TWI795409B - 三維聚合物網絡及其用途 - Google Patents

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Abstract

本發明提供三維交聯聚合物網絡輸送通道，包含該網絡之陣列，製備該網絡之方法，以及該網絡及陣列之用途。

Description

三維聚合物網絡及其用途
本發明係關於三維聚合物網絡及其用途。
美國公開案第2008/0293592號描述一種用於藉助於光反應性交聯劑在有機表面上共價固定探針生物分子的方法。已在實踐中證實該方法特別有利，因為其准許探針生物分子在不起反應之表面諸如由標準商業塑膠組成之矽烷化玻璃載體及基板上固定。在描述於US 2008/0293592中之方法中使用聚合物以在網絡表面或在網絡內部形成可結合有探針生物分子之三維網絡類型。與探針生物分子僅以二維形式固定之有機表面相比，聚合物及/或共聚物網絡中生物分子之三維固定使得有機表面上之探針生物分子的密度更高。此增加了每表面單位之有機表面可結合之分析物的量。因此該表面作為生物感測器之用途產生更高之量測精確性及高量測動態。
然而，描述於U.S.2008/0293592中之方法及聚合物網絡之缺點為結合至於聚合物網絡表面上或接近於聚合物網絡表面而佈置的探針生物分子之分析物分子或分析物組分可阻斷該網絡。隨後其他分析物分子或分析物組分可不再同樣結合至在網絡內部中之距網絡表面更大的距離處佈置的尚未結合之探針生物分子。
因此，需要改良聚合物網絡。
本發明提供三維聚合物網絡，其包含通道鏈，例如水溶性聚合物鏈，以及一或多個輸送通道。該輸送通道允許溶液中分子(例如分析物分子)進入網絡內的聚合物鏈。在某些態樣中，該聚合物鏈經交聯至探針分子，且該輸送通道提供更大面積以將分析物結合至探針分子。
該等網絡適當地共價連接至表面。如前段所述，一或多種探針(諸如生物分子)可固定於網絡表面上及網絡之整個內部中，提供用於偵測樣品中分析物之存在及/或量測其量之感測器。舉例而言，核酸探針可用以偵測存在於樣品中之互補核酸，且抗體探針可用以偵測存在於樣品中之抗原。與不具有輸送通道之網絡相比，本發明網絡允許既定量之分析物更快地雜交，因為輸送通道可有效地增加網絡之表面區域，在既定時間量裏將更多探針曝露至樣品。另外，本發明網絡可比相同體積之無輸送通道網絡結合更多的分析物，因為輸送通道降低或消除以下問題：藉此樣品之在網絡之表面處或在其附近結合至探針之分析物或其他組分阻斷了接近位於網絡內部之探針。與可能不具有輸送通道之網絡相比，本發明網絡之另一優勢為可能藉由輸送通道得到之高量之分析物負載使得對分析物之偵測更靈敏，亦即與無輸送通道網絡相比，信雜比可得以提高，因為既定量之分析物可以更小的網絡體積濃縮。與無輸送通道網絡相比，本發明網絡之又一優勢為可能藉由輸送通道得到之高分析物負載使得可定量更寬範圍之分析物濃度。
本發明亦提供包含本發明之複數個三維網絡及基板之陣列。本發明陣列可用以同時偵測及/或量測一或多個樣品中之一或多種分析物。本發明陣列可經洗滌及再使用，提供比單次使用陣列顯著的成本優勢。本發明陣列之另一優勢為其可按簡單方式製造，因為在製造製程期間製備個別網絡所需的所有 組分可作為單一混合物塗覆於基板表面上。
本發明亦提供用於製備本發明之三維網絡及陣列之方法。本發明之三維網絡可藉由在至少兩種類型鹽晶體、較佳針形鹽晶體及緻密(compact)鹽晶體存在下使聚合物交聯，且隨後溶解鹽晶體以在交聯聚合物網絡中留下輸送通道來製備。不受理論束縛，本發明人相信，交聯期間緻密鹽晶體的存在產生海棉狀聚合物，該海棉狀聚合物具有被長通道穿過的短通道，係在交聯期間針形鹽晶體的存在下產生。
本發明亦提供用於使用本發明之三維網絡及陣列以偵測及/或量測樣品、較佳液體樣品中之分析物的方法。
1:探針生物分子
2:表面
3:聚合物
4:光反應性基團
5:混合物
6:固持器
7:斑點
8:鹽晶體
9:結晶胚
10:表面
11:光學輻射
12:溶劑
13:通道
14:緻密晶體
15:聚合物網絡
16:表面
17:生物晶片
17':生物感測器
18:基板條帶
19:通道
D:直徑
X:距離
Y:距離
圖1顯示具有探針生物分子(1)及聚合物(3)之混合物之圖示，該聚合物每溶解於鹽水溶液中之分子包含兩個光反應性基團(4)(如章節4.3.1所述)。
圖2顯示如圖1中所示之一滴混合物(5)之橫截面，該混合物具有位於表面(2)之斑點(7)處之表面(10)，該表面位於固持器(6)上。該表面較佳為有機基板或具有包含有機物之基板。該基板較佳為硬質。該固持器可為經加熱固持器或經冷卻固持器，以允許鹽類在鹽水溶液中在受控結晶。
圖3顯示在混合物已經加熱且(a)自結晶胚(9)延伸之針形鹽晶體(8)及(b)緻密晶體(14)已在鹽溶液中形成後，通過圖2中所顯示之佈置之橫截面。
圖4顯示混合物已經乾燥且用光輻射(11)照射以形成具有表面(16)之聚合物網絡(15)後，通過圖3中所顯示之佈置之橫截面。
圖5顯示用光輻射照射後圖1混合物之圖示。
圖6顯示將鹽晶體溶解於溶劑(12)中形成輸送長通道(13)及短通道(19)後， 通過圖4中所展示之佈置之橫截面。
圖7顯示形成對(二甲基丙烯醯胺共甲基丙烯醯基二苯甲酮共4-乙烯基苯磺酸鈉)的反應路徑。
圖8顯示生物晶片(17)之透視圖，在其上聚合物網絡(15)位於經佈置為具有列及行之矩陣之斑點(7)處。該晶片較佳具有有機表面。
圖9顯示如圖8中所展示之生物晶片(17)之俯視圖，其中各聚合物網絡(15)具有直徑(D)，且其中列及行分別由自聚合物網絡(15)之中心點量測之距離Y及距離X分隔。
圖10顯示生物感測器(17')，其包含可撓性基板條帶(18)，在其上具有直徑(D)之聚合物網絡(15)位於由自聚合物網絡之中心點量測之距離X分隔開的斑點(7)處。
圖11A-11C顯示具有6列(A-F)及6行(1-6)聚合物網絡之生物晶片在(圖11A)之前及在(圖11B)乾燥之後，其顯示用於製備圖11C顯示之列D及E聚合物網絡之鹽濃度。使用包含磷酸鈉及磷酸鉀二者之水溶液製備列D及E之聚合物網絡。其餘列係使用僅包含磷酸鈉之水溶液(濃度為350mM)製備。列D及E之聚合物網絡看起來更圓、更均勻。
圖12A-12C顯示使用金黃色葡萄球菌及大腸桿菌特異性引子對的PCR反應產物與根據圖12A-圖12C的陣列雜交的結果。圖12A顯示從100個拷貝的金黃色葡萄球菌DNA擴增的PCR產物陣列的雜交。圖12B顯示從100拷貝的大腸桿菌DNA擴增的PCR產物陣列的雜交。圖12C顯示圖12A及圖12B中所示陣列的探針圖。大腸桿菌=大腸桿菌探針；沙門氏菌=沙門氏菌探針(大腸桿菌PCR產物顯示出一些交叉反應)；Allstaph=pan葡萄球菌探針；金黃色葡萄球菌=金黃色葡萄球菌探針；PCR對照=用於檢測PCR擴增過程的內部對照的探針；LL=著陸燈，其為螢光團標記的寡核苷酸，其與用作陣列對照的網絡中的聚合物鏈交聯。
圖13顯示在不存在模板的情況下使用金黃色葡萄球菌或大腸桿菌特異性引子對擴增的PCR產物的雜交的螢光訊號的定量，代表背景「噪音」。1號代表斑點D1，E1；2號代表斑點D1，E2；3號代表斑點D1，E3；4號代表斑點D1，E4；5號代表斑點D1，E5；6號代表斑點D1，E6。
4.1 三維聚合物網絡
本發明之三維網絡包含交聯聚合物，例如根據內容以全文引用之方式併入本文中之Rendl等人，2011，Langmuir 27：6116-6123或US 2008/0293592的聚合物。本發明之三維網絡進一步包含一或多個輸送通道且可視需要進一步包含固定於網絡上之一或多種探針，例如藉交聯至聚合物鏈。
本發明網絡可具有諸如5至75nm(例如，10至20nm、10至30nm、10至40nm、10至50nm、20至30nm、20至40nm、20至50nm、30至40nm、30至50nm、或40至50nm)的網格尺寸(在網絡的水合狀態下測量)。「網絡的水合狀態」是指網絡在吸水方面處於平衡狀態，亦即它在水溶液中吸收與其發出的水一樣多的水。
可用以製備網絡之聚合物描述於章節4.1.1中。可用以製備網絡之交聯劑描述於章節4.1.2中。該一或多個通道之特徵描述於章節4.1.3中。可固定於網絡上之探針描述於章節4.1.4中。
4.1.1 聚合物
本發明之三維網絡可包含交聯之均聚物、共聚物、均聚物之混合物、共聚物之混合物或一或多種均聚物及一或多種共聚物之混合物。如本文中所使用，術語「聚合物」包括均聚物及/或共聚物兩者。如本文中所使用，術語「共聚物」包括由兩種或多於兩種類型之單體聚合之聚合物(例如二元共聚物、 三元共聚物、四元共聚物等)。共聚物包括交替共聚物、週期共聚物、統計共聚物、無規共聚物、嵌段共聚物、線性共聚物及分支共聚物。本發明之三維網絡可包含前述類型聚合物之任何組合。用於製備此類聚合物之試劑及方法在此項技術中已知(參見例如Ravve，A.，Principles of Polymer Chemistry，Springer Science+Business Media，1995；Cowie，J.M.G.，Polymer：Chemistry & Physics of Modern Materials，第2版，Chapman & Hall，1991；Chanda，M.，Introduction to Polymer Science and Chemistry：A Problem-Solving Approach，第2版，CRC Press，2013；Nicholson，J.W.，The Chemistry of Polymer，第4版，RSC Publishing，2012；其中之每一者之內容以其全文引用之方式併入本文中)。
較佳的聚合物為親水性的及/或含有親水性基團。聚合物較佳為可溶水的。在一具體實例中，聚合物為已由兩種或多於兩種種類之所選擇單體聚合之共聚物以提供所需水溶性水準。舉例而言，共聚物之水溶性可藉由改變用以製備共聚物之帶電單體(例如4-乙烯基磺酸鈉)的量來控制。
當交聯時，水可溶聚合物形成水可溶脹凝膠或水凝膠。水凝膠經由與水分子之氫鍵結吸收水溶液。水凝膠之總體吸收性及溶脹能力可藉由用以製備凝膠之交聯劑之類型及程度而控制。低交聯密度聚合物一般在更大程度上比高交聯密度聚合物具有更高的吸收能力及溶脹，但高交聯密度聚合物之凝膠強度更堅固且甚至在適中壓力下可維持網絡形狀。
