TWI808693B

TWI808693B - 製備γ-氨基丁酸的方法，以及製備包含γ-氨基丁酸之機能飲料之方法

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Publication number: TWI808693B
Application number: TW111110717A
Authority: TW
Inventors: 張郁彬; 黃喬盈; 王迺詒; 賴進此
Original assignee: 財團法人食品工業發展研究所
Priority date: 2022-03-23
Filing date: 2022-03-23
Publication date: 2023-07-11
Also published as: TW202338097A

Abstract

本案提供一種麴菌及酵母菌、利用麴菌製備γ-氨基丁酸(GABA)的方法，及將藉由麴菌發酵的麴菌發酵物配合酵母菌以製造含有GABA的機能飲料之方法。利用麴菌製備GABA的方法包括將麴菌加入至麴菌基礎培養基發酵，以獲得含GABA之麴菌發酵物。製造含有GABA的機能飲料的方法包含將麴菌加入至麴菌基礎培養基發酵以得到麴菌發酵物，再將麴菌發酵物與飲料培養基混合得到機能飲料培養基後，加入酵母菌進行第二階段發酵，以得到含GABA的機能飲料。透過上述方法，可生產GABA以及具有GABA的機能飲料。

Description

製備γ-氨基丁酸的方法，以及製備包含γ-氨基丁酸之機能飲料之方法

本發明係關於一種製備γ-氨基丁酸(GABA)的方法。具體而言，關於一種藉由麴菌複合酵母菌的製程，以製備γ-氨基丁酸以及製備包含γ-氨基丁酸之機能飲料之方法。

γ-氨基丁酸(γ-Aminobutyric Acid，簡稱GABA)，為一種非蛋白質的天然胺基酸，存在植物、動物和微生物中，主要是透過麩胺酸脫羧酶(Glutamate decarboxylase,GAD)催化麩胺酸脫羧生成。GABA的生產方法有化學合成法、酵素法、微生物發酵法等，多種微生物均發現了麩胺酸脫羧酶的存在，因此，使用微生物發酵法來生產GABA，相較於化學合成方法和植物富化GABA方法，具有成本低、產量高及可安全用於食品等優點。微生物發酵法一般是以麩胺酸、或其鈉鹽、或富含麩胺酸的物質為原料，再利用酵母菌、真菌或乳酸菌等微生物進行發酵而獲得。GABA已被證實具有多種生理功效，包含降血壓、安定神經、增強記憶、抗焦慮等，因此發展含GABA之機能性食品十分具有市場潛力。

隨著健康意識的抬頭，機能啤酒市場也逐漸成長，低酒精、低嘌呤、低熱量和天然風味啤酒(無人工香料添加)受到消費者喜愛，促使精釀啤酒多元化的發展，全球新品啤酒也朝向獨特風味或保健型態開發，多樣化的產品吸引了新的消費族群，也擴展了啤酒飲品市場。目前機能啤酒主要是從上游菌種突變或基因工程方式建構低酒精生產之酵母菌株，開發無酒精、低酒精啤酒系列產品，或透過調味方式(無添加酵母菌進行發酵)生產，或是酵母菌發酵後再以其他加工去除酒精，或佐以水果或香料的添加，作為風味來源，或添加二氧化碳方式製備擁有類似啤酒口感的產品。

綜上所述，一種能夠簡單製備GABA的方法，或是在製備機能飲料時能夠直接含有GABA的方法是被市場所需求的。

為了達成上述之目的，本案提供了一種製備γ-氨基丁酸(GABA)的方法，其包含：將一麴菌(Monascus pilosus)與一麴菌基礎培養基中進行發酵，以得到含GABA的麴菌發酵物；其中該麴菌係為BCRC31527或BCRC 31505。

