TWI763714B - 緩解發炎之tn疫苗及方法 - Google Patents

Abstract

本發明發展一疫苗組合物，其可對抗及治療或預防發炎及肺損傷(特別係高氧誘發的肺損傷)以及齒根骨膜炎之進展。TN免疫增加血清抗-Tn抗體之效價，並使灌洗的蛋白質及細胞因子減少，且也減小肺損傷的平均線性截距及肺損傷評分。此外，所述肺損傷的改善伴隨NF-κB的活性降低。

Description

緩解發炎之TN疫苗及方法

本發明涉及治療發炎相關疾病的領域。詳言之，本發明涉及使用Tn免疫原減少細胞因子及治療發炎相關疾病。

Tn抗原(GalNAc-a-O-Ser/Thr)是一種黏蛋白型O連接的聚糖，是公認的細胞表面的腫瘤標記物，且其含量升高與癌症進展及預後相關。Tn抗原被發現係通過抑制糖基化的進一步延伸而在各種癌症中異常過度表達。先前研究亦已闡釋T-合成酶核心1 β3-Gal-T特異性分子伴隨蛋白(core 1 β3-Gal-T-specific molecular chaperone，Cosmc)的受質特異性及特異性分子伴隨蛋白。因此，缺陷性T-合成酶或減少的Cosmc表達可預防黏蛋白的O連接的糖基化延伸，從而明顯增加Tn抗原的表達。當O連接的糖基化的進一步延伸受阻時，Tn抗原亦可通過α-2,6-唾液酸基轉移酶用唾液酸殘基進一步修飾以產生唾液酸基Tn(NeuAca6GalNAc-Ser/Thr，sTn)。US 20030170249及US20070275019提供一種疫苗，其包含：(a)醫藥學上有效量的在這些癌細胞上存在的碳水化合物抗原或其模擬物；及(b)醫藥學上可接受的載劑。該碳水化合物抗原可為Tn或唾液酸基-Tn。US 20100278818提供一種醫藥組合物，其包含針對Tn抗原的抗體。 US8,383,767發現醣抗原Tn、sTn或GM3與含有免疫球蛋白(Ig)Fc結構域及富含半胱胺酸的結構域的蛋白質載體偶合提高其抗原性。Chiang等人已研發出一種抗Tn疫苗，其在小鼠中使用線性陣列抗原決定基技術以高特異性及高親和力誘導抗Tn抗體(H.L.Chiang,C.Y.Lin,F.D.Jan,Y.S.Lin,C.T.Hsu,J.Whang-Peng,L.F.Liu,S.Nieh,C.C.Lin,J.Hwang,A novel synthetic bipartite carrier protein for developing glycotope-based vaccines.Vaccine 30(2012)7573-7581)。

亦報導Tn在發炎組織中升高；Tn的表達與組織損傷時的發炎反應程度相關聯。舉例而言，Tn症候群的特徵在於在所有譜系的血細胞上均偵測到Tn抗原。在一些IgA腎病患者中可在IgA1鉸鏈區上偵測到Tn抗原。另外，已知Tn在例如來自類風濕性關節炎及骨關節炎患者的發炎組織的慢性發炎組織中表達。已在發炎造成的組織損傷中觀測到升高的Tn表達，且認為此與宿主免疫反應的調節相關。

高氧增加胎兒及成人肺纖維母細胞中的NF-κB易位以及促炎性介體的產生，這些介體諸如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、干擾素-γ及介白素-1β(IL-1β)(H.D.Li,Q.X.Zhang,Z.Mao,X.J.Xu,N.Y.Li,H.Zhang,Exogenous interleukin-10 attenuates hyperoxia-induced acute lung injury in mice.Exp.Physiol.100(2015)331-330；及C.J.Wright,P.A.Dennery,Manipulation of gene expression by oxygen：a primer from bedside to bench.Pediatr.Res.66(2009)3-10)。長期暴露於高氧導致發炎及急性肺損傷。迄今為止，尚未建立有效療法。

本發明提供一種單劑疫苗，其每劑包含約0.02mg(優選為約0.1mg) 至約2mg的Tn免疫原及佐劑溶液，所述Tn免疫原及佐劑溶液的比例為約0.5至約2(v/v)：約0.5至約2(v/v)。在一具體實施例中，Tn免疫原及佐劑溶液的比例為約1(v/v)：約1(v/v)。

本發明提供一種單劑疫苗於個體誘導免疫反應以治療或預防發炎疾病的方法，其包含投與單劑疫苗至個體，該單劑疫苗包含約0.1mg至約2mg的Tn免疫原。

本發明亦提供一種單劑疫苗於個體誘導免疫反應以治療或預防發炎疾病的方法，其包含投與每劑包含約0.1mg至約2mg的Tn免疫原單劑疫苗至個體，以兩週一次的時間間隔投藥至少四次。在一個實施例中，所述方法進一步包含在第四次免疫接種後的一週後進行額外免疫接種。在一具體實施例中，該額外免疫接種可在最後免疫接種後進行一或多次。

