CN108603223B - 具有位于其中的通道的三维聚合物网络 - Google Patents
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Abstract
本发明公开内容提供三维交联聚合物网络，其包含自该网络的表面和/或在该网络的表面附近延伸于该网络的内部中的一个或多个通道；包含该网络的阵列；用于制备该网络的方法及该网络及阵列的用途。
Description
1.相关申请的交叉参考
本申请根据35U.S.C.§119要求2015年12月18日提交的欧洲申请第15201355号及2016年1月28日提交的美国申请第15/008,728号的优先权，其中每一个的内容以全文引用的方式并入本文中。
2.背景技术
U.S公开第2008/0293592号描述一种用于藉助于光反应性交联剂在有机表面上共价固定探针生物分子的方法。已在实践中证实该方法特别有利，因为其准许探针生物分子在非反应性的表面比如由标准商业塑料制成的硅烷化玻璃载体及基板上固定。在描述于US2008/0293592中的方法中使用聚合物以形成在网络表面或在网络内部可结合有探针生物分子的三维网络类型。与探针生物分子仅以二维形式固定的有机表面相比，聚合物和/或共聚物网络中生物分子的三维固定使得有机表面上的探针生物分子的密度更高。这增加了每表面单位的有机表面可结合的分析物的量。因此该表面作为生物传感器的用途产生更高的测量精确性和高的测量动力学。
然而，描述于U.S.2008/0293592中的方法及聚合物网络的缺点为结合至在聚合物网络表面上或接近于聚合物网络表面而布置的探针生物分子的分析物分子或分析物组分可阻断该网络。随后其他分析物分子或分析物组分可不再同样结合至在网络内部中的距网络表面更大的距离处布置的尚未结合的探针生物分子。
因此，需要改良的聚合物网络。
3.发明内容
发明概述
本发明公开内容提供三维聚合物网络，其包含交联聚合物及自网络表面和/或在网络表面附近延伸于网络内部中的一个或多个通道。该网络适当地共价连接至表面。一种或多种探针(比如生物分子)可固定于网络表面上及网络的整个内部中，提供用于检测样品中分析物的存在和/或测量其量的传感器。举例而言，核酸探针可用于检测存在于样品中的互补核酸，且抗体探针可用于检测存在于样品中的抗原。与不具有通道的网络相比，本发明公开内容网络允许给定量的分析物更快地杂交(hybridization)，因为通道可有效地增加网络的表面积，在给定时间量里将更多探针曝露至样品。另外，本发明公开内容网络可比相同体积的无通道网络结合更多的分析物，因为通道降低或消除以下问题：样品的在网络的表面处或在网络的表面附近结合至探针的分析物或其他组分阻断了对位于网络内部的探针的接近。与可能不具有通道的网络相比，本发明公开内容网络的另一优势为：可以通过通道得到的高量的分析物负载使得对分析物的检测更灵敏，即与无通道网络相比，信噪比可得以提高，因为给定量的分析物可以在更小的网络体积浓缩。与无通道网络相比，本发明公开内容网络的又一优势为：可以通过通道得到的高分析物负载使得可量化更宽范围的分析物浓度。
本发明公开内容亦提供包含本发明公开内容的多个三维网络及基板的阵列(array)。本发明公开内容阵列可用于同时检测和/或测量一个或多个样品中的一种或多种分析物。本发明公开内容阵列可经洗涤及再使用，提供比单次使用阵列显著的成本优势。本发明公开内容阵列的另一优势为其可按简单方式制造，因为在制造方法期间制备个体网络所需的所有组分可作为单一混合物涂覆于基板表面上。
本发明公开内容亦提供用于制备本发明公开内容的三维网络及阵列的方法。本发明公开内容的三维网络可通过在盐晶体、优选针形盐晶体存在下使聚合物交联，和随后溶解盐晶体以在交联聚合物网络中留下通道来制备。
本发明公开内容亦提供用于使用本发明公开内容的三维网络及阵列以检测和/或测量样品、优选液体样品中的分析物的方法。
4.附图说明
图1显示具有探针生物分子(1)和聚合物(3)的混合物的图示，该聚合物对于每个溶解于水性盐溶液(an aqueous salt solution)中的分子包含两个光反应性基团(4)。
图2显示通过图1所显示的一滴混合物(5)的横截面，该混合物具有位于有机表面(2)的斑点(a spot)(7)处的表面(10)，该有机表面位于经加热固持器(6)上。
图3显示在混合物已经加热且自结晶胚(crystallization germ)(9)延伸的针形盐晶体(8)已在盐溶液中形成后，通过图2所显示的布置的横截面。
图4显示混合物已经干燥且用光辐射(11)照射以形成具有表面(16)的聚合物网络(15)后，通过图3所显示的布置的横截面。
图5显示用光辐射照射后图1混合物的图示。
图6显示将盐晶体溶解于溶剂(12)中形成通道(13)后，通过图4所显示的布置的横截面。
图7显示混合物已在经冷却固持器(14)上冷却且针形盐晶体已在盐溶液中形成后，通过图2所显示的布置的横截面。
图8显示混合物已经干燥且用光照射将其照射后，通过图7所显示的布置的横截面。
图9显示用溶剂溶解盐晶体后通过图8所显示的布置的横截面。
图10显示用于形成对(二甲基丙烯酰胺-共聚-甲基丙烯酰氧基二苯甲酮-共聚-4-乙烯基苯磺酸钠)的反应路径。
图11显示具有有机表面(2)的生物芯片(17)的透视图，在有机表面上聚合物网络(15)位于经布置为具有列及行的矩阵的斑点(7)处。
图12显示如图11所显示的生物芯片(17)的俯视图，其中各聚合物网络(15)具有直径(D)，且其中列及行分别由自聚合物网络(15)的中心点测量的距离Y及距离X分隔。
图13显示生物传感器(17')，其包含具有有机表面(2)的挠性基板条带(18)，在该有机表面上具有直径(D)的聚合物网络(15)位于由自聚合物网络的中心点测量的距离X分隔开的斑点(7)处。
图14显示表格，其显示实施例2中不同斑点的测量值的平均值及平均值的标准偏差。
图15为通过章节7.2.1的阵列获得的测量值的平均值的图示。
图16为通过章节7.2.2的阵列获得的测量值的平均值的图示。
5.发明详述
5.1三维聚合物网络
本发明公开内容的三维网络包含交联聚合物，例如根据内容以全文引用的方式并入本文中的Rendl等人,2011,Langmuir 27:6116-6123或US 2008/0293592的聚合物。本发明公开内容的三维网络进一步包含一个或多个通道且可非必要地进一步包含固定于网络上的一种或多种探针。
可用于制备网络的聚合物描述于章节5.1.1中。可用于制备网络的交联剂描述于章节5.1.2中。该一个或多个通道的特征描述于章节5.1.3中。可固定于网络上的探针描述于章节5.1.4中。
5.1.1聚合物
本发明公开内容的三维网络可包含交联的均聚物、共聚物、均聚物的混合物、共聚物的混合物或一种或多种均聚物及一种或多种共聚物的混合物。如本文中所使用，术语“聚合物”包括均聚物和/或共聚物两者。如本文中所使用，术语“共聚物”包括由两种或多于两种类型的单体聚合的聚合物(例如二元共聚物、三元共聚物、四元共聚物等)。共聚物包括交替共聚物、周期共聚物、统计共聚物、无规共聚物、嵌段共聚物、线性共聚物及支化共聚物。本发明公开内容的三维网络可包含前述类型聚合物的任何组合。用于制备此类聚合物的试剂及方法在现有技术中已知(参见例如Ravve,A.,Principles of Polymer Chemistry,Springer Science+Business Media,1995；Cowie,J.M.G.,Polymers:Chemistry&Physicsof Modern Materials,第2版,Chapman&Hall,1991；Chanda,M.,Introduction to PolymerScience and Chemistry:A Problem-Solving Approach,第2版,CRC Press,2013；Nicholson,J.W.,The Chemistry of Polymers,第4版,RSC Publishing,2012；其中的每一个的内容以其全文引用的方式并入本文中)。
优选的聚合物为亲水性的和/或含有亲水性基团。聚合物可为水可溶的。在一实施方案中，聚合物为已由两种或多于两种种类的所选择单体聚合的共聚物以提供所需水溶性水平。举例而言，共聚物的水溶性可通过改变用以制备共聚物的带电单体(例如4-乙烯基磺酸钠)的量来控制。
当交联时，水可溶聚合物形成水可溶胀凝胶或水凝胶。水凝胶经由与水分子的氢键吸收水溶液。水凝胶的总体吸收性及溶胀能力可通过用以制备凝胶的交联剂的类型及程度而控制。低交联密度聚合物一般比高交联密度聚合物具有更高的吸收能力及溶胀到更大程度，但高交联密度聚合物的凝胶强度更坚固和甚至在适中压力下可维持网络形状。
水凝胶吸收水的能力为水溶液的离子浓度的因素。在某些实施方案中，本发明公开内容的水凝胶可在去离子蒸馏水中吸收高达50倍的其重量(5至50倍其自身体积)，且在盐水中吸收高达30倍的其重量(4至30倍其自身体积)。盐水中降低的吸收性归因于价态阳离子的存在，其阻碍聚合物与水分子结合的能力。
本发明公开内容的三维网络可包含已由一种、两种、三种或多于三种种类的单体聚合的共聚物，其中一种、两种、三种或多于三种种类的单体具有独立地选自以下的可聚合基团：丙烯酸酯基(例如丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸羟基乙酯、丙烯酸乙酯、2-苯基丙烯酸酯)、丙烯酰胺基(例如丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、二甲基丙烯酰胺、乙基丙烯酰胺)、衣康酸酯基(例如衣康酸酯、衣康酸4-甲酯、衣康酸二甲酯)和苯乙烯基(例如苯乙烯、4-甲基苯乙烯、4-乙氧基苯乙烯)。优选的可聚合基团为丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、乙基丙烯酸酯(ethacrylate)、2-苯基丙烯酸酯、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、衣康酸酯及苯乙烯。在一些实施方案中，用以制备共聚物的单体中的一个为带电荷的，例如4-乙烯基苯磺酸钠。
用以制备本发明公开内容网络的聚合物对于每分子可包含至少一个、至少两个、或多于两个交联剂基团。交联剂基团为将网络的聚合物分子彼此共价结合和非必要地将其共价结合至探针和/或基板的基团。已由两种或多于两种单体(例如具有独立地选自描述于前述段落中的那些基团的可聚合基团的单体)聚合的共聚物，其中的至少一种包含交联剂，适用于制备本发明公开内容的三维网络。例示性交联剂描述于章节5.1.2中。包含交联剂的优选单体为甲基丙烯酰氧基二苯甲酮(MABP)(参见图10)。
在一优选实施方案中，共聚物为包含交联剂的二元共聚物或三元共聚物。在一尤其优选实施方案中，共聚物包含对(二甲基丙烯酰胺-共聚-甲基丙烯酰氧基二苯甲酮-共聚-4-乙烯基苯磺酸钠)(参见图10)。
5.1.2交联剂
适用于使得三维网络交联的交联试剂(或交联剂)包括通过紫外光(例如长波UV光)、可见光及热活化的那些。通过UV光活化的例示性交联剂包括二苯甲酮、噻吨酮(例如噻吨-9-酮、10-甲基吩噻嗪)和安息香醚(例如安息香甲基醚、安息香乙醚)。通过可见光活化的例示性交联剂包括乙基曙红、曙红Y、玫瑰红、樟脑醌及赤藓红(erythirosin)。通过热活化的例示性交联剂包括4,4'-偶氮双(4-氰基戊酸)和2,2-偶氮双[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二盐酸化物及过氧化苯甲酰。亦可使用现有技术中已知的其他交联剂，例如能够在经照射时形成自由基或其他反应性基团的那些交联剂。
5.1.3通道
本发明公开内容的三维网络含有一个或多个通道。
如本文中所使用，“通道”为该网络中的狭长通路，其(1)基本上为笔直的，和(2)在网络的水合状态下，具有至少500nm的最小横截面及通路的最小横截面的至少五倍且优选至少十倍的长度。举例而言，通道的长度可为通道的最小横截面的5至15倍、5至10倍或10至15倍。“基本上笔直”的通道为在任何方向即X、Y或Z方向上不改变方向大于45度的情况下，在一个方向上自成核点延伸的通道。
“网络的水合状态”意谓网络在水吸收方面处于平衡，即其在水溶液中吸收的水与其发出的水一样多。
通道可允许进入网络内部。尽管通道可具有相对大的通道横截面，但网络可机械地保持稳定，因为该网络的筛目大小可显著小于通道横截面。通道可形成一类高速公路，经由其分析物可快速进入网络内部。在通道中分析物的输送可通过扩散和/或对流实现。
通道可自网络表面或在网络表面附近延伸于网络内部中。举例而言，该一个或多个通道可自离网络的表面小于10微米、小于9微米、小于8微米、小于7微米、小于6微米、小于5微米、小于4微米、小于3微米、小于2微米、小于1微米的点延伸，或自网络表面上的点延伸于内部中。网络可含有多个通道(例如2至100、2至50、2至25、2至10、10至50、10至25或25至50个)，其中的每一个可自网络表面或在网络表面附近延伸于网络内部中。在优选实施方案中，网络含有10、20、30、40或50个通道，或介于前述值中的任两者之间的许多通道(例如10至50、20至40、30至50、10至20、20至30、30至40或40至50个通道)。在一特定优选实施方案中，网络含有10至50个通道。
在一些实施方案中，至少一个通道的长度为该网络的最大尺寸的10至100％、10％至90％、10％至80％、10％至70％、10％至60％、10％至50％、10％至40％、10％至30％、10％至15％、10％至20％、10％至25％、10至30％、15％至20％、15％至25％、15％至30％、20至25％或25％至30％。在优选实施方案中，至少一个通道的长度为该网络的最大尺寸的大约10％、20％、30％、40％或50％，且在一些实施方案中，长度介于前述实施方案中的任何对之间(例如网络的最大尺寸的10％至50％、10％至30％、30％至50％、10％至20％、20％至30％、30％至40％或40％至50％)。在一特定优选实施方案中，长度为该网络的最大尺寸的10％至50％。
