KR102540182B1 - 3차원 중합체 네트워크 및 이들의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 개시내용은 3차원 가교-결합된 중합체 네트워크 수송 채널, 이러한 네트워크를 포함하는 배열, 및 이러한 네트워크 및 배열의 용도를 제공한다.

Description

3차원 중합체 네트워크 및 이들의 용도
1. 배경
미국 공보 제2008/0293592호는 광반응성 가교결합제를 이용하여 유기 표면에서 프로브-생물분자(probe-biomolecule)를 공유결합으로 고정시키는 방법을 기술하고 있다. 이러한 방법은 실란화된 유리 지지체 및 표준 시판 플라스틱으로 제조된 기판(substrate)과 같은 비반응성 표면 위에 프로브의 고정화를 허용하므로 실제로 특히 유리한 것으로 입증되어 있다. 중합체는 제US 2008/0293592호에 기술된 방법에서 사용되어 상부에 프로브 생물분자가 네트워크 표면에서 또는 네트워크 내부에 결합될 수 있는 3차원 네트워크의 유형을 형성한다. 상부에 프로브 생물분자가 단지 2차원 형태로 고정되어 있는 유기 표면과 비교하여, 중합체 및/또는 공중합체 네트워크내 생물분자의 3차원 고정화는 유기 표면에서 프로브 생물분자의 보다 높은 밀도를 허용한다. 이는 유기 표면의 표면 단위(surface unit)당 결합될 수 있는 분석물의 양을 증가시킨다. 따라서, 생물학적 센서로서 표면의 사용은 보다 높은 측정 정밀성 및 고 측정 역학을 야기한다.
그러나, 제U.S. 2008/0293592호에 기술된 방법 및 중합체 네트워크의 단점은 중합체 네트워크의 표면 상에 또는 이에 근접하게 정렬된 프로브 생물분자에 결합하는 분석물 분자 또는 분석물 성분이 네트워크를 차단할 수 있다는 것이다. 이후 추가의 분석물 분자 또는 분석물 구성성분은 이의 내부에서 네트워크의 표면으로부터 보다 큰 거리로 정렬된 아직 결합되지 않은 프로브의 생물분자에 또한 더이상 결합하지 않을 수 있다는 것이다.
따라서, 개선된 중합체 네트워크가 요구되고 있다.
2. 요약
본 개시내용은 가교-결합된 중합체 쇄, 예컨대, 수용성 중합체 쇄, 및 하나 이상의 수송 채널을 포함하는 3차원 중합체 네트워크를 제공한다. 수송 채널(transport channel)은 용액 속의 분자, 예컨대, 분석물 분자가 네트워크내 중합체 쇄에 접근하도록 한다. 특정의 양태에서, 중합체 쇄는 프로브 분자에 가교-결합되며, 수송 채널은 프로브 분자에 분석물을 결합시키기 위한 보다 큰 표면적을 제공한다.
네트워크는 표면에 적합하게 공유결합으로 부착된다. 선행 단락에 내포된 바와 같이, 하나 이상의 프로브, 예를 들면, 생물분자는 네트워크의 표면에 고정될 수 있으며, 네트워크의 내부 전체에서, 샘플내 분석물의 존재를 검출하고/하거나 이의 양을 측정하기 위한 센서(sensor)를 제공한다. 예를 들면, 핵산 프로브는 샘플 속에 존재하는 상보성 핵산을 검출하는데 사용될 수 있으며, 항체 프로브는 샘플 속에 존재하는 항원을 검출하는데 사용될 수 있다. 본 개시내용의 네트워크는 수송 채널이 네트워크의 표면적을 효과적으로 증가시켜, 제공된 양의 시간내에 샘플에 보다 많은 프로브를 노출시키므로 수송 채널을 결여하고 있는 네트워크보다 제공된 양의 분석물의 보다 신속한 하이브리드화를 허용한다. 또한, 본 개시내용의 네트워크는 수송 채널이 문제를 감소시키거나 제거하므로 동일한 용적의 수송 채널-유리된 네트워크보다 더 분석물에 결합할 수 있음으로써 네트워크의 표면에서 또는 근처에서 프로브에 결합된 샘플의 분석물 또는 다른 성분은 네트워크의 내부에 위치한 프로브에 대한 접근을 차단한다. 본 개시내용의 네트워크의 다른 장점은 수송 채널에 의해 가능하게 만들어진 많은 양의 분석물 부하(loading)가 수송 채널-유리된 네트워크를 사용하여 가능할 수 있는 것보다 분석물의 더 민감한 검출을 가능하도록 한다는 것인데, 즉, 신호(signal) 대 노이즈(noise) 비는 제공된 양의 분석물이 보다 작은 네트워크 용적에서 농축될 수 있으므로 채널-유리된 네트워크를 수송하는 것과 비교하여 개선될 수 있다. 본 개시내용의 네트워크의 여전히 다른 장점은 수송 채널에 의해 가능하게 만들어진 높은 분석물 부하가 수송 채널-유리된 네트워크와 비교하여 보다 광범위한 분석물 농도의 정량화를 가능하도록 한다는 것이다.
본 개시내용은 또한 다수의 본 개시내용의 3차원 네트워크 및 기판을 포함하는 배열(array)을 제공한다. 본 개시내용의 배열을 사용하여 하나 이상의 샘플 속의 하나 이상의 분석물을 동시에 검출하고/하거나 측정할 수 있다. 본 개시내용의 배열을 세척하고 재사용하여, 1회용 배열보다 유의적인 비용 장점을 제공할 수 있다. 본 개시내용의 배열의 다른 장점은 개개 네트워크를 제조하는데 필요한 성분들 모두가 제작 공정 동안에 기판의 표면 위에 단일 혼합물로서 적용될 수 있으므로 단순한 방식으로 제작될 수 있다는 것이다.
본 개시내용은 또한 본 개시내용의 3차원 네트워크 및 배열을 제조하는 공정을 제공한다. 본 개시내용의 3차원 네트워크는 적어도 2개 유형의 염 결정, 바람직하게는 침상(needle-shaped)의 염 결정 및 압축 염 결정의 존재하에서 중합체를 가교 결합시키고, 후속적으로 염 결정을 용해하여 가교-결합된 중합체 네트워크 속에 소송 채널을 남겨둠으로써 제조할 수 있다. 이론에 얽메이지 않고, 본 발명자들은 가교-결합 동안 압축 염 결정의 존재는 가교-결합 동안 침상의 염 결정의 존재에 의해 생성된 장 채널(long channel)에 의해 침투된 단 채널(short channel)을 지닌 스폰지-유사 중합체가 생성되는 것으로 고려하고 있다.
본 개시내용은 또한 샘플, 바람직하게는 액체 샘플 속의 분석물을 검출하고/하거나 측정하기 위한 3차원 네트워크 및 본 개시내용의 배열을 사용하는 공정을 제공한다.
3. 도면의 간단한 설명
도 1은 프로브 생물분자(1) 및 수성 염 용액 속에 용해된 분자당 2개의 광반응성 그룹(4)을 포함하는 중합체(3)를 갖는 혼합물의 도식화된 표시를 나타낸다(단락 4.3.1에 기술된 바와 같음).
도 2는 홀더(6)에 위치될 수 있는 표면(2)의 스폿(7)에 위치한 표면(10)을 갖는, 도 1에 나타낸 것과 같은, 혼합물(5)의 점적(drop)을 통한 횡단면을 나타낸다. 표면은 바람직하게는 유기 기판 또는 유기 함유물을 갖는 기판의 것이다. 기판은 바람직하게는 단단하다. 홀더는 수성 염 용액 속에서 염의 조절된 결정화를 허용하는 가열된 홀더 또는 냉각된(chilled) 홀더일 수 있다.
도 3은 혼합물이 가열되고 결정화 기원(crystallization germ)(9)으로부터 연장되는 침상의 염 결정(8) 및 (b) 압축 결정(14) 둘 다가 염 용액 속에서 형성된 후 도 2에 나타낸 정렬을 통과하는 횡단면을 나타낸다.
도 4는 혼합물을 건조시키고 광학적 방사선(11)으로 조사(irradiating)하여 표면(16)을 갖는 중합체 네트워크(15)를 형성시킨 후 도 3에 나타낸 정렬을 통과하는 횡단면을 나타낸다.
도 5는 광학적 방사선으로 조사한 후 도 1의 혼합물의 도식화된 표현을 나타낸다.
도 6은 염 결정을 용매(12)에 용해시켜 장 채널(13) 및 단 채널(19)의 형태의 수송 채널을 형성시킨 후 도 4에 나타낸 정렬을 통과하는 횡단면을 나타낸다.
도 7은 p(디메타크릴아미드 코 메타크릴로일-벤조페논 코 나트륨 4-비닐벤젠설포네이트)의 형성을 위한 반응 경로를 나타낸다.
도 8은 중합체 네트워크(15)가 열(row) 및 컬럼의 매트릭스로서 정렬된 스폿(7)에 위치한 바이오칩(17)의 투시도를 나타낸다. 칩은 바람직하게는 유기 표면을 갖는다.
도 9는 도 8에 나타낸 바와 같은 바이오칩(17)의 상면도를 나타내며, 여기서 각각의 중합체 네트워크(15)는 직경(D)를 가지고, 여기서 열 및 컬럼은 중합체 네트워크(15)의 중심 점으로부터 측정된, 거리 Y 및 거리 X 각각에 의해 분리된다.
도 10은 직경(D)를 갖는 중합체 네트워크(15)가 중합체 네트워크의 중심 점으로부터 측정된 거리 X에 의해 분리된 가요성 기판 밴드(18)를 포함하는 바이오센서(17')를 나타낸다.
도 11a 내지 11c는 건조 전(도 11a) 및 후(도 11b)에 중합체 네트워크의 6개의 열(A-F) 및 6개의 컬럼(1-6)을 지닌 바이오칩을 나타내며, 열 D 및 E의 중합체 네트워크를 제조하는데 사용된 염 농도는 도 11c에 나타낸다. 열 D 및 E의 중합체 네트워크는 인산나트륨 및 인산칼륨 둘 다를 함유하는 수성 염 용액을 사용하여 제조하였다. 나머지 열은 350 mM의 농도에서, 인산나트륨 만을 함유하는 수성 염 용액을 사용하여 제조하였다. 열 D 및 E의 중합체 네트워크는 보다 둥글고 균질한 것으로 보인다.
도 12a 내지 12c는 도 12a 내지 도 12c에 따른 배열에 에스. 아우레우스(S. aureus) 및 이. 콜라이(E. coli)-특이적인 프라이머 쌍을 사용한 PCR 반응 생성물의 하이브리드화의 결과를 나타낸다. 도 12a는 에스. 아루레우스 DNA의 100개 카피로부터 증폭된 PCR 생성물의 배열에 대한 하이브리드화를 나타낸다. 도 12b는 이. 콜라이 DNA의 100개 카피로부터 증폭된 PCR 생성물의 배열에 대한 하이브리드화를 나타낸다. 도 12c는 도 12a 및 도 12b에 나타낸 배열에 대한 프로브 맵(probe map)을 나타낸다. 이. 콜라이 = 이. 콜라이 프로브; 살모넬라(Salmonella) = 살모넬라 프로브(이에 대해 이. 콜라이 PCR 생성물은 일부 가교-반응성을 나타낸다); Allstaph = 팬(pan) 스타필로코쿠스(Staphylococcus) 프로브; 에스. 아우레우스 = 에스. 아우레우스 프로브; PCR 대조군 = PCR 증폭 공정에 대한 내부 대조군을 검출하기 위한 프로브; LL = 랜딩 광(landing light), 이는 배열 대조군으로서 사용된 네트워크내 중합체 쇄에 대해 가교-결합된 형광단-표지된 올리고뉴클레오타이드이다.
도 13은 배경 "노이즈"를 나타내는, 주형(template)의 부재하에서 에스. 아루레우스 또는 이. 콜라이-특이적인 프라이머 쌍을 사용하여 증폭시킨 PCR 생성물의 하이브리드화로부터의 형광성 신호의 정량화를 나타낸다. 1번은 스폿 D1을 나타내고, E1; 2번은 스폿 D1을 나타내며, E2; 3번은 스폿 D1을 나타내고, E3; 4번은 스폿 D1을 나타내며, E4; 5번은 스폿 D1을 나타내고, E5; 6번은 스폿 D1을 나타낸다, E6.
4. 상세한 설명
4.1. 3차원 중합체 네트워크
본 개시내용의 3차원 네트워크는 가교-결합된 중합체, 예컨대, Rendl et al., 2011, Langmuir 27:6116-6123 또는 제US 2008/0293592호에 따른 중합체를 포함하며, 이의 내용은 본원에 이의 전문이 참고로 포함된다. 본 개시내용의 3차원 네트워크는 또한 하나 이상의 수송 채널을 포함하며 임의로 또한 예컨대, 중합체 쇄에 대한 가교-결합에 의해 네트워크 상에 고정된 하나 이상의 프로브를 포함할 수 있다.
본 개시내용의 네트워크는 예를 들면, 5 내지 75 nm(예컨대, 10 내지 20 nm, 10 내지 30 nm, 10 내지 40 nm, 10 내지 50 nm, 20 내지 30 nm, 20 내지 40 nm, 20 내지 50 nm, 30 내지 40 nm, 30 내지 50 nm, 또는 40 내지 50 nm)의 메쉬(mesh) 크기(네트워크의 수화된 상태에서 측정됨)를 가질 수 있다. "네트워크의 수화된 상태"는 네트워크가 물 흡수와 관련하여 평형상태에 있음을, 즉, 이것이 수용액 속에서 이것이 방출하는 만큼의 물을 흡수함을 의미한다.
네트워크를 제조하는데 사용될 수 있는 중합체는 단락 4.1.1에 기술되어 있다. 네트워크를 제조하는데 사용될 수 있는 가교-결합은 단락 4.1.2에 기술되어 있다. 하나 이상의 수송 채널의 특징은 단락 4.1.3에 기술되어 있다. 네트워크 상에 고정될 수 있는 프로브는 단락 4.1.4에 기술되어 있다.
4.1.1. 중합체
본 개시내용의 3차원 네트워크는 가교-결합된 단독중합체, 공중합체, 단독중합체의 혼합물, 공중합체의 혼합물, 또는 하나 이상의 단독중합체와 하나 이상의 공중합체의 혼합물을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "중합체"는 단독중합체 및/또는 공중합체를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "공중합체"는 단량체의 2개 이상이 유형(예컨대, 이중합체(bipolymer), 삼중합체, 사중합체 등)으로부터 중합된 중합체를 포함한다. 공중합체는 교호하는 공중합체, 주기적인 공중합체, 통계적 공중합체, 랜덤 공중합체, 블록 공중합체, 직쇄 공중합체 및 측쇄 공중합체를 포함한다. 본 개시내용의 3차원 네트워크는 앞서의 유형의 중합체의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 이러한 중합체를 제조하기 위한 시약 및 방법은 당해 분야에 공지되어 있다(참고: 예컨대, Ravve, A., Principles of Polymer Chemistry, Springer Science + Business Media, 1995; Cowie, J.M.G., Polymers: Chemistry & Physics of Modern Materials, 2nd Edition, Chapman & Hall, 1991; Chanda, M., Introduction to Polymer Science and Chemistry: A Problem-Solving Approach, 2nd Edition, CRC Press, 2013; Nicholson, J.W., The Chemistry of Polymers, 4th Edition, RSC Publishing, 2012; 이들 각각의 내용은 이의 전문이 본원에 참고로 포함된다).
바람직한 중합체는 친수성이고/이거나 친수성 그룹을 함유한다. 중합체는 바람직하게는 수용성이다. 일 구현예에서, 중합체는 바람직한 수준의 수용성을 제공하기 위해 선택된 2개 이상의 단량체 종으로부터 중합된 공중합체이다. 예를 들면, 공중합체의 수용성은 공중합체를 제조하는데 사용된 하전된 단량체, 예컨대, 나트륨 4-비닐설포네이트의 양을 변화시킴으로써 조절할 수 있다.
가교-결합되는 경우, 수용성 중합체는 수-팽윤성 겔 또는 하이드로겔을 형성한다. 하이드로겔은 물 분자와의 수소 결합을 통해 수용액을 흡수한다. 하이드로겔의 전체 흡수성 및 팽윤력은 겔을 제조하는데 사용된 가교-결합제의 유형 및 정도에 의해 조절될 수 있다. 낮은 가교-결합 밀도 중합체는 일반적으로 보다 높은 흡수 능력을 가지며 높은 가교-결합 밀도 중합체보다 더 큰 정도로 팽윤되지만, 높은 가교-결합 밀도 중합체의 겔 강도는 보다 더 단단하며 심지어 보통의 압력하에서 네트워크 형태를 유지할 수 있다.
