FR2951376A1 - Nouvelle utilisation d'un extrait de l'orchidee vanda coerulea - Google Patents

Abstract

L'invention concerne un extrait de l'orchidée Vanda coerulea comme agent actif cosmétique pour réguler le cycle cellulaire au niveau cutané, notamment pour lutter contre ou retarder l'apparition de signes visibles du vieillissement cutané, ou en ralentir les effets. L'invention concerne en particulier l'utilisation d'un tel extrait dans une composition cosmétique, ou dans une méthode de soin cosmétique, notamment anti-âge, pour retarder l'apparition des signes du vieillissement cutané, ou en ralentir les effets ; notamment pour maintenir la fermeté de la peau et des tissus ou rendre à la peau un teint plus éclatant ou bien encore combattre les désordres de pigmentation lié au vieillissement cutané.

Description

L'invention concerne un extrait de l'orchidée Vanda coerulea comme agent actif cosmétique pour réguler le cycle cellulaire au niveau cutané, notamment pour atténuer ou retarder l'apparition des signes du vieillissement cutané, ou en ralentir les effets. ,ÉTAT DE LA TECHNIQUE

Le vieillissement cutané se manifeste par de nombreux changements intrinsèques se traduisant par l'apparition progressive de 10 signes visibles qui modifient la beauté et la qualité visible de la peau. On sait qu'il existe aujourd'hui différentes manières de lutter contre le vieillissement cutané et qu'il est difficile d'agir sur plusieurs facteurs à la fois. C'est cependant ce que l'homme du métier souhaite réaliser. Des facteurs tels que la modification de la différentiation de l'épiderme, le 15 ralentissement de la prolifération cellulaire, la perte d'élasticité cutanée, le derme moins dense, la diminution de l'hydratation ou les désordres de pigmentation, conduisent avec l'âge à une peau plus fine, plus sèche, moins souple, plus rugueuse et moins lumineuse (Rocquet et al., Acta Dermato. venereol., Vol 2002, 11 (3), 71-93}. Le grain de peau est moins 20 fin, de nombreuses imperfections cutanées se développent et deviennent visibles. Il est donc particulièrement intéressant de combattre le vieillissement cellulaire très en amont de son processus. L'entrée en sénescence des cellules cutanées est particulièrement liée à des altérations et des dérèglements dans les 25 évènements biochimiques ou morphologiques intervenant au cours de ra prolifération cellulaire. Le cycle cellulaire; qui représente l'ensemble de ces évènen Sei a , c divi Ë riiicipalei"llerl'l cri quatre_ phases Scllematlsees st ÎOn la figure I Ces phases traduisent respectivement ia préparation des cellules à la réplication de l'ADN (phase G1 u première phase de croissance cellulaire) le contenu ceIliliaire en ADN den "icon_ e i_i ~t nu de . cG ulE s ais on( ott _ h .sr. G. t 1C 4~I I .' u l JOUVef il ëeI~ulai5 - la préparation des cellules à la mitose (phase G2 ou seconde phase de croissance cellulaire) : cette phase est caractérisée par une augmentation en ARN et en protéines. La cellule a dupliqué son matériel génétique initial et se prépare à la division par une initiation de modification chromatinienne. - la division cellulaire ou mitose (phase M), à l'issue de laquelle les cellules filles ont leurs propres teneurs en ARN et protéines. Les cellules au repos, dans un stade quiescent de non-division, sont dans une phase dite GO, qui correspond à la sortie du cycle cellulaire 10 et survient généralement au cours de la phase Gl. L'homme du métier comprend que ces étapes majeures ne correspondent évidemment pas à des processus aux frontières parfaitement délimitées : certaines synthèses protéiques se déroulent tout au long du cycle cellulaire. 15 Les cellules dites sénescentes sont bloquées en phase GO ou Gl du cycle cellulaire et ne se divisent plus. Elles deviennent incapables de rentrer en phase S et ne répondent plus à la stimulation par des agents mitogènes physiologiques (.'en« Mech. Age Dvpt, 2002, 123, 801-10). Cette baisse de l'activité cellulaire peut s'expliquer par la 20 répression sélective de gènes impliqués dans la progression de la phase G1 et dans la synthèse de l'ADN, ou à l'inverse par la surexpression d'inhibiteurs des cyclines, protéines qui régulent le cycle cellulaire. Cette accumulation de cellules sénescentes entraîne globalement un déclin progressif des fonctions et de l'intégrité du tissu cutané (Camp/:si 25 1996, Ce//,, 84, 497-50G). Les fibroblastes sénescents sécrètent par exemple davantage de métalloprotéinases et produisent moins de collagène ( Ion/us G., 1ech Age /-_),ot, 2002 72 < ,'ol-/O), ce qui conduit à l'altération d la 'T'Ot-ilCL ti2ctiaCtiluiaire

30 BUT DE L'INVENTION irlVe_ntIOli n DO Ur PLjt iXin0pai u iiou\, au L'invention a aussi pour but de résoudre le nouveau problème technique consistant en la fourniture d'un agent actif cosmétique destiné à réguler le cycle cellulaire cutané notamment pour lutter contre, ou retarder, l'apparition des signes du vieillissement cutané, ou en ralentir les effets.