在一些实施方案中，网络包含至少一个通道，其最小横截面为筛目大小的至少5倍、至少10倍、至少15倍或至少20倍(例如网络筛目大小的5至10倍、5至15倍、5至20倍、5至25倍、5至30倍、10至15倍、10至20倍、10至25倍、10至30倍、10至15倍、10至20倍、10至25倍、10至30倍、15至20倍、15至25倍、15至30倍、20至25倍、20至30倍或25至30倍)。在优选实施方案中，网络包含最小横截面为筛目大小的10至30倍的至少一个通道。此确保聚合物网络的高稳定性，且亦可防止因样品中非所需较大分子或组分所致的网络渗透及结合。
网络的筛目大小(在网络的水合状态下测量)可为例如5至75nm(例如10至20nm、10至30nm、10至40nm、10至50nm、20至30nm、20至40nm、20至50nm、30至40nm、30至50nm或40至50nm)。
本发明公开内容网络可包含多个通道(例如2至100、2至50、2至25、2至10、10至50、10至25或25至50个)，且各通道可独立地具有描述于此章节中的一个或多个特征。在一些实施方案中，大多数通道具有描述于此章节中的一个或多个特征。在一特定优选实施方案中，网络含有各自具有描述于此章节中的一个或多个特征的10至50个通道。
优选的三维网络含有多个通道，其汇聚于位于网络内的点处，且经布置使得通道之间的横向距离自网络表面开始朝向内部减小。在一些实施方案中，多个通道远离位于网络内部的点而大致径向地延伸。在一些实施方案中，三维网络含有多组多个通道(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10组多个通道)，各组多个通道汇聚在网络内的不同点处。在某些方面中，多个通道(或各组多个通道)连接在他们的汇聚点处。
网络中通道的存在可使用以下程序证实：
在室温下在例如碗中使网络与水性液体接触。该液体含有多个纳米粒子，其大于网络的筛目大小且小于通道的最小横截面。因此，纳米粒子可进入通道且沿通道扩散。不受理论束缚，相信此可归因于布朗(Brownian)分子运动和/或经由通道中的液体的对流发生。此类纳米粒子称为量子点。其直径可例如为约10纳米。
选择培育期使得液体中的网络完全水合，即网络平均吸收与其释放相同量的水。培育期可为例如一小时。通道中纳米粒子的渗透可通过在培育期间设置网络和/或液体的运动，例如通过振动网络和/或液体(优选藉助于超声波)来加速。
培育完成后，例如通过自碗排出液体或将网络自碗中取出使液体与网络分离。
随后，例如藉助于液氮冷冻水合网络。此后，可藉助于低温切片机(cryomicrotome)沿着相互平行的切割平面将冷冻网络切成薄切片。切割平面横向于通道的纵向延伸而布置且穿透通道。优选使用液氮冷却的金刚石刀片进行切割。切片厚度可为例如约100nm或200nm。
藉助于显微镜，定位置于通过切割冷冻网络获得的盘片中的纳米粒子。必要时，纳米粒子可为荧光的且经光学突显，使得其可更好地与网络区别。可使用适合软件用图像处理方法进行纳米粒子的定位。为检查盘片，优选使用具有荧光光学器件的共焦显微镜激光扫描显微镜或电子显微镜。
藉助于计算机，以此方式获得的纳米粒子的几何结构和/或位置信息可用于制造网络中的纳米粒子分布的三维几何模型。随后该模型可用于确定网络中纳米粒子的布置是否包含至少一个基本上笔直的区域，其横截面不会小于500nm且其长度至少对应于其最小横截面的五倍。若此条件满足，则确定网络包含至少一个通道。
或者，纳米粒子的三维分布可藉助于微3D X-射线计算机断层摄影术在网络中确定。
5.1.4探针
固定于本发明公开内容网络上的探针可为生物分子或结合生物分子的分子，例如互补结合配偶体(partner)的特异性相互作用系统的配偶体(受体/配位体)。举例而言，探针可包含核酸及其衍生物(比如RNA、DNA、锁核酸(LNA)和肽核酸(PNA))、蛋白质、肽、多肽及其衍生物(比如葡糖胺、抗体、抗体片段及酶)、脂质(例如磷脂、脂肪酸，比如花生四烯酸、单酸甘油酯、二酸甘油酯及三酸甘油酯)、碳水化合物、酶抑制剂、酶底物、抗原及抗原决定基。探针亦可包含较大且复杂的结构，比如脂质体、膜及膜片段、细胞、细胞裂解物、细胞片段、孢子及微生物。
互补结合配偶体的特异性相互作用系统可基于例如核酸与互补核酸的相互作用，PNA与核酸的相互作用，或酶/底物、受体/配位体、凝集素/糖、抗体/抗原、抗生素蛋白/生物素或抗生蛋白链菌素/生物素相互作用。
核酸探针可为DNA或RNA，例如寡核苷酸或适体、LNA、PNA或DNA，在5'端包含甲基丙烯酸基(a methacyrl group)(5'AcryditeTM)。寡核苷酸探针可为例如12至30、14至30、14至25、14至20、15至30、15至25、15至20、16至30、16至25、16至20、15至40、15至45、15至50、15至60、20至55、18至60、20至50、30至90、20至100、20至60、40至80、40至100、20至120、20至40、40至60、60至80、80至100、100至120或12至150个核苷酸长。在优选实施方案中，寡核苷酸探针长度为15至60个核苷酸。
当使用核酸探针时，整个探针或仅探针的一部分可与目标序列互补。与目标序列互补的探针部分的长度优选为至少12个核苷酸，且长度更佳为至少15、至少18或至少20个核苷酸。对于长度比40或50个核苷酸更长的核酸探针，与目标序列互补的探针部分的长度可为至少25、至少30或至少35个核苷酸。
抗体可为例如多株、单株或嵌合抗体或其抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或其单链、包含抗体的融合蛋白，及包含抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其他经修饰组态，包括例如(但不限于)单链(scFv)和域抗体(例如人类、骆驼或鲨鱼域抗体)、最大抗体、微型抗体、胞内抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、vNAR及双scFv(参见例如Hollinger及Hudson,2005,Nature Biotech23:1126-1136)。抗体包括任何类别的抗体，比如IgG、IgA或IgM(或其子类)，且该抗体无需为任何特定类别。免疫球蛋白可视其重链的恒定域的抗体胺基酸序列而分为不同类别。存在五种主要类别的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且此等类别中的若干者可进一步分成子类(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。「抗体」亦涵盖前述抗体/免疫球蛋白类型中的每一个中的任一个。
本发明公开内容的三维网络可包含单种类探针或多于一种种类的探针(例如2、3、4或5或多于5种种类)。针对相同目标，三维网络可包含多于一种种类的探针(例如结合相同目标的不同抗原决定基的抗体)和/或包含结合多个目标的探针。
网络可包含经标记(例如经荧光标记)对照探针分子，其可用于例如测量存在于网络中的探针的量。
探针可分布在整个网络中(例如在网络表面上及网络内部)。优选地，至少一种探针与网络表面间隔开且邻近至少一个通道。随后经由通道，如此定位的探针针对分析物分子或分析物组分而言为直接可达的。在一些实施方案中，大多数探针位于网络内部。
一种或多种探针可共价或非共价固定于网络上。举例而言，探针可与交联聚合物交联或探针可非共价结合至网络(比如根据结合至共价结合至网络的分子)。在一优选实施方案中，一种或多种探针与交联聚合物交联。在一些实施方案中，大多数探针共价结合于网络内部(例如使得至少一部分探针邻接通道)。
不受理论束缚，本发明公开内容者相信归因于探针分子(尤其核酸探针分子)与盐晶体之间的静电相互作用，用于在盐晶体(尤其磷酸盐晶体)存在下制造三维网络的描述于章节5.3中的方法可在聚合物与通道之间的界面处或在界面附近产生更大浓度的探针分子。因此，在本发明公开内容的一些实施方案中，本发明公开内容提供根据本发明公开内容的网络，在其中探针密度在聚合物与通道之间的界面处比在不邻接通道的聚合物区域内更大。在各种实施方案中，探针密度在聚合物与通道之间的界面处比在不邻接通道的聚合物区域内致密至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％。
网络中探针分子的密度可使用以下程序证实：
在室温下在例如碗中使网络与水性液体接触。液体含有连接至以下结构部分的多个纳米粒子，该结构部分与网络中的探针分子(例如在探针分子经生物素标记(biotinylated)的情况下为抗生蛋白链菌素(streptavidin))相互作用。纳米粒子的大小小于网络的筛目大小且小于通道的最小横截面以允许纳米粒子分布在整个聚合物中。适合的纳米粒子为直径为2-5纳米的量子点。
选择培育期使得液体中的网络完全水合，即网络平均吸收与其释放相同量的水。培育期可为例如一小时。网络中纳米粒子的渗透可通过在培育期间设置网络和/或液体的运动、例如根据振动网络和/或液体(优选藉助于超声波)来加速。
培育完成后，例如通过自碗排出液体或将网络自碗中取出使液体与网络分离。
随后，例如藉助于液氮冷冻水合网络。此后，可藉助于低温切片机沿着相互平行的切割平面将冷冻网络切成薄切片。切割平面横向于通道的纵向延伸部而布置且穿透通道。优选使用液氮冷却的金刚石刀片进行切割。切片厚度可为例如约100nm或200nm。
藉助于显微镜，定位置于根据切割冷冻网络获得的盘片中的纳米粒子。必要时，纳米粒子可为荧光的且经光学突显，使得其可更好地与网络区别。可使用适合软件用图像处理方法进行纳米粒子的定位。为检查盘片，优选使用具有荧光光学器件的共焦显微镜激光扫描显微镜或电子显微镜。
藉助于计算机，以此方式获得的纳米粒子的几何结构和/或位置信息可用于制造网络中的纳米粒子分布的三维几何模型。随后该模型可用于确定纳米粒子分布是否反映通道位点附近的探针分子的更大密度。
5.2阵列
本发明公开内容的三维网络可安置(例如沉积)于基板上，且优选固定于基板上(例如通过网络与基板之间的共价交联)。多个网络可固定于基板上以形成例如适用作生物芯片的阵列。
适合的基板包括有机聚合物，例如环烯烃共聚物(COC)、聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯及聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA，
)。Ticona以商标名
出售适合COC的一实例。无机材料(例如金属、玻璃)亦可用作基板。此类基板可用有机分子涂布以允许网络与基板表面之间的交联。举例而言，无机表面可用自组装单层(SAM)涂布。SAM本身可完全不起反应和因此包含例如纯烷基硅烷或由纯烷基硅烷组成。其他基板亦可适用于与三维网络交联，其限制条件为其在自由基过程(例如有机硼化合物)期间能够与有机分子稳定结合。
基板可为硬性或挠性的。在一些实施方案中，基板呈盘(例如长方形盘、正方形盘、环形盘片等)形状。举例而言，基板可包含微孔盘，且三维网络可安置于盘的孔中。
个体网络可安置于基板表面上的相异斑点处，例如安置于包含多个行及列的矩阵中。在图11所显示的实施方案中，网络位于布置成六行及六列的36个斑点处。考虑具有不同数目的列及行的阵列，其中的每一个的数目可经独立地选择(例如2至64行及2至64列)。列可由距离X分隔开且行可由距离Y分隔开(例如如图12中所示)以便形成个体网络可位于其上的斑点网格。可选择X及Y使得位于网格斑点处的网络不以脱水状态彼此接触且不以水合状态彼此接触。尺寸X及Y可相同或不同。在一些实施方案中，X及Y相同。在一些实施方案中，X及Y不同。在一些实施方案中，X及Y独立地选自至少约500μm的距离(例如500μm至5mm、500μm至4mm、500μm至3mm、500μm至2mm或500μm至1mm)。在一些实施方案中，X及Y均为约500μm。在其他实施方案中，X及Y均为500μm。
在一些实施方案中，基板为条带形的(例如，如图13中所示)。网络可经布置为在条带形有机表面的纵向方向上延伸的单列，或可经布置为在条带形表面的纵向方向上延伸的多个列。此类条带形阵列中的列及行可具有如上文所描述的网格尺寸X及Y。
个体网络可各自覆盖阵列的环形或基本上环形的表面区域。典型地，被个体网络覆盖的阵列的表面上的区域的直径(即斑点直径)为80μm至1000μm。在各种实施方案中，斑点直径为80μm、100μm、120μm、140μm、160μm、180μm、200μm、300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、800μm、900μm或1000μm，或选自由前述实施方案中的任两者界定的范围，例如80μm至200μm、100μm至120μm、120μm至140μm、120μm至180μm、140μm至160μm、160μm至180μm、180μm至200μm、120μm至200μm、100μm至400μm、160μm至600μm或120μm至700μm等等。在一优选实施方案中，直径在100μm至200μm或其子范围的范围内。
本发明公开内容阵列典型地具有至少8个个体三维网络。在某些方面中，阵列具有至少16、至少24、至少48、至少96、至少128、至少256、至少512或至少1024个个体三维网络。在一些实施方案中，本发明公开内容阵列具有24、48、96、128、256、512、1024、2048、4096或8192个个体网络，或具有选自根据前述实施方案中的任两者界定的范围的许多三维网络，例如8至128、8至512、24至8192、24至4096、48至2048、96至512、128至1024、24至1024、48至512、96至1024或128至512个三维网络等等。在一优选实施方案中，阵列上三维网络的数目在8至1024范围内。在一尤其优选实施方案中，阵列上三维网络的数目在25至400范围内。
包含本发明公开内容阵列的个体网络可具有相同或不同探针(例如各网络可具有独特的探针组，多个网络可具有相同的探针组和其他网络可具有不同的一组或多组探针，或所有网络可具有相同的探针组)。举例而言，布置于矩阵的相同行中的网络可包含相同探针和布置于矩阵的不同行中的网络可具有不同探针。
典型地，阵列上的个体网络的斑点直径和/或网络体积彼此改变不大于20％、不大于15％、不大于10％或不大于5％。
