TWI783378B - 單離胜肽、含彼之醫藥組成物及其用於製備專一性減少或抑制癌細胞活性之醫藥組成物的用途 - Google Patents

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Abstract

本發明有關於一種單離胜肽、含彼之醫藥組成物及其用於製備專一性減少或抑制癌細胞活性之醫藥組成物的用途。前述單離胜肽包含第一型人類免疫缺乏病毒TAT(HIV-1 TAT)鹼性結構域共軛至γ-胺基丁酸受體相關樣蛋白2 α-螺旋2(GABARAPL2 H2)結構域，可專一性減少或抑制癌細胞活性，藉此應用至抗癌醫藥組成物及其用於製備專一性減少或抑制癌細胞活性之醫藥組成物的用途。

Description

單離胜肽、含彼之醫藥組成物及其用於製備專一性減少或抑 制癌細胞活性之醫藥組成物的用途
本發明係有關一種抗癌胜肽及其應用，特別是有關於一種單離胜肽、含彼之醫藥組成物及其用於製備專一性減少或抑制癌細胞活性之醫藥組成物的用途。
自噬(autophagy)是一種演化保守(evolutionarily conserved)的過程，當細胞營養匱乏時，可將受損的蛋白質及胞器從自噬體(autophagosome)送到溶酶體(lysosome)。在許多疾病中，尤其是在癌症發展中，這種演化保守過程扮演舉足輕重的角色。在哺乳動物細胞中，至少有38種ATG基因主要參與在從吞噬泡(phagophore)開始到自噬體形成的自噬進展中。在這些基因中，ATG4是半胱胺酸蛋白酶，對於活化MAP1LC3前驅物(原MAP1LC3， proMAP1LC3)，以及從自噬體將MAP1LC3-II去脂質化(delipidation)使其再利用而促使自噬而言，ATG4是必需的。人類基因體有4個獨立基因用來編碼ATG4[(4A/自噬素(autophagin)-2、4B/自噬素-1、4C/自噬素-3及4D/自噬素-4]。人類ATG8直系同源體(orthologs)包括MAP1LC3A、MAP1LC3B、MAP1LC3C、GBR、GBRL1以及GBRL2，而ATG4B對人類ATG8直系同源體可呈現出最活化且最廣泛的蛋白水解活性。
關於ATG4在癌細胞中扮演的角色，在大腸直腸癌、口腔癌及CD34+慢性骨髓性白血病(chronic myeloid lymphoma，CML)病患的腫瘤組織中，ATG4B的表現顯著增加。ATG4B過度表現與侵略性黑色素瘤(aggressive melanoma)引起的細胞壞死(cell necrosis)有關。將ATG4B基因沉默(silencing)可減少骨肉瘤(osteosarcoma)的腫瘤生長。改造(reconstitution)ATG4BC74A突變體可使細胞週期停滯於G1期，顯示ATG4B的蛋白水解作用對於腫瘤生長是必要的。此外，ATG4A突變與子宮頸癌有關。在卵巢腫瘤初始的細胞中，ATG4A被低度甲基化(hypomethylated)，與卵巢癌患者癒後不良有關。再者，目前已發現對於活體內乳癌幹細胞的致癌調節而言，ATG4A表現至關重要。ATG4C的異位表現(ectopic expression)在乳癌細胞中可促進ATM介導之自噬作用 以及癌幹細胞性(stemness)。更有趣的是，ATG4B基因剔除(knockout)小鼠僅在內耳耳砂發育(otoconial development)中呈現輕微的缺陷，並沒有生長抑制或其他現的異常。這些結果顯示ATG4可作為癌症治療的潛在藥物標的。然而，對於ATG4作為癌症治療的潛在藥物標的的相關研究甚少。
因此，亟需找出癌症治療的解決方案，以更有效抑制ATG4蛋白水解活性及抑制癌細胞。
因此，本發明之一態樣是提供一種單離胜肽，包含第一型人類免疫缺乏病毒TAT(HIV-1 TAT)鹼性結構域共軛至γ-胺基丁酸受體相關樣蛋白2 α-螺旋2(GABARAPL2 alpha-helix 2，GABARAPL2 H2)結構域，藉此專一性減少或抑制癌細胞活性。
本發明之另一態樣是提供一種抗癌醫藥組成物，包含在醫藥學上可接受之賦形劑中含有單離胜肽。
本發明之又一態樣是提供一種單離胜肽用於製備專一性減少或抑制癌細胞活性之醫藥組成物的用途，包含向有需要之對象投予醫藥組成物，此醫藥組成物包含醫藥學有效劑量之單離胜肽，此單離胜肽是如SEQ ID NO：10所示之胺基酸序列，且此單離胜肽有能力專一性減少或抑制癌細胞活性。
根據本發明之上述態樣，提出一種單離胜肽。在 一實施例中，此單離胜肽包括第一型人類免疫缺乏病毒TAT(HIV-1 TAT)鹼性結構域共軛至γ-胺基丁酸受體相關樣蛋白2 α-螺旋2(GABARAPL2 H2)結構域。前述GABARAPL2 H2結構域可由如序列辨識編號(SEQ ID NO)：1所示之序列組成。
在上述實施例中，HIV-1 TAT鹼性結構域(亦簡稱為TAT1)可由如SEQ ID NO：2所示之序列組成。在一些例示中，上述單離胜肽可選擇性包含胜肽連接子，其係插設於HIV-1 TAT鹼性結構域與GABARAPL2 H2結構域之間，且此胜肽連接子可包括富含甘胺酸胜肽、富含甘胺酸/絲胺酸(Gly/Ser)胜肽或富含甘胺酸/丙胺酸(Gly/Ala)胜肽。在一些特定例子中，上述胜肽連接子可包括一序列，且此序列可選自於由如SEQ ID NOs：3至9所示之複數個胺基酸序列所組成之一族群。在一例示中，上述單離胜肽可由如SEQ ID NO：10所示之胺基酸序列組成。
