BR112019025877A2 - redes de polímeros tridimensionais e seu uso - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se a redes de polímeros reticulados tridimensionais, canais de transporte, arranjos que compreendem as redes, processos para a produção das redes, e usos das redes e dos arranjos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "REDES DE POLÍMEROS TRIDIMENSIONAIS E SEU USO".

1. ANTECEDENTES

[0001] A publicação nº US 2008/0293592 descreve um método para imobilizar de modo covalente biomoléculas de sonda em superfí- cies orgânicas por meio de agentes de reticulação fotorreativos. O mé- todo provou, na prática, ser vantajoso, particularmente porque permite a imobilização de biomoléculas de sonda em superfícies não reativas, tais como suportes e substratos de vidro silanizados feitos de plásticos comerciais padrão. Um polímero é usado no método descrito no do- cumento nº US 2008/0293592 para formar um tipo de rede tridimensi- onal em que as biomoléculas de sonda podem ser ligadas, tanto na superfície da rede quanto no interior da rede. Comparada a uma su- perfície orgânica em que as biomoléculas de sonda só são imobiliza- das na forma bidimensional, a imobilização tridimensional das biomo- léculas na rede de polímero e/ou de copolímero permite uma densida- de mais alta das biomoléculas de sonda na superfície orgânica. Isso aumenta a quantidade de analito que pode ser ligado por unidade de superfície da superfície orgânica. Desse modo, o uso da superfície como sensor biológico permite maior exatidão na medição e alta dinà- mica na medição.

[0002] No entanto, uma desvantagem dos métodos e das redes de polímeros descritos no documento nº US 2008/0293592 é que as mo- léculas de analito ou os componentes de analito que ligam as biomolé- culas de sonda arranjadas ou próximas da superfície da rede de polí- mero podem bloquear a rede. Moléculas de analito ou constituintes de analito adicionais podem então não mais se ligar assim como as bio- moléculas de sonda já não ligadas que são arranjadas a uma distância maior da superfície da rede em seu interior.

[0003] Desse modo, há a necessidade de redes de polímeros me-

lhoradas.

2. SUMÁRIO

[0004] A presente descrição apresenta redes de polímeros tridi- mensionais que compreendem cadeia de polímeros reticuladas, por exemplo, cadeias de polímeros solúveis em água, e um ou mais ca- nais de transporte. Os canais de transporte permitem que as molécu- las na solução, por exemplo, as moléculas de analito, acessem as ca- deias de polímeros dentro da rede. Em certos aspectos, as cadeias de polímeros são reticuladas em relação às moléculas de sonda, e os ca- nais de transporte fornecem uma área de superfície maior para ligação dos analitos às moléculas de sonda.

[0005] As redes são unidas de modo covalente de modo apropria- do a uma superfície. Tal como indicado no parágrafo anterior, uma ou mais sondas, tais como uma biomolécula, podem ser imobilizadas na superfície da rede e em todo o interior da rede, provendo um sensor para detectar a presença e/ou medir a quantidade de analito em uma amostra. Por exemplo, as sondas de ácido nucleico podem ser usadas para detectar os ácidos nucleicos complementares presentes em uma amostra, e as sondas de anticorpos podem ser usadas para detectar os antígenos presentes em uma amostra. As redes da presente des- crição permitem uma hibridização mais rápida de uma dada quantida- de de analito do que as redes que não possuem os canais de transpor- te porque os canais de transporte podem aumentar efetivamente a área de superfície da rede, expondo mais sondas à amostra em uma dada quantidade de tempo. Além disso, as redes da presente descri- ção podem ligar mais analitos do que o mesmo volume de uma rede livre de canais de transporte porque os canais de transporte diminuem ou eliminam o problema, com o que o analito ou outros componentes de uma amostra ligada às sondas ou perto da superfície da rede blo- queiam o acesso às sondas situadas no interior da rede. Uma outra vantagem das redes da presente descrição é que uma grande quanti- dade de carga de analito tornada possível pelos canais de transporte permite uma detecção mais sensível do analito do que pode ser possí- vel com uma rede livre de canais de transporte, isto é, a razão entre sinal e ruído pode ser melhorada se comparada às redes livres de ca- nais de transporte porque uma dada quantidade de analito pode ser concentrada em um volume de rede menor. Outra vantagem das redes da presente descrição é que uma alta carga de analito tornada possí- vel pelos canais de transporte permite a quantificação de uma faixa mais ampla de concentrações de analito se comparada às redes livres de canais de transporte.

[0006] A presente descrição também apresenta arranjos que com- preendem uma pluralidade de redes tridimensionais de acordo com a descrição e um substrato. Os arranjos de acordo com a descrição po- dem ser usados para detectar e/ou medir um ou mais analitos em uma ou mais amostras simultaneamente. Os arranjos de acordo com a descrição podem ser lavados e reutilizados, permitindo uma vantagem de custo significativa em relação aos arranjos que só podem ser usa- dos uma vez. Outra vantagem dos arranjos de acordo com a descrição é que eles podem ser fabricados de uma maneira simples porque to- dos os componentes necessários para fazer uma rede individual po- dem ser aplicados como uma mistura única em uma superfície do substrato durante o processo de fabricação.

[0007] A presente descrição também apresenta processos para produção das redes tridimensionais e dos arranjos de acordo com a descrição. As redes tridimensionais de acordo com a descrição podem ser feitas pela reticulação de um polímero na presença de pelo menos dois tipos de cristais de sal, de preferência cristais de sal em formato de agulha e cristais de sal compactos, e subsequentemente pela dis- solução dos cristais de sal para que deixem para trás os canais de transporte na rede de polímeros reticulada. Sem ficarem limitados pela teoria, os autores da presente invenção acreditam que a presença de cristais de sal compactos durante a reticulação resulta em um polímero semelhante a uma esponja com canais curtos que são penetrados pe- los canais longos criados pela presença dos cristais de sal em formato de agulha durante a reticulação.

[0008] A presente descrição também apresenta processos para uso das redes tridimensionais e dos arranjos de acordo com a descri- ção para detectar e/ou medir um analito em uma amostra, de prefe- rência em uma amostra líquida.

3. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0009] A Figura 1 mostra uma representação em diagrama de uma mistura que tem uma biomolécula de sonda 1 e um polímero 3) que compreende dois grupos fotorreativos 4 por molécula dissolvidos em uma solução de sal aquosa (tal como descrito na seção 4.3.1).

[0010] A Figura 2 mostra uma seção transversal de uma gota da mistura 5, tal como a mostrada na Figura 1, a qual tem uma superfície localizada em um ponto 7 de uma superfície 2 que pode ficar situa- da em um suporte 6. A superfície é de preferência a de um substrato orgânico ou substrato que contém um orgânico. O substrato é de pre- ferência rígido. O suporte pode ser um suporte aquecido ou um supor- te resfriado para permitir a cristalização controlada dos sais na solução de sal aquosa.

[0011] A Figura 3 mostra uma seção transversal através do arranjo mostrado na Figura 2 depois que a mistura foi aquecida e que ambos os (a) cristais de sal em formato de agulha 8 se estendem dos germes de cristalização 9 e (b) cristais compactos 14 tiverem sido formados na solução de sal.

[0012] A Figura 4 mostra uma seção transversal através do arranjo mostrado na Figura 3 após a mistura ter sido secada e irradiada com uma radiação óptica 11 para formar uma rede de polímeros 15 que tenha uma superfície 16.

[0013] A Figura 5 mostra uma representação em diagrama da mis- tura da Figura 1 depois da irradiação com radiação óptica.

[0014] A Figura 6 mostra uma seção transversal através do arranjo mostrado na Figura 4 após a dissolução dos cristais de sal em um sol- vente 12, formando os canais de transporte na forma de canais longos 13 e de canais curtos 19.

[0015] A Figura 7 mostra uma passagem de reação para a forma- ção de pí(dimetiacriamida) co metacriloil-benzofenona co 4 vinilbenzenossulfonato de sódio.

[0016] A Figura 8 mostra uma vista em perspectiva de um biochip 17 em que as redes de polímero 15 ficam situadas em pontos 7 arran- jados como uma matriz de fileiras e de colunas. O chip tem de prefe- rência uma superfície orgânica.

[0017] A Figura 9 mostra a vista superior de um biochip 17, tal co- mo o mostrado na Figura 8, em que cada rede de polímeros 15 tem um diâmetro D, e em que as fileiras e as colunas são separadas por uma distância Y e por uma distância X, respectivamente, medida dos pontos centrais das redes de polímeros 15.

[0018] A Figura 10 mostra um biossensor 17' que compreende uma faixa de substrato flexível 18 em que as redes de polímeros 15 que têm um diâmetro D ficam situadas nos pontos 7 separados pela distância X medida dos pontos centrais das redes de polímeros.

[0019] As Figuras 11A a 11C mostram um biochip com 6 fileiras (A-F) e 6 colunas (1 a 6) de redes de polímeros antes (Figura 11A) e depois (Figura 11B) da secagem, que mostra as concentrações de sal usadas para fazer as redes de polímeros das fileiras D e E mostradas na Figura 11C. As redes de polímeros das fileiras D e E foram feitas ao usar uma solução de sal aquosa que contém fosfato de sódio e fos-

fato de potássio. As fileiras restantes foram feitas ao usar uma solução de sal aquosa que contém somente o fosfato de sódio a uma concen- tração de 350 mM. As redes de polímeros das fileiras D e E parecem mais arredondadas e homogêneas.

[0020] As Figuras 12A a 12C mostram os resultados da hibridiza- ção de um produto de reação de PCR ao usar pares de primers espe- cíficos de S. aureus e de E.coli para os arranjos de acordo com a Figu- ra 12A à Figura 12C. A Figura 12A mostra a hibridização para um ar- ranjo do produto de PCR amplificada de 100 cópias do DNA do S. au- reus. A Figura 12B mostra a hibridização para um arranjo do produto de PCR amplificada de 100 cópias do DNA da E. coli. A Figura 12C mostra o mapa de sonda para os arranjos mostrados na Figura 12A e na Figura 12B. E. coli = Sonda de E. coli; Salmonella = Sonda de Sal- monella (à qual o produto de PCR E. coli mostra alguma reatividade cruzada); Allstaf = uma bandeja de sonda de Stafilococcus; S. Aureus = sonda de S. Aureus; Controle de PCR = sonda para detectar o con- trole interno do processo de amplificação de PCR; LL = luzes de ater- ragem, que são oligonucleotídeos etiquetados com fluoróforos reticu- lados às cadeias de polímeros nas redes usadas como controles do arranjo.

[0021] A Figura 13 mostra a quantificação dos sinais de fluores- cência da hibridização do produto de PCR amplificada ao usar os pa- res de primers específicos de S. Aureus ou E. coli na ausência do molde, representando o "ruído" de fundo. O nº 1 representa o ponto D1, E1; o nº 2 representa o ponto D1, E2; o nº 3 representa o ponto D1, E3; o nº 4 representa o ponto D1, E4; o nº 5 representa o ponto D1, E5; e o nº 6 representa o ponto D1, E6.

4. DESCRIÇÃO DETALHADA

4.1. Redes de Polímeros Tridimensionais

[0022] As redes tridimensionais de acordo com a descrição com- preendem um polímero reticulado, por exemplo, um polímero de acor- do com Rendl! et al., 2011, Langmuir 27:6116 a 6123 ou o documento US 2008/0293592, cujos conteúdos são aqui incorporados a título de referência em sua totalidade. As redes tridimensionais de acordo com a descrição também compreendem um ou mais canais de transporte e podem opcionalmente compreender também uma ou mais sondas imobilizadas na rede, por exemplo, pela reticulação em relação às ca- deias de polímeros.

[0023] As redes de acordo com a descrição podem ter um tama- nho de malha (medido no estado hidratado da rede) de, por exemplo, a 75 nm (por exemplo, 10 a 20 nm, 10 a 30 nm, 10 a 40 nm, 10 a 50 nm, 20 a 30 nm, 20 a 40 nm, 20 a 50 nm, 30 a 40 nm, 30 a 50 nm ou 40 a 50 nm). O termo "estado hidratado da rede" significa que a rede está em equilíbrio com respeito à absorção de água, isto é, absorve na solução aquosa tanta água quanto emite.

[0024] Os polímeros que podem ser usados para fazer as redes são descritos na seção 4.1.1. Os reticuladores que podem ser usados para fazer as redes são descritos na seção 4.1.2. As características de um ou mais canais de transporte são descritas na seção 4.1.3. As sondas que podem ser imobilizadas nas redes são descritas na seção

4.1.4.

4.1.1. Polímeros

[0025] As redes tridimensionais de acordo com a descrição podem compreender um homopolímero reticulado, um copolímero, as mistu- ras de homopolímeros, as misturas de copolímeros ou as misturas de um ou mais homopolímeros e de um ou mais copolímeros. O termo "polímero", tal como aqui utilizado, inclui os homopolímeros e/ou os copolímeros. O termo "copolímero", tal como aqui utilizado, inclui tanto os polímeros polimerizados de dois ou mais tipos de monômeros (por exemplo, bipolímeros, terpolímeros, quaterpolímeros, etc.). Os copolí- meros incluem copolímeros alternativos, copolímeros periódicos, copo- límeros estatísticos, copolímeros aleatórios, copolímeros em bloco, copolímeros lineares e copolímeros ramificados. As redes tridimensio- nais de acordo com a descrição podem compreender qualquer combi- nação dos tipos anteriores de polímeros. Os reagentes e os métodos para fazer tais polímeros são conhecidos no estado da técnica (ver, por exemplo, Ravve, A., Principles of Polymer Chemistry, Springer Science + Business Media, 1995; Cowie, J.M.G., Polymers: Chemistry & Physics of Modern Materials, 2º Edição, Chapman & Hall, 1991; Chanda, M., Introduction to Polymer Science and Chemistry: A Pro- blem-Solving Approach, 2º Edição, CRC Press, 2013; Nicholson, J.W,, The Chemistry of Polymers, 4º Edição, RSC Publishing, 2012; cujos teores são aqui incorporados a título de referência em sua totalidade).

[0026] Os polímeros preferidos são hidrofílicos e/ou contêm gru- pos hidrofílicos. O polímero é de preferência solúvel em água. Em uma modalidade, o polímero é um copolímero que foi polimerizado de duas ou mais espécies de monômeros selecionados de modo a prover um nível desejado de solubilidade em água. Por exemplo, a solubilidade em água de um copolímero pode ser controlada pela variação da quantidade de um monômero carregado, por exemplo, sódio 4- vinilsulfonato, usado para fazer o copolímero.

[0027] Quando reticulados, os polímeros solúveis em água formam géis ou hidrogéis intumescíveis em água. Os hidrogéis absorvem as soluções aquosas através da ligação do hidrogênio com as moléculas de água. A capacidade total de absorvência e de intumescimento de um hidrogel pode ser controlada pelo tipo e pelo grau dos reticuladores usados para fazer o gel. Os polímeros com baixa densidade de reticu- lação geralmente têm uma capacidade absorvente mais alta e ficam intumescidos em um grau mais alto do que os polímeros com alta den-

sidade de reticulação, mas a resistência de gel dos polímeros de alta densidade de reticulação é mais firme e pode manter o formato da re- de mesmo sob uma pressão reduzida.