물을 흡수하는 하이드로겔의 능력은 수용액의 이온 농도의 인자이다. 특정의 구현예에서, 본 개시내용의 하이드로겔은 탈이온화된, 증류수 속에서 이의 중량의 50배 이하로(이의 자체 용적의 5 내지 50배) 및 염수 속에서 이의 중량의 30배 이하(이의 자체 용적의 4 내지 30배)를 흡수할 수 있다. 염수의 감소된 흡수성은 원자가 양이온에 기인하며, 이는 물 분자와 결합하는 중합체의 능력을 방해한다.
본 개시내용의 3차원 네트워크는 1, 2, 3, 또는 3개 이상의 단량체의 종으로부터 중합된 공중합체를 포함할 수 있으며, 여기서 1, 2, 3, 또는 3개 이상의 단량체의 종은 아크릴레이트 그룹(예컨대, 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 메틸 메타크릴레이트, 하이드록시에틸 메타크릴레이트, 에틸 아크릴레이트, 2-페닐 아크릴레이트), 아크릴아미드 그룹(예컨대, 아크릴아미드, 메타크릴아미드, 디메타크릴아미드, 에틸아크릴아미드), 이타코네이트 그룹(예컨대, 이타코네이트, 4-메틸 이타코네이트, 디메틸 이타코네이트) 및 스티렌 그룹(예컨대, 4-메틸 스티렌, 4-에톡시스티렌)으로부터 독립적으로 선택된 중합가능한 그룹을 갖는다. 바람직한 중합가능한 그룹은 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 에타크릴레이트, 2-페닐 아크릴레이트, 아크릴아미드, 메타크릴아미드, 이타코네이트, 및 스티렌이다. 일부 구현예에서, 공중합체를 제조하는데 사용된 단량체 중 하나는 하전되어 있는데, 즉, 나트륨 4-비닐벤젠설포네이트이다.
본 개시내용의 네트워크를 제조하는데 사용된 중합체는 분자당 적어도 1개,적어도 2개, 또는 2개 이상의 가교-결합제 그룹을 포함할 수 있다. 가교-결합제 그룹은 네트워크의 중합체 분자를 서로 및, 임의로 프로브 및/또는 기판에 공유결합으로 결합시키는 그룹이다. 이중 적어도 하나가 가교-결합제를 포함하는, 2개 이상의 단량체(예컨대, 상기 단락에 기술된 것으로부터 독립적으로 선택된 중합가능한 그룹을 갖는 단량체)로부터 중합된 공중합체는 본 개시내용의 3차원 네트워크를 제조하는데 적합하다. 예시적인 가교결합제는 단락 4.1.2에 기재되어 있다. 가교-결합제를 포함하는 바람직한 단량체는 메타크릴로일옥시벤조페논(MABP)이다(참고: 도 7).
바람직한 구현예에서, 공중합체는 가교-결합제를 포함하는 이중합체 또는 삼중합체이다. 특히 바람직한 구현예에서, 공중합체는 p(디메틸아크릴아미드 코 메타크릴로일-벤조페논 코 나트륨 4-비닐벤젠설포네이트)를 포함한다(참고: 도 7).
4.1.2. 가교-결합제
3차원 네트워크에서 가교-결합을 이루는데 적합한 가교-결합 시약(가교-결합제)는 자외선(예컨대, 긴 파장의 UV 광), 가시광, 및 열에 의해 활성화된 것을 포함한다. UV 광에 의해 활성화된 예시적인 가교-결합제는 벤조페논, 티옥산톤(예컨대, 티옥산텐-9-온, 10-메틸페노티아진) 및 벤조인 에테르(예컨대, 벤조인 메틸 에테르, 벤조인 에틸 에테르)를 포함한다. 가시광에 의해 활성화된 예시적인 가교-결합제는 에틸 에오신, 에오신 Y, 로즈 벤갈(rose bengal), 캄포르퀴논 및 에리티로신을 포함한다. 열에 의해 활성화된 예시적인 가교-결합제는 4,4' 아조비스(4-시아노펜타노) 산, 및 2,2-아조비스[2-(2-이미다졸린-2-일)프로판]디하이드로클로라이드, 및 벤조일 퍼옥사이드를 포함한다. 당해 분야에 공지된 다른 가교-결합제, 예컨대, 조사시 라디칼 또는 다른 반응성 그룹을 형성할 수 있는 것을 또한 사용할 수 있다.
4.1.3. 수송 채널
본 개시내용의 3차원 네트워크는 하나 이상의 수송 채널을 함유한다.
수송 채널은 네트워크의 내부에 접근하도록 할 수 있다. 수송 채널은 비교적 큰 횡단면을 가질 수 있지만, 네트워크의 메쉬 크기는 수송 채널 횡단면보다 유의적으로 더 작을 수 있으므로 네트워크는 기계적으로 안정하게 남을 수 있다.
수송 채널은 일종의 고속도로 형태일 수 있으며, 이를 통해 분석물은 신속하게 네트워크의 내부 안 및 밖으로 도입될 수 있다. 분석물의 수송은 확산 및/또는 대류에 의해 수송 채널내에서 달성될 수 있다.
수송 채널은 단락 4.3에 기술된 바와 같이, 염 결정의 존재하에서 가교-결합 중합체 쇄에 의해 형성되는 경우 형성된다. 염 결정이 세척 제거된 후, 수송 채널이 이후 남는다.
이론에 얽메이지 않고, 본 발명자들은 본 개시내용에서 네트워크를 제조하는 방법이 상이한 금속 이온-염 이온 쌍화로부터 생성되는 적어도 2개 유형의 염 결정을 야기하는 것으로 고려한다. 염 결정이 세척 제거되는 경우, 적어도 2개 유형의 수송 채널이 "손실된" 형태의 원리에 따라, 남는다. 수송 채널은 분석물이 네트워크의 내부로 침투하여 네트워크의 내부에 위치하는 프로브에 특이적으로 결합하도록 한다. 또한, 수송 채널은 세척하여, 네트워크내 "붙어있는(stuck)" 분석물로부터 비특이적인 신호의 양을 감소시킨 후 결합되지 않은 분석물이 네트워크의 내부에 존재하도록 한다.
하나의 유형의 수송 채널은 침-형 염 결정으로부터 생성된 장 채널인 것으로 여겨진다. 본원에 사용된 바와 같이, "장 채널"은 (1) 실질적으로 직쇄이고, (2) 네트워크의 수화된 형태인 네트워크내 연장된 통로이며, 적어도 300 nm인 최소 횡단면 및 통로의 최소 횡단면의 적어도 3배, 바람직하게는 5배, 및 보다 바람직하게는 적어도 10배인 길이를 갖는다. 예를 들면, 장 채널의 길이는 장 채널의 최소 횡단면의 3 내지 15배, 5 내지 10배, 또는 10 내지 15배일 수 있다. "실질적으로 직쇄"인 장 채널은 임의의 방향, 즉, X, Y 및 Z 방향으로 45도 이상 방향을 변하지 않고 하나의 방향으로 핵화점(point of nucleation)으로부터 연장되는 것이다. 장 채널은 일반적인 핵화점으로부터 형성하는 침형 결정으로부터 발생하므로, 본 개시내용의 네트워크는 결정화의 원래의 핵화점에 상응하는 네트워크내에 위치하는 지점에서 포함하는 (예컨대, 5, 10개 이상)의 장 채널의 그룹을 포함할 수 있다. 장 채널은 전형적으로 정렬됨으로써, 네트워크의 표면으로부터 내부를 향해 출발하여, 장 채널 사이의 측면 거리는 감소한다.
다른 양태에서, 하나의 유형의 수송 채널은 예를 들면, 입방체 또는 봉형 결정으로부터 형성된 단 채널인 것으로 여겨진다. 본원에 사용된 바와 같이, "단 채널"은 (1) 실질적으로 직쇄이고, (2) 네트워크의 수화된 상태인 네트워크내 통로이며, 바람직하게는 네트워크의 메쉬 크기의 적어도 10배인 최소의 횡단면 및 통로의 최소의 횡단면의 3배 미만(예컨대, 1배 내지 2.75배, 1배 내지 2.5배, 1배 내지 2배, 또는 1배 내지 1.5배의 범위일 수 있는) 길이를 갖는다. "실질적으로 직쇄"인 단 채널은 임의의 방향, 즉, X, Y 또는 Z 방향으로 45도 이상의 방향을 변경시키지 않고 하나의 방향으로 핵화점으로부터 연장되는 것이다. 네트워크 강도를 유지하기 위해, 단 채널은 바람직하게는 네트워크 너비 또는 직경의 1/20번째 이하의 횡단면을 갖는데, 예를 들면, 직경이 200 μm인 배열에서 "스폿" 형태인 네트워크의 경우, 단 채널의 횡단면은 바람직하게는 10 μm 이하이고, 직경이 100 μm인 배열 상의 스폿의 경우, 단 채널의 횡단면은 바람직하게는 5 μm 이하이다. 특정의 양태에서, 단 채널의 횡단면은 약 20 nm 이상, 약 50 nm 이상, 약 100 nm 이상, 약 250 nm 이상, 적어도 500 nm 이상, 또는 약 1 μm 이상이다. 네트워크내 단 채널은 대략(예컨대, +/- 10% 또는 +/- 25%)의 동일하거나 상이한 직경을 가질 수 있다. 특수한 구현예에서, 네트워크내 단 채널은 앞서의 임의의 2개의 직경 사이의 범위의 직경을 가지는데, 예컨대, 이들은 100 nm 내지 10 μm, 50 nm 내지 1 μm, 500 nm 내지 5 μm, 250 nm 내지 10 μm 등의 범위일 수 있다.
이론에 얽메이지 않고, 본 발명자들은 단 채널이 장 채널에 의해 침투된 스폰지 중합체를 생성하는 것으로 고려하고 있다.
4.1.4. 프로브
본 개시내용의 네크워크 상에 고정된 프로브는 생물분자 또는 생물분자에 결합하는 분자, 예컨대, 상보성 결합 파트너(수용체/리간드)의 특이적으로 상호작용하는 시스템의 파트너일 수 있다. 예를 들면, 프로브는 핵산 및 이들의 유도체(예를 들면, RNA, DNA, 로킹된(locked) 핵산(LNA), 및 펩타이드 핵산(PNA)), 단백질, 펩타이드, 폴리펩타이드 및 이들의 유도체(예를 들면, 글루코사민, 항체, 항체 단편, 및 효소), 지질(예컨대, 인지질, 지방산, 예를 들면, 아라키돈산, 모노글리세라이드, 디글리세라이드, 및 트리글리세라이드), 탄소화물, 효소 억제제, 효소 기질, 항원, 및 에피토프(epitope)를 포함할 수 있다. 프로브는 또한 보다 크고 복잡한 구조, 예를 들면, 리포좀, 막 및 막 단편, 세포, 세포 분해물, 세포 단편, 포자, 및 미생물을 포함할 수 있다.
상보성 결합 파트너의 구체적으로 상호작용하는 시스템은 예를 들면, 핵산과 상보성 핵산의 상호작용, PNA와 핵산, 또는 효소/기질, 수용체/리간드, 렉틴/당, 항체/항원, 아비딘/바이오틴 또는 스트렙타비딘/바이오틴 상호작용을 기반으로 할 수 있다.
핵산 프로브는 DNA 또는 RNA, 예를 들면, 올리고뉴클레오타이드 또는 아프타머(aptamer), LNA, PNA, 또는 5' 말단에서 메타크릴 그룹을 포함하는 DNA(5' AcryditeTM)일 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 프로브는, 예를 들면, 12 내지 30, 14 내지 30, 14 내지 25, 14 내지 20, 15 내지 30, 15 내지 25, 15 내지 20, 16 내지 30, 16 내지 25, 16 내지 20, 15 내지 40, 15 내지 45, 15 내지 50, 15 내지 60, 20 내지 55, 18 내지 60, 20 내지 50, 30 내지 90, 20 내지 100, 20 내지 60, 40 내지 80, 40 내지 100, 20 내지 120, 20 내지 40, 40 내지 60, 60 내지 80, 80 내지 100, 100 내지 120 또는 12 내지 150개 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드 프로브는 길이가 15 내지 60개 뉴클레오타이드이다.
핵산 프로브를 사용하는 경우, 프로브 중 모두 또는 단지 일부는 표적 서열에 대해 상보성일 수 있다. 표적 서열에 대해 상보성인 프로브의 부위는 바람직하게는 길이가 적어도 12개 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 길이가 적어도 15, 적어도 18 또는 적어도 20개 뉴클레오타이드이다. 40 또는 50개 이상의 뉴클레오타이드 길이의 핵산 프로브의 경우, 표적 서열에 대해 상보성인 프로브의 부위는 길이가 적어도 25, 적어도 30 또는 적어도 35개 뉴클레오타이드일 수 있다.
항체는, 예를 들면, 폴리클로날, 모노클로날, 또는 키메라 항체 또는 이의 항원 결합 단편(즉, "항원-결합 부위") 또는 이의 단일 쇄, 항체를 포함하는 융합 단백질, 및 예를 들면, 제한없이, 단일 쇄(scFv) 및 도메인 항체(예컨대, 사람, 낙타, 또는 상어 도메인 항체), 맥시보디(maxibody), 미니보디(minibody), 인트라보디(intrabody), 디아보디(diabody), 트리아보디(triabody), 테트라보디(tetrabody), vNAR 및 비스-scFv를 포함하는 항원 인식 부위를 포함하는 면역글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 구조일 수 있다(참고: 예컨대, Hollinger and Hudson, 2005, Nature Biotech 23:1126-1136). 항체는 임의의 부류, 예를 들면, IgG, IgA, 또는 IgM(또는 이의 소-부류), 및 임의의 특수한 부류일 필요가 없는 항체를 포함한다. 이의 중쇄의 불변 도메인의 항체 아미노산 서열에 따라서, 면역글로불린은 상이한 부류로 지정될 수 있다. 면역글로불린의 5개의 주요 부류: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM가 존재하며, 이들 중 수개는 또한 소 부류(동형), 예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 나누어질 수 있다. "항체"는 또한 임의의 각각의 전술한 항체/면역글로불린 유형을 포함한다.
본 개시내용의 3차원 네트워크는 단일 종의 프로브 또는 하나 이상의 종의 프로브(예컨대, 2, 3, 4, 또는 5개 이상의 종)을 포함할 수 있다. 3차원 네트워크는 동일한 표적(예컨대, 동일한 표적의 상이한 에피토프에 결합하는 항체)에 대한 하나 이상의 종을 포함할 수 있고/있거나 다수의 표적에 결합하는 프로브를 포함할 수 있다.
네트워크는 예를 들면, 네트워크내에 존재하는 프로브의 양을 측정하는데 사용될 수 있는 표지된(예컨대, 형광성 표지된) 대조군 프로브 분자를 포함할 수 있다.
프로브는 네트워크(예컨대, 네트워크의 표면 및 내부) 전체에 분포될 수 있다. 바람직하게는, 적어도 하나의 프로브는 네트워크의 표면으로부터 이격되어 있고 적어도 하나의 수송 채널과 인잡하여 있다. 이렇게 위치된 프로브는 이후 수송 채널을 통해 분석물 분자 또는 분석물 성분에 직접 접근가능하다. 일부 구현예에서, 대부분의 프로브는 네트워크의 내부에 위치한다.
하나 이상의 프로브를 네트워크 상에 공유결합으로 또는 비-공유결합으로 고정시킬 수 있다. 예를 들면, 프로브는 가교-결합된 중합체에 가교-결합될 수 있거나 프로브는 네트워크(예를 들면, 네트워크에 공유결합으로 결합된 분자에 대한 결합에 의해)에 비-공유결합으로 결합될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 하나 이상의 프로브는 가교-결합된 중합체에 가교-결합된다. 일부 구현예에서, 대부분의 프로브는 네트워크의 내부에 공유결합으로 결합된다(예컨대, 프로브의 적어도 일부는 수송 채널에 인접하게 된다).
이론에 얽메이지 않고, 본 발명자들은 염 결정(특히 인산염 염 결정)의 존재하에서 3차원 네트워크를 제작하기 위한 단락 4.3에 기술된 공정이 프로브 분자(특히 핵산 프로브 분자)와 염 결정 사이의 정전기 상호작용으로 인하여 중합체와 수송 채널 사이에서 또는 근처에서 프로브 분자의 보다 큰 농도를 생성할 수 있는 것으로 여기고 있다. 따라서, 본 발명의 일부 구현예에서, 본 개시내용은 본 개시내용에 따른 네트워크를 제공하며 여기서 프로브 밀도는 수송 채널에 인접해있지 않은 중합체의 영역내에서 보다 중합체와 수송 채널 사이의 계면에서 더 크다. 다양한 구현예에서, 프로브 밀도는 수송 채널에 인접해있지 않은 중합체의 영역내에서보다 중합체와 수송 채널 사이의 계면에서 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 또는 적어도 50% 더 조밀하다.