在一些实施方案中，阵列包含具有一种或多种对照寡核苷酸或探针分子的一个或多个个体网络(例如阵列上的斑点)。对照寡核苷酸可经标记，例如经荧光标记以用作空间对照(a spatial control)(用于空间定向阵列)，和/或量化结合至网络的探针分子的量，例如当洗涤且再使用本发明公开内容阵列(即作为“可重用性对照”)时。空间及可重用性对照探针(其可为相同或不同探针)在章节7.2中称作“着陆灯”，其中相同探针用于两个目的。
阵列上的相同斑点或阵列上的不同斑点可进一步包括与已知目标互补的未经标记的探针。当用于杂交分析时，确定未经标记的探针与标记目标的杂交信号强度可确定杂交反应的效率。当个体网络(即阵列上的斑点)既用作可重用性和/或空间对照又用作杂交对照时，与可重用性对照或空间对照探针的荧光部分不同的荧光部分可用于标记目标分子。
在一些实施方案中，本发明公开内容阵列可再使用至少5次、至少10次、至少20次、至少30次、至少40次或至少50次(例如5至20次、5至30次、10至50次、10至20次、10至30次、20至40次或40至50次，优选包含再使用阵列10至50次)。可用盐溶液在变形条件(例如低盐浓度及高温)下洗涤阵列。举例而言，可在使用之间用1-10mM磷酸盐缓冲剂在80-90℃下洗涤阵列。可基于目标:探针杂合物(hybrid)的长度(Tm)而选择洗涤温度。
阵列的完整性可根据“可重用性对照”探针确定。可重用性对照探针可经荧光标记或可通过与经荧光标记的互补核酸杂交来检测。在核酸的完整性受损之前，经荧光标记的可重用性对照探针的荧光标记可通过重复激发来漂白；在此等情况下任何其他再使用可包括检测与作为对照的经荧光标记的互补核酸的杂交。典型地，本发明公开内容阵列稳定至少6个月。
在各种实施方案中，经荧光标记的可重用性对照探针在使用5、10、20、30、40或50次后保留至少99％、95％、90％、80％、70％、60％或50％的其初始荧光信号强度。优选地，可重用性对照探针在使用5或10次后保留至少75％的其荧光信号强度。阵列可继续再使用直至可重用性对照探针在例如再使用20、30、40或50次后保留至少50％的其荧光信号强度。可在以下各者之间测试对照探针的荧光信号强度：每次再使用、每隔一次再使用、每第三次再使用、每第四次再使用、每第五次再使用、每第六次再使用、每第七次再使用、每第八次再使用、每第九次再使用、每第十次再使用或上文的组合。举例而言，可在最初5或10次再使用之间周期性地测试信号强度，且测试频率随再使用的数目增加，使得其在某一数目(例如5、10、20、30、40或50次)使用后的各再使用后测试。在一些实施方案中，测试频率平均一次/1、1.5、2、2.5、3、4、5或10次使用，或平均值在前述值中的任两者之间界定的范围内，例如一次/1-2次使用、一次/1-1.5次使用、一次/1-3次使用或一次/1.5-3次使用。
应指出出于方便及参考目的，包括“空间对照”、“可重用性对照”及“杂交对照”的命名法，且不意欲意味提及“空间对照”、“可重用性对照”及“杂交对照”的探针按此使用的要求。
5.3用于制备三维聚合物网络的方法
在一个方面中，用于制备三维聚合物网络的本发明公开内容方法包括(a)将包含水性盐溶液、聚合物、交联剂及非必要地一种或多种探针的混合物曝露至盐晶体形成条件，(b)将混合物曝露至交联条件以使聚合物交联而形成交联聚合物网络，和(c)使交联聚合物网络与溶剂接触以溶解盐晶体和形成一个或多个通道。
该方法可进一步包括以下步骤：通过结合水性盐溶液、聚合物、交联剂及非必要地一种或多种探针而形成混合物，和/或进一步包括以下步骤：将混合物曝露至盐形成条件之前将混合物涂覆至基板(例如描述于章节5.2中的基板)。若正使用的聚合物具有预连接的交联剂(例如当使用由包含交联剂的单体聚合的共聚物时)，则形成混合物的步骤可包括将水性盐溶液与聚合物及非必要地一种或多种探针结合。
通过盐晶体溶解形成的通道可具有描述于章节5.1.3中的一个或多个特征。
在将混合物曝露至盐形成条件之前，可例如通过将混合物喷涂于基板表面(例如表面上的1024个位点处)上将混合物涂覆至基板。可使用例如DNA芯片测位仪或喷墨打印机将混合物涂覆至表面。在一优选实施方案中，使用喷墨打印机喷涂混合物。此准许混合物简单且快速涂覆至基板上的大量斑点。斑点可按例如呈若干列和/或行形式的矩阵的形式排列。优选地，在印刷期间混合物中的盐含量低于溶解限度，使得混合物在打印机的印刷头部中不结晶。在个体斑点处涂覆的混合物的体积可为例如100pl、200pl、300pl、400pl、500pl、750pl、1nl、2nl、3nl、4nl或5nl，或可选自根据前述值中的任两者界定的范围(例如100pl至5nl、100pl至1nl、300pl至1nl、200pl至750nl、100pl至500pl、200pl至2nl、500pl至2nl、1nl至2nl等等)。在优选实施方案中，斑点体积为200pl至4nl。
个体斑点的直径将取决于混合物组成、所涂覆混合物的体积及基板的表面化学性质而定。斑点直径典型地在80μm至1000μm之间的范围内且可通过改变前述参数获得。在各种实施方案中，斑点直径为80μm、100μm、120μm、140μm、160μm、180μm、200μm、300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、800μm、900μm或1000μm，或选自根据前述实施方案中的任两者界定的范围，例如80μm至200μm、100μm至120μm、120μm至140μm、120μm至180μm、140μm至160μm、160μm至180μm、180μm至200μm、120μm至200μm、100μm至400μm、160μm至600μm或120μm至700μm等等。在一优选实施方案中，直径在100μm至200μm或其子范围的范围内。
可用于本发明公开内容方法的适合聚合物、交联剂及探针分别描述于章节5.1.1、5.1.2及5.1.4中。在一些实施方案中，方法中所使用的聚合物对于每聚合物分子具有至少一个交联剂基团。在一优选实施方案中，聚合物对于每分子具有至少两个交联剂基团。在一尤其优选实施方案中，聚合物对于每分子具有至少两个光反应性交联剂基团。在这些实施方案中，不需要单独的聚合物及交联剂分子。
可包含于混合物中的适合盐描述于章节5.3.1中。适合的盐形成条件描述于章节5.3.2中。适合的交联条件描述于章节5.3.3中。用于溶解盐晶体的适合溶剂描述于章节5.3.4中。
5.3.1盐
可针对盐与一种或多种探针的相容性而选择盐。理想地，盐具有一个或多个以下特征：(i)盐对探针不具有毒性(例如盐不使探针变性)，(ii)盐不以化学方式与探针反应，(iii)盐不攻击适用于探针的光学标记的荧光团，比如花青染料，(iv)盐不与分析物、检测分子和/或结合至其上的结合配偶体(binding partners)反应，和/或(v)盐形成针形晶体。
在一优选实施方案中，盐溶液包含单价阳离子。混合物可包含在水溶液中释放Na+阳离子及磷酸根离子PO4 3-的磷酸氢二钠和/或磷酸二氢钠。磷酸钠可易溶于水中和形成无色晶体。
在一尤其优选实施方案中，混合物包含磷酸氢二钾(K2HPO4)和/或磷酸二氢钾(KH2PO4)。这些盐可极好地溶于水中和因此能在混合物中形成相对应的大量针形盐晶体。
5.3.2盐晶体形成条件
盐晶体形成条件可包含通过使混合物脱水或冷却混合物直至混合物中的相对盐含量增加至高于溶解限度(意谓混合物被盐过饱和)，在混合物中形成至少一种盐晶体，优选针形盐晶体。这促进盐晶体自位于混合物体积中的结晶胚朝向混合物表面形成。
可通过加热混合物、将混合物曝露至真空和/或降低混合物周围的大气的湿度来使混合物脱水。
可通过将混合物置于经加热基板或表面(例如在约50℃至约70℃之间)上、加热其上已置放混合物的基板或表面(例如至约50℃至约70℃之间)和/或使混合物与热气体(例如温度高于混合物温度的空气、氮气或二氧化碳)接触使得水自混合物中蒸发来加热混合物。与热气体接触可例如通过将混合物置放于加热烘箱中发生。在输送至加热烘箱期间，混合物优选保持潮湿，特别地在高于75％的相对湿度下。此结果为在将混合物输送至加热烘箱期间盐晶体的不受控形成得以削弱。此准许更长的针形盐晶体在加热烘箱中形成。通过加热混合物，亦有可能活化可热活化的交联剂(若存在)且从而使聚合物交联。
在一些实施方案中，用以使混合物脱水的经加热基板和/或空气的温度为高于加热混合物之前的混合物温度20℃或更高，但小于100℃。
可通过将混合物置放于冷却的基板或表面(例如在约5℃至约15℃之间)上、冷却其上已置放混合物的基板或表面(例如至约5℃至约15℃之间)和/或使其与冷气体(例如温度低于混合物温度的空气、氮气或二氧化碳)接触来冷却混合物。当冷却时，混合物中盐的温度依赖性溶解限度减小直至混合物最终被盐过饱和。通过此促进了一种或多种盐晶体(优选针形盐晶体)的形成。在一些实施方案中，通过将混合物培育在具有低湿度(例如温度在0℃与10℃之间，相对湿度<40％)的冷室中来冷却混合物。
在形成该一种或多种盐晶体期间，混合物中的温度优选保持高于混合物周围的环境空气的露点。这防止混合物变得用由环境空气冷凝的水稀释，其可导致混合物中相对盐含量的降低。
5.3.3交联条件
可基于所使用交联剂的类型选择交联条件。举例而言，当使用通过紫外光活化的交联剂(例如二苯甲酮、噻吨酮或安息香醚)时，交联条件可包含将混合物曝露至紫外(UV)光。在一些实施方案中，使用波长为约250nm至约360nm(例如260±20nm或355±20nm)的UV光。使用更低能量/更长波长的UV光(例如相较于254nm UV光，使用360nm UV光)可需要更长的曝露时间。当使用通过可见光活化的交联剂(例如乙基曙红、曙红Y、玫瑰红、樟脑醌或赤藓红)时，交联条件可包含将混合物曝露至可见光。当使用经热活化的交联剂(例如4,4'偶氮双(4-氰基戊酸)和2,2-偶氮双[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二盐酸化物或过氧化苯甲酰)时，交联条件可包含将混合物曝露至热。
可选择交联条件的长度及强度以影响聚合物分子与其他聚合物分子的交联、聚合物分子与探针分子的交联(若存在)和聚合物分子与存在于基板上的基板分子或有机分子的交联(若存在)。用于含有探针的混合物的交联条件的长度及强度可以实验方式确定以平衡例如探针分子固定及诞生(nativity)的稳固。
5.3.4盐晶体溶解
使聚合物交联后，该一种或多种盐晶体可以按使得至少一个通道形成于网络中的方式溶解于溶剂中，该通道自网络表面和/或网络表面附近开始延伸于网络内部中。有利地，根据“损失(lost)”形式的原理，盐晶体已溶解于溶剂中后，在其中盐晶体的地点中产生中空狭长的通道。通道允许分析物经由通道渗透于网络内部中且特异性地结合位于网络内部中的探针。当使用根据本发明公开内容方法产生的阵列作为生物传感器时，准许高的测量精确性及高的测量动力学。
用于溶解该一种或多种盐晶体的溶剂可以使得其与聚合物及探针(若存在)相容的方式经选择(例如溶剂可经选择使得其不溶解聚合物及探针)。优选地，所使用溶剂为水基缓冲剂，比如稀释的磷酸盐缓冲剂。甲醇、乙醇、丙醇或这些液体的混合物可添加至缓冲剂中以促进未结合聚合物自网络移除。
移除盐晶体后，网络可归因于干燥而塌陷且可再水合。将网络干燥具有运送且稳定化探针生物分子的优势。
5.3.5使用三维网络的方法
本发明公开内容的网络及阵列可用于确定是否在样品、优选液体样品中存在分析物。本发明公开内容因而提供用于确定分析物是否存在于一个样品或多个样品中的方法，其包括使包含能够结合至分析物的探针分子的本发明公开内容的网络或阵列与该样品或多个样品接触，且检测分析物与探针分子的结合，从而确定分析物是否存在于该样品或多个样品中。当包含能够结合不同种类分析物的不同种类探针的阵列用于方法时，可通过检测不同种类分析物与探针的结合来确定不同种类分析物的存在。在一些实施方案中，该方法进一步包括以下步骤：量化结合至阵列的一种或多种分析物的量。
分析物可为例如核酸，比如聚合酶链式反应(PCR)扩增子。在一些实施方案中，PCR扩增子自生物或环境样品(例如血液、血清、血浆、组织、细胞、唾液、痰、尿液、脑脊髓液、胸膜液、乳汁、泪液、大便、汗水、精液、全细胞、细胞成分、细胞涂片或其提取物或衍生物)中扩增。在一些实施方案中，核酸经标记(例如经荧光标记)。
置于网络表面上的分析物可经由通道渗透于网络内部中以便特异性结合至在那里共价结合至聚合物的探针(例如生物分子)。当使用其上固定有网络的本发明公开内容阵列作为生物传感器时，准许高的测量精确性以及高的测量动力学。
用作生物传感器后本发明公开内容的网络及阵列可再生且可使用若干次(例如5次、至少10次、至少20次、至少30次、至少40次或至少50次)。若探针分子为DNA，则这可例如通过在1×磷酸盐缓冲盐水中将一个或多个网络加热至80℃与90℃之间的温度约10分钟来实现。随后，可用新磷酸盐缓冲盐水来更换磷酸盐缓冲盐水以自一个或多个网络中洗涤出变性的DNA。若一个或多个网络或阵列的探针分子为抗原，则一个或多个网络或阵列可通过使一个或多个网络与0.1N NaOH接触约10分钟来再生。随后，可用磷酸盐缓冲盐水更换0.1NNaOH以自网络中洗涤出抗原。因此，使用本发明公开内容的网络及阵列的方法的一些实施方案包含在与一个样品或多个样品接触之前使用已经洗涤的网络或阵列。
5.4本发明公开内容阵列的应用
因为本发明公开内容阵列获得对核酸在样品中的定性及定量存在的低成本确定，对于与人类及非人类动物的健康及疾病相关的问题，其具有直接适用。
在这些应用中，含有目标分子的制剂根据现有技术中已知的方案自生物或环境来源衍生或提取。目标分子可自所有分类级别的细胞及组织衍生或提取，包括所有门及纲的病毒、细菌及真核生物、原核生物、原生生物、植物、真菌及动物。动物可为脊椎动物、哺乳动物、灵长类动物且尤其为人类。血液、血清、血浆、组织、细胞、唾液、痰、尿液、脑脊髓液、胸膜液、乳汁、泪液、大便、汗水、精液、全细胞、细胞成分及细胞涂片为目标分子的适合来源。
目标分子优选为自前述来源中的任一个扩增(例如根据PCR)的核酸。
本发明公开内容阵列可包括适用于检测人类或非人类动物的病原体的探针。此类探针包括与细菌、病毒或真菌目标或细菌、病毒及真菌目标的任何组合至少部分互补的寡核苷酸。
本发明公开内容阵列可包括适用于检测人类或非人类动物细胞中的基因表现的探针，例如出于诊断个体、监测个体治疗或预测个体结果的目的，与比如癌症、心血管疾病或代谢疾病的疾病或病症相关的基因表现。随后基因表现信息可追踪疾病进展或消退，且此类信息可帮助监测初始疗法的成功或改变其过程。
