CN110770583B - 三维聚合物网络及其应用 - Google Patents

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Abstract

本公开内容提供了三维交联聚合物网络传输通道、包含网络的阵列、用于制造网络的方法以及网络和阵列的用途。

Description

三维聚合物网络及其应用
1.背景
US 2008/0293592描述了一种借助于光反应性交联剂将探针-生物分子共价固定在有机表面上的方法。实践中已证明该方法是特别有利的，因为该方法允许将探针生物分子固定在未反应的表面(例如硅烷化的玻璃载体和由标准商用塑料制成的基底)上。在US2008/0293592中描述的方法中使用了一种聚合物以形成一种类型的三维网络，在其上可以键合探针生物分子(在网络的表面或网络内部)。与仅将探针生物分子以二维形式固定在其上的有机表面相比，生物分子在聚合物和/或共聚物网络中的三维固定允许探针生物分子在有机表面上的更高的密度。这增加了有机表面的每个表面单元可以键合的分析物的量。因此，将表面用作生物传感器产生了更高的测量精度和高测量动态。
然而，在US 2008/0293592中描述的方法和聚合物网络的缺点在于，与布置在聚合物网络的表面上或附近的探针生物分子结合的分析物分子或分析物组分可阻塞网络。然后，其他分析物分子或分析物成分将不再与布置在网络表面内部中距其较远的位置处的尚未结合的探针生物分子结合。
因此，存在对改进的聚合物网络需要。
2.概述
本公开内容提供了三维聚合物网络，其包含交联的聚合物链例如水溶性聚合物链和一个或多个传输通道。传输通道允许溶液中的分子(例如分析物分子)接近网络中的聚合物链。在某些方面，聚合物链交联至探针分子，并且传输通道提供了更大的表面积用于分析物与探针分子的结合。
网络适当地共价附着至表面。如前一段所提及的，可以将一种或多种探针(例如生物分子)固定在网络表面以及网络的整个内部，从而提供用于检测样品中分析物的存在和/或测量样品中分析物的量的传感器。例如，核酸探针可用于检测样品中存在的互补核酸，抗体探针可用于检测样品中存在的抗原。与缺少传输通道的网络相比，本公开内容的网络允许给定量的分析物更快地杂交，因为传输通道可以有效地增加网络的表面积，从而在给定的时间内将更多的探针暴露于样品。另外，与相同体积的无传输通道的网络相比，本公开内容的网络可以结合更多的分析物，因为传输通道减少或消除了结合到网络表面处或附近的探针的样品分析物或其他成分阻止接近位于网络内部的探针的问题。与无传输通道的网络相比，本公开内容的网络的另一个优点是通过传输通道可以实现的大量分析物负载允许更灵敏地检测分析物，即与无传输通道的网络相比信噪比可以得到改善，因为可以将给定量的分析物集中在较小的网络体积中。与无传输通道的网络相比，本公开内容的网络的另一个优点是通过传输通道可以实现的高分析物负载允许定量更宽范围的分析物浓度。
本公开内容还提供了包含本公开内容的多个三维网络和基底的阵列。本公开内容的阵列可以用于同时检测和/或测量一种或多种样品中的一种或多种分析物。本公开内容的阵列可以被洗涤和重复使用，从而与一次性阵列相比提供了显著的成本优势。本公开内容的阵列的另一个优点是它们可以以简单的方式制造，因为制造单个网络所需的所有组分都可以在制造过程中作为单一混合物被施加到基底的表面上。
本公开内容还提供了用于制造本公开内容的三维网络和阵列的方法。本公开内容的三维网络可以通过在至少两种类型的盐晶体(优选针状盐晶体和致密盐晶体)的存在下交联聚合物，然后溶解盐晶体以在交联聚合物网络中留下传输通道来制备。不受理论的束缚，本发明人认为，在交联过程中紧密盐晶体的存在导致具有短通道的海绵状聚合物，所述短通道被在交联期间由于存在针状盐晶体而产生的长通道穿透。
本公开内容还提供了使用本公开内容的三维网络和阵列来检测和/或测量样品优选液体样品中的分析物的方法。
3.附图简要说明
图1显示了溶解在盐水溶液中的混合物的示意图，该混合物具有探针生物分子(1)和每分子包含两个光反应性基团(4)的聚合物(3)(如第4.3.1节所述)。
图2显示了例如图1中所示的混合物(5)的液滴的横截面，其具有位于表面(2)的点(7)处的表面(10)，该表面(2)可以是位于支架(6)上。表面优选是有机基底或具有有机内含物的基底的表面。基底优选是刚性的。支架可以是加热的支架或冷却的支架，以允许盐水溶液中盐的受控结晶。
图3显示了在已加热混合物并且(a)从结晶胚(9)伸出针状盐晶体(8)和(b)已在盐溶液中形成致密晶体(14)之后图2中所示布置的横截面。
图4显示了在将混合物干燥并用光辐射(11)照射以形成具有表面(16)的聚合物网络(15)之后，图3所示布置的横截面。
图5显示了在用光辐射照射之后图1的混合物的示意图。
图6显示了在将盐晶体溶解在溶剂(12)中，形成长通道(13)和短通道(19)形式的传输通道之后图4中所示布置的横截面。
图7显示了形成聚(二甲基丙烯酰胺共甲基丙烯酰基-二苯甲酮共4-乙烯基苯磺酸钠)的反应途径。
图8显示了生物芯片(17)的透视图，在其上聚合物网络(15)位于以行和列矩阵布置的点(7)处。芯片优选具有有机表面。
图9显示了图8中所示的生物芯片(17)的俯视图，其中每个聚合物网络(15)具有直径(D)，并且其中行和列分别以从聚合物网络(15)的中心点开始测量的距离Y和距离X隔开。
图10显示了包含柔性基底带(18)的生物传感器(17')，在该基底带上具有直径(D)的聚合物网络(15)位于以从聚合物网络的中心点开始测量的距离X隔开的点(7)处。
图11A-11C显示了在干燥前(图11A)和干燥后(图11B)的具有6行(A-F)和6列(1-6)聚合物网络的生物芯片，其显示了用于制备图11C中显示的D行和E行的聚合物网络的盐浓度。使用包含磷酸钠和磷酸钾的盐水溶液制备D行和E行的聚合物网络。其余的行使用仅含磷酸钠(浓度为350mM)的盐水溶液制成。D行和E行的聚合物网络看起来更圆且均匀。
图12A-12C显示了使用金黄色葡萄球菌和大肠杆菌特异性引物对的PCR反应产物与根据图12A至图12C的阵列的杂交结果。图12A显示了与从100个拷贝的金黄色葡萄球菌DNA扩增的PCR产物的阵列的杂交。图12B显示了与从100个拷贝的大肠杆菌DNA扩增的PCR产物的阵列的杂交。图12C显示了图12A和图12B所示的阵列的探针图。大肠杆菌(E.coli)＝大肠杆菌探针；沙门氏菌(Salmonella)＝沙门氏菌探针(大肠杆菌PCR产物与其具有某些交叉反应性)；泛葡萄球菌(Allstaph)＝泛葡萄球菌(Staphylococcus)探针；金黄色葡萄球菌(S.aureus)＝金黄色葡萄球菌探针；PCR对照＝用于检测PCR扩增过程的内部对照的探针；LL＝着陆灯，其是与网络中用作阵列对照的聚合物链交联的荧光团标记的寡核苷酸。
图13显示了在没有模板的情况下，使用金黄色葡萄球菌或大肠杆菌特异性引物对扩增的PCR产物的杂交产生的荧光信号的定量，代表背景“噪声”。1号代表点D1、E1；2号代表点D1、E2；3号代表点D1、E3；4号代表点D1、E4；5号代表点D1、E5；6号代表点D1、E6。
4.详述
4.1.三维聚合物网络
本公开内容的三维网络包括交联的聚合物，例如根据Rendl等人,2011,Langmuir27:6116–6123或US 2008/0293592的聚合物，其内容通过引用整体并入本文。本公开内容的三维网络进一步包括一个或多个传输通道，并且可以任选地进一步包括例如通过交联至聚合物链而固定在网络上的一种或多种探针。
本公开内容的网络可以具有例如5至75nm(例如10至20nm，10至30nm，10至40nm，10至50nm，20至30nm，20至40nm，20至50nm，30至40nm，30至50nm或40至50nm)的网格尺寸(在网络的水合状态下测量)。“网络的水合状态”是指网络在吸水方面处于平衡状态，即它在水溶液中吸收的水量与释放的水量相同。
4.1.1节中描述了可用于制造网络的聚合物。4.1.2节中描述了可用于制造网络的交联剂。4.1.3节中描述了一个或多个传输通道的功能。4.1.4节中描述了可以固定在网络上的探针。
4.1.1.聚合物
本公开内容的三维网络可包含交联的均聚物、共聚物、均聚物的混合物、共聚物的混合物或一种或多种均聚物和一种或多种共聚物的混合物。本文所用的术语“聚合物”包括均聚物和/或共聚物。如本文所用，术语“共聚物”包括由两种或更多种类型的单体(例如，二元共聚物、三元共聚物、四元共聚物等)聚合的聚合物。共聚物包括交替共聚物、周期共聚物、统计共聚物、无规共聚物、嵌段共聚物、线性共聚物和支化共聚物。本公开内容的三维网络可包括前述类型的聚合物的任何组合。制备这种聚合物的试剂和方法是本领域已知的(参见，例如Ravve,A.,Principles of Polymer Chemistry,Springer Science+BusinessMedia,1995；Cowie,J.M.G.,Polymers:Chemistry&Physics of Modern Materials,2ndEdition,Chapman&Hall,1991；Chanda,M.,Introduction to Polymer Science andChemistry:A Problem-Solving Approach,2nd Edition,CRC Press,2013；Nicholson,J.W.,The Chemistry of Polymers,4th Edition,RSC Publishing,2012；其各自的内容均通过引用整体并入本文)。
优选的聚合物是亲水的和/或含有亲水基团。聚合物优选是水溶性的。在一个实施方案中，聚合物是已经从两种或更多种类型的选择提供期望水平的水溶性的单体聚合的共聚物。例如，可以通过改变用于制备共聚物的带电荷单体例如4-乙烯基磺酸钠的量来控制共聚物的水溶性。
当交联时，水溶性聚合物形成水膨胀性凝胶或水凝胶。水凝胶通过与水分子的氢键合吸收水溶液。水凝胶的总吸收能力和膨胀能力可以通过用于制造凝胶的交联剂的类型和程度来控制。低交联密度的聚合物通常比高交联密度的聚合物具有更高的吸收能力，并且膨胀至更大的程度，但是高交联密度的聚合物的凝胶强度更坚固，并且即使在适度的压力下也可以保持网络形状。