네트워크내 프로브 분자의 밀도는 다음의 과정을 사용하여 입증할 수 있다:
네트워크를 예를 들면, 보울(bowl) 속에서 실온에서 수성 액체와 접촉시킨다. 액체는 프로브 분자가 바이오티닐화된 경우 네트워크내 프로브 분자, 예를 들면, 스트렙타비딘과 상호작용하는 모이어티에 부착된 다수의 나노입자를 함유한다. 나노입자의 크기는 네트워크의 메쉬 크기보다 더 작으며 네트워크내 적어도 하나의 유형의 수송 채널의 최소 횡단면보다 더 작아서 나노입자가 중합체 전체에 분포되도록 한다. 적합한 나노입자는 직경이 2 내지 5 나노미터인 양자점(quantum dot)이다.
항온처리 기간은 액체 속의 네트워크가 완전히 수화되도록, 즉, 평균적으로 네트워크가 이것이 방출하는 바와 동일한 양의 물을 취하도록 선택된다. 항온처리 기간은 예를 들면, 1시간일 수 있다. 네트워크내 나노입자의 침투는 항온처리 동안, 예를 들면, 네트워크 및/또는 액체를 진동시킴으로써, 바람직하게는 초음파의 수단에 의해 네트워크 및/또는 액체가 흔들리도록 설정함으로써 가속화시킬 수 있다.
항온처리가 완료된 후, 액체는 예를 들면, 보울로부터 액체를 배수시키거나 네트워크를 보울 박으로 취함으로써 네트워크로부터 분리한다.
이후에, 수화된 네트워크는, 예를 들면, 액체 질소의 수단에 의해 동결시킨다. 이후에, 동결된 네트워크는 상호 평행한 절단 면을 따라 크리오마이크로톰(cryomicrotome)의 보조로 박 슬라이드(thin slice)로 절단할 수 있다. 절단 면은 수송 채널의 장축 연장에 대해 횡방향으로 정렬되어 수송 채널을 침투한다. 절단은 바람직하게는 액체 질소-냉각된 다이아몬드 날(blade)을 사용하여 수행한다. 슬라이스의 두께는 예를 들면, 약 100 nm 또는 200 nm일 수 있다.
현미경의 도움으로, 동결된 네트워크를 절단함으로써 수득된 디스크내에 배치된 나노입자를 위치시킨다. 나노입자는 형광성이고 시각적으로 강조됨으로써 이들이 필요에 따라 네트워크로부터 보다 잘 구별될 수 있도록 할 수 있다. 나노입자의 위치설정은 영상 가공 방법을 사용하여 적합한 소프트웨어로 수행할 수 있다. 디스크를 시험하기 위하여, 바람직하게는 형광성 광학(optics) 또는 전자 현미경이 장착된 공초점 현미경 레이저 스캐닝 현미경을 사용한다.
이러한 방식으로 수득된 나노입자의 기하학 및/또는 위치 정보는 컴퓨터의 보조로, 네트워크내 나노입자의 분포의 3차원 기하학적 모델을 제조하는데 사용될 수 있다. 이후에 모델을 사용하여 나노입자의 분포가 수송 채널의 부위 근처의 프로브 분자의 보다 큰 밀도를 반영하는지의 여부를 측정할 수 있다.
4.2. 배열
본 개시내용의 3차원 네트워크를 기판에 위치((예컨대, 침착)시킬 수 있고, 바람직하게는 기판(예컨대, 네트워크와 기판 사이의 공유결합성 가교-결합에 의해)에 위치시킬 수 있다. 다수의 네트워크를 기판 위에 고정시켜 예를 들면, 바이오칩으로서 유용한 배열을 형성할 수 있다.
적합한 기판은 유기 중합체, 예컨대, 사이클로올레핀 공중합체(COC), 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리카보네이트, 및 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA, Plexiglas®)를 포함한다. Ticona는 적합한 COC의 예를 상표명 Topas® 하에 시판된다. 무기 물질(예컨대, 금속, 유리)은 또한 기판으로 사용될 수 있다. 이러한 기판은 유기 분자로 코팅함으로써 네트워크와 기판 표면 사이에 가교-결합을 허용할 수 있다. 예를 들면, 무기 표면은 자가-조립된 단층(SAM)으로 코팅될 수 있다. SAM는 자체적으로 완전히 비반응성일 수 있으므로 예를 들면, 순수한 알킬 실란을 포함하거나 이로 이루어진다. 다른 기판은 또한 3차원 네트워크에 대한 가교-결합에 적합할 수 있으며, 단 이들은 유리-라디칼 공정 동안 유기 분자(예컨대, 유기붕소 화합물)와의 안정한 결합으로 도입될 수 있다.
기판은 단단하거나 가요성일 수 있다. 일부 구현예에서, 기판은 플레이트의 형상(예컨대, 직사각형 플레이트, 사각형 플레이트, 환형 디스크 등)이다. 예를 들면, 기판은 미세웰 플레이트(microwell plate)를 포함할 수 있으며 3차원 네트워크는 플레이트의 웰 내에 위치할 수 있다.
개개의 네트워크는 기판의 표면, 예컨대, 다수의 컬럼 및 열을 포함하는 매트릭스내 명백한 스폿에 위치할 수 있다. 도 8에 나타낸 구현예에서, 네트워크는 6개의 컬럼 및 6개의 열내에 정렬된 36개의 스폿에 위치한다. 이들 각각의 수가 독립적으로 선택될 수 있는, 상이한 수의 열 및 컬럼을 가진 배열이 고려된다(예컨대, 2 내지 64개 컬럼 및 2 내지 64개 열). 컬럼은 거리 X로 분리되고 열은 거리 Y로 분리되어(예를 들면, 도 9에 나타낸 바와 같이) 개개 네트워크가 위치할 수 있는 스폿의 격자를 형성할 수 있다. X 및 Y는 격자의 스폿에 위치한 네트워크가 탈수된 상태로 서로 접촉하지 않고 수화된 상태로 서로 부착하지 않도록 선택될 수 있다. 치수 X 및 Y는 동일하거나 상이할 수 있다. 일부 구현예에서, X 및 Y는 동일하다. 일부 구현예에서, X 및 Y는 상이하다. 일부 구현예에서, X 및 Y는 적어도 약 500 μm(예컨대, 500 μm 내지 5 mm, 500 μm 내지 4 mm, 500 μm 내지 3 mm, 500 μm 내지 2 mm, 또는 500 μm 내지 1 mm)의 거리로부터 독립적으로 선택된다. 일부 구현예에서, X 및 Y는 둘 다 약 500 μm이다. 다른 구현예에서, X 및 Y는 둘 다 500 μm이다.
일부 구현예에서, 기판은 밴드-형상이다(예를 들면, 도 10에 나타낸 바와 같이). 네트워크는 밴드-형상의 유기 표면의 종 방향으로 연장되는 하나의 열로서 정렬될 수 있거나, 밴드-형상의 표면의 종 방향으로 연장되는 다수의 열로서 정렬될 수 있다. 이러한 밴드-형상의 배열내 열 및 컬럼은 상술한 바와 같이 격자 치수 X 및 Y를 가질 수 있다.
개개 네트워크는 각각 원형 또는 실질적으로 원형인 배열의 표면적을 덮을 수 있다. 전형적으로, 개개 네트워크에 의해 덮여진 배열의 표면 상의 면적의 직경(즉, 스폿 직경)은 80 μm 내지 1000 μm이다. 다양한 구현예에서, 스폿 직경은 80 μm, 100 μm, 120 μm, 140 μm, 160 μm, 180 μm, 200 μm, 300 μm, 400 μm, 500 μm, 600 μm, 700 μm, 800 μm, 900 μm, 또는 1000 μm이거나, 상기 구현예 중 임의의 2개에 의해 결합된 범위, 예컨대, 80 μm 내지 200 μm, 100 μm 내지 120 μm, 120 μm 내지 140 μm, 120 μm 내지 180 μm, 140 μm 내지 160 μm, 160 μm 내지 180 μm, 180 μm 내지 200 μm, 120 μm 내지 200 μm, 100 μm 내지 400 μm, 160 μm 내지 600 μm, 또는 120 μm 내지 700 μm 등의 범위로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서, 직경은 100 μm 내지 200 μm 또는 이의 소범위이다.
본 개시내용의 배열은 전형적으로 적어도 8개의 개개 3차원 네트워크를 가진다. 특정의 양태에서, 배열은 적어도 16개, 적어도 24개, 적어도 48개, 적어도 96개, 적어도 128개, 적어도 256개, 적어도 512개, 또는 적어도 1024개의 개개의 3차원 네트워크를 갖는다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 배열은 24개, 48개, 96개, 128개, 256개, 512개, 1024개, 2048개, 4096개 또는 8192개의 개개 네트워크를 가지거나, 앞서의 구현예 중 임의의 2개에 의해 결합된 범위, 예컨대, 8 내지 128개, 8 내지 512개, 24 내지 8192개, 24 내지 4096개, 48 내지 2048개, 96 내지 512개, 128 내지 1024개, 24 내지 1024개, 48 내지 512개, 96 내지 1024개, 또는 128 내지 512개의 3차원 네트워크 등등으로부터 선택된 다수의 3차원 네트워크를 갖는다. 바람직한 구현예에서, 배열 상의 3차원 네트워크의 수는 8 내지 1024개의 범위이다. 특히 바람직한 구현예에서, 배열 상의 3차원 네트워크의 수는 25 내지 400개의 범위이다.
본 개시내용의 배열을 포함하는 개개의 네트워크는 동일하거나 상이한 프로브(예컨대, 각각의 네트워크는 프로브의 유일한 세트를 가질 수 있고, 다수의 네트워크는 프로브의 동일한 세트를 가질 수 있으며 다른 네트워크는 프로브의 상이한 세트 또는 세트들을 가질 수 있다)를 가질 수 있다. 예를 들면, 매트릭스의 동일한 열에 정렬된 네트워크는 동일한 프로브를 포함할 수 있으며 매트릭스의 상이한 열애 정렬된 네트워크는 상이한 프로브를 가질 수 있다.
전형적으로, 배열 상의 개개의 네트워크는 스폿 직경 및/또는 네트워크 용적에 의해 서로로부터 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하 또는 5% 이하까지 변한다.
일부 구현예에서, 배열은 하나 이상의 대조군 올리고뉴클레오타이드 또는 프로브 분자를 지닌 하나 이상의 개개 네트워크(예컨대, 배열내 스폿)를 포함한다. 대조군 올리고뉴클레오타이드는 공간 대조군으로서 사용하기 위해(배열을 공간적으로 배향시키기 위해) 및/또는 예를 들면, 본 개시내용의 배열을 세척하고 재사용하는 경우(즉, "재사용능 대조군"), 네트워크에 결합된 프로브 분자의 양을 정량화하기 위해, 표지, 예컨대, 형광성으로 표지될 수 있다. 공간적 및 재사용능 대조군 프로브는 동일하거나 상이한 프로브일 수 있다.
배열 상의 동일한 스폿 또는 배열 상의 상이한 스폿은 또한 공지된 표적에 대해 상보성인 표지되지 않은 프로브를 추가로 포함할 수 있다. 하이브리드화 검정에 사용된 경우, 표지된 표적에 대한 표지되지 않은 프로브의 하이브리드화의 신호 강도의 측정은 하이브리드화 반응의 효율을 측정할 수 있다. 개개 네트워크(즉, 배열 상의 스폿)를 재사용능 및/또는 공간 대조군 및 하이브리드화 대조군으로서 둘 다 사용하는 경우, 상이한 형광성 모이어티를 사용하여 재사용능 대조군 또는 공간 대조군 프로브의 형광성 모이어티보다 표적 분자를 표지할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 배열은 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 40배, 또는 적어도 50배(예컨대, 5 내지 20배, 5 내지 30배, 10 내지 50배, 10 내지 20배, 10 내지 30배, 20 내지 40배, 또는 40 내지 50배, 바람직하게는 배열을 10 내지 50회 재사용함을 포함하는) 재사용할 수 있다. 배열은 변성 조건(예컨대, 저 염 농도 및 고온) 하에서 염 용액으로 세척할 수 있다. 예를 들면, 배열은 사용들 사이에 80 내지 90℃에서 1 내지 10 mM 인산염 완충액을 사용하여 세척할 수 있다. 세척액의 온도는 표적:프로브 하이브리드의 길이(Tm)를 기반으로 선택할 수 있다.
배열의 통합성은 "재사용능 대조군" 프로브에 의해 측정할 수 있다. 재사용능 대조군 프로브는 형광성 표지하거나 형광성 표지된 상보성 핵산으로 하이브리드화함으로써 검출할 수 있다. 형광성 표지된 재사용능 대조군 프로브의 형광성 표지는 핵산의 통합성이 절충되기 전에, 반복된 여기(excitation)에 의해 표백시킬 수 있으며; 이러한 경우 임의의 추가의 재사용은 대조군으로서 형광성 표지된 상보성 핵산에 대한 하이브리드화의 검출을 포함할 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 배열은 적어도 6개월 동안 안정하다.
다양한 구현예에서, 형광 표지된 재사용능은 5, 10, 20, 30, 40, 또는 50회 사용 후 이의 초기 형광성 신호 강도의 적어도 99%, 95% 90%, 80%, 70%, 60%, 또는 50%를 보유한다. 바람직하게는, 재사용능 대조군 프로브는 5 또는 10회 사용 후 이의 형광성 신호 강도의 적어도 75%를 보유한다. 배열은 재사용능 대조군 프로브가 예를 들면, 20, 30, 40 또는 50회 재사용 후 이의 형광성 신호 강도의 적어도 50%를 보유할 때까지 지속적으로 재사용될 수 있다. 대조군 프로브의 형광성 신호 강도는 재사용마다, 다른 재사용마다, 제3의 재사용마다, 제4의 재사용마다, 제5의 재사용마다, 제6의 재사용마다, 제7의 재사용마다, 제8의 재사용마다, 제9의 재사용마다, 제10의 재사용마다, 또는 상기의 조합 사이에서 시험할 수 있다. 예를 들면, 신호 강도는 초기에 5 또는 10회 재사용 사이에 및 재사용의 수로 증가시켜 특정의 수(예컨대, 5, 10, 20, 30, 40 또는 50회) 사용 후 각각의 재사용 후에 시험하도록 하는 시험 빈도로 주기적으로 시험할 수 있다. 일부 구현예에서, 시험 빈도는 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 4, 5 또는 10회 사용 당 평균 1회의 평균이거나, 앞서의 값중 임의의 2개 사이에 결합된 범위, 예컨대, 1 내지 2회 사용당 1회, 1 내지 1.5회 사용당 1회, 1 내지 3회 사용당 1회, 또는 1.5 내지 3회 사용당 1회의 평균이다.
"공간 대조군(spatial control)", "재사용능 대조군" 및 "하이브리드화 대조군"의 명명법은 편의 및 참고 목적으로 포함되며 "공간 대조군", "재사용능은 대조군" 및 "하이브리드화 대조군"으로 지칭된 프로브가 자체로 사용되는 요건을 함축하는 것으로 의도되지 않는다.
4.3. 3차원 중합체 네트워크의 제조 공정
일 양태에서, 3차원 중합체 네트워크를 제조하기 위한 본 개시내용의 공정은 (a) 수성 염 용액, 중합체, 가교-결합제 및, 임의로 하나 이상의 프로브를 포함하는 혼합물을 염 결정 형성 조건에 노출시키는 단계, (b) 혼합물을 가교-결합 조건에 노출시켜 가교-결합된 중합체 네트워크를 형성하기 위한 중합체를 가교-결합시키는 단계, 및 (c) 가교-결합된 중합체 네트워크를 용매와 접촉시켜 염 결정을 용해하고 하나 이상의 수송 채널을 형성시키는 단계를 포함한다.
공정은 수성 염 용액, 중합체, 가교-결합제 및, 임의로, 하나 이상의 프로브를 조합함으로써 혼합물을 형성시키는 단계를 추가로 포함할 수 있고/있거나 혼합물을 염 결정 형성 조건에 노출시키기 전에 혼합물을 기판(예컨대, 단락 4.2에 기술된 기판)에 적용시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 사용되는 중합체가 예비-부착된 가교-결합제(예컨대, 가교-결합제를 포함하는 단량체로부터 중합된 공중합체를 사용하는 경우)를 갖는 경우, 혼합물을 형성하는 단계는 수성 염 용액과 중합체 및, 임의로 하나 이상의 프로브를 조합함을 포함할 수 있다.