較佳地，該麴菌基礎培養基包括一碳源、一氮源、一胺基酸鈉鹽及米原料。

較佳地，該碳源為葡萄糖、蔗糖或其組合。

較佳地，該氮源為動物來源蛋白腖、植物來源蛋白腖或其組合。

較佳地，該米原料為糙米、白米或發芽米。

較佳地，其中以該麴菌基礎培養基的重量為基礎，該麴菌基礎培養基包括0.1~5wt%之碳源、0.1~3wt%之氮源、0.5-5.0wt%之胺基酸鹽及1.0~5.0wt%之米原料。

依據本發明的另一目的，還提供了一種製造含γ-氨基丁酸(GABA)的飲料之方法，其包括：將前述方法所製得的一麴菌發酵物加至一飲料培養基以得到一機能飲料培養基，再將培養於一酵母菌基礎培養基中的一酵母菌加入該機能飲料培養基中後進行第二階段發酵。

較佳地，該酵母菌係為Saccharomyces cerevisiae BCRC21377或BCRC 21800。

較佳地，該麴菌與該酵母菌的組合為BCRC31527與BCRC 21377的組合、BCRC31527與BCRC 21800的組合或BCRC 31505與BCRC 21377的組合。

較佳地，該飲料培養基包含麥汁及蔗糖。

較佳地，該麴菌發酵物與該飲料培養基的體積比為2：8至4：6。

較佳地，發酵時間為7至14天，溫度為25℃。

藉由上述技術特徵，本發明至少提供以下優點：

(1)提供一種簡單製備GABA的方法，可以提升GABA產量，降低生產成本。

(2)提供了一種製造含GABA的飲料的方法，可以在製造飲料時使其含有GABA，節省另外添加的成本，並且減少製造步驟。

本發明的上述以及其它目的、特徵與優點，在參照以下的詳細說明與較佳實施例和隨文檢附的圖式後，將變得明顯。

S10~S50:步驟

圖1係為依據本發明實施例的製備GABA的方法流程圖。

圖2係為依據本發明實施例的製造含GABA的機能飲料的方法流程圖。

圖3係為依據本發明實施例的使用麴菌基礎培養基及麴菌進行發酵，以篩選具有GABA潛力之麴菌的發酵物在第7天(左)及第11天(右)的外觀。

圖4係為依據本發明實施例的以麴菌基礎培養基進行發酵的麴菌發酵物在第7天及第11天以HPLC法測得的GABA含量。

圖5係為依據本發明實施例藉由平板快速篩選具有GABA生產潛力之酵母菌落的外觀。

圖6係為依據本發明實施例的將酵母菌以飲料培養基進行發酵的發酵物在第7天及第14天以HPLC法測得的GABA含量。

圖7係為依據本發明實施例的使用麴菌基礎培養基加入麴菌進行發酵的麴菌發酵物在第7天(a)及第14天(b)的外觀。

圖8係為依據本發明實施例的以麴菌基礎培養基進行發酵的麴菌發酵物在第7天以HPLC法測得的GABA含量。

圖9係為依據本發明實施例的以麴菌基礎培養基進行發酵的麴菌發酵物在第14天以HPLC法測得的GABA含量。

圖10係為依據本發明實施例的3種米原料經不同麴菌發酵14天的麴菌發酵物所測得的平均GABA含量。

圖11係為依據本發明實施例，使用麴菌基礎培養基(白米)，並使用有溝槽搖瓶於25℃發酵14天的麴菌發酵物的外觀。

圖12係為依據本發明實施例，使用麴菌基礎培養基(白米)，並使用有溝槽搖瓶於25℃發酵14天的GABA含量。

圖13係為依據本發明實施例的15種經不同麴菌與酵母菌發酵7天所得飲料的外觀。

圖14係為依據本發明實施例的15種經不同麴菌與酵母菌發酵7天所得飲料中測得的GABA含量。

在以下的詳細描述中，為了解釋本發明，提供了許多具體細節，以便能徹底理解所揭露的實施方式。然而，顯而易見的是，一個或多個的實施方式可以在沒有所述具體細節的情況下實現。在其它情況中，為了簡化附圖，習知的結構和流程將以示意性的方式顯示。

