CN109513002B - 缓解发炎的tn疫苗及方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及缓解发炎的Tn疫苗及方法。本发明涉及治疗发炎相关疾病的领域。详言之，本发明涉及Tn免疫原减少细胞因子及治疗发炎相关疾病的用途。

Description

缓解发炎的TN疫苗及方法

技术领域

本发明涉及治疗发炎相关疾病的领域。详言之，本发明涉及使用Tn免疫原减少细胞因子及治疗发炎相关疾病。

背景技术

Tn抗原(GalNAc-a-O-Ser/Thr)是一种黏蛋白型O连接的聚糖，是公认的细胞表面的肿瘤标记物，且其含量升高与癌症进展及预后相关。发现Tn抗原通过抑制糖基化的进一步延伸而在各种癌症中异常过度表达。先前研究亦已证实T-合成酶的受质特异性及特异性分子伴随蛋白核心1β3-Gal-T特异性分子伴随蛋白(Cosmc)。因此，缺陷性T-合成酶或减少的Cosmc表达可预防黏蛋白的O连接的糖基化延伸，从而明显增加Tn抗原的表达。当O连接的糖基化的进一步延伸受阻时，Tn抗原亦可通过α-2,6-唾液酸基转移酶用唾液酸残基进一步修饰以产生唾液酸基Tn(NeuAca6GalNAc-Ser/Thr，sTn)。US 20030170249及US20070275019提供一种疫苗，其包含：(a)医药学上有效量的在这些癌细胞上存在的碳水化合物抗原或其模拟物；及(b)医药学上可接受的载剂。碳水化合物抗原可为Tn或唾液酸基-Tn。US20100278818提供一种医药组合物，其包含针对Tn抗原的抗体。US8,383,767发现糖抗原Tn、sTn或GM3与含有免疫球蛋白(Ig)Fc结构域及富含半胱氨酸的结构域的蛋白质载体偶合提高其抗原性。Chiang等人已研发出一种抗Tn疫苗，其在小鼠中使用线性数组抗原决定基技术以高特异性及高亲和力诱导抗Tn抗体(H.L.Chiang,C.Y.Lin,F.D.Jan,Y.S.Lin,C.T.Hsu,J.Whang-Peng,L.F.Liu,S.Nieh,C.C.Lin,J.Hwang,A novel syntheticbipartite carrier protein for developing glycotope-based vaccines.Vaccine 30(2012)7573-7581)。

亦报导Tn在发炎组织中升高；Tn的表达与组织损伤时的发炎反应程度相关联。举例而言，Tn症候群的特征在于在所有谱系的血细胞上均侦测到Tn抗原。在一些IgA肾病患者中可在IgA1铰链区上侦测到Tn抗原。另外，已知Tn在例如来自类风湿性关节炎及骨关节炎患者的发炎组织的慢性发炎组织中表达。已在发炎造成的组织损伤中观测到升高的Tn表达，且认为此与宿主免疫反应的调节相关。

高氧增加胎儿及成人肺纤维母细胞中的NF-κB易位以及促炎性介体的产生，这些介体诸如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-γ及介白素-1β(IL-1β)(H.D.Li,Q.X.Zhang,Z.Mao,X.J.Xu,N.Y.Li,H.Zhang,Exogenous interleukin-10attenuates hyperoxia-induced acute lung injury in mice.Exp.Physiol.100(2015)331-330；及C.J.Wright,P.A.Dennery,Manipulation of gene expression by oxygen:a primer from bedsideto bench.Pediatr.Res.66(2009)3-10)。长期暴露于高氧导致发炎及急性肺损伤。迄今为止，尚未建立有效疗法。

发明内容

本发明提供一种单剂疫苗，每剂包含约0.02mg(优选为约0.1mg)至约2mg的Tn免疫原及佐剂溶液，所述Tn免疫原及佐剂溶液的比例为约0.5至约2(v/v):约0.5至约2(v/v)。在一具体实施例，Tn免疫原及佐剂溶液的比例为约1(v/v):约1(v/v)。

本发明提供一种单剂疫苗于个体诱导免疫反应以治疗或预防发炎疾病的用途，其中所述单剂疫苗包含约0.1mg至约2mg的Tn免疫原。在一具体实施例，所述单剂疫苗每剂包含约0.1mg至约2mg的Tn免疫原及佐剂溶液，所述Tn免疫原及佐剂溶液的比例为约0.5至约2(v/v):约0.5至约2(v/v)。

