ES2836215T3 - Redes poliméricas tridimensionales con canales situados allí - Google Patents
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Abstract
Una red tridimensional que tiene una superficie y un interior, la red tridimensional: (a) se compone de un polímero hinchable en agua formado al reticular cadenas de polímeros solubles en agua; (b) se reticula a la superficie de un sustrato rígido; y (c) comprende moléculas de sonda covalentemente unidas a las cadenas de polímeros, caracterizada porque (i) la red comprende al menos 5 canales, que convergen en un punto en el interior de la red tal que la distancia lateral entre los canales disminuya desde la superficie hacia el punto en el interior y (ii) una mayoría de las moléculas de sonda se inmoviliza en el interior de la red y al menos una porción de las moléculas de sonda colindan con un canal.
Description
DESCRIPCIÓN
Redes poliméricas tridimensionales con canales situados allí
1. Referencia cruzada a solicitudes relacionadas
Esta solicitud reivindica la prioridad bajo la 35 U.S.C. § 119 a la solicitud Europea no. 15201355, presentada el 18 de diciembre de 2015.
2. Antecedentes de la invención
La Publicación de E.U.A. No. 2008/0293592 describe un método para inmovilizar covalentemente sonda-biomoléculas sobre superficies orgánicas por medio de agentes de reticulación fotoreactivo. El método ha demostrado en la práctica ser ventajoso particularmente debido a que permite una inmovilización de biomoléculas de sonda sobre superficies no reactivas, tal como soportes de vidrio silanizado y sustratos hechos de plástico comercial estándar. Un polímero se usa en el método descrito en la US 2008/0293592 para formar un tipo de red tridimensional sobre la cual las biomoléculas de sonda se pueden enlazar, ya sea en la superficie de la red o en el interior de la red. Comparado con una superficie orgánica sobre la cual las biomoléculas de sonda se inmovilizan únicamente en forma bidimensional, la inmovilización tridimensional de las biomoléculas en la red de polímero y/o copolímero permite una mayor densidad de las biomoléculas de sonda en la superficie orgánica. Esto incrementa la cantidad de analito que se puede enlazar por unidad de superficie de la superficie orgánica. El uso de la superficie como sensor biológico así da lugar a una mayor precisión de medición y una alta medición dinámica.
Sin embargo, una desventaja de los métodos y redes de polímero descrita en la U.S. 2008/0293592 es que las moléculas de analito o componentes de analito que enlazan a biomoléculas de sonda configuradas en o cerca de la superficie de la red de polímero pueden bloquear la red. Además las moléculas de analito o constituyentes de analito ya no pueden enlazarse tampoco a las biomoléculas de sonda no enlazadas que están configuradas en una mayor distancia desde la superficie de la red en su interior.
Así, hay una necesidad de redes de polímero mejoradas.
Horak et al. (Polymer, vol. 49, páginas 2046 a 2054, 2008) describen redes poliméricas de hidrogel tridimensionales como soportes para el cultivo de células, en donde se formaron poros de comunicación en la red por lixiviación de sales.
3. Breve descripción de la invención
Esta descripción proporciona redes poliméricas tridimensionales que comprenden un polímero reticulado y uno o más canales que se extienden desde una superficie y/o cerca de una superficie de la red en el interior de la red. Las redes se enlazan covalentemente de forma adecuada a una superficie. Una o más sondas, tal como una biomolécula, se pueden inmovilizar en la superficie de la red y en todo el interior de la red, proporcionando un sensor para detectar la presencia de y/o medir la cantidad de un analito en una muestra. Por ejemplo, las sondas de ácido nucleico se pueden usar para detectar ácidos nucleicos complementarios presentes en una muestra y las sondas de anticuerpo se pueden usar para detectar antígenos presentes en una muestra. Las redes de la descripción permiten una hibridación más rápida de una cantidad dada de analito que las redes que carecen de canales debido a que los canales pueden incrementar efectivamente el área de superficie de la red, exponiendo más sondas a la muestra en una cantidad dada de tiempo. Adicionalmente, las redes de la descripción pueden enlazar más analito que el mismo volumen de una red libre de canales debido a que los canales disminuyen o eliminan el problema por lo cual el analito u otros componentes de una muestra enlaza a sondas en o cerca de la superficie del acceso de bloque de red a sondas ubicadas en el interior de la red. Otra ventaja de las redes de la descripción es que la alta cantidad de carga de analito posible por los canales permite una detección más sensible de analito de lo que puede ser posible con una red libre de canales, esto es, la relación señal a ruido se puede mejorar comparado con redes libres de canales debido a que una cantidad dada de analito se puede concentrar en un volumen de red más pequeño. Aún otra ventaja de las redes de la descripción es que la alta carga de analito posible por los canales permite la cuantificación de un intervalo más amplio de concentraciones de analito comparada con redes libres de canales.
Esta descripción también proporciona matrices que comprenden una pluralidad de las redes tridimensionales de la descripción y un sustrato. Las matrices de la descripción se pueden usar para detectar y/o medir uno o más analitos en una o más muestras simultáneamente. Las matrices de la descripción se pueden lavar y reutilizar, proporcionando una ventaja de costo significativa sobre matrices de uso simple. Otra ventaja de las matrices de la descripción es que se pueden fabricar de una manera simple debido a que todos de los componentes necesarios para hacer una red individual se pueden aplicar como una mezcla simple sobre una superficie del sustrato durante el proceso de fabricación.
Esta descripción también proporciona procesos para hacer las redes tridimensionales y matrices de la descripción. Las redes tridimensionales de la descripción se pueden hacer al reticular un polímero en la presencia de cristales de sal, preferiblemente cristales de sal en forma de aguja, y posteriormente disolver los cristales de sal dejar atrás los canales en la red de polímero reticulado.
Esta descripción también proporciona procesos para usar las redes tridimensionales y matrices de la descripción para detectar y/o medir un analito en una muestra, preferiblemente una muestra líquida.
4. Breve descripción de los dibujos
La FIGURA 1 muestra una representación diagramática de una mezcla que tiene una biomolécula de sonda (1) y un polímero (3) que comprende dos grupos fotoreactivos (4) por molécula disuelta en una solución de sal acuosa.
La FIGURA 2 muestra una sección transversal a través de una gota de la mezcla (5) mostrada en la FIGURA 1 que tiene una superficie (10) ubicada en un lugar (7) de una superficie orgánica (2) que se coloca en un soporte calentado (6).
La FIGURA 3 muestra una sección transversal a través de la configuración mostrada en la FIGURA 2 después de que la mezcla se ha calentado y los cristales de sal en forma de aguja (8) que se extienden desde gérmenes de cristalización (9) se han formado en la solución de sal.
La FIGURA 4 muestra una sección transversal a través de la configuración mostrada en la FIGURA 3 después de que la mezcla se ha secado e irradiado con radiación óptica (11) para formar una red de polímero (15) que tiene una superficie (16).
La FIGURA 5 muestra una representación diagramática de la mezcla de la FIGURA 1 después de la irradiación con radiación óptica.
La FIGURA 6 muestra una sección transversal a través de la configuración mostrada en la FIGURA 4 después de disolver los cristales de sal en un solvente (12), formando canales (13).
La FIGURA 7 muestra una sección transversal a través de la configuración mostrada en la FIGURA 2 después de que la mezcla se ha enfriado en un soporte refrigerado (14) y los cristales de sal en forma de aguja se han formado en la solución de sal.
La FIGURA 8 muestra una sección transversal a través de la configuración mostrada en la FIGURA 7 después de que la mezcla se ha secado e irradiado con irradiación óptica.
La FIGURA 9 muestra una sección transversal a través de la configuración mostrada en la FIGURA 8 después de la disolución de los cristales de sal con un solvente.
La FIGURA 10 muestra una trayectoria de reacción para la formación de p(Dimetilacrilamida co metacriloiloxibenzofenona co 4-vinilbencenosulfonato de Sodio).
La FIGURA 11 muestra una vista en perspectiva de un biochip (17) que tiene una superficie orgánica (2) sobre la cual las redes de polímero (15) están ubicadas en lugares (7) configurados como una matriz de filas y columnas.
La FIGURA 12 muestra una vista superior de un biochip (17) como se muestra en la FIGURA 11, donde cada red de polímero (15) tiene un diámetro (D), y donde las filas y columnas se separan por una distancia Y, y una distancia X, respectivamente, medidas desde los puntos centrales de las redes de polímero (15).
La FIGURA 13 muestra un biosensor (17') que comprende un banda de sustrato flexible (18) que tiene una superficie orgánica (2) sobre la cual las redes de polímero (15) que tienen un diámetro (D) están ubicadas en lugares (7) separados por la distancia X medida desde los puntos centrales de las redes de polímero.
La FIGURA 14 muestra una tabla mostrando el promedio de los valores medidos y error estándar de la media, para diferentes lugares en el Ejemplo 2.
La FIGURA 15 es una representación gráfica de la media de los valores medidos obtenidos por la matriz de la Sección 7.2.1.
La FIGURA 16 es una representación gráfica de la media de los valores medidos obtenidos por una matriz de la Sección 7.2.2.
5. Descripción detallada de la invención
5.1. Redes Poliméricas Tridimensionales
Las redes tridimensionales de la descripción comprenden un polímero reticulado, por ejemplo, un polímero de acuerdo a Rendl et al., 2011, Langmuir 27: 6116-6123 o US 2008/0293592. Las redes tridimensionales de la descripción además comprenden uno o más canales y opcionalmente además pueden comprender una o más sondas inmovilizadas en la red.
Los polímeros que se pueden usar para hacer las redes se describen en la Sección 5.1.1. Los reticuladores que se pueden usar para hacer las redes se describen en la Sección 5.1.2. Los rasgos de uno o más canales se describen
en la Sección 5.1.3. Las sondas que se puede inmovilizar en las redes se describen en la Sección 5.1.4.
5.1.1. Polímeros
Las redes tridimensionales de la descripción pueden comprender un homopolímero reticulado, copolímero, mezclas de homopolímeros, mezclas de copolímeros, o mezclas de uno o más homopolímeros y uno o más copolímeros. El término “polímero” como se usa en la presente incluye ambos homopolímeros y/o copolímeros. El término “copolímero” como se usa en la presente incluye polímeros polimerizados de dos o más tipos de monómeros (por ejemplo, bipolímeros, terpolímeros, cuaterpolímeros, etc.). Los copolímeros incluyen copolímeros alternantes, copolímeros periódicos, copolímeros estadísticos, copolímeros al azar, copolímeros de bloque, copolímeros lineales y copolímeros ramificados. Las redes tridimensionales de la descripción pueden comprender cualquier combinación de los tipos anteriores de polímeros. Los reactivos y métodos para hacer tales polímeros se conocen en la técnica (ver, por ejemplo, Ravve, A., Principles of Polymers Chemistry, Springer Science Business Media, 1995; Cowie, J.M.G., Polymers: Chemistry & Physics of Modern Materials, 2nd Edition, Chapman & Hall, 1991; Chanda, M., Introduction to Polymers Science and Chemistry: A Problem-Solving Approach, 2nd Edition, CRC Press, 2013; Nicholson, J.W., The Chemistry of Polymers, 4th Edition, RSC Publishing, 2012; los contenidos de cada uno de los cuales se incorporan en la presente como referencia en su totalidad).