[0028] A capacidade de um hidroge!l de absorver a água é um fator da concentração iônica da solução aquosa. Em determinadas modali- dades, um hidrogel de acordo com a descrição pode absorver até 50 vezes seu peso (de 5 a 50 vezes seu próprio volume) em água deioni- zada, destilada, e até 30 vezes seu peso (de 4 a 30 vezes seu próprio volume) em solução salina. A absorvência reduzida em solução salina deve-se à presença dos cátions de valência, que impedem a capaci- dade do polímero de se ligar com a molécula de água.

[0029] A rede tridimensional de acordo com a descrição pode compreender um copolímero que foi polimerizado de uma, duas, três ou mais do que três espécies de monômeros, em que uma, duas, três ou mais do que três espécies de monômeros têm um grupo polimeri- zável selecionado independentemente de um grupo acrilato (por exemplo, acrilato, metacrilato, metacrilato de metila, metacrilato de hi- droxietila, acrilato de etila, acrilato de 2-fenila), de um grupo acrilamida (por exemplo, acrilamida, metacrilamida, dimetilacrilamida, etilacrilami- da), de um grupo itaconato (por exemplo, itaconato, itaconato de 4- metila, itaconato de dimetila) e de um grupo estireno (por exemplo esti- reno, estireno de 4-metila, 4-etoxiestireno). Os grupos polimerizáveis preferidos são acrilato, metacrilato, etacrilato, acrilato de 2-fenila, acri- lamida, metacrilamida, itaconato e estireno. Em algumas modalidades, um dos monômeros usados para fazer o copolímero é carregado, por exemplo, o 4-vinilbenzenossulfonato de sódio.

[0030] O polímero usado para fazer uma rede de acordo com a descrição pode compreender pelo menos um, pelo menos dois ou mais do que dois grupos de reticulador por molécula. Um grupo de re- ticulador é um grupo que liga de modo covalente as moléculas do po-

límero da rede umas às outras e, opcionalmente, às sondas e/ou a um substrato. Os copolímeros que foram polimerizados de dois ou mais monômeros (por exemplo, monômeros que têm um grupo polimerizá- vel selecionado independentemente daqueles descritos no parágrafo anterior), e pelo menos um dos quais compreende um reticulador, são apropriados para fazer uma rede tridimensional de acordo com a des- crição. Os reticuladores exemplificadores são descritos na seção 4.1.2. Um monômero preferido que compreende um reticulador é metacri- loiloxibenzofenona (MABP) (vide a Figura 7).

[0031] Em uma modalidade preferida, o copolímero é um bipolíme- ro ou um terpolímero que compreende um reticulador. Em uma moda- lidade — particularmente — preferida, o copolímero compreende p(Dimetiacriamida) co metacriloil-benzofenona co 4- vinilbenzenossulfonato de sódio (vide a Figura 7).

4.1.2. Reticuladores

[0032] Os reagentes da reticulação (ou os reticuladores) apropria- dos para fazer as reticulações nas redes tridimensionais incluem aque- les ativados pela luz ultravioleta (por exemplo, luz UV de onda longa), pela luz visível e pelo calor. Os reticuladores exemplificadores ativados pela luz UV incluem a benzofenona, as tioxantonas (por exemplo, tioxanten-9-ona, 10-metilfenotiazina) e os éteres de benzoína (por exemplo, éter metílico de benzoína, éter etílico de benzoína). Os reti- culadores exemplificadores ativados pela luz visível incluem a etil eo- sina, eosina Y, rosa bengala, canforquinona e eritirosina. Os reticula- dores exemplificadores ativados por calor incluem o ácido 4,4' azo- bis(4-cianopentanoico) e o dicloridrato de 2,2-azobis[2-(2-imidazolin-2- il)propano] e o peróxido de benzoíla. Outros reticuladores conhecidos no estado da técnica, por exemplo, aqueles que podem formar radicais ou outros grupos reativos quando irradiados, também podem ser usa- dos.

4.1.3. Canais de Transporte

[0033] As redes tridimensionais de acordo com a descrição con- têm um ou mais canais de transporte.

[0034] Os canais de transporte podem permitir o acesso ao interior da rede. Embora os canais de transporte possam ter uma seção trans- versal relativamente grande, a rede pode permanecer mecanicamente estável porque o tamanho de malha da rede pode ser significativamen- te menor do que a seção transversal dos canais de transporte.

[0035] Os canais de transporte podem formar um tipo de via, atra- vés da qual os analitos podem entrar e sair rapidamente do interior da rede. O transporte dos analitos pode ser feito nos canais de transporte por difusão e/ou por convecção.

[0036] Os canais de transporte são formados quando uma rede é formada por cadeias de polímeros de reticulação na presença de cris- tais de sal, tal como descrito na seção 4.3. Depois que os cristais de sal são removidos, os canais de transporte são deixados para trás.

[0037] Sem ficar limitados pela teoria, os autores da presente in- venção acreditam que os métodos de fazer as redes de acordo com a descrição resultam na formação de pelo menos dois tipos de cristais de sal resultantes de um íon de metal diferente — pareações de íon de sal. Quando os cristais de sal são removidos, pelo menos dois tipos de canais de transporte são deixados para trás, de acordo com o princípio da forma "perdida". Os canais de transporte permitem que os analitos penetrem no interior da rede e se liguem especificamente a uma sonda situada no interior da rede. Além disso, os canais de transporte permi- tem que os analitos não ligados existam no interior da rede após a la- vagem, reduzindo a quantidade de sinal não específico dos analitos "colados" dentro da rede.

[0038] Um tipo de canal de transporte é considerado como um ca- nal longo criado de cristais de sal em formato de agulha. Tal como aqui utilizado, "canal longo" é uma passagem alongada em uma rede que (1) é substancialmente reta, e (2) no estado hidratado da rede, tem uma seção transversal mínima que é de pelo menos 300 nm e um comprimento que é de pelo menos três vezes, de preferência cinco vezes, e ainda com mais preferência de pelo menos dez vezes, a se- ção transversal mínima da passagem. Por exemplo, o comprimento do canal longo pode ser de 3 a 15 vezes, de 5 a 10 vezes ou de 10 a 15 vezes a seção transversal mínima do canal longo. Um canal longo que é "substancialmente reto" é um que se estende de um ponto de nucle- ação em uma direção sem mudar a direção mais do que 45 graus em qualquer direção, isto é, a direção X, Y ou Z. Uma vez que os canais longos surgem dos cristais em formato de agulha que formam um pon- to de nucleação comum, as redes de acordo com a descrição podem incluir grupos de (por exemplo, 5, 10 ou mais) canais longos que con- vergem em um ponto situado dentro da rede que corresponde ao pon- to de nucleação original da cristalização. Os canais longos normalmen- te são arranjados de tal maneira que, partindo da superfície da rede para o seu interior, a distância lateral entre os canais longos diminui.

[0039] Em outros aspectos, um tipo de canal de transporte é con- siderado como um canal curto, formado, por exemplo, de cristais cúbi- cos ou em formato de haste. Tal como aqui utilizado, "canal curto" é uma passagem em uma rede que (1) é substancialmente reta, e (2) no estado hidratado da rede, tem uma seção transversal mínima que é de preferência pelo menos 10 vezes o tamanho de malha da rede e um comprimento que é menos de três vezes (por exemplo, pode variar de 1 vez a 2,75 vezes, de 1 vez a 2,5 vezes, de | vez a 2 vezes ou de 1 vez a 1,5 vez) a seção transversal mínima da passagem. Um canal curto que é "substancialmente reto" é aquele que se estende de um ponto da nucleação em uma direção sem mudar de direção por mais do que 45 graus em qualquer direção, isto é, a direção X, Y ou Z. Para manter a resistência da rede, um canal curto tem de preferência uma seção transversal que não é maior do que 1/20º da largura ou do dià- metro da rede, por exemplo, para uma rede que está na forma de um "ponto" em um arranjo com um diâmetro de 200 um, a seção transver- sal do canal curto de preferência não é maior do que 10 um, e para um ponto em um arranjo com um diâmetro de 100 um, a seção transversal da canal curto de preferência não é maior do que 5 um. Em determi- nados aspectos, a seção transversal do canal curto é de cerca de 20 nm ou maior, de cerca de 50 nm ou maior, de cerca de 100 nm ou maior, de cerca de 250 nm ou maior, de pelo menos 500 nm ou maior ou de cerca de 1 um ou maior. Os canais curtos em uma rede podem ter cerca de (por exemplo, +/- 10% ou +/- 25%) o mesmo diâmetro ou diâmetros diferentes. Em certas modalidades, os canais curtos em uma rede têm um diâmetro que varia entre qualquer uma das duas di- mensões anteriores, por exemplo, pode variar de 100 nm a 10 um, de 50 nm a 1 um, de 500 nm a 5 um, de 250 nm a 10 um, e assim por di- ante.

[0040] Sem ficar limitados pela teoria, os autores da presente in- venção acreditam que os canais curtos criam um polímero de esponja que é penetrado pelos canais longos.

4.1.4. Sondas

[0041] Uma sonda imobilizada na rede de acordo com a descrição pode ser uma biomolécula ou uma molécula que liga uma biomolécula, por exemplo, um parceiro de um sistema de interação específico dos parceiros de ligação complementares (receptor/ligando). Por exemplo, as sondas podem compreender o ácido nucleico e seus derivados (tais como RNA, DNA, ácidos nucleicos bloqueados (LNA) e ácidos nuclei- cos peptídicos (PNA)), proteínas, peptídeos, polipeptídeos e seus deri- vados (tais como a glucosamina, os anticorpos, os fragmentos de anti- corpos e as enzimas), os lipídeos (por exemplo, fosfolipídeos, ácidos graxos, tais como o ácido araquidônico, os monodglicerídeos, os digli- cerídeos e os triglicerídeos), os carboidratos, os inibidores de enzima, os substratos de enzima, os antígenos e os epítopos. As sondas tam- bém podem compreender estruturas maiores e compostas, tais como lipossomas, membranas e fragmentos de membrana, células, lisados de células, fragmentos de células, esporos e micro-organismos.

[0042] Um sistema de interação específico dos parceiros de liga- ção complementares pode ser baseado, por exemplo, na interação de um ácido nucleico com um ácido nucleico complementar, na interação de um PNA com um ácido nucleico ou na interação enzima/substrato, receptor/ligando, lectina/açúcar, anticorpo/antígeno, avidina/biotina ou estreptavidina/biotina.

[0043] As sondas de ácido nucleico podem ser um DNA ou um RNA, por exemplo, um oligonucleotídeo ou um aptâmero, um LNA, um PNA ou um DNA que compreende um grupo de metacril na extremida- de 5' (5' Acrydite"Y). As sondas de oligonucleotídeos podem ter, por exemplo, 12 a 30, 14 a 30, 14 a 25, 14 a 20, 15a 30, 15a 25, 15a20, 16 a 30, 16 a 25, 16 a 20, 15 a 40, 15 a 45, 15 a 50, 15 a 60, 20 a 55, 18 a 60, 20 a 50, 30 a 90, 20 a 100, 20 a 60, 40 a 80, 40 a 100,20 a 120, 20 a 40, 40 a 60, 60 a 80, 80 a 100, 100 a 120 ou 12 a 150 nucle- otídeos de comprimento. Nas modalidades preferidas, a sonda de oli- gonucleotídeo tem 15 a 60 nucleotídeos de comprimento.

[0044] Ao usar uma sonda de ácido nucleico, toda a sonda ou so- mente uma porção da mesma pode ser complementar à sequência- alvo. A porção da sonda complementar à sequência-alvo tem de prefe- rência pelo menos 12 nucleotídeos de comprimento, e com mais prefe- rência pelo menos 15, pelo menos 18 ou pelo menos 20 nucleotídeos de comprimento. Para as sondas de ácido nucleico com um compri- mento maior do que 40 ou 50 nucleotídeos, a porção da sonda com-

plementar à sequência-alvo pode ter pelo menos 25, pelo menos 30 ou pelo menos 35 nucleotídeos de comprimento.

[0045] O anticorpo pode ser, por exemplo, um anticorpo policlonal, monoclonal ou quimérico ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo (isto é, a "porção antígeno-ligando") ou cadeia simples do mesmo, as proteínas de fusão que compreendem um anticorpo e qualquer outra configuração modificada da molécula de imunoglobuli- na que compreende um sítio de reconhecimento do antígeno, incluin- do, por exemplo sem limitação, uma cadeia simples (scFv) e os anti- corpos de domínio (por exemplo, anticorpos de domínio de seres hu- manos, de camelídeos ou de tubarão), maxicorpos, minicorpos, intra- corpos, diacorpos, triacorpos, tetracorpos, vNAR e bis-scFv (vide, por exemplo, Hollinger e Hudson, 2005, Nature Biotech 23:1126-1136). Um anticorpo inclui um anticorpo de qualquer classe, tal como IgG, IgA ou IgM (ou subclasse dos mesmos) e o anticorpo não precisa ser de nenhuma classe em particular. Dependendo da sequência de aminoá- cido do anticorpo de domínio constante de suas cadeias pesadas, as imunoglobulinas podem ser classificadas em classes diferentes. Há cinco classes principais de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e várias delas podem ainda ser divididas em subclasses (isotipos), por exemplo, IgG1, IgG2, I9G3, I9Ga4, IgA: e IgA2. O "anticorpo" também abrange qualquer um de cada tipo anterior de anticorpo/imunoglobu- lina.

[0046] As redes tridimensionais de acordo com a descrição podem compreender uma única espécie de sonda ou mais do que uma espé- cie de sonda (por exemplo, 2, 3, 4 ou 5 ou mais espécies). As redes tridimensionais podem compreender mais de uma espécie de sonda para o mesmo alvo (por exemplo, anticorpos que ligam epítopos dife- rentes do mesmo alvo) e/ou compreender as sondas que ligam múlti- plos alvos.

[0047] As redes podem compreender uma molécula de sonda de controle etiquetada (por exemplo, etiquetada de maneira fluorescente) que pode ser usada, por exemplo, para medir a quantidade de sondas presentes na rede.

[0048] As sondas podem ser distribuídas por toda a rede (por exemplo, na superfície e no interior de uma rede). De preferência, pelo menos uma sonda é afastada da superfície da rede e é unida a pelo menos um canal de transporte. Uma sonda assim localizada então fica diretamente acessível para as moléculas de analito ou os componen- tes de analito através dos canais de transporte. Em algumas modali- dades, a maioria das sondas fica situada no interior da rede.

[0049] Uma ou mais sondas podem ser imobilizadas na rede de modo covalente ou não covalente. Por exemplo, uma sonda pode ser reticulada ao polímero reticulado ou uma sonda pode ser ligada de modo não covalente à rede (tal como pela ligação a uma molécula |li- gada de modo covalente à rede). Em uma modalidade preferida, uma ou mais sondas são reticuladas em relação ao polímero reticulado. Em algumas modalidades, a maioria das sondas é ligada de modo cova- lente no interior da rede (por exemplo, de tal modo que pelo menos uma porção das sondas é unida a um canal de transporte).

