のAnti−PD−L1(Ate)−Fc1−D1−Fc2およびAtezolizumab(433.2nM、216.6nM、そして4倍勾配希釈、合計12個の濃度)をそれぞれ加え、4℃で1時間インキュベートし、PBS+2%FBSで洗浄した後、ヤギ抗ヒトIgG Fc−FITC(F9512−2ML、Sigma)を加え、4℃で1時間インキュベートし、PBS+2%FBSで洗浄および再懸濁した後、フローサイトメーター(Accuri C6、BD)により蛍光値を検出した。
以下の方法では、Ofa−Fc1−D1−Fc2またはAnti−EGFR−Fc1−D1−Fc2を例として、ELISAにより標的CD47とSIRPαの結合の競合的結合を測定した。
酵素プレートを100μlの1μg/mlのCD47−His(12283−H08H−200、Sino Biological)でコーティングし、4℃で一晩放置し、PBSTで洗浄した後、PBS+1%BSAで室温で2時間ブロックし、洗浄した後、コーティングされた酵素プレートに希釈された異なる濃度の(1000ng/mlから、3倍勾配希釈、合計11個濃度)Ofa−Fc1−D1−Fc2またはAnti−EGFR−Fc1−D1−Fc2とビオチン標識されたSIRPα D1−Fc(ビオチン標識キット、21925、Thermo、サンプル濃度は100ng/mlである)混合液を1ウェル当たり100μlにそれぞれ加え、25℃で1時間インキュベートし、サンプルを捨てて、PBST溶液で3回洗浄し、100μlの希釈されたストレプトアビジン−HRP(1:10000)(ML−0437P−HRP、ZI501−1研域化学試薬)を加えた後、25で1時間インキュベートし、溶液を捨てて、PBST溶液で3回洗浄し、TMB(P0209,beyotime)を加えて約20分間遮光して発色させた後、H2SO4で反応を停止し、マイクロプレートリーダーでOD(450−650nm)値を読み取った。
組換えタンパク質:Ofa−Fc1−D1m−Fc2、Ofa−Fc1−D1m−D2−Fc2、Anti−EGFR−Fc1−D1m−Fc2、Anti−EGFR−Fc1−D1m−D2−Fc2、Anti−Her2(T)−Fc1−D1m−Fc2、Anti−Her2(T)−Fc1−D1m−D2−Fc2、Anti−Her2(P)−Fc1−D1m−Fc2、Anti−Her2(P)−Fc1−D1m−D2−Fc2、Anti−PD−L1(Ate)−Fc1−D1m−Fc2、Anti−PD−L1(Ate)−Fc1−D1m−D2−Fc2、Anti−PD−L1(13G4)−Fc1−D1m−Fc2、Anti−PD−L1(13G4)−Fc1−D1m−D2−Fc2、Anti−PD−L1(12A4)−Fc1−D1m−Fc2、Anti−PD−L1(12A4)−Fc1−D1m−D2−Fc2の初期インビトロ免疫安全性の評価実験において、以下の方法では、Ofa−Fc1−D1m−Fc2を例とし、右アームにSIRPα細胞外トランケーション高親和性変異体を含む組換えタンパク質の検出に適した。
NCI−H441細胞(ヒト肺腺癌細胞)(北京北納創聯生物技術研究院から購入)、細胞を消化して収集し、且つカウントし、遠心分離し、PBS+2%FBSで細胞を3×106個の細胞/mlの濃度に再懸濁した。細胞を100μl/ウェルで96ウェルプレートUプレート(商品番号:3799、Corning)に加え、少なくとも15分間放置し、遠心して上清を吸引し、12希釈度のOfa−Fc1−D1−Fc2、Ofa−Fc1−D1m−Fc2、Hu5F9−G4、Ofatumumab(433.2nM、216.6nM、そして4倍勾配希釈、合計12個の濃度)をそれぞれ加え、4℃で1時間インキュベートし、PBS+2%FBSで洗浄した後、ヤギ抗ヒトIgG Fc−FITC(F9512−2ML、Sigma)を加え、4℃で1時間インキュベートし、PBS+2%FBSで洗浄および再懸濁した後、フローサイトメーター(Accuri C6、BD)により蛍光値を検出した。
(1)ヒトエフェクター細胞懸濁液を製造:
CD16aの安定且つ高発現する成長が良好なヒトNK92MI−CD16aエフェクター細胞(華博バイオから購入)を取り、遠心分離して(201g、5min)、上清を捨てて、5ml MEM(フェノールレッドフリー)基礎培地(Gibcoから購入、51200−038)に再懸濁し、カウントした後、MEM(フェノールレッドフリー)基礎培地で標的細胞密度を2.4×106個の細胞/mlまで調整して、ヒトエフェクター細胞懸濁液として使用した。
50μl/ウェルのMEM(フェノールレッドフリー)基礎培地を96ウェル黒底移植プレートの対応するウェルに分註し、希釈されたOfa−Fc1−D1−Fc2またはOfa−Fc1−D1m−Fc2二重特異性抗体をそれぞれ希釈勾配25μl/ウェルに加え、マルチウェルを設定した。(1)で製造されたヒトエフェクター細胞懸濁液25μl(60000個の細胞/ウェル)を加えた。均一に混合した後、Ofa−Fc1−D1−Fc2またはOfa−Fc1−D1m−Fc2二重特異性抗体が最終濃度勾配(433.2nMから開始、4倍勾配希釈、合計10の濃度)に達し、そして37℃で5.5時間反応させ、溶解バッファー(Promega由来キット、G7891)を対照群に加えて0.5時間インキュベートした。
インキュベーションが完了した後、プレートを安全キャビネットに置き、蓋を開けて、約15分間自然に室温まで冷却した。室温で30分間平衡化したLDH基質反応溶液(Promega由来キット、G7891)をウェルあたり100μlに加え、穏やかに混合し、室温で15分間インキュベートした後、すぐに停止溶液(Promega由来キット、G7891)50μl/ウェルを加え、均一に混合した後、マイクロプレートリーダーにより蛍光値を読み取った。
組換えタンパク質:Ofa−Fc1−D1−Fc2、Ofa−Fc1−D1−D2−Fc2、Ofa−Fc1−D1−D2−D3−Fc2、Obi−Fc1−D1−Fc2、Obi−Fc1−D1−D2−Fc2、Obi−Fc1−D1−D2−D3−Fc2、Anti−EGFR−Fc1−D1−Fc2、Anti−EGFR−Fc1−D1−D2−Fc2、Anti−EGFR−Fc1−D1−D2−D3−Fc2、Anti−Her2(P)−Fc1−D1−Fc2、Anti−Her2(P)−Fc1−D1−D2−Fc2、Anti−Her2(P)−Fc1−D1−D2−D3−Fc2、Anti−Her2(T)−Fc1−D1−Fc2、Anti−Her2(T)−Fc1−D1−D2−Fc2、Anti−Her2(T)−Fc1−D1−D2−D3−Fc2、Anti−EGFR−Fc1−D1−Fc2、Anti−EGFR−Fc1−D1−D2−Fc2、Anti−EGFR−Fc1−D1−D2−D3−Fc2、Anti−PD−L1(Ate)−Fc1−D1−Fc2、Anti−PD−L1(Ate)−Fc1−D1−D2−Fc2、Anti−PD−L1(Ate)−Fc1−D1−D2−D3−Fc2、Anti−PD−L1(13G4)−Fc1−D1−Fc2、Anti−PD−L1(13G4)−Fc1−D1−D2−Fc2、Anti−PD−L1(13G4)−Fc1−D1−D2−D3−Fc2、Anti−PD−L1(12A4)−Fc1−D1−Fc2、Anti−PD−L1(12A4)−Fc1−D1−D2−Fc2、Anti−PD−L1(12A4)−Fc1−D1−D2−D3−Fc2インビボで腫瘍細胞の成長を阻害する実験において、以下の方法では、Ofa−Fc1−D1−Fc2を例とし、右アームにSIRPα細胞外トランケーションを含む組換えタンパク質の検出に適した。
実施例6 組換えタンパク質のインビボ初期免疫安全性の評価実験
組換えタンパク質Ofa−Fc1−D1m−Fc2、Ofa−Fc1−D1m−D2−Fc2、Anti−EGFR−Fc1−D1m−Fc2、Anti−EGFR−Fc1−D1m−D2−Fc2、Anti−Her2(T)−Fc1−D1m−Fc2、Anti−Her2(T)−Fc1−D1m−D2−Fc2、Anti−Her2(P)−Fc1−D1m−Fc2、Anti−Her2(P)−Fc1−D1m−D2−Fc2、Anti−PD−L1(Ate)−Fc1−D1m−Fc2、Anti−PD−L1(Ate)−Fc1−D1m−D2−Fc2、Anti−PD−L1(13G4)−Fc1−D1m−Fc2、Anti−PD−L1(13G4)−Fc1−D1m−D2−Fc2、Anti−PD−L1(12A4)−Fc1−D1m−Fc2、Anti−PD−L1(12A4)−Fc1−D1m−D2−Fc2のインビボで初期免疫安全性の評価において、以下の方法では、Ofa−Fc1−D1m−Fc2を例とし、右アームにSIRPα細胞外トランケーション高親和性変異体を含む組換えタンパク質の検出に適した。