水凝胶吸收水的能力是水溶液中离子浓度的一个因素。在某些实施方案中，本发明的水凝胶可在去离子蒸馏水中吸收高达其重量的50倍(其自身体积的5至50倍)和在盐水中吸收高达其重量的30倍(其自身体积的4至30倍)。在盐水中降低的吸收能力是由于存在价阳离子，这会阻碍聚合物与水分子键合的能力。
本公开内容的三维网络可包含已经由一种、两种、三种或多于三种类型的单体聚合的共聚物，其中一种、两种、三种或多于三种类型的单体具有可聚合基团，其独立地选自丙烯酸酯基团(例如丙烯酸酯，甲基丙烯酸酯，甲基丙烯酸甲酯，甲基丙烯酸羟乙酯，丙烯酸乙酯，丙烯酸2-苯基酯)、丙烯酰胺基团(例如丙烯酰胺，甲基丙烯酰胺，二甲基丙烯酰胺，乙基丙烯酰胺)、衣康酸酯基团(例如衣康酸酯，衣康酸4-甲酯，衣康酸二甲酯)和苯乙烯基团(例如苯乙烯，4-甲基苯乙烯，4-乙氧基苯乙烯)。优选的可聚合基团是丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、乙基丙烯酸酯、丙烯酸2-苯基酯、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、衣康酸酯和苯乙烯。在一些实施方案中，用于制备共聚物的一种单体是带电荷的，例如4-乙烯基苯磺酸钠。
用于制造本公开内容的网络的聚合物每个分子可包含至少一个、至少两个或多于两个的交联剂基团。交联剂基团是使网络的聚合物分子彼此共价键合并且任选地与探针和/或底物共价键合的基团。由两种或更多种单体(其中至少一种包含交联剂)(例如，具有独立地选自上段所述的可聚合基团的单体)聚合的共聚物适用于制备本公开内容的三维网络。示例性交联剂在4.1.2节中描述。包含交联剂的优选单体是甲基丙烯酰氧基二苯甲酮(MABP)(参见图7)。
在一个优选的实施方案中，共聚物是包含交联剂的二元共聚物或三元共聚物。在一个特别优选的实施方案中，共聚物包含聚(二甲基丙烯酰胺共甲基丙烯酰基-二苯甲酮共4-乙烯基苯磺酸钠)(参见图7)。
4.1.2.交联剂
适用于在三维网络中进行交联的交联试剂(或交联剂)包括通过紫外线(例如长波紫外线)、可见光和热激活的那些。通过紫外线激活的示例性交联剂包括二苯甲酮、噻吨酮(例如9-噻吨酮，10-甲基吩噻嗪)和安息香醚(例如安息香甲醚，安息香乙醚)。通过可见光激活的示例性交联剂包括乙基曙红、曙红Y、玫瑰红、樟脑醌和赤藓红素。通过热激活的示例性交联剂包括4,4'氮双(4-氰基戊酸)和2,2-氮双[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二盐酸盐和过氧化苯甲酰。也可以使用本领域已知的其他交联剂，例如在照射时能够形成自由基或其他反应性基团的那些。
4.1.3.传输通道
本公开内容的三维网络包含一个或多个传输通道。
传输通道可以允许接近(access)网络内部。尽管传输通道可以具有相对较大的横截面，但是网络可以保持机械稳定，因为网络的网格尺寸可以显著小于传输通道的横截面。
传输通道可以形成一种高速通道，分析物可以通过该高速通道快速进入网络内部和从网络内部出来。分析物的传输可以通过扩散和/或对流在传输通道中进行。
如第4.3节中所述，当通过在盐晶体存在下交联聚合物链形成网络时，形成传输通道。在盐晶体被洗掉后，留下了传输通道。
不受理论的束缚，本发明人相信，在本公开内容中制造网络的方法导致由不同的金属离子-盐离子对形成至少两种类型的盐晶体。当盐晶体被洗掉时，根据“丢失”形式的原理，留下了至少两种类型的传输通道。传输通道允许分析物渗入网络内部，并特异性结合位于网络内部的探针。此外，传输通道允许未结合的分析物在洗涤后存在于网络内部，从而减少了来自“滞留”在网络中的分析物的非特异性信号量。
一种类型的传输通道被认为是由针状盐晶体形成的长通道。如本文所用，“长通道”是网络中的伸长通道，其(1)基本笔直，并且(2)在网络的水合状态下具有至少300nm的最小横截面和通道最小横截面的至少三倍，优选五倍，更优选至少十倍的长度。例如，长通道的长度可以是长通道的最小横截面的3至15倍，5至10倍或10至15倍。“基本笔直”的长通道是从成核点沿一个方向延伸而在任何方向(即X、Y或Z方向)上改变方向的角度都没有超过45度的通道。由于长通道来自从公共成核点形成的针状晶体，因此本公开内容的网络可包括(例如5、10或更多个)长通道的组，它们会聚在位于网络中与结晶的原始成核点相对应的点处。长通道通常被布置成使得从网络的表面开始朝向内部，长通道之间的横向距离减小。
在其他方面，一种类型的传输通道被认为是短通道，例如由立方体或棒状晶体形成。如本文所用，“短通道”是网状结构中的通道，其(1)是基本笔直的，和(2)在网络的水合状态下具有优选为网络的网格尺寸的至少10倍的最小横截面和通道最小横截面的小于三倍(例如，可以是1倍至2.75倍，1倍至2.5倍，1倍至2倍或1倍至1.5倍)的长度。“基本笔直”的短通道是从成核点沿一个方向延伸而在任何方向(即X、Y或Z方向)上改变方向的角度都没有超过45度的短通道。为了保持网络强度，短通道的横截面优选不大于网络宽度或直径的1/20，例如，对于在阵列上以“点”形式的直径为200μm的网络，短通道的横截面优选地不大于10μm，并且对于直径为100μm的阵列上的点，短通道的横截面优选地不大于5μm。在某些方面，短通道的横截面为约20nm或更大，约50nm或更大，约100nm或更大，约250nm或更大，至少500nm或更大，或约1μm或更大。网络中的短通道可以具有大约(例如，+/-10％或+/-25％)相同的直径或不同的直径。在特定实施方案中，网络中的短通道的直径在前述尺寸的任何两个之间，例如，它们可以是100nm至10μm，50nm至1μm，500nm至5μm，250至10μm，依此类推。
不受理论的束缚，本发明人相信短通道产生了由长通道穿透的海绵状聚合物。
4.1.4.探针
固定在本公开内容的网络上的探针可以是生物分子或结合生物分子的分子，例如互补结合伴侣(受体/配体)的特异性相互作用系统的伴侣。例如，探针可以包括核酸及其衍生物(例如RNA、DNA、锁核酸(LNA)和肽核酸(PNA))、蛋白质、肽、多肽及其衍生物(例如葡糖胺、抗体、抗体片段和酶)、脂质(例如磷脂、脂肪酸例如花生四烯酸、甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯)、碳水化合物、酶抑制剂、酶底物、抗原和表位。探针还可以包含较大和复合的结构，例如脂质体、膜和膜片段、细胞、细胞裂解物、细胞碎片、孢子和微生物。
互补结合伴侣的特异性相互作用系统可以基于例如核酸与互补核酸的相互作用、PNA与核酸的相互作用或酶/底物、受体/配体、凝集素/糖、抗体/抗原、抗生物素蛋白/生物素或链霉亲和素/生物素相互作用。
核酸探针可以是DNA或RNA，例如寡核苷酸或适体、LNA、PNA或在5'端包含甲基酰基的DNA(5'AcryditeTM)。寡核苷酸探针的长度可以是例如12至30、14至30、14至25、14至20、15至30、15至25、15至20、16至30、16至25、16至20、15至40、15至45、15至50、15至60、20至55、18至60、20至50、30至90、20至100、20至60、40至80、40至100、20至120、20至40、40至60、60至80、80至100、100至120或12至150个核苷酸。在优选的实施方案中，寡核苷酸探针的长度为15至60个核苷酸。
当使用核酸探针时，探针的全部或仅一部分可以与靶序列互补。与靶序列互补的探针部分的长度优选为至少12个核苷酸，更优选为至少15个、至少18个或至少20个核苷酸。对于长度大于40或50个核苷酸的核酸探针，与靶序列互补的探针部分的长度可以是至少25个、至少30个或至少35个核苷酸。
抗体可以是例如多克隆抗体、单克隆抗体或嵌合抗体或其抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或其单链、包含抗体的融合蛋白以及免疫球蛋白分子的包含抗原识别位点的任何其他修饰的构型，包括但不限于单链(scFv)和结构域抗体(例如人、骆驼科动物或鲨鱼结构域抗体)、大型抗体(maxibody)、小型抗体(minibody)、内抗体、双抗体、三抗体、四抗体、vNAR和bis-scFv(参见例如Hollinger and Hudson,2005,Nature Biotech 23:1126-1136)。抗体包括任何种类的抗体，例如IgG、IgA或IgM(或其亚类)，并且抗体不必是任何特定种类。根据其重链恒定结构域的抗体氨基酸序列，免疫球蛋白可分为不同类别。免疫球蛋白有五种主要类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且其中一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。“抗体”还涵盖每种前述抗体/免疫球蛋白类型中的任何一种。
本公开内容的三维网络可以包含单一种类的探针或多于一种种类的探针(例如，2、3、4或5或更多种种类)。三维网络可以包含用于同一靶标的多于一种种类的探针(例如，结合同一靶标的不同表位的抗体)和/或包含结合多种靶标的探针。
网络可包含标记的(例如，荧光标记的)对照探针分子，其可用于例如测量网络中存在的探针的量。
探针可以分布在整个网络中(例如，在网络的表面和内部)。优选地，至少一个探针与网络的表面间隔开并且邻接至少一个传输通道。这样定位的探针可由分析物分子或分析物组分通过传输通道直接进入。在某些实施方案中，大多数探针位于网络内部。
可以将一个或多个探针共价或非共价固定在网络上。例如，探针可以与交联的聚合物交联，或者探针可以非共价结合至网络(例如通过与共价结合至网络的分子结合)。在一个优选的实施方案中，一个或多个探针与交联的聚合物交联。在一些实施方案中，大多数探针共价结合在网络内部(例如，使得至少一部分探针邻接传输通道)。
不受理论的束缚，本发明人认为，在第4.3节中描述的在存在盐晶体(特别是磷酸盐晶体)的情况下制造三维网络的方法可能由于探针分子(特别是核酸探针分子)和盐晶体之间的静电相互作用而在聚合物与传输通道之间的界面处或界面附近导致更高浓度的探针分子。因此，在本发明的一些实施方案中，本公开内容提供了根据本公开内容的网络，其中在聚合物与传输通道之间的界面处的探针密度大于在不邻接传输通道的聚合物的区域内的探针密度。在各种实施方案中，在聚合物和传输通道之间的界面处的探针密度比在不邻接传输通道的聚合物的区域内的密度高至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％。