所述發炎疾病是齒根骨膜炎的進展、器官損傷或器官纖維化。在一個實施例中，器官損傷是肺損傷、腎損傷或肝損傷。在另一實施例中，該肺損傷是高氧誘發的肺損傷。

本發明的方法可減少細胞或個體中白細胞介素-6(IL-6)及TNF-α的量或降低NF-κB的活性。根據本發明，細胞或個體具有升高的Tn表達且Tn表達由TNF-α及IL-6上調。此外，升高的Tn含量通常由細胞因子-Cosmc信號傳導軸調控。

所述Tn免疫原可與載體多肽以約3至約8：約1的重量比結合。載體蛋白是抗原呈現細胞(APC)結合域或富含半胱胺酸的結構域。在一些實施例中，富含半胱胺酸的結構域含有6個半胱胺酸(SEQ ID NO：1)殘基；優選地，富含半胱胺酸的結構域具有Pro-Cys-Cys-Gly-Cys-Cys-Gly-Cys-Gly-Cys(SEQ ID NO：2)的胺基酸序列。在另一其他實施例中，該富含半胱胺 酸的結構域含有所述胺基酸序列的2至30個重複序列。

該Tn免疫原是經O-連接至絲胺酸或蘇胺酸的N-乙醯基半乳糖胺。該Tn免疫原在約0.2mL至約2mL佐劑存在下投與。該Tn免疫原以約0.1mg至約2mg範圍內的劑量投與。根據本發明的方法的Tn免疫原投與可產生具有高血清效價的抗Tn抗體。

圖1(A)及1(B)展示在免疫接種前後抗Tn抗體的血清效價。所有小鼠中在免疫接種之前(預先)抗Tn抗體的含量低。(A)接受載體蛋白的小鼠發展低血清Tn抗體效價且(B)接受Tn免疫接種的小鼠在第一次免疫接種後發展高血清抗體效價(621)且在第二次免疫接種後保持高效價(628)。

圖2展示小鼠犧牲時的體重。暴露於室內空氣及高氧的小鼠均存活。犧牲時，在富含O₂的氛圍中飼養的小鼠展示體重顯著低於在室內空氣(RA)中飼養的小鼠(***P<0.001)。

圖3(A)至3(C)展示支氣管肺泡灌洗液(BALF)蛋白質及細胞因子含量。(A、B)用載體蛋白或Tn疫苗處理且暴露於高氧的小鼠展示BALF中顯著高於暴露於室內空氣(RA)的小鼠的總蛋白質及IL-6含量(**P<0.01及***P<0.001)。Tn免疫接種顯著減少高氧誘發的IL-6含量增加(***P<0.001)。(C)用載體蛋白處理且暴露於高氧的小鼠顯示BALF中顯著高於暴露於RA的小鼠的TNF-α含量(**P<0.01)。Tn免疫接種減少高氧誘發的TNF-α含量增加。

圖4(A)至4(C)展示用載體蛋白或Tn疫苗處理且暴露於RA或高氧的小鼠中的(A)代表性組織學、(B)肺損傷評分及(C)平均線性截距(MLI)。與用載體蛋白或Tn疫苗處理且暴露於RA的小鼠相比，用載體蛋白處理且暴露 於高氧的小鼠顯示顯著更高的肺損傷評分及MLI(***P<0.001)。Tn免疫接種顯著減少高氧誘發的肺損傷評分及MLI增加(***P<0.001)。

圖5(A)至5(C)展示(A)代表性西方墨點及(B)使用密度測定法針對核因子-κB(NF-κB)測定的定量數據及(C)肺組織中的胞溶質磷酸化-I-κBα。與用載體蛋白或Tn疫苗處理且暴露於RA的小鼠相比，用載體蛋白處理且暴露於高氧的小鼠展示顯著更高的核NF-κB p65及胞溶質磷酸化IκBα含量(*P<0.05)。用Tn疫苗處理顯著減少高氧誘發的核NF-κB p65及胞溶質磷酸化IκBα增加(*P<0.05)。

圖6A至6C展示發炎組織及細胞中Tn含量上調。(A)發炎組織(上圖)及正常組織(下圖)中Tn抗原的免疫組織化學分析。動脈粥樣硬化主動脈(左圖；標記主動脈)、支氣管炎組織(中圖；標記支氣管)及齒根骨膜炎組織(右圖；標記齒齦)中的Tn染色。棕色表示Tn抗原表達。(B)使用來自經LPS(脂多醣，lipopolysaccharide)(0、10、30及100ng/ml；24小時)刺激的U937細胞的條件培養基處理HGF，24小時後，使用純化的兔抗Tn抗體(紅色)及DAPI(藍色)染色。(C)使用LPS(0、10、30及100ng/ml)處理U937細胞24小時，通過ELISA分析TNF-α、IL-6及IL-1β的分泌。原始放大倍數(100倍)。比例尺，50μm。