本发明亦提供一种单剂疫苗于个体诱导免疫反应以治疗或预防发炎疾病的用途，其中所述单剂疫苗包含约0.1mg至约2mg的Tn免疫原及其中以两周一次的时间间隔投药所述单剂疫苗将所述个体免疫接种四次。在一个实施例中，所述用途进一步包含在第四次免疫接种后的一周后进行额外免疫接种。在一具体实施例，所述单剂疫苗每剂包含约0.1mg至约2mg的Tn免疫原及佐剂溶液，所述Tn免疫原及佐剂溶液的比例为约0.5至约2(v/v):约0.5至约2(v/v)。

发炎疾病是齿根骨膜炎的进展、器官损伤或器官纤维化。在一个实施例中，器官损伤是肺损伤、肾损伤或肝损伤。在另一实施例中，肺损伤是高氧诱发的肺损伤。

本发明单剂疫苗及用途可减少细胞或个体中白细胞介素-6(IL-6)及TNF-α的量或降低NF-κB的活性。根据本发明，细胞或个体具有升高的Tn表达且Tn表达由TNF-α及IL-6上调。此外，升高的Tn含量通常由细胞因子-Cosmc信号传导轴调控。

Tn免疫原可与载体多肽以约3至约8:约1的重量比结合。载体蛋白是抗原呈现细胞(APC)结合域或富含半胱氨酸的结构域。在一些实施例中，富含半胱氨酸的结构域含有6个半胱氨酸残基；优选地，富含半胱氨酸的结构域具有Pro-Cys-Cys-Gly-Cys-Cys-Gly-Cys-Gly-Cys的氨基酸序列。在另一其他实施例中，富含半胱氨酸的结构域含有所述氨基酸序列的2至30个重复序列。

Tn免疫原是经O-连接至丝氨酸或苏氨酸的N-乙酰基半乳糖胺。Tn免疫原在0.2mL至2mL佐剂存在下投与。Tn免疫原以约0.1mg至约2mg范围内的剂量投与。根据本发明的方法的Tn免疫原投与可产生具有高血清效价的抗Tn抗体。

附图说明

图1(A)及1(B)展示在免疫接种前后抗Tn抗体的血清效价。所有小鼠中在免疫接种之前(预先)抗Tn抗体的含量低。(A)接受载体蛋白的小鼠发展低血清Tn抗体效价且(B)接受Tn免疫接种的小鼠在第一次免疫接种后发展高血清抗体效价(621)且在第二次免疫接种后保持高效价(628)。

图2展示小鼠牺牲时的体重。暴露于室内空气及高氧的小鼠均存活。牺牲时，在富含O₂的氛围中饲养的小鼠展示体重显着低于在室内空气(RA)中饲养的小鼠(***P<0.001)。

图3(A)至3(C)展示支气管肺泡灌洗液(BALF)蛋白质及细胞因子含量。(A、B)用载体蛋白或Tn疫苗处理且暴露于高氧的小鼠展示BALF中显着高于暴露于室内空气(RA)的小鼠的总蛋白质及IL-6含量(**P<0.01及***P<0.001)。Tn免疫接种显着减少高氧诱发的IL-6含量增加(***P<0.001)。(C)用载体蛋白处理且暴露于高氧的小鼠显示BALF中显着高于暴露于RA的小鼠的TNF-α含量(**P<0.01)。Tn免疫接种减少高氧诱发的TNF-α含量增加。

图4(A)至4(C)展示用载体蛋白或Tn疫苗处理且暴露于RA或高氧的小鼠中的(A)代表性组织学、(B)肺损伤评分及(C)平均线性截距(MLI)。与用载体蛋白或Tn疫苗处理且暴露于RA的小鼠相比，用载体蛋白处理且暴露于高氧的小鼠显示显着更高的肺损伤评分及MLI(***P<0.001)。Tn免疫接种显着减少高氧诱发的肺损伤评分及MLI增加(***P<0.001)。

