JP2020520249A - 二重特異性組換えタンパク質およびその応用 - Google Patents

二重特異性組換えタンパク質およびその応用 Download PDF

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Abstract

本発明は、高親和性の腫瘍を標的とするアームと低親和性のＣＤ４７とＳＩＲＰαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質を含む二重特異性組換えタンパク質を開示し、高親和性の腫瘍を標的とするアームに対応する抗体はＣＤ４７に結合せず、腫瘍細胞上の標的抗原に対する結合親和性は、腫瘍細胞上のＣＤ４７に対する低親和性のＣＤ４７とＳＩＲＰαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質に対応するモノマー融合タンパク質ホモダイマーの結合親和性の少なくとも６倍であり、ここで、低親和性のＣＤ４７とＳＩＲＰαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質は、ＳＩＲＰα細胞外トランケーションを含む。本発明は、組換えタンパク質をコードする核酸分子および腫瘍を治療するための薬物の製造における前記組換えタンパク質と核酸分子の用途をさらに開示する。
【選択図】図１３

Description

発明の詳細な説明
本出願は、２０１７年５月８日に出願された、出願番号がＣＮ２０１７１０３１７９２６．７の中国特許出願および２０１７年１２月５日に出願された、出願番号がＣＮ２０１７１１２６９６２０．５の中国特許出願に対して優先権を主張する。本出願は、当該中国特許出願の全文を引用する。
[技術分野]
本発明は、生物医学の分野に属し、具体的に、組換えタンパク質およびその用途に関する。
[背景技術]
腫瘍治療の分野における研究の深化に伴い、腫瘍分子標的治療薬物の開発および応用はますます注目されている。ターゲティングが強く、副作用が小さく、治癒効果が顕著などの利点に基づいて、抗体薬物は腫瘍標的治療分野で急速に注目を集めた。現在、数十の腫瘍を標的とする抗体薬物が臨床使用のために承認されており、顕著な結果を達成した。前記抗体薬物は、例えば、ＣＤ２０標的分子対するリツキサン（Ｒｉｔｕｘａｎ）＜登録商標＞（リツキシマブは、癌の治療に承認された米国で最初のモノクローナル抗体であり、最初は非ホジキンリンパ腫の治療に使用された、ロシュ出品）、Ｚｅｖａｌｉｎ＜登録商標＞（ｉｂｒｉｔｕｍｏｍａｂ ｔｉｕｘｅｔａｎ、最初はリツキシマブに耐性のある低分化型非ホジキンリンパ腫の治療薬として米国ＦＤＡによって承認された、ＩＤＥＣ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ出品）、Ｂｅｘｘａｒ＜登録商標＞（ｔｏｓｉｔｕｍｏｍａｂ ａｎｄ ｉｏｄｉｎｅ Ｉ １３１ ｔｏｓｉｔｕｍｏｍａｂ、ＧＳＫ出品）、Ａｒｚｅｒｒａ＜登録商標＞（ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ、ＧＳＫ出品）など、Ｈｅｒ２標的分子に対するハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）＜登録商標＞（トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、有名な乳癌治療薬物、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ出品）、Ｐｅｒｊｅｔａ＜登録商標＞（ペルツズマブ（Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ）モノクローナル抗体、Ｒｏｃｈｅ出品）、Ｋａｄｃｙｌａ＜登録商標＞（ａｄｏ−ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ ｅｍｔａｎｓｉｎｅ，Ｒｏｃｈｅ出品）など，ＶＥＧＦまたはその受容体標的分子に対するアバスチン（Ａｖａｓｔｉｎ）＜登録商標＞（ベバシズマブ（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）モノクローナル抗体、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ出品）、Ｃｙｒａｍａｚａ＜登録商標＞（ｒａｍｕｃｉｒｕｍａｂ、Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ出品）など、ＥＧＦＲ標的に対するエルビタックス（Ｅｒｂｉｔｕｘ）＜登録商標＞（セツキシマブ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）モノクローナル抗体、世界でトップ１０の売れ筋の抗癌薬の１つ、最初は直腸癌の治療に承認され、Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ出品）、Ｖｅｃｔｉｂｉｘ＜登録商標＞（パニツムマブ（Ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ）、結腸直腸癌の治療薬、Ａｍｇｅｎ出品）など、ＰＤ−Ｌ１標的分子に対するＴｅｃｅｎｔｒｉｑ＜登録商標＞（ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ，Ｒｏｃｈｅ出品）など（曹睿ら、腫瘍標的治療抗体薬物の研究進捗、《中国生化学薬ジャーナル》，２０１６，３６（６）：１５−１８）。
臨床的に応用される腫瘍細胞を標的とする腫瘍抗体薬物（非結合裸抗体）において、抗腫瘍メカニズムは、主に抗体の二つの機能によって実現される。まず、抗体の第一の機能は親和性であり、即ち、抗体は腫瘍表面の標的抗原に特異的に結合した後、そのエフェクター機能を発揮して、腫瘍細胞を殺す。抗体分子は標的抗原に結合することにより、腫瘍成長因子シグナル伝達経路をブロックし、アポトーシスを誘発し、または腫瘍微小環境における新しい血管の形成を阻害することができる。第二に、抗体の第二の機能は免疫系によって実現され、即ち、腫瘍細胞に対する殺傷作用は、免疫系に依存して細胞死を媒介することができ、例えば、抗体定常領域により媒介される抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ：ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）、補体依存性細胞阻害作用（ＣＤＣ：ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）および抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）である。増え続けるデータは、抗体媒介免疫殺害活性は、抗体が抗腫瘍の効果を発揮する重要な作用メカニズムであることを示している（レビューについては、Ｂａｒｎｈａｒｔ ＢＣ， ｅｌ ａｌ． Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｆｃ−ＦｃγＲ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１７，９５：３４０-３４６を参照することができる）。
近年、研究により、腫瘍細胞は自身の表面抗原の修飾および腫瘍組織の周囲の微小環境の変化などの方法によって、生体の免疫系の監視、認識、攻撃を逃げて、分裂および成長し続けることが確認され、これは腫瘍免疫回避とも言える。例えば、腫瘍細胞は、ＣＤ４７を高度に発現し、マクロファージの表面の抑制性受容体シグナル調節タンパク質α（ｓｉｇｎａｌｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ α，ＳＩＲＰα）に結合し、マクロファージの免疫機能を阻害することにより、免疫細胞の活性を著しく阻害する。同時に、腫瘍細胞のＣＤ４７の高発現は、Ｆｃ受容体を介した食作用を阻害し、最終的には抗体薬物の腫瘍標的治療効果に影響を及ぼす（Ｗｉｌｌｉｎｇｈａｍ ＳＢ， ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ＣＤ４７−ｓｉｇｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｌｐｈａ （ＳＩＲＰα） ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｉｓ ａ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒｓ． Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ． ２０１２，１０９（１７）：６６６２−６６６７）。
ＣＤ４７は広く発現している膜糖タンパク質であり、受容体およびリガンドとしてＳＩＲＰαと相互作用し、アポトーシス、増殖、免疫などの一連の反応を媒介するＣＤ４７−ＳＩＲＰαシグナル複合体を形成することができる。２０００年、Ｏｌｄｅｎｂｏｒｇらは、ＣＤ４７がマクロファージの食作用の細胞表面調節の重要なシグナルであることを実証した（Ｏｌｄｅｎｂｏｒｇ ＰＡ， ｅｔ ａｌ． Ｒｏｌｅ ｏｆ ＣＤ４７ ａｓ ａ ｍａｒｋｅｒ ｏｆ ｓｅｌｆ ｏｎ ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０００，２８８（５４７３）：２０５１−２０５４）。ＣＤ４７は「食べないでください」のシグナルを放出することにより、マクロファージ表面のＳＩＲＰαに結合し、その免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｍｏｔｉｆ，ＩＴＩＭ）をリン酸化し、続いて、ＳＨ２含有プロテインチロシンホスファターゼＳＨＰ１（ＳＨ２−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ １）タンパク質を動員し、マクロファージの食作用を阻害する一連のカスケード反応を生成した。若い赤血球はより高いＣＤ４７を発現し、「仲間ですから、食べないでください」というシグナルをマクロファージに放出し、一方、老化した赤血球ＣＤ４７の発現はダウンレギュレートされ、最終的にはマクロファージによって除去される。
ＣＤ４７は、様々な癌細胞の表面で広く発現しているので、当該標的は様々な癌の治療に使用されることができ、マウス同種異系腫瘍移植モデルはＣＤ４７遮断の有効性を実証したので、ＣＤ４７は癌免疫チェックポイント療法の新規標的となった（Ｖｏｎｄｅｒｈｅｉｄｅ Ｒ Ｈ． ＣＤ４７ ｂｌｏｃｋａｄｅ ａｓ ａｎｏｔｈｅｒ ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ． Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ２０１５， ２１（１０）：１１２２−１１２３）。抗ＣＤ４７抗体、ＳＩＲＰα−Ｆｃ融合タンパク質などの研究薬は、ＣＤ４７−ＳＩＲＰαシグナル伝達経路を遮断することにより免疫細胞に対するＣＤ４７の阻害効果を阻害し、一定の抗腫瘍活性を示す。しかし、赤血球も大量のＣＤ４７タンパク質を発現するので、ＣＤ４７タンパク質と高親和性に結合される抗ＣＤ４７抗体治療は、赤血球凝集、貧血などの毒性副作用を引き起こす可能性があり（Ｍｃｃｒａｃｋｅｎ Ｍ Ｎ， ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｔｈｗａｙｓ：Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ａｆｔｅｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ ｆｒｏｍ Ｂｌｏｃｋａｄｅ ｏｆ ＣＤ４７ 「Ｄｏｎ’ｔ Ｅａｔ Ｍｅ」 Ｓｉｇｎａｌｓ． Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２０１５， ２１（１６）：３５９７−３６０１）、これにより、抗ＣＤ４７抗体薬物の臨床開発は非常に困難になり、これまでのところ、第ＩＩＩ相臨床試験進入した抗ＣＤ４７抗体薬物はなく、一方、野生型ＳＩＲＰα−Ｆｃ融合タンパク質はＣＤ４７に対する親和性が低いので、効果は顕著ではなく、一部の研究者は、野生型ＳＩＲＰαの高親和性変異を行い、１０００倍以上の親和性増強を伴うＳＩＲＰα変異体を取得し、良好な抗腫瘍効果を示した（Ｗｅｉｓｋｏｐｆ Ｋ， ｅｔ ａｌ． Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ＳＩＲＰα ｖａｒｉａｎｔｓ ａｓ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｄｊｕｖａｎｔｓ ｔｏ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１３， ３４１（６１４１）：８８−９１）。しかし、ムルチポイント変異が融合タンパク質の人における安全性、免疫原性、安定性、ないし標的特異性などに影響を与えるかどうかは、臨床的観察で確認されていない。
一方、研究により、抗ＣＤ４７抗体は、ＣＤ４７＋ＣＤ２０、ＣＤ４７＋Ｈｅｒ２などの他の腫瘍標的治療抗体と組み合わせて使用することにより、腫瘍効果を大幅に向上させることができる（Ｃｈａｏ ＭＰ， ｅｔ ａｌ． Ａｎｔｉ−ＣＤ４７ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓｙｎｅｒｇｉｚｅｓ ｗｉｔｈ ｒｉｔｕｘｉｍａｂ ｔｏ ｐｒｏｍｏｔｅ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ ａｎｄ ｅｒａｄｉｃａｔｅ ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ ｌｙｍｐｈｏｍａ． Ｃｅｌｌ， ２０１０， １４２（５）：６９９−７１３；Ｚｈａｏ ＸＷ， ｅｔ ａｌ． ＣＤ４７-ｓｉｇｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ−α （ＳＩＲＰα） ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｆｏｒｍ ａ ｂａｒｒｉｅｒ ｆｏｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ． Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ． ２０１１，１０８（４５）：１８３４２−１８３４７）。しかし、抗ＣＤ４７抗体は市場に公開されるか、いつ市場に効果されるかはまだ不確定であり、市場に公開された後、腫瘍を標的とする抗体薬物の組み合わせは、患者が非常に高価な併用療法の費用を負担することも難しくする。
従って、腫瘍を特異的に標的化し、患者の免疫機能を活性化および強化し、安全性を確保しながら腫瘍治療の効果を大幅に改善し、同時に患者の薬物コストを低減できる新しい腫瘍標的薬を開発する必要がある。
なお、ＣＤ４７を標的とする一価または多価の抗体または組換えタンパク質の潜在的な安全性リスク（貧血、赤血球凝集、ＣＤ４７陽性の非腫瘍標的細胞死など）を考慮して、同時にヒトＳＩＲＰαおよびヒトＣＤ４７の組み合わせは種の特異性があり、人間の血液の使用は倫理、遺伝資源などによって制限されるので、ＣＤ４７を標的とする抗体または組換えタンパク質の免疫安全性を評価する早期のインビボ／インビトロの免疫安全性の評価方法の開発が期待されている。
本発明は、マクロファージを調節する機能を有する組換えタンパク質の腫瘍を標的とする飽和結合度を有意に向上させ、非腫瘍を標的とする副作用を有意に低減させることができる二重特異性組換えタンパク質およびその応用を提供する。
一態様において、本発明は、高親和性の腫瘍を標的とするアームと、低親和性のＣＤ４７とＳＩＲＰαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質とを含む二重特異性組換えタンパク質を提供する。
一実施形態において、前記高親和性の腫瘍を標的とするアームは、ＣＤ４７に結合せず、かつ腫瘍細胞上の標的抗原に対する前記高親和性の腫瘍を標的とするアームに対応する抗体の結合親和性は、腫瘍細胞上のＣＤ４７に対する低親和性のＣＤ４７とＳＩＲＰαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質に対応するモノマー融合タンパク質ホモダイマーの結合親和性の少なくとも６倍であり、選択的に、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、またはそれ以上の倍数、またはその間の任意の数値である。
ＣＤ４７に対する前記低親和性のＣＤ４７とＳＩＲＰαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質の結合親和性は、ＣＤ４７に対するＳＩＲＰα細胞外トランケーションを含むモノマー融合タンパク質のホモダイマーの結合親和性より高くない。前記低親和性のＣＤ４７とＳＩＲＰαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質は、ＳＩＲＰα細胞外トランケーションを含む。
一実施形態において、ＳＩＲＰα細胞外トランケーションは、ヒトＳＩＲＰα（野生型またはＣＤ４７非高親和性変異体）の細胞外アミノ酸配列の一部または全部を含む。
さらに別の実施形態において、ＳＩＲＰα細胞外トランケーションは、ヒトＳＩＲＰα細胞外トランケーションである。具体的な実施形態において、前記ＳＩＲＰα細胞外トランケーションは、下記ａ１）−ａ４）から選択されるいずれかの一つのアミノ酸配列を含み、ａ１）配列番号３０、ａ２）配列番号３１、ａ３）配列番号３２、ａ４）前記アミノ酸配列のいずれかの一つのアミノ酸配列が少なくとも一つのアミノ酸残基、例えば１〜５個のアミノ酸残基を挿入、欠損、修飾および／または保守的置換することを経て獲得されるアミノ酸配列であって、そのモノマーは、ＣＤ４７タンパク質に対する結合親和性を有し、且つ当該結合親和性は、ＣＤ４７タンパク質に対するａ１）、ａ２）またはａ３）モノマーの結合親和性より高くないアミノ酸配列を有する。
一実施形態において、前記二重特異性組換えタンパク質は、相対的に設定される左、右のアーム構造を有し、前記高親和性の腫瘍を標的とするアームは、左アームの位置に位置され、前記低親和性のＣＤ４７とＳＩＲＰαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質は、右アームの位置に位置され、好ましくは、前記左アームは、免疫グロブリンのＦａｂまたはＦａｂ’形態であり、前記右アームは、ＳＩＲＰα細胞外トランケーションである。ここで、本発明による「相対的設定される左、右のアーム構造」は、免疫グロブリンの通常の「Ｙ」型構造の説明を参照し、その場合、本発明の二重特異性組換えタンパク質の左側および右側は、異なる標的の特異的機能タンパク質を有する。当該構造の説明は、二つの特定の機能性タンパク質がＣ末端とＮ末端を介して上部構造と下部構造を形成できることと主に区別されるためである。従って、本発明の左アームおよび右アームの空間位置は、二重特異性組換えタンパク質の構造に対する具体的な限定ではなく、二重特異性組換えタンパク質の二つのアームと前記Ｃ末端とＮ末端を介して形成された上部構造と下部構造を区分するだけであり、一方が片側にある場合、他の一方は反対側にあり、明らかに、二つの左右の空間位置は交換可能である。
別の実施形態において、前記右アームの長さは、標的細胞膜の表面から左アームが結合する必要がある抗原空間エピトープの距離に適合する。好ましくは、前記高親和性の腫瘍を標的とするアームが標的細胞の膜近位端のエピトープに結合する必要がある場合、前記ＳＩＲＰα細胞外トランケーションは、ａ１）〜ａ４）中の比較的に短いアミノ酸配列を選択して含む。
一実施形態において、前記高親和性の腫瘍を標的とするアームの標的化の標的は、５Ｔ４、ＡＧＳ−１６、ＡＬＫ１、ＡＮＧ−２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ｃ−ｆｍｓ、ｃ−Ｍｅｔ、ＣＡ６、ＣＤ１２３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ９８、ＣＥＡ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＬＤＮ１８．２、ＣＬＤＮ６、ＣＳ１、ＣＸＣＲ４、ＤＬＬ−４、ＥＧＦＲ、ＥＧＰ−１、ＥＮＰＰ３、ＥｐｈＡ３、ＥＴＢＲ、ＦＧＦＲ２、ＦＮ、ＦＲ−α、ＧＣＣ、ＧＤ２、ＧＰＣ−３、ＧＰＮＭＢ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＬＡ−ＤＲ、ＩＣＡＭ−１、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＬ−３Ｒ、ＬＩＶ−１、ＭＳＬＮ、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ１、ＮａＰｉ２ｂ、ネクチン−４、Ｎｏｔｃｈ ２、Ｎｏｔｃｈ １、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＰＤＧＦＲ−α、ＰＳ、ＰＳＭＡ、ＳＬＴＲＫ６、ＳＴＥＡＰ１、ＴＥＭ１、ＶＥＧＦＲ、ＣＤ２５、ＣＤ２７Ｌ、ＤＫＫ−１、ＣＳＦ−１Ｒ、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ、ＢＣＭＡ、ＣＤ１３８から選択される。
好ましくは、前記標的がＣＤ２０、ＥＧＦＲまたはＰＤ−Ｌ１である場合、前記ＳＩＲＰα細胞外トランケーションは、ａ１）を選択し、前記標的がＨＥＲ２である場合、前記ＳＩＲＰα細胞外トランケーションは、ａ１）またはａ２）を選択する。
一実施形態において、高親和性の腫瘍を標的とするアームと低親和性のＣＤ４７とＳＩＲＰαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質は、分子の間の作用力によって結合され、または鎖間ジスルフィド結合のような共有結合によって結合され、またはイオン結合によって結合され、または上記の結合方法における二つまたは三つの組み合わせによって結合される。
さらに別の実施形態において、高親和性の腫瘍を標的とするアームと低親和性のＣＤ４７とＳＩＲＰαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質は、Ｆｃ領域をさらに含む。通常、本発明のＦｃ領域は、Ｆｃ領域天然配列を含む。しかし、本発明のＦｃ領域は、Ｆｃ領域天然配列にＦｃ領域のＣ１ｑに結合活性が変更されたアミノ酸配列変更または修飾のような一つまたは複数の既存のアミノ酸配列の変更または修飾を有することができる。
別の実施形態において、低親和性のＣＤ４７とＳＩＲＰαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質は、ＳＩＲＰα細胞外トランケーションと前記アームを結合するための結合配列の融合タンパク質を含み、ＳＩＲＰα細胞外トランケーションと前記アームを結合するための結合配列は、選択的に、リンカー配列によって連結され、前記アームを結合するための結合配列は、選択的に、Ｆｃ領域である。
別の実施形態において、本発明のＦｃ領域は、概念的であり、即ち、実際存在しないかもしれないが、所望のＦｃ領域変異体のアミノ酸配列に従って、抗体工程改造を実施することができ、当該配列を含むポリペプチドまたは融合タンパク質を産生し、または所望のＦｃ領域変異体アミノ酸配列のＤＮＡをコードする。
他の実施形態において、前記Ｆｃ領域は、Ｆｃ領域変異体であることができる。本明細書で使用される「Ｆｃ領域変異体」は、Ｆｃ天然アミノ酸配列に一つまたは複数のアミノ酸残基の修飾により獲得されたＦｃ領域を指す。修飾の方法は、当業者に周知であり、ＰＣＲ突然変異誘発およびカセット突然変異誘発によってＦｃ領域変異体を製造するなどのＦｃ領域をコードするＤＮＡ配列に部位特異的突然変異を誘発することに限定されない。例えば、ＦｃＲへの結合を向上させるために、Ｆｃ領域の一つまたは複数のアミノ酸残基を欠損させることができる。例えば、一実施形態において、Ｆｃ領域のエフェクター機能を変更するために、アミノ酸挿入型Ｆｃ領域変異体を製造することができる。
一実施形態において、ＦｃＲ結合に影響を及ぼすと同定された一つまたは複数のＦｃ領域部位の近くに少なくとも一つのアミノ酸残基（例えば、１〜２個のアミノ酸残基、通常１０個のアミノ酸残基を超えない）を導入することができる。「近く」とは、ＦｃＲ結合に影響を及ぼすと同定されたＦｃ領域部位から１−２個のアミノ酸残基以内を指す。このようなＦｃ領域変異体は、ＦｃＲ結合および／またはＡＤＣＣ活性の増強または低下を示すことができる。このような挿入型変異体を製造するために、ＦｃＲ結合領域（例えば、標的ＦｃＲの細胞外ドメイン）を含むポリペプチドと挿入されるアミノ酸残基のＦｃ領域の共結晶構造を評価することができ、例えば、増強されたＦｃＲ結合能力を有するＦｃ領域変異体に関連する。このような挿入は、Ｆｃ領域のループに配置される。
一実施形態において、天然Ｆｃ領域に適切なアミノ酸配列修飾を導入することにより、ヒトエフェクター細胞の存在下で、天然Ｆｃ領域を含む組換えタンパク質よりも効率的に抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介し、および／またはより強い親和性でＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）に結合するＦｃ領域変異体を製造することができる。通常、本発明のＦｃ領域変異体は、Ｆｃ領域に少なくとも一つのアミノ酸修飾を含む。好ましくは、複数のアミノ酸修飾を組み合わせる。例えば、Ｆｃ領域変異体は、例えば、同定された特異的ＦｃＲ結合部位に、２、３、４、５個またはそれ以上のアミノ酸残基の置換を含むことができる。
前記天然Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ１（Ａまたは非Ａアイソタイプ）、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のＦｃ領域天然配列のような、ヒトＦｃ領域が好ましい。
別の実施形態において、前記高親和性の腫瘍を標的とするアームと低親和性のＣＤ４７とＳＩＲＰαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質の結合は、ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓによって結合される。例えば、前記ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓは、Ｔ３６６Ｗ突然変異によって形成される突出された「ｋｎｏｂｓ」型と、一つのアミノ酸突然変異（Ｙ４０７Ｖ）によって形成される凹んだ「ｈｏｌｅｓ」型または三つのアミノ酸突然変異（Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ）によって形成される凹んだ「ｈｏｌｅｓ」型である。突然変異は、Ｋａｂａｔ番号形態［Ｅｕ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｓｃｈｅｍｅ ｏｆ Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ． （１９９１）］に従って、左から右に元のアミノ酸残基、突然変異部位および置換アミノ酸残基としてそれぞれ表示され、例えば、Ｔ３６６Ｗにおいて、Ｔは、元のアミノ酸残基で、３６６は、突然変異部位で、Ｗは、Ｔを置換するアミノ酸残基である。
一実施形態において、前記高親和性の腫瘍を標的とするアームは、標的化の標的が、５Ｔ４、ＡＧＳ−１６、ＡＬＫ１、ＡＮＧ−２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ｃ−ｆｍｓ、ｃ−Ｍｅｔ、ＣＡ６、ＣＤ１２３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ９８、ＣＥＡ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＬＤＮ１８．２、ＣＬＤＮ６、ＣＳ１、ＣＸＣＲ４、ＤＬＬ−４、ＥＧＦＲ、ＥＧＰ−１、ＥＮＰＰ３、ＥｐｈＡ３、ＥＴＢＲ、ＦＧＦＲ２、ＦＮ、ＦＲ−α、ＧＣＣ、ＧＤ２、ＧＰＣ−３、ＧＰＮＭＢ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＬＡ−ＤＲ、ＩＣＡＭ−１、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＬ−３Ｒ、ＬＩＶ−１、ＭＳＬＮ、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ１、ＮａＰｉ２ｂ、ネクチン−４、Ｎｏｔｃｈ ２、Ｎｏｔｃｈ １、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＰＤＧＦＲ−α、ＰＳ、ＰＳＭＡ、ＳＬＴＲＫ６、ＳＴＥＡＰ１、ＴＥＭ１、ＶＥＧＦＲ、ＣＤ２５、ＣＤ２７Ｌ、ＤＫＫ−１、ＣＳＦ−１Ｒ、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ、ＢＣＭＡ、ＣＤ１３８から選択される不完全抗体であり、好ましくは、ＩｇＧ１抗体の不完全抗体であり、選択的に、ヒトマウスキメラ不完全抗体、ヒト化不完全抗体、完全ヒト不完全抗体であり、より好ましくは、ヒト化または完全ヒトＩｇＧ１抗体の不完全抗体である。
一実施形態において、低親和性のＣＤ４７とＳＩＲＰαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質は、下記ｂ１）−ｂ４）から選択されるいずれかの一つのアミノ酸配列を含み、ｂ１）配列番号２６、ｂ２）配列番号２７、ｂ３）配列番号２８、ｂ４）前記アミノ酸配列のいずれかの一つのアミノ酸配列が例えば１〜５個ののアミノ酸残基を挿入、欠損、修飾および／または保守的置換することを経て獲得されるアミノ酸配列であって、そのホモダイマーは、ＣＤ４７タンパク質に対する結合親和性を有し、且つ当該結合親和性は、ＣＤ４７タンパク質に対するｂ１）、ｂ２）またはｂ３）ホモダイマーの結合親和性より高くないアミノ酸配列を有する。前記配列に含まれるシグナルペプチド領域配列、リンカー配列、ヒンジ領域、Ｆｃ領域および／または結合配列は、当業者に周知の方法または一般的に使用されるシグナルペプチド配列、リンカー配列、ヒンジ領域、Ｆｃ領域および／または結合配列によって任意に置き換えることができる。
別の実施形態において、前記二重特異性組換えタンパク質は、以下の配列を含む。
ここで、高親和性の腫瘍を標的とするアームがＣＤ２０を標的とする場合、前記高親和性の腫瘍を標的とするアームは、配列番号１６と配列番号１７を含み、前記低親和性のＣＤ４７とＳＩＲＰαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質は、配列番号２６または配列番号２７または配列番号２８を含み、
ここで、高親和性の腫瘍を標的とするアームがＥＧＦＲを標的とする場合、前記高親和性の腫瘍を標的とするアームは、配列番号１９と配列番号８を含み、前記低親和性のＣＤ４７とＳＩＲＰαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質は、配列番号２６または配列番号２７または配列番号２８を含み、
ここで、高親和性の腫瘍を標的とするアームがＨｅｒ２を標的とする場合、前記高親和性の腫瘍を標的とするアームは、配列番号２０と配列番号２１、または配列番号２２と配列番号２３を含み、前記低親和性のＣＤ４７とＳＩＲＰαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質は、配列番号２６または配列番号２７または配列番号２８を含み、または、