ヒトCD34+ HSC移植メスNSG(Hu−NSG)マウス(IDMOから購入)を選択し、以下の3群に(1群あたり3匹のマウス、各群に標識用量に静脈注射した)分けた:1)0.9%の生理食塩水対照群、2)Hu5F9−G4(6.7μg/匹)群、3)Ofa−Fc1−D1−Fc2(5μg/匹)群、1回投与し、投与して96時間後に、ヘパリンナトリウムを含む抗凝固剤チューブに、80μlの血液をマウスの尾静脈から採取し、新たに調製した赤血球溶解液で赤血球を溶解し(ここで、赤血球溶解液は溶解液である(BD Pharm LyseTM、商品番号:555899):ダブル蒸し水等量に混合して調製)、残りの細胞をPBS+2%FBSで洗浄して再懸濁し、蛍光抗体(PE anti−human CD45(商品番号:304039)/FITC anti−human CD19(商品番号:302206)/APC anti−human CD3(商品番号:300312)、BioLegendから購入)と細胞と共に30分間インキュベートし、PBS+2%FBSで洗浄および再懸濁した後、フローサイトメーター(AccuriTM C6、BD)により検出した。
ヒトCD34+ HSC移植NSG(Hu−NSG)メスマウス(IDMOから購入)を選択し、以下の2群に(1群あたり3匹のマウス、各群に標識用量に静脈注射した)分けた:1)Ofa−Fc1−D1−Fc2(1μg/匹)群、2)Ofa−Fc1−D1m−Fc2(1μg/匹)群、1回投与し、投与して27時間後に、ヘパリンナトリウムを含む抗凝固剤チューブに80μlの血液をマウスの尾静脈から採取し、新たに調製した赤血球溶解液で赤血球を溶解し(ここで、赤血球溶解液は溶解液である(BD Pharm LyseTM、商品番号:555899):ダブル蒸し水等量に混合して調製)、残りの細胞をPBS+2%FBSで洗浄して再懸濁し、蛍光抗体(PE anti−human CD45(商品番号:304039)/FITC anti−human CD19(商品番号:302206)/APC anti−human CD3(商品番号:300312)、BioLegendから購入)と細胞と共に30分間インキュベートし、PBS+2%FBSで洗浄および再懸濁した後、Ofa−Fc1−D1−Fc2(1μg/匹)群サンプルをフローサイトメーター(AccuriTM C6、BD)により検出し、Ofa−Fc1−D1m−Fc2(1μg/匹)群サンプルをフローサイトメーター(NovoCyteTM 3130、ACEA)により検出した。
ヒトCD34+ HSC移植NSG(Hu−NSG)メスマウス(IDMOから購入)を選択し、以下の2群に(1群あたり3匹のマウス、各群に標識用量に静脈注射した):1)Hu5F9−G4(200μg/匹)群、2)Ofa−Fc1−D1−Fc2(150μg/匹)群、1回投与し、投与4日後、投与14日後に、ヘパリンナトリウムを含む抗凝固剤チューブに80μlの血液をマウスの尾静脈から採取し、新たに調製した赤血球溶解液で赤血球を溶解し(ここで、赤血球溶解液は溶解液である(BD Pharm LyseTM、商品番号:555899):ダブル蒸し水体積に混合して調製)、残りの細胞をPBS+2%FBSで洗浄して再懸濁し、蛍光抗体(PE anti−human CD45(商品番号:304039)/FITC anti−human CD19(商品番号:302206)/APC anti−human CD3(商品番号:300312)、BioLegendから購入)と細胞と共に30分間インキュベートし、PBS+2%FBSで洗浄および再懸濁した後、フローサイトメーター(AccuriTM C6、BD)により検出した。