可以使用以下程序验证网络中探针分子的密度：
使网络在室温下例如在碗中与水性液体接触。液体包含附着至与网络中的探针分子相互作用的部分(例如，如果探针分子被生物素化则是链霉亲和素)的多个纳米颗粒。纳米颗粒的尺寸小于网络的网格尺寸，并且小于网络中至少一种类型的传输通道的最小横截面，以允许纳米颗粒分布在整个聚合物中。合适的纳米颗粒是直径为2-5纳米的量子点。
选择孵育时间，以使液体中的网络完全水合，即，网络平均吸收与释放的水量相同的水量。孵育时间可以是例如一小时。可以通过在孵育期间使网络和/或液体运动(例如，通过使网络和/或液体振动，优选地借助于超声波)来加速纳米颗粒在网络中的渗透。
孵育完成后，例如通过从碗中排出液体或将网络从碗中取出来将液体与网络分离。
然后，例如通过液氮将水合的网络冷冻。之后，可以借助冷冻切片机沿着相互平行的切割平面将冷冻的网络切割成薄片。切割平面相对于传输通道的纵向延伸横向布置并且穿透传输通道。切割优选使用液氮冷却的金刚石刀片进行。切片的厚度可以是例如约100nm或200nm。
借助于显微镜，定位排列在通过切割冷冻的网络而获得的盘中的纳米颗粒。纳米颗粒可以是荧光的，并且如有必要任选是高光的使得可以更好地将它们与网络区分开。可以使用合适的软件利用图像处理方法来完成纳米颗粒的定位。为了检查盘，优选地使用具有荧光光学器件的共聚焦显微镜激光扫描显微镜或电子显微镜。
以这种方式获得的纳米颗粒的几何形状和/或位置信息可以在计算机的帮助下用于建立网络中纳米颗粒分布的三维几何模型。然后可以使用该模型来确定纳米颗粒的分布是否反映了传输通道位点附近的更大密度的探针分子。
4.2.阵列
本公开内容的三维网络可被定位(例如沉积)在基底上，并且优选地固定在基底上(例如，通过网络和基底之间的共价交联)。可以将多个网络固定在基底上以形成阵列，例如可用作生物芯片。
合适的基底包括有机聚合物，例如环烯烃共聚物(COC)、聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯和聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA，)。Ticona以商品名/>销售合适的COC的示例。无机材料(例如金属，玻璃)也可以用作基底。可以用有机分子涂覆这样的基底，以允许网络与基底表面之间的交联。例如，无机表面可以涂有自组装单层(SAM)。SAM本身可以是完全不反应的，因此包含例如纯烷基硅烷或由其组成。其他基底也可以适用于交联至三维网络，只要它们能够在自由基工艺过程中与有机分子(例如有机硼化合物)形成稳定的键。
基底可以是刚性的或柔性的。在一些实施方案中，基底呈板状(例如，矩形板、正方板、圆盘等)。例如，基底可以包括微孔板，并且三维网络可以位于板的孔中。
可以将各个网络定位在基底表面上的不同点处，例如，在包括多个列和行的矩阵中。在图8所示的实施方案中，网络位于以六列和六行布置的36个点处。考虑了具有不同数量的行和列的阵列，行和列各自的数量可以独立选择(例如2至64列和2至64行)。列可以以距离X隔开，并且行可以以距离Y隔开(例如，如图9所示)，以形成各个网络可以位于其上的点的网格。可以选择X和Y，以使位于网格的点处的网络在脱水状态下不相互接触，和在水合状态下不相互接触。尺寸X和Y可以相同或不同。在一些实施方案中，X和Y相同。在一些实施方案中，X和Y不同。在一些实施方案中，X和Y独立地选自至少约500μm(例如，500μm至5mm，500μm至4mm，500μm至3mm，500μm至2mm或500μm至1mm)的距离。在一些实施方案中，X和Y均为约500μm。在其他实施方案中，X和Y均为500μm。
在一些实施方案中，基底是带状的(例如，如图10所示)。网络可以布置成在带状有机表面的纵向上延伸的单一行，或者可以布置成在带状有机表面的纵向上延伸的多个行。这种带状阵列中的行和列可以具有如上所述的网格尺寸X和Y。
个体网络可以各自覆盖圆形或基本上圆形的阵列的表面区域。通常，由个体网络覆盖的阵列表面上区域的直径(即点直径)为80μm至1000μm。在各种实施方案中，点直径为80μm、100μm、120μm、140μm、160μm、180μm、200μm、300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、800μm、900μm或1000μm，或选自以任何两个前述实施方案为界的范围，例如80μm至200μm、100μm至120μm、120μm至140μm、120μm至180μm、140μm至160μm、160μm至180μm、180μm至200μm、120μm至200μm、100μm至400μm、160μm至600μm或120μm至700μm，依此类推。在优选的实施方案中，直径为100μm至200μm或其子范围。
本公开内容的阵列通常具有至少8个单独的三维网络。在某些方面，阵列具有至少16个，至少24个，至少48个，至少96个，至少128个，至少256个，至少512个或至少1024个单独的三维网络。在一些实施方案中，本发明的阵列具有24、48、96、128、256、512、1024、2048、4096或8192个单独的网络，或具有选自以任何两个前述实施方案为界的范围的三维网络数量，例如，8至128、8至512、24至8192、24至4096、48至2048、96至512、128至1024、24至1024、48至512、96至1024或128至512个三维网络，依此类推。在一个优选的实施方案中，阵列上的三维网络的数量为8至1024个。在一个特别优选的实施方案中，阵列上的三维网络的数量为25至400个。
包含本公开内容的阵列的个体网络可以具有相同或不同的探针(例如，每个网络可以具有独特的探针组，多个网络可以具有相同的探针组，和其他网络可以具有不同的一个或多个探针组，或者所有网络可以具有相同的探针组)。例如，布置在矩阵的相同行中的网络可以包含相同的探针，并且布置在矩阵的不同行中的网络可以具有不同的探针。
通常，阵列上的个体网络彼此之间在点直径和/或网络体积上的不同不超过20％、不超过15％、不超过10％或不超过5％。
在一些实施方案中，阵列包含具有一种或多种对照寡核苷酸或探针分子的一个或多个单独的网络(例如，阵列上的点)。可以标记对照寡核苷酸，例如荧光标记，以用作空间对照(用于阵列的空间定向)和/或定量结合至网络的探针分子的量，例如，在洗涤和重复使用本公开内容的阵列时(即作为“可重复使用性对照”)。空间和可重复使用性对照探针可以是相同或不同的探针。
阵列上的相同点或阵列上的不同点可进一步包括与已知靶标互补的未标记探针。当用于杂交测定中时，确定未标记探针与标记靶的杂交信号强度可以确定杂交反应的效率。当个体网络(即阵列上的点)同时用作可重复使用性和/或空间对照和杂交对照时，可以使用与可重复使用性对照或空间对照探针的荧光部分不同的荧光部分标记靶分子。
在一些实施方案中，本公开内容的阵列可以重复使用至少5次，至少10次，至少20次，至少30次，至少40次或至少50次(例如5至20次，5至30次，10至50次，10至20次，10至30次，20至40次或40至50次，优选包括重复使用阵列10至50次)。可以在变性条件下(例如，低盐浓度和高温)用盐溶液洗涤阵列。例如，在两次使用之间，可以在80-90℃下用1-10mM磷酸盐缓冲液洗涤阵列。可以基于靶标:探针杂交体的长度(Tm)选择洗涤温度。
阵列的完整性可以通过“可重复使用性对照”探针确定。可重复使用性对照探针可以被荧光标记，或者可以通过与荧光标记的互补核酸杂交来检测。在核酸的完整性被破坏之前，荧光标记的可重复使用性对照探针的荧光标记可以通过重复激发来漂白。在这种情况下，任何进一步的重复使用都可以包括检测与作为对照的荧光标记的互补核酸的杂交。通常，本发明的阵列稳定至少6个月。
在各种实施方案中，荧光标记的可重复使用性对照探针在5、10、20、30、40或50次使用后保留其荧光信号强度的至少99％、95％、90％、80％、70％、60％或50％。优选地，可重复使用性对照探针在使用5次或10次后保留其荧光信号强度的至少75％。阵列可以继续重复使用，直到可重复使用性对照探针例如在20、30、40或50次重复使用之后保留其荧光信号强度的至少50％。可以在每次重复使用、每隔一次重复使用、每三次重复使用、每四次重复使用、每五次重复使用、每六次重复使用、每七次重复使用、每八次重复使用、每九次重复使用、每十次重复使用或上述各项的组合之间测试对照探针的荧光信号强度。例如，最初可以在5次或10次重复使用之间定期测试信号强度，并且随着重复使用次数的增加，测试频率也增加，从而在一定次数(例如5、10、20、30、40或50次)使用之后在每次重复使用后测试信号强度。在一些实施方案中，测试的频率平均为每1、1.5、2、2.5、3、4、5或10次使用进行一次，或平均为前述值中的任意两个之间的范围内的频率，例如每1-2次使用进行一次，每1-1.5次使用进行一次，每1-3次使用进行一次或每1.5-3次使用进行一次。
注意，“空间对照”、“可重复使用性对照”和“杂交对照”的术语是用于方便和参考目的，并且不旨在表示要将称为“空间对照”、“可重复使用性对照”和“杂交对照”的探针这样使用的要求。
4.3.制造三维聚合物网络的方法
在一个方面，本公开内容的用于制造三维聚合物网络的方法包括：(a)将包含盐水溶液、聚合物、交联剂和任选地一种或多种探针的混合物暴露于盐晶体形成条件，(b)使混合物暴露于交联条件以使聚合物交联以形成交联的聚合物网络，和(c)使交联的聚合物网络与溶剂接触以溶解盐晶体并形成一个或多个传输通道。
该方法可以进一步包括通过混合盐水溶液、聚合物、交联剂和任选地一种或多种探针来形成混合物的步骤，和/或进一步包括将混合物施加到基底(例如第4.2节中所述的基底)上的步骤，然后将混合物暴露于盐晶体形成条件。如果所使用的聚合物具有预附着的交联剂(例如，当使用由包含交联剂的单体聚合而成的共聚物时)，形成混合物的步骤可以包括将盐水溶液与聚合物和任选地一种或多种探针混合。
