TWI794607B - 蘭花芽胚複合微晶囊體組合物、其製作方法及用於促進細胞排毒、能量活化與抗老化的用途 - Google Patents

Abstract

本發明之蘭花芽胚複合微晶囊體組合物，包含：形成為殼狀結構的載體；及鑲嵌於殼狀結構或為其包覆的蘭花芽胚萃取物，蘭花芽胚萃取物的製備方法包含：自蘭花頂芽或側芽擷取生長點芽胚組織；去除生長點芽胚組織的壁膜；低溫研磨生長點芽胚組織成粉末；將粉末以水或乙醇覆蓋浸泡以得到混合液；於低溫下利用超音波振盪萃取設備以總能量300至600W對混合液震盪；對混合液離心以取得上清液；以及去除上清液的溶劑。本發明之組合物可避免蘭花芽胚萃取物變質，以提供穩定功效。此外，本發明之組合物可促進細胞排毒、能量活化、抗醣化與抗老化。

Description

蘭花芽胚複合微晶囊體組合物、其製作方法及用於促進細胞排毒、能量活化與抗老化的用途

本發明關於一種微晶囊體組合物，且特別攸關一種蘭花芽胚複合微晶囊體組合物。此外，本發明尚有關上述組合物的製作方法與其用於促進細胞排毒、能量活化與抗老化的用途。

我國素有「蘭花王國」美譽，擁有成熟的種植與組織培養技術，其包括繁多且豐富的品種、純熟的組織培養技巧、病毒檢驗能力、與大規模量產的工程技術等。而且，我國農業目前擁有推動蘭花產業的優勢條件，包括得天獨厚的天然地理條件、傲視全球的多元化品種、技術頂尖的育種專家群、超水準的農業科技基礎、遍佈全國的農業試驗改良及學研等各類農業技術輔助機構、及聞名世界的資訊產業與現代化的物流通路等。

於我國，蝴蝶蘭年產量約1億3,294萬株，年外銷總量約4千萬株，佔全球供應量20％，銷售地區遍及歐美與日本，因此需應用精進的生物科技大量繁殖以滿足供貨需求。蘭花的培育繁殖方法，常見的有：播種繁殖法、花梗催芽繁殖法、斷心催芽繁殖法、切莖繁殖法、與組織培養法等五種，可按照品種特性及需求選用適當的繁殖方法。「組織培養法」多擷取具分生能力的頂芽部位進行培養；而莖頂生長點部位的生產多採用芽體增殖（芽長芽）或誘導擬原球體分生苗方式，芽體增殖可減低頂芽優勢，使側芽易於長出，並以此方式增殖芽體。

蘭花除了用於觀賞外，近年來亦廣泛用於作為化妝品或保養品等產品的原料，使得蘭花的經濟價值大幅提升，且蘭花的需求量更大。蘭花須經萃取成為萃取物後，再製作成化妝品或保養品。因蘭花的萃取部位不同，則須搭配適當的萃取技術，萃取流程如有變化，所萃取的成份亦會不同，可達到的美白效果、抗氧化、或抗老化效果亦會受到影響。

由於人類皮膚經常受到紫外線、空氣、或溫度等外在環境影響，有加速皮膚老化或罹患皮膚癌的風險。以皮膚老化為例，外因性因素占60％，而其中紫外線又占高達60％。於影響皮膚老化的研究發現，紫外線不只會造成黑色素細胞活躍，導致皮膚呈現斑點，亦會使真皮組織退化，並加速皮膚氧化，產生游離自由基，而這些自由基會破壞纖維母細胞、導致膠原蛋白變性或減少其含量、或造成彈性纖維組織退化並產生老化皺紋，更會加速細胞內DNA傷害，以降低皮膚細胞的更新能力與新細胞取代舊細胞的速度變慢。

目前多針對上述種種的皮膚問題，開發不同的化妝品原料，再配合添加其他具特殊效果的添加物，添加物的活性成份如：花青素、類黃酮、或多酚類等，對於皮膚美白、抗氧化、抗老化、或防皺等功效相當顯著，故市面上許多化妝或保養商品常見有各種植物萃取活性成份添加於其中。基於不同的植物種類、不同部位、或所萃取成份要求與功效不同，須採用的萃取技術皆不同。以蘭花為例，同樣作為化妝品或保養品的添加物，其萃取技術有許多不同方式，且萃取步驟、流程與環境參數亦有差異。