[0050] Sem ficar limitados pela teoria, os autores da presente in- venção acreditam que os processos descritos na seção 4.3 para a fa- bricação das redes tridimensionais na presença de cristais de sal (par- ticularmente cristais de sal de fosfato) podem resultar em uma concen- tração maior da molécula de sonda na interface ou perto da mesma entre o polímero e o canal de transporte devido às interações eletros- táticas entre as moléculas de sonda (particularmente moléculas de sonda de ácido nucleico) e os cristais de sal. Por conseguinte, em al- gumas modalidades da invenção, a descrição apresenta redes de acordo com a descrição em que a densidade da sonda é maior na in-

terface entre o polímero e os canais de transporte do que dentro das regiões do polímero que não confinam com os canais de transporte. Nas várias modalidades, a densidade da sonda é pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40% ou pelo menos 50% mais densa na interface entre o polímero e os canais de transpor- te do que dentro das regiões do polímero que não confinam com um canal de transporte.

[0051] A densidade da molécula de sonda em uma rede pode ser verificada ao usar o procedimento a seguir.

[0052] A rede é colocada em contato com um líquido aquoso a temperatura ambiente, por exemplo, em uma vasilha. O líquido contém uma pluralidade de nanopartículas fixadas a uma porção que interage com as moléculas de sonda na rede, por exemplo, estreptavidina, se as moléculas de sonda forem biotiniladas. O tamanho das nanopartí- culas é menor do que o tamanho de malha da rede e menor do que a seção transversal mínima de pelo menos um tipo de canal de transpor- te na rede para permitir que as nanopartículas sejam distribuídas por todo o polímero. As nanopartículas apropriadas são pontos quânticos de 2 a 5 nanômetros de diâmetro.

[0053] Um período de incubação é selecionado de modo que a rede no líquido seja hidratada completamente, isto é, que a rede em média capta a mesma quantidade de água à medida que libera. O pe- ríodo de incubação pode ser, por exemplo, de uma hora. A penetração das nanopartículas na rede pode ser acelerada pelo ajuste do movi- mento da rede e/ou do líquido durante a incubação, por exemplo, com a vibração da rede e/ou do líquido, de preferência por meio de ondas ultrassônicas.

[0054] Após a conclusão da incubação, o líquido é separado da rede, por exemplo, pela drenagem do líquido da vasilha ou retirando a rede da vasilha.

[0055] Então, a rede hidratada é congelada, por exemplo, por meio de nitrogênio líquido. Depois disso, a rede congelada pode ser cortada com a ajuda de um criomicrótomo ao longo de planos de corte mutua- mente paralelos em fatias finas. Os planos de corte são arranjados transversalmente à extensão longitudinal do canal de transporte e pe- netram no canal de transporte. O corte é realizado de preferência ao usar uma lâmina de diamante resfriada por nitrogênio líquido. A es- pessura das fatias pode ser, por exemplo, de cerca de 100 nm ou 200 nm.

[0056] Com a ajuda de um microscópio, as nanopartículas dispos- tas nos discos obtidos pelo corte da rede congelada são localizadas. As nanopartículas podem ser fluorescentes e destacadas opticamente de modo que possam ser mais bem distinguidas da rede, se necessá- rio. A localização das nanopartículas pode ser feita ao usar um softwa- re apropriado com métodos de processamento de imagem. Para exa- minar os discos, de preferência é usado um microscópio confocal, um microscópio de varredura a laser com sistema óptico de fluorescência ou um microscópio eletrônico.

[0057] A geometria e/ou a informação sobre a posição das nano- partículas obtidas dessa maneira podem ser, com a ajuda de um com- putador, usadas para fazer um modelo geométrico tridimensional da distribuição das nanopartículas na rede. O modelo pode então ser usado para determinar se a distribuição das nanopartículas reflete uma densidade maior de moléculas de sonda perto dos sítios dos canais de transporte.

4.2. Arranjos

[0058] As redes tridimensionais de acordo com a descrição podem ser posicionadas (por exemplo, depositadas) em um substrato, e são de preferência imobilizadas em um substrato (por exemplo, por reticu- lações covalentes entre a rede e o substrato). Uma pluralidade de re-

des pode ser imobilizada em um substrato para formar um arranjo útil, por exemplo, como um biochip.

[0059] Os substratos apropriados incluem os polímeros orgânicos, por exemplo, os copolímeros de ciclo-olefina (COCs), o poliestireno, o polietileno, o polipropileno, o policarbonato e o metacrilato de polimeti- la (PMMA, PlexiglasO). A Ticona comercializa um exemplo de COC apropriado sob o nome comercial de TopasO. Os materiais inorgânicos (por exemplo, metal, vidro) também podem ser usados como substra- to. Tais substratos podem ser revestidos com moléculas orgânicas pa- ra permitir reticulações entre a rede e uma superfície do substrato. Por exemplo, as superfícies inorgânicas podem ser revestidas com mono- camadas automontadas (SAMs). As próprias SAMs podem ser com- pletamente não reativas e, desse modo, compreendem ou consistem, por exemplo, em alquil silanos puros. Outros substratos também po- dem ser apropriados para a reticulação da rede tridimensional, desde que possam entrar em ligações estáveis com as moléculas orgânicas durante os processos de radicais livres (por exemplo, compostos de organoboro).

[0060] O substrato pode ser rígido ou flexível. Em algumas moda- lidades, o substrato tem o formato de uma placa (por exemplo, uma placa retangular, uma placa quadrada, um disco circular, etc.). Por exemplo, o substrato pode compreender uma placa de micropoços, e as redes tridimensionais podem ser posicionadas nos poços da placa.

[0061] As redes individuais podem ser posicionadas em pontos distintos na superfície do substrato, por exemplo, em uma matriz que compreende uma pluralidade de colunas e fileiras. Na modalidade mostrada na Figura 8, as redes ficam situadas em 36 pontos arranja- dos em seis colunas e em seis fileiras. Os arranjos que têm números diferentes de fileiras e de colunas, e em que o número de cada uma delas pode ser selecionado independentemente, são contemplados

(por exemplo, 2 a 64 colunas e 2 a 64 fileiras). As colunas podem ser separadas por uma distância X e as fileiras podem ser separadas por uma distância Y (por exemplo, tal como mostrado na Figura 9) de mo- do a formar uma grade de pontos em que as redes individuais podem ficar situadas. X e Y podem ser selecionados de modo que as redes, situadas nos pontos da grade, não ficam em contato umas com as ou- tras no estado desidratado e não ficam em contato umas com as ou- tras no estado hidratado. As dimensões X e Y podem ser as mesmas ou diferentes. Em algumas modalidades, X e Y são os mesmos. Em algumas modalidades, X e Y são diferentes. Em algumas modalida- des, X e Y são selecionados independentemente das distâncias de pelo menos cerca de 500 um (por exemplo, 500 um a 5 mm, 500 um a 4 m, 500 um a 3 mm, 500 um a 2 mm ou 5 um à 1 mm). Em algumas modalidades, X e Y têm ambos cerca de 500 um. Em outras modali- dades, X e Y têm ambos 500 um.

[0062] Em algumas modalidades, o substrato tem o formato de faixa (por exemplo, tal como mostrado na Figura 10). As redes podem ser arranjadas como uma única fileira que se estende na direção longi- tudinal de uma superfície orgânica em formato de faixa, ou podem ser arranjadas como fileiras múltiplas que se estendem na direção longitu- dinal da superfície em formato de faixa. As fileiras e as colunas em tais arranjos em formato de faixas podem ter dimensões de grade X e Y, tal como descrito acima.

[0063] Cada uma das redes individuais pode cobrir uma área da superfície do arranjo que é circular ou substancialmente circular. Nor- malmente, o diâmetro da área na superfície do arranjo coberto pelas redes individuais (isto é, o diâmetro do ponto) é de 80 um a 1.000 um. Em várias modalidades, o diâmetro do ponto é de 80 um, 100 um, 120 um, 140 um, 160 um, 180 um, 200 um, 300 um, 400 um, 500 pum, 600 um, 700 um, 800 um, 900 um ou 1.000 um, ou selecionado de uma faixa limitada por qualquer uma das duas modalidades anteriores, por exemplo, 80 um a 200 um, 100 um a 120 um, 120 um a 140 um, 120 um a 180m, 140 um a 160 um, 160 um a 180 um, 180 um a 200 um, 120 um a 200 um, 100 um a 400 um, 160 um a 600 um ou 120 um a 700 um, e assim por diante. Em uma modalidade preferida, o diâmetro varia de 100 um a 200 um ou uma subfaixa dos mesmos.

[0064] Os arranjos da descrição normalmente têm pelo menos 8 redes tridimensionais individuais. Em determinados aspectos, os ar- ranjos têm pelo menos 16, pelo menos 24, pelo menos 48, pelo menos 96, pelo menos 128, pelo menos 256, pelo menos 512 ou pelo menos

1.024 redes tridimensionais individuais. Em algumas modalidades, os arranjos de acordo com a descrição têm 24, 48, 96, 128, 256, 512,

1.024, 2.048, 4.096 ou 8.192 redes individuais, ou têm um número de redes tridimensionais selecionadas de uma faixa limitada por qualquer dentre duas das modalidades anteriores, por exemplo, 8 a 128, 8 a 512, 24 a 8.192, 24 a 4.096, 48 a 2.048, 96 a 512, 128 a 1.024, HM a

1.024, 48 a 512, 96 a 1.024 ou 128 a 512 redes tridimensionais, e as- sim por diante. Em uma modalidade preferida, o número de redes tri- dimensionais em um arranjo varia de 8 a 1024. Em uma modalidade particularmente preferida, o número de redes tridimensionais em um arranjo varia de 25 a 400.

[0065] As redes individuais que compreendem os arranjos de acordo com a descrição podem ter sondas idênticas ou diferentes (por exemplo, cada rede pode ter um conjunto único de sondas, múltiplas redes podem ter o mesmo conjunto de sondas e outras redes podem ter um conjunto ou conjuntos diferentes de sondas, ou todas as redes podem ter o mesmo conjunto de sondas). Por exemplo, as redes ar- ranjadas na mesma fileira de uma matriz podem compreender as mesmas sondas e as redes arranjadas em fileiras diferentes da matriz podem ter sondas diferentes.

[0066] Normalmente, as redes individuais em um arranjo variam não mais do que 20%, não mais do que 15%, não mais do que 10% ou não mais do que 5% umas das outras por diâmetro do ponto e/ou por volume da rede.

[0067] Em algumas modalidades, os arranjos compreendem uma ou mais redes individuais (por exemplo, pontos em um arranjo) com um ou mais oligonucleotídeos de controle ou moléculas de sonda. Os oligonucleotídeos de controle podem ser etiquetados, por exemplo, etiquetados de maneira fluorescente, para uso como um controle es- pacial (para orientar espacialmente o arranjo) e/ou para quantificar a quantidade de moléculas de sonda ligadas às redes, por exemplo, quando da lavagem e da reutilização de um arranjo de acordo com a descrição (isto é, como um "controle da capacidade de reutilização"). As sondas espaciais e de controle da capacidade de reutilização po- dem ser as mesmas sondas ou sondas diferentes.

[0068] O mesmo ponto no arranjo ou um ponto diferente no arranjo podem ainda incluir uma sonda não etiquetada que é complementar a um alvo conhecido. Quando usada em um ensaio de hibridização, a determinação da intensidade de sinal da hibridização da sonda não etiquetada em relação ao alvo etiquetado pode determinar a eficiência da reação de hibridização. Quando uma rede individual (isto é, um ponto em um arranjo) é usada como um controle da capacidade de reutilização e/ou como um controle espacial e um controle de hibridi- zação, uma porção fluorescente diferente pode ser usada para etique- tar a molécula alvo que não a porção fluorescente das sondas de con- trole da capacidade de reutilização ou de controle espacial.

[0069] Em algumas modalidades, os arranjos de acordo com a descrição podem ser reutilizados pelo menos 5 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 20 vezes, pelo menos 30 vezes, pelo menos 40 vezes ou pelo menos 50 vezes (por exemplo, 5 a 20 vezes, 5 a 30 ve-

zes, 10 a 50 vezes, 10 a 20 vezes, 10 a 30 vezes, 20 a 40 vezes ou 40 a 50 vezes, compreendendo de preferência a reutilização do arranjo por 10 a 50 vezes). O arranjo pode ser lavado com uma solução de sal sob condições de desnaturação (por exemplo, baixa concentração de sal e alta temperatura). Por exemplo, o arranjo pode ser lavado com 1 a 10 mM de um tampão de fosfato a 80 a 90ºC entre os usos. A tem- peratura da lavagem pode ser selecionada com base no comprimento (Tm) do híbrido alvo:sonda.

[0070] A integridade de um arranjo pode ser determinada por uma sonda de "controle da capacidade de reutilização". A sonda de controle da capacidade de reutilização pode ser etiquetada de maneira fluores- cente ou pode ser detectada pela hibridização em relação a um ácido nucleico complementar etiquetado de maneira fluorescente. A etiqueta fluorescente de uma sonda de controle da capacidade de reutilização etiquetada de maneira fluorescente pode ser branqueada por excita- ção repetida, antes que a integridade do ácido nucleico esteja com- prometida; nesses casos qualquer reutilização adicional pode incluir a detecção da hibridização em relação a um ácido nucleico complemen- tar etiquetado de maneira fluorescente como um controle. Normalmen- te, um arranjo da invenção é estável por pelo menos 6 meses.

[0071] Em várias modalidades, uma sonda de controle da capaci- dade de reutilização etiquetada de maneira fluorescente retém pelo menos 99%, 95%, 90%, 80%, 70%, 60% ou 50% de sua intensidade de sinal de fluorescência inicial após 5, 10, 20, 30, 40 ou 50 usos. De preferência, a sonda de controle da capacidade de reutilização retém menos de 75% de sua intensidade de sinal de fluorescência depois de ou 10 usos. Um arranjo pode continuar a ser reutilizado até que a sonda de controle da capacidade de reutilização retenha pelo menos 50% de sua intensidade de sinal de fluorescência, por exemplo, após 20, 30, 40 ou 50 reutilizações. A intensidade do sinal fluorescente da sonda de controle pode ser testada em cada reutilização, a cada outra reutilização, a cada terceira reutilização, a cada quarta reutilização, a cada quinta reutilização, a cada sexta reutilização, a cada sétima reuti- lização, a cada oitava reutilização, a cada nona reutilização, a cada décima reutilização ou uma combinação das mesmas. Por exemplo, a intensidade de sinal pode ser testada periodicamente entre 5 ou 10 reutilizações inicialmente, e a frequência do teste ser aumentada com o número de reutilizações de maneira que ela seja testada depois de cada reutilização após um certo número de utilizações (por exemplo, 5, 10, 20, 30, 40 ou 50). Em algumas modalidades, a frequência de testes média é de uma vez por 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, 5 ou 10 utilizações, ou as médias dentro de uma faixa limitada entre qualquer dentre dois valores anteriores, por exemplo, uma vez por 1 a 2 utilizações, uma vez por 1 a 1,5 utilização, uma vez por 1 a 3 utilizações ou uma vez por 1,5 a 3 utilizações.

[0072] Deve ser observado que a nomenclatura "de controle espa- cial", "de controle da capacidade de reutilização" e "de controle de hi- bridização" é incluída para fins de conveniência e de referência e não se destina a significar uma exigência de que as sondas indicadas co- mo de "controle espacial", "controle da capacidade de reutilização" e "controle de hibridização" sejam usadas como tal.