Los polímeros preferidos son hidrofílicos y/o contienen grupos hidrofílicos. El polímero puede ser soluble en agua. En una modalidad, el polímero es un copolímero que se ha polimerizado desde dos o más especies de monómeros seleccionados para proporcionar un nivel deseado de solubilidad del agua. Por ejemplo, la solubilidad del agua de un copolímero se puede controlar al variar la cantidad de un monómero cargado, por ejemplo, 4-vinilsulfonato de sodio, usado para hacer el copolímero.
Cuando se reticulan, los polímeros solubles en agua forman hidrogeles o geles hinchables en agua. Los hidrogeles absorben soluciones acuosas a través de enlaces de hidrógeno con moléculas de agua. La absorbencia total y capacidad de hinchamiento de un hidrogel se puede controlar por el tipo y grado de reticuladores usados para hacer el gel. Los polímeros de densidad de reticulación baja generalmente tienen una mayor capacidad de absorción e hinchamiento en mayor grado que los polímeros de densidad de reticulación alta, pero la fuerza del gel de polímeros de densidad de reticulación alta es más firme y puede mantener la forma de la red incluso bajo presión modesta.
La capacidad de un hidrogel para absorber agua es un factor de la concentración iónica de la solución acuosa. En ciertas modalidades, un hidrogel de la descripción puede absorber hasta 50 veces su peso (desde 5 hasta 50 veces su propio volumen) en agua desionizada, destilada y hasta 30 veces su peso (desde 4 hasta 30 veces su propio volumen) en solución salina. La absorbencia reducida en solución salina es debido a la presencia de cationes de valencia, que impiden la capacidad del polímero para enlazarse con la molécula de agua.
La red tridimensional de la descripción puede comprender un copolímero que se ha polimerizado desde uno, dos, tres, o más que tres especies de monómeros, en donde uno, dos, tres o más de tres de las especies de monómeros tienen un grupo polimerizable seleccionado independientemente de un grupo de acrilato (por ejemplo, acrilato, metacrilato, metacrilato de metilo, metacrilato de hidroxietilo, acrilato de etilo, acrilato de 2-fenilo), un grupo de acrilamida (por ejemplo, acrilamida, metacrilamida, dimetilacrilamida, etilacrilamida), un grupo de itaconato (por ejemplo, itaconato, itaconato de 4-metilo, itaconato de dimetil) y un grupo de estireno (por ejemplo estireno, estireno de 4-metilo, 4-etoxiestireno). Los grupos polimerizables preferidos son acrilato, metacrilato, etacrilato, acrilato de 2-fenilo, acrilamida, metacrilamida, itaconato, y estireno. En algunas modalidades, uno de los monómeros usados para hacer el copolímero se carga, por ejemplo, 4-vinilbencenosulfonato de sodio.
El polímero usado para hacer una red de la descripción puede comprender al menos uno, al menos dos, o más de dos grupos reticuladores por molécula. Un grupo reticulador es un grupo que enlaza covalentemente las moléculas de polímero de la red una a la otra y, opcionalmente, a sondas y/o a sustrato. Los copolímeros que se han polimerizado desde dos o más monómeros (por ejemplo, monómeros que tienen un grupo polimerizable seleccionados independientemente de aquellos descritos en el párrafo anterior), al menos uno de los cuales comprenden un reticulador, son adecuados para hacer una red tridimensional de la descripción. Reticuladores ejemplares se describen en la Sección 5.1.2. Un monómero preferido que comprende un reticulador es metacriloiloxibenzofenona (MABP) (ver la FIGURA 10).
En una modalidad preferida, el copolímero es un bipolímero o un terpolímero que comprende un reticulador. En una modalidad particularmente preferida, el copolímero comprende p(Dimetilacrilamida co metacriloiloxibenzofenona co 4-vinilbencenosulfonato de Sodio) (ver FIGURA 10).
5.1.2. Reticuladores
Los reactivos de reticulación (o reticuladores) adecuados para hacer las reticulaciones en las redes tridimensionales incluyen aquellos activados por luz ultravioleta (por ejemplo, luz UV de onda larga), luz visible, y calor. Los reticuladores ejemplares activados por luz UV incluyen benzofenona, tioxantonas (por ejemplo, tioxanten-9-ona, 10-metilfenotiazina) y éteres de benzoína (por ejemplo, benzoína metil éter, benzoína etil éter). Los reticuladores ejemplares activados por luz visible incluyen etil eosina, eosina Y, rosa de Bengala, canforquinona y eritirosina. Los reticuladores ejemplares activados por calor incluyen ácido 4,4' azobis(4-cianopentanoico), y 2,2-azobis[2-(2-imidazolin-2il)propano]diclorhidrato, y peróxido de benzoilo. Otros reticuladores conocidos en la técnica, por ejemplo, aquellos que son capaces de formar radicales u otros grupos reactivos tras irradiarse, también se pueden usar.
5.1.3. Canales
Las redes tridimensionales de la descripción contienen uno o más canales.
Como se usa en la presente, un “canal” es un pasaje alargado en una red que (1) es sustancialmente recta, y (2) en el estado hidratado de la red, tiene una sección transversal mínima que es al menos 500 nm y una longitud que es al menos cinco veces, y preferiblemente al menos diez veces, la sección transversal mínima del paso. Por ejemplo, la longitud del canal puede ser 5 hasta 15 veces, 5 hasta 10 veces, o 10 hasta 15 veces la sección transversal mínima del canal. Un canal que es “sustancialmente recto” es uno que se extiende desde un punto de nucleación en una dirección sin cambiar la dirección más de 45 grados en cualquier dirección, esto es, la dirección X, Y o Z.
El “estado hidratado de la red” significa que la red está en equilibrio con respecto a absorción de agua, esto es, absorbe en solución acuosa tanta agua como emite.
Los canales pueden permitir el acceso al interior de la red. Aunque los canales pueden tener una sección transversal de canal relativamente grande, la red puede permanecer mecánicamente estable debido a que el tamaño de la malla de la red puede ser significativamente más pequeño que la sección transversal de canal. Los canales pueden formar una especie de carretera, a través de la cual los analitos pueden ingresar rápidamente en el interior de la red. El transporte de los analitos se puede efectuar en el canal por difusión y/o convección.
Los canales pueden extenderse desde una superficie o cerca de la superficie de la red en el interior de la red. Por ejemplo, uno o más canales pueden extenderse desde un punto que es menos de 10 micras, menos de 9 micras, menos de 8 micras, menos de 7 micras, menos de 6 micras, menos de 5 micras, menos de 4 micras, menos de 3 micras, menos de 2 micras, menos de 1 micra desde la superficie de la red, o se extienden en el interior desde un punto en la superficie de la red. La red puede contener una pluralidad de canales (por ejemplo, 2 hasta 100, 2 hasta 50, 2 hasta 25, 2 hasta 10, 10 hasta 50, 10 hasta 25, o 25 hasta 50), cada uno de los cuales pueden extenderse desde una superficie o cerca de una superficie de la red en el interior de la red. En modalidades preferidas, la red contiene 10, 20, 30, 40 o 50 canales, o un número de canales que varían entre cualquiera de dos de los valores anteriores (por ejemplo, 10 hasta 50, 20 hasta 40, 30 hasta 50, 10 hasta 20, 20 hasta 30, 30 hasta 40, o 40 hasta 50 canales). En una modalidad preferida específica, la red contiene 10 hasta 50 canales.
En algunas modalidades, la longitud de al menos un canal es 10 hasta 100%, 10% hasta 90%, 10% hasta 80%, 10% hasta 70%, 10% hasta 60%, 10% hasta 50%, 10% hasta 40%, 10% hasta 30%, 10% hasta 15%, 10% hasta 20%, 10% hasta 25%, 10 hasta 30%, 15% hasta 20%, 15% hasta 25%, 15% hasta 30%, 20 hasta 25%, o 25% hasta 30% de la dimensión más grande de la red. En modalidades preferidas, la longitud de al menos un canal es aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40% o 50% de la dimensión más grande de la red, y en algunas modalidades tiene una longitud que varía entre cualquier par de las modalidades anteriores (por ejemplo, 10% hasta 50%, 10% hasta 30%, 30% hasta 50%, 10% hasta 20%, 20% hasta 30%, 30% hasta 40%, o 40% hasta 50% de la dimensión más grande de la red). En una modalidad preferida específica, la longitud es 10% hasta 50% de la dimensión más grande de la red.
En algunas modalidades, la red comprende al menos un canal que tiene una sección transversal mínima de al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 15 veces, o al menos 20 veces el tamaño de la malla (por ejemplo, 5 hasta 10 veces, 5 hasta 15 veces, 5 hasta 20 veces, 5 hasta 25 veces, 5 hasta 30 veces, 10 hasta 15 veces, 10 hasta 20 veces, 10 hasta 25 veces, 10 hasta 30 veces, 10 hasta 15 veces, 10 hasta 20 veces, 10 hasta 25 veces, 10 hasta 30 veces, 15 hasta 20 veces, 15 hasta 25 veces, 15 hasta 30 veces, 20 hasta 25 veces, 20 hasta 30 veces, o 25 hasta 30 veces el tamaño de la malla de la red). En modalidades preferidas, la red comprende al menos un canal que tiene una sección transversal mínima de 10 hasta 30 veces el tamaño de la malla. Esto asegura una alta estabilidad de la red de polímero, y también puede prevenir la penetración y enlace de la red por grandes moléculas indeseables o componentes en una muestra.
La red puede tener una tamaño de malla (medido en el estado hidratado de la red) de, por ejemplo, 5 hasta 75 nm (por ejemplo, 10 hasta 20 nm, 10 hasta 30 nm, 10 hasta 40 nm, 10 hasta 50 nm, 20 hasta 30 nm, 20 hasta 40 nm, 20 hasta 50 nm, 30 hasta 40 nm, 30 hasta 50 nm, o 40 hasta 50 nm).