実施例7 標的親和性結合活性に対する異なるトランケーションの影響
組換えタンパク質Ofa−Fc1−D1−Fc2、Ofa−Fc1−D1−D2−Fc2、Ofa−Fc1−D1−D2−D3−Fc2、Obi−Fc1−D1−Fc2、Obi−Fc1−D1−D2−Fc2、Obi−Fc1−D1−D2−D3−Fc2、Anti−EGFR−Fc1−D1−Fc2、Anti−EGFR−Fc1−D1−D2−Fc2、Anti−EGFR−Fc1−D1−D2−D3−Fc2、Anti−Her2(P)−Fc1−D1−Fc2、Anti−Her2(P)−Fc1−D1−D2−Fc2、Anti−Her2(P)−Fc1−D1−D2−D3−Fc2、Anti−Her2(T)−Fc1−D1−Fc2、Anti−Her2(T)−Fc1−D1−D2−Fc2、Anti−Her2(T)−Fc1−D1−D2−D3−Fc2、Anti−EGFR−Fc1−D1−Fc2、Anti−EGFR−Fc1−D1−D2−Fc2、Anti−EGFR−Fc1−D1−D2−D3−Fc2、Anti−PD−L1(Ate)−Fc1−D1−Fc2、Anti−PD−L1(Ate)−Fc1−D1−D2−Fc2、Anti−PD−L1(Ate)−Fc1−D1−D2−D3−Fc2、Anti−PD−L1(13G4)−Fc1−D1−Fc2、Anti−PD−L1(13G4)−Fc1−D1−D2−Fc2、Anti−PD−L1(13G4)−Fc1−D1−D2−D3−Fc2、Anti−PD−L1(12A4)−Fc1−D1−Fc2、Anti−PD−L1(12A4)−Fc1−D1−D2−Fc2、Anti−PD−L1(12A4)−Fc1−D1−D2−D3−Fc2は、Anti−Her2(T)−Fc1−D1−Fc2、Anti−Her2(T)−Fc1−D1−D2−Fc2、Anti−Her2(P)−Fc1−D1−Fc2及びAnti−Her2(P)−Fc1−D1−D2−Fc2を例とし、左アームに同じ長さ、右アームに異なる長さのSIRPα細胞外トランケーションを使用した組換えタンパク質に適用される。
SKBR−3細胞(ヒト乳癌細胞)(上海科学院細胞バンクから購入)、成長が良好な細胞を収集し、カウントし、遠心分離し、PBS+2%FBSで2×106個の細胞/mlの濃度に再懸濁した。細胞を100μl/ウェルで96ウェルプレートUプレート(商品番号:3799、Corning)に加え、少なくとも15分間放置し、遠心して上清を吸引し、11希釈度のAnti−Her2(T)−Fc1−D1−Fc2、Anti−Her2(T)−Fc1−D1−D2−Fc2、Anti−Her2(P)−Fc1−D1−Fc2およびAnti−Her2(P)−Fc1−D1−D2−Fc2(433.2nMから開始、4倍勾配希釈、合計11濃度)をそれぞれ加え、4℃で1時間インキュベートし、PBS+2%FBSで洗浄した後、ヤギ抗ヒトIgG Fc−FITC(F9512−2ML、Sigma)を加え、4℃で1時間インキュベートし、PBS+2%FBSで洗浄および再懸濁した後、フローサイトメーター(Accuri C6、BD)により蛍光値を検出した。
組換えタンパク質Ofa−Fc1−D1−Fc2、Ofa−Fc1−D1−D2−Fc2、Ofa−Fc1−D1−D2−D3−Fc2、Obi−Fc1−D1−Fc2、Obi−Fc1−D1−D2−Fc2、Obi−Fc1−D1−D2−D3−Fc2、Anti−EGFR−Fc1−D1−Fc2、Anti−EGFR−Fc1−D1−D2−Fc2、Anti−EGFR−Fc1−D1−D2−D3−Fc2、Anti−Her2(P)−Fc1−D1−Fc2、Anti−Her2(P)−Fc1−D1−D2−Fc2、Anti−Her2(P)−Fc1−D1−D2−D3−Fc2、Anti−Her2(T)−Fc1−D1−Fc2、Anti−Her2(T)−Fc1−D1−D2−Fc2、Anti−Her2(T)−Fc1−D1−D2−D3−Fc2、Anti−EGFR−Fc1−D1−Fc2、Anti−EGFR−Fc1−D1−D2−Fc2、Anti−EGFR−Fc1−D1−D