圖7展示促炎性細胞因子TNF-α及IL-6上調HGF中的Tn含量。A.促炎性細胞因子對HGF中的Tn表達的影響。使用濃度為0、10、30及100ng/ml的純化的TNF-α、IL-6及IL-1β處理HGF，24小時後，使用經純化的兔抗Tn抗體(紅色)及DAPI(藍色)染色。原始放大倍數(100倍)；比例尺，50μm。B. TNF-α處理後HGF中的Tn表達的時程分析。使用濃度為30ng/ml的純化的TNF-α處理HGF，4、8、12、24及48小時後，使用純化的 兔抗Tn抗體(紅色)及DAPI(藍色)染色(放大倍數630倍；比例尺，50μm)。實驗重複至少三次。

圖8A至8D展示TNF-α上調Tn含量是經由下調HGF中的COSMC基因。A. TNF-α及去甲基化劑(5-氮雜-dC)對HGF中COSMC及T-合成酶的mRNA表達的影響。採用qPCR分析經TNF-α及5-氮雜-dC處理的HGF中之COSMC及T-合成酶mRNA表達。COSMC及T-合成酶的mRNA表達相對於GAPDH校正且進行統計學分析。(*：與僅TNF-α相比p<0.05)。根據△△CT法，進行相對基因表達的計算(相對於GAPDH參考基因校正)。通過熔融溫度分析來測定PCR反應的保真度。B.西方墨點法用於分析在TNF-α處理6小時及24小時後Cosmc及T-合成酶的蛋白質含量。C.及D. HGF用純化的TNF-α處理6小時或24小時且接著用抗Cosmc(紅色)及抗T-合成酶抗體(綠色)及DAPI(藍色)進行免疫螢光染色。原始放大倍數(100倍)；比例尺，50μm。

圖9A及9B展示TNF-α誘發的COSMC基因高甲基化及Tn表達可由去甲基化劑(5-氮雜-dC)抑制。A. TNF-α及去甲基化劑對HGF中COSMC基因的甲基化程度的作用。甲基化改變的比較是在用或未用TNF-α及去甲基化劑處理的HGF中。UCSC基因組瀏覽器說明COSMC的取向及第一外顯子(藍條)、GC百分比(黑色比例尺)、CpG島(綠條)及亞硫酸氫鹽焦磷酸測序的測序區域(COSMC_py02，黑條)。紅色圓圈展示CG島，且黑色顯示甲基化程度。B. HGF用純化的TNF-α及不同濃度的5-氮雜-dC(0、1、2及5μM)共同處理24小時且接著用兔抗Tn抗體(紅色)及DAPI(藍色)進行免疫螢光染色。放大倍數630倍；比例尺，50μm。

下文參考用於說明的實例應用來描述本發明的若干態樣。應瞭解，闡述眾多特定細節、關係及方法以提供對本發明的充分理解。然而，一般熟習此項技術者將易於認識到，可在無一或多個特定細節的情況下或通過其他方法來實踐本發明。本發明不受動作或事件的所說明次序限制，這是因為一些動作可按不同次序發生及/或可與其他動作或事件同時發生。

本文中所使用的術語僅用於達成描述特定實施例的目的，且並不意欲限制本發明。除非上下文以其他方式清楚地指示，否則如本文中所使用，單數形式「一(a)」、「一(an)」及「所述」意欲包括複數形式。

如本文中所使用，如本文所用的術語「表達」定義為特定核苷酸序列由其啟動子驅動的轉錄及/或轉譯。

如本文中所使用，如本文所用的術語「啟動子」定義為起始聚核苷酸序列的特異性轉錄所需的由細胞的合成機制或引入的合成機制識別的DNA序列。

如本文中所使用，如本文所用的術語「抗原」或「Ag」定義為引起免疫反應的分子。此免疫反應可涉及抗體產生或特異性免疫勝任細胞的活化或兩者。熟習此項技術者應瞭解，包括幾乎所有蛋白質或肽的任何大分子均可充當抗原。

如本文中所使用，「Tn抗原」表示GalNAca-O-Ser/Thr，亦即其中GalNAc殘基直接經α連接至在細胞內或在細胞表面上表達的多肽鏈的絲胺酸或蘇胺酸殘基的羥基的抗原。

如本文中所使用，如本文所用的術語「抗體」是指特異性結合抗原的免疫球蛋白分子。抗體可為來源於天然來源或來源於重組來源的完整免疫球蛋白且可為完整免疫球蛋白的免疫反應部分。抗體通常為免疫球蛋白 分子的四聚體。本發明中的抗體可呈多種形式存在，包括例如多株抗體、單株抗體、Fv、Fab及F(ab)₂以及單鏈抗體、人類抗體及人類化抗體。

如本文中所使用，術語「多株抗體」是指包括針對一種抗原或多種抗原內相同及/或不同抗原決定基的多種不同抗體的抗體群體。

如本文中所使用，術語「單株抗體」是指自均質或基本上均質抗體的群體獲得的抗體。術語「單株」不限於任何用於製造抗體的特定方法。一般而言，單株抗體的群體可由細胞、細胞群體或細胞株產生。

如本文所使用，術語「患者」、「個體(subject)」、「個體(individual)」及其類似術語在本文中可互換使用，且是指可進行本文所述的方法的任何動物或其細胞，無論活體外或是原位。在某些非限制性實施例中，患者、個體(subject)或個體(individual)為人類。