根據本發明之另一態樣，提出一種抗癌醫藥組成物，包含在醫藥學上可接受之賦形劑中含有單離胜肽。在一實施例中，此抗癌醫藥組成物可包括在醫藥學上可接受之賦形劑中含有單離胜肽。在此實施例中，前述單離胜肽為有效成分，且此單離胜肽可由如SEQ ID NO：10所示之一胺基酸序列組成。
根據本發明之又一態樣，提出一種單離胜肽用於製備專一性減少或抑制癌細胞活性之醫藥組成物的用途。 在一實施例中，此用途包含向有需要之對象投予醫藥組成物，此醫藥組成物包含醫藥學有效劑量之單離胜肽，且此單離胜肽可如SEQ ID NO：10所示之胺基酸序列。
在上述實施例中，前述癌細胞之種類可包括但不限於大腸直腸癌、膠質母細胞瘤、口腔癌、肝細胞癌、乳癌、前列腺癌及肺癌。
在上述實施例中，前述單離胜肽可具有專一性減少或抑制上述癌細胞之活性。
在上述實施例中，前述癌細胞之活性可包括但不限於ATG4蛋白水解活性、細胞移行、侵襲及幹細胞性(stemness)。
應用本發明的單離胜肽、含彼之醫藥組成物及其用於製備專一性減少或抑制癌細胞活性之醫藥組成物的用途，此單離胜肽包含HIV-1 TAT鹼性結構域共軛至GABARAPL2 H2結構域，可專一性減少或抑制癌細胞活性，藉此應用至抗癌醫藥組成物，以專一性減少或抑制癌細胞活性。
可以理解的是，前述的概括說明及下述的詳細說明僅為例示，旨在對要求保護的發明提供進一步的解釋。
本發明包含至少一張彩色圖式。專利專責機關將根據請求並支付必要費用，提供附有彩色圖式的副本。為讓本發明之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明 顯易懂，所附圖式之詳細說明如下：[圖1]係繪示根據本發明數個實施例的人類ATG8直系同源體(orthologs)的蛋白質序列比對結果，其中人類ATG8直系同源體包括MAP1LC3(MLP3A、MLP3B、MLP3C)及GBR(GBR、GBRL1、GBRL2)次家族，而H1、H2及H3為蛋白質結構的α-螺旋區。
[圖2A]至[圖2C]係繪示根據本發明數個實施例的GBRL2衍生胜肽對ATG4蛋白水解活性之抑制效果。圖2A及圖2B係繪示由GBRL2衍生的三段α-螺旋狀胜肽(H1、H2及H3)經二倍序列稀釋後，在100nM報導基因GBRL2-PLA2(作為ATG4成員的一般性受質)存在下，與重組ATG4A(5nM)(圖2A)或ATG4B(0.1nM)(圖2B)混合，以評估各胜肽對ATG4A及ATG4B的抑制效果。前述胜肽對ATG4A及ATG4B的IC50係利用Prism 5.0進行分析。圖2C上方係顯示EDTA對ATG4蛋白水解之抑制效果的陽性控制組。圖2C下方則進一步利用0.5nM凋亡蛋白酶(caspase)-3以及100μM DEVD-AFC對H2胜肽進行反向檢測(counter assay)，以驗證其專一性。
[圖3A]至[圖3C]係繪示根據本發明數個實施例的胜肽對細胞ATG4蛋白水解作用與自噬流(autophagic flux)的影響。圖3A繪示由不同ATG4受質衍生的H2胜肽與嵌合GBRL2混合，其中前述ATG4受質包括MAP1LC3B、MAP1LC3C、GBR及GBRL2，而嵌合 GBRL2包含N端的C-myc標籤以及C端的S標籤。圖3A上方為帶有S標籤GBRL2，圖3A下方則為帶有未切割myc標籤的GBRL2與帶有已切割myc標籤的GBRL2的比例(ratios of non-cleaved/cleaved Myc-tag GBRL2)，以評估H2胜肽的抑制效果。圖3B繪示人類膠質母細胞瘤H4細胞及大腸直腸癌HCT116細胞二者，單以10μM的GBRL2 H2胜肽(橘色)、單以10μM的TAT胜肽(紅色)或以與TAT胜肽共軛的GBRL2 H2胜肽(綠色)處理6小時後，利用流式細胞儀(flow cytometer)分析。圖3C繪示HCT116細胞以GBRL2 H2胜肽處理6小時後之ATG4可裂解冷光素酶(cleavable luciferase)的表現量。檢測冷光素酶活性，以判斷對ATG4蛋白水解的抑制效果。
[圖4A]及[圖4B]係繪示根據本發明數個實施例的胜肽(5μM)在H4細胞(圖4A)及HCT116細胞(圖4B)中的細胞毒性作用，並利用細胞群落分析(clonogenic assay)再確認。
[圖5A]及[圖5B]係繪示根據本發明數個實施例的GBRL2胜肽對癌細胞移行及侵襲之作用。圖5A係繪示利用塗佈基底膜凝膠之可穿透性細胞培養小室(Matrigel-coated transwell filters)，在上述胜肽存在或不存在下，檢驗HCT116細胞之侵襲，並利用ImageJ軟體量化細胞侵襲結果。圖5B係繪示對侵襲量化的結果，並以平均值±標準誤差(standard error of mean，SEM)表示。*p<0.05；**p<0.01。