2−D3−Fc2、Anti−PD−L1(Ate)−Fc1−D1−Fc2、Anti−PD−L1(Ate)−Fc1−D1−D2−Fc2、Anti−PD−L1(Ate)−Fc1−D1−D2−D3−Fc2、Anti−PD−L1(13G4)−Fc1−D1−Fc2、Anti−PD−L1(13G4)−Fc1−D1−D2−Fc2、Anti−PD−L1(13G4)−Fc1−D1−D2−D3−Fc2、Anti−PD−L1(12A4)−Fc1−D1−Fc2、Anti−PD−L1(12A4)−Fc1−D1−D2−Fc2、Anti−PD−L1(12A4)−Fc1−D1−D2−D3−Fc2の急性毒性試験において、以下の方法では、Ofa−Fc1−D1−Fc2を例とし、右アームにSIRPα細胞外トランケーションを含む組換えタンパク質の検出に適した。
実施例9 組換えタンパク質のインビボでの腫瘍成長阻害実験
組換えタンパク質Ofa−Fc1−D1−Fc2、Ofa−Fc1−D1−D2−Fc2、Ofa−Fc1−D1−D2−D3−Fc2、Obi−Fc1−D1−Fc2、Obi−Fc1−D1−D2−Fc2、Obi−Fc1−D1−D2−D3−Fc2、Anti−EGFR−Fc1−D1−Fc2、Anti−EGFR−Fc1−D1−D2−Fc2、Anti−EGFR−Fc1−D1−D2−D3−Fc2、Anti−Her2(P)−Fc1−D1−Fc2、Anti−Her2(P)−Fc1−D1−D2−Fc2、Anti−Her2(P)−Fc1−D1−D2−D3−Fc2、Anti−Her2(T)−Fc1−D1−Fc2、Anti−Her2(T)−Fc1−D1−D2−Fc2、Anti−Her2(T)−Fc1−D1−D2−D3−Fc2、Anti−EGFR−Fc1−D1−Fc2、Anti−EGFR−Fc1−D1−D2−Fc2、Anti−EGFR−Fc1−D1−D2−D3−Fc2、Anti−PD−L1(Ate)−Fc1−D1−Fc2、Anti−PD−L1(Ate)−Fc1−D1−D2−Fc2、Anti−PD−L1(Ate)−Fc1−D1−D2−D3−Fc2、Anti−PD−L1(13G4)−Fc1−D1−Fc2、Anti−PD−L1(13G4)−Fc1−D1−D2−Fc2、Anti−PD−L1(13G4)−Fc1−D1−D2−D3−Fc2、Anti−PD−L1(12A4)−Fc1−D1−Fc2、Anti−PD−L1(12A4)−Fc1−D1−D2−Fc2、Anti−PD−L1(12A4)−Fc1−D1−D2−D3−Fc2のインビボでの腫瘍成長阻害実験において、以下の方法では、Ofa−Fc1−D1−Fc2を例とし、右アームにSIRPα細胞外トランケーションを含む組換えタンパク質の検出に適した。
V=1/2×a×b2
ここで、a、bは、それぞれ長さ、広さを表す。
ここで、T、Cは、実験終了時の腫瘍体積であり、T0、C0は、実験開始時の腫瘍体積であり、Tは、投与群であり、Cは、対照群である。
腫瘍が初期体積よりも小さい場合、即ち、T<T0またはC<C0である場合、腫瘍部分的消失(PR)と定義され、腫瘍が完全に消失した場合、完全腫瘍消失(CR)と定義される。
Claims (17)
- 高親和性の腫瘍を標的とするアームと、低親和性のCD47とSIRPαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質とを含み、
前記高親和性の腫瘍を標的とするアームはCD47に結合せず、かつ腫瘍細胞上の標的抗原に対する前記高親和性の腫瘍を標的とするアームに対応する抗体の結合親和性は、腫瘍細胞上のCD47に対する低親和性のCD47とSIRPαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質に対応するモノマー融合タンパク質ホモダイマーの結合親和性の少なくとも6倍であり、