如本文中所使用，如本文所用的術語「免疫球蛋白」或「Ig」定義為充當抗體的一類蛋白質。由B細胞表達的抗體有時稱作BCR(B細胞受體)或抗原受體。此類蛋白質中包括的五個成員為IgA、IgG、IgM、IgD及IgE。IgA是存在於諸如唾液、淚液、母乳、胃腸道分泌物及呼吸道及泌尿生殖道的黏液分泌物的身體分泌物中的初級抗體。IgG是最常見的循環抗體。IgM為在大部分個體中主要免疫反應中產生的主要免疫球蛋白。其為凝集、補體結合及其他抗體反應中最有效的免疫球蛋白，且對於防禦細菌及病毒具有重要意義。IgD雖為無已知的抗體功能的免疫球蛋白，但可充當抗原受體。IgE是通過在暴露於過敏原時引起介體自肥大細胞及嗜鹼細胞釋放來介導速發超敏反應的免疫球蛋白。

如本文中所使用，「疫苗」為包含抗原的免疫原組合物，當投藥至個體，誘導或刺激或引發細胞或體液對疫苗抗原的免疫反應。疫苗可含有 對個體產生較加強免疫反應的佐劑。

如本文中所使用，「佐劑」為用於與抗原或抗原組合結合的物質以產生較抗原或抗原組合單獨為強的免疫反應。

如本文中所使用，「刺激免疫反應」、「誘導免疫反應」及「引發免疫反應」除非另有所述，在本文中可交替使用，其包括，但不限於，誘導、刺激或引發由個體免疫反應介導的治療或預防效果。

如本文中所使用，「有效量」意謂提供治療或預防益處的量。

Tn抗原進行疫苗接種抑制NF-κB活性，且經由Tn免疫接種誘導的抗Tn抗體的作用抑制發炎。本發明疫苗組合物及方法可有效治療或預防發炎疾病。Tn免疫接種增加血清抗Tn抗體效價，同時其減少灌洗的蛋白質及細胞因子。本發明因此提出Tn免疫接種可減弱發炎相關的疾病及器官損傷。本發明發展一種抗發炎的疫苗組合物以及發炎與肺損傷(特別是高氧所致的肺損傷)以及牙周病進展的治療或預防。Tn免疫接種也減小肺損傷的平均線性截距及肺損傷評分。此外，肺損傷的改善伴隨NF-κB活性的降低。

在一個態樣中，本發明提供一種單劑疫苗，每劑包含約0.02mg(優選為約0.1mg)至約2mg的Tn免疫原及佐劑溶液，所述Tn免疫原及佐劑溶液的比例為約0.5至約2(v/v)：約0.5至約2(v/v)。在一具體實施例，Tn免疫原及佐劑溶液的比例為約1(v/v)：約1(v/v)。

在一些具體實施例，Tn免疫原的劑量範圍自約0.02mg至約0.1mg、約0.02mg至約0.05mg、約0.1mg至約1.5mg、約0.1mg至約1.2mg、約0.1mg至約1mg、約0.1mg至約0.8mg、約0.1mg至約0.5mg、約0.2mg至約1.5mg、約0.2mg至約1.2mg、約0.2mg至約1mg、約0.2mg至約 0.8mg、約0.2mg至約0.5mg、約0.5mg至約2mg、約0.5mg至約1.5mg、約0.5mg至約1.2mg、約0.5mg至約1mg、約0.5mg至約0.8mg、約1.0mg至約2mg。佐劑溶液的體積範圍自約0.2ml至約1ml、約0.2ml至約0.8ml或約0.2ml至約0.6ml。

在另一個態樣，本發明提供一種單劑疫苗於個體誘導免疫反應以治療或預防發炎疾病的方法，其中所述單劑疫苗包含約0.1mg至約2mg的Tn免疫原。

在一個態樣中，本發明提供一種單劑疫苗於個體誘導免疫反應以治療或預防發炎疾病的方法，其包含投與包含每劑約0.1mg至約2mg的Tn免疫原單劑疫苗至個體，以兩週一次的時間間隔投藥至少四次。在一個實施例中，所述方法進一步包含在第四次免疫接種後的一週後進行額外免疫接種約0.1mg至約2mg的Tn免疫原。在一具體實施例中，該額外免疫接種可在最後免疫接種後進行一或多次。

根據本發明方法的Tn免疫原投藥可產生較控制組高的血清效價的抗-Tn抗體。在一具體實施例中，所產生的抗-Tn抗體的血清效價較控制組高至少2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5或6倍。本文中所使用的「控制組」為載體多肽。

在一具體實施例中，Tn免疫接種降低細胞或個體中白細胞介素-6(IL-6)及TNF-α的量或降低NF-κB的活性。

在一具體實施例中，細胞或個體具有升高的Tn表達。在另一個實施例中，Tn表達由TNF-α及IL-6上調。在另一其他實施例中，升高的Tn含量通常由細胞因子-Cosmc信號傳導軸調控。

在一具體實施例中，所述發炎疾病是齒根骨膜炎(牙周病)的進展、器 官損傷或器官纖維化。在另一實施例中，器官損傷是肺損傷、腎損傷或肝損傷。在另一實施例中，肺損傷是高氧誘發的肺損傷。在另一實施例中，器官纖維化是肺纖維化、肝纖維化或腎纖維化。