Las redes de la descripción pueden comprender una pluralidad de canales (por ejemplo, 2 hasta 100, 2 hasta 50, 2 hasta 25, 2 hasta 10, 10 hasta 50, 10 hasta 25, o 25 hasta 50), y cada canal independientemente puede tener uno o más de los rasgos descritos en esta sección. En algunas modalidades, la mayoría de los canales tienen uno o más rasgos descritos en esta sección. En una modalidad preferida específica, la red contiene 10 hasta 50 canales que cada uno tiene uno o más de los rasgos descritos en esta sección.
Las redes tridimensionales preferidas contienen una pluralidad de canales que convergen en un punto ubicado dentro de la red, y están configurados tal que, comenzando desde la superficie de la red hacia el interior, la distancia lateral entre los canales disminuye. En algunas modalidades, una pluralidad de canales aproximadamente se extiende radialmente lejos de un punto situado en el interior de la red. En algunas modalidades, la red tridimensional contiene múltiples pluralidades de canales (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 pluralidades de canales), cada pluralidad
convergiendo en un punto diferente dentro de la red. En ciertos aspectos, una pluralidad (o cada pluralidad) se conecta en el punto de su convergencia.
La presencia de un canal en una red se puede verificar usando el siguiente procedimiento:
La red se pone en contacto con un líquido acuoso a temperatura ambiente, por ejemplo, en un tazón. El líquido contiene una pluralidad de nanopartículas que son más grandes que el tamaño de la malla de la red y más pequeñas que la sección transversal mínima del canal. Así, las nanopartículas pueden ingresan al canal y se extendió a lo largo del canal. Sin estar limitado por la teoría, se cree que esto puede ocurrir debido al movimiento molecular browniano y/o convección a través del líquido en el canal. Tales nanopartículas se conocen como puntos cuánticos. Ellos pueden, por ejemplo, tener un diámetro de alrededor de 10 nanómetros.
Un periodo de incubación se selecciona para que la red en el líquido esté completamente hidratada, esto es, que la red en promedio toma la misma cantidad de agua que libera. El periodo de incubación puede ser, por ejemplo, una hora. La penetración de las nanopartículas en el canal se puede acelerar poniendo en movimiento la red y/o el líquido durante la incubación, por ejemplo, al vibrar la red y/o líquido, preferiblemente por medio de ondas ultrasónicas.
Después de la terminación de la incubación, el líquido se separa de la red, por ejemplo, al drenar el líquido del tazón o sacando la red del tazón.
Entonces, la red hidratada se congela, por ejemplo, por medio de nitrógeno líquido. Después, la red congelada se puede cortar con la ayuda de un criomicrotomo a lo largo de planos de corte mutuamente paralelos en cortes delgados. Los planos de corte están configurados transversalmente a la extensión longitudinal del canal y penetran el canal. El corte se lleva a cabo preferiblemente usando una cuchilla de diamante enfriada con nitrógeno líquido. El espesor de los cortes puede ser, por ejemplo, alrededor de 100 nm o 200 nm.
Con la ayuda de un microscopio, las nanopartículas colocadas en los discos obtenidos al cortar la red congelada están ubicadas. Las nanopartículas pueden ser fluorescentes y ópticamente resaltadas para que se puedan distinguir mejor de la red, si es necesario. La ubicación de las nanopartículas se puede hacer usando un software adecuado con métodos de procesamiento de imagen. Para examinar los discos, preferiblemente un microscopio de exploración láser de microscopio confocal con óptica de fluorescencia o un microscopio electrónico se usa.
La geometría y/o información de posición de las nanopartículas obtenidas de esta manera pueden ser, con la ayuda de una computadora, usadas para hacer un modelo geométrico tridimensional de distribución de las nanopartículas en la red. El modelo luego se puede usar para determinar si la configuración de las nanopartículas en la red comprende al menos una región sustancialmente recta cuya sección transversal no está en ningún lugar más pequeño que 500 nm y cuya longitud corresponde al menos al quíntuple de su sección transversal más pequeña. Si está condición se cumple, se determina que la red comprende al menos un canal.
Alternativamente, la distribución tridimensional de las nanopartículas se puede determinar en la red por medio de tomografía por computadora con rayos X micro-3D.
5.1.4. Sondas
Una sonda inmovilizada en la red de la descripción puede ser una biomolécula o una molécula que se enlaza a una biomolécula, por ejemplo, un compañero de un sistema específicamente interactivo de compañeros de enlace complementarios (receptor/ligando). Por ejemplo, las sondas pueden comprender ácidos nucleicos y sus derivados (tal como ARN, ADN, ácidos nucleicos bloqueados (LNA), y ácidos nucleicos de péptido (PNA)), proteínas, péptidos, polipéptidos y sus derivados (tal como glucosamina, anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, y enzimas), lípidos (por ejemplo, fosfolípidos, ácidos grasos tal como ácido araquidónico, monoglicéridos, diglicéridos, y triglicéridos), carbohidratos, inhibidores de enzima, sustratos de enzima, antígenos, y epítopos. Las sondas también pueden comprender estructuras más grandes y compuestas tal como liposomas, membranas y fragmentos de membrana, células, lisados celulares, fragmentos de células, esporas, y microorganismos.
Un sistema específicamente interactivo de compañeros de enlace complementarios se puede basar en, por ejemplo, la interacción de un ácido nucleico con un ácido nucleico complementario, la interacción de un PNA con un ácido nucleico, o la interacción enzima/sustrato, receptor/ligando, lectina/azúcar, anticuerpo/antígeno, avidina/biotina o estreptavidina/biotina.
Las sondas de ácido nucleico pueden ser un ADN o un ARN, por ejemplo, un oligonucleótido o un aptómero, un LNA, PNA, o un ADN que comprenden un grupo metacrilo en el extremo 5' (Acrydite™ 5'). Las sondas de oligonucleótido pueden ser, por ejemplo, 12 hasta 30, 14 hasta 30, 14 hasta 25, 14 hasta 20, 15 hasta 30, 15 hasta 25, 15 hasta 20, 16 hasta 30, 16 hasta 25, 16 hasta 20, 15 hasta 40, 15 hasta 45, 15 hasta 50, 15 hasta 60, 20 hasta 55, 18 hasta 60, 20 hasta 50, 30 hasta 90, 20 hasta 100, 20 hasta 60, 40 hasta 80, 40 hasta 100, 20 hasta 120, 20 hasta 40, 40 hasta 60, 60 hasta 80, 80 hasta 100, 100 hasta 120 o 12 hasta 150 nucleótidos de largo. En modalidades preferidas, la sonda de oligonucleótido es 15 hasta 60 nucleótidos de longitud.
Cuando se usa una sonda de ácido nucleico, toda o únicamente una porción de la sonda puede ser complementaria
a la secuencia objetivo. La porción de la sonda complementaria a la secuencia objetivo es preferiblemente al menos 12 nucleótidos en longitud, y más preferiblemente al menos 15, al menos 18 o al menos 20 nucleótidos en longitud. Para sondas de ácido nucleico de mayor longitud que 40 o 50 nucleótidos, la porción de la sonda complementaria a la secuencia objetivo puede ser al menos 25, al menos 30 o al menos 35 nucleótidos en longitud.
El anticuerpo puede ser, por ejemplo, un anticuerpo policlonal, monoclonal, o quimérico o un fragmento de enlace al antígeno del mismo (esto es, “porción de enlace al antígeno”) o cadena simple del mismo, proteínas fusión que comprenden un anticuerpo, y cualquier otra configuración modificada de la molécula de inmunoglobulina que comprende un sitio de reconocimiento de antígeno, que incluye, por ejemplo sin limitación, cadena simple (scFv) y anticuerpos de dominio (por ejemplo, anticuerpos de dominio de humano, de camélido, o de tiburón), maxicuerpos, minicuerpos, intracuerpos, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, vNAR y bis-scFv (ver por ejemplo, Hollinger and Hudson, 2005, Nature Biotech 23:1 126-1136). Un anticuerpo incluye un anticuerpo de cualquier clase, tal como IgG, IgA, o IgM (o subclase del mismo), y el anticuerpo no necesita ser de ninguna clase en particular. Dependiendo de la secuencia de aminoácido de anticuerpo del dominio constante de sus cadenas pesadas, inmunoglobulinas se puede asignar a diferentes clases. Existen cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG, y IgM, y diversas de estas se pueden dividir además en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG-i, IgG2 , IgG3 , IgG4 , IgA1 y IgA2. El “anticuerpo” también abarca cualquiera de cada uno de los tipos de anticuerpo/inmunoglobulina precedentes.
Las redes tridimensionales de la descripción pueden comprender una especie simple de sonda o más de una especie de sonda (por ejemplo, 2, 3, 4, o 5 o más especies). Las redes tridimensionales pueden comprender más de una especie de sonda para el mismo objetivo (por ejemplo, anticuerpos que enlazan diferentes epítopos del mismo objetivo) y/o comprenden sondas que enlazan múltiples objetivos.
Las redes pueden comprender un molécula de sonda de control etiquetada (por ejemplo, fluorescentemente etiquetada) que se puede usar, por ejemplo, para medir la cantidad de sonda presente en la red.
Las sondas se pueden distribuir en toda la red (por ejemplo, en una superficie y el interior de una red). Preferiblemente, al menos una sonda se coloca lejos de la superficie de la red y contigua a al menos un canal. Una sonda así ubicada entonces es directamente accesible para moléculas de analito o componentes de analito a través del canal. En algunas modalidades, una mayoría de las sondas están ubicadas en el interior de la red.
Una o más sondas se pueden inmovilizar en la red covalentemente o no covalentemente. Por ejemplo, una sonda puede ser reticulada al polímero reticulado o una sonda se puede enlazar no covalentemente a la red (tal como al enlazar a una molécula covalentemente enlazada a la red). En una modalidad preferida, una o más sondas están reticuladas al polímero reticulado. En algunas modalidades, una mayoría de las sondas se enlazan covalentemente en el interior de la red (por ejemplo, tal que al menos una porción de las sondas colinda con un canal).
Sin estar limitado por la teoría, los inventores creen que los procesos descritos en la Sección 5.3 para fabricar redes tridimensionales en la presencia de cristales de sal (particularmente cristales de sal de fosfato) pueden resultar en una mayor concentración de molécula de sonda en o cerca de la interfaz entre el polímero y el canal debido a interacciones electrostáticas entre las moléculas de sonda (particularmente moléculas de sonda de ácido nucleico) y los cristales de sal. En consecuencia, en algunas modalidades de la invención, la descripción proporciona redes de acuerdo a la descripción en la cual la densidad de la sonda es mayor en la interfaz entre el polímero y los canales que dentro de las regiones del polímero no es contiguo a un canal. En diversas modalidades, la densidad de la sonda es al menos 10%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, o al menos 50% más densa en la interfaz entre el polímero y los canales que dentro de las regiones del polímero no contiguo a un canal.