中國發明專利申請號第201510295194.7號揭露「蘭花萃取物及其製備方法和應用」，特徵在於：所述蘭花為蝴蝶蘭屬，所述蘭花萃取物由以下步驟製備而得：（1）萃取：將所述蘭花與溶劑以重量比例為0.5：1至10：1混合粉碎或破壁取得蘭花漿，溶劑為水、醇類、或醇類水溶液，而醇類為乙醇、丙醇、或丁醇；（2）固液分離：將所述蘭花漿進行固液分離，留下液態的蘭花濾液；（3）活性劃分：將所分離的蘭花濾液以分子篩純化，得到蘭花萃取篩分液；（4）濃縮：將所純化的蘭花萃取篩分液以分子篩處理濃縮，或以真空或蒸煮方式進行濃縮，得到活性沉澱物或具活性的活性萃取液。

中國發明專利公開號第CN105878122A號揭露「具祛斑美白效果的天然提取物化妝品」，其包括功效成份澤蘭提取物與石吊蘭提取物，所述澤蘭提取物與石吊蘭提取物的重量比為2至4：1。而提取物的製備方法為：將乾燥的澤蘭或石吊蘭用乙醇熱回流提取，並合併濾液濃縮至無醇味得到乙醇提取濃縮液；再用水稀釋後，依次用石油醚、乙酸乙酯、與水飽和的正丁醇萃取；用水溶解正丁醇萃取物並過濾，濾液用大孔樹脂聚集活性成份，噴霧乾燥即得。此專利所提的祛斑美白化妝品以植物提取物為功效成份，且通過控制澤蘭提取物和石吊蘭提取物的含量比來最大化去斑美白效果。

台灣發明專利申請號102140137揭露「白花蝴蝶蘭花瓣的萃取物及其製備方法與用途」，其藉由以下列步驟製得：以超臨界二氧化碳萃取白花蝴蝶蘭花瓣，藉此而得到白花蝴蝶蘭花瓣的脂溶性萃取物與殘餘物；以及以水萃取殘餘物，以得到白花蝴蝶蘭花瓣的水溶性萃取物，可用於促進皮膚美白、提升皮膚保濕能力、與預防或延緩皮膚老化。

上述第一案以整株蘭花進行萃取、固液分離、活性劃分、及濃縮等流程；第二案則以整株澤蘭或石吊蘭進行乾燥、熱回流提取、濃縮、稀釋、溶解、與過濾等步驟；第三案即利用白花蝴蝶蘭的花瓣進行超臨界二氧化碳萃取與以水萃取。然而，上述前案所採用的蘭花部位不同，第一、二案以整株進行，第三案則僅用花瓣，且因萃取方法、流程、使用設備、或環境相關參數均不同，所取得的萃取成份與含量亦會不同。

無論以整株蘭花或花瓣進行萃取，所萃取的活性成份含量與效果仍受限制。中國發明專利公開號第CN105878122A號與台灣發明專利申請號102140137揭露高溫進行步驟，恐破壞活性成份的化學結構或造成其他可能有活性的物質揮發，以致後續製成之化妝品或保養品的美白、抗氧化、或抗老化效果受到影響。再者，以往利用整株蘭花進行萃取，使得蘭花所有部位無論是否提升活性或抑制活性的成份均可能萃取取得，故所取得的萃取物整體活性品質將受限制。

植物莖節部位通常具有生長點以提供優異的生長機能，生長點細胞可快速分裂與分化以產生新芽，並可使芽軸不斷伸長，猶如動物的幹細胞再生功能，如能擷取植物莖節生長點細胞進行萃取，所取得的活性成份含量與效益亦可能相當高。然而，習知蘭花相關的萃取技術未有針對莖節部位進行萃取；故本案發明人提供一種蘭花生長點萃取技術，以獲得活性成份含量高且生物效果佳的蘭花芽胚萃取物。

於是，本發明之一目的在於提供一種蘭花芽胚組織的萃取產物，主要擷取並收集蘭花具有高活性成份的芽胚再生細胞進行萃取作業，所製成之萃取物的活性成分含量高，而具有促進細胞排毒、能量活化、抗醣化、抗老化、抗氧化、美白、促進ATP生成、維持端粒作用、及保護修復受UVB造成之光傷害的功效，並可添加於化妝品或保養品中。

本發明之再一目的在於提供一種蘭花芽胚組織的萃取產物，其萃取過程於非高溫下操作，以減少溫度所造成的熱損失，亦可避免低沸點與有效物質揮發及保有生長點組織的生長活性成分。

本發明之再一目的在於提供一種含蘭花芽胚組織之萃取產物的複合微晶囊體，其可保護蘭花芽胚組織的萃取產物，使蘭花芽胚組織之萃取產物不變質且保有長時間安定性進而維持生物活性。