水凝膠吸收水之能力為水溶液之離子濃度之因素。在某些具體實例中，本發明之水凝膠可在去離子蒸餾水中吸收高達50倍之其重量(5至50倍其自身體積)，且在鹽水中吸收高達30倍之其重量(4至30倍其自身體積)。鹽水中降低之吸收性歸因於價態陽離子之存在，其阻礙聚合物與水分子結合之能力。
本發明之三維網絡可包含已由一種、兩種、三種或多於三種種類之單體聚合之共聚物，其中一種、兩種、三種或多於三種種類之單體具有獨立 地選自以下各者之可聚合基團：丙烯酸酯基(例如丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸羥基乙酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸2-苯酯)、丙烯醯胺基(例如丙烯醯胺、甲基丙烯醯胺、二甲基丙烯醯胺、乙基丙烯醯胺)、衣康酸酯基(例如衣康酸酯、衣康酸4-甲酯、衣康酸二甲酯)及苯乙烯基(例如苯乙烯、4-甲基苯乙烯、4-乙氧基苯乙烯)。較佳的可聚合基團為丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、乙基丙烯酸酯、丙烯酸2-苯酯、丙烯醯胺、甲基丙烯醯胺、衣康酸酯及苯乙烯。在一些具體實例中，用以製備共聚物之單體中之一者為帶電的，例如4-乙烯基苯磺酸鈉。
用以製備本發明網絡之聚合物每分子可包含至少一個、至少兩個、或多於兩個交聯劑基團。交聯劑基團為將網絡之聚合物分子彼此共價結合且視需要共價結合至探針及/或基板之基團。已由兩種或多於兩種單體(例如具有獨立地選自描述於前述段落中之彼等基團之可聚合基團的單體)聚合之共聚物，其中之至少一者包含交聯劑，適用於製備本發明之三維網絡。例示性交聯劑描述於章節4.1.2中。包含交聯劑之較佳單體為甲基丙烯醯氧基二苯甲酮(MABP)(參見圖7)。
在一較佳具體實例中，共聚物為包含交聯劑之二元共聚物或三元共聚物。在一尤佳具體實例中，共聚物包含對(二甲基丙烯醯胺共甲基丙烯醯基二苯甲酮共4-乙烯基苯磺酸鈉)(參見圖7)。
4.1.2 交聯劑
適用於使得三維網絡交聯之交聯試劑(或交聯劑)包括藉由紫外光(例如長波UV光)、可見光及熱活化之彼等劑。藉由UV光活化之例示性交聯劑包括二苯甲酮、噻噸酮(例如噻噸-9-酮、10-甲基啡噻
Figure 107119871-A0305-02-0008-2
)及安息香醚(例如安息香甲基乙醚、安息香乙醚)。藉由可見光活化之例示性交聯劑包括乙基伊紅、伊紅Y、玫瑰紅、樟腦醌及赤蘚紅。藉由熱活化之例示性交聯劑包括4，4' 偶氮雙(4-氰基戊酸)及2，2-偶氮雙[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二鹽酸鹽及過氧化苯甲醯。亦可使用此項技術中已知之其他交聯劑，例如能夠在經照射時形成自由基或其他反應基之彼等交聯劑。
4.1.3 輸送通道
本發明之三維網絡含有一或多個輸送通道。
輸送通道可以允許接近網絡內部。雖然輸送通道可以具有相對大的橫截面，但是網絡可以保持機械穩定，因為網絡的網格尺寸可以顯著小於輸送通道橫截面。
輸送通道可以形成一種高速公路，分析物可以通過該高速公路快速進出網絡內部。分析物的輸送可以藉由擴散及/或對流在輸送通道中進行。
當在鹽晶體存在下藉由交聯聚合物鏈形成網絡時形成輸送通道，如章節4.3所述。在洗掉鹽晶體後，留下輸送通道。
不受理論束縛，發明人相信，在本發明製備網絡的方法導致形成由不同金屬離子-鹽離子配對產生的至少兩種類型的鹽晶體。當洗掉鹽晶體時，根據「丟失」形式的原理，留下至少兩種類型的輸送通道。輸送通道允許分析物滲透到網絡內部並且特異性地結合位於網絡內部的探針。另外，輸送通道允許未結合的分析物在洗滌後存在於網絡內部，從而減少來自「卡在」網絡內的分析物的非特異性訊號的量。
據信一種類型的輸送通道為由針形鹽晶體創造的長鏈。如本文中所使用，「長通道」為網絡中之狹長通路，其(1)實質上為筆直的且(2)在網絡之水合狀態下，具有至少300nm之最小橫截面及通路之最小橫截面的至少三倍且較佳至少五倍且更佳至少十倍之長度。舉例而言，長通道之長度可為長通道之最小橫截面之3至15倍、5至10倍或10至15倍。「實質上筆直」之長通道為在任何方向亦即X、Y或Z方向上不改變方向大於45度的情況下，在一個方向 上自成核點延伸之一者。因為長通道由從共同成核點形成的針形晶體產生，所以本發明的網絡可以包括在與原始成核結晶點對應的網絡內的點處會聚的(例如，5、10或更多個)長通道的群組。長通道通常佈置成使得從網絡表面朝向內部開始，長通道之間的橫向距離減小。
在其他態樣中，一種類型的輸送通道被認為是短通道，例如由立方體或桿狀晶體形成。如本文所用，「短通道」是網絡中的通道，(1)其實質上是筆直的，並且(2)呈網絡的水合狀態下，具有較佳為網絡的網格尺寸至少10倍的最小橫截面以及小於通道最小橫截面三倍(例如，可以從1倍到2.75倍，從1倍到2.5倍，從1倍到2倍，或從1倍到1.5倍)的長度。「實質上筆直」之短通道為在任何方向亦即X、Y或Z方向上不改變方向大於45度的情況下，在一個方向上自成核點延伸之一者。為了保持網絡強度，短通道較佳具有不大於網絡寬度或直徑的1/20橫截面，舉例而言，對於直徑為200μm的陣列上的呈「斑點」形式的網絡而言，短通道的橫截面較佳不大於10μm，並且對於直徑為100μm的陣列上的斑點而言，短通道的橫截面較佳不大於5μm。在某些態樣中，短通道的橫截面為約20nm或更大，約50nm或更大，約100nm或更大，約250nm或更大，至少500nm或更大，或約1μm或更大。網絡中的短通道可具有大約(例如，+/- 10%或+/- 25%)相同直徑或不同直徑。在特定具體實例中，網絡中的短通道具有範圍在任何兩個前述尺寸之間的直徑，例如，它們可以在100nm至10μm，50nm至1μm，500nm至5μm的範圍內，從250nm到10μm等等。
不受理論束縛，發明人相信，短通道創造海棉聚合物，其被長通道穿透。
4.4.4 探針
固定於本發明網絡上之探針可為生物分子或結合生物分子之分子，例如互補結合配偶體之特異性相互作用系統之配偶體(受體/配位體)。舉 例而言，探針可包含核酸及其衍生物(諸如RNA、DNA、鎖核酸(LNA)及肽核酸(PNA))、蛋白質、肽、多肽及其衍生物(諸如葡糖胺、抗體、抗體片段及酶)、脂質(例如磷脂、脂肪酸，諸如花生油酸、單酸甘油酯、二酸甘油酯及三酸甘油酯)、碳水化合物、酶抑制劑、酶受質、抗原及抗原決定基。探針亦可包含較大且複合結構，諸如脂質體、膜及膜片段、細胞、細胞裂解物、細胞片段、孢子及微生物。
互補結合配偶體之特異性相互作用系統可基於例如核酸與互補核酸之相互作用，PNA與核酸之相互作用，或酶/受質、受體/配位體、凝集素/糖、抗體/抗原、抗生素蛋白/生物素或抗生蛋白鏈菌素/生物素相互作用。
核酸探針可為DNA或RNA，例如寡核苷酸或適體、LNA、PNA或DNA，在5'端包含甲基丙烯酸基(5'AcryditeTM)。寡核苷酸探針可為例如12至30、14至30、14至25、14至20、15至30、15至25、15至20、16至30、16至25、16至20、15至40、15至45、15至50、15至60、20至55、18至60、20至50、30至90、20至100、20至60、40至80、40至100、20至120、20至40、40至60、60至80、80至100、100至120或12至150個核苷酸長。在較佳具體實例中，寡核苷酸探針長度為15至60個核苷酸。
當使用核酸探針時，整個探針或僅探針之一部分可與目標序列互補。與目標序列互補之探針部分之長度較佳為至少12個核苷酸，且長度更佳為至少15、至少18或至少20個核苷酸。對於長度比40或50個核苷酸更長之核酸探針，與目標序列互補之探針部分之長度可為至少25、至少30或至少35個核苷酸。
抗體可為例如多株、單株或嵌合抗體或其抗原結合片段(亦即「抗原結合部分」)或其單鏈、包含抗體之融合蛋白，及包含抗原識別位點之免疫球蛋白分子之任何其他經修飾組態，包括例如(但不限於)單鏈(scFv)及域抗體(例如人類、駱駝或鯊魚域抗體)、最大抗體、微型抗體、胞內抗體、雙功 能抗體、三功能抗體、四功能抗體、vNAR及雙scFv(參見例如Hollinger及Hudson，2005，Nature Biotech 23：1126-1136)。抗體包括任何類別之抗體，諸如IgG、IgA或IgM(或其子類)，且該抗體無需為任何特定類別。免疫球蛋白可視其重鏈之恆定域之抗體胺基酸序列而分為不同類別。存在五種主要類別之免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且此等類別中之若干者可進一步分成子類(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。「抗體」亦涵蓋前述抗體/免疫球蛋白類型中之每一者中之任一者。
本發明之三維網絡可包含單種類探針或多於一種種類之探針(例如2、3、4或5或多於5種種類)。針對相同目標，三維網絡可包含多於一種種類之探針(例如結合相同目標之不同抗原決定基之抗體)及/或包含結合多個目標之探針。
網絡可包含經標記(例如經螢光標記)對照探針分子，其可用以例如量測存在於網絡中之探針的量。
探針可分佈在整個網絡中(例如在網絡表面上及網絡內部)。較佳地，至少一種探針與網絡表面間隔開且鄰近至少一個輸送通道。隨後經由輸送通道，如此定位之探針針對分析物分子或分析物組分而言為直接可達的。在一些具體實例中，大多數探針位於網絡內部。
一或多種探針可共價或非共價固定於網絡上。舉例而言，探針可與交聯聚合物交聯或探針可非共價結合至網絡(諸如藉由結合至共價結合至網絡之分子)。在一較佳具體實例中，一或多種探針與交聯聚合物交聯。在一些具體實例中，大多數探針共價結合於網絡內部(例如使得至少一部分探針鄰接輸送通道)。
不受理論束縛，本發明人相信歸因於探針分子(尤其核酸探針分子)與鹽晶體之間的靜電相互作用，用於在鹽晶體(尤其磷酸鹽晶體)存在下 製造三維網絡之描述於章節4.3中之方法可在聚合物與輸送通道之間的界面處或在界面附近產生更大濃度之探針分子。因此，在本發明之一些具體實例中，本發明提供根據本發明之網絡，在其中探針密度在聚合物與輸送通道之間的界面處比在不鄰接輸送通道之聚合物區域內更大。在各種具體實例中，探針密度在聚合物與輸送通道之間的界面處比在不鄰接輸送通道之聚合物區域內緻密至少10%、至少20%、至少30%、至少40%或至少50%。