[圖6A]至[圖6F]係繪示根據本發明數個實施例的胜肽對腫瘤球培養(tumorsphere culture)及異種移植小鼠模式(xenograft mouse models)的作用。圖6A係繪示HCT116細胞種在NanoCulture細胞培養盤3天長成球體的影像，其中HCT116細胞經GBRL2胜肽或TAT-GBRL2胜肽處理3天或7天，並以TAT胜肽做為控制組。圖6B係繪示利用市售的冷光細胞活性分析組(3D CellTiter Glo Assay)檢測腫瘤球存活率，其係與暴露於相同濃度之TAT胜肽的細胞相比，並以百分比表示。圖6C係繪示以上述胜肽(20μM)處理7天後的腫瘤球的影像，並利用市售的細胞存活分析組(LIVE/DEAD Cell Viability Assay)判斷腫瘤球之存活(呈綠色)或死亡(呈紅色)的比例。圖6D係繪示由三個試驗量化之腫瘤球的存活死亡比。圖6E係繪示將穩定表現螢火蟲冷光酶之HCT116細胞異種移植至裸鼠一週後，直到形成腫瘤的結果。小鼠以腫瘤內注射(intratumorally，IT，n=5)或腹腔內注射(intraperitoneally，IP，n=5)上述胜肽7天或14天。小鼠之腫瘤存活率則是對小鼠施予D-冷光素(D-luciferin，150mg/kg)，利用非侵入式影像系統(non-invasive imaging system)監測。圖6F係繪示異種移植小鼠的腫瘤存活率之定量結果。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。
藉由以下詳細說明，並參酌所附圖式，使本發明的實施例顯而易見，其中相同圖號係指相同元件。說明書使用的各種術語應適用本文對該術語的定義。
本發明揭露一種單離胜肽、含彼之醫藥組成物及其用於製備專一性減少或抑制癌細胞活性之醫藥組成物的用途。前述單離胜肽包含第一型人類免疫缺乏病毒TAT(HIV-1 TAT)鹼性結構域(亦簡稱為TAT1)共軛至γ-胺基丁酸受體相關樣蛋白2 α-螺旋2(GABARAPL2 H2)結構域，可專一性減少或抑制癌細胞活性。
此處所述之「胺基酸殘基」、「胺基酸」或「殘基」可相互通用，係指蛋白質、多肽或胜肽中的胺基酸，可包括但不限於天然存在的胺基酸，以及天然胺基酸的已知類似物且其功用與天然存在的胺基酸類似。胺基酸可為L型或D型胺基酸。胺基酸亦可取代為合成胺基酸，其中合成胺基酸係經過改變，以增加胜肽的半衰期、增加胜肽的效力或增加胜肽的生物可用性(bioavailability)。
此處所述之「胜肽」係指二或多個胺基酸以化學鍵結一起的分子。胜肽可指多肽、蛋白或擬肽物(peptidomimetic)。本發明之胜肽可包含D型胺基酸(在活體內對L型胺基酸特異性蛋白酶具有抗性)、D型胺基與L型胺基酸之結合以及各種“專門設計”的胺基酸[“designer”amino acids，例如β-甲基胺基酸 (β-methyl amino acids)、C-α-甲基胺基酸C-α-methyl amino acids)以及N-α-甲基胺基酸(N-α-methyl amino acid)等]，以表現特殊性質。「胜肽」亦可包括各種修飾，包括醣基化(glycosylation)、脂質附著(lipid attachment)、硫酸化(sulfation)、麩胺酸殘基的γ-羧基化(gamma-carboxylation)、羥基化(hydroxylation)以及ADP-核糖基化(ADP-ribosylation)。在一些實施例中，胜肽的長度或大小為任意。除非本文另有所指，否則此處使用的「胜肽(單數)」、「胜肽(複數)」或「擬肽物」應視為包括上述化合物的衍生物以及「原藥(prodrug)」。此處使用的「擬肽物」一詞係指設計成模擬胜肽、小分子類似蛋白的鏈狀物。擬肽物一般是來自於對現有胜肽的修飾，以改變分子的性質。
此處使用的「單離胜肽」一詞係指實質純化且不含其他物質的胜肽，前述其他物質是在自然界或活體系統中通常發現的，且此胜肽對於其預定用途可達到實際且適用的程度。舉例而言，這類組成物的純度足夠，且實質不含宿主細胞之其他生物組份，進而用於例如生產藥物製劑或基因測序。
在一些實施例中，本發明之單離胜肽包括第一型人類免疫缺乏病毒TAT(HIV-1 TAT)鹼性結構域共軛至γ-胺基丁酸受體相關樣蛋白2 α-螺旋2(GABARAPL2 alpha-helix 2，GABARAPL2 H2) 結構域，二者之間選擇性插設有胜肽連接子。
在這些實施例中，GABARAPL2 H2結構域可由如序列辨識編號(SEQ ID NO)：1所示之序列組成，其中此序列是對應於GABARAPL2之第57個胺基酸殘基至第67個胺基酸殘基。
上述HIV-1 TAT鹼性結構域是由如SEQ ID NO：2所示之序列組成，其中此序列是對應於HIV-1 TAT蛋白之第47個胺基酸殘基至第57個胺基酸殘基(或稱為蛋白傳導結構域，protein transduction domain，PTD)。
在一些實施例中，上述單離胜肽可選擇性包含胜肽連接子插設於HIV-1 TAT鹼性結構域與GABARAPL2 H2結構域之間。在這些實施例中，前述胜肽連接子可包含但不限於富含甘胺酸胜肽、富含甘胺酸/絲胺酸(Gly/Ser)胜肽或富含甘胺酸/丙胺酸(Gly/Ala)胜肽，但不誘導HIV-1 TAT鹼性結構域與GABARAPL2 H2結構域的構形改變。在某些例示中，前述胜肽連接子可包括但不限於選自於由如SEQ ID NOs：3至9所示之複數個胺基酸序列所組成之一族群的序列。在一些例示中，上述單離胜肽可由如SEQ ID NO：10所示之一胺基酸序列組成，或稱為TAT-GBRL2胜肽。