本發明之又一目的在於提供一種含蘭花芽胚組織之萃取產物的複合微晶囊體，其具有高經皮穿透能力以有效地輸送蘭花芽胚組織的萃取產物至皮內。

是以，本發明提出一種蘭花芽胚複合微晶囊體組合物，係包括：一載體，為形成為一殼狀結構；以及一蘭花芽胚萃取物，為鑲嵌於殼狀結構或為殼狀結構包覆，而蘭花芽胚萃取物的製備方法包含以下步驟：自一蘭花的頂芽或側芽擷取一生長點芽胚組織；去除生長點芽胚組織的壁膜；低溫研磨生長點芽胚組織成粉末；將粉末以水或乙醇覆蓋浸泡以得到一混合液；於低溫下利用一超音波振盪萃取設備以總能量300至600W對混合液震盪；對混合液離心以取得一上清液；以及去除上清液的溶劑以取得蘭花芽胚萃取物。

本發明之微晶囊體組合物中的蘭花芽胚萃取物為於非高溫流程下進行製備的，可避免低沸點與有效物質揮發及保持芽胚組織的生長活性，且所製成之萃取物的總多酚及總黃酮含量高，添加於化妝品或保養品產品中，具有促進細胞排毒、能量活化、抗醣化、抗老化、抗氧化、美白、促進ATP生成、維持端粒作用、及保護修復受UVB造成之光傷害的功效。然而，本發明透過載體形成的殼狀結構保護蘭花芽胚萃取物，而可提供蘭花芽胚萃取物長時間安定性不變質，進而無損於促進細胞排毒、能量活化、抗醣化、抗老化、抗氧化、美白、促進ATP生成、維持端粒作用、及保護修復受UVB造成之光傷害的功效。如此一來，本發明的微晶囊體組合物可製作成促進皮膚細胞排毒與皮膚細胞能量活化、抗醣化、抗老化、抗氧化、美白、促進ATP生成、維持端粒作用、及保護修復受UVB造成之光傷害的組合物，而組合物型態可為醫藥品、化妝品、保養品、香氛或人體清潔用品，但不限於此。

為讓本發明上述及/或其他目的、功效、特徵更明顯易懂，下文特舉較佳實施方式，作詳細說明如下：

本發明之一實施方式提出一種蘭花芽胚複合微晶囊體組合物，而其包含：一載體以及一蘭花芽胚萃取物。

載體為形成為一殼狀結構，而其實例可為氫化大豆卵磷脂或d-α-生育酚基聚乙二醇1000琥珀酸酯，但不以此為限。於一較佳例中，載體包含氫化大豆卵磷脂以及d-α-生育酚基聚乙二醇1000琥珀酸酯，且以載體總重量計，氫化大豆卵磷脂的重量百分比為50至99%，而d-α-生育酚基聚乙二醇1000琥珀酸酯的重量百分比為1至50%。

蘭花芽胚萃取物為鑲嵌於殼狀結構或為殼狀結構包覆。於一較佳例中，以複合微晶囊體組合物總重量計，蘭花芽胚萃取物的重量百分比為2%至10%。於另一較佳例中，以複合微晶囊體組合物的總體積計，蘭花芽胚萃取物與載體的體積莫耳濃度合計為0.1至20mM。而蘭花芽胚萃取物的製備方法詳如下文所述：

首先，自一蘭花的頂芽或側芽擷取一生長點芽胚組織，而蘭花的實例為蝴蝶蘭，但不以此為限。

其次，去除生長點芽胚組織的壁膜。於一較佳例中，將生長點芽胚組織以液態氮急速冷凍以去除壁膜。

然後，低溫研磨生長點芽胚組織成粉末。於一較佳例中，先將去除壁膜的生長點芽胚組織切成塊，再加入液態氮使組織塊凝固，最後將組織塊研磨成粉末。為避免研磨工具或研磨過程產生的溫度影響後續所得之活性成分，可將研磨工具（如：組織研磨缽與組織研磨器）預置於-80℃中冷卻。

繼之，將粉末以水或乙醇覆蓋浸泡以得到一混合液。於一較佳例中，粉末與水或乙醇的重量比為1：1至1：10，較佳地為1：5。

然後，於低溫下利用一超音波振盪萃取設備以總能量300至600W對混合液震盪。此步驟透過震盪使水或乙醇自生長點芽胚組織萃取出有效成份至溶劑內。於一較佳例中，震盪時間為60分鐘。於另一較佳例中，每震盪3分鐘，休息2分鐘，直到總震盪時間達60分鐘（共震盪20次）。於又一較佳例中，震盪溫度為50至60℃。