在一具體實施例中，所述方法進一步包含在第四次免疫接種後的一週後進行額外免疫接種的步驟。

在一些具體實施例中，Tn免疫原可與載體多肽結合。該Tn免疫原及載體多肽是處於約3至約8：約1的重量比下；優選地，重量比為約5：約1。在一些實施例中，該多肽包括(但不限於)抗原呈現細胞(APC)結合域及富含半胱胺酸的結構域。在一些實施例中，APC結合域為免疫球蛋白(Ig)Fc片段或毒素的受體結合域。在另一實施例中，APC結合域為綠膿桿菌外毒素A(Pseudomonas exotoxin A)、破傷風毒素或霍亂毒素的受體結合域。在另一實施例中，APC結合域為人類Ig的Fc片段。在其他一些實施例中，該富含半胱胺酸的結構域含有10個胺基酸殘基的片段，其中至少3個為半胱胺酸殘基。在另一其他實施例中，富含半胱胺酸的結構域含有6個半胱胺酸(SEQ ID NO：1)殘基。優選地，富含半胱胺酸的結構域具有Pro-Cys-Cys-Gly-Cys-Cys-Gly-Cys-Gly-Cys(SEQ ID NO：2)的胺基酸序列。在另一其他實施例中，該富含半胱胺酸的結構域含有所述胺基酸序列的2至30個重複序列。優選地，該富含半胱胺酸的結構域含有所述胺基酸序列的7個重複序列。在另一實施例中，Tn經由連接子(如含有順丁烯二亞醯胺官能基的連接子；例如，N-順丁烯二亞醯胺(N-maleimide)或6-順丁烯二亞醯胺基己酸N-琥珀醯亞胺酯(N-succinimidyl-6-maleimidocaproate))連接於半胱胺酸殘基。優選地，Tn免疫原與載體多肽結合為Fc片段-7重複的Pro-Cys-Cys-Gly-Cys-Cys-Gly-Cys-Gly-Cys(SEQ ID NO：2)-N-順丁烯 二亞醯胺-Tn或Fc片段-7重複的Pro-Cys-Cys-Gly-Cys-Cys-Gly-Cys-Gly-Cys(SEQ ID NO：2)-6-順丁烯二亞醯胺基己酸N-琥珀醯亞胺酯-Tn。

在一個實施例中，Tn免疫原為經O-連接至絲胺酸或蘇胺酸的N-乙醯基半乳糖胺，其具有以下結構：

；R為絲胺酸或蘇胺酸。

在一具體實施例中，Tn免疫原在0.2ml至2ml佐劑存在下投與。在一些具體實施例中，該佐劑為氫氧化鋁、磷酸鋁、羥磷灰石、Bordetella pertussis死菌、Mycobacterium bovis死菌、類毒素、鯊烯、Quil A、皂素、IL-1、IL-2、IL-12、佛朗氏完全佐劑或佛朗氏不完全佐劑。在另一體實施例治中，佐劑為磷酸鋁。

包含本發明的Tn免疫原的醫藥組合物可投與已受發炎所苦的個體。在治療應用中，將組合物以足以引發針對所存在抗原的有效免疫反應及治癒或至少部分阻滯症狀及/或併發症的量投與患者。足以實現此量定義為「治療有效量」。對此用途有效量將視例如肽組成、投與方式、所治療的疾病的階段及嚴重程度、患者體重及整體健康狀態以及處方醫師的判斷而定。但初始免疫接種(用於治療性或預防性投與)的範圍一般為約0.1mg至約2mg的Tn免疫原，接著依照本文所描述之加強療程，為約0.1mg至約2mg的加強劑量的Tn免疫原。

所述用於治療的疫苗組合物意欲以非經腸、局部、經鼻、經口或局部投與。優選地，該醫藥組合物以非經腸投與，例如靜脈內、皮下、皮內或肌肉內投與。優選地，疫苗經肌肉內投與。本發明提供以非經腸投與的 組合物，其包含該疫苗組合物之溶液，該疫苗組合物溶解或懸浮於可接受的載劑(優選為水性載劑)。此等組合物可通過傳統習知的滅菌技術滅菌或可經無菌過濾。所得水溶液可封裝以按原樣使用，或凍乾，該經凍乾的製劑在投與之前與無菌溶液組合。所述組合物可含有為接近生理條件而需要的醫藥學上可接受的輔助物質，諸如pH調節劑及緩衝劑、張力調節劑、濕潤劑及其類似物，例如乙酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、脫水山梨糖醇單月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯等。

本文所提供本發明的實例，乃藉由實例例示，而非限制。

實例 材料與方法 動物

五週大雌性C57BL/6NCrlBltw小鼠得自BioLASCO Taiwan Co.,Ltd並置於無菌室。動物維持在約25℃並整個實驗隨意供應顆粒食物與水。實驗流程已由臺北醫學大學實驗動物照護及使用委員會核可(LAC-2016-0047)。