本發明之各個具體實例的細節說明如後。本發明之其他特徵將會經由以下各個具體實例中的詳細說明及申請專利範圍而清楚呈現。無須進一步的闡述，咸相信本發明所屬技術領域中具有通常知識者基於前述說明即可利用本發明至最廣的程度。因此，可以理解以下的說明僅僅是作為例示說明之用，而非以任何方式限制其餘的揭露內容。除非另有說明，否則此處使用之全部技術和科學名詞與本發明所屬技術領域中具有通常知識者通常所瞭解的意義相同。

為了達成本發明的目的，先進行麴菌與稻米的發酵試驗篩選具有GABA生產潛力之菌株，探討其原料組成配方及發酵條件後完成製備GABA的方法。接著，將經過麴菌發酵所得的麴菌發酵物結合酵母菌進行第二階段發酵，以製造具有GABA的機能飲料。具體而言，本案提供藉由高GABA產量的麴菌進行GABA製備的方法；以及將含有GABA的麴菌發酵物與機能飲料培養基及酵母菌進行第二階段發酵，以得到具備高GABA含量的機能飲料的方法。

首先參考圖1，圖1係為依據本發明實施例的製備GABA的方法。在步驟S00中，係將篩選出具備高GABA產量潛力的麴菌與作為麴菌基礎培養基的稻米進行發酵培養，以得到高產量的GABA。在此實施例中，麴菌基礎培養基所採用的稻米可以為糙米、白米、發芽米，較佳地為臺灣產的稻米。

參考圖2，圖2係為依據本發明實施例的製造含GABA的機能飲料的方法的流程圖。

在步驟S10，係使用稻米作為麴菌基礎培養基，並添加麴菌進行第一階段發酵培養。在此實施例中，麴菌可選用米麴菌(Aspergillus oryzae(BCRC 31163))或紅麴菌(Monascus ruber(BCRC 31535)、Monascus pilosus(BCRC 31502、BCRC 31505、BCRC 31526、BCRC 31527)、Monascus purpureus(BCRC 31540、BCRC 31615))，麴菌基礎培養基所採用的稻米可以為糙米、白米、發芽米，較佳地為臺灣產的稻米。麴菌的篩選方式將在後面詳細說明。在步驟S20，將步驟S10所得的麴菌發酵物與飲料培養基混合。在此實施例中，飲料培養基包含麥汁及蔗糖，具體而言，蔗糖與麥汁的比例可為2~6g/100mL，較佳地可為3~5g/100mL，更佳地可為4~4.5g/100mL。本發明不限於此，可以依發酵需求、甜度等調整蔗糖含量。

在步驟S30，將含有酵母菌的酵母菌基礎培養基(釀酒酵母)加至麴菌發酵物與飲料培養基混合所得的機能飲料培養基中並進行發酵。在此實施例中，發酵的環境為溫度24~26℃，較佳地為25℃，發酵時間為7~14天，以得到含有GABA的機能飲料。根據本發明的一較佳實施例，可以將發酵後的發酵物沉澱、過濾或離心以去除菌體，並收集所得的液體。其中所得到的機能飲料包含機能飲料產品(酒精含量<0.5%)或是機能啤酒產品(酒精含量>0.5%)。

以下將透過實施例詳述本發明中所包含的麴菌、酵母菌篩選方法，以及判斷依據。

(一)GABA分析：高效能液相層析儀(HPLC法)

以GABA-OPA衍生法進行HPLC分析GABA含量。配製5~500ppm不同濃度的GABA溶液，取試樣與OPA衍生劑以1：5(v/v)比例混合，於室溫下避光反應1分鐘後，使用0.22μm濾膜過濾，取20μL濾液於HPLC進行分析。梯度條件如表1所示。

HPLC管柱：RP-18 column(5μm,120*4mm,Merck)

HPLC移動相：

A：磷酸緩衝液(Phosphate buffer)

B：乙腈(Acetonitrile)

C：去離子水(DIW)