最後，對混合液離心以取得一上清液，並去除上清液的溶劑以取得蘭花芽胚萃取物。於一較佳例中，於4℃下以15,000rpm轉速對混合液離心15分鐘以取得上清液。於另一較佳例中，對上清液抽真空過濾以製成萃取液後，利用減壓濃縮機與冷凍乾燥機將萃取液的溶劑去除，以取得蘭花芽胚萃取物。

此外，本發明之另一實施方式提出一種蘭花芽胚複合微晶囊體組合物的製備方法，詳如下文所述：

於根據上文取得蘭花芽胚萃取物後，使蘭花芽胚萃取物與載體原料混合，使載體原料分散形成一膠體複合物。於一較佳例中，將載體原料溶解於一溶劑中，利用旋轉減壓濃縮儀去除溶劑以形成脂質薄膜，之後加入蘭花芽胚萃取物至脂質薄膜使脂質分散成膠體複合物。

接著，利用高功率超音波震盪器震盪膠體複合物，以獲得一蘭花芽胚複合微晶囊體組合物。於一較佳例中，震盪時間為30分鐘，震盪溫度為45℃。

茲以下述實施例，例示說明以上實施方式：

＜實施例1：製備蘭花芽胚萃取物及安定性試驗＞

從蘭花頂芽或側芽，擷取生長點芽胚組織。其次，採用「急速液態氮冷凍超音波振盪法」，具體操作如下：將芽胚組織以液態氮急速冷凍去除壁膜，另將組織研磨缽與組織研磨器預置於-80℃中使其冷卻；之後，利用刀械將去除壁膜的組織切成塊放入研磨缽中，並加入少許液態氮使組織塊凝固，再將其研磨成粉末；然後，將組織粉末置入超音波振盪萃取設備，並以純水或乙醇將組織粉末覆蓋浸泡；接著，於低溫下以總能量300至600W對溶劑與粉末組成的混合液震盪60分鐘（震盪3分鐘，休息2分鐘，直到震盪時間達60分鐘）；於4℃下以15,000rpm轉速離心15分鐘後，收集上清液並抽真空過濾以製成萃取液。最後，利用減壓濃縮機（Rotary evaporator R-2000）與冷凍乾燥機（Eco nomic freeze dryer CT5020D）將萃取液的溶劑去除，以取得蘭花芽胚萃取物（下文可與符號「OG」交換使用）。

為瞭解蘭花芽胚萃取物安定性，將其分別置於25℃或50℃下7天後觀察外觀並以色差計（MET-CM6）測定色澤Lab值。

如圖1與表1所示，OG置於25℃7天後外觀與色澤Lab值均無明顯變化；反觀，置於50℃、7天後外觀變深，且L值自22.3減為20.1，a值自3.4增為4.7，b值自3.4變為4.2。 表1、OG於不同環境溫度下置於不同天數後的外觀變化

色澤Lab值	天數	環境溫度25℃	環境溫度50℃
L值	0	22.2	22.3
7	22.0	20.1
a值	0	3.2	3.4
7	4.0	4.7
b值	0	3.5	3.4
7	3.7	4.2

DPPH·（2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl）為穩定自由基，利用紫色的DPPH乙醇溶液於波長517nm照射下產生特定吸光值。若DPPH·自由基與樣品反應，吸光值則會降低；故，可由吸光值的變化瞭解樣品清除DPPH·自由基的能力。具體而言，吸光值越低，表示樣品清除DPPH·自由基的能力越強。

於此，於OG置於50℃前與7天後分別配置成不同濃度，並分別加入90μL新鮮配置的100μM DPPH·乙醇溶液於96孔盤中反應。接著，以酵素免疫分析儀檢測反應液的517nm吸光值。

如圖2所示，OG於置於50℃前的自由基清除能力為82.3%；經置於50℃7天後自由基清除能力為73.7%。

＜實施例2：製備蘭花芽胚複合微晶囊體組合物及相關試驗＞

d-α-生育酚基聚乙二醇1000琥珀酸酯（d-alpha tocopheryl polyethylene glycol 1000 succinate，TPGS）為維生素E衍生物，為安全的且與有效活性成分之間具有優異的口服生物相容性。目前應用TPGS於微脂粒的藥物傳遞系統以增加微脂粒穩定性。過往研究以TPGS形成微胞作為抗癌藥物載體。過往研究亦有添加TPGS於高分子載體中作為抗癌藥物控制釋放的載體（Cao & Feng，2008）。因此，TPGS對於本實施例的微晶囊體組合物而言為優異的功效性輔劑，且本身亦具有抗老化及抗氧化活性。