图5(A)至5(C)展示(A)代表性西方墨点及(B)使用密度测定法针对核因子-κB(NF-κB)测定的定量数据及(C)肺组织中的胞溶质磷酸化-I-κBα。与用载体蛋白或Tn疫苗处理且暴露于RA的小鼠相比，用载体蛋白处理且暴露于高氧的小鼠展示显着更高的核NF-κB p65及胞溶质磷酸化IκBα含量(*P<0.05)。用Tn疫苗处理显着减少高氧诱发的核NF-κB p65及胞溶质磷酸化IκBα增加(*P<0.05)。

图6A至6C展示发炎组织及细胞中Tn含量上调。(A)发炎组织(上图)及正常组织(下图)中Tn抗原的免疫组织化学分析。动脉粥样硬化主动脉(左图；标记主动脉)、支气管炎组织(中图；标记支气管)及齿根骨膜炎组织(右图；标记齿龈)中的Tn染色。棕色表示Tn抗原表达。(B)使用来自经LPS(0、10、30及100ng/ml；24小时)刺激的U937细胞的条件培养基处理HGF，24小时后，使用纯化的兔抗Tn抗体(红色)及DAPI(蓝色)染色。(C)使用LPS(0、10、30及100ng/ml)处理U937细胞24小时，通过ELISA分析TNF-α、IL-6及IL-1β的分泌。原始放大倍数(100倍)。比例尺，50μm。

图7展示促炎性细胞因子TNF-α及IL-6上调HGF中的Tn含量。A.促炎性细胞因子对HGF中的Tn表达的影响。使用浓度为0、10、30及100ng/ml的纯化的TNF-α、IL-6及IL-1β处理HGF，24小时后，使用经纯化的兔抗Tn抗体(红色)及DAPI(蓝色)染色。原始放大倍数(100倍)；比例尺，50μm。B.TNF-α处理后HGF中的Tn表达的时程分析。使用浓度为30ng/ml的纯化的TNF-α处理HGF，4、8、12、24及48小时后，使用纯化的兔抗Tn抗体(红色)及DAPI(蓝色)染色(放大倍数630倍；比例尺，50μm)。实验重复至少三次。

图8A至8D展示TNF-α上调Tn含量是经由下调HGF中的COSMC基因。A.TNF-α及去甲基化剂(5-氮杂-dC)对HGF中COSMC及T-合成酶的mRNA表达的影响。采用qPCR分析经TNF-α及5-氮杂-dC处理的HGF中之COSMC及T-合成酶mRNA表达。COSMC及T-合成酶的mRNA表达相对于GAPDH校正且进行统计学分析。(*：与仅TNF-α相比p<0.05)。根据ΔΔCT法，进行相对基因表达的计算(相对于GAPDH参考基因校正)。通过熔融温度分析来测定PCR反应的保真度。B.西方墨点法用于分析在TNF-α处理6小时及24小时后Cosmc及T-合成酶的蛋白质含量。C.及D.HGF用纯化的TNF-α处理6小时或24小时且接着用抗Cosmc(红色)及抗T-合成酶抗体(绿色)及DAPI(蓝色)进行免疫荧光染色。原始放大倍数(100倍)；比例尺，50μm。

图9A及9B展示TNF-α诱发的COSMC基因高甲基化及Tn表达可由去甲基化剂(5-氮杂-dC)抑制。A.TNF-α及去甲基化剂对HGF中COSMC基因的甲基化程度的作用。甲基化改变的比较是在用或未用TNF-α及去甲基化剂处理的HGF中。UCSC基因组浏览器说明COSMC的取向及第一外显子(蓝条)、GC百分比(黑色比例尺)、CpG岛(绿条)及亚硫酸氢盐焦磷酸测序的测序区域(COSMC_py02，黑条)。红色圆圈展示CG岛，且黑色显示甲基化程度。B.HGF用纯化的TNF-α及不同浓度的5-氮杂-dC(0、1、2及5μM)共同处理24小时且接着用兔抗Tn抗体(红色)及DAPI(蓝色)进行免疫荧光染色。放大倍数630倍；比例尺，50μm。

具体实施方式

下文参考用于说明的实例应用来描述本发明的若干态样。应了解，阐述众多特定细节、关系及方法以提供对本发明的充分理解。然而，一般熟习此项技术者将易于认识到，可在无一或多个特定细节的情况下或通过其他方法来实践本发明。本发明不受动作或事件的所说明次序限制，这是因为一些动作可按不同次序发生及/或可与其他动作或事件同时发生。