網絡中探針分子之密度可使用以下程序證實：在室溫下在例如碗中使網絡與水性液體接觸。液體含有連接至一部分之複數個奈米粒子，該部分與網絡中之探針分子(例如在探針分子經生物素標記之情況下為抗生蛋白鏈菌素)相互作用。奈米粒子之大小小於網絡之篩孔大小且小於網絡內至少一種類型輸送通道之最小橫截面以允許奈米粒子分佈在整個聚合物中。適合之奈米粒子為直徑為2-5奈米之量子點。
選擇培育期使得液體中之網絡完全水合，亦即網絡平均吸收與其釋放相同量之水。培育期可為例如一小時。通道中奈米粒子之滲透可藉由在培育期間設置網絡及/或液體之運動、例如藉由振動網絡及/或液體(較佳藉助於超音波)來加速。
培育完成後，例如藉由自碗排出液體或將網絡自碗中取出使液體與網絡分離。
隨後，例如藉助於液氮冷凍水合網絡。此後，可藉助於低溫切片機(cryomicrotome)沿著相互平行之切割平面將冷凍網絡切成薄切片。切割平面橫向於通道之縱向延伸部而佈置且穿透輸送通道。較佳使用液氮冷卻之金剛石刀片進行切割。切片厚度可為例如約100nm或200nm。
藉助於顯微鏡，定位置於藉由切割冷凍網絡獲得之盤片中之奈米粒子。必要時，奈米粒子可為螢光的且經光學突顯，使得其可更好地與網絡區 別。可使用適合軟體用圖像處理方法進行奈米粒子之定位。為檢查盤片，較佳使用具有螢光光學器件之共焦顯微鏡雷射掃描顯微鏡或電子顯微鏡。
藉助於電腦，以此方式獲得之奈米粒子之幾何結構及/或位置資訊可用以製造網絡中之奈米粒子分佈之三維幾何模型。隨後該模型可用以判定奈米粒子分佈是否反映輸送通道位點附近之探針分子之更大密度。
4.2 陣列
本發明之三維網絡可安置(例如沉積)於基板上，且較佳固定於基板上(例如藉由網絡與基板之間的共價交聯)。複數個網絡可固定於基板上以形成例如適用作生物晶片之陣列。
適合之基板包括有機聚合物，例如環烯烴共聚物(COC)、聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯及聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA，Plexiglas®)。Ticona以商標名Topas®出售適合COC之一實例。無機材料(例如金屬、玻璃)亦可用作基板。此類基板可用有機分子塗佈以允許網絡與基板表面之間的交聯。舉例而言，無機表面可用自組裝單層(SAM)塗佈。SAM本身可完全不起反應且因此包含例如純烷基矽烷或由純烷基矽烷組成。其他基板亦可適用於與三維網絡交聯，其限制條件為其在自由基製程(例如有機硼化合物)期間能夠與有機分子穩定結合。
基板可為硬性或可撓性的。在一些具體實例中，基板呈盤(例如長方形盤、方形盤、環形盤片等)形狀。舉例而言，基板可包含微孔盤，且三維網絡可安置於盤之孔中。
個別網絡可安置於基板表面上之相異斑點處，例如安置於包含複數個行及列之矩陣中。在圖8中所顯示之具體實例中，網絡位於佈置成六行及六列之36個斑點處。涵蓋具有不同數目之列及行之陣列，其中之每一者之數目可經獨立地選擇(例如2至64行及2至64列)。行可由距離X分隔開且列可由距離Y 分隔開(例如如圖9中所示)以便形成個別網絡可位於其上之斑點網格。可選擇X及Y使得位於網格斑點處之網絡不以脫水狀態彼此接觸且不以水合狀態彼此接觸。尺寸X及Y可相同或不同。在一些具體實例中，X及Y相同。在一些具體實例中，X及Y不同。在一些具體實例中，X及Y獨立地選自至少約500μm之距離(例如500μm至5mm、500μm至4mm、500μm至3mm、500μm至2mm或500μm至1mm)。在一些具體實例中，X及Y均為約500μm。在其他具體實例中，X及Y均為500μm。
在一些具體實例中，基板為條形的(例如，如圖10中所示)。網絡可經佈置為在條形有機表面之縱向方向上延伸之單列，或可經佈置為在條形表面之縱向方向上延伸之多個列。此類條形陣列中之列及行可具有如上文所描述之網格尺寸X及Y。
個別網絡可各自覆蓋環形或實質上環形之陣列之表面區域。典型地，藉由個別網絡覆蓋之陣列之表面上的區域之直徑(亦即斑點直徑)為80μm至1000μm。在各種具體實例中，斑點直徑為80μm、100μm、120μm、140μm、160μm、180μm、200μm、300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、800μm、900μm或1000μm，或選自由前述具體實例中之任兩者界定之範圍，例如80μm至200μm、100μm至120μm、120μm至140μm、120μm至180μm、140μm至160μm、160μm至180μm、180μm至200μm、120μm至200μm、100μm至400μm、160μm至600μm或120μm至700μm等等。在一較佳具體實例中，直徑在100μm至200μm或其子範圍的範圍內。
本發明陣列典型地具有至少8個個別三維網絡。在某些態樣中，陣列具有至少16、至少24、至少48、至少96、至少128、至少256、至少512或至少1024個個別三維網絡。在一些具體實例中，本發明陣列具有24、48、96、128、256、512、1024、2048、4096或8192個個別網絡，或具有選自藉由前述具體實 例中之任兩者界定之範圍的許多三維網絡，例如8至128、8至512、24至8192、24至4096、48至2048、96至512、128至1024、24至1024、48至512、96至1024或128至512個三維網絡等等。在一較佳具體實例中，陣列上三維網絡之數目在8至1024範圍內。在一尤佳具體實例中，陣列上三維網絡之數目在25至400範圍內。
包含本發明陣列之個別網絡可具有相同或不同探針(例如各網絡可具有獨特集合之探針，多個網絡可具有相同集合之探針且其他網絡可具有不同集合之探針，或所有網絡可具有相同集合之探針)。舉例而言，佈置於矩陣之相同列中之網絡可包含相同探針且佈置於矩陣之不同列中之網絡可具有不同探針。
典型地，陣列上之個別網絡之斑點直徑及/或網絡體積彼此改變不大於20%、不大於15%、不大於10%或不大於5%。
在一些具體實例中，陣列包含具有一或多種對照寡核苷酸或探針分子之一或多個個別網絡(例如陣列上之斑點)。對照寡核苷酸可經標記，例如經螢光標記以用作空間對照(用於空間定向陣列)，及/或量化結合至網絡之探針分子的量，例如當洗滌且再使用本發明陣列(亦即作為「可重用性對照」)時。空間及可重用性對照探針可為相同或不同探針。
陣列上之相同斑點或陣列上之不同斑點可進一步包括與已知目標互補之未經標記之探針。當用於雜交分析時，確定未經標記之探針與標記目標之雜交訊號強度可確定雜交反應之效率。當個別網絡(亦即陣列上之斑點)均用作可重用性及/或空間對照及雜交對照時，與可重用性對照或空間對照探針之螢光部分不同的螢光部分可用以標記目標分子。
在一些具體實例中，本發明陣列可再使用至少5次、至少10次、至少20次、至少30次、至少40次或至少50次(例如5至20次、5至30次、10至50次、10至20次、10至30次、20至40次或40至50次，較佳包含再使用陣列10至50 次)。可用鹽溶液在變形條件(例如低鹽濃度及高溫)下洗滌陣列。舉例而言，可在使用之間用1-10mM磷酸鹽緩衝液在80-90℃下洗滌陣列。可基於目標：探針雜合物之長度(Tm)而選擇洗滌溫度。
陣列之完整性可藉由「可重用性對照」探針確定。可重用性對照探針可經螢光標記或可藉由與經螢光標記之互補核酸雜交來偵測。在核酸之完整性受損之前，經螢光標記之可重用性對照探針之螢光標記可藉由重複激發來漂白；在此等情況下任何其他重新使用可包括偵測與作為對照之經螢光標記之互補核酸的雜交。典型地，本發明陣列穩定至少6個月。
在各種具體實例中，經螢光標記之可重用性對照探針在使用5、10、20、30、40或50次後保留至少99%、95%、90%、80%、70%、60%或50%之其初始螢光訊號強度。較佳地，可重用性對照探針在使用5或10次後保留至少75%之其螢光訊號強度。陣列可繼續重新使用直至可重用性對照探針在例如重新使用20、30、40或50次後保留至少50%之其螢光訊號強度。可在以下各者之間測試對照探針之螢光訊號強度：每次重新使用、每隔一次重新使用、每第三次重新使用、每第四次重新使用、每第五次重新使用、每第六次重新使用、每第七次重新使用、每第八次重新使用、每第九次重新使用、每第十次重新使用或上文之組合。舉例而言，可在最初5或10次重新使用之間週期性地測試訊號強度，且測試頻率隨重新使用之數目增加，使得其在某一數目(例如5、10、20、30、40或50次)使用後的各重新使用後測試。在一些具體實例中，測試頻率平均一次/1、1.5、2、2.5、3、4、5或10次使用，或平均值在前述值中之任兩者之間界定的範圍內，例如一次/1-2次使用、一次/1-1.5次使用、一次/1-3次使用或一次/1.5-3次使用。
應指出出於方便及參考目的，包括「空間對照」、「可重用性對照」及「雜交對照」之命名法，且不意欲意味提及「空間對照」、「可重用性 對照」及「雜交對照」之探針按此使用之要求。
4.3 用於製備三維聚合物網絡之方法
在一個態樣中，用於製備三維聚合物網絡之本發明方法包含(a)將包含鹽水溶液、聚合物、交聯劑及視需要選用之一或多種探針之混合物曝露至鹽晶體形成條件，(b)將混合物曝露至交聯條件以使聚合物交聯而形成交聯聚合物網絡，及(c)使交聯聚合物網絡與溶劑接觸以溶解鹽晶體且形成一或多個輸送通道。
該等方法可進一步包含一步驟：藉由組合鹽水溶液、聚合物、交聯劑及視需要選用之一或多種探針而形成混合物，及/或進一步包含一步驟：將混合物曝露至鹽晶體形成條件之前將混合物塗覆至基板(例如描述於章節4.2中之基板)。若正使用的聚合物具有預附著之交聯劑(例如當使用由包含交聯劑之單體聚合之共聚物時)，則形成混合物之步驟可包含將鹽水溶液與聚合物及視需要選用之一或多種探針組合。
在將混合物曝露至鹽晶體形成條件之前，可例如藉由將混合物噴塗於基板表面(例如表面上之1024個位點處)上將混合物塗覆至基板。可使用例如DNA晶片測位儀或噴墨印刷機將混合物塗覆至表面。在一較佳具體實例中，使用噴墨印刷機噴塗混合物。此准許混合物簡單且快速塗覆至基板上之大量斑點。斑點可按例如呈若干列及/或行形式之矩陣的形式排列。較佳地，在印刷期間混合物中之鹽含量低於溶解限度，使得混合物在印刷機之印刷頭部中不結晶。在個別斑點處塗覆之混合物之體積可為例如100pl、200pl、300pl、400pl、500pl、750pl、1nl、2nl、3nl、4nl或5nl，或可選自藉由前述值中之任兩者界定之範圍(例如100pl至5nl、100pl至1nl、300pl至1nl、200pl至750nl、100pl至500pl、200pl至2nl、500pl至2nl、1nl至2nl等等)。在較佳具體實例中，斑點體積為200pl至4nl。