La présente invention a encore pour but de fournir un agent actif cosmétique anti-âge visant à maintenir la fermeté de la peau et des tissus, à rendre le teint de la peau plus éclatant ou à combattre les désordres de pigmentation liés au vieillissement de la peau. La présente invention a également pour but de fournir une composition cosmétique et une méthode de soin cosmétique anti-âge. L'invention a enfin pour but de résoudre l'ensemble des problèmes techniques ci-dessus par une solution particulièrement simple, relativement peu coûteuse et utilisable à l'échelle industrielle.

RESUME DE L'INVENTION

Selon un premier aspect, l'invention concerne l'utilisation dans une composition cosmétique, d'un extrait de l'orchidée Vanda coerulea destiné à réguler le cycle cellulaire cutané, et notamment à augmenter le pourcentage de cellules cutanées en phase de réplication de l'information génétique ou à diminuer le pourcentage de cellules sénescentes parmi la population totale de cellules cutanées ou à améliorer l'activité biologique des cellules du tissus cutané altérée par le vieillissement ou comme agent actif cosmétique destiné à retarder l'apparition des signes du vieillissement cutané, ou à en ralentir tes effets, et notamment à maintenir la fermeté de la peau et des tissus ou à rendre un teint de peau plus éclatant, ou bien encore destiné à combattre les désordres pigmentation liés au vieillissement de -1 peau. Selon un deuxième aspect, invention concerne une méthode de soin cosmétique anti-âge visant notamment à maintenir la fermeté de la peau et des tissus ou à rendre un teint de peau plus éclatant ou pour combattre les ordres de pigmentation liés au vicilissement cutanet carecterisee en DESCRIPTION DE L'INVENTION

Les inventeurs ont démontré in vitro que dans une population de « jeunes » cellules cutanées ne s'étant que peu divisées, [e pourcentage de cellules actives, c'est-à-dire en phase de réplication de l'information génétique (phase S), est significativement plus élevé en proportion que dans une population de cellules « âgées » s'étant divisées un plus grand nombre de fois.

Ceci démontre l'influence négative du vieillissement cellulaire sur la capacité des cellules cutanées à se diviser et proliférer en vue de maintenir les propriétés mécaniques de la peau et son rôle de barrière efficace vis-à-vis de stress environnementaux. Faire diminuer la proportion relative de cellules sénescentes au profit de cellules se divisant activement parmi la population totale de cellules, a pour conséquence majeure de restaurer les fonctions et les mécanismes biologiques des cellules âgées à un niveau similaire à celui des cellules jeunes. Un agent actif cosmétique capable de redonner aux cellules cette aptitude à se diviser activement, qui permet de lutter contre les effets du vieillissement cutané très en amont, en assurant le maintien du potentiel biochimique de la machinerie cellulaire serait un agent actif anti-âge d'une particulière importance, avec un effet sur l'ensemble des fonctions biologiques des cellules sur lesquelles il agit.

Il a été à présent découvert de manière totalement inattendue que les extraits de l'orchidée Vanda coerulea présentent de telles propriétés. lne particularité intéressante de l'extrait de l'invention est de [imiter phenornune de sénescence cellulaire et de stimuler les mécanismes qui permettent de maintenir un nombre important cellules cutanées actives non sénescentes. La demande de brevet FR 0851 382 décrit 1 utilisation dans une »n.iincisitinn aosmeticiue dun extrait d', renies une rJarUe Par ailleurs, on connaît un extrait de la plante entière de Vanda coerulea, utilisé en tant qu'antioxydant dans des compositions cosmétiques. Cependant, là encore, le principe actif n'est pas décrit pour son effet anti-âge avec une action cellulaire très en amont du processus de vieillissement. Les inventeurs ont à présent découvert les propriétés d'un extrait de l'orchidée Vanda coerulea pour réguler les processus de sénescence et ses conséquences, en particulier vis-à vis de fibroblastes humains normaux (FHN) âgés.