可以在将混合物暴露于盐晶体形成条件之前将混合物施加到基底上，例如通过将混合物喷涂到基底的表面上(例如，在表面的1024个位置上)。例如，可以使用DNA芯片点样仪或喷墨印刷机将混合物施加到表面上。在一个优选的实施方案中，使用喷墨印刷机喷涂混合物。这允许将混合物简单且快速地施加到基底上的大量点上。点可以例如以矩阵的形式布置在几行和/或几列中。优选地，在印刷过程中混合物中的盐含量低于溶解度极限，以使混合物在印刷机的印刷头中不会结晶。在各个点施加的混合物的体积可以是例如100pl、200pl、300pl、400pl、500pl、750pl、1nl、2nl、3nl、4nl或5nl，或可以选自上述值中的任意两个为界的范围(例如100pl至5nl、100pl至1nl、300pl至1nl、200pl至750nl、100pl至500pl、200pl至2nl、500pl至2nl、1nl至2nl，依此类推)。在优选的实施方案中，点体积为200pl至4nl。
各个点的直径将取决于混合物的组成、所施加的混合物的体积以及基底的表面化学性质。点直径通常为80μm至1000μm，并且可以通过改变前述参数来获得。在各种实施方案中，点直径是80μm、100μm、120μm、140μm、160μm、180μm、200μm、300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、800μm、900μm或1000μm，或选自以任何两个前述实施方案为界的范围，例如80μm至200μm、100μm至120μm、120μm至140μm、120μm至180μm、140μm至160μm、160μm至180μm、180μm至200μm、120μm至200μm、100μm至400μm、160μm至600μm或120μm至700μm，依此类推。在优选的实施方案中，直径为100μm至200μm或其子范围。
可以在本公开内容的方法中使用的合适的聚合物、交联剂和探针分别在4.1.1、4.1.2和4.1.4节中描述。在一些实施方案中，该方法中使用的聚合物的每个聚合物分子具有至少一个交联剂基团。在一个优选的实施方案中，聚合物的每个分子具有至少两个交联剂基团。在特别优选的实施方案中，聚合物的每个分子具有至少两个光反应性交联剂基团。在这些实施方案中，不需要单独的聚合物和交联剂分子。
可以包含在混合物中的合适的盐在4.3.1节中描述。合适的盐晶体形成条件在4.3.2节中描述。合适的交联条件在4.3.3节中描述。适用于溶解盐晶体的溶剂在4.3.4节中描述。
4.3.1.盐
本发明的聚合物网络的特征在于当聚合物在由含有至少两种类型的盐的水溶液形成的包含盐晶体的混合物中交联时产生的传输通道。
优选根据盐与一种或多种探针的相容性选择盐。理想情况下，每种盐都具有以下一种或多种特征：(i)盐对探针无毒(例如，盐不会使探针变性)，(ii)盐不会与探针发生化学反应，(iii)盐不会攻击适合于探针的光学标记的荧光团，例如花青染料，和/或(iv)盐不会与分析物、检测分子和/或与之键合的结合伴侣发生反应。优选地，盐中的至少一种形成针状晶体。
在一个优选的实施方案中，盐水溶液包含至少两种类型的单价阳离子，例如两种类型的碱金属阳离子。可以使用的碱金属阳离子包括钠阳离子和钾阳离子，尽管还可以使用其他碱金属阳离子，例如锂阳离子。
对于用于检测核酸分析物的最佳的信噪比，盐水溶液优选包含钠和钾阳离子和/或具有总的单价阳离子浓度，使得当与聚合物溶液和任选的探针溶液混合时(交联之前)所得混合物的总单价阳离子浓度为至少500mM。在特定的实施方案中，混合物中的钠离子浓度为至少250mM，并且可以为250mM至500mM，更优选在300mM至400mM的范围内。在一个具体的实施方案中，混合物中的钠离子浓度为350mM。混合物中的钾离子浓度优选为至少150mM，并且优选在150mM至500mM的范围内，更优选在200mM至400mM的范围内，并且还更优选在250mM至350mM的范围内。
可以使用磷酸氢二钠(Na2HPO4)和/或磷酸二氢钠(NaH2PO4)制备盐水溶液，它们在水溶液中释放Na+阳离子和磷酸根离子PO4 3-。盐水溶液也可以使用磷酸氢二钾(K2HPO4)和/或磷酸二氢钾(KH2PO4)制备。
优选地，盐水溶液可以是磷酸钠缓冲液，其包含磷酸氢二钠和磷酸二氢钠两者，补充有磷酸氢二钾(K2HPO4)和/或磷酸二氢钾(KH2PO4)。在一个实施方案中，分别制备包含磷酸氢二钠和磷酸二氢钠两者的磷酸钠缓冲液和包含磷酸氢二钾和磷酸二氢钾两者的磷酸钾缓冲液并在与聚合物和/或探针溶液混合之前或之后合并成单一水溶液。
通常，盐水溶液的pH优选为6至9，更优选在7-8.5的范围内。在某些示例性实施方案中，pH为7.5、8或8.5，最优选为8。
对于包含基于蛋白质的探针生物分子的网络，盐水溶液可以包含磷酸缓冲盐水(“PBS”)和/或单价阳离子硫酸盐。
4.3.2.盐晶体形成条件
盐晶体形成条件可以包括使混合物脱水或冷却混合物，直到混合物中的相对盐含量增加到溶解度极限以上，这意味着混合物中的盐被过饱和。这促进了从位于混合物体积中的结晶胚朝向混合物表面形成盐晶体。不受理论的束缚，据信使用包含至少两种不同的单价金属离子的水溶液导致形成至少两种不同类型的盐晶体。
可以通过加热混合物、将混合物暴露于真空和/或降低混合物周围气氛的湿度来使混合物脱水。
可以通过将混合物放置在加热的基底或表面上(例如，约50℃至约70℃)、加热已放置混合物的基底或表面(例如，约50℃至约70℃)和/或使混合物与热气体(例如，温度高于混合物温度的空气、氮气或二氧化碳)接触来加热混合物，以使水从混合物中蒸发。与热气体的接触可以例如通过将混合物放入加热炉中进行。在传输到加热炉的过程中，混合物可以保持在40％或更高的湿度，例如大约60％的相对湿度下，尽管更高的相对湿度，甚至高达75％或更高的相对湿度也是可行的。具有较高钾离子浓度的混合物可以耐受较低的相对湿度，并且具有较低钾盐浓度的混合物优选在传输期间保持在较高的相对湿度。
通过加热混合物，还可以活化可热活化的交联剂(如果存在)，并由此使聚合物交联。
在一些实施方案中，用于使混合物脱水的加热的基底和/或空气的温度比加热混合物之前的混合物的温度高20℃或更高，但小于100℃。
可以通过将混合物置于冷却的基底或表面上(例如，约5℃至约15℃)、冷却已放置混合物的基底或表面(例如，约5℃至约15℃)和/或使其与冷气体(例如温度低于混合物温度的空气、氮气或二氧化碳)接触来冷却混合物。冷却后，混合物中盐的温度相关溶解度极限降低，直到混合物最终被盐过饱和。在一些实施方案中，通过在具有低湿度的冷室(例如，温度为0℃至10℃，相对湿度＜40％)中孵育混合物来冷却混合物。
混合物中的温度优选在一种或多种盐晶体的形成过程中保持高于混合物周围的环境空气的露点。这样防止混合物被从环境空气中冷凝的水稀释，这可能导致混合物中的相对盐含量降低。
4.3.3.交联条件
交联条件可以根据使用的交联剂的类型来选择。例如，当使用由紫外线激活的交联剂(例如，二苯甲酮、噻吨酮或安息香醚)时，交联条件可包括使混合物暴露于紫外(UV)线。在一些实施方案中，使用具有约250nm至约360nm(例如260±20nm或355±20nm)的波长的UV光。使用较低能量/较长波长的紫外线(例如360nm紫外线相对254nm紫外线)可能需要更长的曝光时间。当使用由可见光激活的交联剂(例如，乙基曙红、曙红Y、玫瑰红、樟脑醌或赤藓红素)时，交联条件可包括使混合物暴露于可见光。当使用热活化的交联剂(例如4,4'氮双(4-氰基戊酸)和2,2-氮双[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二盐酸盐或过氧化苯甲酰)时，交联条件可包括使混合物暴露于热。
可以选择交联条件的长度和强度，以实现聚合物分子与其他聚合物分子的交联、聚合物分子与探针分子(如果存在)的交联以及聚合物分子与基底分子或存在于底物上的有机分子(如果存在)的交联。包含探针的混合物的交联条件的长度和强度可以通过实验确定以例如平衡固定的坚固性和探针分子的天然性。
4.3.4.盐晶体溶解
在使聚合物交联之后，可以将盐晶体溶解在溶剂中，使得在网络中形成至少一个传输通道。不受理论的束缚，据信在晶体形成过程中使用两种类型的单价盐阳离子产生至少两种类型的晶体、致密晶体和针状晶体。据信致密晶体的溶解导致短通道，其在网络中产生海绵状效果，其被针状晶体的溶解导致的长通道刺穿。
当使用通过本发明的方法生产的阵列作为生物传感器时，允许高测量精度和高测量动态。
可以以与聚合物和探针(如果存在的话)相容的方式选择用于溶解一种或多种盐晶体的溶剂(例如，可以选择溶剂使得其不溶解聚合物和探针)。优选地，所使用的溶剂是水基缓冲剂，例如稀释的磷酸盐缓冲剂。可以将甲醇、乙醇、丙醇或这些液体的混合物添加到缓冲液中，以促进从网络中除去未结合的聚合物。
除去盐晶体后，网络会因干燥而破裂，并可以重新水化。干燥网络具有运输和稳定探针生物分子的优势。
4.3.5.三维网络的使用方法
本公开内容的网络和阵列可用于确定样品优选液体样品中分析物的存在或不存在。因此，本公开内容提供了用于确定样品或多个样品中是否存在分析物的方法，该方法包括使包含能够与分析物结合的探针分子的本公开内容的网络或阵列与样品或多个样品接触并检测分析物与探针分子的结合，从而确定样品或多个样品中是否存在分析物。当在方法中使用包含能够结合不同种类的分析物的不同种类的探针的阵列时，可以通过检测不同种类的分析物与探针的结合来确定不同种类的分析物的存在。在一些实施方案中，该方法进一步包括定量结合至阵列的一种或多种分析物的量的步骤。
分析物可以是例如核酸，例如聚合酶链反应(PCR)扩增子。在一些实施方案中，从生物或环境样品(例如，血液、血清、血浆、组织、细胞、唾液、痰、尿液、脑脊液、胸膜液、牛奶、眼泪、粪便、汗液、精液、全细胞、细胞成分、细胞涂片或其提取物或衍生物)扩增PCR扩增子。在一些实施方案中，核酸被标记(例如，荧光标记)。
放置在网络表面上的分析物可以通过传输通道渗透到网络内部，以特异性地与共价键合到聚合物上的探针(例如生物分子)结合。当使用固定有网络的本公开内容的阵列作为生物传感器时，允许高测量精度以及高测量动态。
本公开内容的网络和阵列可以在用作生物传感器之后被再生，并且可以被使用多次(例如，5次，至少10次，至少20次，至少30次，至少40次或至少50次)。如果探针分子是DNA，其可以通过例如在1x磷酸缓冲盐水中将网络加热到80℃至90℃的温度约10分钟来实现。然后，可以将磷酸缓冲盐水替换为新的磷酸缓冲盐水，以将变性的DNA从网络洗掉。如果网络或阵列的探针分子是抗原，则可以通过使网络与0.1N NaOH接触约10分钟来再生网络或阵列。然后，可以将0.1N NaOH交换为磷酸缓冲盐水，以将抗原从网络中洗出。因此，使用本公开内容的网络和阵列的方法的一些实施方案包括使用在与样品或多个样品接触之前已被洗涤的网络或阵列。