4.3. Processos Para a Produção das Redes de Polímeros Tridimensi- onais

[0073] Em um aspecto, os processos de acordo com a descrição para produção das redes de polímeros tridimensionais compreendem (a) a exposição de uma mistura que compreende uma solução de sal aquosa, um polímero, um reticulador e, opcionalmente, uma ou mais sondas a condições de formação de cristais de sal, (b) a exposição da mistura a condições de reticulação para reticular o polímero a fim de formar uma rede de polímeros reticulada, e (c) colocar em contato a rede de polímeros reticulada com um solvente para dissolver os cris- tais de sal e formar um ou mais canais de transporte.

[0074] Os processos também podem compreender uma etapa de formação da mistura pela combinação de uma solução de sal aquosa, um polímero, um reticulador e, opcionalmente, uma ou mais sondas, e/ou também compreendem uma etapa de aplicação da mistura a um substrato (por exemplo, o substrato descrito na seção 4.2) antes da exposição da mistura às condições de formação de cristais de sal. Se o polímero que está sendo usado tiver um reticulador pré-fixado (por exemplo, ao usar um copolímero polimerizado de um monômero que compreende um reticulador), a etapa de formação da mistura pode compreender a combinação de uma solução de sal aquosa com o po- límero e, opcionalmente, uma ou mais sondas.

[0075] A mistura pode ser aplicada a um substrato antes da expo- sição da mistura às condições de formação de cristais de sal, por exemplo, pulverizando a mistura em uma superfície do substrato (por exemplo, em 1.024 sítios na superfície). A mistura pode ser aplicada à superfície ao usar um spotter do chip de DNA ou uma impressora de jato de tinta, por exemplo. Em uma modalidade preferida, a mistura é pulverizada ao usar uma impressora de jato de tinta. Isto permite uma aplicação simples e rápida da mistura a um grande número de pontos no substrato. Os pontos podem ser arranjados, por exemplo, na forma de uma matriz com várias fileiras e/ou colunas. De preferência, o teor de sal na mistura durante a impressão está abaixo do limite de solubi- lidade, de modo que a mistura não se cristaliza na cabeça de impres- são da impressora. O volume da mistura aplicado em pontos individu- ais pode ser, por exemplo, de 100 pl, 200 pl, 300 pl, 400 pl, 500 pl, 750 pl, 1 nl, 2 nl, 3 nl, 4 nl ou 5 nl, ou pode ser selecionado de uma faixa limitada a qualquer dentre dois dos valores anteriores (por exemplo, 100 pl a 5 nl, 100 pl a 1 nl, 300 pl a 1 nl, 200 pl a 750 nl, 100 pl a 500 pl, 200 pl a 2 nl, 500 pl a 2 nl, 1 nl a 2 nl e assim por diante). Nas mo- dalidades preferidas, o volume do ponto é de 200 pl a 4 nl.

[0076] O diâmetro dos pontos individuais dependerá da composi- ção da mistura, do volume da mistura aplicada e da química da super- fície do substrato. Os diâmetros dos pontos normalmente variam entre 80 um a 1.000 um e podem ser obtidos pela variação dos parâmetros anteriores. Nas várias modalidades, os diâmetros dos pontos são de 80 um, 100 um, 120 um, 140 um, 160 um, 180 um, 200 um, 300 um, 400 um, 500 um, 600 um, 700 um, 800 um, 900 um ou 1.000 um, ou selecionados de uma faixa limitada por qualquer dentre duas das mo- dalidades anteriores, por exemplo, 80 um a 200 um, 100 um a 120 um, 120 um a 140 um, 120 um a 180 um, 140 um a 160 um, 160 um a 180 um, 180 um a 200 um, 120 um a 200 um, 100 um a 400 um, 160 um a 600 um ou 120 um a 700 um, e assim por diante. Em uma modalidade preferida, o diâmetro varia de 100 um a 200 um ou uma subfaixa dos mesmos.

[0077] Os polímeros, reticuladores e sondas apropriados que po- dem ser usados nos processos da presente descrição são descritos nas seções 4.1.1, 4.1.2 e 4.1.4, respectivamente. Em algumas modali- dades, o polímero usado nos processos tem pelo menos um grupo de reticulador por molécula de polímero. Em uma modalidade preferida, o polímero tem pelo menos dois grupos de reticulador por molécula. Em uma modalidade particularmente preferida, o polímero tem pelo menos dois grupos de reticulador fotorreativos por molécula. Nestas modali- dades, as moléculas de polímero e de reticulador separadas não são necessárias.

[0078] Os sais apropriados que podem ser incluídos na mistura são descritos na seção 4.3.1. O cristal de sal apropriado que forma as condições é descrito na seção 4.3.2. As condições de reticulação apropriadas são descritas na seção 4.3.3. Os solventes apropriados para dissolver os cristais de sal são descritos na seção 4.3.4.

4.3.1. Sal

[0079] As redes de polímeros de acordo com a descrição são ca- racterizadas por canais de transporte que ocorrem quando os políme- ros são reticulados em uma mistura que contém os cristais de sal for- mados de uma solução aquosa contendo pelo menos dois tipos de sais.

[0080] De preferência, os sais são selecionados por sua compati- bilidade com uma ou mais sondas. De maneira ideal, cada sal tem uma ou mais das seguintes características, (i) o sal não é tóxico às sondas (por exemplo, o sal não desnatura as sondas), (ii) o sal não reage quimicamente com as sondas, (iii) o sal não ataca os fluorófo- ros, tais como as tinturas de cianina, que são apropriadas para a mar- cação óptica das sondas, e/ou (iv) o sal não reage com os analitos, as moléculas de detecção e/ou os parceiros de ligação ligados ao mes- mo. De preferência, pelo menos um dos sais forma os cristais em for- mato de agulha.

[0081] Em uma modalidade preferida, a solução de sal aquosa compreende pelo menos dois tipos de cátions monovalentes, por exemplo, dois tipos de cátions de metal alcalino. Os cátions de metal alcalino que podem ser usados incluem os cátions de sódio e os cá- tions de potássio, embora outros cátions de metal alcalino, tais como os cátions de lítio, também possam ser usados.

[0082] Para uma razão ideal entre sinal: ruído para a detecção de analitos de ácido nucleico, a solução de sal aquosa compreende de preferência os cátions de sódio e de potássio e/ou tem uma concen- tração de cátion monovalente total de maneira que, quando combinada com a solução de polímero e a solução de sonda opcional (antes da reticulação), a mistura resultante tem uma concentração de cátion mo-

novalente total de pelo menos 500 mM. Em certas modalidades, a concentração de íon de sódio na mistura é de pelo menos 250 mM, e pode variar de 250 mM a 500 mM, e com mais preferência está na fai- xa de 300 mM a 400 mM. Em uma modalidade específica, a concen- tração de íon de sódio na mistura é de 350 mM. A concentração de íon de potássio na mistura é de preferência de pelo menos 150 mM, e de preferência está na faixa de 150 mM a 500 mM, com mais preferência na faixa de 200 mM a 400 mM, e ainda com mais preferência na faixa de 250 mM a 350 mM.

[0083] A solução de sal aquosa pode ser feita ao usar um hidroge- nofosfato de dissódio (Na2HPO4) e/ou um di-hidrogenofosfato de sódio (NaH2PO,4) que, na solução aquosa, liberam os cátions de Na+ e os íons de fosfato PO4*. A solução de sal aquosa também pode ser feita ao usar o fosfato de hidrogenofosfato de dipotássio (K2HPO4) e/ou o di-hidrogenofosfato de potássio (KH2PO,).

[0084] De preferência, a solução de sal aquosa pode ser um tam- pão de fosfato de sódio que contém o hidrogenofosfato de dissódio e o di-hidrogenofosfato de sódio, suplementados com o hidrogenofosfato de dipotássio (KHPO) e/ou o di-hidrogenofosfato de potássio (KH2PO4). Em uma modalidade, um tampão de fosfato de sódio que contém o hidrogenofosfato de dissódio e o di-hidrogenofosfato de só- dioe um tampão de fosfato de potássio que contém o hidrogenofosfato de dipotássio e o di-hidrogenofosfato de potássio são feitos separa- damente e combinados em uma única solução aquosa, antes ou de- pois da mistura com as soluções de polímero e/ou da sonda.

[0085] Geralmente, a solução de sal aquosa tem de preferência um pH que varia de 6 a 9, e com mais preferência na faixa de 7 a 8,5. Em certas modalidades exemplificadoras, o pH é de 7,5, 8 ou 8,5, com mais preferência de 8.

[0086] Para as redes que contêm biomoléculas de sonda à base de proteína, a solução de sal aquosa pode incluir uma solução salina tamponada com fosfato ("PBS") e/ou um sulfato de cátion monovalen- te.

4.3.2. Condições Para a Formação de Cristais de Sal

[0087] As condições para a formação de cristais de sal podem compreender a desidratação da mistura ou o resfriamento da mistura até que o teor de sal relativo na mistura aumente acima do limite de solubilidade, significando que a mistura está supersaturada com o sal. Isto promove a formação de cristais de sal de um germe de cristaliza- ção situado no volume da mistura na direção da superfície da mistura. Acredita-se, sem ficar limitado pela teoria, que o uso de soluções aquosas que contêm pelo menos dois íons de metal monovalentes di- ferentes resulta na formação de pelo menos dois tipos diferentes de cristais de sal.

[0088] A mistura pode ser desidratada pelo aquecimento da mistu- ra, pela exposição da mistura a um vácuo e/ou pela redução da umi- dade da atmosfera que circunda a mistura.

[0089] A mistura pode ser aquecida ao colocar a mistura em um substrato ou superfície aquecidos (por exemplo, entre cerca de 50ºC e cerca de 70ºC), ao aquecer o substrato ou da superfície em que a mis- tura foi colocada (por exemplo, entre cerca de 50ºC a cerca de 70ºC) e/ou ao colocar a mistura em contato com um gás quente (por exem- plo, ar, nitrogênio ou dióxido de carbono com uma temperatura que seja mais alta do que a temperatura da mistura), de tal maneira que a água é evaporada da mistura. O contato com o gás quente pode ocor- rer, por exemplo, ao se colocar a mistura em um forno de aquecimen- to. Durante o transporte para o forno de aquecimento, a mistura pode ser mantida a uma umidade de 40% ou mais, por exemplo, em uma umidade relativa de cerca de 60%, embora umidades relativas mais altas, mesmo tão altas quanto 75% ou mais, também sejam praticá- veis. As misturas com concentrações de íon de potássio mais altas podem tolerar umidades relativas mais baixas, e as misturas com con- centração de sal de potássio mais baixa de preferência são mantidas a umidades relativas mais altas durante o transporte.

[0090] Ao aquecer a mistura, também é possível ativar os reticula- dores ativáveis termicamente, se presentes, e desse modo reticular o polímero.

[0091] Em algumas modalidades, a temperatura do substrato aquecido e/ou do ar usado para desidratar a mistura é de 20ºC ou mais acima da temperatura da mistura antes do aquecimento da mistu- ra, mas de menos de 100ºC.

[0092] A mistura pode ser resfriada pela colocação da mistura em um substrato ou superfície resfriados (por exemplo, entre cerca de 5ºC a cerca de 15ºC), pelo resfriamento do substrato ou da superfície em que a mistura foi colocada (por exemplo, entre cerca de 5ºC a cerca de 15ºC) e/ou colocando a mesma em contato com um gás frio (por exemplo, ar, nitrogênio ou dióxido de carbono com uma temperatura que seja mais baixa do que a temperatura da mistura). Quando resfri- ado, o limite de solubilidade dependente da temperatura do sal na mis- tura diminui até que a mistura finalmente fique supersaturada com o sal. Em algumas modalidades, a mistura é resfriada pela incubação da mesma em uma câmara fria com baixa umidade (por exemplo, tempe- raturas entre 0ºC e 10ºC, umidade relativa < 40%).

[0093] A temperatura na mistura de preferência é mantida acima do ponto de condensação do ar do ambiente que circunda a mistura durante a formação de um ou mais cristais de sal. Isto impede que a mistura se torne diluída com a água condensada do ar do ambiente, o que poderia levar a uma diminuição no teor de sal relativo na mistura.

4.3.3. Condições de Reticulação

[0094] As condições de reticulação podem ser selecionadas com base no tipo de reticulador usado. Por exemplo, ao usar um reticulador ativado pela luz ultravioleta (por exemplo, benzofenona, tioxantona ou éter benzoína), as condições de reticulação podem compreender a ex- posição da mistura à luz ultravioleta (UV). Em algumas modalidades, a luz UV que tem um comprimento de onda de cerca de 250 nm a cerca de 360 nm é usada (por exemplo, 260 + 20 nm ou 355 + 20 nm). O uso da luz UV de baixa energia/comprimento de onda mais longo (por exemplo, luz UV de 360 nm versus luz UV de 254 nm) pode requerer tempos de exposição mais longos. Ao usar um reticulador ativado pela luz visível (por exemplo, etil eosina, eosina Y, rosa bengala, canforqui- nona ou eritirosina), as condições de reticulação podem compreender a exposição da mistura à luz visível. Ao usar um reticulador ativável termicamente (por exemplo, o ácido 4,4' azobis(4-cianopentanoico), e dicloridrato de 2,2-azobis[2-(2-imidazolin-2-il)propano] ou o peróxido de benzoíla), as condições de reticulação podem compreender a ex- posição da mistura ao calor.

[0095] O comprimento e a intensidade das condições de reticula- ção podem ser selecionados para efetuar a reticulação das moléculas do polímero a outras moléculas do polímero, a reticulação das molécu- las do polímero às moléculas de sonda (se presentes) e a reticulação das moléculas do polímero às moléculas do substrato ou às moléculas orgânicas presentes no substrato (se presentes). O comprimento e a intensidade das condições de reticulação para uma mistura que con- tém sondas podem ser determinados experimentalmente para equili- brar a robustez da imobilização e a atividade das moléculas de sonda, por exemplo.

4.3.4. Dissolução dos Cristais de Sal

[0096] Após a reticulação do polímero, os cristais de sal podem ser dissolvidos no solvente de tal maneira que pelo menos um canal de transporte seja formado na rede. Acredita-se, sem ficar limitado pe- la teoria, que o uso de dois tipos de cátions de sal monovalentes du- rante a formação do cristal resulta em pelo menos dois tipos de cris- tais, cristais compactos e cristais em formato de agulha. É considerado que a dissolução dos cristais compactos resulta em canais curtos que criam um efeito semelhante ao de esponja na rede, perfurados pelos canais longos que resultam da dissolução dos cristais em formato de agulha.

[0097] Com o uso de um arranjo produzido pelo método de acordo com a descrição como um sensor biológico, uma grande precisão de medição e uma alta dinâmica de medição são permitidas.

[0098] O solvente para dissolução de um ou mais cristais de sal pode ser escolhido de tal maneira que seja compatível com o polímero e as sondas, se presentes (por exemplo, o solvente pode ser escolhido de tal maneira que não dissolva o polímero e as sondas). De preferên- cia, o solvente usado é um tampão à base de água, tal como o tampão de fosfato diluído. O metanol, o etanol, o propanol ou uma mistura desses líquidos podem ser adicionados ao tampão para facilitar a re- moção do polímero não ligado da rede.

[0099] Depois da remoção dos cristais de sal, a rede pode entrar em colapso devido à secagem e pode ser reidratada. A secagem da rede tem vantagens para o transporte e a estabilização das biomolécu- las de sonda.