Comme expliqué précédemment, le traitement de fibroblastes « âgés » par un extrait de Vanda coerulea permet d'augmenter le pourcentage de cellules en phase de réplication active de l'information génétique (phase S) à un niveau équivalent à celui de « jeunes » fibroblastes du derme.

L'extrait agit ainsi comme régulateur du cycle cellulaire, avec pour conséquence d'avoir plus de cellules en phase active de synthèse, ayant la capacité de se multiplier dans le tissu cutané pour donner des cellules filles. Cet effet important et surprenant de l'extrait de Vanda coerulea permet d'augmenter le potentiel d'activité biologique de l'ensemble des fibroblastes dermiques pour lutter efficacement contre un déclin des fonctions et de l'intégrité du tissu cutané et protéger l'environnement matriciel dans les tissus, ce qui est fondamental pour leur qualité. Un premier objet de la présente invention porte sur l'utilisation dans une composition cosmétique, d'un extrait de l'orchidée Vanda coerulea comme agent actif destiné à retarder l'apparition des signes du vieillissement cutané ou à en ralentir !es effets, notamment à maintenir la `el mets! de Id peau et des tissus ou à rendre un teint de peau plus éclatant. eu bien encore destiné a combattre les désordres pigmentation lies au vieillissement de la peau L'invention concerne selon Jn autre aspect l'utilisation dans une (jan (-aurs- cosmetique «O n xnait O ,()ro-loee vende soen Ilea somme cellules sénescentes parmi la population totale de cellules cutanées, ou bien encore à améliorer l'activité biologique des cellules cutanées altérées par le vieillissement. Le matériel végétal utilisé peut être la plante entière ou une partie de la plante telle que les feuilles, la tige, les fleurs ou les racines. L'extrait est préférentiellement obtenu à partir des tiges et/ou des racines et/ou des feuilles de l'orchidée, de préférence les tiges. L'extrait est préparé par différents procédés d'extraction connus de l'homme du métier.

Toutefois, l'extraction est de préférence réalisée par mise en contact du matériel végétal sélectionné avec un solvant polaire ou un mélange de solvants polaires. Préalablement à l'étape d'extraction elle-même, le matériel végétal peut avoir été séché et/ou broyé.

Selon une mise en oeuvre préférée de l'extraction, le matériel végétal se trouve à l'état sec et broyé. A titre de solvant polaire ou de mélange de solvants polaires, on choisit avantageusement un solvant ou un mélange de solvants choisi(s) parmi l'eau, un alcool en C1-C4, par exemple l'éthanol, un glycol en C2 à C6 choisi préférentiellement parmi le glycérol, le butylèneglycol et le propylèneglycol et l'un quelconque de leurs mélanges. Selon une mise en oeuvre préférée de l'invention, l'extraction est menée en utilisant un mélange hydroalcoolique, de préférence un mélange comprenant 90 %v/v d'eau et 10 % v/v d'éthanol.

Selon une autre variante de l'invention, l'extraction peut être réalisée par un procédé mettant en oeuvre un solvant polaire à l'état suberitique, ledit solvant étant avantageusement l'eau L'extraction peut aussi comprendre, façon optionnelle, au moins une étape supplémentaire de décoloration ou de purification de l'extrait, pouvant comprendre, par exemple, un traitement de l'extrait par une solution d'un solvant ou d'un mélange de solvants polaires, par mple LJc('' (70i/30 \, presence (le particules La décoloration peut aussi comprendre un traitement de l'extrait par un solvant apolaire, par exemple un alcane en C6-C7, ou bien encore par le CO2 à l'état supercritique. L'extraction peut être complétée par une étape d'élimination partielle ou totale des solvants d'extraction. Dans le premier cas, on concentre généralement l'extrait jusqu'à obtenir un concentré aqueux dépourvu d'une quantité significative de solvants organiques, dans Ce second cas on obtient un résidu sec. De façon alternative, le produit de l'étape d'extraction peut être, lyophilisé ou atomisé pour se présenter sous la forme d'une poudre. A titre d'agent actif dans la composition cosmétique selon l'invention, on utilise soit la poudre en l'état, soit une solution ou une suspension de ladite poudre dans un solvant ou un mélange de solvants cosmétiquement acceptables, qui peut être identique ou différent de celui ayant servi à l'extraction. La composition cosmétique comprend une quantité efficace d'extrait pour obtenir l'effet recherché. La composition comprend ainsi préférentiellement de 0,001% à 5% en poids sec d'extrait, de préférence de 0,1% à 2% en poids.