偵測波長：UV338nm

以HPLC分析之層析圖，GABA的滯留時間約17.5分鐘，而由HPLC分析得到不同濃度GABA的積分面積與其含量作圖，獲得GABA的檢量線。將發酵試樣進行HPLC分析所獲得的積分面積帶入公式，即可獲得樣品中的GABA含量。

(二)具GABA生產潛力菌株之篩選

1.菌株

本案所選用之菌株均為「商業上公眾可購得之生物材料」及「申請前業已保存於具有公信力之寄存機構且已可自由分讓之生物材料」，依現行專利法第三十條第一項但書之規定，不須寄存。

依據本發明實施例的篩選步驟，麴菌從以下菌株進行篩選：(1)米麴菌Aspergillus oryzae(BCRC 31163)以及(2)紅麴菌Monascus ruber BCRC 31535、Monascus pilosus(BCRC 31502、BCRC 31505、BCRC 31526、BCRC 31527)以及Monascus purpureus(BCRC 31540、BCRC 31615)。

酵母菌則從釀酒酵母菌Saccharomyces cerevisiae的以下7株進行篩選：BCRC 21680(NO.12)、BCRC 21377(NO.14)、BCRC 21800(NO.16)、BCRC 20848(NO.1)、BCRC 21791(NO.5)、BCRC 21459(NO.6)、BCRC 20262(NO.7)。

2.培養基

依據本發明實施例，包含(1)麴菌基礎培養基、(2)酵母菌基礎培養基、(3)GABA篩選培養基、(4)飲料培養基以及(5)機能飲料培養基。詳細成分如下述。

(1)麴菌基礎培養基，包含臺灣產稻米：糙米、白米、發芽米，稻米精磨成粉，粒徑為10 mesh至100 mesh，葡萄糖(購自Merck)、味精(麩胺酸鈉，MSG，購自味王股份有限公司)以及蛋白腖(Peptone，購自Merck)。每公升溶液中添加的詳細比例如表2所示。

(2)酵母菌基礎培養基，包含酵母菌萃取物、麥芽萃取物、蛋白腖及葡萄糖，每公升溶液中添加的詳細比例如表3所示。

(3)GABA篩選培養基

將前述之酵母菌基礎培養基加入0.01%溴甲酚綠(Sigma-Aldrich)、0.2%乙醛酸(Sigma-Aldrich)和0.2%琥珀酸(Merck)。

(4)飲料培養基，組成如表4所示

(5)機能飲料培養基，組成如表5所示

A.麴菌GABA產量篩選試驗

使用麴菌基礎培養基(白米)，加入麴菌(米麴菌1株、紅麴菌7株)於25℃、125rpm進行發酵，篩選具有產生GABA潛力之麴菌，發酵物於7天、11天的外觀如圖3所示。對麴菌發酵物分析GABA含量的結果如圖4所示，其中GABA產量高於200ppm的菌株共有4株，分別為BCRC 31502、BCRC 31505、BCRC 31527和BCRC 31163。

B.酵母菌GABA產量分析試驗

將131株釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)以酵母菌基礎培養基(酵母菌平板)活化，於25℃條件培養3天，再以接種環挑單一菌落至GABA篩選培養基，於25℃培養3天，觀察菌落呈現藍綠色之深淺，用以代表受測菌株產GABA之能力，如圖5所示，GABA含量越高，菌落呈現顏色越深。

由131株釀酒酵母菌篩選出具有GABA生產潛力的釀酒酵母菌7株BCRC 21680(NO.12)、BCRC 21377(NO.14)、BCRC 21800(NO.16)、BCRC 20848(NO.1)、BCRC 21791(NO.5)、BCRC 21459(NO.6)、BCRC 20262(NO.7)。