4.3.5. Métodos de Uso das Redes Tridimensionais

[0100] As redes e os arranjos da descrição podem ser usados pa- ra determinar a presença ou a ausência de um analito em uma amos- tra, de preferência uma amostra líquida. Desse modo, a descrição apresenta métodos para determinar se um analito está presente em uma amostra ou em uma pluralidade das amostras, os quais compre- endem colocar em contato uma rede ou um arranjo de acordo com a descrição, que compreendem as moléculas de sonda que podem ligar o analito com a amostra ou a pluralidade de amostras, e detectar a li- gação do analito às moléculas de sonda, determinando desse modo se o analito está presente na amostra ou na pluralidade das amostras. Quando os arranjos que compreendem diferentes espécies de sonda capazes de ligar diferentes espécies de analito são usados nos méto- dos, a presença de diferentes espécies de analitos pode ser determi- nada pela detecção da ligação das diferentes espécies de analitos às sondas. Em algumas modalidades, os métodos também compreendem uma etapa de quantificar a quantidade de analito ou de analitos liga- dos ao arranjo.

[0101] O analito pode ser, por exemplo, um ácido nucleico, tal co- mo um amplicon de reação em cadeia de polimerase (PCR). Em al- gumas modalidades, o amplicon de PCR é amplificado de uma amos- tra biológica ou do ambiente (por exemplo, sangue, soro, plasma, teci- do, células, saliva, escarro, urina, fluido cerebrospinal, fluido pleural, leite, lágrimas, fezes, suor, sêmen, célula inteiras, constituintes de cé- lulas, esfregaço de células ou um extrato ou derivado dos mesmos). Em algumas modalidades, o ácido nucleico é etiquetado (por exemplo, etiquetado de maneira fluorescente).

[0102] Um analito colocado na superfície da rede pode penetrar no interior da rede através do canal de transporte a fim de se ligar especi- ficamente a uma sonda (por exemplo, uma biomolécula) ligada de mo- do covalente ao polímero. Ao usar os arranjos de acordo com a des- crição com as redes imobilizadas no mesmo como sensor biológico, uma grande precisão de medição e uma alta dinâmica de medição são permitidas.

[0103] As redes e os arranjos da descrição podem ser regenera- dos depois do uso como um biossensor e podem ser usados várias vezes (por exemplo, 5 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 20 vezes, pelo menos 30 vezes, pelo menos 40 vezes ou pelo menos 50 vezes). Se as moléculas de sonda forem um DNA, estas podem ser obtidas, por exemplo, aquecendo a(s) rede(s) em uma solução salina tamponada com fosfato 1x a uma temperatura entre 80ºC e 90ºC por cerca de 10 minutos. Então, a solução salina tamponada com fosfato pode ser trocada por uma nova solução salina tamponada com fosfato para lavar o DNA desnaturado para fora da(s) rede(s). Se as molécu- las de sonda da(s) rede(s) ou do arranjo forem antígenos, a(s) rede(s) ou o arranjo podem ser regenerados ao colocar em contato a(s) re- de(s) com 0,1 N de NaOH por cerca de 10 minutos. Em seguida, 0,1 N de NaOH pode ser trocado por uma solução salina tamponada com fosfato para lavar os antígenos para fora da rede. Desse modo, algu- mas modalidades dos métodos de usar as redes e os arranjos da des- crição compreendem o uso de uma rede ou arranjo que foram lavados antes do contato com uma amostra ou uma pluralidade de amostras.

4.4. Aplicações dos Arranjos da Invenção

[0104] Devido ao fato de que os arranjos da invenção permitem uma determinação econômica da presença qualitativa e quantitativa de ácidos nucleicos em uma amostra, eles têm aplicação imediata nos problemas que se referem à saúde e à doença em animais humanos e não humanos.

[0105] Nessas aplicações, um preparado que contém uma molécu- la alvo é derivado ou extraído de fontes biológicas ou do ambiente de acordo com os protocolos conhecidos no estado da técnica. As molé- culas alvo podem ser derivadas ou extraídas de célula e de tecidos de todas as classes taxonômicas, incluindo vírus, bactérias e eucariontes, procariontes, protistas, plantas, fungos e animais de todos os filo e classes. Os animais podem ser vertebrados, mamíferos, primatas e especialmente seres humanos. O sangue, soro, plasma, tecido, célu- las, saliva, escarro, urina, fluido cerebrospinal, fluido pleural, leite, lá-

grimas, fezes, suor, sêmen, célula inteiras, constituintes de células e esfregaço de células são fontes apropriadas de moléculas alvo.

[0106] As moléculas alvo são de preferência os ácidos nucleicos amplificados (por exemplo, por PCR) de qualquer uma das fontes an- teriores).

[0107] Os arranjos da invenção podem incluir sondas que são úteis para detectar os patógenos de animais humanos ou não huma- nos. Tais sondas incluem oligonucleotídeos complementares pelo me- nos em parte aos alvos bacterianos, virais ou fúngicos, ou quaisquer combinações de alvos bacterianos, virais e fúngicos.

[0108] Os arranjos da invenção podem incluir sondas úteis para detectar a expressão gênica em células de animais humanos ou não humanos, por exemplo, a expressão gênica associada a uma doença ou desordem, tal como o câncer, uma doença cardiovascular ou uma doença metabólica com a finalidade de diagnosticar um indivíduo, mo- nitorar o tratamento do indivíduo ou fazer o prognóstico dos resultados do indivíduo. A informação sobre a expressão gênica pode então acompanhar a progressão ou a regressão da doença, e tal informação pode ajudar no monitoramento do sucesso ou na mudança de curso de uma terapia inicial.

5. Protocolos Exemplificadores

[0109] Os protocolos exemplificadores a seguir, que se referem aos números de referência apresentados nas figuras, estão dentro do âmbito da descrição e podem ser usados juntamente com os políme- ros, os reticuladores e as sondas das seções 4.1.1, 4.1.2 e 4.1.4, res- pectivamente. Outros polímeros úteis (incluindo os copolímeros) e os grupos de reticulador para uso com os métodos a seguir são descritos em Rendl et a/., 2011, Langmuir 27:6116-6123 e no documento de patente nº US 2008/0293592, cujos teores são aqui incorporados a título de referência. Em uma modalidade, é usada uma mistura de po- límeros de acordo com a seção 6.2.

5.1. Protocolo Exemplificador 1

[0110] Uma placa com uma superfície 2 que é de preferência or- gânica é colocada em um suporte 6 que é aquecido. As temperaturas entre 50ºC e 70ºC são apropriadas. Uma mistura 5 que contém um polímero 3, biomoléculas de sonda 1 e uma solução de sal aquosa é salpicada na superfície orgânica 2 ao usar um spotter de chip de DNA padrão (por exemplo, Scienion, Germany). Os volumes de 0,5 a 4 nl são impressos em cada ponto 7 (vide a Figura 2). O líquido desses pontos seca quase imediatamente, levando a uma nucleação dos cris- tais de sal 8, 14. Após a nucleação, os cristais de sal em formato de agulha podem se estender de pelo menos um germe de cristalização 9 situado no volume da mistura 5 na direção da superfície 10 da mistura (vide a Figura 3). Além disso, acredita-se que a formação de cristais cúbicos mais curtos ou em formato de haste 14 vai ocorrer (vide a Fi- gura 3). Após a nucleação dos cristais 8, 14, os pontos 7 são imedia- tamente irradiados em um reticulador UV com radiação UV óptica 11 (vide a Figura 4) de tal maneira que as biomoléculas de sonda 1 são ligadas de modo covalente ao polímero 3, e o polímero 3 é ligado de modo covalente à superfície orgânica 2 e reticulado (vide a Figura 5). Deve ser tomado cuidado para que a mistura seca, reticulada 5, não atraia umidade para se tornar líquida outra vez.

[0111] A mistura seca, reticulada 5, é então colocada em contato com um solvente 12 para os cristais 8, de tal maneira que nos lugares em que os cristais 8, 14 estavam, são formados canais longos 13 e curtos 19 na rede 15 que compreende o polímero 3 e as biomoléculas de sonda 1 (vide a Figura 6). Depois disso, o solvente 12 é removido. Os canais longos 13 podem se estender da superfície 16 da rede 15 para o interior da rede 15. O solvente 12 em que os cristais de sal 8,

14 são dissolvidos é escolhido de tal maneira que seja compatível com a biomolécula de sonda 1 e também com o polímero 3. De preferência, o solvente 12 usado é à base de água.

5.2. Protocolo Exemplificador 2

[0112] Uma mistura 5 que contém um polímero 3, biomoléculas de sonda 1 e uma solução de sal aquosa é salpicada em uma superfície orgânica 2 arranjada em uma placa ao usar um spotter de chip de DNA padrão (por exemplo, Scienion, Germany). Os volumes de 0,5 a 4 nl são impressos em cada ponto 7 (vide a Figura 2). A placa com os pontos 7 na superfície 2, de preferência orgânica, é colocada em um suporte 6 que é resfriado (vide a Figura 3). As temperaturas entre 5ºC e 15ºC são apropriadas. O líquido desses pontos é resfriado para al- cançar uma supersaturação do tampão que quase imediatamente cau- sa uma nucleação dos cristais. Após a nucleação os cristais de sal em formato de agulha 8 podem se estender de pelo menos de um germe de cristalização 9 situado no volume da mistura 5 para a superfície 10 da mistura 5. Além disso, a formação de cristais cúbicos mais curtos ou em formato de haste 14 deve ocorrer (vide a Figura 3). Após a im- pressão, esses alvos são colocados em um forno (por exemplo, a 70ºC) para a secagem completa. Após a nucleação dos cristais, os pontos são imediatamente irradiados em um reticulador de UV com uma radiação de UV óptica 11 (vide a Figura 4) de tal maneira que as biomoléculas de sonda 1 sejam ligadas de modo covalente ao políme- ro 3, e o polímero 3 é ligado de modo covalente à superfície orgânica 2 e reticulado. Deve ser tomado cuidado para que a mistura seca, reticu- lada, não atraia umidade para se tornar líquida outra vez.

[0113] A mistura seca, reticulada 5, então é colocada em contato com um solvente 12 para dissolver os cristais 8, 14 de tal maneira que nos lugares em que os cristais 8, 14 estavam, canais de transporte, por exemplo, canais longos 13 e canais curtos 19, são formados na rede 15 que compreende o polímero 3 e as biomoléculas de sonda 1. Depois disso, o solvente 12 é removido. Os canais longos 13 podem se estender da superfície 16 da rede 15 para o interior da rede 15. O solvente 12 em que os cristais de sal 8, 14 são dissolvidos é escolhido de tal maneira que seja compatível com a biomolécula de sonda 1 e o polímero 3. De preferência, o solvente 12 usado é à base de água.

[0114] Tal como pode ser visto na Figura 6, uma pluralidade de canais longos 13 e canais curtos 19 pode ser formada na rede 15. Os canais longos 13 podem se estender da superfície 16 da rede 15 para pelo menos um ponto situado dentro da rede 15. Os canais longos 13 podem ser arranjados de tal maneira que, partindo da superfície 16 na direção do interior, a distância lateral entre os canais longos 13 dimi- nui.

5.3. Protocolo Exemplificador 3

[0115] Uma mistura 5 que contém um polímero 3, biomoléculas de sonda 1 e uma solução de sal aquosa é impressa na superfície 2, de preferência orgânica, de uma placa em condições normais com uma umidade que varia de 40 a 80%, de preferência de 50 a 70%. A mistu- ra pode conter 350 mM de fosfato de sódio, pH 8 e 250 a 300 mM de fosfato de potássio, pH 8, por exemplo. Os volumes de 0,5 a 4 nl são impressos em cada ponto 7. O teor de umidade no compartimento da impressão deve garantir que os pontos 7 permanecerão líquidos sem a formação de cristal (isto é, não ocorre nucleação). A placa então é co- locada em um recipiente, uma caixa de papelão, por exemplo. As tam- pas são colocadas sobre a placa para o transporte. A placa com os pontos 7 é colocada então em um forno de secagem ou sobre uma placa quente para rapidamente causar a nucleação, de tal maneira que os cristais de sal em formato de agulha 8 se estendem de pelo menos um germe de cristalização 9 situado no volume da mistura para a superfície 10 da mistura 5. Além disso, a formação de cristais cúbi- cos mais curtos ou em formato de haste 14 deve ocorrer.

[0116] A temperatura do forno/placa quente deve ser de 20ºC ou mais acima da temperatura de impressão. As temperaturas acima de 100ºC não são necessárias.

[0117] Após a secagem, a mistura é irradiada para reticular o po- límero 3, as biomoléculas de sonda 1 e a superfície 2.

[0118] A mistura seca, reticulada 5, é então colocada em contato com um solvente 12 de tal maneira que nos lugares em que os cristais 8, 14 estavam, canais longos 13 e canais curtos 19 são formados na rede 15 que compreende o polímero 3 e as biomoléculas de sonda 1. Depois disso, o solvente 12 é removido. Os canais longos 13 podem se estender da superfície 16 da rede 15 para o interior da rede 15. O solvente 12 em que os cristais de sal 8, 14 são dissolvidos é escolhido de tal maneira que seja compatível com as biomoléculas de sonda 1 e o polímero 3. De preferência, o solvente 12 usado é à base de água.

5.4. Protocolo Exemplificador 4

[0119] Alternativamente, uma placa com pontos 7 na superfície 2, que é de preferência orgânica, preparada tal como no protocolo exem- plificador 3, pode ser resfriada para obtenção da nucleação, sendo co- locada em uma câmara fria com umidade baixa (por exemplo, tempe- raturas <10ºC, umidade relativa <40%). A secagem pode ser executa- da com a redução da umidade ou aplicação de vácuo depois que a nucleação começou. Após a nucleação, os cristais de sal em formato de agulha 8 podem se estender de pelo menos um germe de cristali- zação 9 situado no volume da mistura 5 para a direção da superfície da mistura 5. Além disso, a formação de cristais cúbicos mais cur- tos ou em formato de haste 14 deve ocorrer. A placa com os pontos 7 é colocada em um forno a 60º a 70ºC por 1 hora para secar inteira- mente os pontos. Os pontos 7 são irradiados com UV com 1,00 J Q

254 nm em um reticulador de UV, isto é, Stratalinker 2400. Para fazer isso, a placa com os pontos 7 pode ser colocada no centro da câmara com o lado mais curto paralelo à porta da câmara. Então, a cobertura é removida e o reticulador é iniciado. Quando a máquina termina, o arranjo é removido e a cobertura é substituída.

[0120] Alternativamente, outros reticuladores de UV com o mesmo comprimento de onda (240 a 270 nm, por exemplo) ou comprimentos de ondas mais longos, por exemplo, 360 nm, podem ser usados.

[0121] A mistura 5 é então colocada em contato com um solvente 12 para dissolver os cristais 8, 14, de tal maneira que nos lugares em que os cristais 8, 14 estavam, canais longos 13 e canais curtos 19 são formados na rede 15 que compreende o polímero 3 e as biomoléculas de sonda 1. Depois disso, o solvente 12 é removido. Os canais longos 13 podem se estender da superfície 16 da rede 15 para o interior da rede 15. O solvente 12 em que os cristais de sal 8, 14 são dissolvidos é escolhido de tal maneira que seja compatível com as biomoléculas de sonda 1 e o polímero 3. De preferência, o solvente 12 usado é à base de água.