個別斑點之直徑將視混合物組成、所塗覆混合物之體積及基板之表面化學性質而定。斑點直徑典型地在80μm至1000μm之間的範圍內且可藉由改變前述參數獲得。在各種具體實例中，斑點直徑為80μm、100μm、120μm、140μm、160μm、180μm、200μm、300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、800μm、900μm或1000μm，或選自藉由前述具體實例中之任兩者界定之範圍，例如80μm至200μm、100μm至120μm、120μm至140μm、120μm至180μm、140μm至160μm、160μm至180μm、180μm至200μm、120μm至200μm、100μm至400μm、160μm至600μm或120μm至700μm等等。在一較佳具體實例中，直徑在100μm至200μm或其子範圍的範圍內。
可用於本發明方法之適合聚合物、交聯劑及探針分別描述於章節4.1.1、4.1.2及4.1.4中。在一些具體實例中，方法中所使用之聚合物每聚合物分子具有至少一個交聯劑基團。在一較佳具體實例中，聚合物每分子具有至少兩個交聯劑基團。在一尤佳具體實例中，聚合物每分子具有至少兩個光反應性交聯劑基團。在此等具體實例中，不需要單獨的聚合物及交聯劑分子。
可包含於混合物中之適合鹽描述於章節4.3.1中。適合之鹽晶體形成條件描述於章節4.3.2中。適合之交聯條件描述於章節4.3.3中。用於溶解鹽晶體之適合溶劑描述於章節4.3.4中。
4.3.1. 鹽
本發明的聚合物網絡的特徵在於，該輸送通道係當聚合物在包含由含有至少二種類型鹽的水溶液形成的鹽晶體的混合物中交聯所得。
較佳可針對鹽與一或多種探針之相容性而選擇鹽。理想地，鹽具有一或多個以下特徵：(i)鹽對探針不具有毒性(例如鹽不使探針變性)，(ii)鹽不以化學方式與探針反應，(iii)鹽不攻擊適用於光學標記探針之螢光團，諸如花青染料，及/或(iv)鹽不與分析物、偵測分子及/或結合至其上之結合配偶 體反應，及/或(v)鹽形成針形晶體。較佳者，至少一種鹽形成針形晶體。
較佳具體實例中，鹽水溶液包含至少二種類型單價陽離子，舉例而言二種類型鹼金屬陽離子。可供使用的鹼金屬陽離子包含鈉陽離子及鉀陽離子，雖然其他鹼金屬陽離子，諸如鋰陽離子，也可供使用。
對於用於檢測核酸分析物的最佳信雜比而言，鹽水溶液較佳包含鈉及鉀陽離子及/或具有總的單價陽離子濃度，使得當與聚合物溶液及視需要選用之探針溶液組合時(在交聯之前)，所得混合物的總單價陽離子濃度至少為500mM。在特定具體實例中，混合物中的鈉離子濃度為至少250mM，並且可以為250mM至500mM的範圍，更佳為300mM至400mM的範圍。在特定具體實例中，混合物中的鈉離子濃度為350mM。混合物中的鉀離子濃度較佳為至少150mM，並且較佳為150mM至500mM的範圍，更佳為200mM至400mM的範圍，又更佳為250mM至至350mM的範圍。
可使用磷酸氫二鈉(Na2HPO4)及/或磷酸二氫鈉(NaH2PO4)製備水溶液，在水溶液中釋出Na+陽離子以及磷酸鹽離子PO4 3-。也可使用磷酸氫二鉀(K2HPO4)及/或磷酸二氫鉀(KH2PO4)製備水溶液。
較佳的，水溶液可為包含磷酸氫二鈉及磷酸二氫鈉二者，補充磷酸氫二鉀(K2HPO4)及/或磷酸二氫鉀(KH2PO4)的磷酸鈉緩衝液。在一個具體實例中，包含磷酸氫二鈉及磷酸二氫鈉二者的磷酸鈉緩衝液以及包含磷酸氫二鉀及磷酸二氫鉀二者的磷酸鉀緩衝液係分別製備，並且在與聚合物及/或探針溶液混合之前或之後併入單一水溶液。
一般而言，鹽水溶液較佳具有的pH在6至9範圍，且更佳在7-8.5範圍。在特定例示具體實例中，pH為7.5、8或8.5，最佳為8。
對網絡包含以基於蛋白質的探針生物分子而言，水溶液可包含經磷酸鹽緩衝液化之鹽水(「PBS」)及/或單價硫酸鹽陽離子。
4.3.2. 鹽晶體形成條件
鹽晶體形成條件可包含使混合物脫水或冷卻混合物直至混合物中之相對鹽含量增加至高於溶解限度(意謂混合物經鹽過飽和)，在混合物中形成至少一種鹽晶體，較佳針形鹽晶體。此促進鹽晶體自位於混合物體積中之結晶胚朝向混合物表面形成。不受理論束縛，據信使用包含至少二種不同單價金屬離子的水溶液會導致形成至少二種不同類型的鹽晶體。
可藉由加熱混合物、將混合物曝露至真空及/或降低混合物周圍之大氣的濕度來使混合物脫水。
可藉由將混合物置於經加熱基板或表面(例如在約50℃至約70℃之間)上、加熱已置放混合物之基板或表面(例如至約50℃至約70℃之間)及/或使混合物與熱氣體(例如溫度高於混合物溫度之空氣、氮氣或二氧化碳)接觸使得水自混合物中蒸發來加熱混合物。與熱氣體接觸可例如藉由將混合物置放於加熱烘箱中發生。在輸送到加熱烘箱期間，混合物可以保持在40%或更高的濕度，例如在約60%的相對濕度下，儘管更高的相對濕度，甚至高達75%或更高，也是可行的。具有較高鉀離子濃度的混合物可以耐受較低的相對濕度，並且具有較低鉀鹽濃度的混合物較佳在輸送期間保持較高的相對濕度。
藉加熱混合物，也可能活化可熱活化的交聯劑(若存在)，且藉此使聚合物交聯。
在一些具體實例中，用以使混合物脫水之經加熱基板及/或空氣之溫度為20℃或更高，高於加熱混合物之前的混合物溫度，但小於100℃。
可藉由將混合物置放於冷卻之基板或表面(例如在約5℃至約15℃之間)上、冷卻已置放混合物之基板或表面(例如至約5℃至約15℃之間)及/或使其與冷氣體(例如溫度低於混合物溫度之空氣、氮氣或二氧化碳)接觸來冷卻混合物。當冷卻時，混合物中鹽之溫度依賴性溶解限度減小直至混合物最 終經鹽過飽和。在一些具體實例中，藉由將混合物培育在具有低濕度(例如溫度在0℃與10℃之間，相對濕度<40%)之冷室中來冷卻混合物。
在形成該一或多種鹽晶體期間，混合物中之溫度較佳保持高於混合物周圍之環境空氣之露點。此防止混合物變得用由環境空氣冷凝之水稀釋，其可導致混合物中相對鹽含量之降低。
4.3.3. 交聯條件
可基於所使用交聯劑之類型選擇交聯條件。舉例而言，當使用藉由紫外光活化之交聯劑(例如二苯甲酮、噻噸酮或安息香乙醚)時，交聯條件可包含將混合物曝露至紫外(UV)光。在一些具體實例中，使用波長為約250nm至約360nm(例如260±20nm或355±20nm)之UV光。使用更低能量/更長波長之UV光(例如相較於254nmUV光，使用360nmUV光)可需要更長之曝露時間。當使用藉由可見光活化之交聯劑(例如乙基伊紅、伊紅Y、玫瑰紅、樟腦醌或赤蘚紅)時，交聯條件可包含將混合物曝露至可見光。當使用經熱活化之交聯劑(例如4,4'偶氮雙(4-氰基戊酸)及2,2-偶氮雙[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二鹽酸鹽或過氧化苯甲醯)時，交聯條件可包含將混合物曝露至熱。
可選擇交聯條件之長度及強度以影響聚合物分子與其他聚合物分子之交聯，聚合物分子與探針分子之交聯(若存在)及聚合物分子與存在於基板上之基板分子或有機分子之交聯(若存在)。用於含有探針之混合物的交聯條件之長度及強度可以實驗方式確定以平衡例如探針分子固定及誕生的穩固。
4.3.4. 鹽晶體溶解
在交聯聚合物之後，可以將鹽晶體溶解在溶劑中，使得在網絡中形成至少一個輸送通道。不受理論束縛，據信在晶體形成過程中使用兩種類型的單價鹽陽離子產生至少兩種類型的晶體、緻密晶體及針形晶體。緊密晶體的 溶解被認為導致短通道，在網絡中產生海綿狀效果，由針形晶體溶解導致的長通道所刺穿。
當使用藉由本發明方法產生之陣列作為生物感測器時，准許高量測精確性及高量測動態。
用於溶解該一或多種鹽晶體之溶劑可以使得其與聚合物及探針(若存在)相容的方式經選擇(例如溶劑可經選擇使得其不溶解聚合物及探針)。較佳地，所使用溶劑為基於水之緩衝液，諸如稀釋之磷酸鹽緩衝液。甲醇、乙醇、丙醇或此等液體之混合物可添加至緩衝液中以促進非結合聚合物自網絡移除。
移除鹽晶體後，網絡可歸因於乾燥而塌陷且可再水化。將網絡乾燥具有運送且穩定化探針生物分子之優勢。
4.3.5. 使用三維網絡之方法
本發明之網絡及陣列可用以判定是否在樣品、較佳液體樣品中存在分析物。本發明因而提供用於判定分析物是否存在於一樣品或複數個樣品中之方法，其包含使包含能夠結合至分析物之探針分子的本發明之網絡或陣列與該樣品或複數個樣品接觸，且偵測分析物與探針分子之結合，從而判定分析物是否存在於該樣品或複數個樣品中。當包含能夠結合不同種類分析物之不同種類探針的陣列用於方法時，可藉由偵測不同種類分析物與探針之結合來確定不同種類分析物之存在。在一些具體實例中，該方法進一步包含一步驟：量化結合至陣列之一或多種分析物的量。
分析物可為例如核酸，諸如聚合酶鏈反應(PCR)擴增子。在一些具體實例中，PCR擴增子自生物或環境樣品(例如血液、血清、血漿、組織、細胞、唾液、痰、尿液、腦脊髓液、胸膜液、乳汁、淚液、大便、汗水、精液、整個細胞、細胞成分、細胞塗片或其提取物或衍生物)中擴增。在一些具體實 例中，核酸經標記(例如經螢光標記)。
置於網絡表面上之分析物可經由輸送通道穿透於網絡內部中以便特異性結合至在那裏共價結合至聚合物之探針(例如生物分子)。當使用固定有網絡之本發明陣列作為生物感測器時，准許高量測精確性以及高量測動態。
用作生物感測器後本發明之網絡及陣列可再生且可使用若干次(例如5次、至少10次、至少20次、至少30次、至少40次或至少50次)。若探針分子為DNA，則此可例如藉由在1×磷酸鹽緩衝鹽水中將一或多個網絡加熱至80℃與90℃之間的溫度約10分鐘來實現。隨後，可用新磷酸鹽緩衝鹽水來更換磷酸鹽緩衝鹽水以自一或多個網絡中洗滌出變性之DNA。若一或多個網絡或陣列之探針分子為抗原，則一或多個網絡或陣列可藉由使一或多個網絡與0.1N NaOH接觸約10分鐘來再生。隨後，可用磷酸鹽緩衝鹽水更換0.1N NaOH以自網絡中洗滌出抗原。因此，使用本發明之網絡及陣列的方法之一些具體實例包含在與一樣品或複數個樣品接觸之前使用已經洗滌之網絡或陣列。