在一些實施例中，本發明可提供抗癌醫藥組成物。在這些實施例中，抗癌醫藥組成物可包括在醫藥學上可接 受之賦形劑中含有上述單離胜肽。在這些實施例中，上述單離胜肽可為有效成分，且此單離胜肽是由如SEQ ID NO：10所示之胺基酸序列組成。
此處使用的「對象(subject)」、「病患」或「個體」一詞係指真核生物。生物樣本一般係取自於真核生物，包括但不限於哺乳動物。哺乳動物對象包括但不限於靈長類動物，例如人類；非靈長類動物，例如黑猩猩等。家畜，包括但不限於牛、羊、豬等；寵物，例如狗、貓、馬、兔、鼠(包括小鼠及大鼠)等。
此處使用的「有效成分(active agent)」一詞係指本發明之組成物的上述單離胜肽、成分(ingredient)、組成分(component)或組分(constituent)，可負責達成預期治療效果，例如抗癌處方，以專一性減少或抑制癌細胞活性或功能。在某些實施例中，上述單離胜肽能專一性減少或抑制癌細胞活性或功能，可作為ATG4抑制劑、腫瘤阻遏劑(tumor repressor)或抗癌劑。
此處使用的「癌」一詞係定義為細胞增殖失控，這種獨特性狀的結果會導致生長不受控、缺乏分化、局部組織侵襲及轉移。具體例包括但不限於大腸直腸癌、膠質母細胞瘤、口腔癌、肝細胞癌、乳癌、前列腺癌及肺癌。
此處使用的「抗癌功效(anti-cancer effect)」一詞係指上述單離胜肽或含此之組成物可專一性(選擇性)降低、抑制或阻遏癌細胞的活性或功能，例如抑制其 ATG4蛋白水解活性、細胞移行、侵襲及幹細胞性(stemness)及/或造成其於體外或活體內的破壞，但不影響正常細胞。在一實施例中，上述單離胜肽或含此之醫藥組成物可於傳統抗癌藥物施予前、施予時或施予後給藥。
在一些實施例中，本發明提供一種利用上述單離胜肽及/或上述抗癌醫藥組成物用於製備專一性減少或抑制癌細胞活性之醫藥組成物的用途。在這些實施例中，前述用途可向有需要之對象投予醫藥組成物，此醫藥組成物包含醫藥學有效劑量之單離胜肽，且此單離胜肽是如SEQ ID NO：10所示之胺基酸序列。
此處使用的「施予(administer，或施用)」、「投予(administering，或投藥)」或「給予(to administer，或給藥)」一詞係指給予或提供上述單離胜肽或醫藥組成物，包括以活體內施予以及直接對組織的離體施予。一般而言，組成物可利用系統性或口服、口頰(buccally)、非消化道(parenterally)、局部(topically)、吸入(inhalation)或灌注(insufflation，即經由口或鼻)或直腸給藥，以劑量單位配方，其視需求含有傳統、無毒、醫藥學上可接受的賦形劑、載劑、佐劑、媒液(vehicles)，或可例如但不限於注射、植入、移植、局部施用或非消化道施用等方式予以局部給藥。
此處使用的「減少(抑制或阻遏)」、「減少中(抑制中或阻遏中)」、「已減少(已抑制或已阻遏)」或「以 減少(以抑制或以阻遏)」一詞係指在程度、強度、範圍、規模、數量、密度或數量上的減少、降低、減弱或減輕。
此處使用的「醫藥學上有效劑量」或「劑量」一詞通常係指上述單離胜肽對於目標細胞或對象施用一段期間的含量，以提供一或多個臨床可測量的終點，例如減少或抑制上述對象之癌細胞的活性或功能。上述單離胜肽在抗癌組成物的劑量並無特別限制；然而，在一些例示中，上述單離胜肽之體外投予劑量可為1-20μM，活體內投予劑量可為5-50mg/kg體重。此外，施用期間並不特別限制，端視目標細胞或對象而定。
以下可以理解的是，下述特定配置、觀點、例示、條款及實施例僅為舉例說明，並非做為本發明的限制條件。在不脫離本發明之精神和範圍內，本發明的主要特徵可用於各種實施例。因此本發明所屬技術領域中具有通常知識者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可輕易確定本案的必要技術特徵，對本發明作各種更動及潤飾，以適用不同的用途及條件。
實施例 1.1 胜肽合成
胜肽是由美國澤溪源公司(Lifetein，CA，USA)合成並利用HPLC純化至純度大於(>)95%(經質譜法確認)。抑制用胜肽序列係衍生自GBRL2的H1(LEHRCVESAKIRAK，如SEQ ID NO：11所示)、 H2(VAQFMWIIRKR，如SEQ ID NO：1所示)及H3(MGQLYEKE，如SEQ ID NO：12所示)。H2胜肽以N端共軛至TAT穿膜結構域(YGRKKRRQRRR，如SEQ ID NO：2所示)，中間插入GGS連接子，以增加可撓性。所有胜肽以N端乙醯化(N-terminal acetylation)及C端醯胺化(C-terminal amidation)予以修飾，以增加其穩定性。合成的胜肽溶解於DMSO，並儲存於-20℃備用。
1.2 利用GATE16-PLA2受質測定ATG4活性