本文中所使用的术语仅用于达成描述特定实施例的目的，且并不意欲限制本发明。除非上下文以其他方式清楚地指示，否则如本文中所使用，单数形式“一(a)”、“一(an)”及“所述”意欲包括复数形式。

如本文中所使用，如本文所用的术语“表达”定义为特定核苷酸序列由其启动子驱动的转录及/或转译。

如本文中所使用，如本文所用的术语“启动子”定义为起始聚核苷酸序列的特异性转录所需的由细胞的合成机制或引入的合成机制识别的DNA序列。

如本文中所使用，如本文所用的术语“抗原”或“Ag”定义为引起免疫反应的分子。此免疫反应可涉及抗体产生或特异性免疫胜任细胞的活化或两者。熟习此项技术者应了解，包括几乎所有蛋白质或肽的任何大分子均可充当抗原。

如本文中所使用，“Tn抗原”表示GalNAca-O-Ser/Thr，亦即其中GalNAc残基直接经α连接至在细胞内或在细胞表面上表达的多肽链的丝氨酸或苏氨酸残基的羟基的抗原。

如本文中所使用，如本文所用的术语“抗体”是指特异性结合抗原的免疫球蛋白分子。抗体可为来源于天然来源或来源于重组来源的完整免疫球蛋白且可为完整免疫球蛋白的免疫反应部分。抗体通常为免疫球蛋白分子的四聚体。本发明中的抗体可呈多种形式存在，包括例如多株抗体、单株抗体、Fv、Fab及F(ab)₂以及单链抗体、人类抗体及人类化抗体。

如本文中所使用，术语“多株抗体”是指包括针对一种抗原或多种抗原内相同及/或不同抗原决定基的多种不同抗体的抗体群体。

如本文中所使用，术语“单株抗体”是指自均质或基本上均质抗体的群体获得的抗体。术语“单株”不限于任何用于制造抗体的特定方法。一般而言，单株抗体的群体可由细胞、细胞群体或细胞株产生。

如本文所使用，术语“患者”、“个体(subject)”、“个体(individual)”及其类似术语在本文中可互换使用，且是指可进行本文所述的方法的任何动物或其细胞，无论活体外或是原位。在某些非限制性实施例中，患者、个体(subject)或个体(individual)为人类。

如本文中所使用，如本文所用的术语“免疫球蛋白”或“Ig”定义为充当抗体的一类蛋白质。由B细胞表达的抗体有时称作BCR(B细胞受体)或抗原受体。此类蛋白质中包括的五个成员为IgA、IgG、IgM、IgD及IgE。IgA是存在于诸如唾液、泪液、母乳、胃肠道分泌物及呼吸道及泌尿生殖道的黏液分泌物的身体分泌物中的初级抗体。IgG是最常见的循环抗体。IgM为在大部分个体中主要免疫反应中产生的主要免疫球蛋白。其为凝集、补体结合及其他抗体反应中最有效的免疫球蛋白，且对于防御细菌及病毒具有重要意义。IgD虽为无已知的抗体功能的免疫球蛋白，但可充当抗原受体。IgE是通过在暴露于过敏原时引起介体自肥大细胞及嗜碱细胞释放来介导速发超敏反应的免疫球蛋白。

如本文中所使用，“疫苗”为包含抗原的免疫原组合物，当投药至个体，诱导或刺激或引发细胞或体液对疫苗抗原的免疫反应。疫苗可含有对个体产生较加强免疫反应的佐剂。

如本文中所使用，“佐剂”为用于与抗原或抗原组合结合的物质以产生较抗原或抗原组合单独为强的免疫反应。

如本文中所使用，“刺激免疫反应”、“诱导免疫反应”及“引发免疫反应”除非另有所述，在本文中可交替使用，其包括，但不限于，诱导、刺激或引发由个体免疫反应介导的治疗或预防效果。