分別將以酵母菌平板25℃活化2天的7株酵母菌，使用滅菌後的RO水自酵母菌平板上洗下菌體，使菌體懸浮液OD₆₀₀為20~30，以接種量0.5%接種至飲料培養基，於25℃進行發酵，發酵試樣7天、14天分析GABA含量，如圖6所示。另外，分析糖度(Brix%)、酒精度及觀察飲料氣泡情況及進行感官品評的結果，如表6所示。再將此結果與低酒精釀酒酵母菌數據資料進行比對，交集出低酒精且具有GABA生產潛力的釀酒酵母菌3株，分別為BCRC 21680(NO.12)、BCRC 21377(NO.14)和BCRC 21800(NO.16)。綜合感官品評總分及喜好性排名，評估含GABA的飲料適口性及可接受性，共選擇5株酵母菌，分別為NO.5(BCRC 21791)、NO.6(BCRC 21459)、NO.12(BCRC 21680)、NO.14(BCRC 21377)和NO.16(BCRC 21800)。

由上述結果，選擇麴菌BCRC 31505、BCRC 31527和BCRC 31163，酵母菌選擇前5名的NO.5(BCRC 21791)、NO.6(BCRC 21459)、NO.12(BCRC 21680)、NO.14(BCRC 21377)和NO.16(BCRC 21800)在後述的具體實施例中進行GABA機能飲料發酵實驗。

(三)具體實施例

以下藉由將篩選出的麴菌進行發酵試驗的實施例1來說明本案所提供的製備GABA方法的效果。

實施例1

首先，本案實施例1係使用麴菌基礎培養基(發芽米、糙米、白米)，加入麴菌(米麴菌BCRC 31163、紅麴菌BCRC 31502、BCRC 31505、BCRC 31527)於25℃、125rpm使用有溝槽搖瓶進行發酵，發酵物於7天(a)、14天(b)的外觀如圖 7所示；對麴菌發酵物分析GABA含量的結果分別如圖8(7天)、圖9(14天)及圖10(同原料不同菌株的綜合平均)所示，其中3種原料(發芽米、糙米、白米)分別混合麴菌經7天發酵後，BCRC 31163與糙米的組合的麴菌發酵物的GABA含量高於75ppm，而在經14天發酵後，麴菌發酵物中的GABA含量多數呈現顯著提升(圖9)。此外，比較3種原料經發酵14天後，各菌株所產生之GABA含量平均高於75ppm，且不同原料間無顯著差異，如圖10所示。此外，如圖7所示，BCRC 31527之麴菌發酵物外觀呈現紅色。至此，即可藉由麴菌發酵所得之麴菌發酵物中取得GABA成分。

如上所述，本發明提供的製備GABA的方法中包含了將麴菌與麴菌基礎培養基中進行發酵；其中麴菌可為米麴菌Aspergillus oryzae(BCRC 31163)或紅麴菌Monascus pilosus(BCRC 31502、BCRC 31505、BCRC 31527)。

接著，透過將藉由麴菌進行第一階段發酵，並結合酵母菌進行第二階段發酵，繼而達到製造含GABA的機能飲料的實施例2來說明本案所提供之製造含GABA的機能飲料的方法的效果。

實施例2

本案實施例2係使用麴菌基礎培養基(白米)，加入麴菌(米麴菌31163、紅麴菌31505、31527)於25℃、125rpm使用有溝槽搖瓶進行發酵14天，麴菌發酵物經過濾後與飲料培養基以3：7之比例混合以得到機能飲料培養基。本實施例不限於此，麴菌發酵物與飲料培養基的比例可以為2：8、2.5：7.5、3：7、3.5：6.5、4：6等。