6.实施例
涉及图中所提供的参考编号的以下例示性方案在本发明公开内容范畴内且可分别结合章节5.1.1、5.1.2及5.1.4的聚合物、交联剂及探针而使用。用于以下方法中的其他适用聚合物(包括共聚物)和交联剂基团描述于Rendl等人,2011,Langmuir 27:6116-6123及US 2008/0293592中，其内容以引用的方式并入本文中。在一个实施方案中，使用通过章节7.1的聚合物混合物。
6.1例示性方案1
将具有有机表面(2)的盘置于经加热固持器(6)上。在50℃与70℃之间的温度为适合的。使用标准DNA芯片测位仪(例如Scienion,Germany)将含有聚合物(3)、探针生物分子(1)和水性盐溶液的混合物(5)点样于有机表面(2)上。将0.5至4nl的体积印刷于各斑点(7)上(参见图2)。这些斑点的液体几乎立即干燥，导致盐晶体(8)极快速地成核。成核后，针形盐晶体可自位于混合物(5)的体积中的至少一种结晶胚(9)延伸至混合物(5)的表面(10)(参见图3)。晶体(8)成核后，在UV交联仪中立即用光学UV辐射(11)照射斑点(7)(参见图4)，使得探针生物分子(1)共价结合至聚合物(3)，且聚合物(3)共价结合至有机表面(2)且经交联(参见图5)。注意经干燥交联的混合物(5)不吸引湿气而再次变成液体。
随后使干燥交联的混合物(5)与用于晶体(8)的溶剂(12)接触，使得在晶体(8)的地点处，通道(13)形成于包含聚合物(3)和探针生物分子(1)的网络(15)中(参见图6)。此后，移除溶剂(12)。通道(13)可自网络(15)的表面(16)延伸于网络(15)的内部中。以使得其与探针生物分子(1)以及聚合物(3)相容的方式选择溶解盐晶体(8)的溶剂(12)。优选地，所使用的溶剂(12)为基于水的。
6.2例示性方案2
使用标准DNA芯片测位仪(例如Scienion,Germany)将含有聚合物(3)、探针生物分子(1)和水性盐溶液的混合物(5)点样于在盘上布置的有机表面(2)上。将0.5至4nl的体积印刷于各斑点7上(参见图2)。将于有机表面(2)上具有斑点(7)的盘置于经冷却固持器(14)上(参见图7)。在5℃与15℃之间的温度为适合的。将这些斑点液体冷却至达到几乎立即引起晶体成核的缓冲剂过饱和。成核后针形盐晶体(8)可自位于混合物(5)的体积中的至少一种结晶胚(9)延伸至混合物(5)的表面(10)。印刷后将这些目标置于烘箱(例如在70℃下)中以完成干燥。晶体成核后，在UV交联仪中立即用光学UV辐射(11)照射斑点(参见图8)，使得探针生物分子(1)共价结合至聚合物(3)，且聚合物(3)共价结合至有机表面(2)且经交联。注意经干燥交联的混合物不吸引湿气而再次变成液体。
随后使经干燥交联的混合物(5)与溶剂(12)接触以溶解晶体(8)，使得在晶体(8)的地点处，通道(13)形成于包含聚合物(3)和探针生物分子(1)的网络(15)中。此后，移除溶剂(12)。通道(13)可自网络(15)的表面(16)延伸于网络(15)的内部中。以使得其与探针生物分子(1)和聚合物(3)相容的方式选择溶解盐晶体(8)的溶剂(12)。优选地，所使用的溶剂(12)为基于水的。
如图9中可见，多个通道(13)可形成于网络(15)中。通道(13)可自网络(15)的表面(16)延伸至位于网络(15)内的至少一个点。通道(13)可以按使得通道(13)之间的横向距离在内部方向上自表面(16)开始减小的方式布置。
6.3例示性方案3
在正常条件下在40-80％、优选50-70％范围内的湿度下将含有聚合物(3)、探针生物分子(1)和水性盐溶液的混合物(5)印刷于盘的有机表面(2)上。混合物可接近饱和，例如400mM磷酸钠，pH 8。将0.5至4nl的体积印刷于各斑点(7)上。印刷隔室中的水分含量确保斑点(7)保持液体而无晶体形成(即不发生成核)。随后将盘置于容器中，例如卡纸板盒。将盖子安放于具有有机表面(2)的盘上以用于输送。随后将于有机表面(2)上具有斑点(7)的盘置于干燥烘箱中或热板上以快速引起成核，使得针形盐晶体(8)自位于混合物体积中的至少一种结晶胚(9)朝向混合物(5)的表面10延伸。
烘箱/热板的温度应为高于印刷温度20℃或更高。不需要高于100℃的温度。
在干燥后，照射混合物以使聚合物(3)、探针生物分子(1)和有机表面(2)交联。
随后使经干燥交联的混合物(5)与溶剂(12)接触，使得在晶体(8)的地点处，通道(13)形成于包含聚合物(3)和探针生物分子(1)的网络(15)中。此后，移除溶剂(12)。通道(13)可自网络(15)的表面(16)延伸于网络(15)的内部中。以使得其与探针生物分子(1)和聚合物(3)相容的方式选择溶解盐晶体(8)的溶剂(12)。优选地，所使用的溶剂(12)为基于水的。
6.4例示性方案4
或者，可冷却如在例示性方案3中制备的于有机表面(2)上具有斑点(7)的盘以通过置于具有低湿度(例如温度<10℃，相对湿度<40％)的冷室中获得成核。可在开始成核后通过降低湿度或通过施加真空来进行干燥。成核后，针形盐晶体(8)可自位于混合物(5)的体积中的至少一种结晶胚(9)朝向混合物(5)的表面(10)延伸。将于有机表面(2)上具有斑点(7)的盘置于60℃-70℃下的烘箱中1小时以完全地干燥斑点。在UV交联仪(即Stratalinker 2400)中在254nm下用1.00J UV照射斑点(7)。为进行此操作，可将于有机表面(2)上具有斑点(7)的盘置于较短侧平行于腔室门的腔室的中央中。随后，移出盖罩且启动交联仪。当机器完成时移出阵列且替换盖罩。
或者，可使用具有相同波长(例如240-270nm)或更长波长(例如360nm)的其他UV交联仪。
随后使混合物(5)与溶剂(12)接触以溶解晶体(8)，使得在晶体(8)的地点处，通道(13)形成于包含聚合物(3)和探针生物分子(1)的网络(15)中。此后，移除溶剂(12)。通道(13)可自网络(15)的表面(16)延伸于网络(15)的内部中。以使得其与探针生物分子(1)和聚合物(3)兼容的方式选择溶解盐晶体(8)的溶剂(12)。优选地，所使用的溶剂(12)为基于水的。
7.实施例
7.1实施例1：形成具有通道的三维聚合物网络
通过将10mg交联聚合物聚(二甲基丙烯酰胺)共聚5％甲基丙烯酰氧基二苯甲酮共聚2.5％4-乙烯基苯磺酸钠溶解于1.0ml无DNAse的水中来制备10mg/mL聚合物储备溶液。此通过剧烈震荡且涡流大约5分钟直至所有可见聚合物溶解来实现。随后将储备溶液包裹于箔片中以保护其免受光的影响且放置在冷冻机中隔夜以确保聚合物完全溶解且使得泡沫减少。聚合物对于每分子具有至少两个光反应性基团。
通过混合10μl 100μM DNA寡核苷酸储备溶液、5μl 10mg/mL聚合物储备溶液(以提供1mg/ml的聚合物于混合物中的浓度)和35μl500mM磷酸钠缓冲剂(pH 8)，来制备包含聚合物、DNA寡核苷酸探针及磷酸钠的混合物。
使用例示性方案1至4中的任一个的方法，使用混合物制备本发明公开内容三维网络。
7.2实施例2：使用三维聚合物网络检测细菌
7.2.1制备本发明公开内容阵列
将用于固定的寡核苷酸以20μM浓度溶解于400mM磷酸钠缓冲剂中，该磷酸钠缓冲剂pH为7，含有1mg/ml描述于实施例1中的光反应性聚合物。各寡核苷酸具有与目标DNA互补的30-35个核苷酸的长度及15个胸苷的尾部(总寡核苷酸长度为45-50个核苷酸)。
混合物用以将以下斑点印刷于盘的有机表面上以提供阵列：
LL：所谓的着陆灯。经Cy5标记的DNA寡核苷酸(0.2μM)、聚合物及未经标记的寡核苷酸19.8μM构成20μM总寡核苷酸浓度。
GN：对革兰氏(gram)阴性细菌具有特异性的寡核苷酸。
GP：对革兰氏阳性细菌具有特异性的寡核苷酸。
S.Aure_1：对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus bacteria)具有特异性的寡核苷酸。
S.Aure_2：对金黄色葡萄球菌具有特异性的寡核苷酸。
E.coli_1：对大肠杆菌(Escherichia coli bacteria)具有特异性的寡核苷酸。
E.coli_2：对大肠杆菌具有特异性的寡核苷酸。
为避免在来源盘(即取出混合物的盘)上形成盐晶体，将此盘保持在环境温度(22℃)下。
将具有平坦晶体透明底部具有有机表面的Greiner 96孔盘冷却至10℃以避免干燥出经印刷斑点。使用具有PDC 90喷嘴的
SciFlex 5打印机，将8滴/斑点印刷于有机表面上，产生大约1.4nl的斑点体积。打印机的湿度保持在60-65％相对湿度下。
印刷后，通过印刷头上的自动化头部相机检查斑点的大小，以确保斑点不干燥或在斑点中不发生晶体形成。所有斑点仍然湿润且具有相同大小。未可见到晶体形成。
随后用盖子密封96孔盘以避免斑点干燥且立即置于干燥烘箱中的热板(70℃)上以进行晶体引发和斑点的干燥。
在70℃下培育1小时以确保对斑点进行适当干燥后，在
2000中在254nm下用1J照射盘。
7.2.2制备对照阵列
使用与描述于章节7.2.1中的程序类似的程序，但实质上如Rendl等人,2011,Langmuir 27:6116-6123所描述，将目标盘保持在环境温度下。印刷后，一些斑点显示减小的尺寸，即阵列中随机地点中的一些斑点经干燥且在印刷后立即展现相分离。随后将盘自打印机中拿出且进行如上文所描述的样品干燥过程，其中盘上无盖子，接着进一步发生干燥。
7.2.3杂交分析
在使用之前，在盘清洗机中用300μl洗涤缓冲剂(100mM pH 7磷酸钠)洗涤盘3次，且随后将缓冲剂更换至1mM pH 7磷酸钠。在90℃下于加热器震荡器上加热盘10分钟以提取未结合的DNA及聚合物。随后使用自动化的96孔盘清洗机将缓冲剂更换至100mM磷酸钠缓冲剂。
于阵列上在80℃下将20ml经Cy5标记的PCR产物及30ml磷酸钠缓冲剂(250mM，pH7)的混合物培育10分钟，且于加热器震荡器上在55℃下培育30分钟。然后在96孔盘清洗机中用100mM pH 7磷酸钠缓冲剂洗涤盘三次。在
Flair读取器中扫描具有缓冲剂的盘且测量不同斑点的斑点强度。
7.2.4结果
分析通过章节7.2.1的方法产生的8个阵列及通过章节7.2.2的方法产生的8个阵列，且在电子表格程序中处理数据。计算且比较平均值及平均值的标准偏差(SEM)。结果显示于图14-16中。
8.实施例3：三维聚合物网络阵列的可重用性
根据描述于章节7.2.1中的程序制备若干阵列，其包括含有经荧光标记的寡核苷酸的“着陆灯”斑点。在杂交分析中再使用阵列且在杂交之间根据以下程序洗涤：
(a)用100mM pH 7磷酸盐缓冲剂洗涤阵列三次；
(b)随后将缓冲剂更换至1mM pH 7磷酸盐缓冲剂；和
(c)随后将阵列加热至80℃且用100mM pH 7磷酸盐缓冲剂趁热洗涤。
在使用之间确定来自着陆灯斑点的荧光信号的强度。10次使用后，荧光信号损失小于25％的其强度。再使用阵列直至用参考DNA杂交的参考斑点(内部对照)显示50％的信号损失。
9.特定实施方案
本发明公开内容根据下文的特定实施方案例示。
1.三维网络，其具有表面和内部，包含(a)交联聚合物、(b)一个或多个通道和(c)非必要地固定于网络中的探针分子，所述三维网络非必要地共价连接至基板表面。
2.如实施方案第1项的三维网络，其中该一个或多个通道中的至少一个自离该网络表面小于10微米的点延伸于内部中。
3.如实施方案第2项的三维网络，其中该一个或多个通道中的至少一个自离该网络表面小于9微米的点延伸于内部中。
4.如实施方案第3项的三维网络，其中该一个或多个通道中的至少一个自离该网络表面小于8微米的点延伸于内部中。
5.如实施方案第4项的三维网络，其中该一个或多个通道中的至少一个自离该网络表面小于7微米的点延伸于内部中。
6.如实施方案第5项的三维网络，其中该一个或多个通道中的至少一个自离该网络表面小于6微米的点延伸于内部中。
7.如实施方案第6项的三维网络，其中该一个或多个通道中的至少一个自离该网络表面小于5微米的点延伸于内部中。
8.如实施方案第7项的三维网络，其中该一个或多个通道中的至少一个自离该网络表面小于4微米的点延伸于内部中。
9.如实施方案第8项的三维网络，其中该一个或多个通道中的至少一个自离该网络表面小于3微米的点延伸于内部中。
10.如实施方案第9项的三维网络，其中该一个或多个通道中的至少一个自离该网络表面小于2微米的点延伸于内部中。
11.如实施方案第10项的三维网络，其中该一个或多个通道中的至少一个自离该网络表面小于1微米的点延伸于内部中。
12.如实施方案第11项的三维网络，其中该一个或多个通道中的至少一个自网络表面上的点延伸于内部中。
13.如实施方案第1项至第12项中任一项的三维网络，其中该一个或多个通道中的至少一个的长度为该网络最大尺寸的至少10％。
14.如实施方案第13项的三维网络，其中该一个或多个通道中的至少一个的长度为该网络最大尺寸的10％至100％。
15.如实施方案第13项或实施方案第14项的三维网络，其中该一个或多个通道中的至少一个的长度为该网络最大尺寸的至少15％。
16.如实施方案第13项或实施方案第14项的三维网络，其中该一个或多个通道中的至少一个的长度为该网络最大尺寸的至少20％。
17.如实施方案第13项或实施方案第14项的三维网络，其中该一个或多个通道中的至少一个的长度为该网络最大尺寸的至少25％。
18.如实施方案第13项或实施方案第14项的三维网络，其中该一个或多个通道中的至少一个的长度为该网络最大尺寸的10％至90％。
19.如实施方案第13项或实施方案第14项的三维网络，其中该一个或多个通道中的至少一个的长度为该网络最大尺寸的10％至80％。
20.如实施方案第13项或实施方案第14项的三维网络，其中该一个或多个通道中的至少一个的长度为该网络最大尺寸的10％至70％。
21.如实施方案第13项或实施方案第14项的三维网络，其中该一个或多个通道中的至少一个的长度为该网络最大尺寸的10％至60％。
22.如实施方案第13项或实施方案第14项的三维网络，其中该一个或多个通道中的至少一个的长度为该网络最大尺寸的10％至50％。
23.如实施方案第13项或实施方案第14项的三维网络，其中该一个或多个通道中的至少一个的长度为该网络最大尺寸的10％至40％。
24.如实施方案第13项或实施方案第14项的三维网络，其中该一个或多个通道中的至少一个的长度为该网络最大尺寸的10％至30％。