혼합물은 혼합물을 염 결정 형성 조건에, 예를 들면, 혼합물을 기판(예컨대, 표면 상의 1024개의 부위) 위에 분무함으로써, 노출시키기 전에 기판에 적용시킬 수 있다. 혼합물은 예를 들면, DNA 칩 스포터(chip spotter) 또는 잉크젯 프린터를 사용하여 적용할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 혼합물은 잉크젯 프린터를 사용하여 분무된다. 이는 기판 상의 다수의 스폿에 혼합물의 단순하고 신속하게 적용하는 것을 허용한다. 스폿은 예를 들면, 수개의 열 및/또는 컬럼내에 매트릭스의 형태로 정렬될 수 있다. 바람직하게는, 인쇄 동안 혼합물 속의 염 함량은 용해도 이하이어서 혼합물이 프린터의 인쇄 헤드내에 결정화하지 않도록 제한한다. 개개 스폿에서 적용된 혼합물의 용적은 예를 들면, 100 pl, 200 pl, 300 pl, 400 pl, 500 pl, 750 pl, 1 nl, 2 nl, 3 nl, 4 nl, 또는 5 nl일 수 있거나, 앞서의 값의 임의의 2개에 의해 결합된 범위(예컨대, 100 pl 내지 5 nl, 100 pl 내지 1 nl, 300 pl 내지 1 nl, 200 pl 내지 750 nl, 100 pl 내지 500 pl, 200 pl 내지 2 nl, 500 pl 내지 2 nl, 1 nl 내지 2 nl 등)로부터 선택될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 스폿 용적은 200 pl 내지 4 nl이다.
개개 스폿의 직경은 혼합물의 조성, 적용된 혼합물의 용적, 및 기판의 표면 화학에 의존할 것이다. 스폿 직경은 전형적으로 80 μm 내지 1000 μm 범위일 수 있으며 앞서의 매개변수를 변화시킴으로써 수득할 수 있다. 다양한 구현예에서, 스폿 직경은 80 μm, 100 μm, 120 μm, 140 μm, 160 μm, 180 μm, 200 μm, 300 μm, 400 μm, 500 μm, 600 μm, 700 μm, 800 μm, 900 μm, 또는 1000 μm이거나, 앞서의 구현예 중 임의의 2개로 결합된 범위, 예컨대, 80 μm 내지 200 μm, 100 μm 내지 120 μm, 120 μm 내지 140 μm, 120 μm 내지 180 μm, 140 μm 내지 160 μm, 160 μm 내지 180 μm, 180 μm 내지 200 μm, 120 μm 내지 200 μm, 100 μm 내지 400 μm, 160 μm 내지 600 μm, or 120 μm 내지 700 μm 등으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서, 직경은 100 μm 내지 200 μm 또는 이의 소범위의 범위이다.
본 개시내용의 공정에 사용될 수 있는 적합한 중합체, 가교-결합제, 및 프로브는 각각 단락 4.1.1, 4.1.2, 및 4.1.4에 기술되어 있다. 일부 구현예에서, 공정에 사용된 중합체는 중합체 분자당 적어도 하나의 가교-결합제 그룹을 갖는다. 바람직한 구현예에서, 중합체는 분자당 적어도 2개의 가교-결합제 그룹을 갖는다. 특히 바람직한 구현예에서, 중합체는 분자당 적어도 2개의 광반응성 가교-결합제 그룹을 갖는다. 이러한 구현예에서, 별개의 중합체 및 가교-결합제 분자는 필요하지 않다.
혼합물 속에 포함될 수 있는 적합한 염은 단락 4.3.1에 기술되어 있다. 적합한 염 결정 형성 조건은 단락 4.3.2에 기술되어 있다. 적합한 가교-결합 조건은 단락 4.3.3에 기술되어 있다. 염 결정을 용해시키기에 적합한 용매는 단락 4.3.4에 기술되어 있다.
4.3.1. 염
본 개시내용의 중합체 네트워크는 중합체가 적어도 2개 유형의 염을 함유하는 수용액으로부터 형성된 염 결정을 함유하는 혼합물 속에서 가교-결합되는 경우 생성되는 수송 채널에 의해 특성화된다.
염은 바람직하게는 하나 이상의 프로브와의 이들의 상용성(compatibility)을 위해 선택된다. 이상적으로, 각각의 염은 다음의 특성들 중 하나 이상을 갖는다: (i) 염은 프로브에 대해 독성이 아니며(예컨대, 염은 프로브를 변성시키지 않는다), (ii) 염은 프로브와 화학적으로 반응하지 않고, (iii) 염은 프로브의 광학적 마킹(optical marking)에 적합한, 형광단, 예를 들면, 시아닌 염료를 공격하지 않고/않거나 (iv) 염은 이에 결합된 분석물, 검출 분자, 및/또는 결합 파트너와 반응하지 않는다. 바람직하게는, 적어도 하나의 염은 침-형상의 결정을 형성한다.
바람직한 구현예에서, 수성 염 용액은 적어도 2개 유형의 일가 양이온, 예를 들면, 2개 유형의 알칼리 금속 양이온을 포함한다. 사용될 수 있는 알칼리 금속 양이온은 다른 알칼리 금속, 예를 들면, 리튬 양이온이 또한 사용될 수 있지만, 나트륨 양이온 및 칼륨 양이온을 포함한다.
핵산 분석물의 검출을 위한 최적의 신호:노이즈 비의 경우, 수성 염 용액은 바람직하게는 나트륨 및 칼륨 양이온을 포함하고/하거나 총 일가 양이온 농도를 가짐으로써 중합체 용액 및 임의의 프로브 용액(가교-결합 전)과 합해진 경우, 수득되는 혼합물이 적어도 500 mM의 총 일가 양이온 농도를 가지도록 한다. 특수한 구현예에서, 혼합물 속의 나트륨 이온 농도는 적어도 250 mM이고, 250 mM 내지 500 mM의 범위일 수 있으며, 보다 바람직하게는 300 mM 내지 400 mM 범위이다. 특수한 구현예에서, 혼합물 속의 나트륨 이온 농도는 350 mM이다. 혼합물 속의 칼륨 이온 농도는 바람직하게는 적어도 150 mM이고, 바람직하게는 150 mM 내지 500 mM의 범위, 보다 바람직하게는 200 mM 내지 400 mM의 범위, 및 여전히 보다 바람직하게는 250 mM 내지 350 mM의 범위이다.
수성 염 용액은 수용액 속에서, Na+ 양이온 및 인산염 이온 PO4 3-을 방출하는 인산수소이나트륨(Na2HPO4) 및/또는 인산이수소나트륨(NaH2PO4)을 사용하여 제조할 수 있다. 수성 염 용액은 또한 인산수소이칼륨(K2HPO4) 및/또는 인산이수소칼륨(KH2PO4)을 사용하여 제조할 수 있다.
바람직하게는, 수성 염 용액은 인산수소이칼륨(K2HPO4) 및/또는 인산이수소칼륨(KH2PO4)이 보충된, 인산수소이나트륨 및 인산이수소나트륨 둘 다를 함유하는 인산나트륨 완충액일 수 있다.일 구현예에서, 인산수소이나트륨 및 인산이수소나트륨 둘 다를 함유하는 인산나트륨 완충액 및 인산수소이칼륨 및 인산이수소칼륨 둘 다를 함유하는 인산칼륨 완충액은 별도로 제조하여 중합체 및/또는 프로브 용액과 혼합하기 전 또는 후에, 단일 수용액으로 조합한다.
일반적으로, 수성 염 용액은 바람직하게는 6 내지 9 범위의 pH, 및 보다 바람직하게는 7 내지 8.5 범위의 pH를 갖는다. 특정의 예시적인 구현예에서, pH는 7.5, 8, 또는 8.5, 가장 바람직하게는 8이다.
단백질-계 프로브 생물분자를 함유하는 네트워크의 경우, 수성 염 용액은 인산염 완충된 염수("PBS") 및/또는 일가 양이온 황화물을 포함할 수 있다.
4.3.2. 염 결정 형성 조건
염 결정 형성 조건은 혼합물을 탈수시키거나 혼합물 속의 상대적인 염 함량이 용해도 한계 이상으로 증가할 때까지 혼합물을 냉각시키는 단계를 포함할 수 있으며, 이는 혼합물이 염으로 과포화됨을 의미한다. 이는 혼합물의 표면을 향해 혼합물의 용적 속에 위치한 결정화 미생물로부터 염 결정의 형성을 촉진한다. 이론에 얽메이지 않고, 적어도 2개의 상이한 일가 금속 이온을 함유하는 수용액을 사용하면 적어도 2개의 상이한 유형의 염 결정을 형성시킨다.
혼합물은 혼합물을 가열하고/하거나, 혼합물을 진공에 노출시키고/시키거나 혼합물 주변의 대기의 습도를 감소시킴으로써 탈수시킬 수 있다.
혼합물은 혼합물을 가열된 기판 또는 표면(예컨대, 약 50℃ 내지 약 70℃)에 두는 단계, 상부에 혼합물이 위치한 기판 또는 표면(예컨대, 약 50℃ 내지 약 70℃)을 가열하는 단계, 및/또는 혼합물을 더운 가스(예컨대, 공기, 질소, 또는 혼합물의 온도보다 더 높은 온도를 갖는 이산화탄소)와 접촉시켜 물이 혼합물로부터 증발되도록 하는 단계에 의해 가열시킬 수 있다. 더운 가스와의 접촉은 예를 들면, 혼합물을 가열 오븐 속에 둠으로써 발생시킬 수 있다. 가열 오븐으로 수송하는 동안에, 혼합물은 비록 더 높은 상대 습도, 심지어 75% 이상 높은 습도가 또한 실현가능하다고 해도, 40% 이상의 습도, 예를 들면 대락 60%의 상대적인 습도에서 유지시킬 수 있다. 보다 높은 칼륨 이온 농도를 갖는 혼합물은 보다 낮은 상대 습도에 견딜 수 있으며, 보다 낮은 칼륨 염 농도를 갖는 혼합물은 바람직하게는 수송 동안 보다 높은 상대 습도에서 유지된다.
혼합물을 가열함으로써, 존재할 경우, 열적으로 활성화될 수 있는 가교-결합제를 활성화시키고, 이에 의해 중합체를 가교-결합시키는 것이 가능하다.
일부 구현예에서, 혼합물을 탈수시키는데 사용된 가열된 기판 및/또는 공기의 온도는 혼합물을 가열하기 전 혼합물의 온도의 20℃ 이상이나 100℃ 미만이다.
혼합물은 혼합물을 냉각된 기판 또는 표면(예컨대, 약 5℃ 내지 약 15℃)에 위치시키는 단계, 혼합물이 놓여진 기판 또는 표면(예컨대, 약 5℃ 내지 약 15℃로)을 냉각시키는 단계 및/또는 이를 냉각 가스(예컨대, 혼합물의 온도보다 더 낮은 온도를 갖는 공기, 질소, 또는 이산화탄소)와 접촉시키는 단계에 의해 냉각된다. 냉각되는 경우, 혼합물 속의 염의 온도-의존성 용해도 한계는 혼합물이 궁극적으로 염으로 과포화될 때까지 감소한다. 일부 구현예에서, 혼합물은 이를 저 습도의 냉각 챔버(예컨대, 0℃ 내지 10℃의 온도, 상대 습도 <　40%) 속에서 항온처리함으로써 냉각된다.
혼합물 속의 온도는 바람직하게는 하나 이상의 염 결정의 형성 동안 혼합물 주변의 주위 공기의 이슬점 위로 유지된다. 이는 혼합물이 주위 공기로부터 응축된 물로 희석되는 것을 방지하는데, 이는 혼합물 속의 상대적인 염 함량을 감소시킬 수 있다.
4.3.3. 가교-결합 조건
가교-결합 조건은 사용된 가교-결합제의 유형을 기반으로 선택할 수 있다. 예를 들면, 자외선에 의해 활성화된 가교-결합제(예컨대, 벤조페논, 티옥산톤 또는 벤조인 에테르)를 사용하는 경우, 가교-결합 조건은 혼합물을 자외선(UV) 광에 노출시키는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 파장이 약 250 nm 내지 약 360 nm인 UV 광을 사용한다(예컨대, 260 ±20 nm 또는 355 ±20 nm). 보다 낮은 에너지/보다 긴 파장 UV 광(예컨대, 360 nm UV 광 대 254 nm UV 광)의 사용은 보다 긴 노출 시간을 필요로 할 수 있다. 가시광에 의해 활성화된 가교-결합제(예컨대, 에틸 에오신, 에오신 Y, 로즈 벤갈, 캄포르퀴논 또는 에리티로신)을 사용하는 경우, 가교-결합 조건은 혼합물을 가시광에 노출시키는 단계를 포함할 수 있다. 열적으로 활성화된 가교-결합제(예컨대, 4,4' 아조비스(4-시아노펜타노)산, 및 2,2-아조비스[2-(2-이미다졸린-2-일)프로판]디하이드로클로라이드, 또는 벤조일 퍼옥사이드)를 사용하는 경우, 가교-결합 조건은 혼합물을 열에 노출시키는 단계를 포함할 수 있다.
가교-결합 조건의 길이 및 강도는 다른 중합체 분자에 대한 중합체 분자의 가교-결합을 달성하기 위해 선택될 수 있다. 프로브 분자(존재하는 경우)에 대한 중합체 분자의 가교-결합, 및 기판 분자 또는 기판 위에 존재하는 유기 분자(존재하는 경우)에 대한 중합체 분자의 가교-결합은 기판(존재하는 경우) 위에 존재한다. 프로브를 함유하는 혼합물에 대한 가교-결합 조건의 길이 및 강도는 예를 들면, 프로브 분자의 고정화 및 탄생(nativity)의 강인성에 균형을 맞추도록 실험적으로 결정할 수 있다.
4.3.4. 염 결정 용해
중합체를 가교-결합시킨 후, 염 결정을 적어도 하나의 수송 채널이 네트워크 속에서 형성되는 방식으로 용매 속에 용해시킬 수 있다. 이론에 얽메이지 않고, 결정 형성 동안 2개 유형의 1가 염 양이온의 사용은 적어도 2개 유형의 결정, 압축 결정 및 침-형상의 결정(needle-shaped crystal)을 생성한다. 압축 결정의 용해는 침-형상의 결정의 용해로부터 생성되는 장 채널에 의해 뚫린, 네트워크내 스폰지-유사 효과를 생성하는 단 채널을 생성하는 것으로 여겨진다.
생물학적 센서로서 본 개시내용의 방법에 의해 생산된 배열을 사용하는 경우, 고 측정 정확도 및 고 측정 역학이 허용된다.
하나 이상의 염 결정을 용해하기 위한 용매는 이것이 존재하는 경우, 중합체 및 프로브에 대해 상용성인 방식으로 선택할 수 있다(예컨대, 용매는 이것이 중합체 및 프로브를 용해시키지 않도록 선택할 수 있다). 바람직하게는, 사용된 용매는 수계 완충액, 예를 들면, 희석된 인산염 완충액이다. 메탄올, 에탄올, 프로판올 또는 이러한 액체의 혼합물을 완충액에 가하여 네트워크로부터 결합하지 않은 중합체의 제거를 촉진할 수 있다.
염 결정의 제거 후 네트워크는 건조로 인하여 붕괴될 수 있으며 탈수될 수 있다. 네트워크의 건조는 프로브 생물분자의 선적(shipping) 및 안정화를 위한 장점을 갖는다.
4.3.5. 3차원 네트워크의 사용 방법
본 개시내용의 네트워크 및 배열을 사용하여 샘플, 바람직하게는 액체 샘플 속의 분석물의 존재 또는 부재를 측정할 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 분석물에 결합할 수 있는 프로브 분자를 포함하는 본 개시내용의 네트워크 또는 배열을 샘플 또는 다수의 샘플과 접촉시키는 단계 및 프로브 분자에 대한 분석물의 결합을 검출함으로써, 분석물이 샘플 또는 다수의 샘플 속에 존재하는지의 여부를 측정하는 단계를 포함하여, 분석물이 샘플 또는 다수의 샘플 속에 존재하는지의 여부를 측정하는 방법을 제공한다. 상이한 종의 분석물을 결합시킬 수 있는 상이한 종의 프로브를 포함하는 배열을 방법에 사용하는 경우, 상이한 종의 분석물의 존재는 프로브에 대한 상이한 종의 분석물의 결합을 검출함으로써 측정할 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 방법은 배열에 결합된 분석물 또는 분석물들의 양을 정량화하는 단계를 추가로 포함한다.
분석물은 예를 들면, 핵산, 예를 들면, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 앰플리콘일 수 있다. 일부 구현예에서, PCR 앰플리콘은 생물학적 또는 환경적 샘플(예컨대, 혈액, 혈청, 혈장, 조직, 세포, 타액, 가래, 뇨, 뇌척수액, 흉수액, 젖, 눈물, 대변, 땀, 정액, 전체 세포, 세포 구성성분, 세포 도말(cell smear), 또는 추출물 또는 이의 유도체)으로부터 증폭된다. 일부 구현예에서, 핵산은 표지되어 있다(예컨대, 형광 표지된다).
네트워크의 표면에 놓인 분석물은 수송 채널을 통해 네트워크의 내부로 침투하여 중합체에 공유결합으로 결합된 프로브(예컨대, 생물분자)에 특이적으로 결합할 수 있다. 생물학적 센서로서 이에 고정된 네트워크를 지닌 본 개시내용의 배열을 사용하는 경우, 고 측정 정밀도 및 또한 고 측정 역학이 허용된다.