接著，分別將YM平板25℃活化2天的酵母菌，使用滅菌後的RO水自YM平板上洗下菌體，使菌體懸浮液OD₆₀₀為20~30，分別將5株具有GABA生產潛力的釀酒酵母菌(NO.5、NO.6、NO.12、NO.14、NO.16)，以接種量0.5%接種至機能飲料培養基，於25℃發酵7天後得到機能飲料。將該些機能飲料分析GABA含量、糖度、酒精度以及進行感官品評，結果如圖11至圖14以及表7所示。圖11係為使用麴菌基礎培養基(白米)，並使用有溝槽搖瓶於25℃發酵14天的外觀。可以看到BCRC 31527的發酵產物與實施例1狀態相同，仍呈現紅色。圖12係使用麴菌基礎培養基(白米)，並使用有溝槽搖瓶於25℃發酵14天的GABA含量。如圖所示，可見BCRC 31527的GABA產量最高。圖13係為依據本發明實施例的15種經不同麴菌與酵母菌發酵7天所得飲料的外觀。經酵母菌發酵後BCRC 31527的發酵產物依然維持紅色的液體。圖14係為依據本發明實施例的15種經不同麴菌與酵母菌發酵7天所得飲料中測得的GABA含量。就GABA含量而言，酵母菌為Saccharomyces cerevisiae，較佳地為BCRC 21791(NO.5)、BCRC 21800(NO.16低酒精潛力菌株)及BCRC 21377(NO.14低酒精潛力菌株)。另一方面，亦可將該些機能飲料經沉澱、過濾或離心以去除菌體，以改善其口感。其中所得到的機能飲料可以透過配方調整而包含機能飲料產品(酒精含量<0.5%)或是機能啤酒產品(酒精含量>0.5%)。

結合圖11至圖14以及表7的結果，可以挑選出兼具口感及高GABA含量的麴菌、酵母菌組合。培養結果顯示製程再現良好，機能飲料培養基含有BCRC 31527之麴菌發酵物仍會呈現紅色外觀，此外，GABA產量高於100ppm的飲料共有6支，分別為31505-5、31505-14、31505-16、31527-5、31527-14以及31527-16，其中又以31527-14、31527-16以及31505-14消費者感官品評排名前三。經消費者感官品評及綜合GABA含量的考量後，最佳的麴菌、酵母菌組合為31527-14、31527-16以及31505-14。

綜上所述，透過本發明的實施例，可以提供一種製備GABA的方法，可以透過簡單的方式製備GABA。此外，可以將此麴菌製備GABA的方法與酵母菌結合進行第二階段發酵，以提供製造含有GABA的機能飲料的方法，其可以達成減少製造步驟、節省成本的效果。此外，可以透過選用不同菌株的組合，而達到提供不同外觀、不同口感的含GABA的機能飲料。

以上所述僅為示例性，而非為限制性。任何未脫離本發明的精神與範疇，而對其進行的等效修改或變更，均應包含於申請專利範圍所界定的範圍中。

S00:步驟

Claims

一種製備γ-氨基丁酸(GABA)的方法，其包含：將一麴菌(Monascus pilosus)與一麴菌基礎培養基在25℃進行發酵7至14天，其中該麴菌係為BCRC 31527或BCRC 31505；其中以該麴菌基礎培養基的重量為基礎，該麴菌基礎培養基包括0.1~5wt%之碳源、0.1~3wt%之氮源、0.5~5.0wt%之胺基酸鹽及1.0~5.0wt%之米原料。
如請求項1所述之方法，其中該碳源為葡萄糖、蔗糖或其組合。
如請求項1所述之方法，其中該氮源為動物來源蛋白腖、植物來源蛋白腖或其組合。
如請求項1所述之方法，其中該米原料為糙米、白米或發芽米。
一種製造含γ-氨基丁酸(GABA)的機能飲料之方法，其包括：將如請求項1至4中任一項所述之方法所製得的一麴菌發酵物加至一飲料培養基以得到一機能飲料培養基，將培養於一酵母菌基礎培養基中的一酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)加入該機能飲料培養基中後，於24~26℃進行第二階段發酵7至14天；其中該飲料培養基包含麥汁及蔗糖；該酵母菌基礎培養基包含酵母菌萃取物、麥芽萃取物、蛋白腖及葡萄糖。
如請求項5所述之方法，其中該酵母菌係為BCRC 21377或BCRC 21800。
如請求項5所述之方法，其中該麴菌與該酵母菌的組合為BCRC31527與BCRC 21377的組合、BCRC31527與BCRC 21800的組合或BCRC 31505與BCRC 21377的組合。
如請求項5所述之方法，其中該麴菌發酵物與該飲料培養基的體積比為2：8至4：6。
如請求項5所述之方法，其中該第二階段發酵的溫度為25℃。