6. EXEMPLOS

6.1. Sinal de Fundo

[0121] As redes de polímeros feitas substancialmente tal como aqui descrito, mas contendo um tampão de fosfato de sódio ("NaPi") a uma concentração de 350 mM sem um segundo sal podem secar e ser submetidas à fase de separação se a umidade não for mantida a 60% ou mais alta durante a secagem em uma placa de aquecimento. Isso porque em níveis mais baixos de umidade a cristalização pode ocorrer de uma maneira descontrolada.

[0123] Seria desejável aumentar a concentração de fosfato de só- dio para evitar a cristalização descontrolada. No entanto, a concentra- ção de NaPi não pode ser aumentada significativamente porque então os cristais de NaPi poderiam se precipitar na impressora e bloquear o bocal de impressão.

[0124] Vários sais (cloreto de sódio, sódio foram usados em com- binação com as experiências de teste de NaPi. Mas nenhum deles apresentou sinais melhores do que o NaPi sozinho. Geralmente, os sinais de hibridização desses pontos foram inferiores (dados não mos- trados).

[0125] Outras tentativas de minimizar a secagem a níveis de umi- dade normais que implicaram o teste da solução salina tamponada com fosfato, do tampão de citrato de sódio ou do tampão de fosfato de potássio no lugar de NaPi levaram a sinais de hibridização mais baixos nas redes de polímeros.

[0126] Porém, quando o tampão de NaPi foi reforçado pelo tam- pão de fosfato de potássio (tal como descrito na seção 6.2), uma esta- bilização do ponto líquido foi observada sem perda do sinal, particu- larmente quando a concentração de fosfato de potássio era maior do que 150 mM.

[0127] Quando essas experiências foram realizadas, houve uma observação surpreendente. Em níveis mais altos de fosfato de potás- sio (150 mM e mais), o sinal de fundo ("ruído") foi reduzido e, a con- centrações de 200 mM, o ruído ficou quase totalmente ausente da re- ação de hibridização (tal como descrito na seção 6.3). A razão para esse efeito, muito provavelmente, é que os canais curtos resultam em uma matriz de polímero semelhante a uma esponja que é perfurada pelos canais longos de fosfato de sódio. A combinação dessas duas estruturas então melhora não somente aquela com cinética (hibridiza- ção), mas também aquela sem-cinética (lavagem do material não liga- do ou ligado fracamente). O sinal de fundo mais baixo reduz o sinal de fundo e, portanto, melhora o LOD (limite de detecção) de qualquer tes-

te realizado com o uso das redes de polímeros feitas com o fosfato de sódio e o fosfato de potássio.

6.2. Exemplo 1: Formação de Redes de Polímeros Tridimensionais

[0128] Uma solução de partida de 10 mg/ml do polímero foi prepa- rada pela dissolução de 10 mg do polímero de reticulação po- li(dimetilacrilamida) co 5% de metacriloil-benzofenona co 2,5% de 4- vinilbenzenossulfonato de sódio em 1,0 ml de água livre de DNAse. Isto foi obtido por agitação vigorosa e misturação em vórtice por cerca de 5 minutos até que todo o polímero visível fosse dissolvido. A solu- ção de partida foi então envolvida em folha para proteção contra a luz e colocada em um refrigerador durante a noite para garantir que o po- límero se dissolva completamente e para permitir a redução da espu- ma. O polímero tem pelo menos dois grupos fotorreativos por molécu- la.

[0129] As várias misturas contendo 10 mg/ml do polímero (PDMAA-5% MABP-2,5% SSNa), biomoléculas de sonda (incluindo oligonucleotídeos de DNA com uma porção fluorescente Cy3) e uma solução de sal aquosa com 350 mM de tampão de fosfato de sódio e, em alguns casos, quantidades variáveis de fosfato de potássio, foram impressas na superfície orgânica de uma placa com 65% de umidade. Os volumes de 1,6 nl foram impressos em cada ponto ao usar a im- pressora Scienion Sciflex. A placa foi então colocada em um recipien- te, uma caixa de papelão. Tampas foram colocadas sobre a placa, com uma superfície orgânica, para o transporte. A placa com os pontos na superfície orgânica foi então colocada em um forno de secagem ou sobre uma placa quente (70ºC) para causar a nucleação dos cristais de sal. Após secar por um período de 1 hora, a placa foi irradiada para reti- cular o polímero, as biomoléculas de sonda e a superfície orgânica.

[0130] A placa foi lavada após a impressão com 10 mM de tampão de NaPi para remover o material não ligado e então seca e armazena-

da. Foi feita uma varredura na placa em um scanner de fluorescência Sensovation para avaliar visualmente a morfologia do ponto. As ima- gens resultantes são mostradas na Figura 11A (após a lavagem) e na Figura 11B (após a secagem).

[0131] Os pontos nas fileiras D e E incluem o fosfato de potássio em quantidades variáveis (tal como mostrado na Figura 11C), visto que os pontos nas fileiras restantes foram gerados ao usar uma solu- ção de sal que contém somente o tampão de fosfato de sódio. A inclu- são do fosfato de potássio resultou em redes de polímeros mais ho- mogêneas e mais redondas do que os pontos feitos somente com o fosfato de sódio (Figura 11a e Figura 11B). A inclusão do fosfato de potássio também permite uma cristalização controlada quando a umi- dade relativa não é aumentada, por exemplo, em torno da umidade atmosférica normal de cerca de 40%.

6.3. Exemplo 2: Qualidade da Hibridização das Redes de Polímeros

[0132] Os arranjos, tal como descrito no Exemplo 1, foram feitos ao usar sondas para a detecção de S. Aureus ou de E. coli.

[0133] Os pares de primer para amplificar a S. Aureus e a E. coli foram usados nas reações de PCR com 100 cópias de S. Aureus e o DNA genômico da E. coli, respectivamente, como moldes, e os produ- tos de PCR hibridizados para os arranjos contendo as sondas de S. Aureus e de E. coli, respectivamente. Os resultados são mostrados nas Figuras 12A a 12B. A Figura 12A mostra a hibridização para um arranjo do produto de PCR amplificado de 100 cópias do DNA da S. Aureus. A Figura 12B mostra a hibridização para um arranjo do produ- to de PCR amplificado de 100 cópias do DNA da E. coli. O mapa de sonda para os arranjos da Figura 12A e da Figura 12B é mostrado na Figura 12C. Este estudo mostra que o sinal das redes de polímeros feitas ao usar uma solução de sal aquosa contendo fosfato de potás- sio, assim como o tampão de fosfato de sódio, tem o sinal comparável às redes de polímeros feitas ao usar uma solução de sal aquosa con- tendo somente o fosfato de sódio.

[0134] De modo surpreendente, as redes de polímeros feitas ao usar uma solução de sal aquosa contendo o fosfato de potássio têm um "ruído" de fundo reduzido em comparação com as redes de polí- meros feitas ao usar uma solução de sal aquosa contendo somente o fosfato de sódio, tal como mostrado na Figura 13. A Figura 13 mostra a quantificação dos sinais de fluorescência da hibridização do produto de PCR amplificado ao usar os mesmos pares de primer específicos de S. Aureus ou E. coli na ausência do molde. Desse modo, qualquer sinal de hibridização representa o "ruído" de fundo. O "ruído" de fundo está ausente das redes de polímeros feitas na presença de concentra- ções mais altas de fosfato de potássio.

7. Modalidades Específicas

[0135] A presente invenção é exemplificada pelas modalidades específicas a seguir.

1. "Um processo para a produção de uma rede de hidroge! tri- dimensional, o qual compreende: (a) a exposição de uma mistura (posicionada opcionalmente na super- fície de um substrato), a condições de formação de cristais de sal, a qual compreende: (i) pelo menos dois tipos de íons de metais monovalentes que têm uma concentração total de pelo menos 500 mM, (ii) cadeias de polímeros solúveis em água, (ili) porções de reticulador, e (iv) opcionalmente, moléculas de sonda, e formando desse modo uma mistura que contém um ou mais cristais de sal;

(b) a exposição da mistura que contém um ou mais cristais de sal a condições de reticulação, formando desse modo um hidrogel que con- tém um ou mais cristais de sal; e (c) a colocação do hidrogel que contém um ou mais cristais de sal em contato com um solvente em que um ou mais cristais de sal são solú- veis, dissolvendo desse modo os cristais de sal; formando desse modo a rede de hidrogel tridimensional.

2. O processo da modalidade 1, em que a mistura compreen- de pelo menos dois tipos de íons de metais monovalentes que têm uma concentração total de 500 mM a 1.000 mM.

3. —O processo da modalidade 2, em que concentração total de íons de metais monovalentes na mistura é de 550 mM a 800 mM.

4, O processo da modalidade 3, em que a concentração total de íons de metais monovalentes na mistura é de 600 mM a 750 mM.

5. O processo de qualquer uma das modalidades 1 a 4, em que a mistura compreende dois tipos de íons de metais monovalentes.

6. O processo da modalidade 5, em que a concentração de cada íon monovalente é de pelo menos 150 mM ou pelo menos 200 mM.

7. O processo da modalidade 5 ou modalidade 6, em que os íons de metais monovalentes são selecionados de íons de sódio, íons de potássio, e íons de lítio.

8. —O processo da modalidade 5 ou modalidade 6, em que os íons de metais monovalentes são íons de sódio e íons de potássio.

9. —O processo da modalidade 8, em que concentração de íons de sódio é de pelo menos 300 mM.

10. O processo da modalidade 9, em que a concentração de íons de sódio é de 300 mM a 500 mM.

11. O processo da modalidade 10, em que a concentração de íons de sódio é de 300 mM a 400 mM.

12. O processo da modalidade 11, em que a concentração de íons de sódio é de 350 mM.

13. O processo de qualquer uma das modalidades 8 a 12, em que a concentração de íons de potássio é de 150 mM a 500 mM.

14. O processo da modalidade 13, em que a concentração de íons de potássio é de 175 mM a 400 mM.

15. O processo da modalidade 14, em que a concentração de íons de potássio é de 200 mM a 350 mM.

16. O processo da modalidade 15, em que a concentração de íons de potássio é de 250 mM a 350 mM.

17. O processo de qualquer uma das modalidades 1 a 4, em que a mistura compreende três tipos de íons de metais monovalentes.

18. O processo da modalidade 17, em que a concentração de pelo menos dois dos íons monovalentes é de pelo menos 150 mM ca- da ou pelo menos 200 mM cada.

19. O processo da modalidade 17 ou modalidade 18, em que os íons de metais monovalentes são íons de sódio, íons de potássio e íons de lítio.

20. O processo da modalidade 19, em que a concentração de íons de sódio é de pelo menos 250 mM.

21. O processo da modalidade 20, em que a concentração de íons de sódio é de 250 mM a 500 mM.

22. O processo da modalidade 21, em que a concentração de íons de sódio é de 300 mM a 400 mM.

23. O processo da modalidade 22, em que a concentração de íons de sódio é de 350 mM.

24. O processo de qualquer uma das modalidades 19 a 23, em que a concentração de íons de potássio é de 150 mM a 500 mM.

25. O processo da modalidade 24, em que a concentração de íons de potássio é de 200 mM a 400 mM.

26. O processo da modalidade 25, em que a concentração de íons de potássio é de 250 mM a 350 mM.

27. O processo de qualquer uma das modalidades 1 a 26, o qual também compreende, antes da etapa (a), a formação da mistura.

28. O processo da modalidade 27, em que a formação da mis- tura compreende a combinação de uma solução de sal aquosa que compreende cátions de metais monovalentes e uma ou mais soluções que compreendem as cadeias de polímeros solúveis em água, as por- ções de reticulador e, se estiverem presente, as moléculas de sonda opcionais.

29. O processo da modalidade 28, em que as cadeias de polí- meros solúveis em água e as porções de reticulador estão em uma única solução.

30. O processo da modalidade 29, em que as porções reticula- das são unidas covalentemente às cadeias de polímero.

31. O processo de qualquer uma das modalidades 28 a 30, em que a solução de sal aquosa tem um pH que varia de 6 a 9.

32. O processo da modalidade 31, em que a solução de sal aquosa tem um pH que varia de 7 a 8,5.

33. O processo da modalidade 32, em que a solução de sal aquosa tem um pH igual a 8.

34. O processo de qualquer uma das modalidades 28 a 33, em que a solução de sal aquosa compreende uma solução produzida por um processo que compreende a dissolução de hidrogenofosfato de dissódio, di-hidrogenofosfato de sódio, hidrogenofosfato de dipotássio, di-hidrogenofosfato de potássio, sulfato de sódio, sulfato de potássio ou uma combinação destes na água ou em uma solução aquosa.

35. O processo da modalidade 34, em que a solução de sal aquosa é produzida por um processo que compreende a dissolução de hidrogenofosfato de dissódio, di-hidrogenofosfato de sódio, hidrogeno-

fosfato de dipotássio, di-hidrogenofosfato de potássio, ou uma combi- nação destes na água ou em uma solução aquosa.

36. O processo da modalidade 35, em que a solução de sal aquosa é produzida por um processo que compreende a dissolução de hidrogenofosfato de dissódio, di-hidrogenofosfato de sódio, hidrogeno- fosfato de dipotássio, e di-hidrogenofosfato de potássio na água.

37. O processo de qualquer uma das modalidades 1 a 36, em que a concentração de íons de fosfato na mistura é de pelo menos 250 mM.

38. O processo da modalidade 37, em que a concentração de íons de fosfato na mistura é de 250 mM a 1000 mM.

39. O processo da modalidade 38, em que a concentração de íons de fosfato na mistura é de 550 mM a 800 mM.

40. O processo da modalidade 39, em que a concentração de íons de fosfato na mistura é de 600 mM a 750 mM.

41. O processo de qualquer uma das modalidades 1 a 40, em que as condições de formação de cristais de sal resultam na formação de um ou mais cristais em formato de agulha de maneira tal que um ou mais canais longos são produzidos após a dissolução dos cristais de sal.

42. O processo de qualquer uma das modalidades 1 a 41, em que as condições de formação de cristais de sal resultam em uma formação de um ou mais cristais compactos de maneira tal que uma ou mais canais curtos são produzidos após a dissolução dos cristais de sal.

43. O processo de qualquer uma das modalidades 1 a 42, em que a condição de formação de cristais de sal compreende a desidra- tação da mistura.

44. O processo da modalidade 43, o qual compreende a desi- dratação da mistura mediante o aquecimento da mistura, a exposição da mistura a um vácuo, a redução da umidade da atmosfera que cir- cunda a mistura, ou uma combinação destas.

45. O processo da modalidade 44, o qual compreende a desi- dratação da mistura mediante a exposição da mistura a um vácuo.

46. O processo da modalidade 44, o qual compreende a desi- dratação da mistura mediante o aquecimento da mistura.

47. O processo da modalidade 46, em que o aquecimento da mistura compreende a colocação da mistura em contato com um gás que tem uma temperatura que é mais elevada do que a temperatura da mistura.

48. O processo de qualquer uma das modalidades 1 a 42, em que a condição de formação de cristais de sal compreende o resfria- mento da mistura até que a mistura fique supersaturada com o sal.

49. O processo da modalidade 48, o qual compreende o resfri- amento da mistura ao colocar a mistura em contato com um gás que tem uma temperatura que é mais baixa do que a temperatura da mis- tura.