Les essais réalisés par les inventeurs ont montré que les propriétés de l'extrait peuvent être également obtenues ou améliorées dans des compositions cosmétiques, dans lesquelles l'extrait de l'orchidée Vanda coerulea est associé avec d'autres agents actifs sous forme de molécules purifiées et/ou d'extraits végétaux, présentant des effets cosmétiques similaires et/ou complémentaires de celle dudit extrait. La composition peut ainsi comprendre un ou plusieurs autres extraits de plantes, obtenus à partir de plantes entières ou de parties de plantes. La composition cosmétique peut ainsi avantageusement 30 comprendre au moins un extrait d'une autre orchidée, en particulier un extrait d'une autre espèce d'orchidée appartenant au genre Vanda telle que arts it e V 'eIe `rir i In extrait d'une nrchidd nnnartenant enrn La composition cosmétique peut en outre égaiement comprendre un ou plusieurs autres agents actifs cosmétiques choisis parmi le groupe de substances ayant une activité anti-vieillissement ; de substances ayant une activité dépigmentante ou une activité éclaircissante de la peau; de substances ayant une activité amincissante ; de substances ayant une activité hydratante ; de substances ayant une activité calmante, apaisante ou relaxante ; de substances ayant une activité stimulant la microcirculation cutanée pour améliorer l'éclat du teint, en particulier du visage ; de substances ayant une activité sébo-régulatrice pour le soin des peaux grasses ; de substances destinées à nettoyer ou purifier la peau ; de substances ayant une activité anti-radicalaire. En particulier, la composition cosmétique peut comprendre un ou plusieurs autres agents actifs cosmétiques choisis parmi - des agents favorisant le renouvellement cellulaire telles que la vitamine A (rétinol) et/ou ses esters, en particulier un propionate de vitamine A des alpha- ou beta-hydroxy acides tels que les acides de fruits, l'acide malique, glycolique ou citrique, l'acide salicylique ou ses esters, l'acide gentisique ou ses esters en particulier, le gentisate de tocopherol ; - des agents stimulants la fermeté de la peau, tels que des peptides stimulant la synthèse de collagène, en particulier le collagène de type I, II, IV ou VII, un extrait de Centella asiatica, l'acide madécassique, l'acide asiatique, le madécassoside, un extrait d'avoine, un extrait de Berthollétia exscelsa , un hydrolyzat de protéines, des peptides de soja, un extrait de Potentilla erecta, un extrait de Siegesbeckia orientalis, des 2 ginsenosides ou notoginsenosides en particulier Rbl, RO ; - des agents régulant la différentiation de l'épiderme parmi lesquelles ceux du type eedysteroides, ecdysterone, turkesterone ou des clef ives de calcium ou des précurseurs de vitamine D 1 aclenosine, de la carnitine ou ses dérivés ; - des inhibiteurs de métalloptotéinases, particulier les inhibiteurs de NilivIP1 P1NIP2, ou MMPP tel qu un extrait de Ruscuc- ;r do fIdsonnides tels que quetretine le KaemDferoi d v e a, na) - des agents stimulant la synthèse de dermatopontine, comme un extrait d'ambre - des agents resserrant les pores tels que des extraits de plantes astringentes, par exemple un extrait d'hamamélis - des filtres protégeant des radiations UVA et UVB, tels que la benzophenone, le 4-butyl methoxydibenzoylmethane, l'octocrylène, l'ethylhexyl methoxycinnamate, l'ethylhexyl salicylate, l'acide phenylbenzymidazole sulfonique, r'homosalate, seuls ou en association avec des oxydes de titane - des agents destinés à combattre les désordres de pigmentation, notamment ceux liés au vieillissement cutané, tels que l'acide kojique, les extraits de racine de réglisse ou de murier, l'arbutine, le pantothenosulfonate de calcium, la boldine, la diacetylboldine, la vitamine C et ses dérivées, en particulier des glycosides, des extraits de lys, en particulier de bulbe - des agents antiradicalaires ou antiinflammatoires tels qu'un extrait d'Artemisia capillaris, un extrait de Sanguisorba officinalis, le resvératrol et ses dérivés, le curcuma ou la curcumine ou la tétrahydrocurcumine, des polyphenols extraits de pépins de raisin, de la vitamine E et ses dérivés, en particulier ses dérivés phosphate, l'ergothioneine ou ses dérivés, 19débénone ; - des agents favorisant la synthèse d'acide hyaluronique au niveau épidermique et dermique, ou de glycosaminoglycanes pour donner une peau hydratée et rebondie, en particulier un extrait d'Eriobotrya japonica ou des fragments d'acide hyaluronique de bas poids moléculaire ou encore un extrait d'Adenum obsesum. l'aspartate de magnesium pour améliorer rection antirides - du D-xyiose pour améliorer ie plumpinq effect pour une ebopdle 30 et cun quelconque de leurs mélanges. Avantageusement, la composition comprend n ()titre au moins lient OS111ctiqqeMent acceptable peu \/,-Int te il isl narra! des des eiect evaiii La composition cosmétique peut être par exemple un sérum, une lotion, une crème ou bien encore un hydrogel, de préférence un masque, ou encore se présenter sous la forme d'un stick ou d'un patch. L'extrait et la composition de l'invention présentent un effet particulièrement recherché pour retarder l'apparition des signes du vieillissement cutané, ou en ralentir les effets notamment pour maintenir la fermeté de la peau et des tissus ou rendre un teint de peau plus éclatant ou bien encore pour combattre les désordres de pigmentation liés au vieillissement cutané.