4.4. 本發明陣列之應用
因為本發明陣列獲得對核酸在樣品中之定性及存在之低成本確定，對於與人類及非人類動物之健康及疾病相關之問題，其具有即時應用。
在此等應用中，含有目標分子之製備物根據此項技術中已知之方案自生物或環境來源衍生或提取。目標分子可自所有分類級別之細胞及組織衍生或提取，包括所有門及綱之病毒、細菌及真核生物、原核生物、原生生物、植物、真菌及動物。動物可為脊椎動物、哺乳動物、靈長類動物且尤其為人類。血液、血清、血漿、組織、細胞、唾液、痰、尿液、腦脊髓液、胸膜液、乳汁、淚液、大便、汗水、精液、整個細胞、細胞成分及細胞塗片為目標分子之適合來源。
目標分子較佳為自前述來源中之任一者擴增(例如藉由PCR)之 核酸。
本發明陣列可包括適用於偵測人類或非人類動物之病原體之探針。此類探針包括與細菌、病毒或真菌目標或細菌、病毒及真菌目標之任何組合至少部分互補的寡核苷酸。
本發明陣列可包括適用於偵測人類或非人類動物細胞中之基因表現之探針，例如出於診斷個體、監測個體治療或預測個體結果的目的，與諸如癌症、心血管疾病或代謝疾病之疾病或病症相關的基因表現。隨後基因表現資訊可追蹤疾病進展或消退，且此類資訊可幫助監測初始療法之成功或改變其過程。
5. 例示性方案
涉及圖中所提供之參考編號之以下例示性方案在本發明範疇內且可分別結合章節4.1.1、4.1.2及4.1.4之聚合物、交聯劑及探針而使用。用於以下方法中之其他適用聚合物(包括共聚物)及交聯劑基團描述於Rendl等人，2011，Langmuir 27：6116-6123及US 2008/0293592中，其之內容以引用之方式併入本文中。在一個具體實例中，使用根據章節6.2之聚合物混合物。
5.1 例示性方案1
將具有較佳為有機之表面(2)之盤置於經加熱固持器(6)上。在50℃與70℃之間的溫度為適合的。使用標準DNA晶片測位儀(例如Scienion，Germany)將含有聚合物(3)、探針生物分子(1)及鹽水溶液之混合物(5)點樣於有機表面(2)上。將0.5至4nl之體積印刷於各斑點(7)上(參見圖2)。此等斑點之液體幾乎立即乾燥，導致鹽晶體(8)、(14)成核。成核後，針形鹽晶體可自位於混合物(5)之體積中之至少一種結晶胚(9)延伸至混合物(5)之表面(10)(參見圖3)。此外，據信，形成較短的立方體或桿狀晶體(14)(參見圖3)。晶體(8)、(14)成核後，在UV交聯儀中立即用光學UV輻射(11) 照射斑點(7)(參見圖4)，使得探針生物分子(1)共價結合至聚合物(3)，且聚合物(3)共價結合至有機表面(2)且經交聯(參見圖5)。注意經乾燥交聯的混合物(5)不吸引濕氣而再次變成液體。
隨後使乾燥交聯之混合物(5)與用於晶體(8)之溶劑(12)接觸，使得在晶體(8)、(14)之地點處，長(13)及短(19)通道形成於包含聚合物(3)及探針生物分子(1)之網絡(15)中(參見圖6)。此後，移除溶劑(12)。長通道(13)可自網絡(15)之表面(16)延伸於網絡(15)之內部中。以使得其與探針生物分子(1)以及聚合物(3)相容的方式選擇溶解鹽晶體(8)、(14)之溶劑(12)。較佳地，所使用之溶劑(12)為基於水的。
5.2 例示性方案2
使用標準DNA晶片測位儀(例如Scienion，Germany)將含有聚合物(3)、探針生物分子(1)及鹽水溶液之混合物(5)點樣於在盤上佈置之有機表面(2)上。將0.5至4nl之體積印刷於各斑點(7)上(參見圖2)。將於表面(2)(較佳為有機)上具有斑點(7)之盤置於經冷卻固持器(6)上(參見圖3)。在5℃與15℃之間的溫度為適合的。將此等斑點液體冷卻至達至幾乎立即引起晶體成核之緩衝液過飽和。成核後針形鹽晶體(8)可自位於混合物(5)之體積中之至少一種結晶胚(9)延伸至混合物(5)之表面(10)。此外，據信，形成較短的立方體或桿狀晶體(14)(參見圖3)。印刷後將此等目標置於烘箱(例如在70℃下)中以完成乾燥。晶體成核後，在UV交聯儀中立即用光學UV輻射(11)照射斑點(參見圖4)，使得探針生物分子(1)共價結合至聚合物(3)，且聚合物(3)共價結合至有機表面(2)且經交聯。注意經乾燥交聯的混合物不吸引濕氣而再次變成液體。
隨後使經乾燥交聯的混合物(5)與溶劑(12)接觸以溶解晶體(8)、(14)，使得在晶體(8)、(14)之地點處，輸送通道如長通道(13) 及短通道(19)形成於包含聚合物(3)及探針生物分子(1)之網絡(15)中。此後，移除溶劑(12)。長通道(13)可自網絡(15)之表面(16)延伸於網絡(15)之內部中。以使得其與探針生物分子(1)及聚合物(3)相容的方式選擇溶解鹽晶體(8)、(14)之溶劑(12)。較佳地，所使用之溶劑(12)為基於水的。
如圖6中可見，複數個長通道(13)及短通道(19)可形成於網絡(15)中。長通道(13)可自網絡(15)之表面(16)延伸至位於網絡(15)內之至少一個點。長通道(13)可以使得長通道(13)之間的橫向距離在內部方向上自表面(16)開始減小之方式佈置。
5.3. 例示性方案3
在正常條件下在40-80%、較佳50-70%範圍內之濕度下將含有聚合物(3)、探針生物分子(1)及鹽水溶液之混合物(5)印刷於盤之表面(2)(較佳為有機)之上。混合物可包含例如350mM磷酸鈉，pH 8及250-300mM磷酸鉀，pH 8。將0.5至4nl之體積印刷於各斑點(7)上。印刷隔室中之水分含量確保斑點(7)保持液體而無晶體形成(亦即不發生成核)。隨後將盤置於容器中，例如卡紙板盒。將蓋子安放於盤上以用於輸送。隨後將於具有斑點(7)之盤置於乾燥烘箱中或熱板上以快速引起成核，使得針形鹽晶體(8)自位於混合物體積中之至少一種結晶胚(9)朝向混合物(5)之表面(10)延伸。此外，據信，形成較短的立方體或桿狀晶體(14)。
烘箱/熱板之溫度應為20℃或更高，高於印刷溫度。不需要高於100℃之溫度。
在乾燥之後，照射混合物以使聚合物(3)、探針生物分子(1)及表面(2)交聯。
隨後使經乾燥交聯的混合物(5)與溶劑(12)接觸，使得在晶 體(8)、(14)之地點處，長通道(13)及短通道(19)形成於包含聚合物(3)及探針生物分子(1)之網絡(15)中。此後，移除溶劑(12)。長通道(13)可自網絡(15)之表面(16)延伸於網絡(15)之內部中。以使得其與探針生物分子(1)及聚合物(3)相容的方式選擇溶解鹽晶體(8)、(14)之溶劑(12)。較佳地，所使用之溶劑(12)為基於水的。
5.4. 例示性方案4
或者，可冷卻如在例示性方案3中製備之於較佳為有機表面(2)上具有斑點(7)之盤以藉由置於具有低濕度(例如溫度<10℃，相對濕度<40%)之冷室中獲得成核。可在開始成核後藉由降低濕度或藉由施加真空來進行乾燥。成核後，針形鹽晶體(8)可自位於混合物(5)之體積中之至少一種結晶胚(9)朝向混合物(5)之表面(10)延伸。此外，據信，形成較短的立方體或桿狀晶體(14)。將於具有斑點(7)之盤置於60℃-70℃下之烘箱中1小時以完全地乾燥斑點。在UV交聯儀(亦即Stratalinker 2400)中在254nm下用1.00 J UV照射斑點(7)。為進行此操作，可將於具有斑點(7)之盤置於較短側平行於腔室門之腔室的中央中。隨後，移出除蓋罩且啟動交聯儀。當機器完成時移出陣列且替換蓋罩。
或者，可使用具有相同波長(例如240-270nm)或更長波長(例如360nm)之其他UV交聯儀。
隨後使混合物(5)與溶劑(12)接觸以溶解晶體(8)，使得在晶體(8)、(14)之地點處，長通道(13)及短通道(19)形成於包含聚合物(3)及探針生物分子(1)之網絡(15)中。此後，移除溶劑(12)。長通道(13)可自網絡(15)之表面(16)延伸於網絡(15)之內部中。以使得其與探針生物分子(1)及聚合物(3)相容的方式選擇溶解鹽晶體(8)、(14)之溶劑(12)。較佳地，所使用之溶劑(12)為基於水的。
6. 實施例
6.1. 背景
實質上如本文所述製備但含有濃度為350mM的磷酸鈉緩衝液(「NaPi」)而沒有第二鹽的聚合物網絡可以乾燥並且如果在加熱板上乾燥期間的濕度不保持在60%或更高時進行相分離。這是因為在較低的濕度水平下，結晶可以在不受控制的方式發生。
期望增加磷酸鈉濃度以避免不受控制的結晶。然而，NaPi的濃度不能顯著增加，因為NaPi晶體可能在印刷機中沉澱並阻塞印刷機噴嘴。
各種鹽(氯化鈉，鈉)與NaPi測試實驗合併使用。但這些鹽都沒有比單獨的NaPi有更好的訊號。通常這些斑點的雜交訊號較差(數據未顯示)。
在正常濕度水平下使乾燥最小化的其他嘗試需要測試經磷酸鹽緩衝的鹽水、檸檬酸鈉緩衝液或磷酸鉀緩衝液代替NaPi，導致聚合物網絡中較低的雜交訊號。
但是當用磷酸鉀緩衝液強化NaPi緩衝液時(如章節6.2所述)，在沒有訊號損失的情況下觀察到液斑的穩定化，特別是當磷酸鉀濃度大於150mM時。
當進行這些實驗時，出現了令人驚訝的觀察結果。在較高的磷酸鉀水平(150mM或更高)下，背景訊號(「噪音」)降低，並且在200mM的濃度下，雜交反應幾乎完全不存在噪音(如章節6.3所述)。這種效應的原因很可能是短通道導致海綿狀聚合物基質被磷酸鈉的長通道刺穿。這兩種結構的組合不僅改善了動力學(雜交)，而且改善了非動力學(洗去未結合或弱結合的材料)。較低的背景訊號降低了背景訊號，因此改善了使用磷酸鈉及磷酸鉀製成的聚合物網絡進行的任何測試的LOD(檢測極限)。
6.2 實施例1：三維聚合物網絡之形成
藉由將10mg交聯聚合物對(二甲基丙烯醯胺)共5%甲基丙烯醯基二苯甲酮共2.5% 4-乙烯基苯磺酸鈉溶解於1.0ml無DNA酶水中來製備10mg/mL聚合物儲備溶液。此藉由劇烈震盪且渦流大約5分鐘直至所有可見聚合物溶解來實現。隨後將儲備溶液包裹於箔片中以保護其免受光的影響且放置在冷凍機中隔夜以確保聚合物完全溶解且使得泡沫減少。聚合物每分子具有至少兩個光反應性基團。
將含有10mg/ml聚合物(PDMAA-5%MABP-2.5%SSNa)、探針生物分子(包括具有Cy3螢光部分的DNA寡核苷酸)及含有350mM磷酸鈉緩衝液的鹽水溶液，並且在一些情況下變化量的磷酸鉀的各種混合物印刷在65%濕度的板的有機表面上。使用Scienion Sciflex印刷機在每個點上列印1.6nl的體積。然後將板放入容器，紙板箱中。將蓋子放在具有有機表面的板上以便輸送。然後將具有有機表面上的斑點的板放入乾燥烘箱中或熱板上(70℃)以使鹽晶體成核。在1小時期間的乾燥後，照射板以使聚合物、探針生物分子及有機表面交聯。