ここで、高親和性の腫瘍を標的とするアームがＰＤ−Ｌ１を標的とする場合、前記高親和性の腫瘍を標的とするアームは、配列番号２４と配列番号１３を含み、前記低親和性のＣＤ４７とＳＩＲＰαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質は、配列番号２６または配列番号２７または配列番号２８を含む。
一態様において、本発明は、二重特異性組換えタンパク質をコードする核酸分子を提供する。好ましくは、前記高親和性の腫瘍を標的とするアームをコードする核酸分子と前記低親和性のＣＤ４７とＳＩＲＰαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質をコードする核酸は、同じＤＮＡ鎖に位置され、または前記高親和性の腫瘍を標的とするアームをコードする核酸分子と前記低親和性のＣＤ４７とＳＩＲＰαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質をコードする核酸は、異なるＤＮＡ鎖に位置される。
他の態様において、本発明は、核酸分子を含む発現ベクターを提供する。
一態様において、本発明は、発現ベクターを含む細胞を提供する。
他の態様において、本発明は、１）高親和性の腫瘍を標的とするアームを提供するステップと、２）低親和性のＣＤ４７とＳＩＲＰαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質を提供するステップと、３）高親和性の腫瘍を標的とするアームを低親和性のＣＤ４７とＳＩＲＰαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質に接触させて前記組換えタンパク質を形成するステップとを含む、二重特異性組換えタンパク質の製造方法をさらに提供する。
一実施形態において、組換えタンパク質の製造方法は、発現ベクターを含む宿主細胞により当該組換えタンパク質を発現させるステップを含み、前記発現ベクターは、組換えタンパク質をコードする核酸分子を含む。
他の態様において、本発明は、腫瘍を標的とする治療の方法をさらに提供する。
一実施形態において、腫瘍は、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、膵臓癌、食道癌、子宮内膜癌、卵巣癌、胃癌、前立腺癌、腎臓癌、子宮頸癌、骨髄腫、リンパ腫、白血病、甲状腺癌、子宮癌、膀胱癌、神経内分泌癌、頭頸部癌、肝臓癌、鼻咽頭癌、精巣癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、黒色腫、基底細胞皮膚癌、扁平上皮細胞癌、皮膚線維肉腫、メルケル細胞癌、膠芽腫、神経膠腫、肉腫、中皮腫または骨髄異形成症候群などの血液腫瘍および固形腫瘍から選択される。
さらに別の態様において、本発明は、本発明の組換えタンパク質または融合タンパク質および選択的のアジュバント、賦形剤または薬理学上許容されるベクターを含む薬物組成物をさらに提供する。組成物は、薬理学上許容されるベクターを含むことができる。組成物は、注射剤、散剤、凍結乾燥散剤などを含むがこれに限定されない任意の形態の薬物製剤として存在することができる。当該薬物製剤形態の薬物組成物は、医薬活性成分、本発明の組換えタンパク質または融合タンパク質を薬物ベクターと融合して、製剤の従来の技術に従って製造することができ、、従来の製剤技術に従って所望の剤形に製造される。
一実施形態において、本発明は、本発明組換えタンパク質または融合タンパク質をコードする核酸分子の発現ベクターと任意の薬理学的に許容されるベクターを含む薬物組成物をさらに提供する。
他の態様において、本発明は、患者または実験対象者に治療有効量の本発明に記載の薬物組成物を投与するステップを含む腫瘍の治療方法をさらに提供する。前記腫瘍は、追加の標的分子を発現し、前記標的は、５Ｔ４、ＡＧＳ−１６、ＡＬＫ１、ＡＮＧ−２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ｃ−ｆｍｓ、ｃ−Ｍｅｔ、ＣＡ６、ＣＤ１２３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ９８、ＣＥＡ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＬＤＮ１８．２、ＣＬＤＮ６、ＣＳ１、ＣＸＣＲ４、ＤＬＬ−４、ＥＧＦＲ、ＥＧＰ−１、ＥＮＰＰ３、ＥｐｈＡ３、ＥＴＢＲ、ＦＧＦＲ２、ＦＮ、ＦＲ−α、ＧＣＣ、ＧＤ２、ＧＰＣ−３、ＧＰＮＭＢ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＬＡ−ＤＲ、ＩＣＡＭ−１、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＬ−３Ｒ、ＬＩＶ−１、ＭＳＬＮ、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ１、ＮａＰｉ２ｂ、ネクチン−４、Ｎｏｔｃｈ ２、Ｎｏｔｃｈ １、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＰＤＧＦＲ−α、ＰＳ、ＰＳＭＡ、ＳＬＴＲＫ６、ＳＴＥＡＰ１、ＴＥＭ１、ＶＥＧＦＲ、ＣＤ２５、ＣＤ２７Ｌ、ＤＫＫ−１、ＣＳＦ−１Ｒ、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ、ＢＣＭＡ、ＣＤ１３８を含むが、これに限定されない。
さらに別の態様において、本発明は、患者または実験対象者に治療有効量の本発明の組換えタンパク質または融合タンパク質をコードする核酸分子またはその誘導体を導入するステップを含むインビボ遺伝子治療方法をさらに提供する。
他の態様において、本発明は、ａ）標的とされ、ＡＤＣＣ活性を有する組換えタンパク質／抗体（一価または多価を含む）を提供するステップと、ｂ）前記組換えタンパク質／抗体のＡＤＣＣ活性を検出するステップと、ｃ）前記組換えタンパク質／抗体の初期免疫安全性を評価するステップとを含む、ＣＤ４７を標的とし、且つＡＤＣＣ活性を有する組換えタンパク質／抗体の初期免疫安全性のインビトロ評価方法をさらに提供する。
一実施形態において、本発明は、ａ）ヒトＮＫ９２ＭＩ−ＣＤ１６ａエフェクター細胞などであるが、これに限定されないエフェクター細胞を製造するステップと、ｂ）エフェクター細胞を組換えタンパク質／抗体に接触させるステップと、ｃ）組換えタンパク質／抗体のＡＤＣＣ活性を検出するステップと、ｄ）ＡＤＣＣ活性結果に従って、組換えタンパク質／抗体の初期免疫安全性を評価するステップを含む、ＣＤ４７を標的とし、且つＡＤＣＣ活性を有する組換えタンパク質／抗体の初期免疫安全性のインビトロ評価方法を提供する。
別の実施形態において、本発明は、ａ）成長が良好なヒトＮＫ９２ＭＩ−ＣＤ１６ａエフェクター細胞を獲得し、獲得されたエフェクター細胞を１×１０５個の細胞／ｍｌ乃至５×１０６個の細胞／ｍｌの細胞密度に再懸濁させるステップと、ｂ）勾配希釈した組換えタンパク質／抗体を、ａ）で製造されたエフェクター細胞と０．５〜５ｈインキュベートするステップと、ｃ）インキュベート完了後、ＬＤＨ活性を測定し、細胞分解率を計算するステップと、ｄ）細胞分解率に従って組換えタンパク質／抗体の初期免疫安全性を評価するステップを含み、ここで、細胞分解率を低下させる組換えタンパク質／抗体の免疫安全性が高い、ＣＤ４７を標的とし、且つＡＤＣＣ活性を有する組換えタンパク質／抗体の初期免疫安全性のインビトロ評価方法を提供する。
さらに別の態様において、本発明は、ａ）ＣＤ４７を標的とする組換えタンパク質／抗体（一価または多価を含む）を提供するステップと、ｂ）Ｈｕ−ＮＳＧマウスを提供するステップと、ｃ）前記組換えタンパク質／抗体をＨｕ−ＮＳＧマウスに接触させるステップと、ｄ）前記Ｈｕ−ＮＳＧマウスにおける前記組換えタンパク質／抗体の初期免疫安全性を評価するステップとを含む、ＣＤ４７を標的とする組換えタンパク質／抗体（一価または多価を含む）の初期免疫安全性のインビボ評価方法をさらに提供する。
一実施形態において、本発明は、ａ）Ｈｕ−ＮＳＧマウスを提供するステップと、ｂ）組換えタンパク質／抗体（一価または多価を含む）を投与するステップと、ｃ）２４〜９６時間の投与後、マウス静脈血を採取し、赤血球を分解し、残りの細胞を蛍光標識した抗ヒトＣＤ４５、抗ヒトＣＤ１９または抗ヒトＣＤ３の抗体とともに１５−６０ｍｉｎインキュベートし、フローサイトメトリー検出を行うステップと、ｄ）細胞クリアランスに従って組換えタンパク質／抗体の初期免疫安全性を評価するステップと含み、ここで、免疫細胞（標的細胞を除く）クリアランスを低下させる組換えタンパク質／抗体の免疫安全性が高い、ＣＤ４７を標的とする組換えタンパク質／抗体（一価または多価を含む）の初期免疫安全性のインビボ評価方法を提供する。
本発明は、低親和性のＣＤ４７とＳＩＲＰαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質により、本発明の組換えタンパク質と非腫瘍細胞（例えば、赤血球、ＮＫ細胞、Ｔ細胞など）上のＣＤ４７標的との結合を低減し、それにより本発明に記載の組換えタンパク質の安全性（例えば、Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４などの抗ＣＤ４７抗体／組換えタンパク質の回避、引き起こされる貧血、赤血球凝集、ＣＤ４７陽性非腫瘍標的細胞殺傷、高親和性突然変異によるＳＩＲＰα−Ｆｃ融合タンパク質によって引き起こされる潜在的な安全性、免疫原性、安定性などの不確実性に起因するリスクなどを低減する）を向上させる。
本発明において、高親和性の腫瘍細胞を標的とするアームと、低親和性のＣＤ４７とＳＩＲＰαの相互作用をブロッキングすることにより、本発明の組換えタンパク質と腫瘍細胞の結合親和性を有意に向上させ、それにより効率的に腫瘍細胞を殺傷する作用（抗体と腫瘍表面の標的抗原とが特異的に結合した後のエフェクター機能、マクロファージの標的食作用を含むが、これに限定されない）を媒介することが意外に見出された。
本発明の組換えタンパク質は、高親和性の腫瘍を標的とするアーム（例えば、不完全抗体に限定されない）と、低親和性のＣＤ４７とＳＩＲＰαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質により二重標的作用を実現し、また本発明の結果から、本発明の組換えタンパク質は、高親和性の腫瘍を標的とするアームと、低親和性のＣＤ４７とＳＩＲＰαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質との間の複数の作用により、様々なメカニズムを介して、抗腫瘍作用を発揮し、薬物効果がより高いことを示す。
二つの別個の標的抗体に比べて、本発明の組換えタンパク質は、、低コスト、便利な使用などの利点を有するので、抗体の組み合わせの場合の低い患者コンプライアンスおよび高い治療コストなどの問題を解決できる。
典型的な二重特異性抗体（二つの不完全抗体からなる）に比べて、本発明の組換えタンパク質は、ＣＤ４７とＳＩＲＰαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質の分子量が典型的な二重特異性抗体のシングルアーム（不完全抗体）より小さいので、組換えタンパク質の組織透過率は、典型的な二重特異性抗体より高く、薬物効果が高い。
本発明の低親和性のＣＤ４７とＳＩＲＰαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質は、異なる長さのＳＩＲＰα細胞外トランケーションを含み、高親和性の腫瘍を標的とするアーム（例えば、不完全抗体に限定されない）と迅速に最適化マッチングされることができ、二つの標的抗原を同時に結合する場合、従来の二機能性抗体が二つの標的抗原の空間構造の影響（特に、二つの標的抗原の抗体の認識部位と細胞膜との距離の差が大きい場合、腫瘍標的抗原及びＣＤ４７抗原と同時に結合しにくい問題）を受ける場合を回避して、獲得された組換えタンパク質が腫瘍細胞とより良く結合させるようにし、それにより、より良い腫瘍殺傷効力を発揮する。
本発明は、ＣＤ４７を標的とする免疫治療薬物の新規のインビトロ安全性の評価方法を提供する。従来の抗ＣＤ４７抗体の初期安全性評価は、一般的に赤血球凝集に対する薬物の作用を検出することにより表かされた。しかし、ヒトＳＩＲＰαとＣＤ４７の結合は、種の特異性があるので、ＣＤ４７を標的とする組換えタンパク質／抗体が赤血球凝集の安全性の問題があるかどうかを評価する場合、ヒトの血液を使用する必要があり、ヒトの血液の使用は、倫理、遺伝資源などによって制限される。なお、赤血球凝集の実験では、薬物の免疫安全性を初期に評価することができない。本発明は、最適化されたＡＤＣＣ活性検出方法（初期インビトロ免疫安全性評価実験）を使用して、従来のヒト赤血球凝集実験を代替し、ＣＤ４７を標的とし、ＡＤＣＣ活性を有する組換えタンパク質／抗体（一価または多価を含む）の初期免疫安全性を評価し、当該方法は、簡単で迅速であり、血液源によって制限されない。
本発明は、ＣＤ４７を標的とする免疫治療薬物の新規のインビボ安全性の評価方法を提供する。臨床前の薬物インビボ免疫安全性の評価は、一般的にヒト以外の霊長類を使用するので、必要なサンプル数が多くなり、初期サンプル製造の難しさとコストが増大する。他の種には、初期の生体内免疫安全性評価方法が成熟していないので、将来の臨床研究で大きな安全性リスクが生じ、研究開発投資が無駄になる。本発明は、Ｈｕ−ＮＳＧマウスを提供し、Ｈｕ−ＮＳＧマウスで実施された初期の安全性評価実験は、ヒト免疫系における薬物の安全性をシミュレートすることができ、臨床前または臨床研究と比較して、製造の難易度およびコストが削減され、低検出コストと高検出効率という利点があり、腫瘍免疫療法薬の研究開発のリスクを低減する。
本発明は、組換えタンパク質を提供することにより、高親和性の腫瘍を標的とするアームを介して腫瘍に対する高親和性、特異的標的化を実現し、また低親和性のＣＤ４７とＳＩＲＰαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質を介してＣＤ４７−ＳＩＲＰαの相互作用に対するブロッキングを実現する。
本発明の組換えタンパク質は、従来の二機能抗体目標産物の収率が低く、精製が難しい技術問題を克服することができる。本発明の一実施形態において、組換えタンパク質の右アーム（Ｆｃ ｋｎｏｂ突然変異）は、単鎖タンパク質であり、左アーム軽鎖、左アーム重鎖（Ｆｃ ｈｏｌｅ突然変異）および右アーム（Ｆｃ ｋｎｏｂ突然変異）が細胞で共発現すると、発現産物の８０％以上がプロテインＡによって精製され、発現率を効果的に向上させる。これらの産物の分子量、電荷分布などに明らかな違いがあることにより、少量の左アーム二量体、右アーム二量体、または左アームと右アームのアームモノマーが存在しても、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、分子アレイ、ブロッキングクロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、および塩析（硫酸アンモニウム沈殿など）などの通常の精製手段により除去され、工業規模の生産に適する。
本発明の低親和性のＣＤ４７とＳＩＲＰαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質は、高親和性の腫瘍を標的とするアーム（例えば、不完全抗体に限定されない）とＣＤ４７免疫抑制効果に拮抗する組換えタンパク質を形成することができる。
本発明は、従来技術のＳＩＲＰα−Ｆｃ融合タンパク質がＣＤ４７との親和性が低いために薬理学的効率が低いという欠点を克服し、ＳＩＲＰα高親和性変異体がもたらす可能性のある免疫原性が高く、非腫瘍標的特異性が高いなどの多くの悪影響を回避した。同時に、本発明の組換えタンパク質は、正常細胞（例えば、赤血球）の表面に発現するＣＤ４７に対して弱い結合親和性を有するので、従来の抗ＣＤ４７抗体処理によって生じる赤血球凝集、貧血などの副作用が低減または回避する。
当業者は、本発明の保護範囲は、本発明の技術的解決策の一つが本発明に明示または暗示される一つの有益な効果を達成できるが、別の有益な効果を実現または完全に実現できなかったとして、不適切に制限されることではないことを理解すべきである。当業者は、本発明の保護範囲内で、任意の製品、方法、または使用が、いずれか一つの明示または暗示される本発明の有益な効果、または選択的に明示または暗示される本発明の有益な効果の組み合わせを獲得すると、本発明が解決しようとする技術的問題が解決され、対応する技術的効果が実現されたことを意味することを理解すべきである。
具体的に、本発明は、以下の実施形態に関する。
実施形態１．腫瘍を標的とするアームとＣＤ４７とＳＩＲＰαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質を含む、二重特異性組換えタンパク質。
実施形態２．ＣＤ４７とＳＩＲＰαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質は、ＳＩＲＰα細胞外トランケーション（ヒトＳＩＲＰα野生型細胞外トランケーションまたはＣＤ４７非高親和性突然変異のヒトＳＩＲＰα細胞外トランケーションを含む）を含む、実施形態１の二重特異性組換えタンパク質。
実施形態３．ＳＩＲＰα細胞外トランケーションは、ＳＩＲＰαの細胞外アミノ酸配列の一部または全部を含む、実施形態２の二重特異性組換えタンパク質。
実施形態４．高親和性の腫瘍を標的とするアームは、ＣＤ４７に結合せず、かつ腫瘍細胞上の標的抗原に対する高親和性の腫瘍を標的とするアームに対応する抗体の結合親和性は、腫瘍細胞上のＣＤ４７に対する低親和性のＣＤ４７とＳＩＲＰαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質に対応するモノマー融合タンパク質ホモダイマーの結合親和性の少なくとも６倍である、実施形態１〜３のいずれか１項の二重特異性組換えタンパク質。
実施形態５．ＳＩＲＰα細胞外トランケーションは、下記ａ１）−ａ４）から選択されるいずれかの一つのアミノ酸配列を含み、ａ１）配列番号３０、ａ２）配列番号３１、ａ３）配列番号３２、ａ４）前記アミノ酸配列のいずれかの一つのアミノ酸配列が例えば１〜５個のアミノ酸残基を挿入、欠損、修飾および／または保守的置換することを経て獲得されるアミノ酸配列であって、そのモノマーは、ＣＤ４７タンパク質に対する結合親和性を有し、且つ当該結合親和性は、ＣＤ４７タンパク質に対するａ１）、ａ２）またはａ３）モノマーの結合親和性より高くないアミノ酸配列を有する、実施形態１〜４のいずれか１項の二重特異性組換えタンパク質。
実施形態６．二重特異性組換えタンパク質は、相対的に設定される左、右のアーム構造を有し、高親和性の腫瘍を標的とするアームは、左アームの位置に位置され、低親和性のＣＤ４７とＳＩＲＰαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質は、右アームの位置に位置される、実施形態１〜４のいずれか１項の二重特異性組換えタンパク質。
実施形態７．左アームは、免疫グロブリンのＦａｂまたはＦａｂ’形態であり、右アームは、ＳＩＲＰα細胞外トランケーションである、実施形態６の二重特異性組換えタンパク質。
実施形態８．右アームの長さは、標的細胞膜の表面から左アームが結合する必要がある抗原空間エピトープの距離に適合する、実施形態７の二重特異性組換えタンパク質。
実施形態９．高親和性の腫瘍を標的とするアームが標的細胞の膜の近位端エピトープに結合する必要がある場合、ＳＩＲＰα細胞外トランケーションは、ａ１）〜ａ４）中の比較的に短いアミノ酸配列を選択して含む実施形態８の二重特異性組換えタンパク質。
実施形態１０．高親和性の腫瘍を標的とするアームの標的化の標的は、５Ｔ４、ＡＧＳ−１６、ＡＬＫ１、ＡＮＧ−２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ｃ−ｆｍｓ、ｃ−Ｍｅｔ、ＣＡ６、ＣＤ１２３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ９８、ＣＥＡ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＬＤＮ１８．２、ＣＬＤＮ６、ＣＳ１、ＣＸＣＲ４、ＤＬＬ−４、ＥＧＦＲ、ＥＧＰ−１、ＥＮＰＰ３、ＥｐｈＡ３、ＥＴＢＲ、ＦＧＦＲ２、ＦＮ、ＦＲ−α、ＧＣＣ、ＧＤ２、ＧＰＣ−３、ＧＰＮＭＢ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＬＡ−ＤＲ、ＩＣＡＭ−１、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＬ−３Ｒ、ＬＩＶ−１、ＭＳＬＮ、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ１、ＮａＰｉ２ｂ、ネクチン−４、Ｎｏｔｃｈ ２、Ｎｏｔｃｈ １、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＰＤＧＦＲ−α、ＰＳ、ＰＳＭＡ、ＳＬＴＲＫ６、ＳＴＥＡＰ１、ＴＥＭ１、ＶＥＧＦＲ、ＣＤ２５、ＣＤ２７Ｌ、ＤＫＫ−１、ＣＳＦ−１Ｒ、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ、ＢＣＭＡ、ＣＤ１３８から選択される、実施形態１〜９のいずれか１項の二重特異性組換えタンパク質。
実施形態１１．前記標的がＣＤ２０、ＥＧＦＲまたはＰＤ−Ｌ１である場合、ＳＩＲＰα細胞外トランケーションは、ａ１）を選択し、前記標的がＨＥＲ２である場合、ＳＩＲＰα細胞外トランケーションは、ａ１）またはａ２）を選択する、実施形態１０の二重特異性組換えタンパク質。
実施形態１２．腫瘍を標的とするアームとＣＤ４７とＳＩＲＰαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質は、分子の間の作用力によって結合され、または鎖間ジスルフィド結合のような共有結合によって結合され、またはイオン結合によって結合され、または上記の結合方法における二つまたは三つの組み合わせによって結合される、実施形態１〜１１のいずれか１項の二重特異性組換えタンパク質。
実施形態１３．腫瘍を標的とするアームおよび／またはＣＤ４７とＳＩＲＰαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質は、Ｆｃ領域をさらに含む、実施形態１〜１２のいずれか１項の二重特異性組換えタンパク質。
実施形態１４．Ｆｃ領域は、Ｆｃ領域天然配列またはＦｃ非天然配列を含む、実施形態１３の二重特異性組換えタンパク質。
実施形態１５．Ｆｃ領域は、ヒトＦｃ領域である、実施形態１４の二重特異性組換えタンパク質。
実施形態１６．高親和性の腫瘍を標的とするアームと低親和性のＣＤ４７とＳＩＲＰαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質の結合は、ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓによって結合される、実施形態１５の二重特異性組換えタンパク質。
実施形態１７．腫瘍を標的とするアームは、標的化の標的が５Ｔ４、ＡＧＳ−１６、ＡＬＫ１、ＡＮＧ−２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ｃ−ｆｍｓ、ｃ−Ｍｅｔ、ＣＡ６、ＣＤ１２３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ９８、ＣＥＡ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＬＤＮ１８．２、ＣＬＤＮ６、ＣＳ１、ＣＸＣＲ４、ＤＬＬ−４、ＥＧＦＲ、ＥＧＰ−１、ＥＮＰＰ３、ＥｐｈＡ３、ＥＴＢＲ、ＦＧＦＲ２、ＦＮ、ＦＲ−α、ＧＣＣ、ＧＤ２、ＧＰＣ−３、ＧＰＮＭＢ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＬＡ−ＤＲ、ＩＣＡＭ−１、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＬ−３Ｒ、ＬＩＶ−１、ＭＳＬＮ、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ１、ＮａＰｉ２ｂ、ネクチン−４、Ｎｏｔｃｈ ２、Ｎｏｔｃｈ １、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＰＤＧＦＲ−α、ＰＳ、ＰＳＭＡ、ＳＬＴＲＫ６、ＳＴＥＡＰ１、ＴＥＭ１、ＶＥＧＦＲ、ＣＤ２５、ＣＤ２７Ｌ、ＤＫＫ−１、ＣＳＦ−１Ｒ、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ、ＢＣＭＡ、ＣＤ１３８から選択される不完全抗体であり、好ましくは、ＩｇＧ１抗体の不完全抗体であり、選択的に、ヒトマウスキメラ不完全抗体、ヒト化不完全抗体、完全ヒト不完全抗体であり、より好ましくは、ヒト化または完全ヒトＩｇＧ１抗体の不完全抗体である、実施形態１〜１６のいずれか１項の二重特異性組換えタンパク質。
実施形態１８．ＣＤ４７とＳＩＲＰαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質は、ＳＩＲＰα細胞外トランケーションと前記アームを結合するための結合配列を含む融合タンパク質であって、ＳＩＲＰα細胞外トランケーションと前記アームを結合するための結合配列は、選択的に、リンカー配列によって連結され、前記アームを結合するための結合配列は、選択的に、Ｆｃ領域である実施形態１〜１７のいずれか１項の二重特異性組換えタンパク質。
実施形態１９．ＣＤ４７とＳＩＲＰαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質は、ｂ１）−ｂ４）から選択されるいずれかの一つのアミノ酸配列を含み、ｂ１）配列番号２６、ｂ２）配列番号２７、ｂ３）配列番号２８、ｂ４）前記アミノ酸配列のいずれかの一つのアミノ酸配列が例えば１〜５個のアミノ酸残基を挿入、欠損、修飾および／または保守的置換することを経て獲得されるアミノ酸配列であって、そのホモダイマーは、ＣＤ４７タンパク質に対する結合親和性を有し、且つ当該結合親和性は、ＣＤ４７タンパク質に対するｂ１）、ｂ２）またはｂ３）ホモダイマーの結合親和性より高くないアミノ酸配列である、実施形態１〜１８のいずれか１項の二重特異性組換えタンパク質。
実施形態２０．高親和性の腫瘍を標的とするアームがＣＤ２０を標的とする場合、前記高親和性の腫瘍を標的とするアームは、配列番号１６と配列番号１７を含み、前記低親和性のＣＤ４７とＳＩＲＰαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質は、配列番号２６を含み、高親和性の腫瘍を標的とするアームがＥＧＦＲを標的とする場合、前記高親和性の腫瘍を標的とするアームは、配列番号１９と配列番号８を含み、前記低親和性のＣＤ４７とＳＩＲＰαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質は、配列番号２６を含み、高親和性の腫瘍を標的とするアームがＨｅｒ２を標的とする場合、前記高親和性の腫瘍を標的とするアームは、配列番号２０と配列番号２１、または配列番号２２と配列番号２３を含み、前記低親和性のＣＤ４７とＳＩＲＰαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質は、配列番号２６または配列番号２７を含み、または、高親和性の腫瘍を標的とするアームがＰＤ−Ｌ１を標的とする場合、前記高親和性の腫瘍を標的とするアームは、配列番号２４と配列番号１３を含み、前記低親和性のＣＤ４７とＳＩＲＰαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質は、配列番号２６を含む、実施形態１９の二重特異性組換えタンパク質。
実施形態２１．実施形態１〜２０のいずれか１項の二重特異性組換えタンパク質をコードする核酸分子。
実施形態２２．高親和性の腫瘍を標的とするアームをコードする核酸分子と低親和性のＣＤ４７とＳＩＲＰαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質をコードする核酸は、同じＤＮＡ鎖に位置され、又は異なるＤＮＡ鎖に位置される実施形態２１の核酸分子。
実施形態２３．実施形態２１または２２の核酸分子を含む発現ベクター。
実施形態２４．実施形態２３の発現ベクターを含む細胞。
実施形態２５．１）腫瘍を標的とするアームを提供するステップと、２）ＣＤ４７とＳＩＲＰαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質を提供するステップと、３）腫瘍を標的とするアームをＣＤ４７とＳＩＲＰαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質に接触させて前記組換えタンパク質を形成するステップとを含む、実施形態１〜２０のいずれか１項の二重特異性組換えタンパク質の製造方法。
実施形態２６．実施形態２４の細胞を使用して前記組換えタンパク質を発現させる、実施形態２５の製造方法。
実施形態２７．実施形態２５の製造方法であって、前記接触は、分子の間の作用力による結合、または鎖間ジスルフィド結合のような共有結合による結合、またはイオン結合による結合、または上記の結合方法における二つまたは三つの組み合わせによる結合を含む。
実施形態２８．前記接触は、ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓによる技術結合を含む実施形態２５〜２７のいずれか１項の製造方法。
実施形態２９．前記融合タンパク質は、ＳＩＲＰα細胞外トランケーションと他のポリペプチドを結合するための結合配列を含むことを特徴とする融合タンパク質。
実施形態３０．他のポリペプチドを結合するための結合配列は、Ｆｃ領域であり、選択的に、Ｆｃ領域は、ｈｏｌｅｓ突然変異および／またはｋｎｏｂｓ突然変異を含む、実施形態２９の融合タンパク質。
実施形態３１．ＳＩＲＰα細胞外トランケーションは、ヒトＳＩＲＰα野生型およびその非高親和性変異体の細胞外アミノ酸配列の一部または全部を含む実施形態２９又は３０の融合タンパク質。
実施形態３２．ＳＩＲＰα細胞外トランケーションは、下記ａ１）−ａ４）から選択されるいずれかの一つのアミノ酸配列を含み、ａ１）配列番号３０、ａ２）配列番号３１、ａ３）配列番号３２、ａ４）前記アミノ酸配列のいずれかの一つのアミノ酸配列が例えば１〜５個のアミノ酸残基を挿入、欠損、修飾および／または保守的置換することを経て獲得されるアミノ酸配列であって、そのモノマーは、ＣＤ４７タンパク質に対する結合親和性を有し、且つ当該結合親和性は、ＣＤ４７タンパク質に対するａ１）、ａ２）またはａ３）モノマーの結合親和性より高くないアミノ酸配列を有する実施形態３１の融合タンパク質。
実施形態３３．ｂ１）配列番号２６、ｂ２）配列番号２７、ｂ３）配列番号２８、ｂ４）前記アミノ酸配列のいずれかの一つのアミノ酸配列が例えば１〜５個のアミノ酸残基を挿入、欠損、修飾および／または保守的置換することを経て獲得されるアミノ酸配列であって、そのホモダイマーは、ＣＤ４７タンパク質に対する結合親和性を有し、且つ当該結合親和性は、ＣＤ４７タンパク質に対するｂ１）、ｂ２）またはｂ３）ホモダイマーの結合親和性より高くないアミノ酸配列を有する、ｂ１）−ｂ４）から選択されるいずれかの一つのアミノ酸配列を含む、実施形態２９〜３２のいずれか１項の融合タンパク質。
実施形態３４．実施形態２９〜３３のいずれか１項の融合タンパク質をコードする核酸分子。
実施形態３５．実施形態３４の核酸分子を含む発現ベクター。
実施形態３６．実施形態３５の発現ベクターを含む細胞。