L'invention a également pour objet une méthode de soin cosmétique anti-âge caractérisée en ce qu'elle comprend l'application sur au moins une partie de la peau du visage ou du corps, d'une quantité efficace d'une composition cosmétique contenant un extrait de l'orchidée Vanda coerulea, pour retarder l'apparition des signes du vieillissement cutané, ou en ralentir les effets notamment pour maintenir la fermeté de la peau et des tissus ou rendre à la peau un teint plus éclatant, ou bien encore pour combattre les désordres de pigmentation liés au vieillissement cutané. Avantageusement, la composition cosmétique est appliquée sur une zone de peau du corps ou du visage présentant des signes visibles de vieillissement tels que la présence de rides ou de ridules, une perte d'élasticité cutanée, une diminution de l'épaisseur de la peau, une augmentation de la sécheresse ou de la rugosité cutanée, une perte de souplesse ou d'éclat cutané, ou bien encore des signes visibles d'un désordre de pigmentation lié au vieillissement cutané tel qu'un lentigo sénile.

Dans les exemples, tous les pourcentages sont donnés en poids, fa température est en degrés Celsius, la pression est la pression atmosphérique, sauf indication contraire L) 'autres buts, caractéristiques et avantages de !invention apparaîtront clairement s la lumière de la description explicative qui va suivre faite en référence a des exemples de préparation d'extrait et de tests mettant en evidence les proprietes des extraits et a des exemples de composition e,matini ,tliisant un tel striait .L11 sont donnes titre l'illustretion de pue ~~_ fiant fer unr eu i DESCRIPTION DES FIGURES

La figure 1 représente schématiquement le cycle cellulaire. La figure 2 représente la répartition de cellules cutanées dans chacune des différentes phases du cycle cellulaire, obtenue pour les différents tests (témoins et traitements) menés sur des FHN « jeunes » (F3P) ou « âgés » (F22P).

EXEMPLES Exemple 1 : préparation d'un extrait de tiges de Vanda coerulea.

a) Préparation d'un extrait de tiges L'extrait est préparé à partir de tiges de Vanda coerulea, à l'état 15 sec et broyées. On introduit 10g du végétal dans un ballon de 250 ml dans lequel on ajoute 150m1 d'un mélange éthanol/eau (90/10 v/v). Le ballon surmonté d'un réfrigérant à boule sous agitation magnétique, est chauffé dans un bain thermostaté, jusqu'au reflux de 20 solvant, maintenu 30 minutes sous agitation. On laisse ensuite refroidir le ballon à température ambiante. Le mélange est ensuite filtré sous vide sur büchner avec un filtre GF/F Whatman 70pm et une fiole tarée. Le gâteau est lavé sur le büchner avec 50 ml du solvant d'extraction. 25 Les filtrats sont réunis, pesés, introduits dans un ballon préalablement taré, puis concentrés à sec à l'évaporateur rotatif dans. un bain d'eau placé à une température maximale de 50°C.

è) Préparation dun extrait de racines On procède selon le même protocole pour préparer u,in extrait de racine de Vanda coerulea (extrait n°2 )i Ces deux extraits seront- ubll°d '.jan` suive ir)airiiiR s~ ~>>,~iunnu pros10 Exemple 2 : Mesure des phases du cycle cellulaire sur cellules cutanées dermiques humaines par CytoMétrie de Flux (CMF)

Les fibroblastes sont obtenus à partir de biopsies de peau saine de patients consentants. Leur vieillissement in vit-ro est obtenu par repiquages successifs tel que décrit par Hayflick (Exp Ce// Res 1965, 37:614-636). Le modèle dit d'Hayflick est un modèle de vieillissement cellulaire in vitro. Ces cellules vieillies /n vitro par passages successifs en présence de trypsine, présentent des caractéristiques identiques à celles de cellules issues de patients âgés. Les fibroblastes n'ayant subi que 3 passages en présence de trypsine, notés F3P, possèdent une aptitude à se diviser équivalente à celle de cellules jeunes, alors que des fibroblastes ayant subi un nombre plus important de passages, dans le cas présent 22 passages, présentent une aptitude à proliférer équivalente à celle de cellules âgées. Dans ce dernier cas, les fibroblastes sont notés F22P.