본 개시내용의 네트워크 및 배열은 바이오센서로서 사용 후 재생될 수 있으며 수 배(예컨대, 5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 40배, 또는 적어도 50배) 사용될 수 있다. 프로브 분자가 DNA인 경우, 이는 예를 들면, 네트워크(들)를 1x 인산염 완충된 염수 속에서 80℃ 내지 90℃ 의 온도로 약 10분 동안 가열함으로써 달성할 수 있다. 이후에, 인산염 완충된 염수는 새로운 인산염 완충된 염수에 대해 교환함으로써 네트워크(들)의 변성된 DNA를 세척할 수 있다. 네트워크(들) 또는 배열의 프로브 분자가 항원인 경우, 네트워크(들) 또는 배열은 네트워크(들)을 0.1N NaOH와 약 10분 동안 접촉시킴으로써 재생시킬 수 있다. 이후에, 0.1N NaOH를 인산염 완충된 염수에 대해 교환함으로써 네트워크의 항원을 세척할 수 있다. 따라서, 본 개시내용의 네트워크 및 배열을 사용하는 방법의 일부 구현예는 샘플 또는 다수의 샘플과 접촉시키기 전에 세척된 네트워크 또는 배열을 사용함을 포함한다.
4.4. 본 개시내용의 배열의 적용
본 발명의 배열은 샘플 속의 핵산의 정성적 및 정량적 존재의 경제적 측정을 달성하므로, 이는 사람 및 비-사람 동물에서 건강 및 질환과 관련된 문제에 대해 즉각적인 적용을 갖는다.
이러한 적용에 있어서, 표적 분자를 함유하는 제제는 당해 분야에 공지된 프로토콜에 따라 생물학적 또는 환경적 공급원으로부터 유래되거나 추출된다. 표적 분자는 바이러스, 세균 및 진핵세포, 원핵세포, 원생생물, 식물, 진균, 및 모든 종족 및 부류의 동물을 포함하는, 모든 분류학적 부류의 세포 및 조직으로부터 유래되거나 추출될 수 있다. 동물은 척추동물, 포유동물, 영장류, 및 특히 사람일 수 있다. 혈액, 혈청, 혈장, 조직, 세포, 타액, 가래, 뇨, 뇌척수액, 흉수, 젖, 눈물, 대변, 땀, 정액, 전체 세포, 세포 구성성분, 및 세포 도말이 표적 분자의 적합한 공급원이다.
표적 분자는 바람직하게는 임의의 앞서의 공급원으로부터 증폭된다(예컨대, PCR에 의해).
본 발명의 배열은 사람 또는 비-사람 동물의 병원체를 검출하는데 유용한 프로브를 포함할 수 있다. 이러한 프로브는 적어도 부분적으로 세균, 바이러스 또는 진균 표적, 또는 세균, 바이러스 및 진균 표적의 임의의 조합에 대해 적어도 부분적으로 상보성인 올리고뉴클레오타이드를 포함한다.
본 발명의 배열은 사람 또는 비-사람 동물 세포내에서 유전자 발현, 예컨대, 암, 심혈관 질환, 또는 대사 질환과 관련된 유전자 발현을 대상체를 진단하고, 대상체의 치료 또는 대상체의 결과의 예후를 모니터링할 목적으로 검출하는데 유용한 프로브를 포함할 수 있다. 이후에, 유전자 발현 정보는 질환 진행 또는 퇴행을 추적할 수 있고, 이러한 정보는 초기 치료요법의 성공을 모니터링하거나 이러한 과정을 변화시키는데 보조할 수 있다.
5. 예시적인 프로토콜
도면에 제공된 도면 부호를 지칭하는, 다음의 예시적인 프로토콜은 본 개시내용의 영역내에 있으며 각각 단락 4.1.1, 4.1.2 및 4.1.4의 중합체, 가교-결합제 및 프로브와 함께 사용될 수 있다. 다음의 방법에 사용하기 위한 추가의 유용한 중합체(공-중합체 포함) 및 가교-결합제 그룹은 문헌: Rendl et al., 2011, Langmuir 27:6116-6123 및 제US 2008/0293592호에 기술되어 있으며, 이의 내용은 본원에 참고로 포함된다. 일 구현예에서, 단락 6.2에 따른 중합체 혼합물이 사용된다.
5.1. 예시적인 프로토콜 1
바람직하게는 유기물인 표면(2)을 지닌 플레이트를 가열되는 홀더(holder; 6)에 위치시킨다. 50℃ 내지 70℃의 온도가 적합하다. 중합체(3), 프로브 생물분자(1) 및 수성 염 용액을 함유하는 혼합물(5)을 표준 DNA 칩 스포터(chip spotter)(예컨대, Scienion, 독일 소재)를 사용하여 유기 표면(2) 상에 스폿팅한다. 0.5 내지 4 nl의 용적을 각각의 스폿(7)에 프린트한다(참고: 도 2). 이러한 스폿의 액체를 건조시켜 염 결정(8), (14)의 핵화를 거의 즉시 야기한다. 핵화 후, 침-형상의 염 결정을 혼합물(5)의 용적에 위치한 적어도 하나의 결정화 미생물(9)로부터 혼합물(5)의 표면(10)으로 연장시킬 수 있다(참고: 도 3). 또한, 보다 짧은 입방체 또는 봉-형상의 결정(14)의 형성이 일어나는 것으로 여겨진다(참고: 도 3). 결정(8), (14)의 핵화 후, 스폿(7)을 광학적 UV 방사선(11)을 사용하여 즉시 UV 가교-결합제 속에서 조사함으로써(참고: 도 4) 프로브 생분자(1)를 중합체(3)에 공유결합시키고, 중합체(3)를 유기 표면(2)에 공유결합시키고 가교-결합시킨다(참고: 도 5). 건조된, 가교-결합된 혼합물(5)은 수분을 끌어들여 다시 액체가 되지 않도록 주의를 기울인다.
건조된, 가교-결합된 혼합물(5)을 이후에 결정(8)용 용매(12)와 접촉시킴으로써 결정(8), (14)이 있는 위치에서, 장(13) 및 단(19) 채널이 중합체(3) 및 프로브 생물분자(1)를 포함하는 네트워크(15)내에서 형성된다(참고: 도 6). 이후에, 용매(12)를 제거한다. 장 채널(13)은 네트워크(15)의 표면(16)으로부터 네트워크(15)의 내부로 연장시킬 수 있다. 염 결정(8), (14)가 용해된 용매(12)는 프로브 생물 분자(1) 및 또한 중합체(3)에 대하여 상용성인 방식으로 선택된다. 바람직하게는, 사용된 용매(12)는 물 기반이다.
5.2. 예시적인 프로토콜 2
중합체(3), 프로브 생물분자(1) 및 수성 염 용액을 함유하는 혼합물(5)을 표준 DNA 칩 스포터(예컨대, Scienion, 독일 소재)를 사용하여 플레이트 상에 정렬된 유기 표면(2)에 스폿팅한다. 0.5 내지 4 nl의 용적을 각각의 스폿(7)에서 프린트한다(참고: 도 2). 표면(2), 바람직하게는 유기물 상에 스폿(7)이 있는 플레이트를 냉각시킨 홀더(6) 위에 위치시킨다(참고: 도 3). 5℃ 내지 15℃의 온도가 적합하다. 이러한 스폿의 액체를 냉각시켜 결정의 핵화를 거의 즉시 야기하는 완충액의 포화도를 초과하여 이르도록 한다. 핵화 후 침-형상의 염 결정(8)을 혼합물(5)의 용적 속에 둔 적어도 하나의 결정화 기원(9)으로부터 혼합물(5)의 표면(10)으로 연장시킬 수 있다. 또한, 보다 짧은 입방체 또는 봉-형상의 결정(14)의 형성이 발생하는 것으로 여겨진다(참고: 도 3). 이를 프린트한 후 표적을 완전한 건조를 위해서 오븐(예컨대, 70℃에서)에 둔다. 결정의 핵화 후 스폿을 광학 UV 방사선을 사용하여 즉시 UV 가교-결합제 속에서 조사(참고: 도 4)함으로써 프로브 생물분자(1)가 중합체(3)에 공유결합되고, 중합체(3)가 유기 표면(2)에 공유결합되어 가교-결합되도록 한다. 건조된, 가교-결합된 혼합물이 수분을 끌어들여 다시 액체가 되지 않도록 주의한다.
이후에, 건조된, 가교-결합된 혼합물(5)을 용매(12)와 접촉시켜 결정(8), (14)을 용해함으로써 결정(8), (14)이 있는 위치에서, 수송 채널, 예컨대, 장 채널(13) 및 단 채널(19)을 중합체(3) 및 프로브 생물분자(1)를 포함하는 네트워크(15) 내에 형성시킨다. 이후에, 용매(12)를 제거한다. 장 채널(13)은 네트워크(15)의 표면(16)으로부터 네트워크(15)의 내부로 연장시킬 수 있다. 염 결정(8), (14)이 용해된 용매(12)를 이것이 프로브 생물분자(1) 및 중합체(3)와 상용성이 되도록 선택한다. 바람직하게는, 사용된 용매(12)는 물 기반이다.
도 6에서 알 수 있는 바와 같이, 다수의 장 채널(13) 및 단 채널(19)을 네트워크(15) 내에서 형성시킬 수 있다. 장 채널(13)은 네트워크(15)의 표면(16)으로부터 네트워크(15)내에 위치한 적어도 하나의 점까지 연장시킬 수 있다. 장 채널(13)은 - 내부의 방향에서 표면(16)으로부터 출발하여 - 장 채널(13) 사이의 측면 거리가 감소하도록 하는 방식으로 정렬시킬 수 있다.
5.3. 예시적인 프로토콜 3
중합체(3), 프로브 생물분자(1) 및 수성 염 용액을 함유하는 혼합물(5)을 습도가 40 내지 80%, 바람직하게는 50 내지 70%의 범위인 정상 조건에서 플레이트의 표면(2), 바람직하게는 유기물 위에 프린트한다. 혼합물은 예를 들면, 350 mM 인산나트륨, pH 8, 및 250-300 mM 인산칼륨, pH 8을 함유한다. 0.5 내지 4　nl의 용적을 각각의 스폿(7)에 프린트한다. 프린트 구획내 수분 함량은 스폿(7)이 결정 형성없이(즉, 핵화가 일어나지 않는다) 액체로 있도록 보증한다. 이후에, 플레이트를 용기, 예를 들면, 판지 박스 속에 둔다. 뚜껑을 수송용 플레이트에 둔다. 스폿(7)이 있는 플레이트를 이후에 건조 오븐 속 또는 더운 플레이트 상에 두어 핵화를 신속하게 유발함으로써 침-형상의 염 결정(8)이 혼합물의 용적 속에 위치한 적어도 하나의 결정화 기원(9)으로부터 혼합물(5)의 표면(10)을 향해 연장되도록 한다. 또한, 보다 짧은 입방체 또는 봉-형상의 결정(14)의 형성이 발생할 것으로 여겨진다.
오븐/더운 플레이트의 온도는 프린팅 온도보다 20℃ 이상이어야 한다. 100℃ 이상의 온도는 필수적이지는 않다.
건조 후, 혼합물을 조사하여 중합체(3), 프로브 생물분자(1), 및 표면(2)을 가교-결합시킨다.
이후에, 건조되고, 가교-결합된 혼합물(5)을 용매(12)와 접촉시킴으로써 결정(8), (14)이 있는 위치에서, 장 채널(13) 및 단 채널(19)을 중합체(3) 및 프로브 생물분자(1)를 포함하는 네트워크(15) 속에서 형성시킨다. 이후에, 용매(12)를 제거한다. 장 채널(13)은 네트워크(15)의 표면(16)으로부터 네트워크(15)의 내부로 연장시킬 수 있다. 염 결정(8), (14)가 용해된 용매(12)를 이것이 프로브 생물분자(1) 및 중합체(3)와 상용성인 방식으로 선택한다. 바람직하게는, 사용된 용매(12)는 물 기반이다.
5.4. 예시적인 프로토콜 4
대안적으로, 예시적인 프로토콜 3에서와 같이 제조한, 바람직하게는 유기물인, 표면(2) 위에 스폿(7)이 있는 플레이트를 냉각시켜 저 습도(예컨대, <　10℃, 상대 습도 <　40%)를 지닌 냉각 챔버에 둠으로써 핵화를 달성할 수 있다. 건조는 습도를 감소시키거나 핵화가 시작된 후 진공을 적용함으로써 수행할 수 있다. 핵화 후, 침-형상의 염 결정(8)은 혼합물(5)의 용적내에 위치한 적어도 하나의 결정화 기원(9)으로부터 혼합물(5)의 표면(10)을 향해 연장시킬 수 있다. 또한, 보다 짧은 입방체 또는 봉형 결정(14)의 형성이 일어나는 것으로 여겨진다. 스폿(7)이 있는 플레이트를 오븐 속에 60 내지 70℃에서 1시간 동안 두어 스폿이 완전히 건조되도록 한다. 스폿(7)은 UV 가교-결합제, 즉, Stratalinker 2400 속에서 1.00 J @ 254 nm를 사용하여 UV 조사하였다. 이를 수행하기 위해, 스폿(7)이 있는 플레이트를 챔버의 문에 대해 평행인 보다 짧은 측면을 지닌 챔버의 중심에 둘 수 있다. 이후에, 커버를 제거하고 가교-결합제를 출발시킨다. 기계를 종결시키는 경우 배열을 제거하고 덮개를 교체한다.
대안적으로, 동일한 파장(예를 들면, 240-270 nm) 또는 보다 긴 파장, 예컨대, 360 nm를 지닌 다른 UV 가교-결합제를 사용할 수 있다.
이후에, 혼합물(5)을 용매(12)와 접촉시켜 결정(8), (14)을 용해함으로써 결정(8), (14)이 있는 위치에서, 장 채널(13) 및 단 채널(19)을 중합체(3) 및 프로브 생물분자(1)을 포함하는 네트워크(15) 속에 형성시킨다. 이후에, 용매(12)를 제거한다. 장 채널(13)은 네트워크(15)의 표면(16)으로부터 네트워크(15)의 내부로 연장시킬 수 있다. 염 결정 (8), (14)이 용해된 용매(12)를 이것이 프로브 생물분자(1) 중합체(3)과 상용성이도록 하는 방식으로 선택한다. 바람직하게는, 사용된 용매(12)는 물 기반이다.
6. 실시예
6.1. 배경
실질적으로 본원에 기술된 바와 같이 제조하였지만 제2 염 없이 350 mM의 농도에서 인산나트륨("NaPi")의 완충액을 함유하는 중합체 네트워크를 건조시키고 습도가 가열 플레이트 위에서 건조하는 동안 60% 이상으로 유지되지 않을 경우 상 분리를 겪을 수 있다. 이는 보다 낮은 습도 수준에서 결정화가 조절되지 않은 방식으로 일어날 수 있기 때문이다.
인산나트륨 농도를 증가시켜 조절되지 않는 결정화를 피하는 것이 바람직할 수 있다. 그러나, NaPi의 농도는, 이후에 NaPi 결정이 프린터내에서 침전되고 프린트 노즐을 차단하므로 유의적으로 증가될 수 없다.
다양한 염(염화나트륨, 나트륨 b)을 NaPi 시험 실험과 함께 사용하였다. 그러나, 이들 중 어느 것도 NaPi 단독보다 더 우수한 신호를 제공하지 않았다. 일반적으로 이러한 스폿의 하이브리드화 신호는 열등하였다(데이타는 나타내지 않음).
정상의 습도 수준에서 건조를 최소화하기 위한 다른 시도는 NaPi 대신에 인산염 완충된 염수, 시트르산나트륨 완충액, 또는 인산칼륨 완충액을 시험하는 것이 중합체 네트워크내 보다 낮은 하이브리드화 신호를 초래하였음을 수반하였다.
그러나, NaPi 완충액을 칼륨-인산염 완충액으로 농축시킨 경우(단락 6.2에 기술된 바와 같이), 특히 인삼칼륨 농도가 150 mM 이상이었던 경우 액체 스폿의 안정화는 신호 손실없이 관찰되었다.
이러한 실험을 수행하는 경우 놀라운 관찰이 존재하였다. 보다 높은 인산칼륨 수준(150 mM 이상)에서 배경 신호("노이즈")는 감소하였고 200 mM의 농도에서 노이즈는 하이브리드화 반응이 거의 전적으로 부재한다(단락 6.3에 기술된 바와 같음). 이러한 효과의 이유는 단 채널이 인산칼륨으로부터의 장 채널에 의해 뚫린 스폰지-유사 중합체 매트릭스를 생성한다는 것이 가장 그럴듯한 이유이다. 이후에, 이러한 2개 구조의 조합은 온-역학(on-kinetics)(하이브리드화) 뿐만 아니라 오프-역학(off-kinetics)(결합하지 않거나 약하게 결합된 물질이 세척 제거된다)을 증진시킨다. 보다 낮은 배경 신호는 배경 신호를 감소시키므로 인산나트륨 및 인산칼륨 둘 다를 사용하여 제조한 중합체 네트워크를 사용하여 수행된 임의의 시험의 LOD(검출 한계)를 개선시킨다.