CD47に対する前記低親和性のCD47とSIRPαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質の結合親和性は、CD47に対するSIRPα細胞外トランケーションを含むモノマー融合タンパク質のホモダイマーの結合親和性より高くなく、前記SIRPα細胞外トランケーションは、ヒトSIRPα野生型細胞外トランケーションまたはCD47非高親和性突然変異のヒトSIRPα細胞外トランケーションを含む、二重特異性組換えタンパク質。 - 前記低親和性のCD47とSIRPαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質は、SIRPα細胞外トランケーションを含み、前記SIRPα細胞外トランケーションは下記a1)−a4)から選択されるいずれかの一つのアミノ酸配列を含み、a1)配列番号30、a2)配列番号31、a3)配列番号32、a4)前記アミノ酸配列のいずれかの一つのアミノ酸配列が例えば1〜5個のアミノ酸残基を挿入、欠損、修飾および/または保守的置換することを経て獲得されるアミノ酸配列であって、そのモノマーは、CD47タンパク質に対する結合親和性を有し、且つ当該結合親和性は、CD47タンパク質に対するa1)、a2)またはa3)モノマーの結合親和性より高くないアミノ酸配列を有する、請求項1に記載の二重特異性組換えタンパク質。
- 前記二重特異性組換えタンパク質は、相対的に設定される左、右のアーム構造を有し、前記高親和性の腫瘍を標的とするアームは、左アームの位置に位置され、前記低親和性のCD47とSIRPαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質は、右アームの位置に位置され、好ましくは、前記左アームは、免疫グロブリンのFabまたはFab’形態であり、前記右アームは、SIRPα細胞外トランケーションである、請求項1又は2に記載の二重特異性組換えタンパク質。
- 前記右アームの長さは、標的細胞膜の表面から左アームが結合する必要がある抗原空間エピトープの距離に適合し、好ましくは、前記高親和性の腫瘍を標的とするアームが標的細胞の近位膜エピトープに結合する必要がある場合、前記SIRPα細胞外トランケーションは、a1)〜a4)中の比較的に短いアミノ酸配列を選択して含む、請求項3に記載の二重特異性組換えタンパク質。
- 前記高親和性の腫瘍を標的とするアームの標的化の標的は、5T4、AGS−16、ALK1、ANG−2、B7−H3、B7−H4、c−fms、c−Met、CA6、CD123、CD19、CD20、CD22、EpCAM、CD30、CD32b、CD37、CD38、CD40、CD52、CD70、CD74、CD79b、CD98、CEA、CEACAM5、CLDN18.2、CLDN6、CS1、CXCR4、DLL−4、EGFR、EGP−1、ENPP3、EphA3、ETBR、FGFR2、FN、FR−α、GCC、GD2、GPC−3、GPNMB、HER2、HER3、HLA−DR、ICAM−1、IGF−1R、IL−3R、LIV−1、MSLN、MUC16、MUC1、NaPi2b、ネクチン−4、Notch 2、Notch 1、PD−L1、PD−L2、PDGFR−α、PS、PSMA、SLTRK6、STEAP1、TEM1、VEGFR、CD25、CD27L、DKK−1、CSF−1R、MSB0010718C、BCMA、CD138から選択され、
好ましくは、前記標的がCD20、EGFRまたはPD−L1である場合、前記SIRPα細胞外トランケーションは、a1)を選択し、前記標的がHER2である場合、前記SIRPα細胞外トランケーションは、a1)またはa2)を選択する、請求項1〜4のいずれか1項に記載の二重特異性組換えタンパク質。 - 高親和性の腫瘍を標的とするアームと低親和性のCD47とSIRPαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質は、分子の間の作用力によって結合され、または鎖間ジスルフィド結合のような共有結合によって結合され、またはイオン結合によって結合され、または上記の結合方法における二つまたは三つの組み合わせによって結合される、請求項1〜5のいずれか1項に記載の二重特異性組換えタンパク質。