疫苗製備

疫苗的製備是將Tn接合至如先前研究所述(H.L.Chiang,C.Y.Lin,F.D.Jan,Y.S.Lin,C.T.Hsu,J.Whang-Peng,L.F.Liu,S.Nieh,C.C.Lin,J.Hwang,A novel synthetic bipartite carrier protein for developing glycotcpe-based vaccines.Vaccine 30(2012)7573-7581)的載體。Tn在glycotope/載體蛋白重量比為5比1，接合至ratFc(Cys42)Histag2 or GST(Cys6)Histag2。在含有20mM磷酸鈉、pH 7.9、8M尿素、500mM咪唑及0.2mM TCEP的緩衝液中進行接合。48小時後，接合物於含0.2mM TCEP的磷酸緩衝液(PBS)中再折 疊。GST(Cys6)在含0.2mM TCEP的PBS中透析。不同的glycotope與連接子(順丁烯二亞醯胺基己酸N-琥珀醯亞胺酯)在4℃下接合至GST(Cys6)48小時。

小鼠實驗組

以20μg劑量的Tn疫苗或載體蛋白質(10μg of mFc(Cys42-Tn)Histag2)在100μl佐劑的存在下，以雙週的時間兼隔皮下免疫5週大雌性C57BL/6NCrlBltw小鼠4次，並在第4次免疫後1週額外追加1次免疫接種。從面靜脈抽血，使用酵素免疫分析法(ELISA)在第0、42及49天測定抗-Tn抗體的效價。最後免疫接種後4天，將小鼠暴露於室內空氣(room air；RA)或富含氧的大氣(100% O2)至多96小時。氧曝露的進行以4公升/分鐘連續遞送於透明60×50×40公分Plexiglas室，且氧量以ProOx Model 110監測器(NexBiOxy,Hsinchu,Taiwan)監測，每日檢查濕度，值為60-80%。取得下列4個組：載體蛋白+RA(n=6)、Tn疫苗+RA(n=6)、載體蛋白+O₂(n=6)及Tn疫苗+O2(n=5)。小鼠在O₂處理96小時後以異氟醚深度麻醉。肺以0.6ml、0.9%生理食鹽水在4℃灌洗，灌洗肺內外3次，接著復原。針對每一動物重複清洗程序超過2次，收集3次的洗液並記錄總體積。支氣管肺泡刷洗檢查後，將右肺結紮，左肺在25公分H₂O的壓力下，以4%緩衝的三聚甲醛以氣管內滴注法固定。

通過ELISA分析血清抗Tn-抗體的量

將GST(Cys6-Tn)以1.5μg/ml的濃度塗覆於96孔槽平底盤上(Falcon Labware,Lincoln Park,NJ,USA)。將經各種不同稀釋的血清加入各經塗覆的孔槽中。於37℃反應2小時後，以PBS清洗這些孔槽三次。接著，將與過氧化酶共軛的抗-人類免疫球蛋白加入，並將所述盤於37℃反應1小 時。受質溶液含有0.54mg/ml的2,2'-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(2,2’-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)及0.01% H₂O₂及0.1M檸檬酸(pH 4.2)。以410nm讀取吸收度值。

支氣管肺泡灌洗液蛋白及細胞因子分析

使用二辛可寧酸(bicinchoninic acid)試驗(Pierce Chemical,Rockford,IL,USA)量測支氣管肺泡灌洗液(BALF)中的總蛋白質濃度。所述BALF中的IL-6及TNF-α的量是使用ELISA套組(Cloud-Clone Corp.,Houston,TX,USA)測定。數據分別以mg/ml及pg/ml的方式表達。

NF-kB的西方墨點分析

次細胞劃分(subcellular protein fractionation)是以用於組織的次細胞蛋白劃分套組(Thermo Scientific,Melbourne,VIC,Australia,cat# 87790)來完成。核蛋白提取物被用於偵測NF-κB p65(SC-372,Santa Cruz Biotechnologies,Santa Cruz,CA,USA)次單元及PCNA(SC-7907)；細胞質蛋白提取物被用於偵測IκB-α(SC-1643)及β-肌動蛋白(SC-47778)。蛋白質濃度是使用二辛可寧酸(bicinchoninic acid)試驗套組測定。使用12%的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠將蛋白質分開並轉印至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride)膜上，並將所述膜於5%脫脂牛奶中於室溫進行阻斷1小時。將所述膜與抗體於4℃反應隔夜。隨後，將所述膜及與HRP共軛的二級抗體於室溫反應1小時。依照製造商的指南，通過增強化學發光(enhanced chemiluminescence)試劑將訊號視覺化。抗β-肌動蛋白及PCNA的抗體分別被用作核及細胞質蛋白裝載量的內部控制組。所有點墨實驗皆使用不同小鼠至少進行三次。

肺部型態測定

為將分析標準化，切片是來自右肺的右中葉。將5-μm肺組織切片以蘇木精及曙紅染色並測定型態。在不重疊的10個視野中測定平均線性截距(MLI)，其為肺泡平均直徑的指標。