6.2. 실시예 1: 3차원 중합체 네트워크의 형성
10 mg/ml의 중합체 스톡 용액(stock solution)을 10　mg의 가교-결합 중합체 폴리(디메틸아크릴아미드) 코(co) 5% 메타크릴로일-벤조페논 코 2.5% 나트륨 4-비닐벤젠설포네이트를 1.0 ml의 DNAse가 없는 물 속에 용해시킴으로써 제조하였다. 이는 모든 가시적인 중합체가 용해될 때까지 대략 5분 동안 격렬한 진탕 및 와동시킴으로써 달성하였다. 이후에, 스톡 용액을 호일로 싸서 이를 광으로부터 보호하고 냉장실에 밤새 두어 중합체가 완전히 용해되도록 보증하고 발포체가 감소되도록 하였다. 중합체는 분자당 적어도 2개의 광반응성 그룹을 갖는다.
10 mg/ml의 중합체(PDMAA-5%MABP-2.5%SSNa), 프로브 생물분자(Cy3 형광성 모이어티를 지닌 DNA 올리고뉴클레오타이드를 포함함) 및 350 mM 인산나트륨 완충액이 들어있는 수성 염 용액을 함유하고 일부 경우에, 인삼칼륨의 양을 변화시키는 다양한 혼합물을 65% 습도 하에서 플레이트의 유기 표면 위에서 프린트하였다. 1.6 nl의 용적을 각각의 스폿 상에 Scienion Sciflex 프린터를 사용하여 프린트하였다. 이후에, 플레이트를 용기, 판지 박스 속에 두었다. 뚜겅을 수송용 유기 표면을 가진 플레이트 상에 두었다. 유기 표면 상에 스폿이 있는 플레이트를 이후에 건조 오븐 또는 더운 플레이트(70℃)에 두어 염 결정의 핵화를 유발하였다. 1시간의 기간에 걸쳐 건조시킨 후, 플레이트를 조사하여 중합체, 프로브 생물분자, 및 유기 표면을 가교-결합시켰다.
플레이트를 10 mM NaPi 완충액으로 프린팅한 후 세척하여 결합하지 않은 물질을 제거한 후 건조시키고 저장하였다. 플레이트를 Sensovation 형광성 스캐너 속에서 스캐닝함으로써 스폿 형태학을 육안으로 평가하였다. 수득되는 영상은 도 11a(세척 후) 및 도 11b(건조 후)에 나타낸다.
열 D 및 E에서의 스폿은 다양한 양(도 11c에 나타낸 바와 같이)의 인산칼륨을 포함하나, 나머지 열내의 스폿은 인산나트륨 완충액 만을 함유하는 염 용액을 사용하여 생성시켰다. 인산칼륨의 혼입은 인산나트륨 만으로 제조된 스폿보다 더 균질하고 둥근 중합체 네트워크를 생성하였다(도 11a 및 도 11b). 인산칼륨의 혼입은 또한 상대 습도가 증가되지 않는 경우, 예를 들면, 약 40%의 정상의 대기 습도 주변으로 증가되지 않는 경우, 조절된 결정화를 허용한다.
6.3. 실시예 2: 중합체 네트워크의 하이브리드화 품질
실시예 1에 기술된 바와 같은 배열은 에스. 아우레우스 또는 이. 콜라이의 검출을 위한 프로브를 사용하여 제조하였다.
에스. 아우레우스 및 이. 콜라이를 증폭시키기 위한 프라이머 쌍을 각각 100개 카피의 에스. 아우레우스 및 이. 콜라이 게놈성 DNA를 사용하는 PCR 반응에서 사용하고, PCR 생성물을 에스. 아우레우스 및 이. 콜라이 각각을 함유하는 배열에 하이브리드화하였다. 결과는 도 12a 및 12b에 나타낸다. 도 12a는 100개 카피의 에스. 아우레우스 DNA로부터 증폭된 PCR 생성물의 배열에 대한 하이브리드화를 나타낸다. 도 12b는 100개 카피의 이. 콜라이 DNA로부처 증폭된 PCR 생성물의 배열에 대한 하이브리드화를 나타낸다. 도 12a 및 도 12b의 배열에 대한 프로브 맵은 도 12c에 나타낸다. 이러한 연구는 중합체 네트워크로부터의 신호가 인산칼륨을 함유하는 수성 염 용액을 사용하여 제조하였을 뿐만 아니라 인산나트륨 완충액이 인산나트륨 만을 함유하는 수성 염 용액을 사용하여 제조한 중합체 네트워크에 대해 비교가능한 신호를 가짐을 나타낸다.
놀랍게도, 인삼칼륨을 함유하는 수성 염 용액을 사용하여 제조한 중합체 네트워크는 도 13에 나타낸 바와 같이, 인산나트륨 만을 함유하는 수성 염 용액을 사용하여 제조한 중합체 네트워크와 비교하여 감소된 배경 "노이즈"를 갖는다. 도 13은 주형의 부재하에서 동일한 에스. 아우레우스 또는 이. 콜라이-특이적인 프라이머 쌍을 사용하여 증폭시킨 PCR 생성물의 하이브리드화로부터의 형광성 신호의 정량화를 나타낸다. 따라서, 임의의 하이브리드화 신호는 배경 "노이즈"를 나타낸다. 배경 "노이즈"는 보다 높은 농도의 인산칼륨의 존재하에서 제조된 중합체 네트워크가 부재한다.
7. 구체적인 구현예
본 개시내용은 하기 구체적인 구현예로 예시된다.
1. (a) (i) 총 농도가 적어도 500 mM인 적어도 2개 유형의 1가 금속 이온,
(ii) 수용성 중합체 쇄,
(iii) 가교-결합제 모이어티, 및
(iv) 임의로, 프로브 분자를 포함하는 혼합물(임의로 기판의 표면에 위치함)을 염 결정 형성 조건에 노출시킴으로써 하나 이상의 염 결정을 함유하는 혼합물을 형성시키는 단계;
(b) 하나 이상의 염 결정을 함유하는 혼합물을 가교-결합 조건에 노출시킴으로써, 하나 이상의 염 결정을 함유하는 하이드로겔을 형성시키는 단계; 및
(c) 하나 이상의 염 결정을 함유하는 하이드로겔을 하나 이상의 염 결정이 가용성인 용매와 접촉시켜 염 결정을 용해시킴으로써 3차원 하이드로겔 네트워크를 형성시키는 단계를 포함하는, 3차원 하이드로겔 네트워크의 제조 방법.
2. 구현예 1의 방법으로서, 여기서 혼합물이 총 농도가 500 mM 내지 1000 mM인 적어도 2개 유형의 일가 금속 이온을 포함하는 방법.
3. 구현예 2의 방법으로서, 여기서 혼합물 속의 일가 금속 이온의 총 농도가 550 mM 내지 800 mM인 방법.
4. 구현예 3의 방법으로서, 여기서 혼합물 속의 일가 금속 이온의 총 농도가 600 mM 내지 750 mM인 방법.
5. 구현예 1 내지 4 중 어느 하나의 방법으로서, 여기서 혼합물이 2개 유형의 일가 금속 이온을 포함하는 방법.
6. 구현예 5의 방법으로서, 각각의 일가 이온의 농도가 적어도 150 mM 또는 적어도 200 mM인 방법.
7. 구현예 5 또는 구현예 6의 방법으로서, 여기서 일가 금속 이온이 나트륨 이온, 칼륨 이온, 및 리튬 이온으로부터 선택된 방법.
8. 구현예 5 또는 구현에 6의 방법으로서, 여기서 일가 금속 이온이 나트륨 이온 및 칼륨 이온인 방법.
9. 구현예 8의 방법으로서, 여기서 나트륨 이온의 농도가 적어도 300 mM인 방법.
10. 구현예 9의 방법으로서, 여기서 나트륨 이온의 농도가 300 mM 내지 500 mM인 방법.
11. 구현예 10의 방법으로서, 여기서 나트륨 이온의 농도가 300 mM 내지 400 mM인 방법.
12. 구현예 11의 방법으로서, 나트륨 이온의 농도가 350 mM인 방법.
13. 구현예 8 내지 12 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 여기서 칼륨 이온의 농도가 150 mM 내지 500 mM인 방법.
14. 구현예 13의 방법으로서, 여기서 칼륨 이온의 농도가 175 mM 내지 400 mM인 방법.
15. 구현예 14의 방법으로서, 여기서 칼륨 이온의 농도가 200 mM 내지 350 mM인 방법.
16. 구현예 15의 방법으로서, 여기서 칼륨 이온의 농도가 250 mM 내지 350 mM인 방법.
17. 구현예 1 내지 4 중 어느 하나의 방법으로서, 여기서 혼합물이 3개 유형의 일가 금속 이온을 포함하는 방법.
18. 구현예 17의 방법으로서, 여기서 적어도 2개의 일가 이온의 농도가 각각 적어도 150 mM 또는 각각 적어도 200 mM인 방법.
19. 구현예 17 또는 구현예 18의 방법으로서, 여기서 일가 금속 이온이 나트륨 이온, 칼륨 이온, 및 리튬 이온인 방법.
20. 구현예 19의 방법으로서, 여기서 나트륨 이온의 농도가 적어도 250 mM인 방법.
21. 구현예 20의 방법으로서, 여기서 나트륨 이온의 농도가 250 mM 내지 500 mM인 방법.
22. 구현예 21의 방법으로서, 여기서 나트륨 이온의 농도가 300 mM 내지 400 mM인 방법.
23. 구현예 22의 방법으로서, 여기서 나트륨 이온의 농도가 350 mM인 방법.
24. 구현예 19 내지 23 중 어느 하나의 방법으로서, 여기서 칼륨 이온의 농도가 150 mM 내지 500 mM인 방법.
25. 구현예 24의 방법으로서, 여기서 칼륨 이온의 농도가 200 mM 내지 400 mM인 방법.
26. 구현예 25의 방법으로서, 여기서 칼륨 이온의 농도가 250 mM 내지 350 mM인 방법.
27. 구현예 1 내지 26 중 어느 하나의 방법으로서, 여기서 단계 (a) 전에, 혼합물을 형성시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
28. 구현예 27의 방법으로서, 여기서 혼합물을 형성시키는 단계가 일가 금속 양이온을 포함하는 수성 염 용액 및 수용성 중합체 쇄, 가교-결합제 모이어티 및, 존재하는 경우, 임의의 프로브 분자를 포함하는 하나 이상의 용액을 합하는 단계를 포함하는 방법.
29. 구현예 28의 방법으로서, 여기서 수용성 중합체 쇄 및 가교-결합제 모이어티가 단일 용액 속에 존재하는 방법.
30. 구현예 29의 방법으로서, 여기서 가교-결합된 모이어티가 중합체 쇄에 공유결합으로 부착된 방법.
31. 구현예 28 내지 30 중 어느 하나의 방법으로서, 여기서 수성 염 용액이 6 내지 9 범위의 pH를 갖는 방법.
32. 구현예 31의 방법으로서, 여기서 수성 염 용액이 7 내지 8.5 범위의 pH를 갖는 방법.
33. 구현예 32의 방법으로서, 여기서 수성 염 용액이 8의 pH를 갖는 방법.
34. 구현예 28 내지 33 중 어느 하나의 방법으로서, 여기서 수성 염 용액이 인산수소이나트륨, 인산이수소나트륨, 인산수소이칼륨, 인산이수소칼륨, 황산나트륨, 황산칼륨 또는 이의 조합물을 물 또는 수용액 속에 용해시킴을 포함하는 방법에 의해 생산된 용액을 포함하는 방법.
35. 구현예 34의 방법으로서, 여기서 수성 염 용액이 인산수소이나트륨, 인산이수소나트륨, 인산수소이칼륨, 인산이수소칼륨, 또는 이의 조합물을 물 또는 수용액 속에 용해시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 생산되는 방법.
36. 구현예 35의 방법으로서, 여기서 수성 염 용액이 인산수소이나트륨, 인산이수소나트륨, 인산수소이칼륨, 및 인산이수소칼륨을 물 속에 용해시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 생산되는 방법.
37. 구현예 1 내지 36의 방법으로서, 여기서 혼합물 속의 인산염 이온의 농도가 적어도 250 mM인 방법.
38. 구현예 37의 방법으로서, 여기서 혼합물 속의 인산염 이온의 농도가 250 mM 내지 1000 mM인 방법.
39. 구현예 38의 방법으로서, 여기서 혼합물 속의 인산염 이온의 농도가 550 mM 내지 800 mM인 방법.
40. 구현예 39의 방법으로서, 여기서 혼합물 속의 인산염 이온의 농도가 600 mM 내지 750 mM인 방법.
41. 구현예 1 내지 40의 방법으로서, 여기서 염 결정 형성 조건이 하나 이상의 침-형상의 결정의 형성을 야기함으로써 하나 이상의 장 채널이 염 결정의 용해 후 생산되도록 하는 방법.
42. 구현예 1 내지 41 중 어느 하나의 방법으로서, 여기서 염 결정 형성 조건이 하나 이상의 압축 결정의 형성을 야기함으로써 하나 이상의 단 채널이 염 결정의 용해 후 생산되는 방법.
43. 구현예 1 내지 42 중 어느 하나의 방법으로서, 여기서 염 결정 형성 조건이 혼합물을 탈수시키는 단계를 포함하는 방법.
44. 구현예 43의 방법으로서, 여기서 혼합물을 가열시킴으로써 혼합물을 탈수시키는 단계, 혼합물을 진공에 노출시키는 단계, 혼합물 주변의 대기의 습도를 감소시키는 단계, 또는 이의 조합을 포함하는 방법.
45. 구현예 44의 방법으로서, 여기서 혼합물을 진공에 노출시킴으로써 혼합물을 탈수시키는 단계를 포함하는 방법.
46. 구현예 44의 방법으로서, 여기서 혼합물을 가열함으로써 혼합물을 탈수시키는 단계를 포함하는 방법.
47. 구현예 46의 방법으로서, 여기서 혼합물을 가열시키는 단계가 혼합물을 혼합물의 온도보다 높은 온도를 갖는 가스와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
48. 구현예 1 내지 42 중 어느 하나의 방법으로서, 여기서 염 결정 형성 조건이 혼합물이 염으로 과포화될 때까지 혼합물을 냉각시키는 단계를 포함하는 방법.
49. 구현예 48의 방법으로서, 여기서 혼합물을 혼합물의 온도보다 더 낮은 온도를 갖는 가스와 접촉시킴으로써 혼합물을 냉각시키는 단계를 포함하는 방법.
50. 구현예 1 내지 49 중 어느 하나의 방법으로서, 여기서 단계 (a) 동안에 혼합물의 온도가 혼합물 주변의 대기의 이슬점 이상에서 유지되는 방법.
51. 구현예 1 내지 50의 방법으로서, 여기서 자외(UV) 선 및 가교-결합 조건에 의해 활성화된 가교-결합제 모이어티가 혼합물을 자외선에 노출시키는 단계를 포함하는 방법.
52. 구현예 1 내지 50 중 어느 하나의 방법으로서, 여기서 가교-결합제 모이어티가 가시광에 의해 활성화되고 가교-결합 조건이 혼합물을 가시광에 노출시키는 단계를 포함하는 방법.
53. 구현예 1 내지 50 중 어느 하나의 방법으로서, 여기서 가교-결합제 모이어티가 가열에 의해 활성화되고 가교-결합 조건이 혼합물을 열에 노출시키는 단계를 포함하는 방법.
54. 구현예 1 내지 53 중 어느 하나의 방법으로서, 여기서 수용성 중합체 쇄가 단독중합체 쇄를 포함하는 방법.
55. 구현예 1 내지 54 중 어느 하나의 방법으로서, 여기서 수용성 중합체 쇄가 공중합체 쇄를 포함하는 방법.
56. 구현예 1 내지 54 중 어느 하나의 방법으로서, 여기서 수용성 중합체 쇄가 단독중합체와 공중합체 쇄의 혼합물을 포함하는 방법.
57. 구현예 54 내지 56 중 어느 하나의 방법으로서, 여기서 수용성 중합체 쇄가 하나 이상의 종의 단량체로부터 중합된 중합체 쇄를 포함하는 방법.
58. 구현예 57의 방법으로서, 여기서 각각의 종의 단량체가 아크릴레이트 그룹, 메타트릴레이트 그룹, 에타크릴레이트 그룹, 2-페닐 아크릴레이트 그룹, 아크릴아미드 그룹, 메타크릴아미드 그룹, 이타코네이트 그룹, 및 스티렌 그룹으로부터 독립적으로 선택된 중합가능한 그룹을 포함하는 방법.