MATERIEL ETMETHODES La CMF offre une méthodologie pour l'analyse du cycle cellulaire.

Elle permet l'étude de la distribution des cellules dans les différentes phases du cycle cellulaire. Les cellules isolées et en suspension, sont entraînées dans un flux liquide. Les cellules alignées défilent à grande vitesse devant un laser. La diffusion lumineuse, soit dans l'axe du laser, soit à 900 donne une information sur la taille et la structure de chaque cellule. L'analyse cytométrique est précédée d'une étape de marquage avec des molécules fluorescentes; spécifiques d'une structure ou d'une fonction cellulaire. Ces molécules CHIULLE-2iit une fluorescence mesuraole, après excitation par la source lumineuse incidente Les signaux de diffusion et de fluorescence sont captés par des détecteurs qui les transforment en signaux électriques, traités par un système informatique. Chaque cellule représente ainsi un _isenement électrique avec plusieurs -ordonnee, ;taille'; structure, mine lige .alaire narau; propidium, qui est un agent intercalant aussi bien des doubles brins d'ADN que d'ARN. L'hydrolyse de l'ARN par la ribonucléase est nécessaire avant la coloration de l'ADN par l'agent intercalant,

CUL TURE "E`L L ULAIRE Une grande quantité de cellules (environ 1 million de cellules/mL pour chaque condition d'analyse) est nécessaire pour une analyse en CMF. Les cellules sont décollées du support à l'aide de la trypsine, individualisées puis marquées avant d'être analysées. 10 CUL TURE DES FHN Les cultures primaires de fibroblastes humains normaux (FHN) sont préparées à partir d'expiants de derme. Les FHN sont cultivés pendant une semaine dans des flacons 15 de 75cm2 en présence de milieu MEM (Modified Eagle Medium)+10% SVF (Serum de Voeux Foetal), le milieu est changé tous les 2 jours. Les cellules sont traitées à confluence.

~ITEMENT DES CELLULES 20 Les cellules sont traitées pendant 24 heures avec l'agent actif du test, dans le cas présent un extrait de tiges de l'orchidée Vanda coerulea, dont les solutions mères sont préparées à 50mg/mL dans du DMSO et utilisées à 25pg/mL après dilution.

25 COL CRATION DE L '4DN A L'IODURE DE PROPIDIUM Pour décrocher les cellules on utilise une solution de Trypsine-EDTA â 0.25%. On rince les flacons avec 5 rnL de PBS sans Ca` ni Mg' , puis on apure mL par flacon de trypsine-ED T A, répartis sur l'ensemble du tapis cellulaire, Les cellules sont mises a incuber à 37°C, 5% CO: Lorsque les cellules flottent, on ajoute tO n-JL de milieu MEM u~ OO r flet Jtr~ii v tii îrî de la t rvpsrne.

er 13< Après une nouvelle centrifugation à 1500t/min pendant 5 minutes, on ajoute 1mL d'un mélange d'Iodure de propidium à 10pg/mL et de RNase à 1mg/mL en solution dans le PBS. On incube la préparation pendant 30 minutes à température ambiante et à l'abri de la lumière.

Le contenu des tubes précédents est transféré dans des tubes adaptés pour la CMF (BECKMAN-COULTER). On maintient les échantillons à 4°C jusqu'à l'analyse.

ANAL YSE L'analyse est effectuée sur un cytomètre BECKMAN-COULTER FC500 avec le logiciel MXP. Afin d'éviter les fausses positivités et négativités, des témoins d'autofluorescence (cellules non marquées) sont utilisés. L'excitation du complexe acides nucléiques-fluorochrome par le laser émettant à 488nm, produit une émission du marqueur cellulaire dans le rouge (600-650nm), dont l'intensité est proportionnelle à la quantité d'ADN marqué : un histogramme linéaire monoparamétrique est construit permettant de mesurer la fluorescence rouge en fonction du nombre de cellules.