組織學

將肺組織於含4%三聚甲醛(paraformaldehyde)的磷酸緩衝液中固定，以石蠟包埋，以蘇木精及曙紅染色，且由對實驗流程及組別為盲的病理學家檢測。肺損傷是以以下四個標準來評分：1)肺泡充血、2)出血、3)嗜中性球在空氣腔或血管壁的浸潤及4)肺泡壁的厚度。每一項目是依據如下述的五分等級來分級：0為最小的(少的)損傷、1為輕微的損傷、2為中等的損傷、3為嚴重的損傷及4為最大的損傷。

NF-kB的免疫組織化學染色

在例行的去石蠟步驟後，通過將載玻片浸於0.01mol/L的檸檬酸鈉緩衝液(pH6.0)中來進行熱誘導的抗原決定基修復(retrieval)。為阻斷內生性過氧化酶的活性及非特異性抗體的結合，在與作為一級抗體的兔多株抗-NF-κB P65抗體(1：50稀釋；Abcam Inc.,Cambridge,MA,USA)於4℃反應20小時前，先將切片於含有10%正常山羊血清及0.3%H₂O₂的0.1mol/L PBS中於室溫預反應1小時。接著將這些切片以生物素化的(biotinylated)山羊抗-兔IgG(1：200稀釋，Vector,CA,USA)於室溫處理1小時。接著依照製造商的建議與來自ABC套組(抗生物素蛋白-生物素複合物(Avidin-Biotin Complex),Vector,CA,USA)的試劑進行反應，且透過二氨基聯苯胺(diaminobenzidine)受質套組(Vector,CA,USA)來視覺化所述反應的產物。所有經免疫染色的切片是通過Olympus BX 43來觀察及拍照。

統計分析

所有數據是以平均值±SD呈現。統計分析是使用單因子變異數分析，並以杜凱氏事後檢定用於多重組別比較。當P<0.05時，差異被認為是統計上顯著的。

實例1 抗Tn抗體的血清效價

在免疫接種之前所有小鼠中抗Tn抗體的含量為低的，且將其計為背景(圖1)。接受載體蛋白(亦即，Fc片段-7重複的Pro-Cys-Cys-Gly-Cys-Cys-Gly-Cys-Gly-Cys(SEQ ID NO：2)-6-順丁烯二亞醯胺基己酸N-琥珀醯亞胺酯)且圈養在室內空氣或高氧中的小鼠顯示背景血清抗Tn抗體含量(圖1A)，而接受Tn疫苗接種的小鼠在Tn疫苗接種後發展高血清抗Tn抗體效價，且在疫苗接種若干個月後抗Tn抗體保持高含量(圖1B)。

實例2 存活及體重

在整個研究期間，暴露於室內空氣或高氧的小鼠均存活。暴露於高氧的小鼠顯示犧牲時的體重顯著低於在RA中飼養的小鼠(圖2)。

實例3 支氣管肺泡灌洗液蛋白及細胞因子分析

將小鼠用載體蛋白處理接著暴露於高氧，在BALF中，這些小鼠顯示比暴露於RA的小鼠顯著更高的總蛋白質及IL-6含量(圖3A及3B)。另一方面，用Tn疫苗處理且暴露於高氧的小鼠顯示BALF中顯著低於用載體蛋白處理的小鼠的IL-6含量(圖3B)。在BALF中，用載體蛋白處理且暴露於高氧的小鼠顯示TNF-α含量顯著高於暴露於RA的小鼠(圖3C)。在BALF中，用Tn疫苗處理且暴露於高氧的小鼠顯示TNF-α含量較低。然而，差異未達到顯著性。

實例4 組織學結果

圖4A中呈現來自暴露於RA及高氧的小鼠的經蘇木精及曙紅染色的代 表性肺切片。如更大的線性截距所指示，高氧導致發炎細胞浸潤且肺實質簡化。與用載體蛋白或Tn疫苗處理且暴露於RA的小鼠相比，用載體蛋白處理且暴露於高氧的小鼠顯示顯著更高的肺損傷評分及MLI(圖4B及4C)。用Tn疫苗處理顯著減少高氧誘發的肺損傷評分及MLI增加。

實例5 NF-κB的免疫組織化學

雖然主要在肺泡巨噬細胞的細胞質中發現NFκB的免疫組織化學染色，但肺泡巨噬細胞的細胞核及少數肺泡上皮細胞中亦顯示免疫反應性(圖5A)。經載體蛋白免疫接種的高氧組的肺展示比對照及經Tn處理的高氧組更強的NFκB免疫反應性。

實例6 NF-kB及IkBα的西方墨點分析

與用載體蛋白或Tn疫苗處理且暴露於RA的小鼠相比，用載體蛋白處理且暴露於高氧的小鼠展示顯著更高的核NF-κB p65及胞溶質磷酸化-IκBα含量(圖5B及5C)。即使在經高氧處理的大鼠中，用Tn疫苗處理的大鼠組亦顯著減少NFκB p65及胞溶質磷酸化-IκBα的含量。