報導基因分析係修改自先前的報告。簡言之，將重組ATG4A或ATG4B與100nM之GBRL2-PLA2融合蛋白混合在20μL之PLA2反應緩衝液中，其中PLA2反應緩衝液含有20mM的Tris-HCl(pH 8.0)、2mM的CaCl2、1mM的DTT及20μM的2-(6-(7-硝基苯-2-氧雜-1,3-二唑-4-基)胺基)己醯基-1-十六烷醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼[2-(6-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)hexanoyl-1-hexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，NBD-C6-HPC](Invitrogen，N-3786)。利用市售冷光測讀分析儀(例如Fluoroskan Ascent FL Reader，Thermo Fisher Scientific)在30-60分鐘內檢測室溫的冷光強度，其中激發波長與放射波長分別為485nm及530nm。利用一系列的進度曲線進行非線性回歸擬合(nonlinear regression fitting)，判定上述胜肽對GBRL2-PLA2的IC50。
1.3 例行維持的細胞培養
癌細胞株係購自於美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection)，上述細胞於添加熱不活化胎牛血清(heat-inactivated fetal bovine serum，Biological Industries，Kibbutz Beit-Haemek，Israel)、100U/mL盤尼西林(penicillin，Invitrogen-Gibco,Carlsbad,USA)及100μg/mL鏈黴素(streptomycin，Invitrogen-Gibco，Carlsbad，USA)之DMEM/F12(Invitrogen-Gibco，Carlsbad，USA)中，在37℃且含有5% CO2的加濕氣氛中培養。上述細胞在市售細胞培養處理的塑膠培養盤(Corning公司，USA)中生長。
1.4 細胞轉染及穩定篩選
為了進行暫時性的基因減弱，在5nM混合亂序siRNA(pooled scramble siRNA，亦即將所選的siRNA序列打亂並混合)或抗ATG4B之siRNA(ambion)的存在下，利用市售轉染試劑(例如RNAiMAX，Life technologies)轉染細胞。為了產生穩定沉默細胞株(stable silenced cell line)，利用市售轉染試劑(例如Lipofectamine 2000，Life technologies)，將含有冷光酶表現基因之慢病毒載體轉染HEK293FT細胞，二天後收集含有病毒顆粒的上清液。 上清液過濾後感染癌細胞，並利用1-3μg/mL嘌呤黴素(puromycin)進行挑選。每隔2-3天更換新鮮含有嘌呤黴素之培養液並培養至少2週，以獲得穩定表現冷光酶之癌細胞株。
1.5 MAP1LC3-Luc切割性分析以監控HEK293T之ATG4s活性
將HEK293T細胞種入384-孔白色細胞培養盤的各孔中，利用質體MAP1LC3 wt-Luc或MAP1LC3 G120A-Luc(作為標準化控制組，normalization control)轉染HEK293T細胞(2000細胞/40μL)至隔夜。上述細胞經ATG4抑制劑處理8小時或16小時後，每孔加入200μM D-冷光素(D-luciferin，Promega)，以監測冷光酶的活性，藉此反映細胞中ATG4的活性。在將ATG4B基因減弱48小時之後，蛋白質含量顯著降低，48小時及72小時監控所得之冷光訊號(RLU)可做為陽性控制組。以ATG4B沉默之RLU淨值作為閾值，藉此評估這些抑制劑對細胞內ATG4活性的效果。
1.6 細胞球培養及存活/死亡分析
胰蛋白酶處理後的細胞再懸浮於含2% FBS之PBS，以進行細胞計數。上述細胞(4000細胞/孔)種入24孔奈米細胞培養盤(1.9cm2,SCIVAX Corporation,Kanagawa,Japan)，以腫瘤球培養液[含有升級版DMEM-F12(advanced DMEM-F12，Gibco)、2mmol/L之左旋麩醯胺酸(L-glutamine)、 100Unit/mL之盤尼西林(penicillin)以及鏈黴素(streptomycin)、N2添加物(N2 supplement，Gibco)、20ng/mL之表皮生長因子(epidermal growth factor，R&D)以及10ng/mL之纖維母細胞生長因子(fibroblast growth factor-basic，R&D)]培養並生長7天，以形成球狀細胞體。利用市售的冷光細胞活性分析組(3D CellTiter Glo Assay，Promega)檢測細胞球存活率。另一種方式，每隔1天利用鈣黃綠素AM(Calcein AM，1μM)以及溴乙啡錠二聚體(Ethidium homodimer-1，EthD-1，2μM)(市售的細胞存活分析組，例如LIVE/DEAD® Viability/Cytotoxicity Kit，ThermoFisher Scientific)對存活及死亡的球狀細胞體染色30分鐘。利用螢光顯微鏡拍攝存活(呈綠色)或死亡(呈紅色)的球狀細胞體之影像，並利用市售螢光/化學發光分析儀(例如Fluoroskan Ascent FL reader，Thermo Fisher Scientific)，分別以485nm之激發波長以及530nm(偵測鈣黃綠素AM)與645nm(偵測EthD-1)之放射波長進行定量。
1.7 異體移植小鼠模式