L'intensité de fluorescence est fonction de la quantité d'ADN : l'iodure de propidium est fluorescent et se lie à l'ADN. Plus il y a d'ADN dans le noyau de chaque cellule, plus le signal de fluorescence est intense. Les cellules contenant 2n sont dans la phase du cycle qui précède la synthèse de l'ADN (G1) et les cellules au contenu 4n (après dédoublement 25 des chromosomes) sont dans la phase (au] suit la synthèse (G2). Plus on trouve de contenu d'ADN entre 2n et 4n, plus les cellules sont en train de se repiquer (phase S). Des curseurs séparent les pnases cycle cellulaire en groupes GO/Gi, S et G2aM. Le cytometre analyse la quantité fluorescence, proportionnelle n(d..jrCent-nqeS la quantité d'ADN marqué et la transpose en s donnEes de I"andlySe sonf e>TrIlréeS en pourcentage METIrinr-UlOP Oe prese RESIJLTATS On étudie les effets sur des fibroblastes âgés, du traitement par l'extrait de Vanda coerulea. Les résultats obtenus pour l'analyse des FHN, traités ou non, par 5 la CMF, sont synthétisés dans le tableau 1 ci-dessous (% exprimés par rapport au nombre total de cellules) : Tableau 1. Fibroblastes « jeunes » Fibroblastes « âges , (F3P) (F22P) Témoins Vanda Témoins Vanda coerulea coerulea phases GO/G1 84,1 84 91,1 83,91 phase S 4,6 4,8 1,2 4,7 phases G2/M 10,9 9,4 7,7 10,9 10 Les résultats mettent en évidence une modification de la répartition des cellules selon les différentes phases du cycle cellulaire en fonction du nombre de passages. En effet, on observe pour les cellules « âgées » dites F22P, que leur nombre en phase GO/G1 du cycle cellulaire 15 est plus important que pour les cellules « jeunes » dites F3P. De la même manière, les résultats de CMF mettent en évidence un nombre relativement moins important de cellules en phase de réplication de l'ADN (phase S) et en mitose (phase G2+M). Cette augmentation du nombre de cellules quiescentes dans ces phases GO/G1 20 matérialise une diminution générale de l'activité cellulaire, Ces cellules sont dites pré-sénescentes. Un traitement des fibroblastes jeunes (F3P) par extrait Vanda soerulea e modifie prop 'noms r datives de cellules scion leur engagement dans le cycle cellulaire, comparé au témoin (fibroblastes F3P non traités). Par contre, un traitement des fibroblastes égés (F22P) par trait de Vanda coerulea e l exemple permet Je restaurer un

qua ciru cel s (F3P) nor Le traitement permet de « réverser le phénomène de pré-sénescence observé pour les cellules non traitées. Le traitement par l'extrait de Vanda coerulea induit une diminution du pourcentage de cellules sénescentes, bloquées en phase GO/Gl, et donne relativement plus de cellules en phase active de réplication de l'information génétique (phase S). On augmente ainsi le potentiel d'activité biologique des fibroblastes. Ces propriétés surprenantes permettent une utilisation de l'extrait de l'orchidée Vanda coerulea en tant qu'agent actif cosmétique particulièrement efficace pour lutter contre le vieillissement cutané, notamment au niveau du derme, en augmentant le nombre de cellules actives par rapport au nombre de cellules sénescentes. Ce principe actif est donc tout a fait innovant pour lutter très en amont du processus de vieillissement cellulaire, notamment pour restaurer des fonctions et mécanismes biologiques des fibroblastes « agés Exemple 3 - Crème anti-âge

L'extrait de tige de Vanda coerulea utilisé à titre d'agent actif dans cette composition cosmétique, est obtenu en reproduisant le procédé de l'exemple 1 (extrait Cl). L'extrait sec est mis en solution à 1% p/p dans un mélange glycérol/eau 60/40 v/v. Cette solution d'extrait est utilisée à titre d'agent actif pour la préparation de la composition cosmétique ci-dessous (% exprimé en p/p) Phase A Solution à I"/o en extrait de Vanda coerulea 0,3 Phénoxyéthanoi 0,5 Xcifitildrle. 0,2 Acryiates/fi.20-30 alky1aervlate mspolymê 0,2 EDTA. tétrasodique 0,1 Eau ças Phase B Polyisobutène hydrogéné Squalane Caprylique/caprique triglycéride Pentylène glycol Glycéryl stéarate PEG-100 stéarate Cire d'abeilles Dicaprylyl carbonate Cétyl alcool Stéaryl alcool Diméthicone Phase C Hydroxyde de sodium 0,04 Eau qs 100

On disperse les excipients de la phase A dans l'eau, puis on chauffe à 80°C, avant de solubiliser tous les autres composés y compris la 20 solution hydroglycolique d'extrait de Vanda coerulea. Les composés de la phase B sont chauffés à 85°C pour former une phase homogène. On émulsionne la phase A dans la phase B à l'aide d'un mélangeur Ystral. 25 L'émulsion huile-dans-eau ainsi obtenue est finalement neutralisée à l'aide d'une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium 0,04 p/p, puis refroidie. I_a composluon obtenue est une (-Terne ann-age destinée tre appliquée sur le vouge ou une partie du visage

pLemple4 r_Sérum anti-âge éclaircissant 17 4 3 3 3 3 2,5 Polysaccharides d'avoine 3 Filtres UV 5 Excipient qsp 100 On applique a préparation le matin sur la peau démaquillée.