在用10mM NaPi緩衝液印刷後洗滌板以除去未結合的物質，然後乾燥並儲存。在Sensovation螢光掃描儀中掃描板以目測評估斑點形態。得到的圖像顯示在圖11A中(洗滌後)及圖11B(乾燥後)。
行D及E中的斑點包括不同量的磷酸鉀(如圖11C所示)，而剩餘行中的斑點是使用僅含有磷酸鈉緩衝液的鹽溶液產生的。與僅用磷酸鈉製備的斑點相比，包含磷酸鉀導致更均勻和圓形的聚合物網絡(圖11A-圖11B)。當相對濕度沒有增加時，舉例而言在約40%的正常大氣濕度附近，包含磷酸鉀也允許受控制的結晶。
6.3. 實施例2：聚合物網絡的雜交品質
使用用於檢測金黃色葡萄球菌或大腸桿菌的探針製備如實施例1 中所述的陣列。
用於擴增金黃色葡萄球菌及大腸桿菌的引子對分別用於100個拷貝的金黃色葡萄球菌及大腸桿菌基因組DNA作為模板的PCR反應，並且PCR產物與含有金黃色葡萄球菌和E的陣列雜交。分別為大腸桿菌探針。結果顯示在圖12A-12B中。圖12A顯示與從100個拷貝的金黃色葡萄球菌DNA擴增的PCR產物陣列的雜交。圖12B顯示與從100拷貝的大腸桿菌DNA擴增的PCR產物陣列的雜交。用於圖12A及圖12B的陣列的探針圖如圖12C所示。該研究顯示，使用含有磷酸鉀的鹽水溶液以及磷酸鈉緩衝液製備的聚合物網絡的訊號與使用僅含有磷酸鈉的鹽水溶液製備的聚合物網絡具有相當的訊號。
令人驚訝的是，與僅使用含有磷酸鈉的鹽水溶液製備的聚合物網絡(如圖13所示相比)，使用含有磷酸鉀的鹽水溶液製備的聚合物網絡具有降低的背景「噪音」。圖13顯示在沒有模板的情況下，使用相同的金黃色葡萄球菌或大腸桿菌特異性引子對擴增來自PCR產物雜交的訊號的螢光定量。因此，任何雜交訊號代表背景「噪音」。在存在較高濃度的磷酸鉀的情況下製備的聚合物網絡中不存在背景「噪音」。
7. 特定具體實例
本發明係由以下特定具體實例示範。
1. 一種用於製備三維水凝膠網絡之方法，其包含：(a)使混合物(視需要定位於基板之表面)，曝露於鹽晶體形成條件，其包含：(i)至少二種類型之單價金屬離子，其具有至少500mM之總濃度，(ii)水溶性聚合物鏈，(iii)交聯劑部分，及(iv)視需要選用之探針分子，及 藉此形成包含一或多種鹽晶體之混合物；(b)使包含一或多種鹽晶體之混合物曝露於交聯條件，藉此形成包含一或多種鹽晶體之水凝膠；以及(c)使包含一或多種鹽晶體之水凝膠與溶劑接觸，其中一或多種鹽晶體係可溶的，藉此溶解鹽晶體；藉此形成三維水凝膠網絡。
2. 如具體實例1之方法，其中混合物包含至少二種類型之單價金屬離子，其具有500mM至1000mM之總濃度。
3. 如具體實例2之方法，其中混合物中單價金屬離子總濃度為550mM至800mM。
4. 如具體實例3之方法，其中混合物中單價金屬離子總濃度為600mM至750mM。
5. 如具體實例1至4中任一方法，其中混合物包含二種類型之單價金屬離子。
6. 如具體實例5之方法，其中每一單價離子之濃度為至少150mM或至少200mM。
7. 如具體實例5或具體實例6之方法，其中單價金屬離子係選自鈉離子、鉀離子、及鋰離子。
8. 如具體實例5或具體實例6之方法，其中單價金屬離子係鈉離子及鉀離子。
9. 如具體實例第8項之方法，其中鈉離子濃度為至少300mM。
10. 如具體實例9之方法，其中鈉離子濃度為300mM至500mM。
11. 如具體實例第10項之方法，其中鈉離子濃度為300mM至400mM。
12. 如具體實例11之方法，其中鈉離子濃度為350mM。
13. 如具體實例8至12中任一方法，其中鉀離子濃度為150mM至500mM。
14. 如具體實例13之方法，其中鉀離子濃度為175mM至400mM。
15. 如具體實例14之方法，其中鉀離子濃度為200mM至350mM。
16. 如具體實例15之方法，其中鉀離子濃度為250mM至350mM。
17. 如具體實例1至4中任一方法，其中混合物包含三種類型單價金屬離子。
18. 如具體實例17之方法，其中至少二種單價離子濃度為至少每一150mM至少每一200mM。
19. 如具體實例17或具體實例18之方法，其中單價金屬離子係選自鈉離子、鉀離子、及鋰離子。
20. 如具體實例19之方法，其中鈉離子濃度為至少250mM。
21. 如具體實例20之方法，其中鈉離子濃度為250mM至500mM。
22. 如具體實例21之方法，其中鈉離子濃度為300mM至400mM。
23. 如具體實例22之方法，其中鈉離子濃度為350mM。
24. 如具體實例19至23中任一方法，其中鉀離子濃度為150mM至500mM。
25. 如具體實例24之方法，其中鉀離子濃度為200mM至400mM。
26. 如具體實例25之方法，其中鉀離子濃度為250mM至350mM。
27. 如具體實例1至26中任一方法，其進一步包含在步驟(a)之前形成混合物。
28. 如具體實例27之方法，其中形成混合物包含合併包含單價金屬離子之鹽水溶液以及一或多種包含水溶性聚合物鏈、交聯劑部分及(若存在)視需要選用之探針分子之溶液。
29. 如具體實例28之方法，其中水溶性聚合物鏈及交聯劑部分係於單一溶液中。
30. 如具體實例29之方法，其中交聯部分係共價連接至聚合物鏈。
31. 如具體實例28至30中任一方法，其中鹽水溶液具有6至9之pH。
32. 如具體實例31之方法，其中鹽水溶液具有7至8.5之pH。
33. 如具體實例32之方法，其中鹽水溶液具有8之pH。
34. 如具體實例28至33中任一方法，其中鹽水溶液包含藉由包含將磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、硫酸鈉、硫酸鉀或其組合溶解於水中或水溶液中之方法製備的溶液。
35. 如具體實例34之方法，其中鹽水溶液係藉由包含將磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀或其組合溶解於水中或水溶液中之方法製備的。
36. 如具體實例35之方法，其中鹽水溶液係藉由包含將磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀及磷酸二氫鉀溶解於水中之方法製備的。
37. 如具體實例1至36中任一方法，其中混合物中磷酸鹽濃度係至少250mM。
38. 如具體實例37之方法，其中混合物中磷酸鹽濃度係至少250mM至1000mM。
39. 如具體實例38之方法，其中混合物中磷酸鹽濃度係至少550mM至800mM。
40. 如具體實例39之方法，其中混合物中磷酸鹽濃度係至少600mM至750mM。
41. 如具體實例1至40中任一方法，其中該鹽晶體形成條件導致形成一或多種針形晶體，以致於在溶解該鹽晶體之後產生一或多種長通道。
42. 如具體實例1至41中任一方法，其中該鹽晶體形成條件導致形成一或多種緻密晶體，以致於在溶解該鹽晶體之後產生一或多種短通道。
43. 如具體實例1至42中任一方法，其中該鹽晶體形成條件包含使混合物脫水。
44. 如具體實例43之方法，其包含藉由加熱混合物、將混合物曝露至真空、降低該混合物周圍之大氣的濕度或其組合來使該混合物脫水。
45. 如具體實例44之方法，其包含藉由將該混合物曝露至真空來使該混合物脫水。
46. 如具體實例44之方法，其包含藉由加熱該混合物來使該混合物脫水。
47. 如具體實例46之方法，其中加熱該混合物包含使該混合物與具有高於該混合物溫度的溫度之氣體接觸。
48. 如具體實例1至42中任一方法，其中該鹽晶體形成條件包含冷卻混合物直到該混合物與鹽變成過飽和。
49. 如具體實例48之方法，其包含藉由使該混合物與具有低於該混合物溫度的溫度之氣體接觸而冷卻該混合物。
50. 如具體實例1至49中任一方法，其中步驟(a)期間該混合物溫度經維持在高於該混合物周圍之大氣露點。
51. 如具體實例1至50中任一方法，其中該交聯劑部分係經紫外(UV)光活化且該交聯條件包含使該混合物曝露於紫外光。
52. 如具體實例1至50中任一方法，其中該交聯劑部分係經可見光活化且該交聯條件包含使該混合物曝露於可見光。
53. 如具體實例1至50中任一方法，其中該交聯劑部分係經熱活化且該交聯條件包含使該混合物曝露於熱。
54. 如具體實例1至53中任一方法，其中the水溶性聚合物鏈包含均聚物鏈。
55. 如具體實例1至54中任一方法，其中該水溶性聚合物鏈包含共聚物鏈。
56. 如具體實例1至54中任一方法，其中該水溶性聚合物包含均聚物與共聚物鏈之混合物。
57. 如具體實例54至56中任一方法，其中水溶性聚合物鏈包含由一或多種種類單體聚合之聚合物鏈。
58. 如具體實例0之方法，其中各種類之單體包含獨立地選自以下各者之可聚合基團：丙烯酸酯基、甲基丙烯酸酯基、乙基丙烯酸酯基、丙烯酸2-苯酯基、丙烯醯胺基、甲基丙烯醯胺基、衣康酸酯基及苯乙烯基。
59. 如具體實例58之方法，其中水溶性聚合物包含甲基丙烯酸酯基。
60. 如具體實例59之方法，其中包含甲基丙烯酸酯基之至少一種單體種類為甲基丙烯醯氧基二苯甲酮(MABP)。
61. 如具體實例0任一方法，其中水溶性聚合物包含由二甲基丙烯醯胺(DMAA)、甲基丙烯醯氧基二苯甲酮(MABP)及4-乙烯基苯磺酸鈉(SSNa)聚合之聚合物。
62. 如具體實例1至61中任一方法，其中水溶性聚合物鏈為包含交聯劑部分之共聚物之鏈。
63. 如具體實例62之方法，其中水溶性聚合物鏈每聚合物分子包含至少兩種交聯劑部分。
64. 如具體實例1至63中任一方法，其中交聯劑部分係選自二苯甲酮、噻噸酮、安息香乙醚、乙基伊紅、伊紅Y、玫瑰紅、樟腦醌、赤蘚紅、4,4'偶氮雙(4-氰基戊酸)、2,2-偶氮雙[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二鹽酸鹽及過氧化苯甲醯。
65. 如具體實例64之方法，其中該交聯劑部分為二苯甲酮部分。
66. 如具體實例1至65中任一方法，其中溶劑為水或水基緩衝液。
67. 如具體實例66之方法，其中溶劑為水。
68. 如具體實例66之方法，其中其中溶劑為水基緩衝液。
69. 如具體實例68之方法，其中水基緩衝液包含磷酸鹽、甲醇、乙醇、丙醇或其混合物。
70. 如具體實例1至69中任一方法，其中步驟(a)之混合物進一步包含探針分子。