具體而言，本實施例以氫化大豆卵磷脂（hydrogenated soybean lecithin，HL）與d-α-生育酚基聚乙二醇1000琥珀酸酯製備蘭花芽胚複合微晶囊體組合物，詳細過程如下：依實驗設計比例將HL與TPGS添加至溶劑中溶解（以HL與TPGS總體計，HL重量百分比為50至99%，TPGS則為1至50%），並利用旋轉減壓濃縮儀去除溶劑，以於燒瓶壁上形成脂質薄膜；之後，加入OG與薄膜進行交互作用，使脂質分散而形成膠體複合物；最後，於45℃下利用高功率超音波震盪器震盪膠體複合物30分鐘，即獲得蘭花芽胚複合微晶囊體組合物（下文可與符號「OG-L」交換使用）且其體積莫耳濃度為0.1至20mM。

藉由穿透式電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）觀察OG-L的粒子結構型態，觀察前利用微脂粒分散液滴附OG-L於聚乙烯醇縮甲醛支撐膜（formvar film）上的鍍碳銅網上，並靜置2分鐘使樣品粒子嵌於銅網上，再利用拭淨紙擦拭去除多餘的樣品；再滴加0.5wt%醋酸雙氧鈾於銅網上進行樣品染色，並靜置2分鐘利用拭淨擦拭去除多餘染劑，並存放於乾燥箱12小時後，再利用穿透式電子顯微鏡觀察OG-L的形態結構。

如圖3所示，OG-L形成粒徑介於50至400nm的膠體粒子複合物。

使用動態光散射粒徑及界面電位元分析儀（Dynamic Light Scattering，DLS，型號Brookhaven 90 Plus Particle Size Analyzer，購自Brookhaven Inc.，U.S.A）量測OG-L粒徑與界面電位。分析結果為：OG-L的平均粒徑（average particle size，A.P.S.）為286.13±10.17nm，分佈係數（polydispersity index，Pd.I）為0.217±0.01，平均界面電位（average zeta potential，A.Z.P.）為-7.13±4.51mV，OG結合比例（combined percentage，C.P.）為94.31±3.76%（OG-L中的OG濃度比例）。

利用高效能液相層析儀（high performance liquid chromatography，HPLC）進行OG定量分析，使用的幫浦型號為L-7100，自動注射器型號為L-7200，紫外光偵測器（UV-vis）型號為L-4200，皆購自Hitachi（Japan），使用的管柱型號為Microsorb-MV 100-5 C18（250mm x 4.6mm i.d.，5μm顆粒尺寸）。

如圖4所示，說明著OG水溶液及OG-L水溶液中的OG活性成分濃度隨著時間而變化；可看出，OG-L中的OG相較於純OG於水中穩定且易儲存。換言之，OG-L可改善OG於水中活性不穩定的問題。

＜實施例3：皮膚細胞自噬作用試驗＞

細胞自噬作用為將老化的胞器或蛋白質聚集體包覆並送至溶體分解為小分子。細胞如無法對抗氧化壓力造成的傷害時，便會呈現老化狀態。

將人類皮膚角質株化細胞HaCaT依密度1.5x10⁵ cell/mL培養於96孔盤，並於37℃與5%二氧化碳培養箱中生長24小時以上。之後，添加OG-L反應，並於達反應時間後，移除上清液並以PBS清洗。接著，經過20mJ/cm² UVB照射後，加入含0.1mM過氧化氫的新鮮培養液作用1小時。然後，加入autophagosome detection reagent working solution並置於培養箱反應15分鐘至1小時後，使用wash buffer清洗細胞3至4次。最後，加入定量PBS，並以激發光360nm與發射光520nm測吸光值（BioTek，Synergy^TM 2，USA）。

如圖5所示，僅於氧化誘導劑（UVB與過氧化氫）作用下，可誘導人類皮膚角質株化細胞HaCaT的自噬作用，但於氧化誘導劑搭配OG-L作用下則可提升自噬作用能力，以增加細胞抗氧化壓力的能力與提升細胞排毒能力。綜上所述，OG-L可促進皮膚細胞的自噬作用以對抗氧化壓力。

＜實施例4：細胞活性氧化物含量試驗＞

為評估OG-L是否降低過氧化氫誘導皮膚細胞所產生的ROS活性氧化物，以螢光標記DCFH2DA（2’,7’-dichlorofluorescin diacetate）定量分析活性氧化物含量，詳細過程如下：

將人類皮膚角質株化細胞HaCaT依密度1.5x10⁵ cell/mL培養於96孔盤中，並於37℃與5%二氧化碳培養箱中生長24小時以上。之後，添加OG-L反應，並於達反應時間後，移除上清液並以PBS清洗。接著，先加入含0.1mM過氧化氫的新鮮培養液作用1小時，再移除培養液，後加入含10μM DCFH2DA的新鮮培養液於避光下作用一小時後，再移除培養液。最後，加入定量PBS，並以激發光502nm與發射光524nm測吸光值（BioTek，Synergy^TM 2，USA）。