Claims (5)

1. REVENDICATIONS1. Utilisation dans une composition cosmétique, d'un extrait de l'orchidée Vanda coerulea comme agent actif destiné à retarder l'apparition des signes du vieillissement cutané ou à en ralentir les effets, notamment à maintenir la fermeté de la peau et des tissus ou à rendre un teint de peau plus éclatant, ou bien encore destiné à combattre les désordres de pigmentation liés au vieillissement de la peau.
2. 2. Utilisation dans une composition cosmétique, d'un extrait de l'orchidée Vanda coerulea comme agent actif destiné à réguler le cycle des cellules cutanées, notamment à augmenter le pourcentage de cellules cutanées en phase de réplication de l'information génétique et diminuer dans le même temps le pourcentage de cellules sénescentes parmi la population totale de cellules cutanées, ou bien encore à améliorer l'activité biologique des cellules cutanées altérées par le vieillissement.
3. 3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce ledit extrait est un extrait de tiges et/ou des racines et/ou des feuilles de ladite orchidée.
4. 4. Utilisation, selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ledit extrait est obtenu par mise en contact d'au moins une partie de ladite orchidée, éventuellement séchée et/ou broyée avec au moins un solvant polaire.
5. 5. Utilisation selon la revendication 4, caractérisée en ce que ledit solvant polaire est choisi dans le groupe constitué de l'eau, des alcools en CoC i, en particulier de l'éthanol, des glycols en Ce-C,,, en particulier le glycérol, le bu lèneglyco le propylèneglycol, et l'un quelconque de leurs nelanges Utilisation selon la revendication caractérisée en ce que ledit solvant est un mélange hydroalcoollqueä de préférence un mélan comprenant 90 d'eau et 0 /o v d'éthanol Utilisation selon la icvendication 4, caractérisée en ce que solvant i)001ré Ti Igeusemei8. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que ledit extrait a été soumis à au moins une étape de décoloration et/ou de purification. 9. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisée 5 en ce que ladite composition contient de 0,001 % à 5% en poids d'extrait sec, de préférence de 0,1 à 2% en poids. 10. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que ladite composition comprend en outre au moins un extrait d'une autre orchidée, en particulier un extrait d'une autre espèce d'orchidée 10 appartenant au genre Vanda telle que l'orchidée Vanda teres, ou un extrait d'une orchidée appartenant au genre Brassocattleya telle que l'orchidée Brassocattleya marcella Kas ou bien encore un extrait d'une orchidée appartenant au genre Phalaenopsis telle que l'orchidée Phalaenopsis amabllis. 15 11. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisée en ce que ladite composition comprend en outre au moins un excipient cosmétiquement acceptable pouvant être choisi parmi des pigments, des colorants, des polymères, des agents tensioactifs, des agents de rhéologie, des parfums, des électrolytes, des ajusteurs de pH, des agents anti- 20 oxydants, des conservateurs, et leurs mélanges. 12. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisée en ce que ladite composition cosmétique est un sérum, une lotion, une crème, un hydrogel, de préférence un masque, ou se présente sous la forme d'un stick ou d'un patch. 25 13. Méthode de soin cosmétique anti-âge caractérisée en ce qu'elle comprend l'application sur au moins une partie de la peau du visage ou du corps, d'une quantité efficace d'une composition cosmétique contenant un extrait de iorcnidee vanda coerulea, telle que définie dans l'une des revendications 1 à 12, pour retarder l'apparition des signes du vieillissement cutané, ou en ralentir les effets ; notamment pour maintenir la fermeté de la peau et des tissus ou rendre a la peau un teint plus eclatant, ou bien encore pour combattre les (leserdres de plqmentarlon ries eu vieillissement cutané. (') 1 n «" i. (1 1 -PI n rr rnon cosmeti( )résentant visvieillissement tels que la présence de rides ou de ridules, une perte d'élasticité cutanée, une diminution de l'épaisseur de la peau, une augmentation de la sécheresse ou de la rugosité cutanée, une perte de souplesse ou d'éclat cutané, ou bien encore des signes visibles d'un désordre de pigmentation lié au vieillissement cutané tel qu'un lentigo sénile.