異體移植的模式係選用年齡匹配的雌性裸鼠(6-8週齡)分析腫瘤生長及轉移。所有動物實驗業經實驗動物照護與使用委員會(Institutional Animal Care and Use Committee，IACUC)的審查通過。將表現冷光酶之HCT116細胞(2×106細胞懸浮於0.05mL之 PBS中)與基底膜凝膠(Matrigel)以1：1比例混合後，由皮下注入小鼠(n=5隻/組別)。每隔一天，將PBS或胜肽經由腫瘤內(5mg/kg)或腹腔內(50mg/kg)注射施予小鼠。每週一次經由腹腔內注射D-冷光素(D-luciferin，150mg/kg)施予小鼠，再利用非侵入式影像系統(non-invasive imaging system，例如Xenogen IVIS-200 system)監測。所有數值是來自於選定區域(defined region)內，相較於控制組小鼠，原發性(primary)腫瘤的冷光強度。
1.8 統計分析
除非另外指明，所有數值係由至少三次重複實驗的平均值±標準誤差(standard error of mean，SEM)表示。上述結果是由司徒頓t檢定所得，且統計顯著性設定為p<0.05。*p<0.05；**p<0.01。
實施例2：評估TAT-GBRL2胜肽對癌症的抗癌效果
在各種癌症中，ATG4與腫瘤發生為高度相關且預後不佳。將ATG4B基因沉默，亦可減少癌細胞增殖、轉移及侵襲。α-螺旋(α-helix)對於蛋白-蛋白之交互作用至關重要。圖1係繪示根據本發明數個實施例的人類ATG8直系同源體(orthologs)的蛋白質序列比對結果，其中人類ATG8直系同源體包括MAP1LC3(MLP3A、MLP3B、MLP3C)及GBR(GBR、GBRL1、GBRL2) 次家族。分析ATG4受質GBRL2的結構，發現GBRL2蛋白結構中具有三個α-螺旋區(圖1)。六個ATG4受質之序列比對結果指出，α-螺旋區(H1、H2及H3)與其中二群(GBR/GBRL1及MAP1LC3A/MAP1LC3B)的序列幾乎一致，而根據蛋白序列譜系圖更顯示，上述α-螺旋區(H1、H2及H3)與這二群(GBR/GBRL1及MAP1LC3A/MAP1LC3B)的家族樹比較接近(結果未顯示)。其他ATG受質則在序列中存在一些差異(圖1)。GBRL2是ATG4A與ATG4B的共同受質。因此，為了檢驗由GBRL2衍生之α-螺旋狀胜肽對ATG4蛋白水解活性的效果，首先測試上述攜帶ATG4報導基因的三種GBRL2-PLA2胜肽。以EDTA做為正控制組，所有α-螺旋狀胜肽(H1、H2及H3)顯示對ATG4A與ATG4B之蛋白水解活性都具有抑制效果，在報導基因分析中，其中又以H2胜肽呈現的IC50較低(圖2A至圖2C)。其次，H2胜肽不影響細胞凋亡酶-3(caspase-3，屬於另一群的半胱胺酸蛋白酶)的活性(圖2C)，推測H2螺旋狀胜肽或許能選擇性地干擾ATG4的活性。
再者，利用GABARAL2嵌合受質來測試不同ATG4受質的H2螺旋狀胜肽對ATG4B活性的影響，其中GABARAL2嵌合受質包含N端的C-myc標籤以及C端的S標籤(圖3A)。相較於控制組，對於帶有全長C-myc標籤之GBRL2與帶有切割後C-myc標籤的GBRL2所殘留的S標籤以及二者之比例進行定量，以判斷上述胜肽 在GBRL2的方面，對於ATG4B蛋白水解活性的抑制效果。來自MAP1LC3B、MAP1LC3C、GBR及GBRL2的H2胜肽以劑量依存方式抑制ATG4B切割活性，而來自MAP1LC3B與GBRL2的H2胜肽對ATG4B的抑制活性較強(圖3A)。因此，後續係選用GBRL2衍生的H2胜肽(GBRL2)進行以下實驗。
為了進一步研究GBRL2胜肽在細胞中的效果，上述胜肽係利用FITC標定，並與或未與TAT1細胞穿透胜肽(cell penetration peptide)融合。人類膠質母細胞瘤(glioblastoma)H4細胞及大腸直腸癌HCT116細胞以FITC標定胜肽處理後，利用流式細胞法(flow cytometry)分析FITC陽性細胞的比例(圖3B)。相較於TAT胜肽或GBRL2胜肽，TAT-GBRL2胜肽較易穿透H4細胞及HCT116細胞之細胞膜。以ATG4B沉默(silencer)的細胞組作為陽性控制組(圖3C)，表現ATG4切割性冷光酶的細胞可用於檢驗胜肽對細胞的ATG4活性之效果。GBRL2胜肽及TAT-GBRL2胜肽提高了細胞的冷光酶活性，表示可抑制細胞的ATG4。此外，以上述胜肽處理的癌細胞，在自噬抑制劑(autophagy inhibitor)BafA1存在或不存在下，判斷對MAP1LC3自噬流的影響(結果未顯示)。相較於TAT胜肽，TAT-GBRL2胜肽可顯著減少癌細胞中的MAP1LC3自噬流。
既然ATG4對於癌細胞存活率及轉移特性(例如 移行及侵襲)而言可能是必須的，利用上述胜肽處理H4細胞及HCT116細胞，以判斷上述胜肽對癌細胞的短期及長期效應(圖4A至圖4B)。TAT-GBRL2胜肽以劑量依存方式顯著減少H4細胞及HCT116細胞之細胞存活率，而TAT胜肽及GBRL2胜肽對於癌細胞存活率影響則無或不大(結果未顯示)。同樣地，碘化丙啶(propidium iodide，PI)攝取的結果顯示，TAT-GBRL2胜肽明顯提高H4細胞及HCT116細胞之PI陽性比例(結果未顯示)。GBRL2胜肽稍微增加PI陽性細胞，但TAT胜肽對於癌細胞攝取PI則無影響，暗示GBRL2胜肽及TAT-GBRL2胜肽可誘導癌細胞死亡。一致地，細胞群落分析(clonogenic assay)的結果指出，GBRL2胜肽及TAT-GBRL2胜肽長期處理後可減少細胞群落形成(圖4A及圖4B)。