4.4.本公开内容的阵列的应用
因为本发明的阵列实现了样品中核酸的定性和定量存在的经济确定，所以它可直接应用于与人和非人动物的健康和疾病有关的问题。
在这些应用中，根据本领域已知的方案从生物学或环境来源衍生或提取含有靶分子的制剂。靶分子可以从所有分类学类别的细胞和组织(包括所有门和类的病毒、细菌和真核生物、原核生物、原生生物、植物、真菌和动物)中衍生或提取。动物可以是脊椎动物，哺乳动物，灵长类动物，尤其是人。血液、血清、血浆、组织、细胞、唾液、痰、尿液、脑脊液、胸膜液、牛奶、眼泪、粪便、汗液、精液、全细胞、细胞成分和细胞涂片是靶分子的合适来源。
靶分子优选是从任何前述来源扩增(例如，通过PCR)的核酸。
本发明的阵列可以包含用于检测人或非人动物的病原体的探针。此类探针包含与细菌、病毒或真菌靶标或细菌、病毒和真菌靶标的任何组合至少部分互补的寡核苷酸。
本发明的阵列可包含用于检测人或非人动物细胞中的基因表达(例如与疾病或病症例如癌症、心血管疾病或代谢性疾病相关的基因表达)的探针用于诊断受试者、监测受试者的治疗或受试者结局的预后的目的。然后，基因表达信息可以跟踪疾病的进展或消退，并且此类信息可以帮助监测初始治疗的成功或改变初始治疗的过程。
5.示例性方案
以下参考附图中提供的附图标记的示例性方案在本公开内容的范围内，并且可以与分别4.1.1、4.1.2和4.1.4节的聚合物、交联剂和探针一起使用。用于以下方法的其他有用的聚合物(包括共聚物)和交联剂基团在Rendl等人，2011，Langmuir 27：6116-6123和US2008/0293592中进行了描述，其内容通过引用并入本文。在一个实施方案中，使用根据6.2节的聚合物混合物。
5.1.示例性方案1
将具有优选为有机的表面(2)的板放置在经加热的支架(6)上。50℃至70℃是温度是合适的。使用标准DNA芯片点样仪(例如，Scienion，Germany)将包含聚合物(3)、探针生物分子(1)和盐水溶液的混合物(5)点样在有机表面(2)上。0.5至4nl的体积印刷在每个点(7)上(参见图2)。这些点的液体几乎立即干燥，导致盐晶体(8)、(14)的成核。成核后，针状盐晶体可以从位于混合物(5)体积中的至少一个结晶胚(9)延伸到混合物(5)的表面(10)(参见图3)。另外，据信发生了较短的立方或棒状晶体(14)的形成(参见图3)。在晶体(8)、(14)的成核后，立即用光学UV辐射(11)在UV交联剂中照射点(7)(参见图4)，使得探针生物分子(1)共价键合到聚合物(3)上，并且聚合物(3)共价键合到有机表面(2)上并交联(参见图5)。注意，干燥的交联的混合物(5)不吸引水分以再次变成液体。
然后使干燥的交联的混合物(5)与用于晶体(8)的溶剂(12)接触，使得在晶体(8)、(14)所在的位置处，长(13)和短(19)的通道在包含聚合物(3)和探针生物分子(1)的网络(15)中形成(参见图6)。之后，除去溶剂(12)。长通道(13)可以从网络(15)的表面(16)延伸到网络(15)的内部。溶解有盐晶体(8)、(14)的溶剂(12)被选择为使得其与探针生物分子(1)以及聚合物(3)相容。优选地，所使用的溶剂(12)是水基的。
5.2.示例性方案2
使用标准DNA芯片点样仪(例如，Scienion，Germany)，将包含聚合物(3)、探针生物分子(1)和盐水溶液的混合物(5)点样在布置在板上的有机表面(2)上。0.5至4nl的体积印刷在每个点(7)上(参见图2)。将具有在表面(2)(优选为有机的)上的点(7)的板放置在已冷却的支架(6)上(参见图3)。5℃至15℃的温度是合适的。这些点的液体被冷却下来以使缓冲液过饱和，其几乎立即导致晶体成核。成核后，针状盐晶体(8)可以从位于混合物(5)体积中的至少一个结晶胚(9)延伸到混合物(5)的表面(10)。另外，据信发生了较短的立方或棒状晶体(14)的形成(参见图3)。印刷后，将这些靶标放入烘箱(例如70℃)中以完全干燥。晶体成核后，将点立即用光学UV辐射(11)在UV交联剂中照射(参见图4)，以使探针生物分子(1)共价键合到聚合物(3)上，并且聚合物(3)共价键合到有机表面(2)并交联。注意，干燥的交联的混合物不吸引水分以再次变成液体。
然后使干燥的交联混合物(5)与溶剂(12)接触，以溶解晶体(8)、(14)，使得在晶体(8)、(14)所在的位置处，在包含聚合物(3)和探针生物分子(1)的网络(15)中形成传输通道，例如长通道(13)和短通道(19)。之后，除去溶剂(12)。长通道(13)可以从网络(15)的表面(16)延伸到网络(15)的内部。溶解有盐晶体(8)、(14)的溶剂(12)被选择为使得其与探针生物分子(1)和聚合物(3)相容。优选地，所使用的溶剂(12)是水基的。
如能够在图6中所看到的，可以在网络(15)中形成多个长通道(13)和短通道(19)。长通道(13)可以从网络(15)的表面(16)延伸到位于网络(15)内的至少一个点。长通道(13)可以布置为使得从表面(16)开始沿内部方向，长通道(13)之间的横向距离减小。
5.3.示例性方案3
含有聚合物(3)、探针生物分子(1)和盐水溶液的混合物(5)在湿度为40-80％优选50-70％的正常条件下印刷在板的表面(2)(优选为有机的)上。例如，混合物可以包含350mM的磷酸钠(pH 8)和250-300mM的磷酸钾(pH 8)。将0.5至4nl的体积印刷在每个点(7)上。印刷室中的水分含量确保点(7)保持液体状态而不会形成晶体(即不发生成核作用)。然后将板放入容器，例如纸板箱中。将盖子放在板上进用于传输。然后将具有点(7)的板放入干燥炉或加热板上，以迅速引起成核，使得针状盐晶体(8)从位于混合物的体积内的至少一个结晶胚(9)朝向混合物(5)的表面(10)延伸。另外，据信发生了较短的立方或棒状晶体(14)的形成。
烘箱/热板的温度应高于印刷温度20℃或更多。高于100℃的温度不是必须的。
干燥后，照射混合物以使聚合物(3)、探针生物分子(1)和表面(2)交联。
然后使干燥的交联的混合物(5)与溶剂(12)接触，使得在晶体(8)、(14)所在的位置处，在包含聚合物(3)和探针生物分子(1)的网络(15)中形成长通道(13)和短通道(19)。之后，除去溶剂(12)。长通道(13)可以从网络(15)的表面(16)延伸到网络(15)的内部。溶解有盐晶体(8)、(14)的溶剂(12)被选择为使得其与探针生物分子(1)和聚合物(3)相容。优选地，所使用的溶剂(12)是水基的。
5.4.示例性方案4
备选地，可以通过放入具有低湿度的冷室(例如，温度<10℃，相对湿度<40％)中将示例性方案3中制备的具有在表面(2)(优选为有机的)上的点(7)的板冷却以实现成核。干燥可以通过在成核开始后降低湿度或施加真空来进行。在成核之后，针状盐晶体(8)可以从位于混合物(5)的体积中的至少一个结晶胚(9)向混合物(5)的表面(10)延伸。另外，据信发生了较短的立方或棒状晶体(14)的形成。将具有(7)点的板放入60℃-70℃的烘箱中1小时，以完全干燥点。在UV交联剂(即Stratalinker 2400)中以1.00J@254nm对点(7)进行UV照射。为此，可以将具有点(7)的板放在腔室中央，其中较短一侧平行于腔室的门。然后，移除盖子并启动交联剂。仪器完成后，将阵列取出并重新装上盖子。
或者，可以使用具有相同波长(例如240-270nm)或更长波长例如360nm的其他UV交联剂。
然后使混合物(5)与溶剂(12)接触以溶解晶体(8)、(14)，使得在晶体(8)、(14)所在的位置处，在包含聚合物(3)和探针生物分子(1)的网络(15)中形成长通道(13)和短通道(19)。之后，除去溶剂(12)。长通道(13)可以从网络(15)的表面(16)延伸到网络(15)的内部。溶解有盐晶体(8)、(14)的溶剂(12)被选择为使得其与聚合物(3)和的探针生物分子(1)相容。优选地，所使用的溶剂(12)是水基的。
6.实施例
6.1.背景
基本上如本文所述制备聚合物网络但包含浓度为350mM的磷酸钠(“NaPi”)的缓冲液而没有第二种盐的聚合物网络如果在加热板上的干燥过程中湿度不保持在60％或更高，则可以干燥并经历相分离。这是因为在较低的湿度水平下结晶可不受控制地发生。
将期望的是增加磷酸钠浓度以避免不受控制的结晶。但是，NaPi的浓度无法显著增加，因为随后NaPi晶体可能会在印刷机中沉淀并阻塞印刷喷嘴。
各种盐(氯化钠、钠盐)与NaPi实验组合使用。但是，没有一个给出比单独的NaPi更好的信号。通常，这些点的杂交信号是较差的(数据未显示)。
在正常湿度水平下最小化干燥的其他尝试包括测试磷酸缓冲盐水、柠檬酸钠缓冲液或磷酸钾缓冲液来代替NaPi，导致聚合物网络中的杂交信号降低。
但是，当NaPi缓冲液同磷酸钾缓冲液增强时(如第6.2节所述)，观察到液体点的稳定而没有信号损失，尤其是当磷酸钾浓度大于150mM时。
当进行这些实验时，得到令人惊讶的观察结果。在较高的磷酸钾水平(150mM和更高)下，背景信号(“噪音”)降低了，并且在200mM的浓度下，杂交反应几乎完全没有噪音(如第6.3节所述)。这种作用的原因很可能是短通道导致海绵状聚合物基底被来自磷酸钠的长通道刺穿。然后，这两种结构的组合不仅改善了缔合动力学(杂交)，而且还改善了解离动力学(洗掉未结合或弱结合的物质)。较低的背景信号降低背景信号，并因此改善使用磷酸钠和磷酸钾两者制备的聚合物网络进行的任何测试的LOD(检测限)。
6.2.实施例1：三维聚合物网络的形成
通过将10mg交联聚合物聚(二甲基丙烯酰胺)共5％甲基丙烯酰基-二苯甲酮共2.5％4-乙烯基苯磺酸钠溶解在1.0ml不含DNA酶的水中，制备10mg/ml聚合物储备溶液。这可以通过剧烈摇动和涡旋约5分钟直至所有可见的聚合物溶解来实现。然后将储备溶液包裹在箔中以保护其免受光照，并放置在冰箱中过夜，以确保聚合物完全溶解并允许减少泡沫。该聚合物的每个分子具有至少两个光反应性基团。
将包含10mg/ml聚合物(PDMAA-5％MABP-2.5％SSNa)、探针生物分子(包括具有Cy3荧光部分的DNA寡核苷酸)和含350mM磷酸钠缓冲液和在某些情况下不同量的磷酸钾的盐水溶液的各种混合物在65％的湿度下印刷在板的有机表面上。使用Scienion Sciflex印刷机在每个点上印刷1.6nl的体积。然后将板放入容器(纸板箱)中。将盖子置于具有有机表面的板上用于传输。然后将具有在有机表面上的点的板放入干燥箱或热板(70℃)中，以使盐晶体成核。在干燥1小时后，照射板以使聚合物、探针生物分子和有机表面交联。