La densidad de molécula de sonda en una red se puede verificar usando el siguiente procedimiento:
La red se pone en contacto con un líquido acuoso a temperatura ambiente, por ejemplo, en un tazón. El líquido contiene una pluralidad de nanopartículas enlazadas a una porción que interactúa con las moléculas de sonda en la red, por ejemplo estreptavidina si las moléculas de sonda están biotiniladas. El tamaño de las nanopartículas es más pequeño que el tamaño de la malla de la red y más pequeñas que la sección transversal mínima del canal para permitir a las nanopartículas volverse a distribuir en todo el polímero. Las nanopartículas adecuadas son puntos cuánticos 2-5 nanómetros de diámetro.
Un periodo de incubación se selecciona para que la red en el líquido este completamente hidratada, esto es, que la red en promedio tome la misma cantidad de agua como la libera. El periodo de incubación puede ser, por ejemplo, una hora. La penetración de las nanopartículas en la red se puede acelerar poniendo en movimiento la red y/o el líquido durante la incubación, por ejemplo, al vibrar la red y/o líquido, preferiblemente por medio de ondas ultrasónicas.
Después de la terminación de la incubación, el líquido se separa de la red, por ejemplo, al drenar el líquido del tazón o sacando la red del tazón.
Entonces, la red hidratada se congela, por ejemplo, por medio de nitrógeno líquido. Después de eso, la red congelada se puede cortar con la ayuda de un criomicrotomo a lo largo de los planos de corte mutuamente paralelos en cortes delgados. Los planos de corte están configurados transversalmente a la extensión longitudinal del canal y penetran el canal. El corte se lleva a cabo preferiblemente usando una cuchilla de diamante enfriada con nitrógeno líquido. El
espesor de los cortes puede ser, por ejemplo, alrededor de 100 nm o 200 nm.
Con la ayuda de un microscopio, las nanopartículas colocadas en los discos obtenidos al cortar la red congelada se colocan. Las nanopartículas pueden ser fluorescentes y ópticamente resaltadas para que se puedan distinguir mejor de la red, si es necesario. La ubicación de las nanopartículas se puede hacer usando un software adecuado con métodos de procesamiento de imagen. Para examinar los discos, preferiblemente un microscopio de exploración láser de microscopio confocal con óptica de fluorescencia o un microscopio electrónico se usa.
La geometría e/o información de posición de las nanopartículas obtenidas de esta manera puede ser, con la ayuda de una computadora, usada para hacer un modelo geométrico tridimensional de distribución de las nanopartículas en la red. El modelo luego se puede usar para determinar si la distribución de nanopartículas refleja una mayor densidad de moléculas de sonda cerca de sitios de canales.
5.2. Matrices
Las redes tridimensionales de la descripción se pueden colocar (por ejemplo, depositar) en un sustrato, y están preferiblemente inmovilizadas en un sustrato (por ejemplo, por reticulaciones covalentes entre la red y el sustrato). Una pluralidad de redes se puede inmovilizar en un sustrato para formar una matriz útil, por ejemplo, como un biochip.
Los sustratos adecuados incluyen polímeros orgánicos, por ejemplo, copolímeros de cicloolefina (COCs), poliestireno, polietileno, polipropileno y polimetilmetacrilato (PMMA, Plexiglas®). Ticona comercializa un ejemplo de un COC adecuado bajo el nombre comercial Topas®. Los materiales inorgánicos (por ejemplo, metal, vidrio) también se pueden usar como un sustrato. Tales sustratos se pueden cubrir con moléculas orgánicas para permitir reticulaciones entre la red y una superficie del sustrato. Por ejemplo, superficies inorgánicas se pueden cubrir con monocapas autoensambladas (SAMs). Las SAMs pueden ser ellas mismas completamente no reactivas y así comprenden o consisten de, por ejemplo, silanos de alquilo puro. Otros sustratos también pueden ser adecuados para la reticulación a la red tridimensional siempre que puedan ingresar en enlaces estables con moléculas orgánicas durante los procesos de radical libre (por ejemplo, compuestos de organoboro).
El sustrato puede ser rígido o flexible. En algunas modalidades, el sustrato está en la forma de una placa (por ejemplo, una placa rectangular, una placa cuadrada, un disco circular, etc). Por ejemplo, el sustrato puede comprender una placa de micropocillo, y las redes tridimensionales se pueden colocar en los pocillos de la placa.
Las redes individuales se pueden colocar en puntos distintos en una superficie del sustrato, por ejemplo, en una matriz que comprende una pluralidad de columnas y filas. En la modalidad mostrada en la FIGURA 11, las redes están ubicadas en 36 puntos configurados en seis columnas y seis filas. Las matrices que tienen diferentes números de filas y columnas, el número de cada una de los cuales se puede seleccionar independientemente, se contemplan (por ejemplo, 2 hasta 64 columnas y 2 hasta 64 filas). Las columnas se pueden separar por una distancia X y las filas se pueden separar por una distancia Y (por ejemplo, como se muestra en la FIGURA 12) para formar una cuadrícula de puntos sobre la cual las redes individuales se pueden ubicar. X e Y se pueden seleccionar para que las redes, ubicadas en los puntos de la cuadrícula, no se contacten en el estado deshidratado y no se contacten en el estado hidratado. Las dimensiones X e Y pueden ser las mismas o diferentes. En algunas modalidades, X e Y son las mismas. En algunas modalidades, X e Y son diferentes. En algunas modalidades, X e Y se seleccionan independientemente de las distancias de al menos alrededor de 500 pm (por ejemplo, 500 pm hasta 5 mm, 500 pm hasta 4 mm, 500 pm hasta 3 mm, 500 pm hasta 2 mm, o 500 pm hasta 1 mm). En algunas modalidades, X e Y ambas son alrededor de 500 pm. En otras modalidades, X e Y ambas son 500 pm.
En algunas modalidades, el sustrato tiene forma de banda (por ejemplo, como se muestra en la FIGURA 13). Las redes se pueden configurar como una fila simple que se extiende en la dirección longitudinal de una superficie orgánica en forma de banda, o se pueden configurar como múltiples filas que se extienden en la dirección longitudinal de la superficie en forma de banda. Las filas y columnas en tales matrices en forma de banda pueden tener dimensiones de cuadrícula X e Y como se describió anteriormente.
Las redes individuales cada una puede cubrir un área de la superficie de la matriz que es circular o sustancialmente circular. Típicamente, el diámetro del área en la superficie de la matriz cubierta por las redes individuales (esto es, el diámetro del punto) es 80 pm hasta 1000 pm. En diversas modalidades, el diámetro del punto es 80 pm, 100 pm, 120 pm, 140 pm, 160 pm, 180 pm, 200 pm, 300 pm, 400 pm, 500 pm, 600 pm, 700 pm, 800 pm, 900 pm, o 1000 pm, o seleccionado de un intervalo limitado por cualquiera de dos de las modalidades anteriores, por ejemplo, 80 pm hasta 200 pm, 100 pm hasta 120 pm, 120 pm hasta 140 pm, 120 pm hasta 180 pm, 140 pm hasta 160 pm, 160 pm hasta 180 pm, 180 pm hasta 200 pm, 120 pm hasta 200 pm, 100 pm hasta 400 pm, 160 pm hasta 600 pm, o 120 pm hasta 700 pm, y y así sucesivamente. En una modalidad preferida, los intervalos de diámetro desde 100 pm hasta 200 pm o un subintervalo del mismo.
Las matrices de la descripción típicamente tienen al menos 8 redes tridimensionales individuales. En ciertos aspectos, las matrices tienen al menos 16, al menos 24, al menos 48, al menos 96, al menos 128, al menos 256, al menos 512, o al menos 1024 redes tridimensionales individuales. En algunas modalidades, las matrices de la descripción tienen 24, 48, 96, 128, 256, 512, 1024, 2048, 4096 o 8192 redes individuales, o tienen un número de redes tridimensionales seleccionadas de un intervalo limitado cualquiera de dos de las modalidades anteriores, por ejemplo, desde 8 hasta
128, 8 hasta 512, 24 hasta 8192, 24 hasta 4096, 48 hasta 2048, 96 hasta 512, 128 hasta 1024, 24 hasta 1024, 48 hasta 512, 96 hasta 1024, o 128 hasta 512 redes tridimensionales, y así sucesivamente. En una modalidad preferida, el número de redes tridimensionales en una matriz varía desde 8 hasta 1024. En una modalidad particularmente preferida, el número de redes tridimensionales en una matriz varía desde 25 hasta 400.
Las redes individuales que comprenden las matrices de la descripción pueden tener sondas idénticas o diferentes (por ejemplo, cada red puede tener un conjunto único de sondas, múltiples redes pueden tener el mismo conjunto de sondas y otras redes pueden tener un conjunto diferente o conjuntos de sondas, o todas de las redes pueden tener el mismo conjunto de sondas). Por ejemplo, las redes configuradas en la misma fila de una matriz pueden comprender las mismas sondas y las redes configuradas en diferentes filas de la matriz pueden tener diferentes sondas.
Típicamente, las redes individuales en una matriz varían por no más de 20%, no más de 15%, no más de 10% o no más de 5% el uno del otro por diámetro de punto y/o volumen de red.
En algunas modalidades, las matrices comprenden una o más redes individuales (por ejemplo, puntos en una matriz) con uno o más oligonucleótidos de control o moléculas de sonda. Los oligonucleótidos de control se pueden etiquetar, por ejemplo, etiquetado fluorescentemente, para uso como un control espacial (para orientar espacialmente la matriz) y/o una cuantificación de la cantidad de moléculas de sonda que enlaza a las redes, por ejemplo, cuando se lava y reutiliza una matriz de la descripción (esto es, como un “control de reutilización”). Las sondas de control espacial y de reutilización (que pueden ser las mismas o diferentes sondas) se mencionan en la Sección 7.2 como una “ luz de aterrizaje”, donde la misma sonda se usa para ambos propósitos.
El mismo punto en la matriz o un punto diferente en la matriz pueden además incluir una sonda no etiquetada que es complementaria a un objetivo conocido. Cuando se usa en un ensayo de hibridación, que determina la intensidad de la señal de hibridación de la sonda no etiquetada al objetivo etiquetado puede determinar la eficacia de la reacción de hibridación. Cuando una red individual (esto es, un punto en una matriz) se usa tanto como un control de reutilización y/o espacial y un control de hibridación, una porción fluorescente diferente se puede usar para etiquetar la molécula objetivo que la porción fluorescente de las sondas de control de reutilización o control espacial.