如本文中所使用，“有效量”意谓提供治疗或预防益处的量。

Tn抗原进行疫苗接种抑制NF-κB活性，且经由Tn免疫接种诱导的抗Tn抗体的作用抑制发炎。本发明疫苗组合物及方法可有效治疗或预防发炎疾病。Tn免疫接种增加血清抗Tn抗体效价，同时其减少灌洗的蛋白质及细胞因子。本发明因此提出Tn免疫接种可减弱发炎相关的疾病及器官损伤。本发明发展一种抗发炎的疫苗组合物以及发炎与肺损伤(特别是高氧所致的肺损伤)以及牙周病进展的治疗或预防。Tn免疫接种也减小肺损伤的平均线性截距及肺损伤评分。再者，肺损伤的改善伴随NF-κB活性的降低。

在一个态样中，本发明提供一种单剂疫苗，每剂包含约0.02mg(优选为约0.1mg)至约2mg的Tn免疫原及佐剂溶液，所述Tn免疫原及佐剂溶液的比例为约0.5至约2(v/v):约0.5至约2(v/v)。在一具体实施例，Tn免疫原及佐剂溶液的比例为约1(v/v):约1(v/v)。

在一些具体实施例，Tn免疫原的剂量范围自约0.02mg至约0.1mg、约0.02mg至约0.05mg、约0.1mg至约1.5mg、约0.1mg至约1.2mg、约0.1mg至约1mg、约0.1mg至约0.8mg、约0.1mg至约0.5mg、约0.2mg至约1.5mg、约0.2mg至约1.2mg、约0.2mg至约1mg、约0.2mg至约0.8mg、约0.2mg至约0.5mg、约0.5mg至约2mg、约0.5mg至约1.5mg、约0.5mg至约1.2mg、约0.5mg至约1mg、约0.5mg至约0.8mg、约1.0mg至约2mg。佐剂溶液的体积范围自约0.2ml至约1ml、约0.2ml至约0.8ml或约0.2ml至约0.6ml。

在另一个态样，本发明提供一种单剂疫苗于个体诱导免疫反应以治疗或预防发炎疾病的用途，其中所述单剂疫苗包含约0.1mg至约2mg的Tn免疫原。在一具体实施例，所述单剂疫苗每剂包含约0.1mg至约2mg的Tn免疫原及佐剂溶液，所述Tn免疫原及佐剂溶液的比例为约0.5至约2(v/v):约0.5至约2(v/v)。

在一个态样，本发明提供一种单剂疫苗于个体诱导免疫反应以治疗或预防发炎疾病的用途，其中所述单剂疫苗包含约0.1mg至约2mg的Tn免疫原及其中以两周一次的时间间隔投药所述单剂疫苗将所述个体免疫接种四次。在一个实施例中，所述用途进一步包含在第四次免疫接种后的一周后进行额外免疫接种。在一具体实施例，所述单剂疫苗每剂包含约0.1mg至约2mg的Tn免疫原及佐剂溶液，所述Tn免疫原及佐剂溶液的比例为约0.5至约2(v/v):约0.5至约2(v/v)。

根据本发明方法的投药可产生较控制组高的血清效价的抗-Tn抗体。在一具体实施例，所产生的抗-Tn抗体的血清效价较控制组高至少2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5或6倍。本文中所使用的“控制组”为载体多肽。

在一具体实施例，Tn免疫接种降低细胞或个体中白细胞介素-6(IL-6)及TNF-α的量或降低NF-κB的活性。

在一个具体实施例中，细胞或个体具有升高的Tn表达。在另一个实施例中，Tn表达由TNF-α及IL-6上调。在另一其他实施例中，升高的Tn含量通常由细胞因子-Cosmc信号传导轴调控。

在一个具体实施例中，发炎疾病是齿根骨膜炎(牙周病)的进展、器官损伤或器官纤维化。在另一个实施例中，器官损伤是肺损伤、肾损伤或肝损伤。在另一实施例中，肺损伤是高氧诱发的肺损伤。在另一个实施例中，器官纤维化是肺纤维化、肝纤维化或肾纤维化。