實例7：發炎組織及細胞中升高的Tn含量

為檢查升高的Tn含量是否與發炎相關，使用免疫組織化學(IHC)在發炎組織中量測Tn含量。在動脈粥樣硬化、支氣管炎及齒根骨膜炎的組織中觀測到Tn含量顯著增加，但在其對應正常組織中未觀測到此增加(圖6A)。為研究發炎性細胞因子對Tn含量的可能調控，使用來自經LPS刺激的單核細胞U937細胞的條件培養基。觀測到補充來自經LPS刺激的U937細胞的一天條件培養基的人類齒齦纖維母細胞(HGF)中Tn含量以LPS劑量依賴性方式增加(圖6B)。與來自無LPS下培養的U937細胞的培養基相比，在來自經LPS(10、30或100ng/ml)處理24小時的U937細胞的條件培養基 中發炎性細胞因子(例如TNF-α、IL-6及IL-1β)的分泌顯著更高(圖6C)。

實例8：HGF中TNF-α及IL-6上調Tn表達

為確定細胞因子是否可使Tn含量升高，HGF用各種量的純化細胞因子處理。如圖7A中所示，HGF中的Tn含量對TNF-α的反應最大，對IL-6的反應中等，且對IL-1β無反應，即使在實驗條件下100ng/ml的濃度下。TNF-α(30ng/ml)使Tn升高顯示為時間依賴性的。在TNF-α處理4小時後，HGF中的Tn含量基本上不變。在8至12小時間觀測到Tn含量逐漸增加。Tn含量在TNF-α處理24小時後逐漸減少，且在TNF-α處理48小時後顯著減少(圖7B)。

實例9：TNF-α經由下調COSMC基因來上調Tn表達

為探索在細胞因子介導的Tn含量上調下面的可能分子機制，研究TNF-α對COSMC基因的mRNA含量的作用。如圖8A中所示，TNF-α(100ng/ml，處理24小時)顯著下調HGF中的COSMC mRNA。相比之下，TNF-α未顯著改變T-合成酶mRNA含量。在TNF-α處理後，觀測到HGF中Cosmc及T-合成酶的蛋白質含量的結果類似(圖8B、8C及8D)。TNF-α對COSMC基因下調的作用可能涉及其啟動子中CpG島的高甲基化。使用亞硫酸氫鹽焦磷酸測序定量COSMC基因的啟動子中的甲基化變化，TNF-α處理使四個CpG位點顯著高甲基化(圖9A)。用去甲基化劑預處理HGF以劑量依賴性方式減少COSMC啟動子中四個CpG位點的甲基化(圖9A)，且相對應地，增加COSMC mRNA的表達且減少Tn的含量(圖9B)。總而言之，吾人的結果表明細胞因子介導的Tn含量上調是由涉及COSMC基因啟動子的高甲基化的COSMC下調引起。

<110> 臺北醫學大學(TAIPEI MEDICAL UNIVERSITY)

<120> 緩解發炎之TN疫苗及方法

<140> 106132099

<141> 2017-09-19

<160> 2

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> 合成肽

<400> 1

<210> 2

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<213> 人工序列

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<223> 合成肽

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Claims (13)

1. 一種單劑疫苗之用途，其用於製備於個體誘導免疫反應以治療或預防高氧誘發的肺損傷的藥劑，所述單劑疫苗每劑包含0.1mg至2mg的GalNAc-a-O-Ser/Thr(Tn)免疫原及佐劑溶液，該Tn免疫原及佐劑溶液之比例為0.5至2(v/v)，其中該Tn免疫原與載體多肽結合。
2. 如請求項1的用途，其中每劑0.1mg至2mg的Tn免疫原以兩週一次的時間間隔投與四次。
3. 如請求項2的用途，其中所述藥劑之投與方法進一步包含在第四次免疫接種的一周後，以0.1mg至2mg的Tn免疫原進行額外免疫接種。
4. 如請求項1的用途，其中所述單劑疫苗的投與產生與控制組相比具有高血清效價的抗Tn抗體。
5. 如請求項4的用途，其中所述產生的抗Tn抗體的血清效價較控制組高至少2倍。
6. 如請求項1的用途，其中在投與該疫苗後，個體中的白細胞介素-6(IL-6)及TNF-α的量或NF-κB的活性降低。
7. 如請求項1的用途，其中所述個體具有升高的Tn表達。
8. 如請求項7的用途，其中所述Tn表達由TNF-α及IL-6上調。
9. 如請求項7的用途，其中所述升高的Tn表現通常由細胞因子-Cosmc(核心1 β3-Gal-T特異性分子伴隨蛋白，core 1 β3-Gal-T-specific molecular chaperone)信號傳導軸調控。
10. 如請求項1的用途，其中所述Tn免疫原與所述載體多肽的重量比為3：1至8：1。
11. 如請求項1的用途，其中所述載體多肽具有Pro-Cys-Cys-Gly-Cys-Cys-Gly-Cys-Gly-Cys(SEQ ID NO：2)的胺基酸序列。
12. 如請求項1的用途，其中所述載體多肽含有Fc片段及如請求項11的胺基酸序列的7個重複序列。
13. 如請求項1的用途，其中所述載體多肽是Fc片段-(7重複的SEQ ID NO：2)-N-順丁烯二亞醯胺；或Fc片段-(7重複的SEQ ID NO：2)-6-順丁烯二亞醯胺基己酸N-琥珀醯亞胺酯。

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