En algunas modalidades, las matrices de la descripción se pueden reutilizar al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 30 veces, al menos 40 veces, o al menos 50 veces (por ejemplo, 5 hasta 20 veces, 5 hasta 30 veces, 10 hasta 50 veces, 10 hasta 20 veces, 10 hasta 30 veces, 20 hasta 40 veces, o 40 hasta 50 veces, preferiblemente comprenden reutilizar la matriz 10 hasta 50 veces). La matriz se puede lavar en una solución de sal bajo condiciones desnaturalizantes (por ejemplo, baja concentración de sal y alta temperatura). Por ejemplo, la matriz se puede lavar con una solución amortiguadora de fosfato 1-10 mM a 80-90°C entre usos. La temperatura del lavado se puede seleccionar basado sobre la longitud (Tm) del objetivo:sonda híbrida.
La integridad de una matriz se puede determinar por una sonda de “control de reutilización”. La sonda de control de reutilización puede ser fluorescentemente etiquetada o se puede detectar por hibridación a un ácido nucleico complementario fluorescentemente etiquetado. La etiqueta fluorescente de una sonda de control de reutilización fluorescentemente etiquetada se puede blanquear por excitación repetida, antes de que la integridad del ácido nucleico este comprometida; en tales casos cualquier reutilización adicional puede incluir detección de hibridación a un ácido nucleico complementario fluorescentemente etiquetado como un control. Típicamente, una matriz de la invención es estable por al menos 6 meses.
En diversas modalidades, una sonda de control de reutilización fluorescentemente etiquetada conserva al menos 99%, 95% 90%, 80%, 70%, 60%, o 50% de su fuerza de señal de la fluorescencia inicial después de 5, 10, 20, 30, 40, o 50 usos. Preferiblemente, la sonda de control de reutilización conserva al menos 75% de su fuerza de señal de la fluorescencia después de 5 o 10 usos. Una matriz puede continuar siendo reutilizada hasta que la sonda de control de reutilización conserva al menos 50% de su fuerza de señal de la fluorescencia, por ejemplo después de 20, 30, 40 o 50 reutilizaciones. La fuerza de señal fluorescente de la sonda de control se puede probar entre cada reutilización, cada otra reutilización, cada tercer reutilización, cada cuarta reutilización, cada quinta reutilización, cada sexta reutilización, cada séptima reutilización, cada octava reutilización, cada novena reutilización, cada décima reutilización, o una combinación de las anteriores. Por ejemplo, la fuerza de la señal se puede probar periódicamente entre 5 o 10 reutilizaciones inicialmente y la frecuencia de las pruebas aumento con el número de reutilizaciones tal que es probado después de cada reutilización después de un cierto número (por ejemplo, 5, 10, 20, 30, 40 o 50) de usos. En algunas modalidades, la frecuencia de los promedios de prueba una vez por cada 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 4, 5 o 10 usos, o promedios dentro de un intervalo limitado entre cualquiera de dos de los valores anteriores, por ejemplo, una vez por 1-2 usos, una vez por 1-1.5 usos, una vez por 1-3 usos, o una vez por 1.5-3 usos.
Se observa que la nomenclatura de “control espacial”, “control de reutilización” y “control de hibridación” está incluida por conveniencia y propósitos de referencia y no tiene la intención de connotar un requerimiento que las sondas referidas a “control espacial”, “control de reutilización” y “control de hibridación” se utilizarán como tal.
5.3. Procesos Para Hacer Redes Poliméricas Tridimensionales
En un aspecto, los procesos de la descripción para hacer redes poliméricas tridimensionales comprenden (a) exponer una mezcla que comprende una solución de sal acuosa, un polímero, un reticulador y, opcionalmente, una o más
sondas a las condiciones de formación del cristal de sal, (b) exponer la mezcla a condiciones de reticulación para reticular el polímero para formar una red de polímero reticulado, y (c) poner en contacto la red de polímero reticulado con un solvente para disolver los cristales de sal y formar uno o más canales.
Los procesos además pueden comprender una etapa de formar la mezcla al combinar una solución de sal acuosa, un polímero, un reticulador y, opcionalmente, una o más sondas, y/o además comprender una etapa de aplicar la mezcla a un sustrato (por ejemplo, un sustrato descrito en la Sección 5.2) antes de exponer la mezcla a condiciones de formación de sal. Si el polímero que se utiliza tiene un reticulador pre-enlazado (por ejemplo, cuando se usa un copolímero polimerizado de un monómero que comprende un reticulador), la etapa de formar la mezcla puede comprender combinar una solución de sal acuosa con el polímero y, opcionalmente, una o más sondas.
Los canales formados por la disolución de los cristales de sal pueden tener uno o más de los rasgos descritos en la Sección 5.1.3.
La mezcla se puede aplicar a un sustrato antes de exponer la mezcla a condiciones de formación de sal por ejemplo, al rociar la mezcla sobre una superficie del sustrato (por ejemplo, en 1024 sitios en la superficie). La mezcla se puede aplicar a la superficie usando un localizador de chip de ADN o impresora de chorro de tinta, por ejemplo. En una modalidad preferida, la mezcla se rocía usando una impresora de chorro de tinta. Esto permite una aplicación simple y rápida de la mezcla a un gran número de puntos en el sustrato. Los puntos se pueden configurar, por ejemplo, en la forma de una matriz en diversas filas y/o columnas. Preferiblemente, el contenido de sal en la mezcla durante la impresión está por debajo del límite de solubilidad para que la mezcla no se cristalice en la cabeza de impresión de la impresora. El volumen de mezcla aplicada en puntos individuales puede ser, por ejemplo, 100 pl, 200 pl, 300 pl, 400 pl, 500 pl, 750 pl, 1 nl, 2 nl, 3 nl, 4 nl, o 5 nl, o se puede seleccionar de un intervalo limitado por cualquiera de dos de los valores anteriores (por ejemplo, 100 pl hasta 5 nl, 100 pl hasta 1 nl, 300 pl hasta 1 nl, 200 pl hasta 750 nl, 100 pl hasta 500 pl, 200 pl hasta 2 nl, 500 pl hasta 2 nl 1 nl hasta 2 nl, y así sucesivamente). En modalidades preferidas, el volumen de punto es 200 pl hasta 4 nl.
El diámetro de los puntos individuales dependerá de la composición de la mezcla, el volumen de la mezcla aplicada, y la química superficial del sustrato. Los diámetros de punto típicamente varían entre 80 pm hasta 1000 pm y se puede obtener la variar los parámetros anteriores. En diversas modalidades, el diámetro de los puntos son 80 pm, 100 pm, 120 pm, 140 pm, 160 pm, 180 pm, 200 pm, 300 pm, 400 pm, 500 pm, 600 pm, 700 pm, 800 pm, 900 pm, o 1000 pm, o seleccionado de un intervalo limitado por cualquiera de dos de las modalidades anteriores, por ejemplo, 80 pm hasta 200 pm, 100 pm hasta 120 pm, 120 pm hasta 140 pm, 120 pm hasta 180 pm, 140 pm hasta 160 pm, 160 pm hasta 180 pm, 180 pm hasta 200 pm, 120 pm hasta 200 pm, 100 pm hasta 400 pm, 160 pm hasta 600 pm, o 120 pm hasta 700 pm, y así sucesivamente. En una modalidad preferida, los intervalos de diámetro desde 100 pm hasta 200 pm o un subintervalo del mismo.
Los polímeros adecuados, reticuladores, y sondas que se pueden usar en los procesos de la descripción se describen en las Secciones 5.1.1, 5.1.2, y 5.1.4, respectivamente. En algunas modalidades, el polímero usado en los procesos tiene al menos un grupo reticulador por molécula de polímero. En una modalidad preferida, el polímero tiene al menos dos grupos reticuladores por molécula. En una modalidad particularmente preferida, el polímero tiene al menos dos grupos reticuladores fotoreactivos por molécula. En estas modalidades, el polímero separado y moléculas reticuladoras no son necesarios
Las sales adecuadas que se pueden incluir en la mezcla se describen en la Sección 5.3.1. Las condiciones de formación de sal adecuadas se describen en la Sección 5.3.2. Las condiciones adecuadas de reticulación se describen en la Sección 5.3.3. Los solventes adecuados para disolver los cristales de sal se describen en la Sección 5.3.4.
5.3.1. Sal
La sal se puede seleccionar para su compatibilidad con una o más sondas. Idealmente, la sal tiene una o más de las siguientes características, (i) la sal no es tóxica a las sondas (por ejemplo, la sal no desnaturaliza las sondas), (ii) la sal no reacciona químicamente con las sondas, (iii) la sal no ataca los fluoróforos, tal como tintes de cianina, que son adecuados para el marcado óptico de sondas, (iv) la sal no reacciona con analitos, moléculas de detección, y/o compañeros de enlace enlazados a ello, y/o (v) la sal forma cristales en forma de aguja.
En una modalidad preferida, la solución de sal comprende cationes monovalentes. La mezcla puede comprender fosfato ácido de disodio y/o fosfato diácido de sodio que, en solución acuosa, libera cationes Na+ y iones de fosfato P043-. El fosfato de sodio es fácilmente soluble en agua y forma cristales incoloros.
En una modalidad particularmente preferida, la mezcla comprende fosfato ácido de dipotasio (K2HPO4) y/o fosfato diácido de potasio (KH2PO4). Estas sales son excelentemente solubles en agua y por lo tanto pueden formar un número correspondientemente grande de cristales de sal en forma de aguja en la mezcla.
5.3.2. Condiciones de Formación de Cristal de Sal
Las condiciones de formación de cristal de sal pueden comprender formar en la mezcla al menos un cristal de sal, preferiblemente un cristal de sal en forma de aguja, al deshidratar la mezcla o enfriar la mezcla hasta que el contenido
relativo de sal en la mezcla aumenta por encima del límite de solubilidad, significa que la mezcla está sobresaturada con la sal. Esto promueve la formación de cristales de sal de un germen de cristalización ubicado en el volumen de la mezcla hacia la superficie de la mezcla.
La mezcla se puede deshidratar al calentar la mezcla, exponiendo la mezcla a un vacío, y/o reduciendo la humedad de la atmósfera que rodea la mezcla.