実施形態３７．１）ＳＩＲＰα細胞外トランケーションを提供するステップと、２）他のポリペプチドに結合するための結合配列を提供するステップと、３）ＳＩＲＰα細胞外トランケーションを他のポリペプチドに結合するための結合配列に接触させて前記融合タンパク質を形成するステップとを含む、実施形態２９〜３３のいずれか１項の融合タンパク質の製造方法。
実施形態３８．実施形態３２の細胞を使用して前記融合タンパク質を発現させる、実施形態２９〜３３のいずれか１項の融合タンパク質の製造方法。
実施形態３９．実施形態１〜２０のいずれか１項の組換えタンパク質または実施形態２９〜３３のいずれか１項の融合タンパク質、および選択的なアジュバント、賦形剤または薬理学上許容されるベクターを含む、薬物組成物。
実施形態４０．注射剤または凍結乾燥粉末形態である、実施形態３９の薬物組成物。
実施形態４１．実施形態１〜２０のいずれか１項の組換えタンパク質または実施形態２９〜３３のいずれか１項の融合タンパク質をコートする核酸分子、および選択的な薬理学的に許容されるベクターを含む、薬物組成物。
実施形態４２．実施形態１〜２０のいずれか１項の組換えタンパク質の製造における実施形態２９〜３３のいずれか１項の融合タンパク質の用途。
実施形態４３．腫瘍を治療するための薬物の製造における実施形態１〜２０のいずれか１項の組換えタンパク質または実施形態２９〜３３のいずれか１項の融合タンパク質の用途。
実施形態４４．腫瘍は、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、膵臓癌、食道癌、子宮内膜癌、卵巣癌、胃癌、前立腺癌、腎臓癌、子宮頸癌、骨髄腫、リンパ腫、白血病、甲状腺癌、子宮癌、膀胱癌、神経内分泌癌、頭頸部癌、肝臓癌、鼻咽頭癌、精巣癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、黒色腫、基底細胞皮膚癌、扁平上皮細胞癌、皮膚線維肉腫、メルケル細胞癌、膠芽腫、神経膠腫、肉腫、中皮腫または骨髄異形成症候群などの血液腫瘍および固形腫瘍から選択される、実施形態４３の用途。
実施形態４５．インビボ遺伝子治療方法のための薬物の製造における実施形態１〜２０のいずれか１項の組換えタンパク質または実施形態２９〜３３のいずれか１項の融合タンパク質をコードする核酸分子またはその誘導体の用途。
実施形態４６．ａ）標的とされ、ＡＤＣＣ活性を有する組換えタンパク質／抗体（一価または多価を含む）を提供するステップと、ｂ）前記組換えタンパク質／抗体のＡＤＣＣ活性を検出するステップと、ｃ）前記組換えタンパク質／抗体の初期免疫安全性を評価するステップとを含む、インビトロ評価ＣＤ４７を標的とし、且つＡＤＣＣ活性を有する組換えタンパク質／抗体の初期免疫安全性のインビトロ評価方法。
実施形態４７．ａ）ヒトＮＫ９２ＭＩ−ＣＤ１６ａエフェクター細胞などであるが、これに限定されないエフェクター細胞を製造するステップと、ｂ）エフェクター細胞を組換えタンパク質／（一価または多価抗体を含む）抗体と接触させるステップと、ｃ）前記組換えタンパク質／抗体のＡＤＣＣ活性を検出するステップと、ｄ）ＡＤＣＣ活性の結果に従って、前記組換えタンパク質／抗体の初期免疫安全性を評価するステップとを含む、インビトロ評価ＣＤ４７を標的とし、且つＡＤＣＣ活性を有する組換えタンパク質／抗体の初期免疫安全性の評価方法。
実施形態４８．ａ）成長が良好なヒトＮＫ９２ＭＩ−ＣＤ１６ａエフェクター細胞を獲得し、獲得されたエフェクター細胞を１×１０５個の細胞／ｍｌ乃至５×１０６個の細胞／ｍｌの細胞密度に再懸濁させるステップと、ｂ）勾配希釈した組換えタンパク質／抗体を、ａ）で製造されたエフェクター細胞と０．５〜５ｈインキュベートするステップと０．５−５ｈインキュベートするステップと、ｃ）ｈインキュベート完了後、ＬＤＨ活性を測定し、細胞分解率を計算するステップと、ｄ）細胞分解率に従って組換えタンパク質／抗体の初期免疫安全性を評価するステップを含み、ここで、細胞分解率を低下させる組換えタンパク質／抗体の免疫安全性が高い、実施形態４７の評価方法。
実施形態４９．ａ）ＣＤ４７を標的とする組換えタンパク質／抗体（一価または多価を含む）を提供するステップと、ｂ）Ｈｕ−ＮＳＧマウスを提供するステップと、ｃ）前記組換えタンパク質／抗体をＨｕ−ＮＳＧマウスに接触させるステップと、ｄ）前記Ｈｕ−ＮＳＧマウスにおける前記組換えタンパク質／抗体の初期免疫安全性を評価するステップとを含むＣＤ４７を標的とする組換えタンパク質／抗体（一価または多価を含む）の初期免疫安全性のインビボ評価方法。
実施形態５０．ａ）Ｈｕ−ＮＳＧマウスを提供するステップと、ｂ）組換えタンパク質／抗体（一価または多価を含む）を投与するステップと、ｃ）２４〜９６時間の投与後、マウス静脈血を採取し、赤血球を分解し、残りの細胞を蛍光標識した抗ヒトＣＤ４５、抗ヒトＣＤ１９または抗ヒトＣＤ３の抗体とともに１５〜６０ｍｉｎインキュベートし、フローサイトメトリー検出を行うステップと、ｄ）細胞クリアランスに従って組換えタンパク質／抗体の初期免疫安全性を評価するステップと含み、ここで、免疫細胞（標的細胞を除く）クリアランスを低下させる組換えタンパク質／抗体の免疫安全性が高い、ＣＤ４７を標的とする組換えタンパク質／抗体（一価または多価を含む）の初期免疫安全性インビボ評価方法。
本発明の挿入される発現ベクターの挿入物の構造模式図である。 本発明で使用される例示的な発現ベクターｐＣＨＯ−ＴＥ２のプラスミドマップである。 本発明の組換えタンパク質の例示的な実施形態としての構造模式図である。 プロテインＡによる精製後の組換えタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動図である。図４Ａの第１〜６レーンは、還元サンプルであり、それぞれ１：Ｍａｒｋｅｒ、２：Ａｎｔｉ−ＣＤ２０ ｍＡｂ（Ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ）、３：Ａｎｔｉ−ＣＤ４７ ｍＡｂ（Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４）、４：ＳＩＲＰα Ｄ１−Ｆｃ、５：Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、６：Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２であり、図４Ａの第７〜１２レーンは、非還元サンプルであり、それぞれ７：Ｍａｒｋｅｒ、８：Ａｎｔｉ−ＣＤ２０ ｍＡｂ（Ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ）、９：Ａｎｔｉ−ＣＤ４７ ｍＡｂ（Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４）、１０：ＳＩＲＰα Ｄ１−Ｆｃ、１１：Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、１２：Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２である。 プロテインＡによる精製後の組換えタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動図である。図４Ｂのレーン１は、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２非還元サンプルであり、レーン２は、Ｍａｒｋｅｒであり、レーン３は、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２還元サンプルである。 本発明の組換えタンパク質とヒトＣＤ４７の結合親和性をＥＬＩＳＡにより測定した結果（タンパク質レベル）である。 フローサイトメトリーによって本発明の組換えタンパク質とヒトヒトＣＤ４７の結合親和性を測定した結果（細胞レベル）である。 フローサイトメトリーによって本発明の組換えタンパク質と対応する左アーム標的の結合力を測定した結果である。Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、ＳＩＲＰα Ｄ１−Ｆｃは、サンプルＨｕ５Ｆ９−Ｇ４、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、ＳＩＲＰα Ｄ１−Ｆｃと抗ＣＤ４７抗体Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４（Ｆａｂ）２によってブロックされなかったＲａｊｉ細胞結合後の平均蛍光強度に対応し、Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４（ｂ）、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２（ｂ）、ＳＩＲＰα Ｄ１−Ｆｃ（ｂ）は、サンプルＨｕ５Ｆ９−Ｇ４、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、ＳＩＲＰα Ｄ１−Ｆｃと抗ＣＤ４７抗体Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４（Ｆａｂ）２よってブロックされたＲａｊｉ細胞結合後の平均蛍光強度に対応する。 フローサイトメトリーによって本発明の組換えタンパク質とＣＤ４７および左アーム標的二重陽性細胞の結合親和性を測定した結果である。図８Ａでは、Ｒａｊｉ細胞（ＣＤ２０＋ＣＤ４７）を使用し、図８ＢではＳＫＢＲ−３細胞（Ｈｅｒ２＋ＣＤ４７）を使用し、図８Ｃでは、Ａ４３１細胞（ＥＧＦＲ＋ＣＤ４７）を使用し、図８Ｄでは、ＮＣＩ−Ｈ４４１細胞（ＰＤ−Ｌ１＋ＣＤ４７）を使用した。 ＥＬＩＳＡによって本発明の組換えタンパク質とＣＤ４７に対するＳＩＲＰα Ｄ１−Ｆｃおよび抗ＣＤ４７抗体の競合的結合を測定した結果である。 フローサイトメトリーによって本発明の組換えタンパク質およびそのＣＤ４７高親和性変異体、抗ＣＤ４７抗体と、抗ＣＤ２０抗体とヒトＣＤ４７の結合親和性を測定した結果である。 本発明の組換えタンパク質のインビトロ免疫安全性評価実験の結果である。 Ｒａｊｉリンパ腫皮下移植ＮＳＧマウスモデルにおける本発明の組換えタンパク質の薬物効果を実験した結果である。 同じ用量の異なるサンプルでＨｕ−ＮＳＧマウスを処理した後、９６時間のＢ細胞の含有量を検出した結果である。ここで、図１３Ａでは、０．９％の生理食塩水を使用し、図１３Ｂでは、Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４（６．７μｇ／匹）を使用し、図１３Ｃでは、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２（５μｇ／匹）を使用した。 Ｈｕ−ＮＳＧ体内におけるＯｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２およびＯｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｆｃ２初期安全性評価実験結果（ＦＡＣＳ免疫細胞タイピングアッセイ）である。図１４Ａ〜ＤはそれぞれＯｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２（１μｇ／匹）を使用し、ここで、図１４Ａと図１４Ｂは、投与前の検出結果図であり、図１４Ｃと図１４Ｄは、投与７２時間後の検出結果図である。図１４Ｅ〜ＨはそれぞれＯｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｆｃ２（１μｇ／匹）を使用し、ここで、図１４Ｅと図１４Ｆは、投与前の検出結果図であり、図１４Ｇと図１４Ｈは、投与７２時間後の検出結果図である。 高用量の異なるサンプルでＨｕ−ＮＳＧマウスを処理した後、９６時間のＦＡＣＳ免疫細胞タイピングアッセイである。図１５Ａ〜Ｂは、投与した後９６時間の結果であり、ここで、図ＡではＨｕ５Ｆ９−Ｇ４（２００μｇ／匹）を使用し、図１５ＢではＯｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２高用量（１５０μｇ／匹）を使用した。図１５Ｃ〜Ｄは、投与した後用１４日の結果であり、ここで、図１５ＣではＨｕ５Ｆ９−Ｇ４（２００μｇ／匹）を使用し、図１５ＤではＯｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２高用量（１５０μｇ／匹）を使用した。 本発明の組換えタンパク質のＳＫＢＲ−３で二重標的（Ｈｅｒ２、ＣＤ４７）との結合状況である。図１６Ａは、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２とＡｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２サンプルの検出結果であり、図１６Ｂは、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２とＡｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２サンプルの検出結果である。 本発明の例示的な蛋白質の対応するアミノ酸配列とＤＮＡ配列である。 本発明の例示的な蛋白質の対応するアミノ酸配列とＤＮＡ配列である。 本発明の例示的な蛋白質の対応するアミノ酸配列とＤＮＡ配列である。 本発明の例示的な蛋白質の対応するアミノ酸配列とＤＮＡ配列である。 本発明の例示的な蛋白質の対応するアミノ酸配列とＤＮＡ配列である。 図１８Ａは、カニクイザル赤血球の数に対する二つの用量のＯｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２の影響であり、図１８Ｂは、カニクイザルヘモグロビンに対する二つの用量のＯｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２の影響である。 カニクイザルＢ細胞含有量に対する二つの用量のＯｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２の検出結果である。 ヒトＢ細胞リンパ腫Ｄａｕｄｉ皮下移植腫瘍の成長に対するＯｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、リツキシマブ＜登録商標＞の影響である。 担癌マウスの体重に対するＯｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、リツキシマブ＜登録商標＞の影響である。 ヒトＢ細胞リンパ腫Ｄａｕｄｉ皮下移植腫瘍に対するＯｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、リツキシマブ＜登録商標＞の効果の腫瘍写真である。
本発明の理解を容易にするために、いくつかの実施形態を参照し、特定の言語を使用して本発明を説明する。しかし、これらの具体的な実施形態は、本発明の範囲を限定することを意図するものではないことを理解されたい。記載された実施形態における任意の変更およびさらなる修正、ならびに本発明の任意のさらなる応用は、当業者には明らかである。
組換えタンパク質
本明細書で使用される場合、用語「組換えタンパク質」とは、天然に存在するタンパク質ではなく、設計／構築されたタンパク質を指す。本発明の「組換えタンパク質」における「組換え」は、その生産方法を意味するものではなく、単に「組換えタンパク質」が自然に存在しないことを示すために使用される。本発明の組換えタンパク質は、発現タンパク質であってもよく、組み立てタンパク質であってもよい。
選択的に、本発明の組換えタンパク質は、高親和性の腫瘍を標的とするアームおよび低親和性のＣＤ４７とＳＩＲＰαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質を含む。
本明細書で使用する「高親和性標的腫瘍」は、本発明の組換えタンパク質の腫瘍に対する結合親和性が、先行技術における腫瘍に結合する抗体ベースの薬物の結合親和性よりも高いかまたは略同等であることを意味し、通常、先行技術において、腫瘍への結合親和性に対する腫瘍に結合する抗体ベースの薬物の結合親和性ＥＣ５０は、一般的にｎＭまたはｐＭレベルである。好ましくは、本発明の組換えタンパク質において、腫瘍細胞上の標的抗原に対する高親和性の腫瘍を標的とするアームに対応する抗体の結合親和性は、腫瘍細胞上のＣＤ４７に対する低親和性のＣＤ４７とＳＩＲＰαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質に対応するモノマー融合タンパク質ホモダイマーの結合親和性の少なくとも６倍であり、選択的に、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍であり、またはより高い倍数であり、またはその間の任意の数値である。選択的に、本発明の組換えタンパク質において、腫瘍細胞上の標的抗原に対する高親和性の腫瘍を標的とするアームに対応する抗体の結合親和性は、腫瘍細胞上のＣＤ４７に対する低親和性のＣＤ４７とＳＩＲＰαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質に対応するＳＩＲＰα−Ｆｃホモダイマーの結合親和性の少なくとも６倍であり、選択的に、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍であり、またはより高い倍数であり、またはの間の任意の数値である。
本明細書で使用する「低親和性のＣＤ４７とＳＩＲＰαの相互作用をブロッキングする」は、本発明の組換えタンパク質が低い親和性でＣＤ４７とＳＩＲＰαの相互作用をブロッキングすることを指す。好ましくは、ＣＤ４７に対する本発明の組換えタンパク質における低親和性のＣＤ４７とＳＩＲＰαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質の結合親和性は、ＣＤ４７に対するＳＩＲＰα細胞外トランケーションを含むモノマー融合タンパク質のホモダイマーの結合親和性より高くない。より好ましくは、ＣＤ４７に対するヒトＳＩＲＰα−Ｆｃ融合タンパク質の結合親和性より高くない。
本明細書に記載の二重特異性組換えタンパク質は、腫瘍細胞上の標的抗原に対する高親和性の腫瘍を標的とするアームに対応する抗体の結合親和性が、腫瘍細胞上のＣＤ４７に対するＣＤ４７とＳＩＲＰαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質のアームに対応するモノマー融合タンパク質ホモダイマーの結合親和性の少なくとも６倍である場合、マクロファージ機能を調節する組換えタンパク質の腫瘍標的飽和結合度を有意に向上させ、非腫瘍標的の副作用の欠缺を低減することを実現することができる。
本明細書で使用する結合親和性の測定方法は、当業者に周知であり、例えば、ＥＬＩＳＡおよび／またはフローサイトメトリーを含むがこれに限定されない。
選択的に、本発明に記載のシグナル調節タンパク質α細胞外トランケーション（野生型細胞外トランケーションおよび非高親和性変異体細胞外トランケーションを含む）−Ｆｃ融合タンパク質と不完全抗体は、抗体重鎖を修飾してヘテロ二量体を形成することができ、具体的に、例えば、Ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ連結および／または鎖間ジスルフィド結合および／またはイオン結合媒介により、組換えタンパク質を獲得することができる。
選択的に、「腫瘍を標的とするアーム」または「不完全抗体」または「左アーム」または「不完全抗体構造」または「Ｉｇ分子モノマー」と「ＣＤ４７を標的とするアーム」または「右アーム」または「シグナル調節タンパク質αトランケーション−Ｆｃ融合タンパク質」または「ＳＩＲＰα−Ｆｃ」がｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ連結を介して組換えタンパク質を獲得する場合、獲得された組換えタンパク質の構造は、図３に示した通りである。ここで、左アームは、腫瘍を標的をする不完全抗体であり、抗５Ｔ４不完全抗体、抗ＡＧＳ−１６不完全抗体、抗ＡＬＫ１不完全抗体、抗ＡＮＧ−２不完全抗体、抗Ｂ７−Ｈ３不完全抗体、抗Ｂ７−Ｈ４不完全抗体、抗ｃ−ｆｍｓ不完全抗体、抗ｃ−Ｍｅｔ不完全抗体、抗ＣＡ６不完全抗体、抗ＣＤ１２３不完全抗体、抗ＣＤ１９不完全抗体、抗ＣＤ２０不完全抗体、抗ＣＤ２２不完全抗体、抗ＥｐＣＡＭ不完全抗体、抗ＣＤ３０不完全抗体、抗ＣＤ３２ｂ不完全抗体、抗ＣＤ３７不完全抗体、抗ＣＤ３８不完全抗体、抗ＣＤ４０不完全抗体、抗ＣＤ５２不完全抗体、抗ＣＤ７０不完全抗体、抗ＣＤ７４不完全抗体、抗ＣＤ７９ｂ不完全抗体、抗ＣＤ９８不完全抗体、抗ＣＥＡ不完全抗体、抗ＣＥＡＣＡＭ５不完全抗体、抗ＣＬＤＮ１８．２不完全抗体、抗ＣＬＤＮ６不完全抗体、抗ＣＳ１不完全抗体、抗ＣＸＣＲ４不完全抗体、抗ＤＬＬ−４不完全抗体、抗ＥＧＦＲ不完全抗体、抗ＥＧＰ−１不完全抗体、抗ＥＮＰＰ３不完全抗体、抗ＥｐｈＡ３不完全抗体、抗ＥＴＢＲ不完全抗体、抗ＦＧＦＲ２不完全抗体、抗ＦＮ不完全抗体、抗ＦＲ−α不完全抗体、抗ＧＣＣ不完全抗体、抗ＧＤ２不完全抗体、抗ＧＰＣ−３不完全抗体、抗ＧＰＮＭＢ不完全抗体、抗ＨＥＲ２不完全抗体、抗ＨＥＲ３不完全抗体、抗ＨＬＡ−ＤＲ不完全抗体、抗ＩＣＡＭ−１不完全抗体、抗ＩＧＦ−１Ｒ不完全抗体、抗ＩＬ−３Ｒ不完全抗体、抗ＬＩＶ−１不完全抗体、抗ＭＳＬＮ不完全抗体、抗ＭＵＣ１６不完全抗体、抗ＭＵＣ１不完全抗体、抗ＮａＰｉ２ｂ不完全抗体、抗ネクチン−４不完全抗体、抗Ｎｏｔｃｈ ２不完全抗体、抗Ｎｏｔｃｈ １不完全抗体、抗ＰＤ−Ｌ１不完全抗体、抗ＰＤ−Ｌ２不完全抗体、抗ＰＤＧＦＲ−α不完全抗体、抗ＰＳ不完全抗体、抗ＰＳＭＡ不完全抗体、抗ＳＬＴＲＫ６不完全抗体、抗ＳＴＥＡＰ１不完全抗体、抗ＴＥＭ１不完全抗体、抗ＶＥＧＦＲ不完全抗体、抗ＣＤ２５不完全抗体、抗ＣＤ２７Ｌ不完全抗体、抗ＤＫＫ−１不完全抗体、抗ＣＳＦ−１Ｒ不完全抗体、抗ＭＳＢ００１０７１８Ｃ不完全抗体、抗ＢＣＭＡ不完全抗体、抗ＣＤ１３８不完全抗体を含むがこれに限定されない。右アームは、ＳＩＲＰα（ヒトＳＩＲＰα野生型および非高親和性変異体を含む）細胞外トランケーションがＩｇＧ抗体のヒンジ領域とＦｃ領域に連結することによって形成される融合タンパク質である。ここで、右アームＦｃ領域がｈｏｌｅ変異体である場合、対応する左アームＦｃ領域は、ｋｎｏｂ変異体であり、右アームがｋｎｏｂ変異体である場合、対応する左アームＦｃ領域は、ｈｏｌｅ変異体である。当業者に知られているように、Ｆｃ領域は複数のｈｏｌｅｓおよび／またはｋｎｏｂｓの突然変異を同時に製造することもできる。
以下の表１は、組換えタンパク質の例示的な分子構造である。
Ｄ１ｍは、ＳＩＲＰα細胞外トランケーションＤ１の高親和性変異体を示し、Ｄ１は、ヒトＳＩＲＰα野生型および非高親和性変異体の細胞外Ｄ１ドメインを示し、Ｆｃは、野生型Ｆｃ領域を示し、Ｆｃ１は、ｈｏｌｅまたはｈｏｌｅｓ突然変異を有するＦｃ領域を示し、Ｆｃ２は、ｋｎｏｂまたはｋｎｏｂｓ突然変異を有するＦｃ領域を示す。
本発明組換えタンパク質の対応するアミノ酸配列とＤＮＡ配列は、図１７Ａ〜Ｅに示され、本発明の配列表ファイルに見出される。
抗体
本明細書で使用される場合、用語「抗体」または「免疫グロブリン」は、２つの同じ軽鎖（Ｌ）および２つの同じ重鎖（Ｈ）からなる、同じ構造的特徴を有する約１５００００ダルトンのアイソテトラマー糖タンパク質である。各軽鎖は、一つの共有結合のジスルフィド結合によって重鎖に連結され、異なる免疫グロブリンのアイソタイプの重鎖間のジスルフィド結合の数は異なる。各重鎖と軽鎖には、一定の間隔で鎖内ジスルフィド結合がある。各重鎖の一端には可変領域（ＶＨ）があり、その後には複数の定常領域がある。各軽鎖の一端には可変領域（ＶＬ）があり、他端には定常領域があり、軽鎖の定常領域と重鎖の最初の定常領域は対向し、軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域は対向し。特定のアミノ酸残基は、軽鎖と重鎖の可変領域間に界面を形成する。
腫瘍を標的とするアーム
本明細書で使用される場合、用語「腫瘍を標的とするアーム」または「不完全抗体」または「左アーム」または「不完全抗体構造」または「Ｉｇ分子モノマー」は、抗体の一つの軽鎖（Ｌ）および一つの重鎖（Ｈ）からなるヘテロ二糖類タンパク質であり、免疫グロブリン分子を形成する基本構造であり、本発明において互換的に使用することができ、その分子量は、抗体分子量の半分に対応し、約７５０００ダルトンであり、ここで、軽鎖は、一つの共有結合のジスルフィド結合によって重鎖に結合される。重鎖と軽鎖にも一定の間隔で鎖内ジスルフィド結合を有する。各重鎖の一端には、可変領域（ＶＨ）があり、その後には複数の定常領域がある。各軽鎖の一端には可変領域（ＶＬ）があり、他端には定常領域があり、軽鎖の定常領域と重鎖の最初の定常領域は対向し、軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域は対向し。特定のアミノ酸残基は、軽鎖と重鎖の可変領域間に界面を形成する。
本明細書で使用される場合、用語「腫瘍を標的とするアーム」、「不完全抗体」または「左アーム」または「不完全抗体構造」または「Ｉｇ分子モノマー」は、様々な腫瘍を標的とするＩｇＧタンパク質であることができる。腫瘍標的分子は、５Ｔ４、ＡＧＳ−１６、ＡＬＫ１、ＡＮＧ−２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ｃ−ｆｍｓ、ｃ−Ｍｅｔ、ＣＡ６、ＣＤ１２３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ９８、ＣＥＡ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＬＤＮ１８．２、ＣＬＤＮ６、ＣＳ１、ＣＸＣＲ４、ＤＬＬ−４、ＥＧＦＲ、ＥＧＰ−１、ＥＮＰＰ３、ＥｐｈＡ３、ＥＴＢＲ、ＦＧＦＲ２、ＦＮ、ＦＲ−α、ＧＣＣ、ＧＤ２、ＧＰＣ−３、ＧＰＮＭＢ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＬＡ−ＤＲ、ＩＣＡＭ−１、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＬ−３Ｒ、ＬＩＶ−１、ＭＳＬＮ、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ１、ＮａＰｉ２ｂ、ネクチン−４、Ｎｏｔｃｈ ２、Ｎｏｔｃｈ １、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＰＤＧＦＲ−α、ＰＳ、ＰＳＭＡ、ＳＬＴＲＫ６、ＳＴＥＡＰ１、ＴＥＭ１、ＶＥＧＦＲ、ＣＤ２５、ＣＤ２７Ｌ、ＤＫＫ−１、ＣＳＦ−１Ｒ、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ、ＢＣＭＡ、ＣＤ１３８を含むが、これらに限定されない。
「腫瘍を標的とするアーム」、「不完全抗体」または「左アーム」または「不完全抗体構造」または「Ｉｇ分子モノマー」のＦｃ配列は、ｈｏｌｅまたはｈｏｌｅｓ変異体および／またはｋｎｏｂまたはｋｎｏｂｓ変異体を使用することができる。
ＣＤ４７を標的とするアーム
本明細書で使用される場合、用語「ＣＤ４７を標的とするアーム」または「右アーム」または「シグナル調節タンパク質αトランケーション−Ｆｃ融合タンパク質」または「ＳＩＲＰα−Ｆｃ」または「ＣＤ４７とＳＩＲＰαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質」は、本発明において交換可能に使用することができる。当業者に知られているように、前記「ＣＤ４７を標的とするアーム」または「右アーム」または「シグナル調節タンパク質αトランケーション−Ｆｃ融合タンパク質」または「ＳＩＲＰα−Ｆｃ」または「ＣＤ４７とＳＩＲＰαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質」分子の長さは変えられる。選択的に、ＳＩＲＰα（ヒトＳＩＲＰα野生型および非高親和性変異体を含む）の細胞外トランケーションをＩｇＧ１抗体のヒンジ領域およびＦｃ領域に連結することにより、複数の分子長さの異なる「ＣＤ４７を標的とするアーム」または「右アーム」または「シグナル調節タンパク質αトランケーション−Ｆｃ融合タンパク質」または「ＳＩＲＰα−Ｆｃ」または「ＣＤ４７とＳＩＲＰαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質」を形成することができる。ＩｇＧ１は、ヒトＩｇＧ１であることができる。
「ＣＤ４７を標的とするアーム」または「右アーム」または「シグナル調節タンパク質αトランケーション−Ｆｃ融合タンパク質」または「ＳＩＲＰα−Ｆｃ」または「ＣＤ４７とＳＩＲＰαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質」のＦｃは、ｋｎｏｂまたはｋｎｏｂｓ変異体および／またはｈｏｌｅまたはｈｏｌｅｓ変異体を使用することができる。
「腫瘍を標的とするアーム」または「不完全抗体」または「左アーム」または「不完全抗体構造」または「Ｉｇ分子モノマー」および「ＣＤ４７を標的とするアーム」または「右アーム」または「シグナル調節タンパク質αトランケーション−Ｆｃ融合タンパク質」または「ＳＩＲＰα−Ｆｃ」または「ＣＤ４７とＳＩＲＰαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質」は、当業者に知られているように、Ｆｃフラグメント（領域）を改造することによりヘテロ二量体組換えタンパク質を形成することができる。具体的に、本発明の組換えタンパク質は、分子の間の作用力によって得られることができ、鎖間ジスルフィド結合のような共有結合によって得られることもでき、イオン結合媒介によって得られることもでき、また前記三つの技術における二つまたは三つの任意に組み合わせによって得られることもできる。選択的に、本発明の組換えタンパク質は、ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ技術によって結合される。
ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ技術
本明細書で使用される場合、用語「ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ技術」または「杵臼」技術または「突起−入り−空洞」技術または「ボタン」技術は、遺伝子工学技術を使用して、重鎖の二つのＣＨ３ドメインに異なる突然変異を導入して、重鎖のヘテロ二量体化を引き起こし、一つの重鎖に一つのノブ（ｋｎｏｂ）を作り、他方の重鎖にホール（ｈｏｌｅ）を作り、その後二つが優先的に咬合して、非対称抗体を形成する（Ｒｉｄｇｗａｙ ＪＢ， ｅｔ ａｌ． ’Ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ’ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ＣＨ３ ｄｏｍａｉｎｓ ｆｏｒ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， １９９６， ９（７）：６１７−６２１）。当業者に知られているように、一つの重鎖に複数のノブ（ｋｎｏｂ）および／またはホール（ｈｏｌｅ）を作りことができ、対応的に、他方の重鎖に複数のホール（ｈｏｌｅ）および／またはノブ（ｋｎｏｂ）を作ることができる。
ＳＩＲＰα