印刷后用10mM NaPi缓冲液将板洗涤以除去未结合的物质，然后干燥并保存。在Sensovation荧光扫描仪中扫描板，以目测评估点形态。所得的图像显示在图11A(洗涤后)和图11B(干燥后)中。
D和E行中的点包括变化量的磷酸钾(如图11C所示)，而其余行中的点是使用仅包含磷酸钠缓冲液的盐溶液产生的。与仅用磷酸钠制备的点相比，包含磷酸钾导致更均匀和圆形的聚合物网络(图11A-图11B)。包含磷酸钾还允许在相对湿度不增加(例如在约40％的正常大气湿度附近)时受控的结晶。
6.3.实施例2：聚合物网络的杂交质量
使用用于检测金黄色葡萄球菌或大肠杆菌的探针制备如实施例1中所述的阵列。
将用于扩增金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的引物对用于分别使用100个拷贝的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌基因组DNA作为模板的PCR反应中，并将PCR产物杂交到含有金黄色葡萄球菌和大肠杆菌探针的阵列中。结果显示在图12A-12B中。图12A显示了从100个拷贝的金黄色葡萄球菌DNA扩增的PCR产物与阵列的杂交。图12B显示了从100个拷贝的大肠杆菌DNA扩增的PCR产物与阵列的杂交。图12A和图12B的阵列的探针图显示在图12C中。这项研究表明，来自使用含磷酸钾以及磷酸钠缓冲液的盐水溶液制备的聚合物网络的信号与使用仅含有磷酸钠的盐水溶液制备的聚合物网络相比具有可比较的信号。
出乎意料的是，与使用仅含有磷酸钠的盐水溶液制备的聚合物网络相比，使用含磷酸钾的盐水溶液制备的聚合物网络具有降低的背景“噪声”，如图13所示。图13显示了在没有模板的情况下，使用相同的金黄色葡萄球菌或大肠杆菌特异性引物对扩增的PCR产物的杂交产生的荧光信号的定量。因此，任何杂交信号都代表背景“噪声”。在较高浓度的磷酸钾的存在下制备的聚合物网络没有背景“噪声”。
7.具体实施方案
下面的具体实施方案举例说明了本公开内容。
1.一种制造三维水凝胶网络的方法，包括：
(a)使混合物(任选地位于基底表面上)暴露于盐晶体形成条件从而形成含有一种或多种盐晶体的混合物，所述盐晶体形成条件包括：
(i)总浓度至少为500mM的至少两种类型的单价金属离子，
(ii)水溶性聚合物链，
(iii)交联剂部分，和
(iv)任选地，探针分子；
(b)将含有一种或多种盐晶体的混合物暴露于交联条件，从而形成含有一种或多种盐晶体的水凝胶；和
(c)使含有一种或多种盐晶体的水凝胶与一种或多种盐晶体可溶于其中的溶剂接触，从而溶解盐晶体；
从而形成三维水凝胶网络。
2.实施方案1的方法，其中所述混合物包含总浓度为500mM至1000mM的至少两种类型的单价金属离子。
3.实施方案2的方法，其中混合物中单价金属离子的总浓度为550mM至800mM。
4.实施方案3的方法，其中混合物中单价金属离子的总浓度为600mM至750mM。
5.实施方案1-4中任一项的方法，其中所述混合物包含两种类型的单价金属离子。
6.实施方案5的方法，其中每种单价离子的浓度为至少150mM或至少200mM。
7.实施方案5或实施方案6的方法，其中所述单价金属离子选自钠离子、钾离子和锂离子。
8.实施方案5或实施方案6的方法，其中所述单价金属离子为钠离子和钾离子。
9.实施方案8的方法，其中钠离子的浓度为至少300mM。
10.实施方案9的方法，其中钠离子的浓度为300mM至500mM。
11.实施方案10的方法，其中钠离子的浓度为300mM至400mM。
12.实施方案11的方法，其中钠离子的浓度为350mM。
13.实施方案8至12中任一项的方法，其中钾离子的浓度为150mM至500mM。
14.实施方案13的方法，其中钾离子的浓度为175mM至400mM。
15.实施方案14的方法，其中钾离子的浓度为200mM至350mM。
16.实施方案15的方法，其中钾离子的浓度为250mM至350mM。
17.实施方案1-4中任一项的方法，其中所述混合物包含三种类型的单价金属离子。
18.实施方案17的方法，其中至少两种单价离子的浓度各自为至少150mM或各自为至少200mM。
19.实施方案17或实施方案18的方法，其中所述单价金属离子为钠离子、钾离子和锂离子。
20.实施方案19的方法，其中钠离子的浓度为至少250mM。
21.实施方案20的方法，其中钠离子的浓度为250mM至500mM。
22.实施方案21的方法，其中钠离子的浓度为300mM至400mM。
23.实施方案22的方法，其中钠离子的浓度为350mM。
24.实施方案19至23中任一项的方法，其中钾离子的浓度为150mM至500mM。
25.实施方案24的方法，其中钾离子的浓度为200mM至400mM。
26.实施方案25的方法，其中钾离子的浓度为250mM至350mM。
27.实施方案1至26中任一项的方法，其还包括在步骤(a)之前形成混合物。
28.实施方案27的方法，其中形成混合物包括将包含单价金属阳离子的盐水溶液与包含水溶性聚合物链、交联剂部分和任选的探针分子(如果存在)的一种或多种溶液混合。
29.实施方案28的方法，其中所述水溶性聚合物链和所述交联剂部分在单一溶液中。
30.实施方案29的方法，其中所述交联的部分共价附着至所述聚合物链。
31.实施方案28至30中任一项的方法，其中所述盐水溶液的pH为6至9。
32.实施方案31的方法，其中所述盐水溶液的pH为7至8.5。
33.实施方案32的方法，其中所述盐水溶液的pH为8。
34.实施方案28至33中任一项的方法，其中所述盐水溶液通过包括将磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸钠、硫酸钾或其组合溶解在水或水性溶液中的方法制备。
35.实施方案34的方法，其中所述盐水溶液通过包括将磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾或其组合溶解在水或水性溶液中的方法制备。
36.实施方案35的方法，其中所述盐水溶液通过包括将磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾和磷酸二氢钾溶解在水中的方法制备。
37.实施方案1-36中任一项的方法，其中混合物中磷酸根离子的浓度为至少250mM。
38.实施方案37的方法，其中混合物中磷酸根离子的浓度为250mM至1000mM。
39.实施方案38的方法，其中混合物中磷酸根离子的浓度为550mM至800mM。
40.实施方案39的方法，其中混合物中磷酸根离子的浓度为600mM至750mM。
41.实施方案1至40中任一项的方法，其中盐晶体形成条件导致形成一种或多种针状晶体，使得在盐晶体溶解后产生一个或多个长通道。
42.实施方案1-41中任一项的方法，其中盐晶体形成条件导致形成一种或多种致密晶体，使得在盐晶体溶解后产生一个或多个短通道。
43.实施方案1-42中任一项的方法，其中盐晶体形成条件包括使混合物脱水。
44.实施方案43的方法，其包括通过加热混合物、使混合物暴露于真空、降低混合物周围的气氛的湿度或其组合来使混合物脱水。
45.实施方案44的方法，其包括通过将混合物暴露于真空来使混合物脱水。
46.实施方案44的方法，其包括通过加热混合物使混合物脱水。
47.实施方案46的方法，其中加热混合物包括使混合物接触具有高于混合物的温度的温度的气体。
48.实施方案1-42中任一项的方法，其中盐晶体形成条件包括冷却混合物直到混合物被盐过饱和。
49.实施方案48的方法，其包括通过使混合物与具有低于混合物的温度的温度的气体接触来冷却混合物。
50.实施方案1至49中任一项的方法，其中在步骤(a)期间混合物的温度保持在混合物周围的气氛的露点以上。
51.实施方案1至50中任一项的方法，其中通过紫外(UV)光活化交联剂部分并且交联条件包括将混合物暴露于紫外光。
52.实施方案1至50中任一项的方法，其中通过可见光活化交联剂部分，并且交联条件包括将混合物暴露于可见光。
53.实施方案1至50中任一项的方法，其中通过加热活化交联剂部分，并且交联条件包括将混合物暴露于热。
54.实施方案1至53中任一项的方法，其中所述水溶性聚合物链包含均聚物链。
55.实施方案1至54中任一项的方法，其中所述水溶性聚合物链包含共聚物链。
56.实施方案1-54中任一项的方法，其中所述水溶性聚合物链包含均聚物和共聚物链的混合物。
57.实施方案54至56中任一项的方法，其中所述水溶性聚合物链包含由一种或多种种类的单体聚合而成的聚合物链。
58.实施方案57的方法，其中每种种类的单体包括独立地选自以下的可聚合基团：丙烯酸酯基团，甲基丙烯酸酯基团，乙基丙烯酸酯基团，2-苯基丙烯酸酯基团，丙烯酰胺基团，甲基丙烯酰胺基团，衣康酸酯基团和苯乙烯基团。
59.实施方案58的方法，其中水溶性聚合物中的至少一种单体种类包含甲基丙烯酸酯基团。
60.实施方案59的方法，其中包含甲基丙烯酸酯基团的至少一种单体种类是甲基丙烯酰氧基二苯甲酮(MABP)。
61.实施方案57中任一项的方法，其中所述水溶性聚合物包含由二甲基丙烯酰胺(DMAA)、甲基丙烯酰氧基二苯甲酮(MABP)和4-乙烯基苯磺酸钠(SSNa)聚合的聚合物。
62.实施方案1-61中任一项的方法，其中所述水溶性聚合物链是包含交联剂部分的共聚物的链。
63.实施方案62的方法，其中水溶性聚合物链的每个聚合物分子包含至少两个交联剂部分。
64.实施方案1至63中任一项的方法，其中所述交联剂部分选自二苯甲酮，噻吨酮，安息香醚，乙基曙红，曙红Y，玫瑰红，樟脑醌，赤藓红素，4,4'氮双(4-氰基戊酸)，2,2-氮双[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二盐酸盐和过氧化苯甲酰。
65.实施方案64的方法，其中所述交联剂部分是二苯甲酮部分。
66.实施方案1至65中任一项的方法，其中所述溶剂是水或水基缓冲剂。
67.实施方案66的方法，其中所述溶剂是水。
68.实施方案66的方法，其中所述溶剂是水基缓冲剂。