如圖6所示，未經過氧化氫作用下，細胞ROS活性氧化物含量設定為基準100.0±3.1%；而僅受過氧化氫作用下，細胞ROS活性氧化物的相對含量為121.0±6.1%；而受過氧化氫搭配OG-L作用下，細胞ROS活性氧化物的相對含量為113.0±4.2%。這表示說，OG-L可保護細胞免受到66.3%氧化傷害的功效。綜上所述，細胞經OG-L作用後能降低經過氧化氫氧化誘導劑誘發的氧化傷害，進而保護細胞免受氧化壓力造成的傷害。

＜實施例5：三磷酸腺苷活化試驗＞

ATP為核苷酸的一種，作為細胞能量傳遞的「分子通貨」，儲存與傳遞化學能，因此ATP是生命活動能量的直接來源，人體所需的能量幾乎來自ATP，例如：心臟跳動、肌肉運動、及不同細胞執行不同生物功能。反之，缺乏ATP人體各器官組織便相繼罷工，而出現心臟衰竭、肌肉酸痛、或容易疲勞等生理現象。

人類皮膚角質株化細胞HaCaT依密度1.5x10⁵ cell/mL培養於24孔盤，並於37℃與5%二氧化碳培養箱中生長24小時以上。之後，加入OG-L作用24小時後，置入培養箱再作用24小時。達反應時間後，先移除培養液及樣品，再加入PBS清洗，後換上新的培養液。接著，加入lysis buffer作用30分鐘後，以1,500rpm離心2分鐘，之後取50μL上清液至白色96孔盤，並使用ATP determination kit（Molecular Probes，Eugene，OR，USA）測定吸光值（BioTek，Synergy^T M2，USA），評估細胞內ATP含量（μmol/g-cell）。

如圖7所示，經過OG-L作用後，細胞ATP含量高於未加入OG-L的細胞（控制組）。

＜實施例6：抗醣化試驗＞

衰老為人體不可逆的現象，當細胞分裂多代後可能受外界過度刺激而導致生長停滯進而衰老。Senescence-associated β-galactosidase（SA-β-gal）會於衰老細胞中會過度表達，而可作為細胞衰老的指標之一。

將人類皮膚角質株化細胞HaCaT依密度1.5x10⁵ cell/mL培養於24孔盤，並經24小時細胞貼附後，移除培養液。加入OG-L預處理24小時後，先使用50mJ/cm² UVB照射細胞，再加入不含血清的培養液培養24小時。達反應時間後，用senescence β-galactosidase staining kit（Cell Signaling Technology，Danvers，MA，USA）染色，之後利用顯微鏡觀察並計數藍色的老化細胞。

如圖8所示，顯示經UVB照射後，細胞的β-galactosidase大幅增加；而經UVB照射與OG-L作用後，細胞能降低UVB造成的β-galactosidase活化。此外，正控制組25μg/mL維他命C可有效抑制β-galactosidase活性，特別是UVB造成的β-galactosidase活化。

＜實施例7：長壽基因SIRT-1表現試驗＞

衰老雖然為人體不可逆的現象，但部分基因的活化可維持細胞機能，促進個體健康，而這些基因稱為「長壽基因」，SIRT-1為典型代表例之一。以往的研究證實，向上調節SIRT-1的表現可有效保護細胞修護並維持正常功能，免於細胞走向衰老而引起疾病。

利用反轉錄聚合酶連鎖反應（reverse transcription-PCR，RT-PCR）進行試驗，分析OG-L調控長壽基因SIRT-1的表現。

將人類皮膚角質株化細胞HaCaT依密度1.5x10⁵ cell/mL培養於24孔盤，並經24小時細胞貼附後，移除培養液。接著，加入OG-L預處理24小時，再使用50mJ/cm² UVB照射細胞，後加入不含血清的培養液再培養24小時。之後，移除培養液後，以Trypsin取下細胞，並以PBS收集細胞並離心移除上清液。然後，加入1mL REzol^TM C&T並於室溫均勻混合5分鐘溶解細胞。加入200μL氯仿均勻混合15秒後，置於4℃反應5分鐘萃取出RNA。然後，於4℃下以轉速12,000rpm離心10分鐘後，取上層透明層至浸泡過DEPC水並滅菌過的微量離心管中。之後， 加入等體積的異丙醇混合均勻並於4℃靜置5分鐘使RNA沉澱。再於4°C下以轉速12,000rpm離心10分鐘並去除上清液。加入200μL 75%冰酒精清洗RNA後，於4°C下以轉速12,000rpm離心10分鐘，並去除上清液。最後，於無菌操作臺中倒置陰乾，使離心管中剩餘的水氣完全揮發，並加入100μL 0.1%DEPC水分散溶解RNA，並儲存於-80℃。此外，取2μL RNA至198μL 0.1%DEPC水中後，混合均勻取100μL於微量石英管中，以分光光度計測OD260nm與OD280nm的吸光值（BioTek，Synergy^TM 2，USA）。