50. O processo de qualquer uma das modalidades 1 a 49, em que a temperatura da mistura durante a etapa (a) é mantida acima do ponto de orvalho da atmosfera que circunda a mistura.

51. O processo de qualquer uma das modalidades 1 a 50, em que as porções de reticulador são ativadas pela luz ultravioleta (UV) e as condições de reticulação compreendem a exposição da mistura à luz ultravioleta.

52. O processo de qualquer uma das modalidades 1 a 50, em que as porções de reticulador são ativadas pela luz visível e as condi- ções de reticulação compreendem a exposição da mistura à luz visível.

53. O processo de qualquer uma das modalidades 1 a 50, em que as porções de reticulador são ativadas pelo calor e as condições de reticulação compreendem a exposição da mistura ao calor.

54. O processo de qualquer uma das modalidades 1 a 53, em que as cadeias de polímeros solúveis em água compreendem cadeias de homopolímeros.

55. O processo de qualquer uma das modalidades 1 a 54, em que as cadeias de polímeros solúveis em água compreendem cadeias de copolímeros.

56. O processo de qualquer uma das modalidades 1 a 54, em que as cadeias de polímeros solúveis em água compreendem uma mistura de cadeias de homopolímeros e copolímeros.

57. O processo de qualquer uma das modalidades 54 a 56, em que as cadeias de polímeros solúveis em água compreendem cadeia de polímeros polimerizadas de uma ou mais espécies de monômeros.

58. O processo da modalidade 57, em que cada espécie de monômero compreende um grupo polimerizável selecionado indepen- dentemente de um grupo acrilato, um grupo metacrilato, um grupo eta- crilato, um grupo acrilato de 2-fenila, um grupo acrilamida, um grupo metacrilamida, um grupo itaconato e um grupo estireno.

59. O processo da modalidade 58, em que pelo menos uma espécie de monômero no polímero solúvel em água compreende um grupo metacrilato.

60. O processo da modalidade 59, em que pelo menos uma espécie de monômero que compreende um grupo metacrilato é meta- criloiloxibenzofenona (MABP).

61. O processo de qualquer da modalidade 57, em que o polí- mero solúvel em água compreende um polímero polimerizado de di- metilacrilamida (DMAA), metacriloiloxibenzofenona (MABP) e 4- vinilbenzenossulfonato de sódio (SSNa).

62. O processo de qualquer uma das modalidades 1 a 61, em que as cadeias de polímeros solúveis em água são cadeias de um co- polímero que compreende as porções de reticulador.

63. O processo da modalidade 62, em que as cadeias de polí- meros solúveis em água compreendem pelo menos duas porções de reticulador por molécula de polímero.

64. O processo de qualquer uma das modalidades 1 a 63, em que as porções de reticulador são selecionadas de benzofenona, uma tioxantona, um éter benzoína, etil eosina, eosina Y, rosa bengala, can- forquinona, eritirosina, ácido 4,4' azobis(4-cianopentanoico), dicloridra- to de 2,2-azobis[2-(2-imidazolin-2-il)propano], e peróxido de benzoíla.

65. O processo da modalidade 64, em que as porções de reti- culador são porções de benzofenona.

66. O processo de qualquer uma das modalidades 1 a 65, em que o solvente é a água ou um tampão à base de água.

67. O processo da modalidade 66, em que o solvente é a água.

68. O processo da modalidade 66, em que o solvente é um tampão à base de água.

69. O processo da modalidade 68, em que o tampão à base de água compreende fosfato, metanol, etanol, propanol, ou uma mistura destes.

70. O processo de qualquer uma das modalidades 1 a 69, em que a mistura da etapa (a) também compreende moléculas de sonda.

71. O processo da modalidade 70, em que pelo menos algu- mas, a maioria ou todas as moléculas de sonda compreendem um ácido nucleico, um derivado de ácido nucleico, um peptídeo, um poli- peptídeo, uma proteína, um carboidrato, um lipídio, uma célula, um ligando, ou uma combinação destes.

72. O processo da modalidade 71, em que pelo menos algu- mas das moléculas de sonda compreendem um ácido nucleico ou um derivado do ácido nucleico.

73. O processo da modalidade 71, em que pelo menos a maio- ria das moléculas de sonda compreende um ácido nucleico ou um de- rivado de ácido nucleico.

74. O processo da modalidade 71, em que todas as moléculas de sonda compreendem um ácido nucleico ou um derivado de ácido nucleico.

75. O processo da modalidade 70, em que pelo menos algu- mas, a maioria ou todas as moléculas de sonda compreendem um an- ticorpo, um fragmento do anticorpo, um antígeno, um epítopo, uma en- zima, um substrato de enzima, um inibidor de enzima, um ácido nu- cleico, ou uma combinação destes.

76. O processo da modalidade 75, em que pelo menos algu- mas das moléculas de sonda compreende um ácido nucleico.

77. O processo da modalidade 75, em que pelo menos a maio- ria das moléculas de sonda compreende um ácido nucleico.

78. O processo da modalidade 75, em que todas as moléculas de sonda compreendem um ácido nucleico.

79. O processo de qualquer uma das modalidades 76 a 78, em que o ácido nucleico é um oligonucleotídeo.

80. O processo da modalidade 79, em que o oligonucleotídeo tem de 12 a 30 nucleotídeos de extensão.

81. O processo da modalidade 79, em que o oligonucleotídeo tem de 14 a 30 nucleotídeos de extensão.

82. O processo da modalidade 79, em que o oligonucleotídeo tem de 14 a 25 nucleotídeos de extensão.

83. O processo da modalidade 79, em que o oligonucleotídeo tem de 14 a 20 nucleotídeos de extensão.

84. O processo da modalidade 79, em que o oligonucleotídeo tem de 15 a 30 nucleotídeos de extensão.

85. O processo da modalidade 79, em que o oligonucleotídeo tem de 15 a 25 nucleotídeos de extensão.

86. O processo da modalidade 79, em que o oligonucleotídeo tem de 15 a 20 nucleotídeos de extensão.

87. O processo da modalidade 79, em que o oligonucleotídeo tem de 16 a 30 nucleotídeos de extensão.

88. O processo da modalidade 79, em que o oligonucleotídeo tem de 16 a 25 nucleotídeos de extensão.

89. O processo da modalidade 79, em que o oligonucleotídeo tem de 16 a 20 nucleotídeos de extensão.

90. O processo da modalidade 79, em que o oligonucleotídeo tem de 15 a 40 nucleotídeos de extensão.

91. O processo da modalidade 79, em que o oligonucleotídeo tem de 15 a 45 nucleotídeos de extensão.

92. O processo da modalidade 79, em que o oligonucleotídeo tem de 15 a 50 nucleotídeos de extensão.

93. O processo da modalidade 79, em que o oligonucleotídeo tem de 15 a 60 nucleotídeos de extensão.

94. O processo da modalidade 79, em que o oligonucleotídeo tem de 20 a 55 nucleotídeos de extensão.

95. O processo da modalidade 79, em que o oligonucleotídeo tem de 18 a 60 nucleotídeos de extensão.

96. O processo da modalidade 79, em que o oligonucleotídeo tem de 20 a 50 nucleotídeos de extensão.

97. O processo da modalidade 79, em que o oligonucleotídeo tem de 30 a 90 nucleotídeos de extensão.

98. O processo da modalidade 79, em que o oligonucleotídeo tem de 20 a 100 nucleotídeos longos.

99. O processo da modalidade 79, em que o oligonucleotídeo tem de 20 a 120 nucleotídeos longos.

100. O processo da modalidade 79, em que o oligonucleotídeo tem de 20 a 40 nucleotídeos de extensão.

101. O processo da modalidade 79, em que o oligonucleotídeo tem de 20 a 60 nucleotídeos de extensão.

102. O processo da modalidade 79, em que o oligonucleotídeo tem de 40 a 80 nucleotídeos de extensão.

103. O processo da modalidade 79, em que o oligonucleotídeo tem de 40 a 100 nucleotídeos longos.

104. O processo da modalidade 79, em que o oligonucleotídeo tem de 40 a 60 nucleotídeos de extensão.

105. O processo da modalidade 79, em que o oligonucleotídeo tem de 60 a 80 nucleotídeos de extensão.

106. O processo da modalidade 79, em que o oligonucleotídeo tem de 80 a 100 nucleotídeos longos.

107. O processo da modalidade 79, em que o oligonucleotídeo tem de 100 a 120 nucleotídeos longos.

108. O processo da modalidade 79, em que o oligonucleotídeo tem de 12 a 150 nucleotídeos longos.

109. O processo de qualquer uma das modalidades 1 a 108, o qual também compreende, antes da etapa (a), uma etapa de aplicação da mistura a uma superfície de um substrato.

110. O processo da modalidade 109, em que a mistura é aplica- da em um volume de 100 pl a 5 nl.

111. O processo da modalidade 109, em que a mistura é apli- cada em um volume de 100 pl a 1 nl.

112. O processo da modalidade 109, em que a mistura é aplica- da em um volume de 200 pl a 1 nl.

113. O processo de qualquer uma das modalidades 109 a 112, em que a etapa de aplicação da mistura ao substrato compreende a aspersão da mistura à superfície do substrato.

114. O processo da modalidade 113, em que a mistura é pulve- rizada por uma impressora de jato de tinta.

115. O processo de qualquer uma das modalidades 109 a 114, em que o substrato compreende um polímero orgânico ou um material inorgânico que tem uma monocamada automontada de moléculas or- gânicas na superfície.

116. O processo da modalidade 115, em que o substrato com- preende um polímero orgânico.

117. O processo da modalidade 116, em que o polímero orgâni- co é selecionado de copolímeros de ciclo-olefina, poliestireno, polieti- leno, polipropileno, policarbonato e metacrilato de polimetila.

118. O processo da modalidade 117, em que o substrato com- preende metacrilato de polimetila, poliestireno ou copolímeros de ciclo- olefina.

119. O processo da modalidade 115, em que o substrato com- preende um material inorgânico que tem uma monocamada automon- tada de alquil silano na superfície.

120. O processo de qualquer uma das modalidades 109 a 119, em que o substrato compreende uma placa de micropoços.

121. O processo de qualquer uma das modalidades 109 a 120, em que o polímero é reticulado à superfície na etapa (b).

122. O processo da modalidade 121, em que é produzido um po- límero intumescível com água que é reticulado à superfície.

123. O processo da modalidade 122, em que o polímero intu- mescível com água pode absorver até 50 vezes o seu peso da água destilada deionizada.

124. O processo da modalidade 122 ou modalidade 123, em que o polímero intumescível com água pode absorver de 5 a 50 vezes o seu próprio volume de água destilada deionizada.

125. O processo de qualquer uma das modalidades 122 a 124, em que o polímero intumescível com água pode absorver até 30 vezes o seu peso de solução salina.

126. O processo de qualquer uma das modalidades 122 a 125, em que o polímero intumescível com água pode absorver de 4 a 30 vezes o seu próprio volume de solução salina.

127. Um processo para a produção de um arranjo, o qual com- preende a geração de uma pluralidade de redes de hidrogel tridimen- sionais pelo processo de qualquer uma das modalidades 1 a 126 em pontos distintos na superfície do mesmo substrato.

128. O processo da modalidade 127, em que as redes de hidro- gel tridimensionais são geradas simultaneamente.

129. O processo da modalidade 127, em que as redes de hidro- gel tridimensionais são geradas sequencialmente.

130. O processo de qualquer uma das modalidades 127 a 129,0 qual também compreende a reticulação da pluralidade de redes de hi- drogel tridimensionais à superfície do substrato.

131. Um processo para a obtenção de um arranjo, o qual com- preende o posicionamento de uma pluralidade de redes de hidrogel tridimensionais produzidas ou que podem ser obtidas de acordo com o processo de qualquer uma das modalidades 1 a 126 em pontos distin- tos em uma superfície do mesmo substrato.

132. O processo de qualquer uma das modalidades 127 a 131,0 qual também compreende a reticulação da pluralidade de redes de hi- drogel tridimensionais à superfície.

133. Um processo para a obtenção de um arranjo, o qual com- preende o posicionamento de uma pluralidade de redes de hidrogel tridimensionais produzidas ou que podem ser obtidas de acordo com o processo de qualquer uma das modalidades 109 a 126 em pontos dis- tintos em uma superfície do mesmo substrato.

134. O processo da modalidade 133, em que o posicionamento compreende a aplicação das misturas a partir das quais as redes de hidrogel! tridimensionais são formadas nos pontos distintos.

135. O processo de qualquer uma das modalidades 127 a 134, em que os pontos são arranjados em colunas e/ou fileiras.

136. Uma rede de hidrogel tridimensional produzida ou que pode ser obtida pelo processo de qualquer uma das modalidades 1 a 126.

137. Um arranjo que compreende uma pluralidade de redes de hidrogel tridimensionais de acordo com a modalidade 136 em um substrato.

138. Um arranjo produzido ou que pode ser obtido pelo processo de qualquer uma das modalidades 127 a 135.

139. O arranjo da modalidade 137 ou modalidade 138, o qual compreende pelo menos 8 redes de hidrogel tridimensionais.

140. O arranjo da modalidade 137 ou modalidade 138, o qual compreende pelo menos 16 redes de hidroge! tridimensionais.

141. O arranjo da modalidade 137 ou modalidade 138, o qual compreende pelo menos 24 redes de hidroge! tridimensionais.

142. O arranjo da modalidade 137 ou modalidade 138, o qual compreende pelo menos 48 redes de hidroge! tridimensionais.

143. O arranjo da modalidade 137 ou modalidade 138, o qual compreende pelo menos 96 redes de hidroge! tridimensionais.

144. O arranjo da modalidade 137 ou modalidade 138, o qual compreende pelo menos 128 redes de hidrogel tridimensionais.

145. O arranjo da modalidade 137 ou modalidade 138, o qual compreende pelo menos 256 redes de hidrogel tridimensionais.

146. O arranjo da modalidade 137 ou modalidade 138, o qual compreende pelo menos 512 redes de hidrogel tridimensionais.

147. O arranjo da modalidade 137 ou modalidade 138, o qual compreende pelo menos 1024 redes de hidroge! tridimensionais.

148. O arranjo da modalidade 137 ou modalidade 138, o qual compreende 24 a 8192 redes de hidroge! tridimensionais.

149. O arranjo da modalidade 137 ou modalidade 138, o qual compreende 24 a 4096 redes de hidroge! tridimensionais.

150. O arranjo da modalidade 137 ou modalidade 138, o qual compreende 24 a 2048 redes de hidrogel tridimensionais.

151. O arranjo da modalidade 137 ou modalidade 138, o qual compreende 24 a 1024 redes de hidroge! tridimensionais.

152. O arranjo da modalidade 137 ou modalidade 138, o qual compreende 24 redes de hidrogel tridimensionais.

153. O arranjo da modalidade 137 ou modalidade 138, o qual compreende 48 redes de hidrogel tridimensionais.

154. O arranjo da modalidade 137 ou modalidade 138, o qual compreende 96 redes de hidrogel tridimensionais.

155. O arranjo da modalidade 137 ou modalidade 138, o qual compreende 128 redes de hidrogel tridimensionais.

156. O arranjo da modalidade 137 ou modalidade 138, o qual compreende 256 redes de hidrogel tridimensionais.

157. O arranjo da modalidade 137 ou modalidade 138, o qual compreende 512 redes de hidrogel tridimensionais.

158. O arranjo da modalidade 137 ou modalidade 138, o qual compreende 1024 redes de hidroge! tridimensionais.

159. O arranjo de qualquer uma das modalidades 137 a 158, em que as redes de hidrogel tridimensionais compreendem moléculas de sonda, e duas ou mais de redes de hidrogel tridimensionais compre- endem espécies diferentes de moléculas de sonda.