71. 如具體實例70之方法，其中至少一些、大多數或所有探針分子包含核酸、核酸衍生物、肽、多肽、蛋白質、碳水化合物、脂質、細胞、配位體或其組合。
72. 如具體實例71之方法，其中至少一些探針分子包含核酸或核酸衍生物。
73. 如具體實例71之方法，其中至少大多數探針分子包含核酸或核酸衍生物。
74. 如具體實例71之方法，其中所有探針分子包含核酸或核酸衍生物。
75. 如具體實例70之方法，其中至少一些、大多數或所有探針分子包含抗體、抗體片段、抗原、抗原決定基、酶、酶受質、酶抑制劑、核酸或其組合。
76. 如具體實例75之方法，其中至少一些探針分子包含核酸。
77. 如具體實例75之方法，其中至少大多數探針分子包含核酸。
78. 如具體實例75之方法，其中所有探針分子包含核酸。
79. 如具體實例76至78中任一方法，其中核酸為寡核苷酸。
80. 如具體實例79之方法，其中寡核苷酸為12至30個核苷酸長度。
81. 如具體實例79之方法，其中寡核苷酸為14至30個核苷酸長度。
82. 如具體實例79之方法，其中寡核苷酸為14至25個核苷酸長度。
83. 如具體實例79之方法，其中寡核苷酸為14至20個核苷酸長度。
84. 如具體實例79之方法，其中寡核苷酸為15至30個核苷酸長度。
85. 如具體實例79之方法，其中寡核苷酸為15至25個核苷酸長度。
86. 如具體實例79之方法，其中寡核苷酸為15至20個核苷酸長度。
87. 如具體實例79之方法，其中寡核苷酸為16至30個核苷酸長度。
88. 如具體實例79之方法，其中寡核苷酸為16至25個核苷酸長度。
89. 如具體實例79之方法，其中寡核苷酸為16至20個核苷酸長度。
90. 如具體實例79之方法，其中寡核苷酸為15至40個核苷酸長度。
91. 如具體實例79之方法，其中寡核苷酸為15至45個核苷酸長度。
92. 如具體實例79之方法，其中寡核苷酸為15至50個核苷酸長度。
93. 如具體實例79之方法，其中寡核苷酸為15至60個核苷酸長度。
94. 如具體實例79之方法，其中寡核苷酸為20至55個核苷酸長度。
95. 如具體實例79之方法，其中寡核苷酸為18至60個核苷酸長度。
96. 如具體實例79之方法，其中寡核苷酸為20至50個核苷酸長度。
97. 如具體實例79之方法，其中寡核苷酸為30至90個核苷酸長度。
98. 如具體實例79之方法，其中寡核苷酸為20至100個核苷酸長度。
99. 如具體實例79之方法，其中寡核苷酸為20至120個核苷酸長度。
100. 如具體實例79之方法，其中寡核苷酸為20至40個核苷酸長度。
101. 如具體實例79之方法，其中寡核苷酸為20至60個核苷酸長度。
102. 如具體實例79之方法，其中寡核苷酸為40至80個核苷酸長度。
103. 如具體實例79之方法，其中寡核苷酸為40至100個核苷酸長度。
104. 如具體實例79之方法，其中寡核苷酸為40至60個核苷酸長度。
105. 如具體實例79之方法，其中寡核苷酸為60至80個核苷酸長度。
106. 如具體實例79之方法，其中寡核苷酸為80至100個核苷酸長度。
107. 如具體實例79之方法，其中寡核苷酸為100至120個核苷酸長度。
108. 如具體實例79之方法，其中寡核苷酸為12至150個核苷酸長度。
109. 如具體實例1至108中任一方法，在步驟(a)之前其進一步包含將混合物塗覆至基板表面之步驟。
110. 如具體實例109之方法，其中混合物以100pl至5nl之體積塗覆。
111. 如具體實例109之方法，其中混合物以100pl至1nl之體積塗覆。
112. 如具體實例109之方法，其中混合物以200pl至1nl之體積塗覆。
113. 如具體實例109至112中任一方法，其中將混合物塗覆至基板之步驟包含將混合物噴塗於基板表面上。
114. 如具體實例113之方法，其中混合物藉由噴墨印刷機噴塗。
115. 如具體實例109至114中任一方法，其中基板包含有機聚合物，或在表 面上具有有機分子之自組裝單層之無機材料。
116. 如具體實例115之方法，其中基板包含有機聚合物。
117. 如具體實例116之方法，其中有機聚合物係選自環烯烴共聚物、聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯及聚甲基丙烯酸甲酯。
118. 如具體實例117之方法，其中基板包含聚甲基丙烯酸甲酯、聚苯乙烯或環烯烴共聚物。
119. 如具體實例115之方法，其中基板包含在表面上具有烷基矽烷自組裝單層之無機材料。
120. 如具體實例109至119中任一方法，其中基板包含微孔盤。
121. 如具體實例109至120中任一方法，其中在步驟(b)中聚合物與表面交聯。
122. 如具體實例121之方法，其中產生水可溶脹聚合物，亦即與表面交聯。
123. 如具體實例122之方法，其中水可溶脹聚合物可吸收高達50倍之去離子蒸餾水之其重量。
124. 如具體實例122或具體實例123之方法，其中水可溶脹聚合物可吸收5至50倍之去離子蒸餾水之其自身體積。
125. 如具體實例122至124中任一方法，其中水可溶脹聚合物可吸收高達30倍之鹽水之其重量。
126. 如具體實例122至125中任一方法，其中水可溶脹聚合物可吸收4至30倍之鹽水之其自身體積。
127. 一種用於製備陣列之方法，其包含藉由如具體實例第1項至第126項中任一項之方法在相同基板之表面上的離散斑點處產生複數個三維水凝膠網絡。
128. 如具體實例127之方法，其中三維水凝膠網絡同時產生。
129. 如具體實例127之方法，其中三維水凝膠網絡依序產生。
130. 如具體實例127至129中任一方法，其進一步包含使該複數個三維水凝膠網絡與基板表面交聯。
131. 一種用於製備陣列之方法，其包含在相同基板之表面上的離散斑點處安置如具體實例1至126中任一方法產生或可獲得的複數個三維水凝膠網絡。
132. 如具體實例127至131中任一方法，其進一步包含使該複數個三維水凝膠網絡與表面交聯。
133. 一種用於製備陣列之方法，其包含在相同基板之表面上的離散斑點處安置根據如具體實例109至126中任一方法產生或可獲得之複數個三維水凝膠網絡。
134. 如具體實例133之方法，其中安置包含在離散斑點處塗覆由其形成三維水凝膠網絡之混合物。
135. 如具體實例127至134中任一方法，其中斑點按行及/或列佈置。
136. 一種三維水凝膠網絡，其藉由如具體實例1至126中任一方法產生或可獲得。
137. 一種陣列，其包含在基板上如具體實例136之複數個三維水凝膠網絡。
138. 一種陣列，其藉由如具體實例127至135中任一方法產生或可獲得。
139. 如具體實例137或具體實例138之陣列，其包含至少8個三維水凝膠網絡。
140. 如具體實例137或具體實例138之陣列，其包含至少16個三維水凝膠網絡。
141. 如具體實例137或具體實例138之陣列，其包含至少24個三維水凝膠網絡。
142. 如具體實例第137項或具體實例第138項之陣列，其包含至少48個三維水凝膠網絡。
143. 如具體實例137或具體實例138之陣列，其包含至少96個三維水凝膠網絡。
144. 如具體實例137或具體實例138之陣列，其包含至少128個三維水凝膠網絡。
145. 如具體實例137或具體實例138之陣列，其包含至少256個三維水凝膠網絡。
146. 如具體實例137或具體實例138之陣列，其包含至少512個三維水凝膠網絡。
147. 如具體實例137或具體實例138之陣列，其包含至少1024個三維水凝膠網絡。
148. 如具體實例137或具體實例138之陣列，其包含24至8192個三維水凝膠網絡。
149. 如具體實例137或具體實例138之陣列，其包含24至4096個三維水凝膠網絡。
150. 如具體實例第137項或具體實例第138項之陣列，其包含24至2048個三維水凝膠網絡。
151. 如具體實例第137項或具體實例第138項之陣列，其包含24至1024個三維水凝膠網絡。
152. 如具體實例137或具體實例138之陣列，其包含24個三維水凝膠網絡。
153. 如具體實例137或具體實例138之陣列，其包含48個三維水凝膠網絡。
154. 如具體實例137或具體實例138之陣列，其包含96個三維水凝膠網絡。
155. 如具體實例137或具體實例138之陣列，其包含128個三維水凝膠網絡。
156. 如具體實例137或具體實例138之陣列，其包含256個三維水凝膠網絡。
157. 如具體實例第137項或具體實例第138項之陣列，其包含512個三維水凝 膠網絡。
158. 如具體實例137或具體實例138之陣列，其包含1024個三維水凝膠網絡。
159. 如具體實例137至158中任一項之陣列，其中三維水凝膠網絡包含探針分子，且三維水凝膠網絡中之兩者或多於兩者包含不同種類探針分子。
160. 如具體實例137至159中任一項之陣列，其中三維水凝膠網絡包含探針分子，且兩個或多於兩個三維水凝膠網絡包含相同種類探針分子。
161. 如具體實例137至158中任一項之陣列，其中三維水凝膠網絡包含探針分子，且三維水凝膠網絡中之每一者包含相同種類探針分子。
162. 如具體實例137至161中任一陣列，其中該複數個三維水凝膠網絡包含包括經標記對照探針分子之一或多個三維水凝膠網絡。
163. 如具體實例162之陣列，其中經標記對照探針分子係經螢光標記。
164. 如具體實例137至163中任一陣列，其中基板包含微孔盤且微孔盤之各孔含有不大於單個之三維水凝膠網絡。
165. 一種用於判定分析物是否存在於樣品中之方法，其包含：(a)使如具體實例136之三維水凝膠網絡或包含能夠結合至分析物之探針分子的如具體實例164任一陣列與樣品接觸；及(b)偵測分析物與三維水凝膠網絡或陣列中之探針分子之結合，從而判定分析物是否存在於樣品中。
166. 如具體實例165之方法，其進一步包含在步驟(a)與(b)之間洗滌包含探針分子之網絡或陣列。
167. 如具體實例165或具體實例166之方法，其進一步包含在步驟(a)之前使包含探針分子之網絡或陣列與阻斷試劑接觸。
168. 如具體實例165至167中任一方法，其進一步包含量化結合至包含探針分子之三維水凝膠網絡或陣列之分析物的量。