La mezcla se puede calentar al colocar la mezcla en un sustrato calentado o superficie (por ejemplo, entre alrededor de 50°C hasta alrededor de 70°C), calentar el sustrato o superficie sobre la cual la mezcla se ha colocado (por ejemplo, hasta entre alrededor de 50°C hasta alrededor de 70°C), y/o poner en contacto la mezcla con un gas caliente (por ejemplo, aire, nitrógeno, o dióxido de carbono que tiene una temperatura que es mayor que la temperatura de la mezcla) tal que se evapora agua de la mezcla. El poner en contacto con el gas caliente puede, por ejemplo, ocurrir al colocar la mezcla en un horno de calentamiento. Durante el transporte al horno de calentamiento, la mezcla preferiblemente se mantiene húmeda, en particular en una humedad relativa de arriba del 75%. Como un resultado de esto, una formación no controlada de cristales de sal durante el transporte de la mezcla al horno de calentamiento es contrarrestado. Esto permite la formación de cristales de sal en forma de aguja, más largos en el horno de calentamiento. Al calentar la mezcla también es posible activar reticuladores térmicamente activables, si está presente, y reticula el polímero de este modo.
En algunas modalidades, la temperatura del sustrato calentado y/o aire usado para deshidratar la mezcla es 20°C o más arriba de la temperatura de la mezcla antes de calentar la mezcla, pero menos de 100°C.
La mezcla se puede enfriar al colocar la mezcla en un sustrato enfriado o superficie (por ejemplo, entre alrededor de 5°C hasta alrededor de 15°C), enfriando el sustrato o superficie sobre la cual la mezcla se ha colocado (por ejemplo, hasta entre alrededor de 5°C hasta alrededor de 15°C) y/o poniéndolo en contacto con un gas frío (por ejemplo, aire, nitrógeno, o dióxido de carbono que tiene una temperatura que es menor que la temperatura de la mezcla). Cuando se enfría, el límite de solubilidad dependiente de temperatura de la sal en la mezcla disminuye hasta que la mezcla está finalmente sobresaturada con la sal. La formación de uno o más cristales de sal, preferiblemente en forma de aguja, es promovido por esto. En algunas modalidades, la mezcla se enfría al incubarla en una cámara fría con baja humedad (por ejemplo, temperaturas entre 0°C y 10°C, humedad relativa < 40%).
La temperatura en la mezcla preferiblemente e mantiene por arriba del punto de rocío del aire ambiente que rodea la mezcla durante la formación de uno o más cristales de sal. Esto previene que la mezcla se diluya con agua condensada del aire ambiente, lo que podría llevar a una disminución en el contenido relativo de sal en la mezcla.
5.3.3. Condiciones de Reticulación
Las condiciones de reticulación se pueden seleccionar basadas sobre el tipo de reticulador usado. Por ejemplo, cuando se usa un reticulador activado por luz ultravioleta (por ejemplo, benzofenona, una tioxantona o un éter de benzoína), las condiciones de reticulación pueden comprender exponer la mezcla a luz ultravioleta (UV). En algunas modalidades, la luz UV que tiene una longitud de onda desde alrededor de 250 nm hasta alrededor de 360 nm se usa (por ejemplo, 260 ±20 nm o 355 ±20 nm). El uso de luz UV de menor energía/mayor longitud de onda (por ejemplo, 360 nm luz UV vs. 254 nm luz UV) puede requerir tiempos de exposición más largos. Cuando se usa un reticulador activados por luz visible (por ejemplo, eosina de etilo, eosina Y, rosa de Bengala, canforquinona o eritirosina), las condiciones de reticulación pueden comprender exponer la mezcla a luz visible. Cuando se usa un reticulador térmicamente activado (por ejemplo, ácido 4,4' azobis(4-cianopentanoico), y 2,2-azobis[2-(2-imidazolin-2-il) propano]diclorhidrato, o peróxido de benzoilo), las condiciones de reticulación pueden comprender exponer la mezcla a calor.
La longitud e intensidad de las condiciones de reticulación se pueden seleccionar para efectuar la reticulación de molécula de polímeros a otra molécula de polímeros, reticulación de molécula de polímeros a moléculas de sonda (si se presenta), y reticulación de molécula de polímeros a moléculas de sustrato o moléculas orgánicas presentes en el sustrato (si se presenta). La longitud e intensidad de condiciones de reticulación para una mezcla que contiene sondas se puede determinar experimentalmente para equilibrar la robustez de inmovilización y natividad de moléculas de sonda, por ejemplo.
5.3.4. Disolución de Cristal de Sal
Después de la reticulación del polímero, uno o más cristales de sal se pueden disolver en el solvente de tal manera que al menos un canal se forma en la red, tal canal se extiende comenzando desde la superficie y/o cerca de la superficie de la red en el interior de la red. Ventajosamente, después de que los cristales de sal se han disuelto en un solvente, se produce un canal hueco, alargado en el lugar donde el cristal de sal fue, de acuerdo al principio de la forma “perdida”. Los canales permiten analitos para penetrar a través del canal en el interior de la red y específicamente enlazan una sonda ubicada en el interior de la red. Cuando se usa una matriz producida por el método de la descripción como un sensor biológico, una alta precisión de medición y alta medición dinámica se permiten.
El solvente para disolver uno o más cristales de sal se puede elegir de tal manera que es compatible con el polímero y sondas, si está presente (por ejemplo, el solvente se puede elegir tal que no disuelve el polímero y sondas). Preferiblemente, el solvente usado es una solución amortiguadora basada en agua, tal como la solución amortiguadora
de fosfato diluida. Metanol, etanol, propanol o una mezcla de estos líquidos se puede agregar a la solución amortiguadora para facilitar la eliminación de polímero no enlazado de la red.
Después de la eliminación de los cristales de sal la red puede colapsar debido al secado y se puede rehidratar. Secar la red tiene ventajas para envío y estabilización de biomoléculas de sonda.
5.3.5. Métodos para Usar las Redes Tridimensionales
Las redes y matrices de la descripción se pueden usar para determinar la presencia o ausencia de un analito en una muestra, preferiblemente una muestra líquida. La descripción por lo tanto proporciona métodos para determinar si un analito está presente en una muestra o pluralidad de muestras, que comprenden poner en contacto una red o matriz de la descripción que comprende moléculas de sonda que son capaces de enlazar al analito con la muestra o pluralidad de muestras y detectar el enlace del analito a las moléculas de sonda, de este modo determinando si el analito está presente en la muestra o pluralidad de muestras. Cuando las matrices comprenden diferentes especies de sondas capaces de enlazar diferentes especies de analito se usan en los métodos, la presencia de las diferentes especies de analitos se puede determinar al detectar el enlace de las diferentes especies de analitos a las sondas. En algunas modalidades, los métodos además comprenden una etapa de cuantificación de la cantidad de analito o analitos que enlaza a la matriz.
El analito puede ser, por ejemplo, un ácido nucleico, tal como un amplicón de reacción de cadena de polimerasa (PCR). En algunas modalidades, el amplicón PCR se amplifica de una muestra biológica o ambiental (por ejemplo, sangre, suero, plasma, tejido, células, saliva, esputo, orina, fluido cerebroespinal, fluido pleural, leche, lágrimas, heces, sudor, semen, células completas, constituyente celular, frotis celular, o un extracto o derivado del mismo). En algunas modalidades, el ácido nucleico se etiqueta (por ejemplo, fluorescentemente etiquetado).
Un analito colocado en la superficie de la red puede penetrar en el interior de la red a través del canal con objeto de enlazar específicamente a una sonda (por ejemplo, una biomolécula) covalentemente enlazada allí al polímero. Cuando se usan las matrices de la descripción con las redes inmovilizadas sobre eso como sensor biológico, una alta precisión de medición y también una alta medición dinámica se permite.
Las redes y matrices de la descripción se pueden regenerar después del uso como un biosensor y se pueden usar varias veces (por ejemplo, en 5 veces, al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 30 veces, al menos 40 veces, o al menos 50 veces). Si las moléculas de sonda son ADN, esto se puede alcanzar, por ejemplo, al calentar la(s) red(s) en una solución salina amortiguada con fosfato 1x a una temperatura entre 80°C y 90°C por alrededor de 10 minutos. Entonces, la solución salina amortiguada con fosfato se puede intercambiar para una nueva solución salina amortiguada con fosfato para lavar el ADN desnaturalizado fuera de la(s) red(s). Si las moléculas de sonda de la(s) red(s) o matriz son antígenos la(s) red(s) o matriz se pueden regenerar al llevar la(s) red(s) en contacto con NaOH 0.1 N por alrededor de 10 minutos. Entonces, el NaOH 0.1 N se puede intercambiar por una solución salina amortiguada con fosfato para lavar los antígenos fuera de la red. Así, algunas modalidades de los métodos para usar las redes y matrices de la descripción comprenden usar una red o matriz que se ha lavado antes del contacto con una muestra o una pluralidad de muestras.
5.4. Aplicaciones de Matrices de la Descripción
Debido a que las matrices de la invención logran la determinación económica de la presencia cualitativa y cuantitativa de ácidos nucleicos en una muestra, tiene una aplicación inmediata a problemas relacionados con la salud y la enfermedad en animales humanos y no humanos.
En estas aplicaciones una preparación que contiene una molécula objetivo se deriva o extrae de fuentes biológicas o ambientales de acuerdo a protocolos conocidos en la técnica. Las moléculas objetivo se pueden derivar o extraer de células y tejidos de todas las clases taxonómicas, que incluyen virus, bacterias y eucariotas, procariotas, protozoarios, plantas, hongos, y animales de todos los tipos y clases. Los animales pueden ser vertebrados, mamíferos, primates, y especialmente humanos. Sangre, suero, plasma, tejido, células, saliva, esputo, orina, fluido cerebroespinal, fluido pleural, leche, lágrimas, heces, sudor, semen, células completas, constituyente celular, y los frotis celulares son fuentes adecuados de moléculas objetivo.
Las moléculas objetivo preferiblemente son ácidos nucleicos amplificados (por ejemplo, por PCR) de cualquiera de las fuentes anteriores).
Las matrices de la invención pueden incluir sondas que son útiles para detectar patógenos de humanos o animales no humanos. Tales sondas incluyen oligonucleótidos complementarios al menos en parte a objetivos bacterianos, virales o fúngicos, o cualquiera de las combinaciones de objetivos bacterianos, virales y fúngicos.
Las matrices de la invención pueden incluir sondas útiles para detectar expresión de gen en células de humano o de animal no humano, por ejemplo, expresión de gen asociada con una enfermedad o trastorno tal como cáncer, enfermedad cardiovascular, o enfermedad metabólica para el propósito de diagnosticar un sujeto, monitorear el tratamiento de un sujeto o pronóstico de un resultado del sujeto. La información de expresión de gen puede rastrear la progresión o regresión de la enfermedad, y tal información puede ayudar a monitorear el éxito o cambiar el curso
de una terapia inicial.