69.实施方案68的方法，其中所述水基缓冲剂包括磷酸盐、甲醇、乙醇、丙醇或其混合物。
70.实施方案1-69中任一项的方法，其中步骤(a)的混合物还包含探针分子。
71.实施方案70的方法，其中至少一些、大多数或所有探针分子包含核酸、核酸衍生物、肽、多肽、蛋白质、碳水化合物、脂质、细胞、配体或其组合。
72.实施方案71的方法，其中至少一些探针分子包含核酸或核酸衍生物。
73.实施方案71的方法，其中至少大部分探针分子包含核酸或核酸衍生物。
74.实施方案71的方法，其中所有探针分子包含核酸或核酸衍生物。
75.实施方案70的方法，其中至少一些、大多数或所有探针分子包含抗体、抗体片段、抗原、表位、酶、酶底物、酶抑制剂、核酸或其组合。
76.实施方案75的方法，其中至少一些探针分子包含核酸。
77.实施方案75的方法，其中至少大部分探针分子包含核酸。
78.实施方案75的方法，其中所有探针分子均包含核酸。
79.实施方案76至78中任一项的方法，其中所述核酸是寡核苷酸。
80.实施方案79的方法，其中所述寡核苷酸长12至30个核苷酸。
81.实施方案79的方法，其中所述寡核苷酸长14至30个核苷酸。
82.实施方案79的方法，其中所述寡核苷酸长14至25个核苷酸。
83.实施方案79的方法，其中所述寡核苷酸长14至20个核苷酸。
84.实施方案79的方法，其中所述寡核苷酸长15至30个核苷酸。
85.实施方案79的方法，其中所述寡核苷酸长15至25个核苷酸。
86.实施方案79的方法，其中所述寡核苷酸长15至20个核苷酸。
87.实施方案79的方法，其中所述寡核苷酸长16至30个核苷酸。
88.实施方案79的方法，其中所述寡核苷酸长16至25个核苷酸。
89.实施方案79的方法，其中所述寡核苷酸长16至20个核苷酸。
90.实施方案79的方法，其中所述寡核苷酸长15至40个核苷酸。
91.实施方案79的方法，其中所述寡核苷酸长15至45个核苷酸。
92.实施方案79的方法，其中所述寡核苷酸长15至50个核苷酸。
93.实施方案79的方法，其中所述寡核苷酸长15至60个核苷酸。
94.实施方案79的方法，其中所述寡核苷酸长20至55个核苷酸。
95.实施方案79的方法，其中所述寡核苷酸长18至60个核苷酸。
96.实施方案79的方法，其中所述寡核苷酸长20至50个核苷酸。
97.实施方案79的方法，其中所述寡核苷酸长30至90个核苷酸。
98.实施方案79的方法，其中所述寡核苷酸长20至100个核苷酸。
99.实施方案79的方法，其中所述寡核苷酸长20至120个核苷酸。
100.实施方案79的方法，其中所述寡核苷酸长20至40个核苷酸。
101.实施方案79的方法，其中所述寡核苷酸长20至60个核苷酸。
102.实施方案79的方法，其中所述寡核苷酸长40至80个核苷酸。
103.实施方案79的方法，其中所述寡核苷酸长40至100个核苷酸。
104.实施方案79的方法，其中所述寡核苷酸长40至60个核苷酸。
105.实施方案79的方法，其中所述寡核苷酸长60至80个核苷酸。
106.实施方案79的方法，其中所述寡核苷酸长80至100个核苷酸。
107.实施方案79的方法，其中所述寡核苷酸长100至120个核苷酸。
108.实施方案79的方法，其中所述寡核苷酸长12至150个核苷酸。
109.实施方案1至108中任一项的方法，其在步骤(a)之前，进一步包括将混合物施加至基底表面的步骤。
110.实施方案109的方法，其中以100pl至5nl的体积施加所述混合物。
111.实施方案109的方法，其中以100pl至1nl的体积施加所述混合物。
112.实施方案109的方法，其中以200pl至1nl的体积施加所述混合物。
113.实施方案109至112中任一项的方法，其中将混合物施加至基底的步骤包括将混合物喷涂到基底的表面上。
114.实施方案113的方法，其中所述混合物通过喷墨印刷机喷涂。
115.实施方案109至114中任一项的方法，其中所述基底包含有机聚合物或在表面上具有有机分子的自组装单层的无机材料。
116.实施方案115的方法，其中所述基底包含有机聚合物。
117.实施方案116的方法，其中有机聚合物选自环烯烃共聚物、聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯和聚甲基丙烯酸甲酯。
118.实施方案117的方法，其中所述基底包含聚甲基丙烯酸甲酯、聚苯乙烯或环烯烃共聚物。
119.实施方案115的方法，其中所述基底包括在表面上具有烷基硅烷自组装单层的无机材料。
120.实施方案109至119中任一项的方法，其中所述基底包括微孔板。
121.实施方案109至120中任一项的方法，其中在步骤(b)中将聚合物交联至表面。
122.实施方案121的方法，其中产生交联至表面的水膨胀性聚合物。
123.实施方案122的方法，其中所述水膨胀性聚合物可吸收高达其重量的50倍的去离子蒸馏水。
124.实施方案122或实施方案123的方法，其中所述水膨胀性聚合物可吸收其自身体积的5至50倍的去离子蒸馏水。
125.实施方案122至124中任一项的方法，其中所述水膨胀性聚合物可以吸收高达其重量的30倍的盐水。
126.实施方案122至125中任一项的方法，其中所述水膨胀性聚合物可吸收其自身体积的4至30倍的盐水。
127.一种用于制造阵列的方法，其包括通过实施方案1至126中任一项的方法在同一基底的表面上的离散点处产生多个三维水凝胶网络。
128.实施方案127的方法，其中三维水凝胶网络是同时产生的。
129.实施方案127的方法，其中三维水凝胶网络是顺序产生的。
130.实施方案127至129中任一项的方法，其进一步包括将所述多个三维水凝胶网络交联至所述基底的表面。
131.一种用于制造阵列的方法，包括将根据实施方案1至126中任一项的方法产生的或可根据实施方案1至126中任一项的方法获得的多个三维水凝胶网络定位在同一基底的表面上的离散点处。
132.实施方案127至131中任一项的方法，其还包括将所述多个三维水凝胶网络交联至表面。
133.一种用于制造阵列的方法，包括将根据实施方案109至126中任一项的方法产生或可根据实施方案109至126中任一项的方法获得的多个三维水凝胶网络定位在同一基底的表面上的离散点处。
134.实施方案133的方法，其中所述定位包括将形成三维水凝胶网络的混合物施加在离散点处。
135.实施方案127至134中任一项的方法，其中将所述点布置成列和/或行。
136.通过实施方案1至126中任一项的方法产生或可通过实施方案1至126中任一项的方法获得的三维水凝胶网络。
137.一种阵列，其包含在基底上的根据实施方案136的多个三维水凝胶网络。
138.通过实施方案127至135中任一项的方法产生或可通过实施方案127至135中任一项的方法获得的阵列。
139.实施方案137或实施方案138的阵列，其包含至少8个三维水凝胶网络。
140.实施方案137或实施方案138的阵列，其包含至少16个三维水凝胶网络。
141.实施方案137或实施方案138的阵列，其包含至少24个三维水凝胶网络。
142.实施方案137或实施方案138的阵列，其包含至少48个三维水凝胶网络。
143.实施方案137或实施方案138的阵列，其包含至少96个三维水凝胶网络。
144.实施方案137或实施方案138的阵列，其包含至少128个三维水凝胶网络。
145.实施方案137或实施方案138的阵列，其包含至少256个三维水凝胶网络。
146.实施方案137或实施方案138的阵列，其包含至少512个三维水凝胶网络。
147.实施方案137或实施方案138的阵列，其包含至少1024个三维水凝胶网络。
148.实施方案137或实施方案138的阵列，其包含24至8192个三维水凝胶网络。
149.实施方案137或实施方案138的阵列，其包含24至4096个三维水凝胶网络。
150.实施方案137或实施方案138的阵列，其包含24至2048个三维水凝胶网络。
151.实施方案137或实施方案138的阵列，其包含24至1024个三维水凝胶网络。
152.实施方案137或实施方案138的阵列，其包含24个三维水凝胶网络。
153.实施方案137或实施方案138的阵列，其包含48个三维水凝胶网络。
154.实施方案137或实施方案138的阵列，其包含96个三维水凝胶网络。
155.实施方案137或实施方案138的阵列，其包含128个三维水凝胶网络。
156.实施方案137或实施方案138的阵列，其包含256个三维水凝胶网络。
157.实施方案137或实施方案138的阵列，其包含512个三维水凝胶网络。
158.实施方案137或实施方案138的阵列，其包含1024个三维水凝胶网络。
159.实施方案137至158中任一项的阵列，其中三维水凝胶网络包含探针分子，并且三维水凝胶网络中的两个或更多个包含不同种类的探针分子。
160.实施方案137至159中任一项的阵列，其中三维水凝胶网络包含探针分子，并且三维水凝胶网络中的两个或更多个包含相同种类的探针分子。
161.实施方案137至158中任一项的阵列，其中三维水凝胶网络包含探针分子，并且每个三维水凝胶网络包含相同种类的探针分子。
162.实施方案137至161中任一项的阵列，其中多个三维水凝胶网络包含含有标记的对照探针分子的一个或多个三维水凝胶网络。
163.实施方案162的阵列，其中标记的对照探针分子是荧光标记的。
164.实施方案137至163中任一项的阵列，其中所述基底包括微孔板，并且所述微孔板的每个孔包含不超过单个三维水凝胶网络。
165.一种确定样品中是否存在分析物的方法，包括：
(a)使根据实施方案136的三维水凝胶网络或实施方案164中任一项的阵列与样品接触，所述三维水凝胶网络或阵列包含能够与分析物结合的探针分子；和
(b)检测分析物与三维水凝胶网络或阵列中的探针分子的结合，从而确定样品中是否存在分析物。
166.实施方案165的方法，其进一步包括在步骤(a)和(b)之间洗涤包含探针分子的网络或阵列。
167.实施方案165或实施方案166的方法，其进一步包括在步骤(a)之前使包含探针分子的网络或阵列与封闭剂接触。
168.实施方案165至167中任一项的方法，其还包括定量结合至包含探针分子的三维水凝胶网络或阵列的分析物的量。
169.一种用于确定多个样品中的每个样品中是否存在分析物的方法，包括：
(a)使实施方案137至164中任一项的包含能够与分析物结合的探针分子的阵列与样品接触；和