本明細書で使用される場合、用語「ＳＩＲＰα」は、シグナル調節タンパク質α（Ｓｉｇｎａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ α）であり、ＣＤ１７２ａとも称される。シグナル調節タンパク質（ＳＩＲＰ）は、三つのファミリーメンバ、ＳＩＲＰα（ＣＤ１７２ａ）、ＳＩＲＰβ（ＣＤ１７２ｂ）、およびＳＩＲＰγ（ＣＤ１７２ｇ）を含む膜貫通糖タンパク質である。これらの三つのメンバーは、外膜の端が似ているが、内膜の領域が異なる。膜の外端には三つの免疫グロブリン（Ｉｇ）様領域が含まれ、その第１領域はＩｇＶ領域に属し、第２と第３領域はＩｇＣ領域に属する。ＳＩＲＰα（ＣＤ１７２ａ）の膜内領域には、阻害シグナルを伝達し、細胞の対応する機能を阻害する二つの阻害シグナルドメインが含まれる。ＳＩＲＰβ（ＣＤ１７２ｂ）およびＳＩＲＰγ（ＣＤ１７２ｇ）の細胞内領域は短く、シグナル伝達領域はないが、ＳＩＲＰβ（ＣＤ１７２ｂ）はアダプタータンパク質（Ａｄａｐｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ、ＤＡＰ１２など）を介して活性化シグナルを伝達することができる。ＳＩＲＰタンパク質は、主にマクロファージ（Ｍφ）、樹状細胞（ＤＣ）、および神経細胞で発現する。本明細書は、特に、ヒトＳＩＲＰα野生型とそのＣＤ４７非高親和性変異体を指す。
ＳＩＲＰα細胞外トランケーション
「細胞外トランケーション」は、膜貫通機能を有するタンパク質を指す。本明細書で使用される「ＳＩＲＰα細胞外トランケーション」は、細胞膜の外側空間に全体的または部分的に位置するアミノ酸配列を選択的にトランケーションするヒトＳＩＲＰα野生型およびそのＣＤ４７非高親和性変異体を指す。
本明細書で使用される場合、用語「Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３」は、タンパク質のアミノ基端から順次に、Ｄ１ドメイン（Ｉｇ可変領域様ドメイン，ＩｇＶ領域）、Ｄ２ドメイン（Ｉｇ定常領域様ドメイン，ＩｇＣ領域）及びＤ３ドメイン（Ｉｇ定常領域様ドメイン，ＩｇＣ領域）であるＳＩＲＰα細胞外の三つのＩｇ様ドメインを指す（Ｌｅｅ ＷＹ， ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ Ｒｏｌｅ ｏｆ ｃｉｓ Ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｉｇｎａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ α （ＳＩＲＰα） ｉｎ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ＣＤ４７． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２０１０，２８５ （４９）：３７９５３−３７９６３）。
ＳＩＲＰα−Ｆｃ融合タンパク質
本明細書で使用される場合、用語「ＳＩＲＰα−Ｆｃ融合タンパク質」は、ＳＩＲＰα細胞外トランケーション、リンカー配列およびＦｃ領域を含む融合タンパク質を指す。前記配列に含まれるリンカー配列および／またはＦｃ領域は、当業者に周知の方法または従来のリンカー配列および／またはＦｃ領域に従って任意に置換することができる。
グリコシル化の影響を回避するために、本発明は、Ｄ１をアスパラギンからアラニンへのＤ１の突然変異を実施した（参考文献：Ｌｅｅ Ｗ Ｙ， ｅｔ ａｌ． Ｎｏｖｅｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｏｎ ＳＩＲＰ α ｔｈａｔ Ｍｅｄｉａｔｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ＣＤ４７． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ２００７， １７９（１１）：７７４１−７７５０）。
本発明のＤ１、Ｄ２、Ｄ３は、対応するリンカー配列をさらに含む。
リンカー配列
本明細書で使用されるように、用語「リンカー配列」は、ＳＩＲＰα細胞外トランケーションと結合配列を連結するアミノ酸配列を指し、選択的に、ＩｇＧ抗体のヒンジ領域であり、選択的に、ヒンジ領域とＩｇＧ重鎖ＣＨ１ドメインを含む。前記配列に含まれるリンカー配列またはヒンジ領域配列は、当業者に周知の方法または従来のリンカー配列またはヒンジ領域配列に従って任意に置換することができる。
結合配列
本明細書で使用されるように、用語「結合配列」は、高親和性の腫瘍を標的とするアームと、低親和性のＣＤ４７とＳＩＲＰαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質を結合させる配列を指し、選択的に、前記結合配列は、ヒンジ領域とＦｃ領域を含み、より選択的に、前記Ｆｃ領域は、ｋｎｏｂまたはｋｎｏｂｓおよび／またはｈｏｌｅまたはｈｏｌｅｓ突然変異を含む。前記配列に含まれる結合配列またはヒンジ領域またはＦｃ領域配列は、当業者に周知の方法または従来の結合配列またはヒンジ領域またはＦｃ領域配列に従って任意に置換することができる。
ＣＤ４７
ＣＤ４７は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する膜貫通糖タンパク質であり、赤血球を含むほぼすべての細胞表面に発現する。ＣＤ４７のリガンドには、接着因子（インテグリン）、トロンボスポンジン１（ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ−１）、およびシグナル調節タンパク質（ＳＩＲＰ）を含む。ＣＤ４７は、細胞移動、Ｔ細胞、樹状細胞の活性化、軸索の発達などを含むさまざまな生物学的機能を有する。さらに、ＣＤ４７はＳＩＲＰαと相互作用することによりマクロファージの食作用を阻害する。ＣＤ４７は、このような方法でいわゆる「食べないでください」（「Ｄｏｎ’ｔ ｅａｔ ｍｅ」）信号を送信し、赤血球、Ｂ細胞、Ｔ細胞などの正常細胞をマクロファージによる食作用から保護する。
Ｏｆａ
本明細書で使用される場合、用語「Ｏｆａ」、「Ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ」、「Ａｎｔｉ−ＣＤ２０（Ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ）」は、本発明で交換的に使用することができ、抗ＣＤ２０抗体Ｏｆａｔｕｍｕｍａｂを示す。
Ｏｂｉ
本明細書で使用されるように、用語「Ｏｂｉ」、「Ｏｂｉｎｕｔｕｚｕｍａｂ」、「Ａｎｔｉ−ＣＤ２０（Ｏｂｉｎｕｔｕｚｕｍａｂ）」は、本発明で交換的に使用することができ、抗ＣＤ２０抗体Ｏｂｉｎｕｔｕｚｕｍａｂを示す。
Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４
本明細書で使用されるように、用語「Ａｎｔｉ−ＣＤ４７ ｍＡｂ」、「抗ＣＤ４７抗体」、「Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４」は、本発明で交換的に使用することができ、抗ＣＤ４７抗体Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４を示す。
Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ ｍＡｂ
本明細書で使用される場合、用語「Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ ｍＡｂ」、「ＪＭＴ１０１」は、本発明で交換的に使用することができ、抗ＥＧＦＲ抗体ＪＭＴ１０１を示す。ＪＭＴ１０１は、ヒト化抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体であり、ＺＬ２０１２１０４０６２８８．３特許ＢＡ０３を参照することができる。
トラスツズマブモノクローナル抗体
本明細書で使用されるように、用語「トラスツズマブモノクローナル抗体」、「Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ」、「Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ） ｍＡｂ」、「Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ」は、本発明で交換的に使用することができ、抗Ｈｅｒ２抗体Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂを示す。
ペルツズマブモノクローナル抗体
本明細書で使用されるように、用語「ペルツズマブモノクローナル抗体」、「Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ」、「Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ） ｍＡｂ」、「Ｐｅｒｊｅｔａ」は、本発明で交換的に使用することができ、抗Ｈｅｒ２抗体Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂを示す。
Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ
本明細書で使用されるように、用語「Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ」、「Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ」は、本発明で交換的に使用することができ、抗ＰＤ−Ｌ１抗体Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂを示す。
ＳＩＲＰα Ｄ１−Ｆｃ
本明細書で使用されるように、用語「ＳＩＲＰα Ｄ１−Ｆｃ」、「Ｄ１−Ｆｃ」は、本発明で交換的に使用することができ、一本鎖融合タンパク質ＳＩＲＰα Ｄ１−Ｆｃの二量体を示す。
Ｏｆａ−Ｆｃ１
ｈｏｌｅ突然変異を有するＦｃ領域のＯｆａｔｕｍｕｍａｂ不完全抗体を示す。
Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１
ｈｏｌｅ突然変異を有するＦｃ領域のＴｒａｎｓｔｕｚｕｍａｂ不完全抗体を示す。
Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１
ｈｏｌｅ突然変異を有するＦｃ領域のＰｅｒｔｕｚｕｍａｂ不完全抗体を示す。
Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１
ｈｏｌｅ突然変異を有するＦｃ領域の抗ＥＧＦＲ不完全抗体を示す。
Ｄ１−Ｆｃ２
ＳＩＲＰα Ｄ１ドメイン細胞外トランケーションとｋｎｏｂ突然変異を有するＦｃ領域を含む融合タンパク質を示す。
Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２
ＳＩＲＰα Ｄ１およびＤ２ドメイン細胞外トランケーションとｋｎｏｂ突然変異を有するＦｃ領域を含む融合タンパク質を示す。
Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２
ＳＩＲＰα Ｄ１、Ｄ２およびＤ３ドメイン細胞外トランケーションとｋｎｏｂ突然変異を有するＦｃ領域を含む融合タンパク質を示す。
治療
本明細書で使用される場合、用語「治療」、「治療方法」および「治癒」は、交換的に使用することができる。用語「治療」は、疾患、病症、病状、および関連する症状の進行を制御すること、好ましくは、疾患、病症、病状を低減し、または疾患、病症、病状の一つまたは複数の症状の影響を緩和することを含む。この用語は、疾患の治癒または症状の完全な除去を含む。この用語は、症状の緩和を含む。この用語は、非治癒の緩和治療も含むが、これに限定されない。用語「治療する」は、疾患、病症、病状の進行、またはまたは疾患、病症、病状の一つまたは複数の症状の影響を予防または遅延、低減または緩和するために、本発明の組換えタンパク質または融合タンパク質を含む医薬組成物の治療有効量を実験対象者に投与することを含む。
投与
本明細書で使用されるように、用語「投与」は、本発明の組換えタンパク質または融合タンパク質を含む医薬組成物の治療有効量を実験対象者へ送達することを指す。投与は、全身的投与または局所的投与であり得る。投与は、注射器などの投与装置によることができる。投与方法は、埋め込み、経鼻吸入、噴霧、注射などを含むが、これらに限定されない。投与経路は、吸入、鼻腔内、経口、静脈内、皮下または筋肉内投与などを含む。
実施例１ 発現ベクターの構築
設計された分子構造に従って、各構成部分のアミノ酸配列を前後で一緒にスプライスし、コドンに対するチャイニーズハムスター（Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）の好みに従って、最適なＤＮＡコード配列が設計され、遺伝子クローニング操作などに必要な酵素トランケーション部位を除外し、その後、当該配列５’端に順序にクローニングサイト、Ｋｏｚａｋ配列とシグナルペプチドコード配列を追加し、当該配列３’端に順序に停止コードン及びクローニングサイトを追加し、図１に示された通りである。
全遺伝子合成を実施し、５’端および３’端クローニングサイトを使用して、発現ベクターｐＣＨＯ−ＴＥ２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒから購入）の対応するクローニングサイトの間に、全遺伝子を一方向にクローニングし、配列が正しいことを確認した後、発現プラスミドを獲得することができる。５’端および３’端で使用されるクローニングサイトはすべて、ＥｃｏＲＶおよびＰａｃＩサイトである。図２は、発現ベクターｐＣＨＯ−ＴＥ２のプラスミドマップである。

実施例２ 発現プラスミドの製造、細胞トランスフェクションおよび標的タンパク質の発現、精製
発現プラスミドの製造
発現プラスミドを含むグリセロール細菌（発現プラスミドを含む１ｍＬの大腸菌液に０．５ｍＬの６０％滅菌グリセロール溶液を加え、十分に混ぜる）を、液体ＬＢ培地に１：１０００の比率で接種した。３７℃、２２０ｒｐｍで１６時間振盪した後、遠心分離によりバクテリアを収集した。発現プラスミドは、エンドトキシンを含まないプラスミドキット（ＤＰ１１７、Ｔｉａｎｇｅｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｂｅｉｊｉｎｇ）Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入）を使用して、キットの説明書に提供された標準手順に従って、抽出することにより得た。
細胞トランスフェｄクション、タンパク質の発現
得られた発現プラスミドを０．２２μｍフィルターで濾過した後、３ｍｇのプラスミド（ここで、生成物は典型的な抗体分子であり、その軽鎖と重鎖の発現プラスミドの比は１：１（モル比）であり、生成物は組換えタンパク質であり、その軽鎖、重鎖、右アーム発現プラスミドの発現プラスミドの比率は１：１：１（モル比）であり、具体的に表３を参照）を吸引し、５０ｍＬのＯｐｔｉ ＭＥＭ Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ（ＧＩＢＣＯから購入）に加え、均一に混合した。６ｍｇのトランスフェクション試薬ポリエーテルイミド（Ｐｏｌｙｅｔｈｅｒｉｍｉｄｅ、ＰＥＩ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓから購入し、１ｍｇ／ｍＬの濃度で滅菌超純水に溶解）を吸引し、５０ｍＬのＯｐｔｉ ＭＥＭ Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍに加え、均一に混合した。得られたＰＥＩ溶液を、プラスミドを含むＯｐｔｉ ＭＥＭ Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ溶液に加え、均一に混合した。室温で１５分間放置した後、プラスミドとＰＥＩの混合物を、１Ｌの体積と３×１０６細胞／ｍＬの細胞密度を有する宿主細胞ＣＨＯ−Ｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒから購入）の懸濁液にゆっくりと均一に加え、３７℃に置き、５％のＣＯ２インキュベーターで培養した。４時間後、初期容量の７％に相当するフィード培地を添加（当該フィード培地は、水１リットルあたりに８０ｇのＣＤ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｆｅｅｄ Ｃ ＡＧＴ（Ｇｉｂｃｏから購入）、７５ｇの５×００４８３（Ｋｅｒｒｙから購入）を溶解した）した。培養温度を３３℃に下げ、６日間の培養後に収穫した。細胞懸濁液を１０℃で１００００ｇで３０分間遠心分離し、遠心分離によって得られた上清、すなわち細胞培養回収溶液を標的タンパク質の精製に使用した。
タンパク質の精製
以下の方法では、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２を例として、プロテインＡをアフィニティキャプチャした。
前記細胞培養回収液を１００００ｒｐｍで３０分間遠心分離して、細胞とその断片を除去した後、プロテインＡアフィニティーカラム（カタログ番号１７−５４３８−０２、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でロードし、溶出によって目標のタンパク質を回収した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥでタンパク質の純度を検出した。
プロテインＡ精製方法は、当業者に周知の従来のタンパク質精製方法であり、具体的に試験方法は、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ プロテインＡ製品取扱説明書およびＧＥ抗体精製マニュアルを参照することができる。
ＳＩＲＰα Ｄ１−Ｆｃ、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２四種類のたんぱく質の理論分子量は、それぞれ３７．８ｋＤ、１１０．７ｋＤ、１２１．７ｋＤおよび１３１．４ｋＤである。ＳＤＳ−ＰＡＧＥタンパク質電気泳動検出の結果は、図４Ａと図４Ｂに示された通りである。
タンパク質電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）：結果（図４Ａと図４Ｂ）は、各レーンの標的タンパク質はすべて効率的に発現および精製されたことを示し、ここで、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２（図４Ａのレーン１１）、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２（図４Ｂのレーン１）、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２（図４Ａのレーン１２）は、異なる程度の左アーム二量体（Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｏｆａ−Ｆｃ１）、右アーム二量体（ＳＩＲＰα−Ｆｃ２）および／または多量体を示す。
備考：Ｄ１ｍは、ＳＩＲＰα細胞外トランケーションＤ１の高親和性変異体を表し、Ｄ１は、ヒトＳＩＲＰα野生型およびその非高親和性変異体の細胞外Ｄ１ドメインを表し、Ｆｃは、野生型Ｆｃ領域であり、Ｆｃ１は、ｈｏｌｅまたはｈｏｌｅｓ突然変異を有するＦｃ領域であり、Ｆｃ２は、ｋｎｏｂまたはｋｎｏｂｓ突然変異を有するＦｃ領域である。

実施例３ 標的親和性、標的競合結合活性の検出
１、ＣＤ４７、ＣＤ２０、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２標的親和性の検出方法
標的ＣＤ４７およびＣＤ２０に対する組換えタンパク質Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｆｃ２、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｄ２−Ｆｃ２、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ｏｂｉ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ｏｂｉ−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｆｃ２、Ｏｂｉ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ｏｂｉ−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｄ２−Ｆｃ２、Ｏｂｉ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２の結合親和性は、ＥＬＩＳＡおよび／またはフローサイトメトリーにより測定した。以下の方法では、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２を例とし、左アームがＣＤ２０標的である組換えタンパク質の検出に適用される。
組換えタンパク質Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２が、標的ＣＤ４７およびＨｅｒ２に対する結合親和性は、ＥＬＩＳＡおよび／またはフローサイトメトリーにより測定した。以下の方法では、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２を例とし、左アームがＨｅｒ２標的である組換えタンパク質の検出に適用される。
標的ＣＤ４７およびＥＧＦＲに対する組換えタンパク質Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２の結合親和性は、ＥＬＩＳＡおよび／またはフローサイトメトリーにより測定した。以下の方法では、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃを例とし、左アームがＥＧＦＲ標的である組換えタンパク質の検出に適用される。
標的ＣＤ４７およびＰＤ−Ｌ１に対する組換えタンパク質Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（Ａｔｅ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（Ａｔｅ）−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（Ａｔｅ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（Ａｔｅ）−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（Ａｔｅ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１３Ｇ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１３Ｇ４）−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１３Ｇ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１３Ｇ４）−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１３Ｇ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１２Ａ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１２Ａ４）−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１２Ａ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１２Ａ４）−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１２Ａ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２の結合親和性は、ＥＬＩＳＡおよび／またはにより測定した。以下の方法では、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（Ａｔｅ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２を例とし、左アームがＰＤ−Ｌ１標的である組換えタンパク質の検出に適用される。
ＥＬＩＳＡにより標的ＣＤ４７に対するＯｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２の親和性を検出：
酵素プレートを１００μｌの１μｇ／ｍｌのＣＤ４７−Ｈｉｓ（１２２８３−Ｈ０８Ｈ−２００、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）でコーティングし、４℃で一晩放置し、ＰＢＳＴ溶液（０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ）で洗浄した後、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡで室温で２時間ブロックし、洗浄した後、コーティングされた酵素プレートに希釈されたＯｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２（１０００ｎｇ／ｍｌから、２．５倍希釈、合計１１ポイント）をウェルあたり１００μｌにそれぞれ加え、２５℃で１時間インキュベートし、サンプルを捨てて、ＰＢＳＴ溶液で３回洗浄し、１００μｌの希釈マウス抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ−ＨＲＰ（１：１００００）（Ａｂ７４９９、ａｂｃａｍ）を加え、２５℃で１時間インキュベートし、溶液を捨ててＰＢＳＴ溶液で３回洗浄し、ＴＭＢ（Ｐ０２０９、ｂｅｙｏｔｉｍｅ）を加えて約２０分間遮光して発色させた後、Ｈ２ＳＯ４で反応を停止し、マイクロプレートリーダーでＯＤ（４５０−６５０ｎｍ）値を読み取った。
試験結果は、抗ＣＤ４７抗体Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４、ＳＩＲＰα Ｄ１−Ｆｃ、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｆｃ２、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｄ２−Ｆｃ２、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ｏｂｉ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ｏｂｉ−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｆｃ２、Ｏｂｉ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ｏｂｉ−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｄ２−Ｆｃ２、Ｏｂｉ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２がそれぞれＣＤ４７に結合することができ、ＣＤ４７に対するＯｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ｏｂｉ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ｏｂｉ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ｏｂｉ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２の結合親和性が略弱于ＣＤ４７に対する抗ＣＤ４７抗体Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４および／またはＳＩＲＰα Ｄ１−Ｆｃの結合親和性よりわずかに弱いことを示した。
以上の試験データは、本発明の組換えタンパク質がタンパク質レベルで腫瘍細胞のＣＤ４７抗原を特異的に標的とすることができ、ＣＤ４７への結合親和性は、ＣＤ４７タンパク質に対するＳＩＲＰα Ｄ１−Ｆｃ融合タンパク質の結合親和性より高くなく、本発明の組換えタンパク質は、抗ＣＤ４７抗体の治療による赤血球凝集、貧血および／またはＳＩＲＰα高親和性変異体治療による非腫瘍を標的とする細胞殺傷などの副作用を低減または回避することができることを証明した（Ｐｅｔｒｏｖａ ＰＳ， ｅｔ ａｌ． ＴＴＩ−６２１ （ＳＩＲＰαＦｃ）：Ａ ＣＤ４７−Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｉｎｎａｔｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｗｉｔｈ Ｂｒｏａｄ Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ． Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２０１７，２３（４）：１０６８−１０７９）。
例えば、図５に示したように、ＣＤ２０抗体Ｏｆａｔｕｍｕｍａｂおよび抗ＥＧＦＲ抗体ＪＭＴ１０１がＣＤ４７に結合できないこと以外に、抗ＣＤ４７抗体Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４、ＳＩＲＰα Ｄ１−Ｆｃ、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２はすべてＣＤ４７に結合することができるが、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２とＡｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２は、右アームのみがＣＤ４７抗原に結合することができるなどの原因により、その親和性（ＥＣ５０＝５２．５７ｎｇ／ｍＬ／ＥＣ５０＝９３．８６ｎｇ／ｍＬ）は、抗ＣＤ４７抗体（ＥＣ５０＝５．４３９ｎｇ／ｍＬ）と／ＳＩＲＰα Ｄ１−Ｆｃ（ＥＣ５０＝６．１１８ｎｇ／ｍＬ）より弱い。
フローサイトメトリーによる標的ＣＤ４７に対するＯｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２の親和性を検出：
Ａ４３１細胞（ヒト表皮癌細胞）、成長が良好な細胞を収集し、カウントし、遠心分離し、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏから購入）で３×１０６個の細胞／ｍｌの濃度に再懸濁した。細胞を１００μｌ／ウェルで９６ウェルプレートＵプレート（商品番号：３７９９、Ｃｏｒｎｉｎｇ）に加え、少なくとも１５分間放置し、遠心して上清を吸引し、９希釈度のＯｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２（１５０００ｎｇ／ｍｌから開始、５倍勾配希釈、合計９濃度）をそれぞれ加え、９６ウェルプレートを４℃の冷蔵庫で１時間インキュベートし、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳで洗浄した後、ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ−ＦＩＴＣ（Ｆ９５１２−２ＭＬ、Ｓｉｇｍａ）を加え、４℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳで洗浄および再懸濁した後、フローサイトメーター（Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６、ＢＤ）により蛍光値を測定した。