取3μg RNA與適量DEPC水混合後，加入1μL Oligo(dT)₁₈ primer置於70℃作用2分鐘並迅速移至冰上。接著，分別加入4μL 10x MMLV RT buffer solution、1μL dNTP mixture（每種dNTP 10mM）、0.5μL recombinant RNase inhibitor（1　unit/ml）、1μL MMLV reverse transcriptase（5　unit），使總體積為20μL。將混合液均勻混合後，於42℃下作用1小時，再於94℃加熱5分鐘，去除MMLV reverse transcriptase活性終止反應，完成cDNA模板製備。最後，加入80μL DEPC水，並保存於-20℃備用。

取1μL cDNA至微量離心管中，並加入5μL 10x reaction buffer、0.8 μL 10mM dNTP（每種dNTP 200mM）與各1μL的50mM正向引子（5’- tcgcaactatacccagaacatagaca-3’）與反向引子（5’-ctgttgcaaaggaaccatgaca-3’）、Taq DNA polymerase（5　unit/μL），最後加入去離子水使總體積達50μL。混合均勻後，置於自動溫度循環機（Techne Progene）進行PCR反應，反應條件如下：變性反應（denaturation），98℃，3分鐘；接著，包含變性反應，94℃、黏合反應，60℃、合成反應，72，且各1分鐘的聚合酶鏈反應，聚合酶鏈反應共進行35個循環。反應完畢後，取適量反應產物進行2%瓊脂凝膠電泳分析參照基因（β-actin）和目標基因。此外，利用影像軟體（Image J）進行定量。

如圖9所示，未經過UVB傷害下，SIRT-1表現量定為1.0（控制組），而經UVB照射後，其表現量明顯降低至0.2。另外經UVB照射與OG-L作用後，則可明顯提升SIRT-1的表現量至0.6，表示OG-L可有效調控保護皮膚細胞免於UV對長壽基因SIRT-1的傷害。

＜實施例8：細胞回春基因mTOR與端粒酶調控基因TERT表現試驗＞

mTOR是一種絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，為造成老化與癌化的重要因子，其會促進細胞吸收熱量、關閉自噬機制進而阻止細胞更新，故近年來有針對抑制mTOR表現相關研究指出透過抑制老化細胞中mTOR的表現可使細胞新生。

端粒作用為維持真核生物染色體完整性與控制細胞分裂週期，並於細胞分裂後，端粒會穩定所複製的DNA，確保遺傳序列完整性。然而，細胞每次分裂後，端粒便會縮短；當端粒消耗殆盡時，細胞便啟動凋亡，故視端粒為老化的最佳標記。端粒酶可補充端粒，延長細胞分裂次數，減緩老化速度。TOP1與TPP1為端粒保護蛋白，促進其表現可提升對端粒體的保護。

於此，利用即時定量PCR（qPCR）進行試驗，分析OG-L調控回春基因mTOR與端粒酶調控基因TERT相關基因的表現。

將人類皮膚角質株化細胞HaCaT依密度1.5x10⁵ cell/mL培養於6孔盤，並經24小時培養後，加入OG-L混合無血清培養液作用72小時。之後，移除培養液後，以Trypsin取下細胞，並以PBS收集細胞並離心移除上清液。然後，加入1mL REzol^TM C&T並於室溫均勻混合5分鐘溶解細胞。加入200μL氯仿均勻混合15秒後，置於4℃反應5分鐘萃取出RNA。然後，於4℃下以轉速12,000rpm離心10分鐘後，取上層透明層至浸泡過DEPC水並滅菌過的微量離心管中。之後，加入等體積的異丙醇混合均勻並於4℃靜置5分鐘使RNA沉澱。再於4°C下以轉速12,000rpm離心10分鐘並去除上清液。加入200μL 75%冰酒精清洗RNA後，於4°C下以轉速12,000rpm離心10分鐘，並去除上清液。最後，於無菌操作臺中倒置陰乾，使離心管中剩餘的水氣完全揮發，並加入100μL 0.1% DEPC水分散溶解RNA，並儲存於-80℃。此外，取2μL RNA至198μL 0.1% DEPC水中後，混合均勻取100μL於微量石英管中，以分光光度計測OD260nm與OD280nm的吸光值（BioTek，Synergy^TM 2，USA）。