160. O arranjo de qualquer uma das modalidades 137 a 159, em que as redes de hidrogel tridimensionais compreendem moléculas de sonda, e duas ou mais redes de hidrogel tridimensionais compreen- dem a mesma espécie de moléculas de sonda.

161. O arranjo de qualquer uma das modalidades 137 a 158, em que as redes de hidrogel tridimensionais compreendem moléculas de sonda, e cada uma das redes de hidrogel tridimensionais compreende a mesma espécie de moléculas de sonda.

162. O arranjo de qualquer uma das modalidades 137 a 161, em que a pluralidade de redes de hidrogel tridimensionais compreende uma ou mais redes de hidrogel tridimensionais que compreendem mo- léculas de sonda de controle etiquetadas.

163. O arranjo da modalidade 162, em que as moléculas de sonda de controle etiquetadas são etiquetadas de maneira fluorescen- te.

164. O arranjo de qualquer uma das modalidades 137 a 163, em que o substrato compreende uma placa de micropoços e cada poço da placa de micropoços contém não mais do que uma única rede de hi- drogel tridimensional.

165. Um método para determinar se um analito está presente em uma amostra, o qual compreende: (a) a colocação de uma rede de hidrogel tridimensional de acordo com a modalidade 136, ou um arranjo de qualquer uma das modalidades até 164 que compreendem moléculas de sonda que podem se ligar ao analito, em contato com a amostra; e (b) a detecção da ligação do analito às moléculas de sonda na rede ou no arranjo de hidrogel tridimensional, determinando desse modo se o analito está presente na amostra.

166. O método da modalidade 165, o qual também compreende a lavagem da rede ou do arranjo que compreende moléculas de sonda entre as etapas (a) e (b).

167. O método da modalidade 165 ou modalidade 166, o qual também compreende a colocação da rede ou do arranjo que compre-

ende moléculas de sonda em contato com um reagente bloqueador antes da etapa (a).

168. O método de qualquer uma das modalidades 165 a 167, o qual também compreende a quantificação da quantidade de analito ligado à rede de hidrogel! tridimensional ou ao arranjo que compreende moléculas de sonda.

169. Um método para determinar se um analito está presente em cada amostra de uma pluralidade de amostras, o qual compreen- de: (a) a colocação de um arranjo de qualquer uma das modalidades 137 a 164 que compreende moléculas de sonda que podem se ligar ao analito em contato com as amostras; e (b) a detecção da ligação do analito às moléculas de sonda no arranjo, determinando desse modo se o analito está presente em cada amostra na pluralidade de amostras.

170. Um método para determinar se um analito está presente em cada amostra de uma pluralidade de amostras, o qual compreen- de: (a) a colocação de um arranjo de qualquer uma das modalidades 137 a 164 que compreende moléculas de sonda que podem se ligar ao analito em contato com as amostras e compreende moléculas de son- da de controle, em que o arranjo foi usado e lavado antes da etapa (a); e (b) a detecção da ligação do analito às moléculas de sonda no arranjo, determinando desse modo se o analito está presente em cada amostra na pluralidade de amostras.

171. Um método para determinar se mais de uma espécie de analito está presente em uma amostra, o qual compreende: (a) a colocação de um arranjo de qualquer uma das modalidades 137 a 164 que compreende espécies diferentes de moléculas de sonda que podem se ligar a espécies diferentes de analitos em contato com a amostra; e (b) a detecção da ligação dos analitos às moléculas de sonda no ar- ranjo, determinando desse modo se mais de uma espécie de analito está presente na amostra.

172. Um método para determinar se mais de uma espécie de analito está presente em uma amostra, o qual compreende: (a) a colocação de um arranjo de qualquer uma das modalidades 137 a 164 que compreende espécies diferentes de moléculas de sonda que podem se ligar a espécies diferentes de analitos em contato com a amostra e compreende moléculas de sonda do controle, em que o ar- ranjo foi usado e lavada antes da etapa (a); e (b) a detecção da ligação de analitos às moléculas de sonda no arran- jo, determinando desse modo se mais de uma espécie de analito está presente na amostra.

173. O método de qualquer uma das modalidades 169 a 172, em que: (a) o substrato do arranjo compreende uma placa de micropoços; (b) cada poço da placa de micropoços contém não mais do que uma única rede de hidrogel tridimensional; e (c) a colocação do arranjo em contato com as amostras compreende a colocação de cada poço com não mais do que uma única amostra.

174. O método de qualquer uma das modalidades 169 a 173, o qual também compreende a lavagem do arranjo que compreende mo- léculas de sonda entre as etapas (a) e (b).

175. O método de qualquer uma das modalidades 169 a 174, o qual também compreende a colocação do arranjo que compreende moléculas de sonda em contato com um reagente bloqueador antes da etapa (a).

176. O método de qualquer uma das modalidades 169 a 175, o qual também compreende a quantificação da quantidade de analito ou analitos ligados ao arranjo.

177. O método de qualquer uma das modalidades 165 a 176, o qual também compreende a reutilização do arranjo.

178. O método da modalidade 177, em que o arranjo é reutiliza- do pelo menos 5 vezes.

179. O método da modalidade 177, em que o arranjo é reutiliza- do pelo menos 10 vezes.

180. O método da modalidade 177, em que o arranjo é reutiliza- do pelo menos 20 vezes.

181. O método da modalidade 177, em que o arranjo é reutiliza- do pelo menos 30 vezes.

182. O método da modalidade 177, em que o arranjo é reutiliza- do pelo menos 40 vezes.

183. O método da modalidade 177, em que o arranjo é reutiliza- do pelo menos 50 vezes.

184. O método da modalidade 178, o qual compreende a reutili- zação do arranjo de 5 a 20 vezes.

185. O método da modalidade 178, o qual compreende a reutili- zação do arranjo de 5 a 30 vezes.

186. O método da modalidade 178, o qual compreende a reutili- zação do arranjo de 10 a 50 vezes.

187. O método da modalidade 178, o qual compreende a reutili- zação do arranjo de 10 a 20 vezes.

188. O método da modalidade 178, o qual compreende a reutili- zação do arranjo de 10 a 30 vezes.

189. O método da modalidade 178, o qual compreende a reutili- zação do arranjo de 20 a 40 vezes.

190. O método da modalidade 178, o qual compreende a reutili- zação do arranjo de 40 a 50 vezes.

191. O método de qualquer uma das modalidades 177 a 190, o qual compreende a lavagem do arranjo entre as reutilizações.

192. O método da modalidade 191, em que o arranjo é lavado sob condições de desnaturação.

193. O método da modalidade 192 em que as condições de desnaturação compreendem a exposição do arranjo ao calor.

194. O método da modalidade 192 em que as condições de desnaturação compreendem a exposição do arranjo a baixas concen- trações de sal.

195. O método da modalidade 192 em que as condições de desnaturação compreendem a exposição do arranjo ao calor e a bai- xas concentrações de sal.

196. O método da modalidade 192, em que as condições de desnaturação são removidas antes da reutilização.

197. O método da modalidade 196, em que as condições de desnaturação compreendem a exposição do arranjo ao calor e a tem- peratura é reduzida antes da reutilização.

198. O método da modalidade 196, em que as condições de desnaturação compreendem a exposição do arranjo a baixas concen- trações de sal e a concentração de sal é aumentada antes da reutiliza- ção.

199. O método da modalidade 196, em que as condições de desnaturação compreendem a exposição do arranjo ao calor e a bai- xas concentrações de sal e em que a temperatura é reduzida e a con- centração de sal é aumentada antes da reutilização.

200. O método de qualquer uma das modalidades 177 a 199, em que o arranjo compreende pelo menos uma rede de hidrogel! tridimen-

sional que compreende um oligonucleotídeo etiquetado de maneira fluorescente como um controle da capacidade de reutilização.

201. O método da modalidade 200, o qual compreende o teste da intensidade do sinal fluorescente.

202. O método da modalidade 201, em que o controle da capa- cidade de reutilização retém pelo menos 70% de sua intensidade de fluorescência depois de 10 usos.

203. O método da modalidade 202, em que o controle da capa- cidade de reutilização retém pelo menos 50% de sua intensidade de sinal depois de 20 usos.

204. O método de qualquer uma das modalidades 200 a 203, em que o arranjo não é mais reutilizado depois que o controle da capaci- dade de reutilização perde mais de 50% de sua intensidade de sinal.

205. O método de qualquer uma das modalidades 165 a 204, em que o analito é um ácido nucleico.

206. O método da modalidade 205, em que o ácido nucleico é um amplicon de reação em cadeia de polimerase (PCR).

207. O método da modalidade 205, em que o amplicon de PCR é amplificado a partir de uma amostra biológica ou da amostra ambien- tal.

208. O método da modalidade 207, em que o amplicon de PCR é amplificado a partir de uma amostra biológica.

209. O método da modalidade 207, em que o amplicon de PCR é amplificado a partir de uma amostra ambiental.

210. O método da modalidade 208, em que a amostra biológica é um sangue, soro, plasma, tecido, célula, saliva, escarro, urina, fluido cerebrospinal, fluido pleural, leite, lágrimas, fezes, suor, sêmen, célu- las integrais, constituintes de células, esfregado de célula, ou um ex- trato ou um derivado dos mesmos.

211. O método da modalidade 210, em que a amostra biológica é o sangue, soro ou plasma de um mamífero ou um extrato destes.

212. O método da modalidade 211, em que a amostra biológica é o sangue, soro ou plasma de um ser humano ou um bovino, ou um extrato destes.

213. O método da modalidade 210, em que a amostra biológica é o leite ou um extrato do mesmo.

214. O método da modalidade 213, em que a amostra biológica é o leite de vaca ou um extrato do mesmo.

215. O método de qualquer uma das modalidades 205 a 214, em que o ácido é etiquetado.

216. O método da modalidade 215, em que o ácido nucleico é etiquetado de maneira fluorescente.

Embora várias modalidades específicas tenham sido ilustradas e descritas, deve ser apreciado que várias mudanças podem ser feitas sem desviar do caráter e do âmbito da(s) invenção(ões).

8. CITAÇÃO DE REFERÊNCIAS

[0136] Todas as publicações, patentes, pedidos de patente e ou- tros documentos citados neste pedido de patente são incorporados no presente documento a título de referência em suas totalidades para todas as finalidades até a mesma extensão em que cada publicação, patente, pedido de patente ou outro documento individual fosse indi- cado individualmente para ser incorporado a título de referência para todas as finalidades. No caso de haver uma inconsistência entre os ensinamentos de uma ou mais das referências incorporadas no pre- sente documento e a presente invenção, são empregados os ensina- mentos do presente relatório descritivo.

Claims (15)

REIVINDICAÇÕES

1. Processo para a produção de uma rede de hidrogel tridi- mensional, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) a exposição de uma mistura (posicionada opcionalmen- te na superfície de um substrato), a condições de formação de cristais de sal, a qual compreende: (i) pelo menos dois tipos de íons de metais monova- lentes que têm uma concentração total de pelo menos 500 mM, (ii), cadeias de polímeros solúveis em água, (iii) porções de reticulador, e (iv) opcionalmente, moléculas de sonda, e formando desse modo uma mistura que contém um ou mais cristais de sal; (b) a exposição da mistura que contém um ou mais cristais de sal a condições de reticulação, formando desse modo um hidrogel que contém um ou mais cristais de sal; e (c) colocação do hidrogel que contém um ou mais cristais de sal em contato com um solvente em que um ou mais cristais de sal são solúveis, dissolvendo desse modo os cristais de sal; formando desse modo a rede de hidroge! tridimensional.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a mistura compreende pelo menos dois tipos de íons de metais monovalentes que têm uma concentração total de 500 mM a

1.000 mM.

3. Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a mistura compreende íons de sódio a uma concen- tração de 200 mM ou mais e íons de potássio a uma concentração de 150 mM ou mais, opcionalmente em que: (a) a concentração de íons de sódio varia de 300 mM a 400 nM; e

(b) a concentração de íons de potássio varia de 200 mM a 350 nM.

4. Processo de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 3, caracterizado pelo fato de que compreende ainda, antes da etapa (a), a formação da mistura, opcionalmente ao combinar uma so- lução de sal aquosa que compreende cátions de metais monovalentes e uma ou mais soluções que compreendem cadeias de polímeros so- lúveis em água, as porções de reticulador e, se estiverem presentes, as moléculas de sonda opcionais.

5. Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que solução de sal aquosa tem um pH que varia de 6 a 9.

6. Processo de acordo com a reivindicação 4 ou de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a solução de sal aquosa é produzida por um processo que compreende a dissolução de hidrogenofosfato de dissódio, di-hidrogenofosfato de sódio, hidrogeno- fosfato de dipotássio, e di-hidrogenofosfato de potássio na água.

7. Processo de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 6, caracterizado pelo fato de que as cadeias de polímeros solúveis em água compreendem grupos metacrilato e pelo menos du- as porções de reticulador por molécula, opcionalmente em que as por- ções de reticulador são porções de benzofenona.

8. Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que as cadeias de polímeros solúveis em água são poli- merizadas a partir de dimetilacrilamida (DMAA), metacriloiloxibenzofe- nona (MABP), e 4-vinilbenzenossulfonato de sódio (SSNa).

9. Processo de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a mistura da etapa (a) com- preende moléculas de sonda, opcionalmente em que as moléculas de sonda são moléculas de ácido nucleico.

10. Rede tridimensional, caracterizada pelo fato de que é obtida ou pode ser obtida pelo processo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9.

11. Arranjo que compreende uma pluralidade de redes tri- dimensionais como definida na reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que (a) as redes tridimensionais são imobilizadas no substrato e (b) cada uma das redes tridimensionais fica localizada em um ponto separado no substrato, opcionalmente em que o arranjo pode ser reuti- lizado pelo menos 10 vezes.

12. Processo para fazer um arranjo, caracterizado pelo fato de que compreende a geração de uma pluralidade de redes de hidro- gel tridimensionais pelo processo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9 em pontos distintos na superfície do mesmo subs- trato, e a reticulação das redes ao substrato durante a etapa (b).

13. Método para determinar se um analito está presente em uma amostra, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) a colocação de uma rede de hidrogel tridimensional co- mo definida reivindicação 10 ou um arranjo como definido na reivindi- cação 11, em que a dita rede ou arranjo compreende moléculas de sonda que podem se ligar ao analito, em contato com a amostra; e (b) a detecção da ligação do analito às moléculas de sonda na rede ou no arranjo de hidrogel tridimensional, determinando desse modo se o analito está presente na amostra.

14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracteriza- do pelo fato de que a rede ou o arranjo foi usado e lavado pelo menos vezes antes da etapa (a) ou também compreende a reutilização da rede ou do arranjo pelo menos 10 vezes depois da etapa (b).

15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracteriza- do pelo fato de que compreende ainda a ligação quantificadora do analito às moléculas de sonda na rede tridimensional.