- Fc領域をさらに含み、好ましくは、前記Fc領域は、Fc領域天然配列またはFc非天然配列を含み、より好ましくは、前記Fc領域は、ヒトFc領域であり、さらにより好ましくは、高親和性の腫瘍を標的とするアームと低親和性のCD47とSIRPαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質の結合は、knobs−into−holesによって結合される、請求項6に記載の二重特異性組換えタンパク質。
- 前記高親和性の腫瘍を標的とするアームは、標的化の標的が、5T4、AGS−16、ALK1、ANG−2、B7−H3、B7−H4、c−fms、c−Met、CA6、CD123、CD19、CD20、CD22、EpCAM、CD30、CD32b、CD37、CD38、CD40、CD52、CD70、CD74、CD79b、CD98、CEA、CEACAM5、CLDN18.2、CLDN6、CS1、CXCR4、DLL−4、EGFR、EGP−1、ENPP3、EphA3、ETBR、FGFR2、FN、FR−α、GCC、GD2、GPC−3、GPNMB、HER2、HER3、HLA−DR、ICAM−1、IGF−1R、IL−3R、LIV−1、MSLN、MUC16、MUC1、NaPi2b、ネクチン−4、Notch 2、Notch 1、PD−L1、PD−L2、PDGFR−α、PS、PSMA、SLTRK6、STEAP1、TEM1、VEGFR、CD25、CD27L、DKK−1、CSF−1R、MSB0010718C、BCMA、CD138から選択される不完全抗体であり、好ましくは、IgG1抗体の不完全抗体であり、選択的に、ヒトマウスキメラ不完全抗体、ヒト化不完全抗体、完全ヒト不完全抗体であり、より好ましくは、ヒト化または完全ヒトIgG1抗体の不完全抗体である、請求項7に記載の二重特異性組換えタンパク質。
- 低親和性のCD47とSIRPαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質は、下記b1)−b4)から選択されるいずれかの一つのアミノ酸配列を含み、b1)配列番号26、b2)配列番号27、b3)配列番号28、b4)前記アミノ酸配列のいずれかの一つのアミノ酸配列が例えば1〜5個のアミノ酸残基を挿入、欠損、修飾および/または保守的置換することを経て獲得されるアミノ酸配列であって、そのホモダイマーは、CD47タンパク質に対する結合親和性を有し、且つ当該結合親和性は、CD47タンパク質に対するb1)、b2)またはb3)ホモダイマーの結合親和性より高くないアミノ酸配列を有する、請求項7又は8に記載の二重特異性組換えタンパク質。
- 高親和性の腫瘍を標的とするアームがCD20を標的とする場合、前記高親和性の腫瘍を標的とするアームは、配列番号16と配列番号17を含み、前記低親和性のCD47とSIRPαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質は、配列番号26を含み、
高親和性の腫瘍を標的とするアームがEGFRを標的とする場合、前記高親和性の腫瘍を標的とするアームは、配列番号19と配列番号8を含み、前記低親和性のCD47とSIRPαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質は、配列番号26を含み、
高親和性の腫瘍を標的とするアームがHer2を標的とする場合、前記高親和性の腫瘍を標的とするアームは、配列番号20と配列番号21、または配列番号22と配列番号23を含み、前記低親和性のCD47とSIRPαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質は、配列番号26または配列番号27を含み、または、
高親和性の腫瘍を標的とするアームがPD−L1を標的とする場合、前記高親和性の腫瘍を標的とするアームは、配列番号24と配列番号13を含み、前記低親和性のCD47とSIRPαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質は、配列番号26を含む、請求項9に記載の二重特異性組換えタンパク質。 - 請求項1〜10のいずれか1項の二重特異性組換えタンパク質をコードする核酸分子であって、