此外，在癌細胞存活的角色中，ATG4在癌症轉移過程扮演關鍵性的角色。胜肽處理後的人類膠質母細胞瘤H4細胞及大腸直腸癌HCT116細胞進行細胞移行分析。高劑量(20μM)的TAT-GBRL2胜肽可抑制癌細胞移行，但以TAT胜肽及GBRL2胜肽處理的細胞移行則無改變(結果未顯示)。其次，GBRL2胜肽與TAT-GBRL2胜肽可顯著減少侵襲的HCT116細胞(圖5A及圖5B)。
此外，為了模擬癌細胞在體內複雜的本質，利用腫瘤球培養以初步檢驗胜肽對腫瘤的抑制效果。培養 HCT116細胞形成腫瘤球，並利用TAT胜肽、GBRL2胜肽及TAT-GBRL2胜肽處理(圖6A至圖6D)。結果發現，TAT-GBRL2胜肽可顯著減少腫瘤球的存活率並增加死亡細胞數。此外，將表現冷光酶的HCT116細胞異種移植至小鼠，以利用市售生物螢冷光影像IVIS系統(biolumineseent imaging IVIS system)評估TAT-GBRL2胜肽對活體內腫瘤生長的效果(圖6E)。同時由腫瘤內注射及腹腔內注射TAT-GBRL2胜肽可顯著減少活體內腫瘤生長(圖6F)。綜言之，上述結果指出TAT-GBRL2胜肽可望有潛力做為ATG4抑制劑及腫瘤阻遏劑。
討論
ATG4為自噬作用及正常生理中所需的半胱胺酸蛋白酶(cysteine protease)。不過，ATG4過量表現與癌症的增生及惡化呈現高度相關。ATG4的RNAi及小分子抑制劑也證明在不同癌細胞中具有抗腫瘤效果。然而，上述胜肽對ATG4及癌症的效果，則所知不多。相關結果如下所述。首先，ATG8哺乳類同系物(homologues)衍生的α-螺旋狀胜肽可抑制ATG4蛋白水解活性，特別是由GBRL2及MAP1LC3B衍生的H2胜肽。第二，與TAT1融合的GBRL2胜肽可顯著抑制細胞的ATG4及自噬流(autophagic flux)。第三，相較於GBRL2胜肽，TAT-GBRL2胜肽對癌細胞之存活及轉移的特性具有較強的抑制效果。第四，TAT-GBRL2胜肽減少異種 移植小鼠之腫瘤球形成及腫瘤生長。因此，上述結果可提供由GBRL2衍生新穎的TAT-GBRL2胜肽作為ATG4抑制劑及抗癌劑。
自噬在許多疾病中扮演重要的角色，特別是在癌症發展中。越來越多報告已顯示，自噬有助於癌症的惡化及幹細胞性(stemness)。舉例而言，I)對多種癌症類型進行基因突變的大量篩選結果顯示，多數癌症類型之自噬相關的(autophagy-related，ATG)基因表現沒有變化且沒有突變，暗示癌細胞中的ATG基因是活化的；II)人類shRNA資料庫之高通量篩選結果顯示，ATG4A對於腫瘤球形成是必須的；III)在異種移植小鼠模式中，ATG6哺乳類同系物BECN1可促進癌幹細胞(cancer stem cells，CSCs)存活及腫瘤形成；IV)自噬缺陷(autophagy deficiency)會減少骨肉瘤(osteosarcoma)的CSCs並提高化學敏感性；V)ATG7-缺陷會使T細胞活化，以抑制大腸直腸癌；VI)相較於只進行ATG7基因剔除之癌細胞，將ATG7系統性基因剔除對於Kras驅動的癌細胞之腫瘤形成的抑制效果較強，意味著自噬作用不僅促使腫瘤細胞存活，更有助於形成腫瘤微環境。這些結果也提供了一種新穎的自噬抑制胜肽，以抑制腫瘤。
綜言之，以上特定的胜肽、特定的劑量、特定的處理方式、特定的分析模式或特定的評估方法僅為例示說明本發明之單離胜肽、含彼之醫藥組成物及其用於製備專 一性減少或抑制癌細胞活性之醫藥組成物的用途。然而，正如本發明所屬技術領域具有通常知識者所理解，在不脫離本發明之精神和範圍內，本發明之單離胜肽、含彼之醫藥組成物及其用於製備專一性減少或抑制癌細胞活性之醫藥組成物的用途亦可使用其他與TAT-GBRL2類似的胜肽、其他的劑量、其他的處理方式、其他的分析模式或其他的評估方法，並不限於以上所述。
根據本發明上述實施例，本發明之單離胜肽、含彼之醫藥組成物及其用於製備專一性減少或抑制癌細胞活性之醫藥組成物的用途，其係將TAT-GBRL2胜肽投予具有癌症的對象，可專一性減少或抑制癌細胞活性。
雖然本發明已以數個特定實施例揭露如上，但可對前述揭露內容進行各種潤飾、各種更動及替換，而且應可理解的是，在不脫離本發明之精神和範圍內，某些情況將採用本發明實施例之某些特徵但不對應使用其他特徵。因此，本發明的精神和權利要求範圍不應限於以上例示實施例所述。
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<110> 國立中山大學
<120> 單離胜肽、含彼之醫藥組成物及其用於製備專一性減少或抑制癌細胞活性之醫藥組成物的用途
<130> 無
<150> US17/096,463
<151> 2020-11-12
<160> 12
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GABARAPL2 H2結構域
<400> 1
Figure 110105356-A0305-02-0032-1
<210> 2