在一个具体实施例中，所述方法进一步包含在第四次免疫接种后的一周后进行额外免疫接种的步骤。

在一些具体实施例中，Tn免疫原可与载体多肽结合。Tn免疫原及载体多肽是处于约3至约8:约1的重量比下；优选地，重量比为约5:约1。在一些实施例中，多肽包括(但不限于)抗原呈现细胞(APC)结合域及富含半胱氨酸的结构域。在一些实施例中，APC结合域为免疫球蛋白(Ig)Fc片段或毒素的受体结合域。在另一个实施例中，APC结合域为绿脓杆菌外毒素A(Pseudomonas exotoxin A)、破伤风毒素或霍乱毒素的受体结合域。在另一个实施例中，APC结合域为人类Ig的Fc片段。在其他一些实施例中，富含半胱氨酸的结构域含有10个氨基酸残基的片段，其中至少3个为半胱氨酸残基。在另一其他实施例中，富含半胱氨酸的结构域含有6个半胱氨酸残基。优选地，富含半胱氨酸的结构域具有Pro-Cys-Cys-Gly-Cys-Cys-Gly-Cys-Gly-Cys的氨基酸序列。在另一其他实施例中，富含半胱氨酸的结构域含有所述氨基酸序列的2至30个重复序列。优选地，富含半胱氨酸的结构域含有所述氨基酸序列的7个重复序列。在另一实施例中，Tn经由连接符(如含有顺丁烯二亚酰胺官能基的连接符；例如，N-顺丁烯二亚酰胺(N-maleimide)或6-顺丁烯二亚酰胺基己酸N-琥珀酰亚胺酯(N-succinimidyl-6-maleimidocaproate))连接于半胱氨酸残基。优选地，Tn免疫原与载体多肽结合为Fc片段-7重复的Pro-Cys-Cys-Gly-Cys-Cys-Gly-Cys-Gly-Cys-N-顺丁烯二亚酰胺-Tn或Fc片段-7重复的Pro-Cys-Cys-Gly-Cys-Cys-Gly-Cys-Gly-Cys-6-顺丁烯二亚酰胺基己酸N-琥珀酰亚胺酯-Tn。

在一个实施例中，Tn免疫原为经O-连接至丝氨酸或苏氨酸的N-乙酰基半乳糖胺，其具有以下结构。

R为丝氨酸或苏氨酸。

在一具体实施例，Tn免疫原在0.2ml至2ml佐剂存在下投与。在一些具体实施例，佐剂为氢氧化铝、磷酸铝、羟磷灰石、Bordetella pertussis死菌、Mycobacterium bovis死菌、类毒素、鲨烯、Quil A、皂素、IL-1、IL-2、IL-12、佛朗氏完全佐剂或佛朗氏不完全佐剂。在另一具体实施例，佐剂为磷酸铝。

包含本发明的Tn免疫原的医药组合物可投与已罹患发炎的个体。在治疗应用中，组合物以足以引发针对所存在抗原的有效免疫反应及治愈或至少部分阻滞症状及/或并发症的量投与患者。足以实现此量定义为“治疗有效量”。对此用途有效量将视例如肽组成、投与方式、所治疗的疾病的阶段及严重程度、患者体重及整体健康状态以及处方医师的判断而定。但初始免疫接种(用于治疗性或预防性投与)的范围一般为0.1mg至2mg的Tn免疫原，接着依照加强疗程，0.1mg至2mg的加强剂量的Tn免疫原。

疫苗组合物意欲非经肠、局部、经鼻、经口或局部投与。优选地，医药组合物非经肠投与，例如静脉内、皮下、皮内或肌肉内投与。优选地，疫苗经肌肉内投与。本发明提供非经肠投与的组合物，其包含疫苗组合物溶解或悬浮于可接受的载剂(优选为水性载剂)中的溶液。此等组合物可通过公知的熟知灭菌技术灭菌或可经无菌过滤。所得水溶液可封装以按原样使用，或冻干，经冻干的制剂在投与之前与无菌溶液组合。组合物可含有为接近生理条件而需要的医药学上可接受的辅助物质，诸如pH调节剂及缓冲剂、张力调节剂、湿润剂及其类似物，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯等。

举例而言且不限制，应给出本发明的实例。

实例

材料与方法

动物

五周大雌性C57BL/6NCrlBltw小鼠得自BioLASCO Taiwan Co.,Ltd并置于无菌室。动物维持在约25℃并整个实验随意供应颗粒食物与水。实验流程已由台北医学大学实验动物照护及使用委员会核可(LAC-2016-0047)。