(b)检测分析物与阵列中的探针分子的结合，从而确定分析物是否存在于多个样品中的每个样品中。
170.一种用于确定多个样品中的每个样品中是否存在分析物的方法，包括：
(a)使实施方案137至164中任一项的包含能够与分析物结合的探针分子的阵列与样品接触并包含对照探针分子，其中所述阵列在步骤(a)之前已被使用和洗涤；和
(b)检测分析物与阵列中的探针分子的结合，从而确定分析物是否存在于多个样品中的每个样品中。
171.一种确定样品中是否存在多于一种种类的分析物的方法，该方法包括：
(a)使实施方案137至164中任一项的包含能够与不同种类的分析物结合的不同种类的探针分子的阵列与样品接触；和
(b)检测分析物与阵列中的探针分子的结合，从而确定样品中是否存在多于一种种类的分析物。
172.一种用于确定样品中是否存在多于一种分析物的方法，该方法包括：
(a)使实施方案137至164中任一项的包含能够与不同种类的分析物结合的不同种类的探针分子的阵列与样品接触并包含对照探针分子，其中该阵列在步骤(a)之前已被使用和洗涤；和
(b)检测分析物与阵列中的探针分子的结合，从而确定样品中是否存在多于一种种类的分析物。
173.实施方案169至172中任一项所述的方法，其中：
(a)阵列的基底包括微孔板；
(b)微孔板的每个孔包含不多于单个三维水凝胶网络；和
(c)使阵列与样品接触包括使每个孔与不超过单个样品接触。
174.实施方案169至173中任一项的方法，其进一步包括在步骤(a)和(b)之间洗涤包含探针分子的阵列。
175.实施方案169至174中任一项的方法，其进一步包括在步骤(a)之前使包含探针分子的阵列与封闭剂接触。
176.实施方案169至175中任一项的方法，其进一步包括定量与阵列结合的一种或多种分析物的量。
177.实施方案165至176中任一项所述的方法，还包括重新使用该阵列。
178.根据实施方案177所述的方法，其中所述阵列被重复使用至少5次。
179.根据实施方案177所述的方法，其中所述阵列被重复使用至少10次。
180.根据实施方案177所述的方法，其中所述阵列被重复使用至少20次。
181.根据实施方案177所述的方法，其中所述阵列被重复使用至少30次。
182.根据实施方案177所述的方法，其中所述阵列被重复使用至少40次。
183.根据实施方案177所述的方法，其中所述阵列被重复使用至少50次。
184.实施方案178的方法，其包括重复使用阵列5至20次。
185.实施方案178的方法，其包括重复使用阵列5至30次。
186.实施方案178的方法，其包括重复使用阵列10至50次。
187.根据实施方案178所述的方法，其包括重复使用阵列10至20次。
188.实施方案178的方法，其包括重复使用阵列10至30次。
189.实施方案178的方法，其包括重复使用阵列20至40次。
190.实施方案178的方法，其包括重复使用阵列40至50次。
191.实施方案177至190中任一项的方法，其包括在重复使用之间洗涤阵列。
192.实施方案191的方法，其中所述阵列在变性条件下洗涤。
193.实施方案192的方法，其中变性条件包括将阵列暴露于热。
194.实施方案192的方法，其中变性条件包括将阵列暴露于低盐浓度。
195.实施方案192的方法，其中变性条件包括将阵列暴露于热和低盐浓度。
196.实施方案192的方法，其中变性条件在重复使用之前被除去。
197.实施方案196的方法，其中变性条件包括使阵列暴露于热，并且其中在重复使用之前降低温度。
198.实施方案196的方法，其中变性条件包括使阵列暴露于低盐浓度，并且其中在重复使用之前增加盐浓度。
199.实施方案196的方法，其中变性条件包括使阵列暴露于热和低盐浓度两者，并且其中在重复使用之前降低温度并增加盐浓度。
200.实施方案177至199中任一项的方法，其中阵列包含至少一个三维水凝胶网络，其包含荧光标记的寡核苷酸作为可重复使用性对照。
201.实施方案200的方法，其包括测试荧光信号强度。
202.实施方案201的方法，其中在10次使用后，可重复使用性对照保留其初始荧光信号强度的至少70％。
203.根据实施方案202所述的方法，其中在20次使用之后，可重复使用性对照保留其信号强度的至少50％。
204.实施方案200至203中任一项的方法，其中在可重复使用性对照失去其信号强度的多于50％之后，不再重复使用该阵列。
205.实施方案165至204中任一项的方法，其中分析物是核酸。
206.实施方案205的方法，其中所述核酸是聚合酶链反应(PCR)扩增子。
207.实施方案205的方法，其中从生物样品或环境样品扩增PCR扩增子。
208.实施方案207的方法，其中从生物样品扩增PCR扩增子。
209.实施方案207的方法，其中从环境样品扩增PCR扩增子。
210.实施方案208的方法，其中所述生物样品是血液、血清、血浆、组织、细胞、唾液、痰、尿液、脑脊液、胸膜液、牛奶、眼泪、粪便、汗液、精液、全细胞、细胞成分和细胞涂片或其提取物或衍生物。
211.实施方案210的方法，其中所述生物样品是哺乳动物血液、血清或血浆或其提取物。
212.实施方案211的方法，其中所述生物样品是人或牛血液、血清或血浆或其提取物。
213.实施方案210的方法，其中所述生物样品是牛奶或其提取物。
214.实施方案213的方法，其中所述生物样品是奶牛的牛奶或其提取物。
215.实施方案205至214中任一项的方法，其中核酸是被标记的。
216.实施方案215的方法，其中核酸是荧光标记的。
尽管已经示出和描述了各种特定的实施方案，但是将理解的是，可以在不脱离本公开内容的精神和范围的情况下进行各种改变。
8.参考文献的引用
出于所有目的，将本申请中引用的所有出版物、专利、专利申请和其他文件的全部内容完整地通过引用并入本文，就好像每个单独的出版物、专利、专利申请或其他文件被单独指出出于所有目的通过引用并入一样。如果并入本文的一个或多个参考文献的教导与本公开内容不一致，则以本说明书的教导为准。

Claims (21)

1.一种制造三维水凝胶网络的方法，包括：
(a)使混合物暴露于盐晶体形成条件从而形成含有一种或多种盐晶体的混合物，
其中所述混合物包括：
(i)总浓度为至少500mM的至少两种类型的单价金属离子，
(ii)水溶性聚合物链，和
(iii)交联剂部分；或者
其中所述混合物包括：
(i)总浓度为至少500mM的至少两种类型的单价金属离子，
(ii)水溶性聚合物链，
(iii)交联剂部分，和
(iv)探针分子；
(b)将含有一种或多种盐晶体的混合物暴露于交联条件，从而形成含有一种或多种盐晶体的水凝胶；和
(c)使含有一种或多种盐晶体的水凝胶与所述一种或多种盐晶体可溶于其中的溶剂接触，从而溶解盐晶体；
从而形成三维水凝胶网络。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述混合物位于基底表面上。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述混合物包含总浓度为500mM～1000mM的至少两种类型的单价金属离子。
4.根据权利要求3所述的方法，
其中所述混合物包含：
浓度为200mM或更高的钠离子，和
浓度为150mM或更高的钾离子。
5.根据权利要求4所述的方法，其中：
钠离子的浓度为300mM～400mM；和
钾离子的浓度为200mM～350mM。
6.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括在步骤(a)之前形成混合物。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述混合物通过将包含单价金属阳离子的盐水溶液与一种或多种溶液混合来形成，其中
所述一种或多种溶液包含：水溶性聚合物链和交联剂部分；或
所述一种或多种溶液包含：水溶性聚合物链、交联剂部分及探针分子。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述盐水溶液的pH为6～9。
9.根据权利要求7所述的方法，其中所述盐水溶液通过包括将磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾和磷酸二氢钾溶解在水中的方法制备。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述水溶性聚合物链包含甲基丙烯酸酯基团和每分子至少两个交联剂部分。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述交联剂部分为二苯甲酮部分。
12.根据权利要求10所述的方法，其中所述水溶性聚合物链由二甲基丙烯酰胺(DMAA)、甲基丙烯酰氧基二苯甲酮(MABP)和4-乙烯基苯磺酸钠(SSNa)聚合而成。
13.根据权利要求1～12中任一项所述的方法，其中步骤(a)的混合物包含探针分子。
14.根据权利要求13所述的方法，任选地其中所述探针分子是核酸分子。
15.一种三维水凝胶网络，其通过根据权利要求1～14中任一项所述的方法获得。
16.一种阵列，其包含多个根据权利要求15所述的三维水凝胶网络，其中所述三维水凝胶网络被固定在基底上。
17.根据权利要求16所述的阵列，其中所述阵列可以重复使用至少10次。
18.一种用于制造阵列的方法，包括通过根据权利要求1～14中任一项所述的方法在同一基底的表面上的离散点处产生多个三维水凝胶网络，和在步骤(b)的过程中将所述网络交联至所述基底。
19.一种确定样品中是否存在分析物的方法，包括：
(a)使所述样品与权利要求15所述的三维水凝胶网络或权利要求16所述的阵列接触，所述网络或阵列包含能够与分析物结合的探针分子；和
(b)检测分析物与三维水凝胶网络或阵列中的探针分子的结合，从而确定样品中是否存在分析物。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述网络或阵列在步骤(a)之前已被使用和洗涤至少10次，或者其进一步包括在步骤(b)之后重复使用所述网络或阵列至少10次。
21.根据权利要求20所述的方法，其进一步包括定量分析物与三维水凝胶网络中的探针分子的结合。
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