Ａ４３１細胞は、ＣＤ２０抗原を発現せず、Ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ、Ｏｂｉｎｕｔｕｚｕｍａｂに結合できないため、細胞レベルでＡ４３１細胞を用いてＯｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｆｃ２、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｄ２−Ｆｃ２、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ｏｂｉ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ｏｂｉ−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｆｃ２、Ｏｂｉ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ｏｂｉ−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｄ２−Ｆｃ２、Ｏｂｉ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２がＣＤ４７に対する結合親和性を評価することができる。
試験結果は、抗ＣＤ２０抗体Ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ、ＯｂｉｎｕｔｕｚｕｍａｂがＡ４３１に結合できないこと以外に、抗ＣＤ４７抗体Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４、ＳＩＲＰα Ｄ１−Ｆｃ、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｆｃ２、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｄ２−Ｆｃ２、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ｏｂｉ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ｏｂｉ−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｆｃ２、Ｏｂｉ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ｏｂｉ−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｄ２−Ｆｃ２、Ｏｂｉ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２はすべてＡ４３１細胞に結合することができ、ＣＤ４７に対するＯｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ｏｂｉ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ｏｂｉ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ｏｂｉ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２の結合親和性は、ＣＤ４７に対する抗ＣＤ４７抗体および／またはＳＩＲＰα Ｄ１−Ｆｃの結合親和性よりわずかに弱く、ＥＬＩＳＡのデータの傾向と一致することを示す。
以上の試験データは、本発明の組換えタンパク質がタンパク質レベルで腫瘍細胞ＣＤ４７抗原を特異的に標的とすることができ、ＣＤ４７への結合親和性は、ＣＤ４７タンパク質に対するＳＩＲＰα Ｄ１−Ｆｃ融合タンパク質の結合親和性より高くなく、本発明の組換えタンパク質は、抗ＣＤ４７抗体の治療による赤血球凝集、貧血および／またはＳＩＲＰα高親和性変異体治療に起因する非腫瘍を標的とする細胞殺傷などの副作用を低減または回避することができることを証明した。
例えば、図６に示したように、抗ＣＤ４７抗体Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４、ＳＩＲＰα Ｄ１−ＦｃおよびＯｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２はすべてＡ４３１細胞に結合することができる。具体的に、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２の親和性は、抗ＣＤ４７抗体および／またはＳＩＲＰα Ｄ１−Ｆｃよりわずかに弱く、ＥＬＩＳＡのデータの傾向と一致する。
フローサイトメトリーにより標的ＣＤ２０に対するＯｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２の親和性を測定：
Ｒａｊｉ細胞（ヒトＢ細胞リンパ腫）（上海科学院細胞バンクから購入）、成長が良好な細胞を収集し、カウントし、遠心分離し、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳで３×１０６個の細胞／ｍｌの濃度に再懸濁した。細胞を１００μｌ／ウェルで９６ウェルプレートＵプレート（商品番号：３７９９、Ｃｏｒｎｉｎｇ）に加え、少なくとも１５分間放置し、遠心して上清を吸引し、１００μＬのＰＢＳ＋２％ＦＢＳ（対照群）または１．５μｇ／ｍＬの抗ＣＤ４７抗体Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４（Ｆａｂ）２（実験群）（ペプシンによりＦｃを切除、キット：Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、４４９８８）を加え、４℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳで洗浄した後、７希釈度のＯｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４、ＳＩＲＰα Ｄ１−Ｆｃ（６２５０ｎｇ／ｍｌから開始、４倍 勾配希釈、合計７濃度、図７では形質転換後のモル濃度）をそれぞれ加え、４℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳで洗浄した後、ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ−ＦＩＴＣ（Ｆ９５１２−２ＭＬ、Ｓｉｇｍａ）を加え、４℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳで洗浄および再懸濁した後、フローサイトメーター（Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６、ＢＤ）により蛍光値を測定した。
試験結果は、抗ＣＤ４７抗体Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４（Ｆａｂ）２が、抗ＣＤ４７抗体Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４および／またはＳＩＲＰα Ｄ１−ＦｃとＲａｊｉ細胞上のＣＤ４７の結合を効果的にブロックすることができるが、ＣＤ４７抗原に対するＨｕ５Ｆ９−Ｇ４（Ｆａｂ）２のブロック作用は、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ｏｂｉ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ｏｂｉ Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ｏｂｉ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２とＲａｊｉ細胞の結合を有意に阻害しなかったことを示す。
以上の試験データは、腫瘍細胞表面のＣＤ４７抗原がブロックされ、ＳＩＲＰα−ＣＤ４７相互結合がブロックされた場合にも、本発明の組換えタンパク質は、左アームによって腫瘍細胞上の対応する抗原に特異的に結合することができ、左アーム親和性は、右アームの結合がブロックされたことによって影響を受けないことを証明した。
例えば、図７に示したように、抗ＣＤ４７抗体Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４（Ｆａｂ）２は、抗ＣＤ４７抗体Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４および／またはＳＩＲＰα Ｄ１−ＦｃとＲａｊｉ細胞上のＣＤ４７の結合を効果的にブロックすることができるが、ＣＤ４７抗原に対するＨｕ５Ｆ９−Ｇ４（Ｆａｂ）２のブロック作用は、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２とＲａｊｉ細胞の結合を有意に阻害せず、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２は、ＳＩＲＰα−ＣＤ４７の相互結合がブロックされた後にも、左アーム（抗ＣＤ２０不完全抗体）により、Ｒａｊｉ細胞上のＣＤ２０抗原と特異的に結合することができ、且つ親和性が右アーム結合によってブロックされたことにより、影響を受けなかったことを示す。
フローサイトメトリーにより標的ＣＤ２０とＣＤ４７の二重特異性結合状況を検出：
Ｒａｊｉ細胞（ヒトＢ細胞リンパ腫）（上海科学院細胞バンクから購入）、成長が良好な細胞を収集し、カウントし、遠心分離し、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳで３×１０６個の細胞／ｍｌの濃度に再懸濁した。細胞を１００μｌ／ウェルで９６ウェルプレートＵプレート（商品番号：３７９９、Ｃｏｒｎｉｎｇ）に加え、少なくとも１５分間放置し、遠心して上清を吸引し、１２希釈度のＯｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ、Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４、ＳＩＲＰα Ｄ１−Ｆｃ（５００００ｎｇ／ｍｌ、２５０００ｎｇ／ｍｌ、６２５０ｎｇ／ｍｌ、４倍勾配希釈、合計１２濃度、図８Ａは形質転換後のモル濃度）をそれぞれ加え、４℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳで洗浄した後、ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ−ＦＩＴＣ（Ｆ９５１２−２ＭＬ、Ｓｉｇｍａ）を加え、４℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳで洗浄および再懸濁した後、フローサイトメーター（Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６、ＢＤ）により蛍光値を検出した。
Ｒａｊｉ細胞表面に発現ＣＤ２０およびＣＤ４７抗原が同時に発現されるので、抗ＣＤ２０抗体Ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ、Ｏｂｉｎｕｔｕｚｕｍａｂ、抗ＣＤ４７抗体Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４およびＳＩＲＰα Ｄ１−Ｆｃはすべて、Ｒａｊｉ細胞に特異的に結合することができるが、最大の平均蛍光強度は、それぞれ異なる。
試験結果は、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｆｃ２、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｄ２−Ｆｃ２、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ｏｂｉ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ｏｂｉ−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｆｃ２、Ｏｂｉ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ｏｂｉ−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｄ２−Ｆｃ２、Ｏｂｉ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２もＲａｊｉ細胞に結合することができ、且つより高い最大の平均蛍光強度を有することを示す。
以上の試験データは、同じ過飽和タンパク質サンプル能動環境において、抗ＣＤ２０抗体Ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ、Ｏｂｉｎｕｔｕｚｕｍａｂおよび／または抗ＣＤ４７抗体Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４および／またはＳＩＲＰα Ｄ１−Ｆｃと比較して、本発明の組換えタンパク質は、腫瘍細胞に特異的に結合することができ、且つ有意な分子量の利点を示すことを証明した。好ましくは、同じ過飽和タンパク質サンプル濃度環境において、本発明の組換えタンパク質と腫瘍細胞の飽和結合度は、抗ＣＤ２０抗体およびＳＩＲＰα Ｄ１−Ｆｃと腫瘍細胞の飽和結合度の合計よりも大きい。
例えば、図８Ａと表４に示したように、抗ＣＤ２０抗体Ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ、抗ＣＤ４７抗体Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４とＳＩＲＰα Ｄ１−Ｆｃは、すべてＲａｊｉ細胞に特異的に結合することができるが、最大の平均蛍光強度はそれぞれ異なり、同時にＯｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２もＲａｊｉ細胞に結合することができ、且つより高い最大の平均蛍光強度を有することから、同じ過飽和タンパク質サンプル濃度環境において、Ｒａｊｉ細胞が特異的に結合することができるＯｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２タンパク質の数がそれぞれ抗ＣＤ２０抗体Ｏｆａｔｕｍｕｍａｂまたは抗ＣＤ４７抗体Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４またはＳＩＲＰα Ｄ１−Ｆｃの分子の数より高く、抗ＣＤ２０抗体Ｏｆａｔｕｍｕｍａｂと抗ＣＤ４７抗体Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４分子の数の合計より高く、および抗ＣＤ２０抗体ＯｆａｔｕｍｕｍａｂとＳＩＲＰα Ｄ１−Ｆｃ分子の数の合計より高いことを示唆する。
当業者に知られているように、以上の試験結果は、抗ＣＤ４７抗体またはＳＩＲＰα Ｄ１−Ｆｃと他の抗腫瘍標的治療抗体を組み合わせて使用することと比較して、本発明の腫瘍標的抗原とＣＤ４７抗原が同時結合した組換えタンパク質を使用することにより、より多くの腫瘍細胞を結合することができ、これによりさらに有意な抗腫瘍効果を獲得することを示唆した。
フローサイトメトリーにより標的Ｈｅｒ２とＣＤ４７の二重特異性の結合状況を検出：
ＳＫＢＲ−３細胞（ヒト乳癌細胞）（上海科学院細胞バンクから購入）、成長が良好な細胞を収集し、カウントし、遠心分離し、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳで細胞を２×１０６個の細胞／ｍｌの濃度に再懸濁した。細胞を１００μｌ／ウェルで９６ウェルプレートＵプレート（商品番号：３７９９、Ｃｏｒｎｉｎｇ）に加え、少なくとも１５分間放置し、遠心して上清を吸引し、１０希釈度のＡｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、ＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂおよびＨｕ５Ｆ９−Ｇ４（４３３．２ｎＭから開始、４倍勾配希釈、合計１０濃度）をそれぞれ加え、４℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳで洗浄した後、ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ−ＦＩＴＣ（Ｆ９５１２−２ＭＬ、Ｓｉｇｍａ）を加え、４℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳで洗浄および再懸濁した後、フローサイトメーター（Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６、ＢＤ）により蛍光値を検出した。
ＳＫＢＲ−３細胞表面にＨｅｒ２およびＣＤ４７抗原が同時に発現されるので、抗Ｈｅｒ２抗体Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ、Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ、抗ＣＤ４７抗体Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４およびＳＩＲＰα Ｄ１−Ｆｃは、すべてＳＫＢＲ−３細胞に特異的に結合することができるが、最大の平均蛍光強度は、それぞれ異なる。
試験結果は、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２もＳＫＢＲ−３細胞に結合することができ、且つより高い最大の平均蛍光強度を有することを示す。
以上の試験データは、同じ過飽和タンパク質サンプル濃度環境において、抗Ｈｅｒ２抗体Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ、Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂおよび／または抗ＣＤ４７抗体Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４および／またはＳＩＲＰα Ｄ１−Ｆｃと比較して、本発明の組換えタンパク質は、腫瘍細胞に特異的に結合することができ、且つ有意な分子の数の利点を示すことを証明した。好ましくは、同じ過飽和タンパク質サンプル濃度環境において、本発明の組換えタンパク質と腫瘍細胞の飽和結合度は、抗Ｈｅｒ２抗体およびＳＩＲＰα Ｄ１−Ｆｃと腫瘍細胞の飽和結合度の合計よりも大きい。
例えば、図８Ｂと表５に示したように、抗Ｈｅｒ２抗体Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂおよび抗ＣＤ４７抗体Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４は、すべてＳＫＢＲ−３細胞に特異的に結合することができるが、最大の平均蛍光強度はそれぞれ異なり、同時にＡｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２もＳＫＢＲ−３細胞に結合することができ、且つより高い最大の平均蛍光強度を有することから、同じ過飽和タンパク質サンプル濃度環境において、ＳＫＢＲ−３細胞が特異的に結合することができるＡｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２タンパク質の数が、それぞれ抗Ｈｅｒ２抗体Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂまたは抗ＣＤ４７抗体Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４の分子量より高く、抗Ｈｅｒ２抗体Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂおよび抗ＣＤ４７抗体Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４分子量の合計より高いことを示唆する。
当業者に知られているように、以上の試験結果は、抗ＣＤ４７抗体またはＳＩＲＰα Ｄ１−Ｆｃと他の抗腫瘍標的治療抗体を組み合わせて使用することと比較して、本発明の腫瘍標的抗原およびＣＤ４７抗原と同時に結合することができる組換えタンパク質を使用することにより、より多くの腫瘍細胞を結合することができ、これによりさらに有意な抗腫瘍効果を獲得することを示唆した。
フローサイトメトリーにより標的ＥＧＦＲとＣＤ４７の二重特異性の結合状況を検出：
Ａ４３１細胞（ヒト表皮癌細胞）（中国医学科学院の基礎医学研究所から購入）、成長が良好な細胞を収集し、カウントし、遠心分離し、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳで細胞を２×１０６個の細胞／ｍｌの濃度に再懸濁した。細胞を１００μｌ／ウェルで９６ウェルプレートＵプレート（商品番号：３７９９、Ｃｏｒｎｉｎｇ）に加え、少なくとも１５分間放置し、遠心して上清を吸引し、１１希釈度のＡｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、ＪＭＴ１０１、ＳＩＲＰαＤ１−ＦｃおよびＨｕ５Ｆ９−Ｇ４（２１６．６ｎＭから開始、４倍勾配希釈、合計１１個の濃度）をそれぞれ加え、４℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳで洗浄した後、ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ−ＦＩＴＣ（Ｆ９５１２−２ＭＬ、Ｓｉｇｍａ）を加え、４℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳで洗浄および再懸濁した後、フローサイトメーター（Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６、ＢＤ）により蛍光値を検出した。
Ａ４３１細胞表面にＥＧＦＲおよびＣＤ４７抗原が同時に発現されるので、抗ＥＧＦＲ抗体ＪＭＴ１０１、抗ＣＤ４７抗体Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４、ＳＩＲＰαＤ１−Ｆｃは、すべてＡ４３１細胞に特異的に結合することができるが、最大の平均蛍光強度は、それぞれ異なる。
試験結果は、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２もＡ４３１細胞に結合することができ、且つより高い最大の平均蛍光強度を有することを示す。
以上の試験データは、同じ過飽和タンパク質サンプル濃度環境において、抗ＥＧＦＲ抗体ＪＭＴ１０１および／または抗ＣＤ４７抗体Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４および／またはＳＩＲＰα Ｄ１−Ｆｃと比較して、本発明の組換えタンパク質は、腫瘍細胞に特異的に結合することができ、且つ有意な分子量の利点を示すことを証明した。好ましくは、同じ過飽和タンパク質サンプル濃度環境において、本発明の組換えタンパク質と腫瘍細胞の飽和結合度は、抗ＥＧＦＲ抗体およびＳＩＲＰα Ｄ１−Ｆｃと腫瘍細胞の対応する飽和結合度の合計よりも大きい。
例えば、図８Ｃと表６に示したように、抗ＥＧＦＲ抗体ＪＭＴ１０１、抗ＣＤ４７抗体Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４、ＳＩＲＰα Ｄ１−Ｆｃは、すべてＡ４３１細胞に特異的に結合することができるが、最大の平均蛍光強度はそれぞれ異なり、且つＥＣ５０はそれぞれＥＣ５０（ＪＭＴ１０１）＝０．５９８ｎＭ、ＥＣ５０（ＳＩＲＰα Ｄ１−Ｆｃ）＝３．６７７ｎＭ、ＥＣ５０（Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４）＝０．８６５ｎＭであることから、ＪＭＴ１０１とＡ４３１細胞の結合親和性は、ＳＩＲＰα Ｄ１−ＦｃとＡ４３１細胞の結合親和性の６倍以上であることが分かり、同時にＡｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２もＡ４３１細胞に結合することができ、且つより高い最大の平均蛍光強度を有することから、同じ過飽和タンパク質サンプル濃度環境において、Ａ４３１細胞が特異的に結合することができるＡｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２タンパク質の数がそれぞれ抗ＥＧＦＲ抗体ＪＭＴ１０１またはＳＩＲＰα Ｄ１−Ｆｃまたは抗ＣＤ４７抗体Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４的分子量より有意に高く、且つ抗ＥＧＦＲ抗体ＪＭＴ１０１およびＳＩＲＰα Ｄ１−Ｆｃの分子量の合計より高いことを示唆した。
当業者に知られているように、以上の試験結果は、抗ＣＤ４７抗体またはＳＩＲＰα Ｄ１−Ｆｃと他の抗腫瘍標的治療抗体を組み合わせて使用することと比較して、本発明の腫瘍標的抗原およびＣＤ４７抗原と同時に結合することができる組換えタンパク質を使用することにより、より多くの腫瘍細胞を結合することができ、これによりさらに有意な抗腫瘍効果を獲得することを示唆した。
フローサイトメトリーにより標的ＰＤ−Ｌ１とＣＤ４７の二重特異性の結合状況を検出：
ＮＣＩ−Ｈ４４１細胞（ヒト肺腺癌細胞）（北京北納創聯生物技術研究院から購入）、１０ｎｇ／ｍｌ ｈＩＦＮ−γ（ＢＤ、商品番号：５５４６１６）で２×１０７個の細胞を１８時間刺激し、細胞を消化して収集し、且つカウントし、遠心分離し、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳで細胞を３×１０６個の細胞／ｍｌの濃度に再懸濁した。細胞を１００μｌ／ウェルで９６ウェルプレートＵプレート（商品番号：３７９９、Ｃｏｒｎｉｎｇ）に加え、少なくとも１５分間放置し、遠心して上清を吸引し、１２希釈度のＡｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（Ａｔｅ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２およびＡｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ（４３３．２ｎＭ、２１６．６ｎＭ、そして４倍勾配希釈、合計１２個の濃度）をそれぞれ加え、４℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳで洗浄した後、ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ−ＦＩＴＣ（Ｆ９５１２−２ＭＬ、Ｓｉｇｍａ）を加え、４℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳで洗浄および再懸濁した後、フローサイトメーター（Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６、ＢＤ）により蛍光値を検出した。
ＮＣＩ−Ｈ４４１細胞表面に発現ＰＤ−Ｌ１およびＣＤ４７抗原が同時に発現されるので、抗ＰＤ−Ｌ１抗体Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ、１３Ｇ４、１２Ａ４、抗ＣＤ４７抗体Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４、ＳＩＲＰαＤ１−Ｆｃは、ＮＣＩ−Ｈ４４１細胞に特異的に結合することができる。
試験結果は、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（Ａｔｅ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（Ａｔｅ）−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（Ａｔｅ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（Ａｔｅ）−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（Ａｔｅ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１３Ｇ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１３Ｇ４）−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１３Ｇ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１３Ｇ４）−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１３Ｇ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１２Ａ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１２Ａ４）−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１２Ａ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１２Ａ４）−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１２Ａ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２もすべてＮＣＩ−Ｈ４４１細胞に結合することができ、且つより高い最大の平均蛍光強度を有することを示す。
以上の試験データは、同じ過飽和タンパク質サンプル濃度環境において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ、１３Ｇ４、１２Ａ４と比較して、本発明の組換えタンパク質は、腫瘍細胞に特異的に結合することができ、且つ一定の分子の数の利点を示すことを証明した。例えば、同じ過飽和タンパク質サンプル濃度環境において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂと比較して、本発明の組換えタンパク質は腫瘍細胞により多く結合し、有意な分子の数の利点を示す。
例えば、図８Ｄと表７に示したように、抗ＰＤ−Ｌ１抗体ＡｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂはＮＣＩ−Ｈ４４１細胞に特異的に結合することができ、同時にＡｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（Ａｔｅ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２もＮＣＩ−Ｈ４４１細胞に結合することができ、且つより高い最大の平均蛍光強度を有することから、同じ過飽和タンパク質サンプル濃度環境において、ＮＣＩ−Ｈ４４１細胞が特異的に結合することができるＡｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（Ａｔｅ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２タンパク質の数が抗ＰＤ−Ｌ１抗体Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂの分子量より高いことを示唆した。ＥＣ５０はそれぞれＥＣ５０（Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）＝０．２００６ｎＭ、ＥＣ５０（ＳＩＲＰα Ｄ１−Ｆｃ）＝１．６４３ｎＭ、ＥＣ５０（Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４）＝０．３８６５ｎＭであることから、ＡｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂとＮＣＩ−Ｈ４４１細胞の結合親和性は、ＳＩＲＰα Ｄ１−ＦｃとＮＣＩ−Ｈ４４１細胞の結合親和性の６倍以上であることが分かる。