6. PROTOCOLOS EJEMPLARES
Los siguientes protocolos ejemplares, que se refieren a los números de referencia proporcionados en las figuras, están dentro del alcance de la descripción y se pueden usar en conjunto con los polímeros, reticuladores y sondas de las Secciones 5.1.1, 5.1.2 y 5.1.4, respectivamente. Además los polímeros útiles (que incluyen co-polímeros) y grupos reticuladores para uso en los siguientes métodos se describen en Rendl et al., 2011, Langmuir 27: 6116-6123 y en US 2008/0293592. En una modalidad, una mezcla de polímero de acuerdo a la Sección 7.1 se usa.
6.1. Protocolo Ejemplar 1
Una placa con una superficie orgánica (2) se coloca en un soporte calentado (6). Las temperaturas entre 50°C y 70°C son adecuadas. Una mezcla (5) que contiene un polímero (3), biomoléculas de sonda (1) y una solución de sal acuosa es visto en la superficie orgánica (2) usando un localizador de chip de ADN estándar (por ejemplo, Scienion, Alemania). Los volúmenes de 0.5 hasta 4 nl, están impresos en cada punto (7) (ver, FIGURA 2). El líquido de estos puntos se seca casi inmediatamente dando lugar a una nucleación muy rápida de cristales de sal (8). Después de la nucleación, los cristales de sal en forma de aguja pueden extenderse desde al menos un germen de cristalización (9) ubicado en el volumen de la mezcla (5) a la superficie (10) de la mezcla (5) (ver, FIGURA 3). Después de la nucleación de los cristales (8) los puntos (7) son irradiados en un reticulador UV inmediatamente con radiación UV óptica (11) (ver, FIGURA 4) tal que las biomoléculas de sonda (1) se enlazan covalentemente al polímero (3), y el polímero (3) se enlaza covalentemente a la superficie orgánica (2) y se reticula (ver, FIGURA 5). Se tiene cuidado de que la mezcla seca, reticulada (5) no esté atrayendo la humedad para volverse líquida nuevamente.
La mezcla seca, reticulada (5) luego se pone en contacto con un solvente (12) por los cristales (8) de forma tal que en los lugares en los cuales se encuentran los cristales (8), los canales (13) se forman en la red (15) que comprende el polímero (3) y las biomoléculas de sonda (1) (ver, FIGURA 6). Después de eso, el solvente (12) se elimina. Los canales (13) pueden extenderse desde la superficie (16) de la red (15) en el interior de la red (15). El solvente (12) en el cual los cristales de sal (8) se disuelven se elige de tal manera que es compatible con la biomolécula de sonda (1) y también el polímero (3). Preferiblemente, el solvente (12) usado es basado en agua.
6.2. Protocolo Ejemplar 2
Una mezcla (5) que contiene un polímero (3), biomoléculas de sonda (1) y una solución de sal acuosa es visto en una superficie orgánica (2) configurada en una placa usando un localizador de chip de ADN estándar (por ejemplo, Scienion, Alemania). Los volúmenes de 0.5 hasta 4 nl están impresos en cada punto 7 (ver, FIGURA 2). La placa con los puntos (7) en la superficie orgánica (2) está colocada en un soporte refrigerado (14) (ver, FIGURA 7). Las temperaturas entre 5°C y 15°C son adecuadas. El líquido de estos puntos se enfría para alcanzar una sobre saturación de la solución amortiguadora que casi de inmediato lleva a una nucleación de cristales. Después de la nucleación cristales de sal en forma de aguja (8) pueden extenderse desde al menos un germen de cristalización (9) ubicado en el volumen de la mezcla (5) hasta la superficie (10) de la mezcla (5). Después de la impresión estos objetivos se ponen en un horno (por ejemplo, a 70°C) para secado completo. Después de la nucleación de los cristales los puntos son irradiados en un reticulador UV inmediatamente con radiación UV óptica (11) (ver, FIGURA 8) tal que las biomoléculas de sonda (1) se enlazan covalentemente al polímero (3), y el polímero (3) se enlaza covalentemente a la superficie orgánica (2) y se reticula. Se tiene cuidado de que la mezcla seca, reticulada no esté atrayendo la humedad para volverse líquida nuevamente.
La mezcla seca, reticulada (5) luego se pone en contacto con un solvente (12) para disolver los cristales (8) de forma tal que en los lugares en los cuales se encuentran los cristales (8), los canales (13) se forman en la red (15) que comprende el polímero (3) y las biomoléculas de sonda (1). Después de eso, el solvente (12) se elimina. Los canales (13) pueden extenderse desde la superficie (16) de la red (15) en el interior de la red (15). El solvente (12) en el cual los cristales de sal (8) se disuelven se elige de tal manera que sea compatible con la biomolécula de sonda (1) y el polímero (3). Preferiblemente, el solvente (12) usado está basado en agua.
Como se puede ver en la FIGURA 9 una pluralidad de canales (13) se puede formar en la red (15). Los canales (13) pueden extenderse desde la superficie (16) de la red (15) hasta al menos un punto ubicado dentro de la red (15). Los canales (13) se pueden configurar de tal manera que - comenzando desde la superficie (16) en la dirección del interior - la distancia lateral entre los canales (13) disminuye.
6.3. Protocolo Ejemplar 3
Una mezcla (5) que contiene un polímero (3), biomoléculas de sonda (1) y una solución de sal acuosa está impresa en una superficie orgánica (2) de una placa en condiciones normales con una humedad que varía desde 40-80%, preferiblemente 50-70%. La mezcla puede estar cerca de la saturación, 400 mM fosfato de sodio, pH 8, por ejemplo. Los volúmenes de 0.5 hasta 4 nl están impresos en cada punto (7). El contenido de humedad en el compartimiento de impresión se asegura que los puntos (7) permanezcan líquidos sin la formación de cristal (esto es, no se produce nucleación). La placa luego se pone en un recipiente, una caja de cartón por ejemplo. Las tapas se ponen en la placa que tiene la superficie orgánica (2) para el transporte. La placa con los puntos (7) en la superficie orgánica (2) luego
se pone en un horno de secado o sobre una placa caliente para causar rápidamente la nucleación tal que los cristales de sal en forma de aguja (8) se extienden desde al menos un germen de cristalización (9) ubicado en el volumen de la mezcla hacia la superficie 10 de la mezcla (5).
La temperatura del horno/placa caliente debe ser 20°C o más arriba de la temperatura de impresión. Las temperaturas por arriba de 100°C no son necesarias.
Después de secar, la mezcla es irradiada para reticular el polímero (3), biomoléculas de sonda (1), y superficie orgánica (2).
La mezcla seca, reticulada (5) luego se pone en contacto con un solvente (12) de forma tal que en los lugares en los cuales se encuentran los cristales (8), los canales (13) se forman en la red (15) que comprende el polímero (3) y las biomoléculas de sonda (1). Después de eso, el solvente (12) se elimina. Los canales (13) se pueden extender desde la superficie (16) de la red (15) en el interior de la red (15). El solvente (12) en el cual los cristales de sal (8) se disuelven se elige de tal manera que sea compatible con las biomoléculas de sonda (1) y el polímero (3). Preferiblemente, el solvente (12) usado está basado en agua.
6.4. Protocolo Ejemplar 4
Alternativamente, una placa con puntos (7) en la superficie orgánica (2) preparada como en el protocolo ejemplar 3 se puede enfriar para alcanzar la nucleación al ponerla en una cámara fría con baja humedad (por ejemplo, temperaturas < 10°C, humedad relativa < 40%). El secado se puede realizar al reducir la humedad o al aplicar un vacío después de que la nucleación ha comenzado. Después de la nucleación, los cristales de sal en forma de aguja (8) pueden extenderse desde al menos un germen de cristalización (9) ubicado en el volumen de la mezcla (5) hacia la superficie (10) de la mezcla (5). La placa con los puntos (7) en la superficie orgánica (2) se pone en un horno a 60°-70°C durante 1 hora para secar completamente los puntos. Los puntos (7) son irradiados con UV con 1.00 J @ 254 nm en un reticulador UV, esto es Stratalinker 2400. Para hacer esto, la placa con los puntos (7) en la superficie orgánica (2) se puede poner en el centro de la cámara con el lado más corto paralelo a la puerta de la cámara. Entonces, la cubierta se elimina y la reticulación se inicia. Cuando la máquina se termina la matriz se elimina y la cubierta se reemplaza.
Alternativamente, otros reticuladores UV con la misma longitud de onda (240-270 nm, por ejemplo) o longitudes de onda más largas, por ejemplo, 360 nm, se pueden usar.
La mezcla (5) luego se pone en contacto con un solvente (12) para disolver los cristales (8) de forma tal que en los lugares en los cuales se encuentran los cristales (8), los canales (13) se forman en la red (15) que comprende el polímero (3) y las biomoléculas de sonda (1). Después de eso, el solvente (12) se elimina. Los canales (13) pueden extenderse desde la superficie (16) de la red (15) en el interior de la red (15). El solvente (12) en el cual los cristales de sal (8) se disuelven se elige de tal manera que es compatible con las biomoléculas de sonda (1) el polímero (3). Preferiblemente, el solvente (12) usado está basado en agua.
7. EJEMPLOS
7.1. Ejemplo 1: Formación de una red de polímero tridimensional con canales
Una solución de reserva de polímero 10 mg/ml se prepara al disolver 10 mg del polímero de reticulación poli(dimetilacrilamida) co 5% metacriloiloxibenzofenona co 2.5% 4-vinilbencenosulfonato de Sodio en 1.0 ml de agua libre de ADNasa. Esto se alcanza por agitación vigorosa y vórtice durante aproximadamente 5 minutos hasta que todo el polímero visible se disuelve. La solución de reserva luego se envuelve en papel aluminio para protegerla de luz y se coloca en un refrigerador durante la noche para asegurar que el polímero completamente se disuelva y para permitir a la espuma reducirse. El polímero tiene al menos dos grupos fotoreactivos por molécula.
Una mezcla que comprende el polímero, sondas de oligonucleótido de ADN, y fosfato de sodio se hace al mezclar 10 |jl de una solución de reserva de oligonucleótido de ADN 100 jM , 5 j l de la solución de reserva de polímero 10 mg/ml (para proporcionar una concentración de polímero en la mezcla de 1 mg/ml), y 35 j l de una solución amortiguadora de fosfato de sodio 500 mM, pH 8.
La mezcla se usa para preparar una red tridimensional de la invención usando el método de uno de cualesquiera de los Protocolos Ejemplares 1 a 4.