25.如实施方案第13项或实施方案第14项的三维网络，其中该一个或多个通道中的至少一个的长度为该网络最大尺寸的10％至25％。
26.如实施方案第13项或实施方案第14项的三维网络，其中该一个或多个通道中的至少一个的长度为该网络最大尺寸的10％至20％。
27.如实施方案第13项或实施方案第14项的三维网络，其中该一个或多个通道中的至少一个的长度为该网络最大尺寸的10％至15％。
28.如实施方案第13项或实施方案第14项的三维网络，其中该一个或多个通道中的至少一个的长度为该网络最大尺寸的15％至20％。
29.如实施方案第13项或实施方案第14项的三维网络，其中该一个或多个通道中的至少一个的长度为该网络最大尺寸的15％至25％。
30.如实施方案第13项或实施方案第14项的三维网络，其中该一个或多个通道中的至少一个的长度为该网络最大尺寸的15％至35％。
31.如实施方案第13项或实施方案第14项的三维网络，其中该一个或多个通道中的至少一个的长度为该网络最大尺寸的20％至25％。
32.如实施方案第13项或实施方案第14项的三维网络，其中该一个或多个通道中的至少一个的长度为该网络最大尺寸的25％至30％。
33.如实施方案第1项至第32项中任一项的三维网络，其中该一个或多个通道中的至少一个的最小横截面为该网络筛目大小的至少5倍。
34.如实施方案第33项的三维网络，其中该一个或多个通道中的至少一个的最小横截面为该网络筛目大小的至少10倍。
35.如实施方案第34项的三维网络，其中该一个或多个通道中的至少一个的最小横截面为该网络筛目大小的至少15倍。
36.如实施方案第35项的三维网络，其中该一个或多个通道中的至少一个的最小横截面为该网络筛目大小的至少20倍。
37.如实施方案第33项的三维网络，其中该一个或多个通道中的至少一个的最小横截面为该网络筛目大小的5至10倍。
38.如实施方案第33项的三维网络，其中该一个或多个通道中的至少一个的最小横截面为该网络筛目大小的5至15倍。
39.如实施方案第33项的三维网络，其中该一个或多个通道中的至少一个的最小横截面为该网络筛目大小的5至20倍。
40.如实施方案第33项的三维网络，其中该一个或多个通道中的至少一个的最小横截面为该网络筛目大小的5至25倍。
41.如实施方案第33项的三维网络，其中该一个或多个通道中的至少一个的最小横截面为该网络筛目大小的5至30倍。
42.如实施方案第33项的三维网络，其中该一个或多个通道中的至少一个的最小横截面为该网络筛目大小的10至15倍。
43.如实施方案第33项的三维网络，其中该一个或多个通道中的至少一个的最小横截面为该网络筛目大小的10至20倍。
44.如实施方案第33项的三维网络，其中该一个或多个通道中的至少一个的最小横截面为该网络筛目大小的10至25倍。
45.如实施方案第33项的三维网络，其中该一个或多个通道中的至少一个的最小横截面为该网络筛目大小的10至30倍。
46.如实施方案第33项的三维网络，其中该一个或多个通道中的至少一个的最小横截面为该网络筛目大小的15至20倍。
47.如实施方案第33项的三维网络，其中该一个或多个通道中的至少一个的最小横截面为该网络筛目大小的15至25倍。
48.如实施方案第33项的三维网络，其中该一个或多个通道中的至少一个的最小横截面为该网络筛目大小的15至30倍。
49.如实施方案第33项的三维网络，其中该一个或多个通道中的至少一个的最小横截面为该网络筛目大小的20至25倍。
50.如实施方案第33项的三维网络，其中该一个或多个通道中的至少一个的最小横截面为该网络筛目大小的20至30倍。
51.如实施方案第33项的三维网络，其中该一个或多个通道中的至少一个的最小横截面为该网络筛目大小的25至30倍。
52.如实施方案第1项至第51项中任一项的三维网络，其包含多个通道。
53.如实施方案第52项的三维网络，其中该多个通道为至少5个通道。
54.如实施方案第53项的三维网络，其中该多个通道为至少10个通道。
55.如实施方案第54项的三维网络，其中该多个通道为至少15个通道。
56.如实施方案第52项至第55项中任一项的三维网络，其中该多个通道为高达50个通道。
57.如实施方案第52项的三维网络，其中该多个通道为10至50个通道。
58.如实施方案第52项至第57项中任一项的三维网络，其中多个通道汇聚在网络内部中的点处，使得通道之间的横向距离自表面朝向内部中的点减小。
59.如实施方案第58项的三维网络，其中该多个通道在他们的汇聚点处连接。
60.如实施方案第58项的三维网络，其中该网络中的大多数通道汇聚在网络内部中的一个或多个点处，使得通道之间的横向距离自表面朝向内部中的点减小。
61.如实施方案第60项的三维网络，其中汇聚在网络内部中的相同点处的多个通道在他们的汇聚点处连接。
62.如实施方案第60项的三维网络，其中该网络中的大多数通道在网络中的一个或多个汇聚点处连接至其他通道。
63.如实施方案第52项至第62项中任一项的三维网络，其中至少多个通道或其中该网络中的大多数通道自离该网络表面小于10微米的点延伸于内部中。
64.如实施方案第63项的三维网络，其中至少多个通道或其中该网络中的大多数通道自离该网络表面小于9微米的点延伸于内部中。
65.如实施方案第64项的三维网络，其中至少多个通道或其中该网络中的大多数通道自离该网络表面小于8微米的点延伸于内部中。
66.如实施方案第65项的三维网络，其中至少多个通道或其中该网络中的大多数通道自离该网络表面小于7微米的点延伸于内部中。
67.如实施方案第66项的三维网络，其中至少多个通道或其中该网络中的大多数通道自离该网络表面小于6微米的点延伸于内部中。
68.如实施方案第67项的三维网络，其中至少多个通道或其中该网络中的大多数通道自离该网络表面小于5微米的点延伸于内部中。
69.如实施方案第68项的三维网络，其中至少多个通道或其中该网络中的大多数通道自离该网络表面小于4微米的点延伸于内部中。
70.如实施方案第69项的三维网络，其中至少多个通道或其中该网络中的大多数通道自离该网络表面小于3微米的点延伸于内部中。
71.如实施方案第70项的三维网络，其中至少多个通道或其中该网络中的大多数通道自离该网络表面小于2微米的点延伸于内部中。
72.如实施方案第71项的三维网络，其中至少多个通道或其中该网络中的大多数通道自离该网络表面小于1微米的点延伸于内部中。
73.如实施方案第72项的三维网络，其中至少多个通道或其中该网络中的大多数通道自网络表面上的点延伸于内部中。
74.如实施方案第52项至第73项中任一项的三维网络，其中至少多个通道或其中该网络中的大多数通道的长度为该网络最大尺寸的至少10％。
75.如实施方案第74项的三维网络，其中至少多个通道或其中该网络中的大多数通道的长度为该网络最大尺寸的10％至100％。
76.如实施方案第74项或实施方案第75项的三维网络，其中至少多个通道或其中该网络中的大多数通道的长度为该网络最大尺寸的至少15％。
77.如实施方案第74项或实施方案第75项的三维网络，其中至少多个通道或其中该网络中的大多数通道的长度为该网络最大尺寸的至少20％。
78.如实施方案第74项或实施方案第75项的三维网络，其中至少多个通道或其中该网络中的大多数通道的长度为该网络最大尺寸的至少25％。
79.如实施方案第74项或实施方案第75项的三维网络，其中至少多个通道或其中该网络中的大多数通道的长度为该网络最大尺寸的10％至90％。
80.如实施方案第74项或实施方案第75项的三维网络，其中至少多个通道或其中该网络中的大多数通道的长度为该网络最大尺寸的10％至80％。
81.如实施方案第74项或实施方案第75项的三维网络，其中至少多个通道或其中该网络中的大多数通道的长度为该网络最大尺寸的10％至70％。
82.如实施方案第74项或实施方案第75项的三维网络，其中至少多个通道或其中该网络中的大多数通道的长度为该网络最大尺寸的10％至60％。
83.如实施方案第74项或实施方案第75项的三维网络，其中至少多个通道或其中该网络中的大多数通道的长度为该网络最大尺寸的10％至50％。
84.如实施方案第74项或实施方案第75项的三维网络，其中至少多个通道或其中该网络中的大多数通道的长度为该网络最大尺寸的10％至40％。
85.如实施方案第74项或实施方案第75项的三维网络，其中至少多个通道或其中该网络中的大多数通道的长度为该网络最大尺寸的10％至30％。
86.如实施方案第74项或实施方案第75项的三维网络，其中至少多个通道或其中该网络中的大多数通道的长度为该网络最大尺寸的10％至25％。
87.如实施方案第74项或实施方案第75项的三维网络，其中至少多个通道或其中该网络中的大多数通道的长度为该网络最大尺寸的10％至20％。
88.如实施方案第74项或实施方案第75项的三维网络，其中至少多个通道或其中该网络中的大多数通道的长度为该网络最大尺寸的10％至15％。
89.如实施方案第74项或实施方案第75项的三维网络，其中至少多个通道或其中该网络中的大多数通道的长度为该网络最大尺寸的15％至20％。
90.如实施方案第74项或实施方案第75项的三维网络，其中至少多个通道或其中该网络中的大多数通道的长度为该网络最大尺寸的15％至25％。
91.如实施方案第74项或实施方案第75项的三维网络，其中至少多个通道或其中该网络中的大多数通道的长度为该网络最大尺寸的15％至30％。
92.如实施方案第74项或实施方案第75项的三维网络，其中至少多个通道或其中该网络中的大多数通道的长度为该网络最大尺寸的20％至25％。
93.如实施方案第74项或实施方案第75项的三维网络，其中至少多个通道或其中该网络中的大多数通道的长度为该网络最大尺寸的25％至30％。
94.如实施方案第52项至第93项中任一项的三维网络，其中至少多个通道或其中该网络中的大多数通道的最小横截面为该网络筛目大小的至少5倍。
95.如实施方案第94项的三维网络，其中至少多个通道或其中该网络中的大多数通道的最小横截面为该网络筛目大小的至少10倍。
96.如实施方案第95项的三维网络，其中至少多个通道或其中该网络中的大多数通道的最小横截面为该网络筛目大小的至少15倍。
97.如实施方案第96项的三维网络，其中至少多个通道或其中该网络中的大多数通道的最小横截面为该网络筛目大小的至少20倍。
98.如实施方案第94项的三维网络，其中至少多个通道或其中该网络中的大多数通道的最小横截面为该网络筛目大小的5至10倍。
99.如实施方案第94项的三维网络，其中至少多个通道或其中该网络中的大多数通道的最小横截面为该网络筛目大小的5至15倍。
100.如实施方案第94项的三维网络，其中至少多个通道或其中该网络中的大多数通道的最小横截面为该网络筛目大小的5至20倍。
101.如实施方案第94项的三维网络，其中至少多个通道或其中该网络中的大多数通道的最小横截面为该网络筛目大小的5至25倍。
102.如实施方案第94项的三维网络，其中至少多个通道或其中该网络中的大多数通道的最小横截面为该网络筛目大小的5至30倍。
103.如实施方案第94项的三维网络，其中至少多个通道或其中该网络中的大多数通道的最小横截面为该网络筛目大小的10至15倍。
104.如实施方案第94项的三维网络，其中至少多个通道或其中该网络中的大多数通道的最小横截面为该网络筛目大小的10至20倍。
105.如实施方案第94项的三维网络，其中至少多个通道或其中该网络中的大多数通道的最小横截面为该网络筛目大小的10至25倍。
106.如实施方案第94项的三维网络，其中至少多个通道或其中该网络中的大多数通道的最小横截面为该网络筛目大小的10至30倍。
107.如实施方案第94项的三维网络，其中至少多个通道或其中该网络中的大多数通道的最小横截面为该网络筛目大小的15至20倍。
108.如实施方案第94项的三维网络，其中至少多个通道或其中该网络中的大多数通道的最小横截面为该网络筛目大小的15至25倍。
109.如实施方案第94项的三维网络，其中至少多个通道或其中该网络中的大多数通道的最小横截面为该网络筛目大小的15至30倍。
110.如实施方案第94项的三维网络，其中至少多个通道或其中该网络中的大多数通道的最小横截面为该网络筛目大小的20至25倍。
111.如实施方案第94项的三维网络，其中至少多个通道或其中该网络中的大多数通道的最小横截面为该网络筛目大小的20至30倍。
112.如实施方案第94项的三维网络，其中至少多个通道或其中该网络中的大多数通道的最小横截面为该网络筛目大小的25至30倍。
113.如实施方案第1项至第112项中任一项的三维网络，其中该网络在其水合状态下的筛目大小为5nm至75nm。
114.如实施方案第113项的三维网络，其中该网络在其水合状态下的筛目大小为10nm至50nm。
115.如实施方案第113项的三维网络，其中该网络在其水合状态下的筛目大小为10nm至40nm。
116.如实施方案第113项的三维网络，其中该网络在其水合状态下的筛目大小为10nm至30nm。
117.如实施方案第113项的三维网络，其中该网络在其水合状态下的筛目大小为10nm至20nm。
118.如实施方案第113项的三维网络，其中该网络在其水合状态下的筛目大小为20nm至50nm。
119.如实施方案第113项的三维网络，其中该网络在其水合状态下的筛目大小为20nm至40nm。
120.如实施方案第113项的三维网络，其中该网络在其水合状态下的筛目大小为20nm至30nm。
121.如实施方案第113项的三维网络，其中该网络在其水合状态下的筛目大小为30nm至50nm。
122.如实施方案第113项的三维网络，其中该网络在其水合状态下的筛目大小为30nm至40nm。
123.如实施方案第113项的三维网络，其中该网络在其水合状态下的筛目大小为40nm至50nm。
124.如实施方案第1项至第123项中任一项的三维网络，其中交联聚合物为水可溶胀聚合物。
125.如实施方案第124项的三维网络，其中水可溶胀聚合物可吸收高达50倍的它的去离子蒸馏水的重量。
126.如实施方案第124项或实施方案第125项的三维网络，其中水可溶胀聚合物可吸收5至50倍的它的去离子蒸馏水的自身体积。
127.如实施方案第124项至第126项中任一项的三维网络，其中水可溶胀聚合物可吸收高达30倍的它的盐水的重量。
128.如实施方案第124项至第127项中任一项的三维网络，其中水可溶胀聚合物可吸收4至30倍的它的盐水的自身体积。