59. 구현예 58의 방법으로서, 여기서 수용성 중합체 속의 적어도 하나의 단량체 종이 메타크릴레이트 그룹을 포함하는 방법.
60. 구현예 59의 방법으로서, 여기서 메타크릴레이트 그룹을 포함하는 적어도 하나의 단량체 종이 메타크릴로일옥시벤조페논(MABP)인 방법.
61. 구현예 57의 방법으로서, 여기서 수용성 중합체가 디메틸아크릴아미드(DMAA), 메타크릴로일옥시벤조페논(MABP), 및 나트륨 4-비닐벤젠설포네이트(SSNa)로부터 중합된 중합체를 포함하는 방법.
62. 구현예 1 내지 61 중 어느 하나의 방법으로서, 여기서 수용성 중합체 쇄가 가교-결합제 모이어티를 포함하는 공중합체의 쇄인 방법.
63. 구현예 62의 방법으로서, 여기서 수용성 중합체 쇄가 중합체 분자당 적어도 2개의 가교-결합제 모이어티를 포함하는 방법.
64. 구현예 1 내지 63 중 어느 하나의 방법으로서, 여기서 가교-결합제 모이어티가 벤조페논, 티옥사톤, 벤조인 에테르, 에틸 에오신, 에오신 Y, 로즈 벤갈, 캄포르퀴논, 에리티로신, 4,4' 아조비스(4-시아노펜타노)산, 2,2-아조비스[2-(2-이미다졸린-2-일)프로판]디하이드로클로라이드, 및 벤조일 퍼옥사이드로부터 선택된 방법.
65. 구현예 64의 방법으로서, 여기서 가교-결합제 모이어티가 벤조페논 모이어티인 방법.
66. 구현예 1 내지 65 중 어느 하나의 방법으로서, 여기서 용매가 물 또는 수-기반한 완충액인 방법.
67. 구현예 66의 방법으로서, 여기서 용매가 물인 방법.
68. 구현예 66의 방법으로서, 여기서 용매가 물-기반한 완충액인 방법.
69. 구현예 68의 방법으로서, 여기서 물-기반한 완충액이 인산염, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 또는 이의 혼합물을 포함하는 방법.
70. 구현예 1 내지 69 중 어느 하나의 방법으로서, 여기서 단계 (a)의 혼합물이 프로브 분자를 추가로 포함하는 방법.
71. 구현예 70의 방법으로서, 여기서 적어도 일부, 대부분 또는 모든 프로브 분자가 핵산, 핵산 유도체, 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, 탄수화물, 지질, 세포, 리간드, 또는 이의 조합물을 포함하는 방법.
72. 구현예 71의 방법으로서, 여기서 프로브 분자의 적어도 일부가 핵산 또는 핵산 유도체를 포함하는 방법.
73. 구현예 71의 방법으로서, 여기서 프로브 분자의 적어도 대부분이 핵산 또는 핵산 유도체를 포함하는 방법.
74. 구현예 71의 방법으로서, 여기서 모든 프로브 분자가 핵산 또는 핵산 유도체를 포함하는 방법.
75. 구현예 70의 방법으로서, 여기서 적어도 일부, 대부분 또는 모든 프로브 분자가 항체, 항체 단편, 항원, 에피토프, 효소, 효소 기질, 효소 억제제, 핵산, 또는 이의 조합을 포함하는 방법.
76. 구현예 75의 방법으로서, 여기서 프로브 분자의 적어도 일부가 핵산을 포함하는 방법.
77. 구현예 75의 방법으로서, 여기서 프로브 분자의 적어도 대부분이 핵산을 포함하는 방법.
78. 구현예 75의 방법으로서, 여기서 모든 프로브 분자가 핵산을 포함하는 방법.
79. 구현예 76 내지 78 중 어느 하나의 방법으로서, 여기서 핵산이 올리고뉴클레오타이드인 방법.
80. 구현예 79의 방법으로서, 여기서 올리고뉴클레오타이드가 12 내지 30개 뉴클레오타이드 길이인 방법.
81. 구현예 79의 방법으로서, 여기서 올리고뉴클레오타이드가 14 내지 30개 뉴클레오타이드 길이인 방법.
82. 구현예 79의 방법으로서, 여기서 올리고뉴클레오타이드가 14 내지 25개 뉴클레오타이드 길이인 방법.
83. 구현예 79의 방법으로서, 여기서 올리고뉴클레오타이드가 14 내지 20개 뉴클레오타이드 길이인 방법.
84. 구현예 79의 방법으로서, 여기서 올리고뉴클레오타이드가 15 내지 30개 뉴클레오타이드 길이인 방법.
85. 구현예 79의 방법으로서, 여기서 올리고뉴클레오타이드가 15 내지 25개 뉴클레오타이드 길이인 방법.
86. 구현예 79의 방법으로서, 여기서 올리고뉴클레오타이드가 15 내지 20개 뉴클레오타이드 길이인 방법.
87. 구현예 79의 방법으로서, 여기서 올리고뉴클레오타이드가 16 내지 30개 뉴클레오타이드 길이인 방법.
88. 구현예 79의 방법으로서, 여기서 올리고뉴클레오타이드가 16 내지 25개 뉴클레오타이드 길이인 방법.
89. 구현예 79의 방법으로서, 여기서 올리고뉴클레오타이드가 16 내지 20개 뉴클레오타이드 길이인 방법.
90. 구현예 79의 방법으로서, 여기서 올리고뉴클레오타이드가 15 내지 40개 뉴클레오타이드 길이인 방법.
91. 구현예 79의 방법으로서, 여기서 올리고뉴클레오타이드가 15 내지 45개 뉴클레오타이드 길이인 방법.
92. 구현예 79의 방법으로서, 여기서 올리고뉴클레오타이드가 15 내지 50개 뉴클레오타이드 길이인 방법.
93. 구현예 79의 방법으로서, 여기서 올리고뉴클레오타이드가 15 내지 60개 뉴클레오타이드 길이인 방법.
94. 구현예 79의 방법으로서, 여기서 올리고뉴클레오타이드가 20 내지 55개 뉴클레오타이드 길이인 방법.
95. 구현예 79의 방법으로서, 여기서 올리고뉴클레오타이드가 18 내지 60개 뉴클레오타이드 길이인 방법.
96. 구현예 79의 방법으로서, 여기서 올리고뉴클레오타이드가 20 내지 50개 뉴클레오타이드 길이인 방법.
97. 구현예 79의 방법으로서, 여기서 올리고뉴클레오타이드가 30 내지 90개 뉴클레오타이드 길이인 방법.
98. 구현예 79의 방법으로서, 여기서 올리고뉴클레오타이드가 20 내지 100개 뉴클레오타이드 길이인 방법.
99. 구현예 79의 방법으로서, 여기서 올리고뉴클레오타이드가 20 내지 120개 뉴클레오타이드 길이인 방법.
100. 구현예 79의 방법으로서, 여기서 올리고뉴클레오타이드가 20 내지 40개 뉴클레오타이드 길이인 방법.
101. 구현예 79의 방법으로서, 여기서 올리고뉴클레오타이드가 20 내지 60개 뉴클레오타이드 길이인 방법.
102. 구현예 79의 방법으로서, 여기서 올리고뉴클레오타이드가 40 내지 80개 뉴클레오타이드 길이인 방법.
103. 구현예 79의 방법으로서, 여기서 올리고뉴클레오타이드가 40 내지 100개 뉴클레오타이드 길이인 방법.
104. 구현예 79의 방법으로서, 여기서 올리고뉴클레오타이드가 40 내지 60개 뉴클레오타이드 길이인 방법.
105. 구현예 79의 방법으로서, 여기서 올리고뉴클레오타이드가 60 내지 80개 뉴클레오타이드 길이인 방법.
106. 구현예 79의 방법으로서, 여기서 올리고뉴클레오타이드가 80 내지 100개 뉴클레오타이드 길이인 방법.
107. 구현예 79의 방법으로서, 여기서 올리고뉴클레오타이드가 100 내지 120개 뉴클레오타이드 길이인 방법.
108. 구현예 79의 방법으로서, 여기서 올리고뉴클레오타이드가 12 내지 150개 뉴클레오타이드 길이인 방법.
109. 구현예 1 내지 108 중 어느 하나의 방법으로서, 단계(a) 전에, 혼합물을 기판의 표면에 적용시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
110. 구현예 109의 방법으로서, 여기서 혼합물이 100 pl 내지 5 nl의 용적 내 용적으로 적용되는 방법.
111. 구현예 109의 방법으로서, 여기서 혼합물이 100 pl 내지 1 nl의 용적 내 용적으로 적용되는 방법.
112. 구현예 109의 방법으로서, 여기서 혼합물이 200 pl 내지 1 nl의 용적 내 용적으로 적용되는 방법.
113. 구현예 109 내지 112 중 어느 하나의 방법으로서, 여기서 혼합물을 기판에 적용시키는 단계가 혼합물을 기판의 표면 위에 분무시키는 단계를 포함하는 방법.
114. 구현예 113의 방법으로서, 여기서 혼합물이 잉크젯 프린터에 의해 분무되는 방법.
115. 구현예 109 내지 114 중 어느 하나의 방법으로서, 여기서 기판이 유기 중합체 또는 표면에 유기 분자의 자가-조립된 단층을 갖는 무기 물질을 포함하는 방법.
116. 구현예 115의 방법으로서, 여기서 기판이 유기 중합체를 포함하는 방법.
117. 구현예 116의 방법으로서, 여기서 유기 중합체가 사이클로올레핀 공중합체, 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리카보네이트, 및 폴리메틸메타크릴레이트로부터 선택되는 방법.
118. 구현예 117의 방법으로서, 여기서 기판이 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리스티렌, 또는 사이클로올레핀 공중합체를 포함하는 방법.
119. 구현예 115의 방법으로서, 여기서 기판이 표면 위에 알킬 실란 자가-조립된 단층을 갖는 무기 물질을 포함하는 방법.
120. 구현예 109 내지 119 중 어느 하나의 방법으로서, 여기서 기판이 미세웰 플레이트를 포함하는 방법.
121. 구현예 109 내지 120 중 어느 하나의 방법으로서, 여기서 중합체가 단계(b)에서 표면에 가교-결합되는 방법.
122. 구현예 121의 방법으로서, 여기서 표면에 가교-결합된 수-팽윤성 중합체가 생산되는 방법.
123. 구현예 122의 방법으로서, 여기서 수-팽윤성 중합체가 이의 중량의 50배까지의 탈이온화된, 증류수를 흡수할 수 있는 방법.
124. 구현예 122 또는 구현예 123의 방법으로서, 여기서 수-팽윤성 중합체가 이의 용적의 5 내지 50배의 탈이온화된, 증류수를 흡수할 수 있는 방법.
125.구현예 122 내지 124 중 어느 하나의 방법으로서, 수-팽윤성 중합체가 이의 중량의 30배 까지의 염수를 흡수할 수 있는 방법.
126. 구현예 122 내지 125 중 어느 하나의 방법으로서, 여기서 수-팽윤성 중합체가 이의 자체의 용적의 4 내지 30배의 염수를 흡수할 수 있는 방법.
127. 구현예 1 내지 126 중 어느 하나의 방법에 의해 다수의 3차원 하이드로겔 네트워크를 동일한 기판의 표면 상의 별개의 스폿에서 생성시키는 단계를 포함하는, 배열의 제조 방법.
128. 구현예 127의 방법으로서, 여기서 3차원 하이드로겔 네트워크가 동시에 생성되는 방법.
129. 구현예 127의 방법으로서, 여기서 3차원 하이드로겔 네트워크가 연속적으로 생성되는 방법.
130. 구현예 127 내지 129 중 어느 하나의 방법으로서, 다수의 3-차원 하이드로겔 네트워크를 기판의 표면에 가교-결합시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
131. 구현예 1 내지 126 중 어느 하나의 방법에 따라 생산되거나 수득가능한 다수의 3차원 하이드로겔 네트워크를 동일한 기판의 표면 상의 별개의 스폿에 위치시키는 단계를 포함하는 방법.
132. 구현예 127 내지 131 중 어느 하나의 방법으로서, 다수의 3차원 하이드로겔 네트워크를 표면에 가교-결합시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
133. 구현예 109 내지 126 중 어느 하나의 방법에 따라 생산되거나 수득가능한 다수의 3차원 하이드로겔 네트워크를 동일한 기판의 표면 상의 별개의 스폿에 위치시키는 단계를 포함하는, 배열의 제조 방법.
134. 구현예 133의 방법으로서, 여기서 위치시키는 단계가 이로부터 3차원 하이드로겔 네트워크가 별개의 스폿에 형성되는 혼합물을 적용시키는 단계를 포함하는 방법.
135. 구현예 127 내지 134 중 어느 하나의 방법으로서, 여기서 스폿이 컬럼 및/또는 열에 정렬되는 방법.
136. 구현예 1 내지 126 중 어느 하나의 방법에 의해 수득되거나 수득가능한 3차원 하이드로겔 네트워크.
137. 기판 상에 구현예 136에 따른 다수의 3차원 하이드로겔 네트워크를 포함하는 배열.
138. 구현예 127 내지 135 중 어느 하나의 방법에 의해 생산되거나 수득가능한 배열.
139. 적어도 8개의 3차원 하이드로겔 네트워크를 포함하는, 구현예 137 또는 구현예 138의 배열.
140. 적어도 16개의 3차원 하이드로겔 네트워크를 포함하는, 구현예 137 또는 구현예 138의 배열.
141. 적어도 24개의 3차원 하이드로겔 네트워크를 포함하는, 구현예 137 또는 구현예 138의 배열.
142. 적어도 48개의 3차원 하이드로겔 네트워크를 포함하는, 구현예 137 또는 구현예 138의 배열.
143. 적어도 96개의 3차원 하이드로겔 네트워크를 포함하는, 구현예 137 또는 구현예 138의 배열.
144. 적어도 128개의 3차원 하이드로겔 네트워크를 포함하는, 구현예 137 또는 구현예 138의 배열.
145. 적어도 256개의 3차원 하이드로겔 네트워크를 포함하는, 구현예 137 또는 구현예 138의 배열.
146. 적어도 512개의 3차원 하이드로겔 네트워크를 포함하는, 구현예 137 또는 구현예 138의 배열.
147. 적어도 1024개의 3차원 하이드로겔 네트워크를 포함하는, 구현예 137 또는 구현예 138의 배열.
148. 24 내지 8192개의 3차원 하이드로겔 네트워크를 포함하는, 구현예 137 또는 구현예 138의 배열.
149. 24 내지 4096개의 3차원 하이드로겔 네트워크를 포함하는, 구현예 137 또는 구현예 138의 배열.
150. 24 내지 2048개의 3차원 하이드로겔 네트워크를 포함하는, 구현예 137 또는 구현예 138의 배열.
151. 24 내지 1024개의 3차원 하이드로겔 네트워크를 포함하는, 구현예 137 또는 구현예 138의 배열.
152. 24개의 3차원 하이드로겔 네트워크를 포함하는, 구현예 137 또는 구현예 138의 배열.
153. 48개의 3차원 하이드로겔 네트워크를 포함하는, 구현예 137 또는 구현예 138의 배열.
154. 96개의 3차원 하이드로겔 네트워크를 포함하는, 구현예 137 또는 구현예 138의 배열.
155. 128개의 3차원 하이드로겔 네트워크를 포함하는, 구현예 137 또는 구현예 138의 배열.
156. 256개의 3차원 하이드로겔 네트워크를 포함하는, 구현예 137 또는 구현예 138의 배열.
157. 512개의 3차원 하이드로겔 네트워크를 포함하는, 구현예 137 또는 구현예 138의 배열.
158. 1024개의 3차원 하이드로겔 네트워크를 포함하는, 구현예 137 또는 구현예 138의 배열.
159. 구현예 137 내지 158 중 어느 하나의 배열로서, 여기서 3차원 하이드로겔 네트워크가 프로브 분자를 포함하고, 2개 이상의 3차원 하이드로겔 네트워크가 상이한 종의 프로브 분자를 포함하는 배열.
160. 구현예 137 내지 159 중 어느 하나의 배열로서, 여기서 3차원 하이드로겔 네트워크가 프로브 분자를 포함하고, 2개 이상의 3차원 하이드로겔 네트워크가 동일한 종의 프로브 분자를 포함하는 배열.
161. 구현예 137 내지 158 중 어느 하나의 배열로서, 여기서 3차원 하이드로겔 네트워크가 프로브 분자를 포함하고, 각각의 3차원 하이드로겔 네트워크가 동일한 종의 프로브 분자를 포함하는 배열.
162. 구현예 137 내지 161 중 어느 하나의 배열로서, 여기서 다수의 3차원 하이드로겔 네트워크가 표지된 대조군 프로브 분자를 포함하는 하나 이상의 3차원 하이드로겔 네트워크를 포함하는 배열.