7.2. Ejemplo 2: Uso de una red de polímero tridimensional para detectar bacterias
7.2.1. Preparación de una matriz de la invención
Los oligonucleótidos para inmovilización se disolvieron en una concentración de 20 jM en una solución amortiguadora de fosfato de sodio 400 mM, pH 7 que contiene 1 mg/ml del polímero fotoreactivo descrito en el Ejemplo 1. Cada oligonucleótido tiene una longitud de 30-35 nucleótidos complementarios al ADN objetivo y una cola de 15 timidinas (para una longitud de oligonucleótido total de 45-50 nucleótidos).
La mezcla se usó para imprimir los siguientes puntos en una superficie orgánica de una placa para proporcionar una
matriz:
LL: Llamado luces de aterrizaje. Oligonucleótido de ADN etiquetado Cy5 (0.2 j M), polímero y oligonucleótido no etiquetado 19.8 j M para hacer hasta 20j M de concentración de oligonucleótido total.
GN: Oligonucleótido específico para bacterias gram negativas.
GP: Oligonucleótido específico para bacterias gram positivas.
S.Aure_1: Oligonucleótido específico para bacterias Staphylococcus aureus.
S.Aure_2: Oligonucleótido específico para bacterias Staphylococcus aureus.
E.coli_1: Oligonucleótido específico para bacterias Escherichia coli.
E.coli_2: Oligonucleótido específico para bacterias Escherichia coli.
Para evitar la formación de cristales de sal en la placa de la fuente (esto es, la placa de la cual la mezcla se tomó) esta placa se mantuvo a temperatura ambiente (22°C).
Una placa de 96 pocillos Greiner con un fondo claro de cristal plano con una superficie orgánica se enfrió a 10°C para evitar el secado fuera de los puntos impresos. Usando una impresora Scienion® SciFlex 5 con una boquilla PDC 90 de 8 gotas por punto se imprimieron en la superficie orgánica, que resulta en un volumen de punto de aproximadamente 1.4 nl. La humedad de la impresora se mantuvo a 60-65% de humedad relativa.
Después de la impresión el tamaño de los puntos se verificó por una cámara principal automatizada en el cabezal de impresión para asegurar que no haya tenido lugar el secado o la formación de cristales en los puntos. Todos los puntos todavía estaban húmedos y tienen el mismo tamaño. Ninguna formación de cristal fue visible.
La placa de 96 pocillos luego se selló con una tapa para evitar el secado y que se ponga inmediatamente en una placa caliente (70°C) en un horno de secado para realizar la iniciación de cristal y el secado de los puntos.
Después de 1 hr de incubación a 70°C para asegurar el secado apropiado de los puntos la placa se irradió con 1 J @ 254 nm en un Stratalinker® 2000.
7.2.2. Preparación de una matriz de control
Un procedimiento similar a ese descrito en la Sección 7.2.1 se usó pero la placa objetivo se mantuvo a temperatura ambiente sustancialmente como se describe por Rendl et al., 2011, Langmuir 27: 6116-6123. Después de la impresión, algunos puntos mostraron un tamaño reducido, esto es, algunos de los puntos en lugares aleatorios en la matriz se secaron en y exhibieron separación de fase inmediatamente después de la impresión. La placa luego se llevó fuera de la impresora y se fue llevado al proceso de secado de muestra como se describió anteriormente sin tapa en, sobre el cual el secado adicional ocurrió.
7.2.3. Ensayo de Hibridación
Antes de usar las placas se lavaron en una lavadora de placas 3 veces con 300 j l de solución amortiguadora de lavado (100 mM fosfato de sodio pH 7) y luego la solución amortiguadora se intercambió a fosfato de sodio 1 mM pH 7. Las placas se calentaron durante 10 minutos a 90°C en una coctelera del calentador para extraer el ADN no enlazado y polímero. La solución amortiguadora luego se intercambió a solución amortiguadora de fosfato de sodio 100 mM usando una lavadora de placas de 96 pocillos automatizada.
Una mezcla de 20 ml producto PCR etiquetado Cy5 y solución amortiguadora de fosfato de sodio 30 ml (250 mM, pH7) se incubó en las matrices durante 10 minutos a 80°C y 30 minutos a 55°C en coctelera del calentador. Más tarde las placas se lavaron con solución amortiguadora de fosfato de sodio 100 mM pH7 tres veces en lavadora de placas de 96 pozos. Las placas con solución amortiguadora se exploraron en el lector Sensovation® Flair y la intensidad de punto de los diferentes puntos se midió.
7.2.4. Resultados
8 matrices se produjeron por el método de Sección 7.2.1 y 8 matrices producidas por el método de la Sección 7.2.2 se analizaron y los datos se procesaron en un programa de hoja de cálculo. La media y el error estándar de la media (SEM) se calcularon y compararon. Los resultados se muestran en las Figs. 14-16.
8. EJEMPLO 3: Reutilización de una matriz de red de polímero tridimensional
Diversas matrices se prepararon de acuerdo al procedimiento descrito en la Sección 7.2.1, que incluye un punto de “ luz de aterrizaje” que contiene oligonucleótidos fluorescentemente etiquetados. Las matrices se reutilizaron en los ensayos de hibridación y se lavaron de acuerdo al siguiente procedimiento entre hibridaciones:
(a) las matrices se lavaron tres veces con solución amortiguadora de fosfato 100 mM pH 7;
(b) la solución amortiguadora luego se intercambió a solución amortiguadora de fosfato 1 mM pH 7; y
(c) las matrices luego se calentaron a 80°C y se lavaron mientras está caliente con solución amortiguadora de fosfato 100 mM pH 7.
La fuerza de la señal fluorescente del punto de luz de aterrizaje se determinó entre usos. Después de 10 usos, la señal fluorescente perdió menos de 25% de su intensidad. Las matrices se reutilizaron hasta que un punto de referencia hibridado con un ADN de referencia (control interno) mostró una pérdida de señal de 50%.
9. CITA DE REFERENCIAS
Varias publicaciones, patentes, solicitudes de patente y otros documentos se citan en esta solicitud. En el caso de que haya una inconsistencia entre las enseñanzas de una o más de las referencias incorporadas en la presente y la presente descripción, las enseñanzas de la presente especificación están destinadas.
Claims (15)
1. Una red tridimensional que tiene una superficie y un interior, la red tridimensional:
(a) se compone de un polímero hinchable en agua formado al reticular cadenas de polímeros solubles en agua; (b) se reticula a la superficie de un sustrato rígido; y
(c) comprende moléculas de sonda covalentemente unidas a las cadenas de polímeros, caracterizada porque (i) la red comprende al menos 5 canales, que convergen en un punto en el interior de la red tal que la distancia lateral entre los canales disminuya desde la superficie hacia el punto en el interior y
(ii) una mayoría de las moléculas de sonda se inmoviliza en el interior de la red y al menos una porción de las moléculas de sonda colindan con un canal.
2. La red tridimensional de la reivindicación 1, caracterizada porque al menos uno de los canales está caracterizado por una, dos o tres de las siguientes propiedades:
(a) el canal se extiende hacia el interior desde un punto que está a menos de 5 micras de la superficie de la red o se extiende hacia el interior desde un punto en la superficie de la red;
(b) el canal tiene una longitud que es al menos 10% de la dimensión más grande de la red; y
(c) el canal tiene una sección transversal mínima de al menos 5 veces el tamaño de la malla de red.
3. La red tridimensional de la reivindicación 1 o 2, caracterizada porque al menos una mayoría de los canales en la red tienen una longitud que está al menos 10% de la dimensión más grande de la red.
4. La red tridimensional de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque la mayoría de los canales en la red se extiende desde un punto que está a menos de 10 micras de la superficie de la red, o se extiende hacia el interior desde un punto en la superficie de la red.
5. La red tridimensional de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque la red tiene en su estado hidratado un tamaño de malla de 5 a 75 nm.
6. La red tridimensional de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque la mayoría de las moléculas de sonda colindan con un canal.
7. La red tridimensional de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque el polímero comprende un polímero polimerizado a partir de dimetilacrilamida (DMAA), metacriloxibenzofenona (MABP), y 4-vinilbencenosulfonato de sodio (SSNa).
8. Una matriz que comprende una pluralidad de redes tridimensionales de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en un sustrato rígido, en donde cada una de las redes tridimensionales se ubica en un punto separado del sustrato.
9. Un proceso para hacer una red tridimensional de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque comprende los pasos de:
(a) exponer una mezcla ubicada en la superficie de un sustrato rígido a condiciones de formación de cristales en forma de aguja, la mezcla que comprende
(i) una solución salina acuosa,
(ii) un polímero soluble en agua,
(iii) un reticulador, y
(iv) moléculas de sonda, formando de esta manera una mezcla que contiene cristales de sal en forma de aguja; (b) exponer la mezcla que contiene los cristales de sal a condiciones de reticulación, formando de esta manear una red de polímeros reticulados que tiene moléculas de sonda reticuladas a la misma y que contienen cristales de sal en forma de aguja; y
(c) poner en contacto la red de polímeros reticulados que contiene los cristales de sal con un solvente en el cual los cristales de sal son solubles, disolviendo de esta manera los cristales de sal en forma de aguja y formando canales en lugar de los cristales de sal.
10. El proceso de la reivindicación 9, caracterizado porque la solución salina acuosa es una solución salina de cationes monovalente.
11. El proceso de la reivindicación 9 o 10, caracterizado porque:
(a) las condiciones de formación de sal cristalina en forma de aguja comprenden:
(i) deshidratar la mezcla; o
(ii) enfriar la mezcla; y/o
(b) el solvente es un agente amortiguador basado en agua.
12. Un proceso para producir una matriz, caracterizado porque comprende:
(a) crear una pluralidad de redes tridimensionales por el proceso de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11 en puntos discretos en la superficie del mismo sustrato, y
(b) reticular la pluralidad de redes tridimensionales a la superficie.
13. Un método para determinar si un analito está presente en una muestra, caracterizado porque comprende:
(a) poner en contacto una red tridimensional de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o una matriz de acuerdo con la reivindicación 8 que comprende moléculas de sonda que son capaces de unirse al analito con la muestra; y
(b) detectar la unión del analito a las moléculas de sonda en la red tridimensional, determinando de esta manera si el analito está presente en la muestra y, opcionalmente, la cantidad del analito.
14. El método de la reivindicación 13, caracterizado porque la red o matriz se ha utilizado y lavado al menos 10 veces antes del paso (a) o que comprende además reutilizar la red o matriz al menos 10 veces después del paso (b).
15. El método de la reivindicación 14, caracterizado porque comprende además cuantificar la unión del analito a las moléculas de sonda en la red tridimensional.
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