当業者に知られているように、以上の試験結果は、抗ＣＤ４７抗体と他の抗腫瘍標的治療抗体を組み合わせて使用することと比較して、本発明の腫瘍標的抗原およびＣＤ４７抗原と同時に結合することができる組換えタンパク質を使用することにより、より多くの腫瘍細胞を結合することができ、これによりさらに有意な抗腫瘍効果を獲得することを示唆した。
２、標的の競合的結合の検出
以下の方法では、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２を例として、ＥＬＩＳＡにより標的ＣＤ４７とＳＩＲＰαの結合の競合的結合を測定した。
ＥＬＩＳＡによりＯｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２の競合的結合を検出：
酵素プレートを１００μｌの１μｇ／ｍｌのＣＤ４７−Ｈｉｓ（１２２８３−Ｈ０８Ｈ−２００、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）でコーティングし、４℃で一晩放置し、ＰＢＳＴで洗浄した後、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡで室温で２時間ブロックし、洗浄した後、コーティングされた酵素プレートに希釈された異なる濃度の（１０００ｎｇ／ｍｌから、３倍勾配希釈、合計１１個濃度）Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２とビオチン標識されたＳＩＲＰα Ｄ１−Ｆｃ（ビオチン標識キット、２１９２５、Ｔｈｅｒｍｏ、サンプル濃度は１００ｎｇ／ｍｌである）混合液を１ウェル当たり１００μｌにそれぞれ加え、２５℃で１時間インキュベートし、サンプルを捨てて、ＰＢＳＴ溶液で３回洗浄し、１００μｌの希釈されたストレプトアビジン−ＨＲＰ（１：１００００）（ＭＬ−０４３７Ｐ−ＨＲＰ、ＺＩ５０１−１研域化学試薬）を加えた後、２５で１時間インキュベートし、溶液を捨てて、ＰＢＳＴ溶液で３回洗浄し、ＴＭＢ（Ｐ０２０９，ｂｅｙｏｔｉｍｅ）を加えて約２０分間遮光して発色させた後、Ｈ２ＳＯ４で反応を停止し、マイクロプレートリーダーでＯＤ（４５０−６５０ｎｍ）値を読み取った。
試験結果は、抗ＣＤ４７抗体Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４、ＳＩＲＰα Ｄ１−Ｆｃ、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ｏｂｉ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ｏｂｉ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ｏｂｉ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（Ａｔｅ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（Ａｔｅ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（Ａｔｅ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１３Ｇ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１３Ｇ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１３Ｇ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１２Ａ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１２Ａ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１２Ａ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２が、ビオチン標識されたＳＩＲＰα Ｄ１−Ｆｃと異なる程度でＣＤ４７抗原に競合的に結合して、競合的結合を発揮することができることを示した。
例えば、図９に示したように、抗ＣＤ４７抗体Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４、ＳＩＲＰα Ｄ１−Ｆｃ、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２およびＡｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２はすべて、ビオチン標識されたＳＩＲＰα Ｄ１−ＦｃとＣＤ４７抗原に競合的に結合して、競合的結合活性を発揮することができ、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２とＣＤ４７の競合的結合力はそれぞれ、抗ＣＤ４７抗体Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４またはＳＩＲＰα Ｄ１−Ｆｃより弱く、これは、本実施例で前述した親和性の結果と一致する。
実施例４ 組換えタンパク質の初期インビトロ免疫安全性の評価実験
組換えタンパク質：Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｆｃ２、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（Ａｔｅ）−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（Ａｔｅ）−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１３Ｇ４）−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１３Ｇ４）−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１２Ａ４）−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１２Ａ４）−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｄ２−Ｆｃ２の初期インビトロ免疫安全性の評価実験において、以下の方法では、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｆｃ２を例とし、右アームにＳＩＲＰα細胞外トランケーション高親和性変異体を含む組換えタンパク質の検出に適した。
Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ｏｂｉ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ｏｂｉ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ｏｂｉ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（Ａｔｅ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（Ａｔｅ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（Ａｔｅ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１３Ｇ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１３Ｇ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１３Ｇ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１２Ａ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１２Ａ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１２Ａ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２の初期インビボ免疫安全性の評価実験において、以下の方法では、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２を例とし、右アームにＳＩＲＰα細胞外トランケーションを含む組換えタンパク質の検出に適した。
フローサイトメトリーにより二重抗体特異的右アーム突然変異の前後のＣＤ４７との特異的結合状況を検出：
ＮＣＩ−Ｈ４４１細胞（ヒト肺腺癌細胞）（北京北納創聯生物技術研究院から購入）、細胞を消化して収集し、且つカウントし、遠心分離し、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳで細胞を３×１０６個の細胞／ｍｌの濃度に再懸濁した。細胞を１００μｌ／ウェルで９６ウェルプレートＵプレート（商品番号：３７９９、Ｃｏｒｎｉｎｇ）に加え、少なくとも１５分間放置し、遠心して上清を吸引し、１２希釈度のＯｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｆｃ２、Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４、Ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ（４３３．２ｎＭ、２１６．６ｎＭ、そして４倍勾配希釈、合計１２個の濃度）をそれぞれ加え、４℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳで洗浄した後、ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ−ＦＩＴＣ（Ｆ９５１２−２ＭＬ、Ｓｉｇｍａ）を加え、４℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳで洗浄および再懸濁した後、フローサイトメーター（Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６、ＢＤ）により蛍光値を検出した。
例えば、図１０と表８に示したように、抗ＣＤ２０抗体ＯｆａｔｕｍｕｍａｂがＣＤ４７に結合できない以外に、抗ＣＤ４７抗体Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｆｃ２はすべてＣＤ４７に結合することができ、且つＯｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｆｃ２（ＥＣ５０＝０．５２９ｎＭ）とＮＣＩ−Ｈ４４１細胞の結合親和性は、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２（ＥＣ５０＝８．６８ｎＭ）より高く、ここで、Ｄ１ｍは、Ｄ１領域でのＳＩＲＰαの高親和性変異体（即ち、ＣＮ１０６５１９０３６Ａの配列番号１０）である。
組換えタンパク質の初期インビトロ免疫安全性の評価実験
（１）ヒトエフェクター細胞懸濁液を製造：
ＣＤ１６ａの安定且つ高発現する成長が良好なヒトＮＫ９２ＭＩ−ＣＤ１６ａエフェクター細胞（華博バイオから購入）を取り、遠心分離して（２０１ｇ、５ｍｉｎ）、上清を捨てて、５ｍｌ ＭＥＭ（フェノールレッドフリー）基礎培地（Ｇｉｂｃｏから購入、５１２００−０３８）に再懸濁し、カウントした後、ＭＥＭ（フェノールレッドフリー）基礎培地で標的細胞密度を２．４×１０６個の細胞／ｍｌまで調整して、ヒトエフェクター細胞懸濁液として使用した。
（２）エフェクター細胞と抗体のインキュベーション：
５０μｌ／ウェルのＭＥＭ（フェノールレッドフリー）基礎培地を９６ウェル黒底移植プレートの対応するウェルに分註し、希釈されたＯｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２またはＯｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｆｃ２二重特異性抗体をそれぞれ希釈勾配２５μｌ／ウェルに加え、マルチウェルを設定した。（１）で製造されたヒトエフェクター細胞懸濁液２５μｌ（６００００個の細胞／ウェル）を加えた。均一に混合した後、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２またはＯｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｆｃ２二重特異性抗体が最終濃度勾配（４３３．２ｎＭから開始、４倍勾配希釈、合計１０の濃度）に達し、そして３７℃で５．５時間反応させ、溶解バッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ由来キット、Ｇ７８９１）を対照群に加えて０．５時間インキュベートした。
（３）ＡＤＣＣ活性を検出：
インキュベーションが完了した後、プレートを安全キャビネットに置き、蓋を開けて、約１５分間自然に室温まで冷却した。室温で３０分間平衡化したＬＤＨ基質反応溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ由来キット、Ｇ７８９１）をウェルあたり１００μｌに加え、穏やかに混合し、室温で１５分間インキュベートした後、すぐに停止溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ由来キット、Ｇ７８９１）５０μｌ／ウェルを加え、均一に混合した後、マイクロプレートリーダーにより蛍光値を読み取った。
試験結果は、ＮＫ細胞上にＣＤ４７抗原の発現があるので、ＡＤＣＣ活性を有するＣＤ４７を標的とする組換えタンパク質および／または抗体は、ＮＫ細胞の相互殺傷作用をもたらした。従って、ＳＩＲＰα細胞外トランケーション高親和性変異体を含むＯｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｆｃ２またはＯｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｄ２−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｄ２−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｄ２−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｄ２−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（Ａｔｅ）−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（Ａｔｅ）−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｄ２−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１３Ｇ４）−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１３Ｇ４）−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｄ２−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１２Ａ４）−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１２Ａ４）−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｄ２−Ｆｃ２、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２またはＯｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２またはＯｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２またはＯｂｉ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２またはＯｂｉ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２またはＯｂｉ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（Ａｔｅ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（Ａｔｅ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（Ａｔｅ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１３Ｇ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１３Ｇ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１３Ｇ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１２Ａ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１２Ａ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１２Ａ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２と比較して、ＣＤ４７抗原との弱い親和作用により、ＮＫ細胞によって引き起こされる毒性副作用を有意に低減させ、毒性副作用を少なくとも１０００倍低減させることを示した。
例えば、図１１に示したように、抗体／組換えタンパク質の濃度が１０−１ｎＭに達した場合、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｆｃ２では細胞溶解が開始し、抗体／組換えタンパク質の濃度が１０３ｎＭに達した場合，Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｆｃ２の細胞分解率は１５．２５％に達し、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２が１０３ｎＭである場合、細胞溶解を観察できなかった。
当業者に知られているように、以上の試験結果は、本発明に記載のＡＤＣＣ活性を有し、且つ低親和性のＣＤ４７を標的とする抗原の組換えタンパク質がより高い免疫安全性を有することを示唆した。
当業者に知られているように、以上の試験結果は、本発明に記載の最適化した後のＡＤＣＣ活性検出を使用した方法（即ち、初期のインビトロ免疫安全性の評価実験）は、ＣＤ４７を標的とし、且つＡＤＣＣ活性を有する組換えタンパク質（一価または多価を含む）または抗体（一価または多価を含む）の初期免疫安全性を評価するために使用することができ、当該評価方法は、簡単で迅速であり、血液源によって制限されないことを示唆した。
実施例５ 組換えタンパク質のインビボで腫瘍細胞の成長を阻害する実験
組換えタンパク質：Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ｏｂｉ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ｏｂｉ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ｏｂｉ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（Ａｔｅ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（Ａｔｅ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（Ａｔｅ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１３Ｇ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１３Ｇ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１３Ｇ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１２Ａ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１２Ａ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１２Ａ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２インビボで腫瘍細胞の成長を阻害する実験において、以下の方法では、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２を例とし、右アームにＳＩＲＰα細胞外トランケーションを含む組換えタンパク質の検出に適した。
オスＮＳＧマウス（ＩＤＭＯから購入）にヒトＢ細胞リンパ腫Ｒａｊｉ細胞を皮下接種し、腫瘍細胞を接種して、腫瘍組織が８０ｍｍ３−１５０ｍｍ３に達した後、以下の２群（１群当たりに６匹のマウス、各群に標識用量を腹腔内に注射した）に分けた：１）溶媒対照群（トリスクエン酸塩、ｐＨ ６．５）、２）Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２群（１５０μｇ／匹）、週２回、合計２週間投与した。投与前（０日）、投与後第３日、第５日、第７日、第１０日、第１２日、第１４日に、それぞれ腫瘍の成長状況を観察し、腫瘍の大きさを測定して、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２の抗腫瘍効果を評価した。
試験結果は、Ｒａｊｉリンパ腫皮下移植のＮＳＧマウスモデルで、組換えタンパク質Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ｏｂｉ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ｏｂｉ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ｏｂｉ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（Ａｔｅ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（Ａｔｅ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（Ａｔｅ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１３Ｇ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１３Ｇ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１３Ｇ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１２Ａ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１２Ａ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１２Ａ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２は、ＣＤ４７−ＳＩＲＰαシグナル伝達経路をブロックすることにより、マクロファージを標的とする食作用および／またはマクロファージを介した抗体依存性細胞の食作用（Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ，ＡＤＣＰ）を活性化して、有意な腫瘍阻害効果を示す。
例えば、図１２に示したように、横軸は、Ｒａｊｉリンパ腫皮下移植したＮＳＧマウスが薬物処理を受けた時間（日）であり、縦軸は、腫瘍体積（ｍｍ３）である。図１２は、一定の薬物Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２治療期間後、溶媒対照群と比較して、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２群は、有意な腫瘍阻害傾向を示し、ここで、第１４日目のＯｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２群の阻害率は、６３．１４％に達することができた。
当業者に知られているように、以上の試験結果は、本発明に記載の腫瘍を標的とする抗原およびＣＤ４７抗原と同時に結合することができる組換えタンパク質が、腫瘍細胞皮下移植したＮＳＧマウスインビボで有意な腫瘍抑制効果を得ることができることを示唆した。

実施例６ 組換えタンパク質のインビボ初期免疫安全性の評価実験
組換えタンパク質Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｆｃ２、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（Ａｔｅ）−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（Ａｔｅ）−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１３Ｇ４）−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１３Ｇ４）−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１２Ａ４）−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１２Ａ４）−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｄ２−Ｆｃ２のインビボで初期免疫安全性の評価において、以下の方法では、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｆｃ２を例とし、右アームにＳＩＲＰα細胞外トランケーション高親和性変異体を含む組換えタンパク質の検出に適した。
組換えタンパク質Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ｏｂｉ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ｏｂｉ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ｏｂｉ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（Ａｔｅ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（Ａｔｅ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（Ａｔｅ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１３Ｇ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１３Ｇ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１３Ｇ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１２Ａ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１２Ａ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１２Ａ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２インビボ初期免疫安全性の評価、以下の方法では、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２を例とし、右アームにＳＩＲＰα細胞外トランケーションを含む組換えタンパク質の検出に適した。
Ｂ細胞でのＣＤ２０抗原の高発現のために、本実験ではＢ細胞含有量を測定することにより、腫瘍細胞の殺傷状況を代表した。他の腫瘍抗原およびＣＤ４７抗原を標的とする組換えタンパク質インビボ初期免疫安全性を評価する場合、本実施例に記載の実験マウスに対応する腫瘍細胞を皮下移植する必要がある。
腫瘍特異的標的化作用：
ヒトＣＤ３４＋ ＨＳＣ移植メスＮＳＧ（Ｈｕ−ＮＳＧ）マウス（ＩＤＭＯから購入）を選択し、以下の３群に（１群あたり３匹のマウス、各群に標識用量に静脈注射した）分けた：１）０．９％の生理食塩水対照群、２）Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４（６．７μｇ／匹）群、３）Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２（５μｇ／匹）群、１回投与し、投与して９６時間後に、ヘパリンナトリウムを含む抗凝固剤チューブに、８０μｌの血液をマウスの尾静脈から採取し、新たに調製した赤血球溶解液で赤血球を溶解し（ここで、赤血球溶解液は溶解液である（ＢＤ Ｐｈａｒｍ ＬｙｓｅＴＭ、商品番号：５５５８９９）：ダブル蒸し水等量に混合して調製）、残りの細胞をＰＢＳ＋２％ＦＢＳで洗浄して再懸濁し、蛍光抗体（ＰＥ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＣＤ４５（商品番号：３０４０３９）／ＦＩＴＣ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＣＤ１９（商品番号：３０２２０６）／ＡＰＣ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＣＤ３（商品番号：３００３１２）、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄから購入）と細胞と共に３０分間インキュベートし、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳで洗浄および再懸濁した後、フローサイトメーター（ＡｃｃｕｒｉＴＭ Ｃ６、ＢＤ）により検出した。
試験結果は、同じ用量のＯｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２と抗ＣＤ４７抗体Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４をＨｕ−ＮＳＧマウスモデルに使用し、投与９６時間後、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２が発現ＣＤ２０抗原を発現するＢ細胞（即ち、標的細胞）を優先的に除去し、抗ＣＤ４７抗体Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４は、ＣＤ４７抗原との高親和性作用により、Ｔ細胞などの高いＣＤ４７発現量を持つ非標的細胞を優先的に除去することを示した。