好ましくは、前記高親和性の腫瘍を標的とするアームをコードする核酸分子と前記低親和性のCD47とSIRPαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質をコードする核酸は、同じDNA鎖に位置され、または前記高親和性の腫瘍を標的とするアームをコードする核酸分子と前記低親和性のCD47とSIRPαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質をコードする核酸は、異なるDNA鎖に位置される、核酸分子。 - 請求項11の核酸分子を含む、発現ベクター。
- 請求項12の発現ベクターを含む、宿主細胞。
- 請求項13に記載の細胞を用いて前記組換えタンパク質を発現させる、前記二重特異性組換えタンパク質の製造方法。
- 腫瘍を治療するための薬物の製造における請求項1〜10のいずれか1項に記載の二重特異性組換えタンパク質の用途であって、
好ましくは、前記腫瘍は、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、膵臓癌、食道癌、子宮内膜癌、卵巣癌、胃癌、前立腺癌、腎臓癌、子宮頸癌、骨髄腫、リンパ腫、白血病、甲状腺癌、子宮癌、膀胱癌、神経内分泌癌、頭頸部癌、肝臓癌、鼻咽頭癌、精巣癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、黒色腫、基底細胞皮膚癌、扁平上皮細胞癌、皮膚線維肉腫、メルケル細胞癌、膠芽腫、神経膠腫、肉腫、中皮腫または骨髄異形成症候群などの血液腫瘍および固形腫瘍から選択される、用途。 - a)標的とされ、ADCC活性を有する組換えタンパク質/抗体(一価または多価を含む)を提供するステップと、
b)前記組換えタンパク質/抗体のADCC活性を検出するステップと、
c)前記組換えタンパク質/抗体の初期免疫安全性を評価するステップとを含み、
好ましくは、ステップa)とステップb)の間に、
a1)ヒトNK92MI−CD16aエフェクター細胞などであるが、これに限定されないエフェクター細胞を製造するステップと、
a2)エフェクター細胞を組換えタンパク質/一価または多価抗体を含む抗体と接触させるステップとをさらに含み、
より好ましくは、前記a1)において、獲得されたエフェクター細胞を1×105個の細胞/ml乃至5×106個の細胞/mlの細胞密度に再懸濁させ、前記a2)において、勾配希釈した組換えタンパク質/抗体を、a1)で製造されたエフェクター細胞と0.5〜5hインキュベートし、前記b)において、LDH活性を測定し、細胞分解率を計算し、および/または,前記c)において、細胞分解率に従って組換えタンパク質/抗体の初期免疫安全性を評価し、ここで、細胞分解率を低下させる組換えタンパク質/抗体の免疫安全性が高い、CD47を標的とし、且つADCC活性を有する組換えタンパク質/抗体の初期免疫安全性のインビトロ評価方法。 - a)CD47を標的とする組換えタンパク質/一価または多価抗体を含む抗体を提供するステップと、
b)Hu−NSGマウスを提供するステップと、
c)前記組換えタンパク質/抗体をHu−NSGマウスと接触させるステップと、
d)前記Hu−NSGマウスにおける前記組換えタンパク質/抗体の初期免疫安全性を評価するステップとを含み、
好ましくは、前記c)において、24〜96時間の投与後、マウス静脈血を採取し、赤血球を分解し、残りの細胞を蛍光標識した抗ヒトCD45、抗ヒトCD19または抗ヒトCD3の抗体とともに15〜60minインキュベートし、フローサイトメトリー検出を行い、前記d)において、細胞クリアランスに従って組換えタンパク質/抗体の初期免疫安全性を評価し、ここで、免疫細胞クリアランスを低下させる組換えタンパク質/抗体の免疫安全性が高い、CD47を標的とする組換えタンパク質/抗体の初期免疫安全性のインビボ評価方法。
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