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HIV-1 TAT鹼性結構域
<400> 2
Figure 110105356-A0305-02-0032-2
<210> 3
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胜肽連接子
<400> 3
Figure 110105356-A0305-02-0033-3
<210> 4
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胜肽連接子
<400> 4
Figure 110105356-A0305-02-0033-4
<210> 5
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胜肽連接子
<400> 5
Figure 110105356-A0305-02-0033-6
<210> 6
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胜肽連接子
<400> 6
Figure 110105356-A0305-02-0033-7
<210> 7
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胜肽連接子
<400> 7
Figure 110105356-A0305-02-0033-8
<210> 8
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胜肽連接子
<400> 8
Figure 110105356-A0305-02-0034-9
<210> 9
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胜肽連接子
<400> 9
Figure 110105356-A0305-02-0034-10
<210> 10
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TAT-GBL2胜肽
<400> 10
Figure 110105356-A0305-02-0034-11
<210> 11
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GABARAPL2 H1結構域
<400> 11
Figure 110105356-A0305-02-0035-12
<210> 12
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GABARAPL2 H3結構域
<400> 12
Figure 110105356-A0305-02-0035-13

Claims (9)

  1. 一種單離胜肽，包含一第一型人類免疫缺乏病毒TAT(HIV-1 TAT)鹼性結構域共軛至一γ-胺基丁酸受體相關樣蛋白2 α-螺旋2(GABARAPL2 H2)結構域，其中該GABARAPL2 H2結構域是由如序列辨識編號(SEQ ID NO)：1所示之序列組成，且該HIV-1 TAT鹼性結構域是由如SEQ ID NO：2所示之序列組成。
  2. 如請求項1所述之單離胜肽，更包含一胜肽連接子插設於該HIV-1 TAT鹼性結構域與該GABARAPL2 H2結構域之間，且該胜肽連接子包含一富含甘胺酸胜肽、一富含甘胺酸/絲胺酸(Gly/Ser)胜肽或一富含甘胺酸/丙胺酸(Gly/Ala)胜肽。
  3. 如請求項2所述之單離胜肽，其中該胜肽連接子包含一序列，且該序列是選自於由如SEQ ID NOs：3至9所示之複數個胺基酸序列所組成之一族群。
  4. 如請求項2所述之單離胜肽，其中該單離胜肽是由如SEQ ID NO：10所示之一胺基酸序列組成。
  5. 一種抗癌醫藥組成物，包含在一醫藥學上可接受之賦形劑中含有一單離胜肽，其中該單離胜肽為一有效成分，且該單離胜肽是由如SEQ ID NO：10所示之一 胺基酸序列組成。
  6. 一種單離胜肽用於製備專一性減少或抑制癌細胞活性之醫藥組成物的用途，包含：向有需要之一對象投予一醫藥組成物，該醫藥組成物包含一醫藥學有效劑量之一單離胜肽，且該單離胜肽是如SEQ ID NO：10所示之一胺基酸序列。
  7. 如請求項6所述之單離胜肽用於製備專一性減少或抑制癌細胞活性之醫藥組成物的用途，其中該單離胜肽具有專一性減少或抑制該對象之複數個癌細胞之一活性。
  8. 如請求項7所述之單離胜肽用於製備專一性減少或抑制癌細胞活性之醫藥組成物的用途，其中該些癌細胞之一種類是選自於由大腸直腸癌、膠質母細胞瘤、口腔癌、肝細胞癌、乳癌、前列腺癌及肺癌所組成之一族群。
  9. 如請求項7所述之單離胜肽用於製備專一性減少或抑制癌細胞活性之醫藥組成物的用途，其中該些癌細胞之該活性是選自於由ATG4蛋白水解活性、細胞移行、侵襲及幹細胞性(stemneas)所組成之一族群。
TW110105356A 2020-11-12 2021-02-17 單離胜肽、含彼之醫藥組成物及其用於製備專一性減少或抑制癌細胞活性之醫藥組成物的用途 TWI783378B (zh)

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