129.如实施方案第1项至第128项中任一项的三维网络，其中交联聚合物包含交联均聚物。
130.如实施方案第1项至第128项中任一项的三维网络，其中交联聚合物包含交联共聚物。
131.如实施方案第1项至第128项中任一项的三维网络，其中交联聚合物包含均聚物与共聚物的交联混合物。
132.如实施方案第129项至第131项中任一项的三维网络，其中交联聚合物包含由一种或多种种类的单体聚合的聚合物。
133.如实施方案第132项的三维网络，其中各种类的单体包含独立地选自以下的可聚合基团：丙烯酸酯基、甲基丙烯酸酯基、乙基丙烯酸酯基、2-苯基丙烯酸酯基、丙烯酰胺基、甲基丙烯酰胺基、衣康酸酯基及苯乙烯基。
134.如实施方案第133项的三维网络，其中聚合物中的至少一种单体种类包含甲基丙烯酸酯基。
135.如实施方案第134项的三维网络，其中包含甲基丙烯酸酯基的至少一种单体种类为甲基丙烯酰氧基二苯甲酮(MABP)。
136.如实施方案第132项的三维网络，其中交联聚合物包含由二甲基丙烯酰胺(DMAA)、甲基丙烯酰氧基二苯甲酮(MABP)和4-乙烯基苯磺酸钠(SSNa)聚合的聚合物。
137.如实施方案第1项至第136项中任一项的三维网络，其中探针分子共价连接至网络。
138.如实施方案第1项至第137项中任一项的三维网络，其中大多数探针分子固定于网络内部中。
139.如实施方案第138项的三维网络，其中至少一部分探针分子邻接通道。
140.在各种实施方案中，探针密度在聚合物与通道之间的界面处比在不靠近通道的聚合物区域内致密至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％。
141.如实施方案第1项至第139项中任一项的三维网络，其中探针密度在聚合物与通道之间的界面处比在不邻接通道的聚合物区域内平均大至少10％。
142.如实施方案第140项的三维网络，其中探针密度在聚合物与通道之间的界面处比在不邻接通道的聚合物区域内平均大至少20％。
143.如实施方案第140项的三维网络，其中探针密度在聚合物与通道之间的界面处比在不邻接通道的聚合物区域内平均大至少30％。
144.如实施方案第140项的三维网络，其中探针密度在聚合物与通道之间的界面处比在不邻接通道的聚合物区域内平均大至少40％。
145.如实施方案第140项的三维网络，其中探针密度在聚合物与通道之间的界面处比在不邻接通道的聚合物区域内平均大至少50％。
146.如实施方案第1项至第145项中任一项的三维网络，其中探针分子包含核酸、核酸衍生物、肽、多肽、蛋白质、碳水化合物、脂质、细胞、配位体或其组合，优选地其中探针分子包含核酸或核酸衍生物。
147.如实施方案第1项至第146项中任一项的三维网络，其中探针分子包含抗体、抗体片段、抗原、抗原决定基、酶、酶底物、酶抑制剂、核酸或其组合。
148.如实施方案第1项至第147项中任一项的三维网络，其中探针分子包含核酸。
149.如实施方案第148项的三维网络，其中核酸为寡核苷酸。
150.如实施方案第149项的三维网络，其中寡核苷酸为12至30个核苷酸长度。
151.如实施方案第149项的三维网络，其中寡核苷酸为14至30个核苷酸长度。
152.如实施方案第149项的三维网络，其中寡核苷酸为14至25个核苷酸长度。
153.如实施方案第149项的三维网络，其中寡核苷酸为14至20个核苷酸长度。
154.如实施方案第149项的三维网络，其中寡核苷酸为15至30个核苷酸长度。
155.如实施方案第149项的三维网络，其中寡核苷酸为15至25个核苷酸长度。
156.如实施方案第149项的三维网络，其中寡核苷酸为15至20个核苷酸长度。
157.如实施方案第149项的三维网络，其中寡核苷酸为16至30个核苷酸长度。
158.如实施方案第149项的三维网络，其中寡核苷酸为16至25个核苷酸长度。
159.如实施方案第149项的三维网络，其中寡核苷酸为16至20个核苷酸长度。
160.如实施方案第149项的三维网络，其中寡核苷酸为15至40个核苷酸长度。
161.如实施方案第149项的三维网络，其中寡核苷酸为15至45个核苷酸长度。
162.如实施方案第149项的三维网络，其中寡核苷酸为15至50个核苷酸长度。
163.如实施方案第149项的三维网络，其中寡核苷酸为15至60个核苷酸长度。
164.如实施方案第149项的三维网络，其中寡核苷酸为20至55个核苷酸长度。
165.如实施方案第149项的三维网络，其中寡核苷酸为18至60个核苷酸长度。
166.如实施方案第149项的三维网络，其中寡核苷酸为20至50个核苷酸长度。
167.如实施方案第149项的三维网络，其中寡核苷酸为30至90个核苷酸长度。
168.如实施方案第149项的三维网络，其中寡核苷酸为20至100个核苷酸长度。
169.如实施方案第149项的三维网络，其中寡核苷酸为20至60个核苷酸长度。
170.如实施方案第149项的三维网络，其中寡核苷酸为40至80个核苷酸长度。
171.如实施方案第149项的三维网络，其中寡核苷酸为40至100个核苷酸长度。
172.如实施方案第149项的三维网络，其中寡核苷酸为20至120个核苷酸长度。
173.如实施方案第149项的三维网络，其中寡核苷酸为20至40个核苷酸长度。
174.如实施方案第149项的三维网络，其中寡核苷酸为40至60个核苷酸长度。
175.如实施方案第149项的三维网络，其中寡核苷酸为60至80个核苷酸长度。
176.如实施方案第149项的三维网络，其中寡核苷酸为80至100个核苷酸长度。
177.如实施方案第149项的三维网络，其中寡核苷酸为100至120个核苷酸长度。
178.如实施方案第149项的三维网络，其中寡核苷酸为12至150个核苷酸长度。
179.一种阵列，其在基板上包含多个如实施方案第1项至第178项中任一项的三维网络。
180.如实施方案第179项的阵列，其中三维网络固定于基板上。
181.如实施方案第180项的阵列，其中三维网络通过网络与基板之间的共价键固定于基板上。
182.如实施方案第179项至第181项中任一项的阵列，其中基板包含有机聚合物，或在无机材料表面上具有有机分子的自组装单层的无机材料。
183.如实施方案第182项的阵列，其中基板包含选自环烯烃共聚物、聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯及聚甲基丙烯酸甲酯的有机聚合物。
184.如实施方案第183项的阵列，其中基板包含环烯烃共聚物、聚苯乙烯或聚甲基丙烯酸甲酯。
185.如实施方案第182项的阵列，其中基板包含在无机材料表面上具有烷基硅烷自组装单层的无机材料。
186.如实施方案第179项至第185项中任一项的阵列，其包含至少8个三维网络。
187.如实施方案第179项至第185项中任一项的阵列，其包含至少16个三维网络。
188.如实施方案第179项至第185项中任一项的阵列，其包含至少24个三维网络。
189.如实施方案第179项至第185项中任一项的阵列，其包含至少48个三维网络。
190.如实施方案第179项至第185项中任一项的阵列，其包含至少96个三维网络。
191.如实施方案第179项至第185项中任一项的阵列，其包含至少128个三维网络。
192.如实施方案第179项至第185项中任一项的阵列，其包含至少256个三维网络。
193.如实施方案第179项至第185项中任一项的阵列，其包含至少512个三维网络。
194.如实施方案第179项至第185项中任一项的阵列，其包含至少1024个三维网络。
195.如实施方案第179项至第185项中任一项的阵列，其包含24至8192个三维网络。
196.如实施方案第179项至第185项中任一项的阵列，其包含24至4096个三维网络。
197.如实施方案第179项至第185项中任一项的阵列，其包含24至2048个三维网络。
198.如实施方案第179项至第185项中任一项的阵列，其包含24至1024个三维网络。
199.如实施方案第179项至第185项中任一项的阵列，其包含24个三维网络。
200.如实施方案第179项至第185项中任一项的阵列，其包含48个三维网络。
201.如实施方案第179项至第185项中任一项的阵列，其包含96个三维网络。
202.如实施方案第179项至第185项中任一项的阵列，其包含128个三维网络。
203.如实施方案第179项至第185项中任一项的阵列，其包含256个三维网络。
204.如实施方案第179项至第185项中任一项的阵列，其包含512个三维网络。
205.如实施方案第179项至第185项中任一项的阵列，其包含1024个三维网络。
206.如实施方案第179项至第205项中任一项的阵列，其中三维网络中的每一个位于基板上的单独斑点处。
207.如实施方案第206项的阵列，其中斑点按行和/或列布置。
208.如实施方案第179项至第207项中任一项的阵列，其中基板包含微孔盘且三维网络安置于盘的孔中。
209.如实施方案第179项至第208项中任一项的阵列，其中该多个三维网络包含包括不同种类探针分子的两个或多于两个三维网络。
210.如实施方案第179项至第209项中任一项的阵列，其中该多个三维网络包含包括相同种类探针分子的两个或多于两个三维网络。
211.如实施方案第179项至第210项中任一项的阵列，其中大多数三维网络包含相同种类探针分子或其中所有三维网络包含相同种类探针分子。
212.如实施方案第179项至第211项中任一项的阵列，其中该多个三维网络包含包括经标记对照探针分子的一个或多个三维网络。
213.如实施方案第212项的阵列，其中经标记对照探针分子是经荧光标记。
214.如实施方案第212项或实施方案第213项的阵列，其中至少一种对照探针分子为空间对照(a spatial control)。
215.如实施方案第179项至第214项中任一项的阵列，其可再使用。
216.如实施方案第215项的阵列，其可再使用至少5次。
217.如实施方案第215项的阵列，其可再使用至少10次。
218.如实施方案第215项的阵列，其可再使用至少20次。
219.如实施方案第215项的阵列，其可再使用至少30次。
220.如实施方案第215项的阵列，其可再使用至少40次。
221.如实施方案第215项的阵列，其可再使用至少50次。
222.如实施方案第215项的阵列，其可再使用至少60次。
223.如实施方案第215项的阵列，其可再使用至少70次。
224.如实施方案第215项的阵列，其可再使用至少80次。
225.如实施方案第215项的阵列，其可再使用至少90次。
226.如实施方案第215项的阵列，其可再使用至少100次。
227.如实施方案第215项至第226项中任一项的阵列，其中至少一个三维网络为可重用性对照。
228.如实施方案第227项的阵列，其中可重用性对照包含经荧光标记的探针。
229.如实施方案第228项的阵列，其中可重用性对照亦为空间对照。
230.用于制备三维网络的方法，该三维网络具有表面和内部，包含(a)交联聚合物和(b)一个或多个通道，该方法包括：
(a)将混合物曝露至盐晶体形成条件，所述混合物包含(i)水性盐溶液、(ii)聚合物和(iii)交联剂，和非必要地安置于基板表面上，从而形成含有一种或多种盐晶体的混合物；
(b)将含有一种或多种盐晶体的混合物曝露至交联条件，从而形成含有一种或多种盐晶体的交联聚合物网络；和
(c)使含有一种或多种盐晶体的交联聚合物网络与该一种或多种盐晶体可溶于其中的溶剂接触，从而溶解盐晶体和形成一个或多个通道来替代盐晶体；
从而形成包含交联聚合物和一个或多个通道的三维网络。
231.如实施方案第230项的方法，其中盐形成条件包括形成一种或多种针形晶体。
232.如实施方案第230项或实施方案第231项的方法，其中该一个或多个通道中的至少一个具有如实施方案第2项至第51项中任一项的网络的通道的性质。
233.如实施方案第230项或实施方案第231项的方法，其中产生三维网络，其具有表面和内部，包含(a)交联聚合物和(b)多个通道。
234.如实施方案第233项的方法，其中该多个通道具有如实施方案第53项至第112项中任一项的网络的该多个通道的性质。
235.如实施方案第230项至第234项中任一项的方法，其中盐形成条件包括使混合物脱水。
236.如实施方案第235项的方法，其包括通过加热混合物、将混合物曝露至真空、降低混合物周围的大气的湿度或其组合来使混合物脱水。
237.如实施方案第236项的方法，其包括通过将混合物曝露至真空使混合物脱水。
238.如实施方案第236项的方法，其包括通过加热混合物使混合物脱水。
239.如实施方案第238项的方法，其中加热混合物包括使混合物与温度高于混合物温度的气体接触。
240.如实施方案第230项至第234项中任一项的方法，其中盐形成条件包括冷却混合物直至混合物被盐过饱和。
241.如实施方案第240项的方法，其包括通过使混合物与温度低于混合物温度的气体接触来冷却混合物。
242.如实施方案第230项至第241项中任一项的方法，其中在步骤(a)期间混合物的温度维持高于混合物周围的大气的露点。
243.如实施方案第230项至第242项中任一项的方法，其中交联剂通过紫外(UV)光活化和交联条件包括将混合物曝露至紫外光。
244.如实施方案第230项至第242项中任一项的方法，其中交联剂通过可见光活化和交联条件包括将混合物曝露至可见光。
245.如实施方案第230项至第242项中任一项的方法，其中交联剂通过热活化和交联条件包括将混合物曝露至热。
246.如实施方案第230项至第245项中任一项的方法，其中水性盐溶液包含单价阳离子。
247.如实施方案第246项的方法，其中单价阳离子包含Na+和/或K+，优选地其中单价阳离子包含Na+及K+。
248.如实施方案第247项的方法，其中水性盐溶液包含通过以下方法产生的溶液：包括将磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾或其组合溶解于水或水溶液中。
249.如实施方案第230项至第248项中任一项的方法，其中聚合物为水可溶聚合物。
250.如实施方案第230项至第249项中任一项的方法，其中聚合物包含均聚物。
251.如实施方案第230项至第249项中任一项的方法，其中聚合物包含共聚物。
252.如实施方案第230项至第249项中任一项的方法，其中聚合物包含均聚物与共聚物的混合物。