例えば、図１３に示したように、０．９％の生理食塩水（図１３Ａ）と比較して、抗ＣＤ４７抗体Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４（図１３Ｂ）は、ＣＤ４７発現量が比較的に高い非標的細胞（例えば、T細胞）が有意に除去し（すべての検出細胞において、Ｂ細胞、即ち、ＣＤ２０抗原標的細胞の割合が投与前の４０．９％から投与９６時間後の７３．５％に上昇した）、０．９％の生理食塩水（図１３Ａ）と比較して、組換えタンパク質Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２（図１３Ｃ）は、Ｂ細胞（即ち、ＣＤ２０抗原標的細胞）が有意に除去され、即ち、投与９６時間後、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２は、Ｂ細胞（すべての検出細胞において、Ｂ細胞の割合が投与前の４０．９％から投与９６時間後の３．７％に低下した）を優先的に除去した。
当業者に知られているように、以上の試験結果は、本発明に記載の腫瘍標的抗原およびＣＤ４７抗原と同時に結合することができる組換えタンパク質が、同じ用量条件下で腫瘍標的抗原が位置される細胞および／または腫瘍細胞を優先的に除去することを示唆した。
低用量での免疫安全性：
ヒトＣＤ３４＋ ＨＳＣ移植ＮＳＧ（Ｈｕ−ＮＳＧ）メスマウス（ＩＤＭＯから購入）を選択し、以下の２群に（１群あたり３匹のマウス、各群に標識用量に静脈注射した）分けた：１）Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２（１μｇ／匹）群、２）Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｆｃ２（１μｇ／匹）群、１回投与し、投与して２７時間後に、ヘパリンナトリウムを含む抗凝固剤チューブに８０μｌの血液をマウスの尾静脈から採取し、新たに調製した赤血球溶解液で赤血球を溶解し（ここで、赤血球溶解液は溶解液である（ＢＤ Ｐｈａｒｍ ＬｙｓｅＴＭ、商品番号：５５５８９９）：ダブル蒸し水等量に混合して調製）、残りの細胞をＰＢＳ＋２％ＦＢＳで洗浄して再懸濁し、蛍光抗体（ＰＥ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＣＤ４５（商品番号：３０４０３９）／ＦＩＴＣ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＣＤ１９（商品番号：３０２２０６）／ＡＰＣ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＣＤ３（商品番号：３００３１２）、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄから購入）と細胞と共に３０分間インキュベートし、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳで洗浄および再懸濁した後、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２（１μｇ／匹）群サンプルをフローサイトメーター（ＡｃｃｕｒｉＴＭ Ｃ６、ＢＤ）により検出し、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｆｃ２（１μｇ／匹）群サンプルをフローサイトメーター（ＮｏｖｏＣｙｔｅＴＭ ３１３０、ＡＣＥＡ）により検出した。
試験結果は、Ｈｕ−ＮＳＧマウスモデルで低用量の組換えタンパク質を使用し、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ｏｂｉ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ｏｂｉ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ｏｂｉ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（Ａｔｅ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（Ａｔｅ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（Ａｔｅ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１３Ｇ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１３Ｇ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１３Ｇ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１２Ａ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１２Ａ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１２Ａ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２を一回投与して７２時間後、左アーム抗原を発現する標的細胞（例えば、腫瘍細胞）が有意に除去され、左アーム抗原を発現しない細胞（例えば、Ｔ細胞、他の免疫細胞）では明らかな影響が見だされなく、ＳＩＲＰα細胞外トランケーション高親和性変異体を含むＯｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｄ２−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｄ２−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｄ２−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｄ２−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（Ａｔｅ）−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（Ａｔｅ）−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｄ２−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１３Ｇ４）−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１３Ｇ４）−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｄ２−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１２Ａ４）−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１２Ａ４）−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｄ２−Ｆｃ２を一回投与して７２時間後、左アーム抗原を発現する標的細胞（例えば、腫瘍細胞）は有意に除去されたが、左アーム抗原を発現しない細胞（例えば、Ｔ細胞、他の免疫細胞）も有意に除去されたことを示す。
例えば、図１４に示されたように、投与前（図１４Ａ、図１４Ｂ）と比較して、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２を一回投与して７２時間（図１４Ｃ、図１４Ｄ）において、Ｂ細胞（ＣＤ２０抗原標的細胞）が有意に除去され（ほぼ完全に除去された）、ＣＤ２０抗原を発現しない細胞（例えば、Ｔ細胞、他の免疫細胞）では明らかな影響が見だされなかった。投与前（図１４Ｅ、図１４Ｆ）と比較して、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１ｍ−Ｆｃ２を一回投与して７２時間（図１４Ｇ、図１４Ｈ）は、Ｂ細胞（ＣＤ２０抗原標的細胞）は有意に除去されたが、ＣＤ２０抗原を発現しない細胞（例えば、Ｔ細胞、他の免疫細胞）も有意に除去された。
当業者に知られているように、以上の試験結果は、同じ用量条件下で、右アームにＳＩＲＰα細胞外トランケーション高親和性変異体を含む組換えタンパク質と比較して、右アームにＳＩＲＰα細胞外トランケーションを含む組換えタンパク質は、より高い腫瘍特異的標的化作用を有し、より高い免疫安全性を示した。
高用量下の免疫回復作用：
ヒトＣＤ３４＋ ＨＳＣ移植ＮＳＧ（Ｈｕ−ＮＳＧ）メスマウス（ＩＤＭＯから購入）を選択し、以下の２群に（１群あたり３匹のマウス、各群に標識用量に静脈注射した）：１）Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４（２００μｇ／匹）群、２）Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２（１５０μｇ／匹）群、１回投与し、投与４日後、投与１４日後に、ヘパリンナトリウムを含む抗凝固剤チューブに８０μｌの血液をマウスの尾静脈から採取し、新たに調製した赤血球溶解液で赤血球を溶解し（ここで、赤血球溶解液は溶解液である（ＢＤ Ｐｈａｒｍ ＬｙｓｅＴＭ、商品番号：５５５８９９）：ダブル蒸し水体積に混合して調製）、残りの細胞をＰＢＳ＋２％ＦＢＳで洗浄して再懸濁し、蛍光抗体（ＰＥ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＣＤ４５（商品番号：３０４０３９）／ＦＩＴＣ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＣＤ１９（商品番号：３０２２０６）／ＡＰＣ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＣＤ３（商品番号：３００３１２）、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄから購入）と細胞と共に３０分間インキュベートし、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳで洗浄および再懸濁した後、フローサイトメーター（ＡｃｃｕｒｉＴＭ Ｃ６、ＢＤ）により検出した。
試験結果は、Ｈｕ−ＮＳＧマウスモデルで高用量のＯｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２またはＯｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２またはＯｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２またはＯｂｉ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２またはＯｂｉ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２またはＯｂｉ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（Ａｔｅ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（Ａｔｅ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（Ａｔｅ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１３Ｇ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１３Ｇ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１３Ｇ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１２Ａ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１２Ａ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１２Ａ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２および抗ＣＤ４７抗体Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４を使用し、一回投与して９６時間後、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ｏｂｉ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ｏｂｉ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ｏｂｉ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（Ａｔｅ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（Ａｔｅ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（Ａｔｅ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１３Ｇ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１３Ｇ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１３Ｇ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１２Ａ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１２Ａ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１２Ａ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２および抗ＣＤ４７抗体Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４は、Ｂ細胞（ＣＤ２０抗原標的細胞）および非標的細胞（例えば、Ｔ細胞および他の免疫細胞）の大部分が除去された状況が見だされることを示した。１４日後、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２またはＯｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２またはＯｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２またはＯｂｉ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２またはＯｂｉ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２またはＯｂｉ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（Ａｔｅ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（Ａｔｅ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（Ａｔｅ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１３Ｇ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１３Ｇ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１３Ｇ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１２Ａ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１２Ａ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２またはＡｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１２Ａ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２群のマウスにおいて、そのＢ細胞（ＣＤ２０抗原標的細胞）はまだ除去された状態であるが、ＣＤ４７を発現する他の非標的細胞（例えば、Ｔ細胞）は有意に回復され、抗ＣＤ４７抗体Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４群のマウスにおいて、Ｂ細胞（ＣＤ２０抗原標的細胞）またはＣＤ４７を発現する非標的細胞にかかわらず回復されなかった。
例えば、図１５に示されたように、高用量の抗ＣＤ４７抗体Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４（図１５Ａ）およびＯｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２（図１５Ｂ）は、投与して９６時間後にすべてＢ細胞（ＣＤ２０抗原標的細胞）およびＣＤ４７を発現する非標的細胞（例えば、Ｔ細胞）が大量に除去されたが、１４日後、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２（図１５Ｄ）群マウスは、Ｂ細胞（ＣＤ２０抗原標的細胞）は除去された状態であるが、Ｂ細胞（ＣＤ２０抗原標的細胞）以下のＣＤ４７を発現する非標的細胞（例えば、Ｔ細胞）は、有意に回復され、抗ＣＤ４７抗体Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４（図１５Ｃ）群マウスにおいて、そのＢ細胞（ＣＤ２０抗原標的細胞）、ＣＤ４７を発現する非標的細胞（例えば、Ｔ細胞）はすべて回復兆候がなかった。
当業者に知られているように、以上の試験結果は、本発明に記載の腫瘍を標的とする抗原およびＣＤ４７抗原と同時に結合することができる組換えタンパク質において、そのＣＤ４７を発現する非標的細胞（例えば、Ｔ細胞などの免疫細胞）は、高用量投与条件下で、回復性を有し、当該組換えタンパク質はより高い免疫安全性を有することを示唆した。
当業者に知られているように、以上の試験結果は、本発明に記載のインビボ初期免疫安全性を使用して、ＣＤ４７を標的とする組換えタンパク質（一価または多価を含む）または抗体（一価または多価を含む）の初期免疫安全性を評価することができることを示唆した。

実施例７ 標的親和性結合活性に対する異なるトランケーションの影響
組換えタンパク質Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ｏｂｉ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ｏｂｉ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ｏｂｉ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（Ａｔｅ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（Ａｔｅ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（Ａｔｅ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１３Ｇ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１３Ｇ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１３Ｇ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１２Ａ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１２Ａ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１２Ａ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２は、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２及びＡｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２を例とし、左アームに同じ長さ、右アームに異なる長さのＳＩＲＰα細胞外トランケーションを使用した組換えタンパク質に適用される。
フローサイトメトリーにより標的Ｈｅｒ２およびＣＤ４７の二重特異性結合状況を検出：
ＳＫＢＲ−３細胞（ヒト乳癌細胞）（上海科学院細胞バンクから購入）、成長が良好な細胞を収集し、カウントし、遠心分離し、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳで２×１０６個の細胞／ｍｌの濃度に再懸濁した。細胞を１００μｌ／ウェルで９６ウェルプレートＵプレート（商品番号：３７９９、Ｃｏｒｎｉｎｇ）に加え、少なくとも１５分間放置し、遠心して上清を吸引し、１１希釈度のＡｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２およびＡｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２（４３３．２ｎＭから開始、４倍勾配希釈、合計１１濃度）をそれぞれ加え、４℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳで洗浄した後、ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ−ＦＩＴＣ（Ｆ９５１２−２ＭＬ、Ｓｉｇｍａ）を加え、４℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳで洗浄および再懸濁した後、フローサイトメーター（Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６、ＢＤ）により蛍光値を検出した。
ＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂとＰｅｒｔｕｚｕｍａｂがそれぞれＨｅｒ２抗原の異なるエピトープに作用し、且つ二つの抗原エピトープと細胞膜の間の距離に大きな違いがあるので、組換えタンパク質Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２は、すべてＳＫＢＲ−３細胞に特異的結合することができるが、結合親和性および達する最大の平均蛍光強度はそれぞれ異なる。
試験結果は、ＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂとＨｅｒ２抗原エピトープ（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ Ｍ Ｗ， ｅｔ ａｌ． Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｔｈｒｅｅ Ｄｉｓｔｉｎｃｔ ＨＥＲ２ Ｄｏｍａｉｎｓ ｗｉｔｈ ａ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｏｖｅｒｃｏｍｅｓ Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， ２０１５， １４（３）：６６９−６８０）との距離が細胞膜表面により近いので、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２とＳＫＢＲ−３細胞親和性は、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２より優れたことを示す。ＰｅｒｔｕｚｕｍａｂとＨｅｒ２抗原エピトープ（Ｈｅｒ２細胞外第ＩＩドメイン）との距離が細胞膜表面により遠いので、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２とＳＫＢＲ−３細胞親和性は、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２と同等である。
以上の試験データは、右アームの異なる長さのトランケーションからなる組換えタンパク質は、組換えタンパク質と標的細胞の親和性を影響することを証明した。近位膜エピトープに結合する左アームにおいて、右アームが短いＳＩＲＰαトランケーションを選択する場合、二重標的に結合する組換えタンパク質の能力が大幅に向上される。しかし、遠位膜エピトープに結合する左アームにおいて、右アームは、短いＳＩＲＰαトランケーションを選択すると利点を失い、左アーム抗原標的が細胞膜から遠いほど、右アームのＳＩＲＰαトランケーションは、長くなることにより最適な一致に達することができる。
例えば、図１６に示したように、ＳＫＢＲ−３細胞に結合する能力は、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２（ＥＣ５０＝２．０４ｎＭ）がＡｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２（ＥＣ５０＝２５．９５ｎＭ）（図１６Ａ）より有意に優れている。ＳＫＢＲ−３細胞に結合する能力（ＥＣ５０＝１５．２２ｎＭ）は、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２がＡｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２（ＥＣ５０＝１１．０３ｎＭ）に相当する（図１６Ｂ）。
当業者に知られているように、以上の試験結果は、標的抗原空間エピトープと標的細胞膜の表面の距離に従って、右アームが適切な的長さのヒトＳＩＲＰα細胞外トランケーションを適合的に選択することにより、組換えタンパク質と標的細胞の結合能力を効果的に向上させることができることを示唆した。
実施例８ 組換えタンパク質急性毒性試験
組換えタンパク質Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ｏｂｉ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ｏｂｉ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ｏｂｉ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（Ａｔｅ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（Ａｔｅ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（Ａｔｅ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１３Ｇ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１３Ｇ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１３Ｇ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１２Ａ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１２Ａ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１２Ａ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２の急性毒性試験において、以下の方法では、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２を例とし、右アームにＳＩＲＰα細胞外トランケーションを含む組換えタンパク質の検出に適した。
注射用Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２緩衝液（トリスクエン酸塩、ｐＨ ６．５）で適切な量のＯｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２溶液（４．０２ｍｇ／ｍＬ）を０．２５ｍｇ／ｍＬおよび２．５ｍｇ／ｍＬにそれぞれ希釈し、それぞれ実験動物第１群と第２群に投与した。
健康な４匹のメスカニクイザルは、広西桂東霊長類開発実験有限公司から購入し、４歳であり、広西壮族自治区科学技術庁によって上記実験動物の生産が許可され、実験動物の製造ライセンス番号は、ＳＣＸＫ桂２０１６−０００１である。投与前に、詳細な臨床観察と計量が行われ、異常は観察されなかった。体重の範囲は、投与当日は、２．４７〜２．８５ｋｇであった。
４匹のメスカニクイザルを２群に分け、１群当たり２匹、静脈内注射により投与し、投与量は、０．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇであり、投与体積は、２ｍＬ／ｋｇである。実験設計は、表９に示した。投与当日に一回投与し、投与後に２８日間観察し続けた。カニクイザルは、ケージごとに１つずつ、ステンレス製の移動ケージで飼養した。毎日約１２時間の明暗交互の照明を提供した。実験用のサル用配合飼料はＢｅｉｊｉｎｇ Ｋｅａｏ Ｘｉｅｌｉ Ｆｅｅｄ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入し、特定の絶食を除いて動物は試験中自由に食べさせた。特定の微生物、重金属、残留農薬について当該バッチの飼料は、上海ペニーテストテクノロジー有限会社（ＰＯＮＹ）によって検出した。試験中にすべての動物は水筒を介して水を自由に飲み、飲料水は、逆浸透システムでろ過した純水を使用し、計量スタッフが飲料水のｐＨ、硬度、重金属、微生物を検出した。
試験中にすべての試験動物を１日２回（朝と午後に１回）観察し、観察は、罹患、損傷、死亡、および給水給食状況を含むがこれらに限定されない。すべての試験動物は、試験前に１回の詳細な臨床観察を受けた。試験中にすべての実験動物に対して、投与後、詳細な臨床観察を少なくとも１日１回実施した。観察内容は、罹患、死亡率、損傷、および給水給食状況、皮膚、毛、目、耳、鼻、口、胸、腹部、外性器、手足、呼吸器および循環器系、自律神経効果（例えば、唾液分泌）神経系（例えば、振戦、痙攣、ストレス反応、異常行動など）を含むが、これらに限定されない。動物の体重は、Ｄ−１（投与前）、Ｄ１、Ｄ４、Ｄ８、Ｄ１１、Ｄ１５、Ｄ１８、Ｄ２２、Ｄ２５および解剖の前にそれぞれ測定した。２４時間以内（２４時間±１時間）の動物の食物消費量は、Ｄ２、Ｄ４、Ｄ８、Ｄ１１、Ｄ１５、Ｄ１８、Ｄ２２、Ｄ２５でそれぞれ測定した。心電図測定は、Ｄ−１、Ｄ２、Ｄ１４、およびＤ２８で、５０ｍｍ／秒の記録速度で標準ＩＩリード（８リード）を使用して実行した。
臨床病理学サンプルの収集と血液学、凝固、血液生化学およびリンパ球タイピングは、投与前（Ｄ−１）、投与後Ｄ２、Ｄ７、Ｄ１４およびＤ２８で行った。２８日目に尿サンプルを採取し、尿を分析した。
サンプルを採取する前に、すべての動物を一晩（少なくとも１０時間）絶食させたが、水は禁止されなかった。大腿静脈（４．５〜６ｍＬ）から血液サンプルを収集し、そのうち約１．８ｍＬの全血をクエン酸ナトリウムを含む抗凝固剤チューブに入れ、凝固分析に使用し、約１ｍＬの全血を血液分析のためにＫ３−ＥＤＴＡを含む抗凝固剤チューブに入れ、約２ｍＬの全血を、血液生化学分析のために分離ゲル血液採取チューブ（抗凝固剤なし）に入れ、標準的な操作手順に従って血清を遠心分離した。同時に、投与前Ｄ−１、投与後Ｄ２分離した後の血清サンプルを、フローサイトメトリーによりＴ／Ｂ細胞タイピング検出を行った。