取3μg RNA與適量DEPC水混合後，加入1μL Oligo(dT)₁₈ primer置於70℃作用2分鐘並迅速移至冰上。接著，分別加入4μL 10x MMLV RT buffer solution、1μL dNTP mixture（每種dNTP 10mM）、0.5μL recombinant RNase inhibitor（1　unit/mL）、1μL MMLV reverse transcriptase（5 unit），使總體積為20μL。將混合液均勻混合後，於42℃下作用1小時，再於94℃加熱5分鐘，去除MMLV reverse transcriptase活性終止反應，完成cDNA模板製備。最後，加入80μL DEPC水，並保存於-20℃備用。

取10μL cDNA至微量離心管中，並加入OmicsGreen 5x qPCR masterMix (ROX)（Omics Bio）及各5μL的50mM正向引子與反向引子均勻混合進行qPCR分析。置於qPCR機器（MyGo Pro）進行即時定量PCR反應，反應條件如下：變性反應（denaturation），98℃，3分鐘；繼之，包含變性反應94℃、黏合反應（annealing），60℃、合成反應（extension），72℃各1分鐘的聚合酶鏈反應，聚合酶鏈反應共進行25至35個循環。數據使用2^-ΔΔCt 表達來計算基因的相對表現量值。

如圖10所示，OG-L會向下調節mTOR基因表現而向上調節TOP1及TPP1等端粒保護蛋白的基因表現，表示OG-L具有抗老化的潛力。

惟以上所述者，僅為本發明之較佳實施例，但不能以此限定本發明實施之範圍；故，凡依本發明申請專利範圍及發明說明書內容所作之簡單的等效改變與修飾，皆仍屬本發明專利涵蓋之範圍內。

無

圖1為一照片圖，以說明著蘭花芽胚萃取物於不同環境溫度下置放不同天數後的外觀變化。 圖2為一自由基清除實驗統計圖，以說明著蘭花芽胚萃取物於不同環境溫度下置放不同天數後的相對自由基清除活性。 圖3為一穿透式電子顯微鏡照片圖，以說明著蘭花芽胚複合微晶囊體組合物的外觀。 圖4為一高效能液相層析統計圖，以說明著蘭花芽胚萃取物與蘭花芽胚複合微晶囊體組合物之蘭花芽胚萃取物於水中的穩定度。 圖5為一自噬實驗結果圖，以說明著蘭花芽胚複合微晶囊體組合物對皮膚細胞的自噬作用。 圖6為一ROS活性氧化物實驗結果圖，以說明著蘭花芽胚複合微晶囊體組合物對皮膚細胞ROS活性氧化物誘發的抑制。 圖7為一ATP含量實驗結果圖，以說明著蘭花芽胚複合微晶囊體組合物對皮膚細胞ATP含量的促進。 圖8為一SA-β-gal實驗結果圖，以說明著蘭花芽胚複合微晶囊體組合物對皮膚細胞衰老的延緩。 圖9為一PCR電泳照片圖，以說明著蘭花芽胚複合微晶囊體組合物對SIRT-1基因表現的影響。 圖10為一qPCR實驗結果圖，以說明著蘭花芽胚複合微晶囊體組合物對mTOR、TOP1、與TPP1等基因表現的影響。

Claims (1)

1. 一種蘭花芽胚複合微晶囊體組合物的用途，係用於製備保護修復皮膚細胞受UVB造成之光傷害的組合物，其中該保護修復皮膚細胞受UVB造成的光傷害係透過促進該皮膚細胞受UVB造成的自噬作用、抑制該皮膚細胞受UVB造成的β-galactosidase活化、促進該皮膚細胞受UVB造成的SIRT-1表現量；其中，該蘭花芽胚複合微晶囊體組合物，係包括：一載體，包含氫化大豆卵磷脂以及d-α-生育酚基聚乙二醇1000琥珀酸酯，並形成為一殼狀結構；以及一蘭花芽胚萃取物，為鑲嵌於該殼狀結構或為該殼狀結構包覆；其中，該蘭花芽胚萃取物的製備方法包含以下步驟：自一蘭花的頂芽或側芽擷取一生長點芽胚組織；去除該生長點芽胚組織的壁膜；低溫研磨該生長點芽胚組織成粉末；將該粉末以水覆蓋浸泡以得到一混合液；於低溫下利用一超音波振盪萃取設備以總能量300至600W對該混合液震盪；對該混合液離心以取得一上清液；以及去除該上清液的溶劑以取得該蘭花芽胚萃取物。

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