253.如实施方案第249项至第252项中任一项的方法，其中聚合物包含由一种或多种种类单体聚合的聚合物。
254.如实施方案第253项的方法，其中各种类的单体包含独立地选自以下的可聚合基团：丙烯酸酯基、甲基丙烯酸酯基、乙基丙烯酸酯基、2-苯基丙烯酸酯基、丙烯酰胺基、甲基丙烯酰胺基、衣康酸酯基及苯乙烯基。
255.如实施方案第254项的方法，其中聚合物中的至少一种单体种类包含甲基丙烯酸酯基。
256.如实施方案第255项的方法，其中包含甲基丙烯酸酯基的至少一种单体种类为甲基丙烯酰氧基二苯甲酮(MABP)。
257.如实施方案第253项中任一项的方法，其中聚合物包含由二甲基丙烯酰胺(DMAA)、甲基丙烯酰氧基二苯甲酮(MABP)和4-乙烯基苯磺酸钠(SSNa)聚合的聚合物。
258.如实施方案第230项至第257项中任一项的方法，其中聚合物为包含交联剂的共聚物。
259.如实施方案第258项的方法，其中聚合物每聚合物分子包含至少两个交联剂。
260.如实施方案第230项至第259项中任一项的方法，其中交联剂是选自二苯甲酮、噻吨酮、安息香醚、乙基曙红、曙红Y、玫瑰红、樟脑醌、赤藓红、4,4'偶氮双(4-氰基戊酸)、2,2-偶氮双[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二盐酸化物及过氧化苯甲酰。
261.如实施方案第260的方法，其中交联剂为二苯甲酮。
262.如实施方案第230项至第261项中任一项的方法，其中溶剂为水或水基缓冲剂。
263.如实施方案第262项的方法，其中溶剂为水。
264.如实施方案第262项的方法，其中溶剂为水基缓冲剂。
265.如实施方案第264项的方法，其中水基缓冲剂包含磷酸盐、甲醇、乙醇、丙醇或其混合物。
266.如实施方案第230项至第265项中任一项的方法，其中步骤(a)的混合物进一步包含探针分子。
267.如实施方案第266项的方法，其中至少一些、大多数或所有探针分子包含核酸、核酸衍生物、肽、多肽、蛋白质、碳水化合物、脂质、细胞、配位体或其组合。
268.如实施方案第267项的方法，其中至少一些探针分子包含核酸或核酸衍生物。
269.如实施方案第267项的方法，其中至少大多数探针分子包含核酸或核酸衍生物。
270.如实施方案第267项的方法，其中所有探针分子包含核酸或核酸衍生物。
271.如实施方案第266项的方法，其中至少一些、大多数或所有探针分子包含抗体、抗体片段、抗原、抗原决定基、酶、酶底物、酶抑制剂、核酸或其组合。
272.如实施方案第271项的方法，其中至少一些探针分子包含核酸。
273.如实施方案第271项的方法，其中至少大多数探针分子包含核酸。
274.如实施方案第271项的方法，其中所有探针分子包含核酸。
275.如实施方案第272项至第274项中任一项的方法，其中核酸为寡核苷酸。
276.如实施方案第275项的方法，其中寡核苷酸为12至30个核苷酸长度。
277.如实施方案第275项的方法，其中寡核苷酸为14至30个核苷酸长度。
278.如实施方案第275项的方法，其中寡核苷酸为14至25个核苷酸长度。
279.如实施方案第275项的方法，其中寡核苷酸为14至20个核苷酸长度。
280.如实施方案第275项的方法，其中寡核苷酸为15至30个核苷酸长度。
281.如实施方案第275项的方法，其中寡核苷酸为15至25个核苷酸长度。
282.如实施方案第275项的方法，其中寡核苷酸为15至20个核苷酸长度。
283.如实施方案第275项的方法，其中寡核苷酸为16至30个核苷酸长度。
284.如实施方案第275项的方法，其中寡核苷酸为16至25个核苷酸长度。
285.如实施方案第275项的方法，其中寡核苷酸为16至20个核苷酸长度。
286.如实施方案第275项的方法，其中寡核苷酸为15至40个核苷酸长度。
287.如实施方案第275项的方法，其中寡核苷酸为15至45个核苷酸长度。
288.如实施方案第275项的方法，其中寡核苷酸为15至50个核苷酸长度。
289.如实施方案第275项的方法，其中寡核苷酸为15至60个核苷酸长度。
290.如实施方案第275项的方法，其中寡核苷酸为20至55个核苷酸长度。
291.如实施方案第275项的方法，其中寡核苷酸为18至60个核苷酸长度。
292.如实施方案第275项的方法，其中寡核苷酸为20至50个核苷酸长度。
293.如实施方案第275项的方法，其中寡核苷酸为30至90个核苷酸长度。
294.如实施方案第275项的方法，其中寡核苷酸为20至100个核苷酸长度。
295.如实施方案第275项的方法，其中寡核苷酸为20至120个核苷酸长度。
296.如实施方案第275项的方法，其中寡核苷酸为20至40个核苷酸长度。
297.如实施方案第275项的方法，其中寡核苷酸为20至60个核苷酸长度。
298.如实施方案第275项的方法，其中寡核苷酸为40至80个核苷酸长度。
299.如实施方案第275项的方法，其中寡核苷酸为40至100个核苷酸长度。
300.如实施方案第275项的方法，其中寡核苷酸为40至60个核苷酸长度。
301.如实施方案第275项的方法，其中寡核苷酸为60至80个核苷酸长度。
302.如实施方案第275项的方法，其中寡核苷酸为80至100个核苷酸长度。
303.如实施方案第275项的方法，其中寡核苷酸为100至120个核苷酸长度。
304.如实施方案第275项的方法，其中寡核苷酸为12至150个核苷酸长度。
305.如实施方案第230项至第304项中任一项的方法，在步骤(a)之前其进一步包括将混合物涂覆至基板表面的步骤。
306.如实施方案第305项的方法，其中混合物以100pl至5nl的体积涂覆。
307.如实施方案第305项的方法，其中混合物以100pl至1nl的体积涂覆。
308.如实施方案第305项的方法，其中混合物以200pl至1nl的体积涂覆。
309.如实施方案第305项至第308项中任一项的方法，其中将混合物涂覆至基板的步骤包括将混合物喷涂于基板表面上。
310.如实施方案第309项的方法，其中混合物通过喷墨打印机喷涂。
311.如实施方案第305项至第310项中任一项的方法，其中基板包含有机聚合物，或在表面上具有有机分子的自组装单层的无机材料。
312.如实施方案第311项的方法，其中基板包含有机聚合物。
313.如实施方案第312项的方法，其中有机聚合物是选自环烯烃共聚物、聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯及聚甲基丙烯酸甲酯。
314.如实施方案第313项的方法，其中基板包含聚甲基丙烯酸甲酯、聚苯乙烯或环烯烃共聚物。
315.如实施方案第311项的方法，其中基板包含在表面上具有烷基硅烷自组装单层的无机材料。
316.如实施方案第305项至第315项中任一项的方法，其中基板包含微孔盘。
317.如实施方案第305项至第316项中任一项的方法，其中在步骤(b)中聚合物与表面交联。
318.如实施方案第317项的方法，其中产生与表面交联的水可溶胀聚合物。
319.如实施方案第318项的方法，其中水可溶胀聚合物可吸收高达50倍的它的去离子蒸馏水的重量。
320.如实施方案第318项或实施方案第319项的方法，其中水可溶胀聚合物可吸收5至50倍的它的去离子蒸馏水的自身体积。
321.如实施方案第318项至第320项中任一项的方法，其中水可溶胀聚合物可吸收高达30倍的它的盐水的重量。
322.如实施方案第318项至第321项中任一项的方法，其中水可溶胀聚合物可吸收4至30倍的它的盐水的自身体积。
323.用于制备阵列的方法，其包括通过如实施方案第230项至第322项中任一项的方法在相同基板的表面上的离散斑点处产生多个三维网络。
324.如实施方案第323项的方法，其中三维网络同时产生。
325.如实施方案第323项的方法，其中三维网络依序产生。
326.如实施方案第323项至第325项中任一项的方法，其进一步包括使该多个三维网络与基板表面交联。
327.用于制备阵列的方法，其包括在相同基板的表面上的离散斑点处安置如实施方案第1项至第178项中任一项的多个三维网络(a)或根据如实施方案第230项至第322项中任一项的方法产生或可获得的多个三维网络(b)。
328.如实施方案第323项至第327项中任一项的方法，其进一步包括使该多个三维网络与表面交联。
329.用于制备阵列的方法，其包括在相同基板的表面上的离散斑点处安置根据如实施方案第305项至第322项中任一项的方法产生或可获得的多个三维网络。
330.如实施方案第329项的方法，其中安置包括在离散斑点处涂覆由其形成三维网络的混合物。
331.如实施方案第323项至第330项中任一项的方法，其中斑点按行和/或列布置。
332.三维网络，其通过如实施方案第230项至第322项中任一项的方法产生或可获得。
333.阵列，其在基板上包含如实施方案第332项的多个三维网络。
334.阵列，其通过如实施方案第323项至第331项中任一项的方法产生或可获得。
335.如实施方案第333项或实施方案第334项的阵列，其包含至少8个三维网络。
336.如实施方案第333项或实施方案第334项的阵列，其包含至少16个三维网络。
337.如实施方案第333项或实施方案第334项的阵列，其包含至少24个三维网络。
338.如实施方案第333项或实施方案第334项的阵列，其包含至少48个三维网络。
339.如实施方案第333项或实施方案第334项的阵列，其包含至少96个三维网络。
340.如实施方案第333项或实施方案第334项的阵列，其包含至少128个三维网络。
341.如实施方案第333项或实施方案第334项的阵列，其包含至少256个三维网络。
342.如实施方案第333项或实施方案第334项的阵列，其包含至少512个三维网络。
343.如实施方案第333项或实施方案第334项的阵列，其包含至少1024个三维网络。
344.如实施方案第333项或实施方案第334项的阵列，其包含24至8192个三维网络。
345.如实施方案第333项或实施方案第334项的阵列，其包含24至4096个三维网络。
346.如实施方案第333项或实施方案第334项的阵列，其包含24至2048个三维网络。
347.如实施方案第333项或实施方案第334项的阵列，其包含24至1024个三维网络。
348.如实施方案第333项或实施方案第334项的阵列，其包含24个三维网络。
349.如实施方案第333项或实施方案第334项的阵列，其包含48个三维网络。
350.如实施方案第333项或实施方案第334项的阵列，其包含96个三维网络。
351.如实施方案第333项或实施方案第334项的阵列，其包含128个三维网络。
352.如实施方案第333项或实施方案第334项的阵列，其包含256个三维网络。
353.如实施方案第333项或实施方案第334项的阵列，其包含512个三维网络。
354.如实施方案第333项或实施方案第334项的阵列，其包含1024个三维网络。
355.如实施方案第333项至第354项中任一项的阵列，其中三维网络包含探针分子，和三维网络中的两个或多于两个包含不同种类探针分子。
356.如实施方案第333项至第355项中任一项的阵列，其中三维网络包含探针分子，且两个或多于两个三维网络包含相同种类探针分子。
357.如实施方案第333项至第354项中任一项的阵列，其中三维网络包含探针分子，且三维网络中的每一个包含相同种类探针分子。
358.如实施方案第333项至第357项中任一项的阵列，其中该多个三维网络包含包括经标记对照探针分子的一个或多个三维网络。
359.如实施方案第358项的阵列，其中经标记对照探针分子是经荧光标记。
360.如实施方案第333项至第359项中任一项的阵列，其中基板包含微孔盘和微孔盘的各孔含有不大于单个的三维网络。
361.用于确定分析物是否存在于样品中的方法，其包括：
(a)使包含能够结合至分析物的探针分子的如实施方案第1项至第178项或第332项中任一项的三维网络或如实施方案第179项至第229项或第333项至第360项中任一项的阵列与样品接触；和
(b)检测分析物与三维网络或阵列中的探针分子的结合，从而确定分析物是否存在于样品中。
362.如实施方案第361项的方法，其进一步包括在步骤(a)与(b)之间洗涤包含探针分子的网络或阵列。
363.如实施方案第361项或实施方案第362项的方法，其进一步包括在步骤(a)之前使包含探针分子的网络或阵列与阻断试剂接触。
364.如实施方案第361项至第363项中任一项的方法，其进一步包括量化结合至包含探针分子的三维网络或阵列的分析物的量。
365.用于确定分析物是否存在于多个样品中的各样品中的方法，其包括：
(a)使包含能够结合至分析物的探针分子的如实施方案第179项至第229项或第333项至第360项中任一项的阵列与样品接触；和
(b)检测分析物与阵列中的探针分子的结合，从而确定分析物是否存在于该多个样品中的各样品中。
366.用于确定分析物是否存在于多个样品中的各样品中的方法，其包括：
(a)使包含能够结合至分析物的探针分子的如实施方案第179项至第229项或第333项至第360项中任一项的阵列与样品接触，和包含对照探针分子，其中阵列在步骤(a)之前已经使用且洗涤；和
(b)检测分析物与阵列中的探针分子的结合，从而确定分析物是否存在于该多个样品中的各样品中。
367.用于确定多于一种种类的分析物是否存在于样品中的方法，其包括：
(a)使包含能够结合至不同种类分析物的不同种类探针分子的如实施方案第179项至第229项或第333项至第360项中任一项的阵列与样品接触；和
(b)检测分析物与阵列中的探针分子的结合，从而确定多于一种种类的分析物是否存在于样品中。
368.用于确定多于一种种类的分析物是否存在于样品中的方法，其包括：
(a)使包含能够结合至不同种类分析物的不同种类探针分子的如实施方案第179项至第229项或第333项至第360项中任一项的阵列与样品接触，和包含对照探针分子，其中阵列在步骤(a)之前已经使用且洗涤；和
(b)检测分析物与阵列中的探针分子的结合，从而确定多于一种种类的分析物是否存在于样品中。
369.如实施方案第365项至第368项中任一项的方法，其中：
(a)阵列的基板包含微孔盘；
(b)微孔盘的各孔含有不大于单个的三维网络；且
(c)使阵列与样品接触包含使各孔与不大于单个的样品接触。
370.如实施方案第365项至第369项中任一项的方法，其进一步包括在步骤(a)与(b)之间洗涤包含探针分子的阵列。