Ｄ２９で動物を安楽死させ、心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓の組織、肝臓、肺（主気管支を含む）、腎臓、脾臓、心臓、副腎、下垂体、甲状腺、副甲状腺、胸腺、卵巣、子宮（子宮頸部を含む）、脳などの組織の重量を量った。
Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２それぞれ０．５ｍｇ／ｋｇおよび５ｍｇ／ｋｇの用量で一回静脈内投与した場合、投与後に２８日観察し続けた結果、動物に有意な薬物関連の異常は観察されず、この期間中、動物の摂食量と体重は正常範囲内で変動し、動物の血液凝固、尿、心電図関連の試験データは投与前と比較して、投与後に有意な変化を示されず、動物を解剖した後、すべての臓器は通常正常範囲内で観察され、動物の臓器重量、内臓係数、および臓脳比率も正常範囲内にある。
投与後Ｄ２、低用量群と高用量群のリンパ球数とリンパ球の割合は大幅に減少し、Ｄ７後に正常レベルに戻ったが、この変化は薬物効果に関連している可能性がある。
組換えタンパク質Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ｏｂｉ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ｏｂｉ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ｏｂｉ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（Ａｔｅ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（Ａｔｅ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（Ａｔｅ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１３Ｇ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１３Ｇ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１３Ｇ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１２Ａ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１２Ａ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１２Ａ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２は、同じ用量でＯｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２の上記結果と類似する。
図１８Ａおよび表１０に示したように、０．５ｍｇ／ｋｇと５ｍｇ／ｋｇの二つの用量のＯｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２は、カニクイザル赤血球の数に影響を与えなかった。図１８Ｂおよび表１０に示したように、０．５ｍｇ／ｋｇと５ｍｇ／ｋｇの二つの用量のＯｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２は、カニクイザルヘモグロビンに影響を与えなかった。
組換えタンパク質Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ｏｂｉ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ｏｂｉ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ｏｂｉ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（Ａｔｅ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（Ａｔｅ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（Ａｔｅ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１３Ｇ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１３Ｇ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１３Ｇ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１２Ａ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１２Ａ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１２Ａ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２は、同じ用量でカニクイザル赤血球の数およびヘモグロビンに対する影響は、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２の上記結果と類似する。
図１９に示したように、Ｔ／Ｂ細胞タイピング検出結果によると、０．５ｍｇ／ｋｇと５ｍｇ／ｋｇの２用量のＯｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２は、動物のＢ細胞（ＣＤ２０抗原標的細胞）が有意に除去されることを引き起こすことができる。
当業者に知られているように、以上の試験結果は、本発明に記載の腫瘍標的抗原とＣＤ４７抗原と同時に結合することができる組を一回投与した後、動物に有意な薬物関連の異常は観察されず、この期間中、動物の摂食量と体重は正常範囲内で変動し、動物の血液凝固、尿、心電図関連の試験データは投与前と比較して、投与後に有意な変化を示されず、動物を解剖した後、すべての臓器は通常正常範囲内で観察され、動物の臓器重量、内臓係数、および臓脳比率も正常範囲内にあることを示唆した。
当業者に知られているように、以上の試験結果は、本発明に記載の腫瘍標的抗原とＣＤ４７抗原に同時に結合することができる組換えタンパク質は、一回投与した後、動物赤血球の数およびヘモグロビンに影響を与えなかったことを示唆した。
当業者に知られているように、以上の試験結果は、本発明に記載の腫瘍標的抗原とＣＤ４７抗原に同時に結合することができる組換えタンパク質は、同じ用量下で腫瘍標的抗原が位置される細胞および／または腫瘍細胞を優先的に除去することを示唆した。

実施例９ 組換えタンパク質のインビボでの腫瘍成長阻害実験
組換えタンパク質Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ｏｂｉ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ｏｂｉ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ｏｂｉ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（Ａｔｅ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（Ａｔｅ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（Ａｔｅ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１３Ｇ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１３Ｇ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１３Ｇ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１２Ａ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１２Ａ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１２Ａ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２のインビボでの腫瘍成長阻害実験において、以下の方法では、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２を例とし、右アームにＳＩＲＰα細胞外トランケーションを含む組換えタンパク質の検出に適した。
Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２：無色透明液体、濃度１．１４−４．０２ｍｇ／ｍｌ、−８０℃で分注して保存し、リツキシマブ＜登録商標＞（リツキシマブ単クローン注射液）：無色透明液体、仕様１００ｍｇ／１０ｍｌ、ロット番号Ｈ０２０５、２−８℃で遮光保存した。調製緩衝液（トリスクエン酸塩、ｐＨ ６．５）：無色透明液体，２−８℃で保存した。調製方法：Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、リツキシマブ＜登録商標＞はすべて調製緩衝液で希釈し；調製緩衝液を溶剤として直接投与した。
細胞：ＣＤ２０陽性ヒトＢ細胞リンパ腫Ｄａｕｄｉ細胞は、中国科学院細胞バンクから購入した。培養条件は、ＲＰＭＩ １６４０培地に１０％ウシ胎仔血清およびペニシリン、ストレプトマイシンを加え、３７℃で５％ＣＯ２空気を含むインキュベーターで培養した。週に２回継代した後、細胞が指数関数的増殖期にあるとき、細胞を収集し、カウントし、接種した。
実験動物：メスＮＯＤ−ＳＣＩＤマウス、６−７週、上海Ｌｉｎｇｃｈａｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入した。製造ライセンス番号：ＳＣＸＫ（滬）２０１３−００１８；動物証明書番号２０１３００１８２９４６３、２０１３００１８２７５４５。飼養環境：ＳＰＦレベル。本実験動物の使用と福祉は、「国際実験動物管理公認協会（ＡＡＡＬＡＣ）」の規定に従って実施した。動物の健康状態と死亡率を毎日監視し、定期検査には、行為活動、体重の変化、外観の兆候など、動物の毎日の行動に対する被験物質と薬物の効果の観察が含まれる。
各マウスに１．５×１０７Ｄａｕｄｉ細胞を皮下接種し、接種後１８日目に平均腫瘍体積が１００〜１５０ｍｍ３に達したときに、腫瘍体積に応じて群分けて投与した（Ｄ０）。マウスに（ＩＶ）薬剤を静脈内注射し、溶剤群には同量の溶剤を注射し、注射体積は０．１ｍＬ／１０ｇ体重であり、投与量と投与スケジュールについては表１２を参照する。
ノギスで腫瘍径を週に２回測定し、腫瘍体積（Ｖ）の計算式は以下の通りである。
腫瘍体積（Ｖ）計算式：
Ｖ＝１／２×ａ×ｂ２
ここで、ａ、ｂは、それぞれ長さ、広さを表す。
Ｔ／Ｃ（％）＝（Ｔ−Ｔ０）／（Ｃ−Ｃ０）×１００
ここで、Ｔ、Ｃは、実験終了時の腫瘍体積であり、Ｔ０、Ｃ０は、実験開始時の腫瘍体積であり、Ｔは、投与群であり、Ｃは、対照群である。
腫瘍抑制率（ＴＧＩ）（％）＝１００−Ｔ／Ｃ（％）。
腫瘍が消え始まると、腫瘍抑制率（ＴＧＩ）（％）＝１００−（Ｔ−Ｔ０）／Ｔ０×１００
腫瘍が初期体積よりも小さい場合、即ち、Ｔ＜Ｔ０またはＣ＜Ｃ０である場合、腫瘍部分的消失（ＰＲ）と定義され、腫瘍が完全に消失した場合、完全腫瘍消失（ＣＲ）と定義される。
実験終了後、または当動物の腫瘍体積が１５００ｍｍ３の安楽死エンドポイントに達したとき、二酸化炭素麻酔により動物を屠殺し、腫瘍を解剖して写真を撮った。
２群の腫瘍体積または腫瘍重量の比較は、両側Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ検定を使用して行われ、Ｐ＜０．０５は統計的に有意な差として定義された。
Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２（５ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ、週２回、５回）は、Ｄａｕｄｉ皮下移植腫瘍の成長を有意に抑制し、腫瘍抑制率は８０．８％であり、１／６マウスの腫瘍は部分的に消失した。Ｄａｕｄｉ皮下移植腫瘍に対するリツキシマブ＜登録商標＞（７ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ、週２回、５回）の腫瘍抑制率は２４．５％である。腫瘍を有するマウスは、一般に上記の薬物により耐性が高かった（表１２、図２０、２１、２２）。
Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２和リツキシマブ＜登録商標＞は、ＣＤ２０陽性ヒトＢ細胞リンパ腫Ｄａｕｄｉ細胞皮下移植腫瘍の成長に対して異なる阻害効果を有し、ここで、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２はリツキシマブ＜登録商標＞よりも有意に優れ、腫瘍を有するマウスは一般に上記の薬物により耐性が高いことが分かる。
組換えタンパク質Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ｏｂｉ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ｏｂｉ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ｏｂｉ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｐ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２（Ｔ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（Ａｔｅ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（Ａｔｅ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（Ａｔｅ）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１３Ｇ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１３Ｇ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１３Ｇ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１２Ａ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１２Ａ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃ２、Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（１２Ａ４）−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｆｃ２は、同じ用量下でＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスにインビボ移植された腫瘍の抗腫瘍効果および組換えタンパク質に対するマウスの耐性は、Ｏｆａ−Ｆｃ１−Ｄ１−Ｆｃ２の上記結果と類似する。
当業者に知られているように、以上の試験結果は、本発明に記載の腫瘍標的抗原とＣＤ４７抗原に同時に結合することができる組換えタンパク質は、同じ用量下で腫瘍を標的とする抗体と比較して、マウスインビボで予想外に有意な抗腫瘍効果を有することを示唆した。
本実験動物の使用と福祉は、「国際実験動物管理公認協会（ＡＡＡＬＡＣ）」の規定に従って実施した。動物の健康状態と死亡率を毎日監視し、定期検査には、行為活動、体重の変化、外観の兆候など、動物の毎日の行動に対する被験物質と薬物の効果の観察が含まれる。
本明細書で提供されるあらゆる実施例または例示的な言語（例えば、「など」）の使用は、本発明をよりよく説明するためであり、特に請求されない限り、本発明の範囲を限定しない。明細書中の言語は、保護要求されていない要素が本発明の実施に不可欠であることを示すものとして解釈されるべきではない。
本明細書で引用されるすべての刊行物および特許出願は、個々の出版物または特許出願が、具体的かつ個別に参照により組み込まれるように、参照により本明細書に全体として組み込まれる。なお、本明細書に記載の理論、メカニズム、証拠、または発見は、本発明の理解をさらに高めることを意図しており、いずれかの方法によって本発明をそのような理論、メカニズム、、証拠、または発見に限定されることを決して意図していない。本発明は、図面および前述の説明において詳細に示され説明されたが、本発明は例示的であり、限定的ではないとみなされるべきである。

Claims (17)

  1. 高親和性の腫瘍を標的とするアームと、低親和性のＣＤ４７とＳＩＲＰαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質とを含み、
    前記高親和性の腫瘍を標的とするアームはＣＤ４７に結合せず、かつ腫瘍細胞上の標的抗原に対する前記高親和性の腫瘍を標的とするアームに対応する抗体の結合親和性は、腫瘍細胞上のＣＤ４７に対する低親和性のＣＤ４７とＳＩＲＰαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質に対応するモノマー融合タンパク質ホモダイマーの結合親和性の少なくとも６倍であり、
    ＣＤ４７に対する前記低親和性のＣＤ４７とＳＩＲＰαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質の結合親和性は、ＣＤ４７に対するＳＩＲＰα細胞外トランケーションを含むモノマー融合タンパク質のホモダイマーの結合親和性より高くなく、前記ＳＩＲＰα細胞外トランケーションは、ヒトＳＩＲＰα野生型細胞外トランケーションまたはＣＤ４７非高親和性突然変異のヒトＳＩＲＰα細胞外トランケーションを含む、二重特異性組換えタンパク質。
  2. 前記低親和性のＣＤ４７とＳＩＲＰαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質は、ＳＩＲＰα細胞外トランケーションを含み、前記ＳＩＲＰα細胞外トランケーションは下記ａ１）−ａ４）から選択されるいずれかの一つのアミノ酸配列を含み、ａ１）配列番号３０、ａ２）配列番号３１、ａ３）配列番号３２、ａ４）前記アミノ酸配列のいずれかの一つのアミノ酸配列が例えば１〜５個のアミノ酸残基を挿入、欠損、修飾および／または保守的置換することを経て獲得されるアミノ酸配列であって、そのモノマーは、ＣＤ４７タンパク質に対する結合親和性を有し、且つ当該結合親和性は、ＣＤ４７タンパク質に対するａ１）、ａ２）またはａ３）モノマーの結合親和性より高くないアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の二重特異性組換えタンパク質。
  3. 前記二重特異性組換えタンパク質は、相対的に設定される左、右のアーム構造を有し、前記高親和性の腫瘍を標的とするアームは、左アームの位置に位置され、前記低親和性のＣＤ４７とＳＩＲＰαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質は、右アームの位置に位置され、好ましくは、前記左アームは、免疫グロブリンのＦａｂまたはＦａｂ’形態であり、前記右アームは、ＳＩＲＰα細胞外トランケーションである、請求項１又は２に記載の二重特異性組換えタンパク質。
  4. 前記右アームの長さは、標的細胞膜の表面から左アームが結合する必要がある抗原空間エピトープの距離に適合し、好ましくは、前記高親和性の腫瘍を標的とするアームが標的細胞の近位膜エピトープに結合する必要がある場合、前記ＳＩＲＰα細胞外トランケーションは、ａ１）〜ａ４）中の比較的に短いアミノ酸配列を選択して含む、請求項３に記載の二重特異性組換えタンパク質。
  5. 前記高親和性の腫瘍を標的とするアームの標的化の標的は、５Ｔ４、ＡＧＳ−１６、ＡＬＫ１、ＡＮＧ−２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ｃ−ｆｍｓ、ｃ−Ｍｅｔ、ＣＡ６、ＣＤ１２３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ９８、ＣＥＡ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＬＤＮ１８．２、ＣＬＤＮ６、ＣＳ１、ＣＸＣＲ４、ＤＬＬ−４、ＥＧＦＲ、ＥＧＰ−１、ＥＮＰＰ３、ＥｐｈＡ３、ＥＴＢＲ、ＦＧＦＲ２、ＦＮ、ＦＲ−α、ＧＣＣ、ＧＤ２、ＧＰＣ−３、ＧＰＮＭＢ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＬＡ−ＤＲ、ＩＣＡＭ−１、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＬ−３Ｒ、ＬＩＶ−１、ＭＳＬＮ、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ１、ＮａＰｉ２ｂ、ネクチン−４、Ｎｏｔｃｈ ２、Ｎｏｔｃｈ １、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＰＤＧＦＲ−α、ＰＳ、ＰＳＭＡ、ＳＬＴＲＫ６、ＳＴＥＡＰ１、ＴＥＭ１、ＶＥＧＦＲ、ＣＤ２５、ＣＤ２７Ｌ、ＤＫＫ−１、ＣＳＦ−１Ｒ、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ、ＢＣＭＡ、ＣＤ１３８から選択され、
    好ましくは、前記標的がＣＤ２０、ＥＧＦＲまたはＰＤ−Ｌ１である場合、前記ＳＩＲＰα細胞外トランケーションは、ａ１）を選択し、前記標的がＨＥＲ２である場合、前記ＳＩＲＰα細胞外トランケーションは、ａ１）またはａ２）を選択する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の二重特異性組換えタンパク質。
  6. 高親和性の腫瘍を標的とするアームと低親和性のＣＤ４７とＳＩＲＰαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質は、分子の間の作用力によって結合され、または鎖間ジスルフィド結合のような共有結合によって結合され、またはイオン結合によって結合され、または上記の結合方法における二つまたは三つの組み合わせによって結合される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の二重特異性組換えタンパク質。
  7. Ｆｃ領域をさらに含み、好ましくは、前記Ｆｃ領域は、Ｆｃ領域天然配列またはＦｃ非天然配列を含み、より好ましくは、前記Ｆｃ領域は、ヒトＦｃ領域であり、さらにより好ましくは、高親和性の腫瘍を標的とするアームと低親和性のＣＤ４７とＳＩＲＰαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質の結合は、ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓによって結合される、請求項６に記載の二重特異性組換えタンパク質。
  8. 前記高親和性の腫瘍を標的とするアームは、標的化の標的が、５Ｔ４、ＡＧＳ−１６、ＡＬＫ１、ＡＮＧ−２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ｃ−ｆｍｓ、ｃ−Ｍｅｔ、ＣＡ６、ＣＤ１２３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ９８、ＣＥＡ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＬＤＮ１８．２、ＣＬＤＮ６、ＣＳ１、ＣＸＣＲ４、ＤＬＬ−４、ＥＧＦＲ、ＥＧＰ−１、ＥＮＰＰ３、ＥｐｈＡ３、ＥＴＢＲ、ＦＧＦＲ２、ＦＮ、ＦＲ−α、ＧＣＣ、ＧＤ２、ＧＰＣ−３、ＧＰＮＭＢ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＬＡ−ＤＲ、ＩＣＡＭ−１、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＬ−３Ｒ、ＬＩＶ−１、ＭＳＬＮ、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ１、ＮａＰｉ２ｂ、ネクチン−４、Ｎｏｔｃｈ ２、Ｎｏｔｃｈ １、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＰＤＧＦＲ−α、ＰＳ、ＰＳＭＡ、ＳＬＴＲＫ６、ＳＴＥＡＰ１、ＴＥＭ１、ＶＥＧＦＲ、ＣＤ２５、ＣＤ２７Ｌ、ＤＫＫ−１、ＣＳＦ−１Ｒ、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ、ＢＣＭＡ、ＣＤ１３８から選択される不完全抗体であり、好ましくは、ＩｇＧ１抗体の不完全抗体であり、選択的に、ヒトマウスキメラ不完全抗体、ヒト化不完全抗体、完全ヒト不完全抗体であり、より好ましくは、ヒト化または完全ヒトＩｇＧ１抗体の不完全抗体である、請求項７に記載の二重特異性組換えタンパク質。
  9. 低親和性のＣＤ４７とＳＩＲＰαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質は、下記ｂ１）−ｂ４）から選択されるいずれかの一つのアミノ酸配列を含み、ｂ１）配列番号２６、ｂ２）配列番号２７、ｂ３）配列番号２８、ｂ４）前記アミノ酸配列のいずれかの一つのアミノ酸配列が例えば１〜５個のアミノ酸残基を挿入、欠損、修飾および／または保守的置換することを経て獲得されるアミノ酸配列であって、そのホモダイマーは、ＣＤ４７タンパク質に対する結合親和性を有し、且つ当該結合親和性は、ＣＤ４７タンパク質に対するｂ１）、ｂ２）またはｂ３）ホモダイマーの結合親和性より高くないアミノ酸配列を有する、請求項７又は８に記載の二重特異性組換えタンパク質。
  10. 高親和性の腫瘍を標的とするアームがＣＤ２０を標的とする場合、前記高親和性の腫瘍を標的とするアームは、配列番号１６と配列番号１７を含み、前記低親和性のＣＤ４７とＳＩＲＰαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質は、配列番号２６を含み、
    高親和性の腫瘍を標的とするアームがＥＧＦＲを標的とする場合、前記高親和性の腫瘍を標的とするアームは、配列番号１９と配列番号８を含み、前記低親和性のＣＤ４７とＳＩＲＰαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質は、配列番号２６を含み、
    高親和性の腫瘍を標的とするアームがＨｅｒ２を標的とする場合、前記高親和性の腫瘍を標的とするアームは、配列番号２０と配列番号２１、または配列番号２２と配列番号２３を含み、前記低親和性のＣＤ４７とＳＩＲＰαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質は、配列番号２６または配列番号２７を含み、または、
    高親和性の腫瘍を標的とするアームがＰＤ−Ｌ１を標的とする場合、前記高親和性の腫瘍を標的とするアームは、配列番号２４と配列番号１３を含み、前記低親和性のＣＤ４７とＳＩＲＰαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質は、配列番号２６を含む、請求項９に記載の二重特異性組換えタンパク質。
  11. 請求項１〜１０のいずれか１項の二重特異性組換えタンパク質をコードする核酸分子であって、
    好ましくは、前記高親和性の腫瘍を標的とするアームをコードする核酸分子と前記低親和性のＣＤ４７とＳＩＲＰαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質をコードする核酸は、同じＤＮＡ鎖に位置され、または前記高親和性の腫瘍を標的とするアームをコードする核酸分子と前記低親和性のＣＤ４７とＳＩＲＰαの相互作用をブロッキングする融合タンパク質をコードする核酸は、異なるＤＮＡ鎖に位置される、核酸分子。
  12. 請求項１１の核酸分子を含む、発現ベクター。
  13. 請求項１２の発現ベクターを含む、宿主細胞。
  14. 請求項１３に記載の細胞を用いて前記組換えタンパク質を発現させる、前記二重特異性組換えタンパク質の製造方法。
  15. 腫瘍を治療するための薬物の製造における請求項１〜１０のいずれか１項に記載の二重特異性組換えタンパク質の用途であって、
    好ましくは、前記腫瘍は、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、膵臓癌、食道癌、子宮内膜癌、卵巣癌、胃癌、前立腺癌、腎臓癌、子宮頸癌、骨髄腫、リンパ腫、白血病、甲状腺癌、子宮癌、膀胱癌、神経内分泌癌、頭頸部癌、肝臓癌、鼻咽頭癌、精巣癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、黒色腫、基底細胞皮膚癌、扁平上皮細胞癌、皮膚線維肉腫、メルケル細胞癌、膠芽腫、神経膠腫、肉腫、中皮腫または骨髄異形成症候群などの血液腫瘍および固形腫瘍から選択される、用途。
  16. ａ）標的とされ、ＡＤＣＣ活性を有する組換えタンパク質／抗体（一価または多価を含む）を提供するステップと、
    ｂ）前記組換えタンパク質／抗体のＡＤＣＣ活性を検出するステップと、
    ｃ）前記組換えタンパク質／抗体の初期免疫安全性を評価するステップとを含み、
    好ましくは、ステップａ）とステップｂ）の間に、
    ａ１）ヒトＮＫ９２ＭＩ−ＣＤ１６ａエフェクター細胞などであるが、これに限定されないエフェクター細胞を製造するステップと、
    ａ２）エフェクター細胞を組換えタンパク質／一価または多価抗体を含む抗体と接触させるステップとをさらに含み、
    より好ましくは、前記ａ１）において、獲得されたエフェクター細胞を１×１０５個の細胞／ｍｌ乃至５×１０６個の細胞／ｍｌの細胞密度に再懸濁させ、前記ａ２）において、勾配希釈した組換えタンパク質／抗体を、ａ１）で製造されたエフェクター細胞と０．５〜５ｈインキュベートし、前記ｂ）において、ＬＤＨ活性を測定し、細胞分解率を計算し、および／または，前記ｃ）において、細胞分解率に従って組換えタンパク質／抗体の初期免疫安全性を評価し、ここで、細胞分解率を低下させる組換えタンパク質／抗体の免疫安全性が高い、ＣＤ４７を標的とし、且つＡＤＣＣ活性を有する組換えタンパク質／抗体の初期免疫安全性のインビトロ評価方法。
  17. ａ）ＣＤ４７を標的とする組換えタンパク質／一価または多価抗体を含む抗体を提供するステップと、
    ｂ）Ｈｕ−ＮＳＧマウスを提供するステップと、
    ｃ）前記組換えタンパク質／抗体をＨｕ−ＮＳＧマウスと接触させるステップと、
    ｄ）前記Ｈｕ−ＮＳＧマウスにおける前記組換えタンパク質／抗体の初期免疫安全性を評価するステップとを含み、
    好ましくは、前記ｃ）において、２４〜９６時間の投与後、マウス静脈血を採取し、赤血球を分解し、残りの細胞を蛍光標識した抗ヒトＣＤ４５、抗ヒトＣＤ１９または抗ヒトＣＤ３の抗体とともに１５〜６０ｍｉｎインキュベートし、フローサイトメトリー検出を行い、前記ｄ）において、細胞クリアランスに従って組換えタンパク質／抗体の初期免疫安全性を評価し、ここで、免疫細胞クリアランスを低下させる組換えタンパク質／抗体の免疫安全性が高い、ＣＤ４７を標的とする組換えタンパク質／抗体の初期免疫安全性のインビボ評価方法。
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