163. 구현예 162의 배열로서, 여기서 표지된 대조군 프로브 분자가 형광 표지된 배열.
164. 구현예 137 내지 163 중 어느 하나의 배열로서, 여기서 기판이 미세웰 플레이트를 포함하고 미세웰 플레이트의 각각의 웰이 하나 이하의 3차원 하이드로겔 네트워크를 함유하는 배열.
165. (a) 구현예 136에 따른 3차원 하이드로겔 네트워크 또는 분석물에 결합할 수 있는 프로브 분자를 포함하는 구현예 164 중 어느 하나의 배열을 샘플과 접촉시키는 단계; 및
(b) 3차원 하이드로겔 네트워크 또는 배열내 프로브 분자에 대한 분석물의 결합을 검출함으로써, 분석물이 샘플 속에 존재하는지의 여부를 측정하는 단계를 포함하는, 분석물이 샘플 속에 존재하는지의 여부를 측정하는 방법.
166. 구현예 165의 방법으로서, 단계 (a)와 단계 (b) 사이에 프로브 분자를 포함하는 네트워크 또는 배열을 세척하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
167. 구현예 165 또는 구현예 166의 방법으로서, 단계 (a) 전에 프로브 분자를 포함하는 네트워크 또는 배열을 차단 시약과 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
168. 구현예 165 내지 167 중 어느 하나의 배열로서, 프로브 분자를 포함하는 3차원 하이드로겔 네트워크 또는 배열에 결합된 분석물의 양을 정량화하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
169. (a) 분석물에 결합할 수 있는 프로브 분자를 포함하는, 구현예 137 내지 164 중 어느 하나의 배열을 샘플과 접촉시키는 단계; 및
(b) 배열내의 프로브 분자에 대한 분석물의 결합을 검출함으로써, 분석물이 다수의 샘플 속의 각각의 샘플 내에 존재하는지의 여부를 측정하는 단계를 포함하는, 분석물이 다수의 샘플 속의 각각의 샘플내에 존재하는지의 여부를 측정하는 방법.
170. (a) 분석물에 결합할 수 있는 프로브 분자를 포함하는, 구현예 137 내지 164 중 어느 하나의 배열을 샘플과 접촉시키고 대조군 프로브 분자를 포함하는 단계로서, 여기서 배열이 단계 (a) 전에 사용되고 세척되는 단계; 및
(b) 배열내의 프로브 분자에 대한 분석물의 결합을 검출함으로써, 분석물이 다수의 샘플 속의 각각의 샘플 내에 존재하는지의 여부를 측정하는 단계를 포함하는, 분석물이 다수의 샘플 속의 각각의 샘플내에 존재하는지의 여부를 측정하는 방법.
171. (a) 상이한 종의 분석물에 결합할 수 있는 상이한 종의 프로브 분자를 포함하는, 구현예 137 내지 164 중 어느 하나의 배열을 샘플과 접촉시키는 단계; 및
(b) 배열내의 프로브 분자에 대한 분석물의 결합을 검출함으로써, 분석물의 하나 이상의 종이 샘플 속에 존재하는지의 여부를 측정하는 단계를 포함하는, 분석물의 하나 이상의 종이 샘플 속에 존재하는지의 여부를 측정하는 방법.
172. (a) 상이한 종의 분석물에 결합할 수 있는 상이한 종의 프로브 분자를 포함하는, 구현예 137 내지 164 중 어느 하나의 배열을 샘플과 접촉시키고 대조군 프로브 분자를 포함하는 단계로서, 여기서 배열이 단계 (a) 전에 사용되고 세척되는 단계; 및
(b) 배열내의 프로브 분자에 대한 분석물의 결합을 검출함으로써, 분석물의 하나 이상의 종이 샘플 속에 존재하는지의 여부를 측정하는 단계를 포함하는, 분석물의 하나 이상의 종이 샘플 속에 존재하는지의 여부를 측정하는 방법.
173. 구현예 169 내지 172 중 어느 하나의 방법으로서, 여기서:
(a) 배열의 기판이 미세웰 플레이트를 포함하고;
(b) 미세웰 플레이트의 각각의 웰이 하나 이하의 3차원 하이드로겔 네트워크를 함유하며;
(c) 배열과 샘플의 접촉이 각각의 웰과 하나 이상의 단일 샘플을 접촉시킴을 포함하는 방법.
174. 구현예 169 내지 173 중 어느 하나의 방법으로서, 여기서, 단계 (a) 내지 단계 (b) 사이에 프로브 분자를 포함하는 배열을 세척하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
175. 구현예 169 내지 174 중 어느 하나의 방법으로서, 프로브 분자를 포함하는 배열을 단계 (a) 전에 차단 시약과 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
176. 구현예 169 내지 175 중 어느 하나의 방법으로서, 배열에 결합된 분석물 또는 분석물들의 양을 정량화하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
177. 구현예 165 내지 176 중 어느 하나의 방법으로서, 배열을 재사용하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
178. 구현예 177의 방법으로서, 여기서, 배열이 적어도 5회 재사용되는 방법.
179. 구현예 177의 방법으로서, 여기서, 배열이 적어도 10회 재사용되는 방법.
180. 구현예 177의 방법으로서, 여기서, 배열이 적어도 20회 재사용되는 방법.
181. 구현예 177의 방법으로서, 여기서, 배열이 적어도 30회 재사용되는 방법.
182. 구현예 177의 방법으로서, 여기서, 배열이 적어도 40회 재사용되는 방법.
183. 구현예 177의 방법으로서, 여기서, 배열이 적어도 50회 재사용되는 방법.
184. 구현예 178의 방법으로서, 배열을 5 내지 20회 재사용하는 단계를 포함하는 방법.
185. 구현예 178의 방법으로서, 배열을 5 내지 30회 재사용하는 단계를 포함하는 방법.
186. 구현예 178의 방법으로서, 배열을 10 내지 50회 재사용하는 단계를 포함하는 방법.
187. 구현예 178의 방법으로서, 배열을 10 내지 20회 재사용하는 단계를 포함하는 방법.
188. 구현예 178의 방법으로서, 배열을 10 내지 30회 재사용하는 단계를 포함하는 방법.
189. 구현예 178의 방법으로서, 배열을 20 내지 40회 재사용하는 단계를 포함하는 방법.
190. 구현예 178의 방법으로서, 배열을 40 내지 50회 재사용하는 단계를 포함하는 방법.
191. 구현예 177 내지 190 중 어느 하나의 방법으로서, 배열을 재사용 사이에 세척하는 단계를 포함하는 방법.
192. 구현예 191의 방법으로서, 여기서, 배열이 변성 조건 하에서 세척되는 방법.
193. 구현예 192의 방법으로서, 여기서, 변성 조건이 배열을 열에 노출시키는 단계를 포함하는 방법.
194. 구현예 192의 방법으로서, 여기서, 변성 조건이 배열을 저 염 농도에 노출시키는 단계를 포함하는 방법.
195. 구현예 192의 방법으로서, 여기서, 변성 조건이 배열을 열 및 저 염 농도 둘 다에 노출시키는 단게를 포함하는 방법.
196. 구현예 192의 방법으로서, 여기서, 변성 조건이 재사용 전에 제거되는 방법.
197. 구현예 196의 방법으로서, 여기서, 변성 조건이 배열을 열에 노출시키는 단계를 포함하고 여기서 온도가 재사용 전에 강하되는 방법.
198. 구현예 196의 방법으로서, 여기서 변성 조건이 배열을 저 염 농도에 노출시키는 단계를 포함하고 여기서 염 농도가 재사용 전에 증가되는 방법.
199. 구현예 196의 방법으로서, 여기서, 변성 조건이 배열을 열 및 저 염 농도 둘 다에 노출시키는 단계를 포함하고 여기서 재사용 전에 온도가 강하되며 염 농도가 증가되는 방법.
200. 구현예 177 내지 199 중 어느 하나의 방법으로서, 여기서, 배열이 재사용능 대조군으로서 형광 표지된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 적어도 하나의 3차원 하이드로겔 네트워크를 포함하는 방법.
201. 구현예 200의 방법으로서, 형광성 신호 강도를 시험하는 단계를 포함하는 방법.
202. 구현예 201의 방법으로서, 여기서, 재사용능 대조군이 10회 사용 후 이의 초기의 형광성 신호 강도의 적어도 70%를 유지하는 방법.
203. 구현예 202의 방법으로서, 여기서, 재사용능 대조군이 20회 사용 후 이의 신호 강도의 적어도 50%를 유지하는 방법.
204. 구현예 200 내지 203의 방법으로서, 여기서, 재사용능 대조군이 이의 초기 강도의 50% 이상을 손실한 후에 배열이 더 이상 재사용되지 않는 방법.
205. 구현예 165 내지 204 중 어느 하나의 방법으로서, 여기서, 분석물이 핵산인 방법.
206. 구현예 205의 방법으로서, 여기서, 핵산이 폴리머라제 쇄 반응(PCR) 앰플리콘인 방법.
207. 구현예 205의 방법으로서, 여기서, PCR 앰플리콘이 생물학적 샘플 또는 환경적 샘플로부터 증폭되는 방법.
208. 구현예 207의 방법으로서, 여기서, PCR 앰플리콘이 생물학적 샘플로부터 증폭되는 방법.
209. 구현예 207의 방법으로서, 여기서, PCR 앰플리콘이 환경적 샘플로부터 증폭되는 방법.
210. 구현예 208의 방법으로서, 여기서, 생물학적 샘플이 혈액, 혈청, 혈장, 조직, 세포, 타액, 가래, 뇨, 뇌척수액, 흉수액, 젖, 눈물, 대변, 땀, 정액, 전체 세포, 세포 구성성분, 세포 도말, 또는 추출물 또는 이의 유도체인 방법.
211. 구현예 210의 방법으로서, 여기서, 생물학적 샘플이 혈액, 혈청 또는 혈장 또는 이의 추출물인 방법.
212. 구현예 211의 방법으로서, 여기서, 생물학적 샘플이 사람 또는 소 혈액, 혈청 또는 혈장 또는 이의 추출물인 방법.
213. 구현예 210의 방법으로서, 여기서, 생물학적 샘플이 젖 또는 이의 추출물인 방법.
214. 구현예 213의 방법으로서, 여기서, 생물학적 샘플이 우유 또는 이의 추출물인 방법.
215. 구현예 205 내지 214 중 어느 하나의 방법으로서, 여기서, 핵산이 표지되는 방법.
216. 구현예 215의 방법으로서, 여기서, 핵산이 형광 표지되는 방법.
다양한 구체적인 구현예가 예시되고 기술되었지만, 다양한 변화가 본 개시내용(들)의 취지 및 영역으로부터 벗어남이 없이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다.
8. 참고문헌의 인용
본 출원에서 모든 공보, 특허, 특허원 및 다른 서류는 각각의 개개 공보, 특허, 특허원 또는 다른 서류가 모든 목적을 위해 참고로 혼입되도록 개별적으로 나타낸 경우와 동일한 정도로 모든 목적을 위해 이들의 전문이 참고로 본원에 포함된다. 본원에 포함된 하나 이상의 참고문헌과 본 개시내용의 교시내용들 사이에 불일치하는 경우에는, 본 명세서의 교시내용이 의도된다.

Claims (25)

  1. 하기를 포함하는, 하나 이상의 수송 채널을 포함하는 3차원 하이드로겔 네트워크의 제조 방법:
    (a) (i) 총 농도가 적어도 500 mM인 적어도 2개 유형의 1가 금속 이온,
    (ii) 수용성 중합체 쇄, 및
    (iii) 가교-결합제 모이어티(cross-linker moiety),
    를 포함하는 혼합물을 염 결정 형성 조건에 노출시킴으로써 하나 이상의 염 결정을 함유하는 혼합물을 형성시키는 단계;
    (b) 하나 이상의 염 결정을 함유하는 혼합물 내 중합체 쇄를 가교-결합 하여, 하나 이상의 염 결정을 함유하는 하이드로겔을 형성시키는 단계; 및
    (c) 하나 이상의 염 결정을 함유하는 하이드로겔을 하나 이상의 염 결정이 가용성인 용매와 접촉시켜, 염 결정을 용해시킴으로써,
    하나 이상의 수송 채널을 포함하는 3차원 하이드로겔 네트워크를 형성시키는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 혼합물이 프로브 분자를 포함하는, 방법.
  3. 제2항에 있어서, 프로브 분자가 핵산 분자인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 혼합물이 기판의 표면 위에 위치하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 염 결정 형성 조건이, 혼합물 속의 상대적인 염 함량이 용해도 한계 이상으로 증가할 때까지 혼합물을 탈수시키거나 혼합물을 냉각시키는 것를 포함하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 혼합물이 총 농도가 500 mM 내지 1000 mM인 적어도 2개 유형의 1가 금속 이온을 포함하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 혼합물이 200 mM 이상의 농도의 나트륨 이온을 포함하고 150 mM 이상의 농도의 칼륨 이온을 포함하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 나트륨 이온의 농도가 300 mM 내지 400 mM의 범위이고 상기 칼륨 이온의 농도가 200 mM 내지 350 mM의 범위인, 방법.
  9. 제1항에 있어서, 단계 (a) 전에, 혼합물을 형성시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 혼합물을 형성시키는 단계가 1가 금속 양이온을 포함하는 수성 염 용액 및 수용성 중합체 쇄, 가교-결합제 모이어티 및, 존재하는 경우, 프로브 분자를 포함하는 하나 이상의 용액을 조합하는 것을 포함하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 수성 염 용액이 6 내지 9 범위의 pH를 갖는 방법.
  12. 제10항에 있어서, 수성 염 용액이 인산수소이나트륨, 인산이수소나트륨, 인산수소이칼륨, 및 인산이수소칼륨을 물 속에 용해시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 생산되는 방법.
  13. 제1항에 있어서, 수용성 중합체 쇄가 분자당 적어도 2개의 가교-결합제 모이어티 및 메타크릴레이트 그룹을 포함하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 가교-결합제 모이어티가 벤조페논 모이어티인 방법.
  15. 제13항에 있어서, 수용성 중합체 쇄가 디메틸아크릴아미드(DMAA), 메타크릴로일옥시벤조페논(MABP), 및 나트륨 4-비닐벤젠설포네이트(SSNa)로부터 중합되는 방법.
  16. 제1항에 따른 방법에 의해 수득되거나 수득가능한 3차원 하이드로겔 네트워크.
  17. 가교-결합된 수용성 중합체 쇄 및 하나 이상의 프로브 분자를 포함하고 하나 이상의 장 채널 및 하나 이상의 단 채널을 가지는 3차원 하이드로겔 네트워크로,
    (a) 장 채널 각각은 실질적으로 직쇄이고 3차원 하이드로겔 네트워크의 수화된 형태에서 최소 횡단면이 300nm 이상이고 길이가 최소 횡단면의 3배 이상이며,
    (b) 단 채널 각각은 실질적으로 직쇄이고 3차원 하이드로겔 네트워크의 수화된 형태에서 길이가 최소 횡단면의 3배 미만인, 3차원 하이드로겔 네트워크.
  18. 제17항에 있어서, 상기 프로브 분자가 핵산 분자인, 3차원 하이드로겔 네트워크.
  19. 제17항에 있어서, 하나 이상의 단 채널이 하나 이상의 장 채널에 의해 침투되는(penetrated), 3차원 하이드로겔 네트워크.
  20. 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 다수의 3차원 하이드로겔 네트워크를 포함하는 배열(array)로서, (a) 3차원 하이드로겔 네트워크가 기판 위에 고정되고 (b) 각각의 3차원 하이드로겔 네트워크가 기판 위에 별개의 스폿에 위치하는, 배열.
  21. 제20항에 있어서, 배열이 적어도 10회 재사용될 수 있는, 배열.
  22. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 다수의 3차원 하이드로겔 네트워크를 동일한 기판의 표면 위의 별개의 스폿에 생성시키는 단계, 및 3차원 하이드로겔 네트워크를 단계 (b) 동안에 기판에 가교-결합시키는 단계를 포함하는, 배열(array)의 제조 방법.
  23. (a) 분석물에 결합할 수 있는 프로브 분자를 포함하는, 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 3차원 하이드로겔 네트워크를 샘플과 접촉시키는 단계; 및
    (b) 3차원 하이드로겔 네트워크 내에서 프로브 분자에 대한 분석물의 결합을 검출함으로써 분석물이 샘플 속에 존재하는지의 여부를 측정하는 단계를 포함하는, 분석물이 샘플 속에 존재하는지의 여부를 측정하기 위한 방법.
  24. 제23항에 있어서, 3차원 하이드로겔 네트워크가 단계 (a) 전에 적어도 10회 사용되고 세척되거나, 단계 (b) 후에 3차원 하이드로겔 네트워크를 적어도 10회 재사용하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 3차원 하이드로겔 네트워크 내에서 프로브 분자에 대한 분석물의 결합을 정량하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
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