371.如实施方案第365项至第370项中任一项的方法，其进一步包括在步骤(a)之前使包含探针分子的阵列与阻断试剂接触。
372.如实施方案第365项至第371项中任一项的方法，其进一步包括量化结合至阵列的一种或多种分析物的量。
373.如实施方案第361项至第372项中任一项的方法，其进一步包括再使用阵列。
374.如实施方案第373项的方法，其中阵列再使用至少5次。
375.如实施方案第373项的方法，其中阵列再使用至少10次。
376.如实施方案第373项的方法，其中阵列再使用至少20次。
377.如实施方案第373项的方法，其中阵列再使用至少30次。
378.如实施方案第373项的方法，其中阵列再使用至少40次。
379.如实施方案第373项的方法，其中阵列再使用至少50次。
380.如实施方案第374项的方法，其包括再使用阵列5至20次。
381.如实施方案第374项的方法，其包括再使用阵列5至30次。
382.如实施方案第374项的方法，其包括再使用阵列10至50次。
383.如实施方案第374项的方法，其包括再使用阵列10至20次。
384.如实施方案第374项的方法，其包括再使用阵列10至30次。
385.如实施方案第374项的方法，其包括再使用阵列20至40次。
386.如实施方案第374项的方法，其包括再使用阵列40至50次。
387.如实施方案第373项至第386项中任一项的方法，其包括在再使用之间洗涤阵列。
388.如实施方案第387项的方法，其中阵列在变性条件下洗涤。
389.如实施方案第388项的方法，其中变性条件包括将阵列曝露至热。
390.如实施方案第388项的方法，其中变性条件包括将阵列曝露至低盐浓度。
391.如实施方案第388项的方法，其中变性条件包括将阵列曝露至热及低盐浓度两者。
392.如实施方案第388项的方法，其中在再使用之前移除变性条件。
393.如实施方案第392项的方法，其中变性条件包括将阵列曝露至热，并且其中在再使用之前降低温度。
394.如实施方案第392项的方法，其中变性条件包括将阵列曝露至低盐浓度，并且其中在再使用前增加盐浓度。
395.如实施方案第392项的方法，其中变性条件包括将阵列曝露至热及低盐浓度两者，并且其中在再使用之前降低温度且增加盐浓度。
396.如实施方案第373项至第395项中任一项的方法，其中阵列包含包括经荧光标记的寡核苷酸作为可重用性对照的至少一个三维网络。
397.如实施方案第396项的方法，其包括测试荧光信号强度。
398.如实施方案第397项的方法，其中可重用性对照在10次使用后保留至少70％的其初始荧光信号强度。
399.如实施方案第398项的方法，其中可重用性对照在20次使用后保留至少50％的其信号强度。
400.如实施方案第396项至第399项中任一项的方法，其中阵列在可重用性对照失去大于50％的其信号强度后不再再使用。
401.如实施方案第361项至第400项中任一项的方法，其中分析物为核酸。
402.如实施方案第401项的方法，其中核酸为聚合酶链式反应(PCR)扩增子。
403.如实施方案第401项的方法，其中PCR扩增子自生物样品或环境样品扩增。
404.如实施方案第403项的方法，其中PCR扩增子自生物样品扩增。
405.如实施方案第403项的方法，其中PCR扩增子自环境样品扩增。
406.如实施方案第404项的方法，其中生物样品为血液、血清、血浆、组织、细胞、唾液、痰、尿液、脑脊髓液、胸膜液、乳汁、泪液、大便、汗水、精液、全细胞、细胞成分、细胞涂片(cell smear)或其提取物或衍生物。
407.如实施方案第406项的方法，其中生物样品为哺乳动物血液、血清或血浆或其提取物。
408.如实施方案第407项的方法，其中生物样品为人类或牛血液、血清或血浆或其提取物。
409.如实施方案第406项的方法，其中生物样品为乳汁或其提取物。
410.如实施方案第409项的方法，其中生物样品为牛乳汁或其提取物。
411.如实施方案第401项至第410项中任一项的方法，其中核酸经标记。
412.如实施方案第411项的方法，其中核酸经荧光标记。
413.三维网络(15)，其具有表面(16)和内部，包含：
(a)共价连接至基板的表面(2)的交联聚合物(3)；
(b)一个或多个通道(13)；和
(c)固定于网络(15)中的探针分子(1)，非必要地其中
(i)探针分子(1)共价连接至网络(15)，和/或
(ii)大多数探针分子(1)固定于网络(15)的内部中，和/或
(iii)大多数探针分子(1)邻接通道(13)。
414.如实施方案第413项的三维网络(15)，其中至少一个或至少大多数通道(13)的特征在于以下性质中的一个、两个或三个：
(a)通道(13)自离网络(15)的表面(16)小于5微米的点延伸于内部中，或自网络(15)的表面(16)上的点延伸于内部中；
(b)通道(13)的长度为该网络(15)的最大尺寸的至少10％或至少20％；和
(c)通道(13)的最小横截面为该网络(15)的筛目大小的至少5倍或至少15倍。
415.如实施方案第414项的三维网络(15)，其中至少一个或至少大多数通道(13)
(a)具有为该网络(15)的最大尺寸的10％至40％或15％至25％的长度，和/或
(b)具有为该网络(15)的筛目大小的5至10倍或10至25倍的最小横截面。
416.如实施方案第413项至第415项中任一项的三维网络(15)，其包含至少5个通道(13)、至少10个通道(13)或至少15个通道(13)，非必要地其中多个通道(13)汇聚在网络(15)的内部中的点处，使得通道(13)之间的横向距离自网络(15)的表面(16)朝向内部中的点减小，和非必要地其中各通道(13)的特征独立地在于以下性质中的一个、两个或三个：
(a)通道(13)自离网络(15)的表面(16)小于10微米、小于9微米、小于8微米、小于7微米、小于6微米、小于5微米、小于4微米、小于3微米、小于2微米、小于1微米的点或自网络(15)的表面(16)上的点延伸于内部中；
(b)通道(13)的长度为该网络(15)的最大尺寸的至少10％、至少15％、至少20％或至少25％，和/或
(c)通道(13)的最小横截面为该网络(15)的筛目大小的至少5倍、至少10倍、至少15倍或至少20倍。
417.如实施方案第413项至第416项中任一项的三维网络(15)，其中该网络(15)在其水合状态下的筛目大小为5至75nm或10至50nm。
418.阵列，其在基板上包含如实施方案第413项至第417项中任一项的多个三维网络(15)，非必要地其中(a)三维网络(15)固定于基板上，和/或(b)三维网络(15)中的每一个位于基板上的单独斑点(7)处。
419.如实施方案第418项的阵列，其包含至少8个或至少48个三维网络(15)，非必要地其中阵列上三维网络(15)的数目在24与1024之间的范围内。
420.如实施方案第418项或实施方案第419项的阵列，其中该多个三维网络(15)包含包括经标记对照探针分子(1)的一个或多个三维网络(15)，非必要地其中经标记对照探针分子(1)是经荧光标记。
421.如实施方案第418项至第420项中任一项的阵列，其可再使用，非必要地其中阵列可再使用至少10次。
422.用于制备如实施方案第413项至第417项中任一项的三维网络(15)的方法，其包括以下步骤：
(a)将安置于基板的表面(2)上的混合物(5)曝露至针形晶体形成条件，所述混合物(5)包含：
(i)非必要地为单价阳离子盐溶液的水性盐溶液，
(ii)聚合物，和(iii)交联剂，从而形成含有一种或多种针形盐晶体(8)的混合物(5)；
(b)将含有一种或多种盐晶体(8)的混合物(5)曝露至交联条件，从而形成含有一种或多种针形盐晶体(8)的交联聚合物网络(15)；和
(c)使含有一种或多种盐晶体(8)的交联聚合物网络(15)与可溶解该一种或多种盐晶体(8)的溶剂接触，从而溶解针形盐晶体(8)和形成一个或多个通道(13)来替代盐晶体(8)。
423.如实施方案第422项的方法，其中：
(a)针形晶体盐形成条件包括：
(i)非必要地通过加热混合物(5)(非必要地通过使混合物(5)与温度高于混合物(5)的温度的气体接触)、将混合物(5)曝露至真空和/或降低混合物(5)周围的大气的湿度来使混合物(5)脱水；或
(ii)冷却混合物(5)，非必要地通过使混合物(5)与温度低于混合物(5)的温度的气体接触；和/或
(b)其中溶剂为水基缓冲剂，所述缓冲剂非必要地包含磷酸盐、甲醇、乙醇、丙醇或其混合物。
424.如实施方案第422项或实施方案第423项的方法，其中步骤(a)的混合物(5)进一步包含探针分子(1)。
425.如实施方案第422项至第424项中任一项的方法，在步骤(a)之前其进一步包含以下步骤：将混合物(5)以非必要地100pl至5nl的体积、100pl至1nl的体积或500pl至2nl的体积涂覆至基板的表面(2)。
426.用于制备阵列的方法，其包括(a)通过如实施方案第422项至第425项中任一项的方法在相同基板的表面(2)上的离散斑点(7)处产生多个三维网络(15)，和(b)将该多个三维网络(15)交联至基板的表面(2)。
427.用于确定分析物是否存在于样品中的方法，其包括：
(a)使包含能够结合至分析物的探针分子(1)的如实施方案第413项至第417项中任一项的三维网络(15)与样品接触，非必要地其中三维网络(15)安置于如实施方案第418项至第421项中任一项的阵列上；和
(b)检测和非必要地量化分析物与三维网络(15)或阵列中的探针分子(1)的结合，从而确定分析物是否存在于样品中和非必要地确定分析物的量。
428.如实施方案第427项的方法，其中：
(a)网络(15)或阵列在步骤(a)之前已经使用且洗涤，非必要地至少10次、至少20次或至少50次；和/或
(b)步骤(b)后进一步包含再使用网络(15)或阵列，非必要地至少10次、至少20次或至少50次。
429.如实施方案第427项或实施方案第428项的方法，其中分析物为核酸，非必要地其中核酸为经荧光标记的聚合酶链式反应(PCR)扩增子。
虽然已举例说明且描述各种特定实施方案，但应了解可在不偏离本发明公开内容的精神及范畴的情况下做出各种改变。
10.文献的引用
本申请中所引用的所有公开、专利、专利申请及其他文献均出于所有目的特此以全文引用的方式并入，引用的程度就如同个体地指示将各个体公开、专利、专利申请及其他文献以引用的方式并入以用于所有目的一样。在并入本文中的一个或多个文献的教示内容与本发明公开内容不一致的情况下，以本说明书的教示内容为准。
Claims (18)
1.三维网络，其具有表面和内部，所述三维网络：
(a)由水可溶胀聚合物构成，该水可溶胀聚合物通过交联水可溶的聚合物链形成；
(b)交联到硬性基板的表面；和
(c)包含共价连接至该聚合物链的探针分子，
特征在于：
(i)所述网络包含至少5个通道，其汇聚在该网络的该内部中的点处，使得该通道之间的横向距离自该表面朝向该内部中的该点处减小，和
(ii)大多数该探针分子固定在该网络的内部，和至少一部分的该探针分子邻接通道。
2.权利要求1的所述三维网络，其中至少一个通道的特征在于以下性质中的一个、两个或三个：
(a)该通道自离该网络的表面小于5微米的点延伸到该内部中；
(b)该通道的长度为该网络的最大尺寸的至少10％；和
(c)该通道的最小横截面为该网络的筛目大小的至少5倍。
3.权利要求2的所述三维网络，其中至少一个通道的特征在于以下性质：
(a)该通道自该网络的表面上的点延伸到该内部中。
4.权利要求1或权利要求2的所述三维网络，其中该网络中的至少大多数通道的长度为该网络最大尺寸的至少10％。
5.权利要求1或权利要求2的所述三维网络，其中该网络中的大多数通道自离该网络的表面小于10微米的点延伸于内部中。
6.权利要求5的所述三维网络，其中该网络中的大多数通道自该网络的表面上的点延伸于内部中。
7.权利要求1或权利要求2的所述三维网络，其中该网络在其水合状态下的筛目大小为5至75nm。
8.权利要求1或权利要求2的所述三维网络，其中大多数探针分子邻接通道。
9.权利要求1或权利要求2的所述三维网络，其中该聚合物包含由二甲基丙烯酰胺(DMAA)、甲基丙烯酰氧基二苯甲酮(MABP)和4-乙烯基苯磺酸钠(SSNa)聚合的聚合物。
10.阵列，其包含在基板上的根据权利要求1-9任一项的多个三维网络，其中(a)该三维网络固定于该基板上，和(b)该三维网络中的每一个位于该基板上的单独斑点处。
11.权利要求10所述的阵列，其可再使用至少10次。
12.用于制备根据权利要求1-9中任一项的三维网络的方法，其包括以下步骤：
(a)将安置于基板表面上的混合物曝露至针形盐晶体形成条件，所述混合物包含(i)水性盐溶液、(ii)水可溶聚合物、(iii)交联剂和(iv)探针分子，从而形成含有一种或多种针形盐晶体的混合物；
(b)将含有一种或多种盐晶体的该混合物曝露至交联条件，从而形成具有交联至其上的探针分子和含有针形盐晶体的交联聚合物网络；和
(c)使含有该盐晶体的该交联聚合物网络与该盐晶体可溶于其中的溶剂接触，从而溶解该针形盐晶体和形成一个或多个通道来替代该盐晶体。
13.权利要求12的所述方法，其中该水性盐溶液是单价阳离子盐溶液。
14.权利要求12或权利要求13的所述方法，其中：
(a)该针形盐晶体形成条件包括：
(i)使该混合物脱水；或
(ii)冷却该混合物；和/或
(b)该溶剂为水基缓冲剂。
15.用于制备阵列的方法，其包括(a)通过权利要求12-14中任一项的方法在相同基板的表面上的离散斑点处产生多个三维网络，和(b)将该多个三维网络交联至该表面。
16.用于确定分析物是否存在于样品中的方法，其包括：
(a)使包含能够结合至该分析物的探针分子的根据权利要求1-9中任一项的三维网络或根据权利要求10或权利要求11的阵列与样品接触；和
(b)检测该分析物与该三维网络中的该探针分子的结合，从而确定该分析物是否存在于该样品中和非必要地确定该分析物的量，
其中该方法不是用于疾病的诊断或治疗。
17.权利要求16的所述方法，其中该网络或阵列在步骤(a)之前已经使用且洗涤至少10次，或在步骤(b)后再使用该网络或阵列至少10次。
18.权利要求17的所述方法，其进一步包括量化该分析物与该三维网络中的该探针分子的结合。
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