169. 一種用於判定分析物是否存在於複數個樣品中之各樣品中的方法，其包含：(a)使包含能夠結合至分析物之探針分子的如具體實例137至164中任一陣列與樣品接觸；及(b)偵測分析物與陣列中之探針分子之結合，從而判定分析物是否存在於該複數個樣品中之各樣品中。
170. 一種用於判定分析物是否存在於複數個樣品中之各樣品中的方法，其包含：(a)使包含能夠結合至分析物之探針分子的如具體實例137至164中任一之陣列與樣品接觸，且包含對照探針分子，其中陣列在步驟(a)之前已經使用且洗滌；及(b)偵測分析物與陣列中之探針分子之結合，從而判定分析物是否存在於該複數個樣品中之各樣品中。
171. 一種用於判定多於一種種類之分析物是否存在於樣品中之方法，其包含：(a)使包含能夠結合至不同種類分析物之不同種類探針分子的如具體實例137至164中任一陣列與樣品接觸；及(b)偵測分析物與陣列中之探針分子之結合，從而判定多於一種種類之分析物是否存在於樣品中。
172. 一種用於判定多於一種種類之分析物是否存在於樣品中之方法，其包含：(a)使包含能夠結合至不同種類分析物之不同種類探針分子的如具體實例137至164中任一陣列與樣品接觸，且包含對照探針分子，其中陣列在步驟(a)之前已經使用且洗滌；及 (b)偵測分析物與陣列中之探針分子之結合，從而判定多於一種種類之分析物是否存在於樣品中。
173. 如具體實例169至172中任一方法，其中：(a)陣列之基板包含微孔盤；(b)微孔盤之各孔含有不大於單個之三維水凝膠網絡；且(c)使陣列與樣品接觸包含使各孔與不大於單個之樣品接觸。
174. 如具體實例169至173中任一方法，其進一步包含在步驟(a)與(b)之間洗滌包含探針分子之陣列。
175. 如具體實例169至174中任一方法，其進一步包含在步驟(a)之前使包含探針分子之陣列與阻斷試劑接觸。
176. 如具體實例169至175中任一方法，其進一步包含量化結合至陣列之一或多種分析物的量。
177. 如具體實例165至176中任一方法，其進一步包含重新使用陣列。
178. 如具體實例177之方法，其中陣列重新使用至少5次。
179. 如具體實例177之方法，其中陣列重新使用至少10次。
180. 如具體實例177之方法，其中陣列重新使用至少20次。
181. 如具體實例177之方法，其中陣列重新使用至少30次。
182. 如具體實例177之方法，其中陣列重新使用至少40次。
183. 如具體實例177之方法，其中陣列重新使用至少50次。
184. 如具體實例178之方法，其包含重新使用陣列5至20次。
185. 如具體實例178之方法，其包含重新使用陣列5至30次。
186. 如具體實例178之方法，其包含重新使用陣列10至50次。
187. 如具體實例178之方法，其包含重新使用陣列10至20次。
188. 如具體實例178之方法，其包含重新使用陣列10至30次。
189. 如具體實例178之方法，其包含重新使用陣列20至40次。
190. 如具體實例178之方法，其包含重新使用陣列40至50次。
191. 如具體實例177至190中任一方法，其包含在重新使用之間洗滌陣列。
192. 如具體實例191之方法，其中陣列在變性條件下洗滌。
193. 如具體實例192之方法，其中變性條件包含將陣列曝露至熱。
194. 如具體實例192之方法，其中變性條件包含將陣列曝露至低鹽濃度。
195. 如具體實例192之方法，其中變性條件包含將陣列曝露至熱及低鹽濃度兩者。
196. 如具體實例192之方法，其中在重新使用之前移除變性條件。
197. 如具體實例196之方法，其中變性條件包含將陣列曝露至熱，並且其中在重新使用之前降低溫度。
198. 如具體實例196之方法，其中變性條件包含將陣列曝露至低鹽濃度，並且其中在重新使用之前增加鹽濃度。
199. 如具體實例196之方法，其中變性條件包含將陣列曝露至熱及低鹽濃度兩者，並且其中在重新使用之前降低溫度且增加鹽濃度。
200. 如具體實例177至199中任一項之方法，其中陣列包含包括經螢光標記之寡核苷酸作為可重用性對照之至少一個三維水凝膠網絡。
201. 如具體實例206之方法，其包含測試螢光訊號強度。
202. 如具體實例201之方法，其中可重用性對照在10次使用後保留至少70%之其初始螢光訊號強度。
203. 如具體實例202之方法，其中可重用性對照在20次使用後保留至少50%之其訊號強度。
204. 如具體實例200至203中任一方法，其中陣列在可重用性對照失去大於50%之其訊號強度後不再重新使用。
205. 如具體實例165至204中任一方法，其中分析物為核酸。
206. 如具體實例205之方法，其中核酸為聚合酶鏈反應(PCR)擴增子。
207. 如具體實例205之方法，其中PCR擴增子自生物樣品或環境樣品擴增。
208. 如具體實例第207項之方法，其中PCR擴增子自生物樣品擴增。
209. 如具體實例第207項之方法，其中PCR擴增子自環境樣品擴增。
210. 如具體實例208之方法，其中生物樣品為血液、血清、血漿、組織、細胞、唾液、痰、尿液、腦脊髓液、胸膜液、乳汁、淚液、大便、汗水、精液、整個細胞、細胞成分、細胞塗片或其提取物或衍生物。
211. 如具體實例210之方法，其中生物樣品為哺乳動物血液、血清或血漿或其提取物。
212. 如具體實例211之方法，其中生物樣品為人類或牛血液、血清或血漿或其提取物。
213. 如具體實例210之方法，其中生物樣品為乳汁或其提取物。
214. 如具體實例213之方法，其中生物樣品為牛乳汁或其提取物。
215. 如具體實例205至214中任一方法，其中核酸經標記。
216. 如具體實例215之方法，其中核酸經螢光標記。
雖然已說明且描述各種特定具體實例，但應瞭解可在不偏離本發明之精神及範疇的情況下做出各種改變。
8. 文獻之引用
本申請案中所引用之所有公開案、專利、專利申請案及其他文獻均出於所有目的特此以全文引用之方式併入，引用的程度就如同個別地指示將各個別公開案、專利、專利申請案及其他文獻以引用之方式併入以用於所有目的一樣。在併入本文中之一或多個文獻之教示內容與本發明不一致之情況下，以本說明書之教示內容為準。
1‧‧‧探針生物分子
3‧‧‧聚合物
4‧‧‧光反應性基團

Claims (18)

  1. 一種用於製備具有一或多個輸送通道之三維水凝膠網絡之方法，其包含：(a)使混合物曝露於鹽晶體形成條件，該混合物包含：(i)至少二種類型之單價金屬離子，其具有至少500mM之總濃度，(ii)水溶性聚合物鏈，(iii)交聯劑部分，及(iv)視需要選用之探針分子，視需要其中該混合物定位於基板之表面，且視需要其中該鹽晶體形成條件包含使該混合物脫水或冷卻該混合物直至該混合物中之相對鹽含量增加至高於溶解限度，藉此形成包含一或多種鹽晶體之混合物；(b)使包含一或多種鹽晶體之該混合物中之該聚合物鏈交聯，藉此形成包含一或多種鹽晶體之水凝膠；及(c)使包含一或多種鹽晶體之該水凝膠與溶劑接觸，其中一或多種鹽晶體係可溶的，藉此溶解該鹽晶體；藉此形成具有一或多個輸送通道之三維水凝膠網絡。
  2. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中該混合物包含至少二種類型之單價金屬離子，其具有500mM至1000mM之總濃度。
  3. 根據申請專利範圍第2項之方法，其中該混合物包含濃度為250mM或更大的鈉離子以及濃度為150mM或更大的鉀離子。
  4. 根據申請專利範圍第3項之方法，其中該鈉離子濃度範圍為300mM至400mM，及該鉀離子濃度範圍為200mM至350mM。
  5. 根據申請專利範圍第1至4項中任一項之方法，其進一步包含在步驟(a)之前形成該混合物，其視需要藉由合併包含單價金屬離子之鹽水溶液以及 一或多種包含該水溶性聚合物鏈、該交聯劑部分及(若存在)該視需要選用之探針分子之溶液。
  6. 根據申請專利範圍第5項之方法，其中鹽水溶液具有範圍為6至9的pH。
  7. 根據申請專利範圍第5項之方法，其中該鹽水溶液係藉由包含將磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀及磷酸二氫鉀溶解於水中之方法製備的。
  8. 根據申請專利範圍第1至4項中任一項之方法，其中該水溶性聚合物鏈包含甲基丙烯基及每個分子至少二種交聯劑部分，視需要其中該交聯劑部分為二苯甲酮部分。
  9. 根據申請專利範圍第8項之方法，其中該水溶性聚合物鏈係由二甲基丙烯醯胺(DMAA)、甲基丙烯醯氧基二苯甲酮(MABP)及4-乙烯基苯磺酸鈉(SSNa)聚合。
  10. 根據申請專利範圍第1至4項中任一項之方法，其中步驟(a)之該混合物包含探針分子，視需要其中該探針分子為核酸分子。
  11. 一種三維水凝膠網絡，其係根據申請專利範圍第1至10項中任一項之方法獲得或可獲得的。
  12. 一種三維水凝膠網絡，其包含交聯的水溶性聚合物鏈及一或多個探針分子並且具有一或多個長輸送通道及一或多個短輸送通道，視需要其中該探針分子為核酸分子。
  13. 根據申請專利範圍第12項之三維水凝膠網絡，其中至少一個短輸送通道被一或多個長輸送通道刺穿。
  14. 一種包含複數個根據申請專利範圍第11至13項中任一項之三維水凝膠網絡之陣列，其中(a)該三維水凝膠網絡係固定於基板上且(b)每一該三維水凝膠網絡係位於該基板上分隔的斑點處，視需要其中該陣列可重覆使用至少 10次。
  15. 一種製備陣列之方法，其包含藉由根據申請專利範圍第1至10項中任一項之方法在相同基板之表面上的離散斑點處產生複數個三維水凝膠網絡以及在步驟(b)期間將該三維水凝膠網絡交聯至該基板。
  16. 一種用於判定分析物是否存在於樣品中之方法，其包含：(a)使根據申請專利範圍第11至13項中任一項之三維水凝膠網絡或根據申請專利範圍第14項之陣列與樣品接觸，該三維水凝膠網絡或陣列包含能夠結合至分析物之探針分子；及(b)偵測該分析物與該三維水凝膠網絡或陣列中之該探針分子之結合，從而判定該分析物是否存在於該樣品中。
  17. 根據申請專利範圍第16項之方法，其中該三維水凝膠網絡或陣列在步驟(a)之前已被使用且洗滌至少10次或其進一步包含在步驟(b)之後再使用該三維水凝膠網絡或陣列至少10次。
  18. 根據申請專利範圍第17項之方法，其進一步包含在該三維水凝膠網絡中為該分析物結合至該探針分子定量。
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