疫苗制备

疫苗的制备是将Tn接合至如先前研究所述(H.L.Chiang,C.Y.Lin,F.D.Jan,Y.S.Lin,C.T.Hsu,J.Whang-Peng,L.F.Liu,S.Nieh,C.C.Lin,J.Hwang,A novel syntheticbipartite carrier protein for developing glycotope-based vaccines.Vaccine 30(2012)7573–7581)的载体。Tn在glycotope/载体蛋白重量比为5比1，接合至ratFc(Cys42)Histag2or GST(Cys6)Histag2。在含有20mM磷酸钠、pH 7.9、8M尿素、500mM咪唑及0.2mMTCEP的缓冲液中进行接合。48小时后，接合物于含0.2mM TCEP的磷酸缓冲液(PBS)中再折迭。GST(Cys6)在含0.2mM TCEP的PBS中透析。不同的glycotope与连接符(顺丁烯二亚酰胺基己酸N-琥珀酰亚胺酯)在4℃下接合至GST(Cys6)48小时。

小鼠实验组

以20μg剂量的Tn疫苗或载体蛋白质(10μg of mFc(Cys42-Tn)Histag2)在100μl佐剂的存在下，以双周的时间兼隔皮下免疫5周大雌性C57BL/6NCrlBltw小鼠4次，并在第4次免疫后1周额外追加1次免疫接种。从面静脉抽血，使用酵素免疫分析法(ELISA)在第0、42及49天测定抗-Tn抗体的效价。最后免疫接种后4天，将小鼠暴露于室内空气(room air；RA)或富含氧的大气(100％O2)至多96小时。氧曝露的进行以4公升/分钟连续递送于透明60×50×40公分Plexiglas室，且氧量以ProOx Model 110监测器(NexBiOxy,Hsinchu,Taiwan)监测，每日检查湿度，值为60–80％。取得下列4个组：载体蛋白+RA(n＝6)、Tn疫苗+RA(n＝6)、载体蛋白+O₂(n＝6)及Tn疫苗+O2(n＝5)。小鼠在O₂处理96小时后以异氟醚深度麻醉。肺在4℃，以0.6ml、0.9％生理食盐水灌洗，灌洗肺内外3次，接着复原。针对每一动物重复清洗程序超过2次，收集3次的洗液并记录总体积。支气管肺泡刷洗检查后，将右肺结扎，左肺在25公分H₂O的压力下，以4％缓冲的三聚甲醛以气管内滴注法固定。

通过ELISA分析血清抗Tn-抗体的量

将GST(Cys6-Tn)以1.5μg/ml的浓度涂覆于96孔槽平底盘上(Falcon Labware,Lincoln Park,NJ,USA)。将经各种不同稀释的血清加入各经涂覆的孔槽中。于37℃反应2小时后，以PBS清洗这些孔槽三次。接着，将与过氧化酶共轭的抗-人类免疫球蛋白加入，并将所述盘于37℃反应1小时。受质溶液含有0.54mg/ml的2,2'-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(2,2’-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)及0.01％H₂O₂及0.1M柠檬酸(pH 4.2)。以410nm读取吸收度值。

支气管肺泡灌洗液蛋白及细胞因子分析

使用二辛可宁酸(bicinchoninic acid)试验(Pierce Chemical,Rockford,IL,USA)量测支气管肺泡灌洗液(BALF)中的总蛋白质浓度。所述BALF中的IL-6及TNF-α的量是使用ELISA套组(Cloud-Clone Corp.,Houston,TX,USA)测定。数据分别以mg/ml及pg/ml的方式表达。

NF-kB的西方墨点分析

次细胞划分(subcellular protein fractionation)是以用于组织的次细胞蛋白划分套组(Thermo Scientific,Melbourne,VIC,Australia,cat#87790)来完成。核蛋白提取物被用于侦测NF-κB p65(SC-372,Santa Cruz Biotechnologies,Santa Cruz,CA,USA)次单元及PCNA(SC-7907)；细胞质蛋白提取物被用于侦测IκB-α(SC-1643)及β-肌动蛋白(SC-47778)。蛋白质浓度是使用二辛可宁酸(bicinchoninic acid)试验套组测定。使用12％的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶将蛋白质分开并转印至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride)膜上，并将所述膜于5％脱脂牛奶中于室温进行阻断1小时。将所述膜与抗体于4℃反应隔夜。随后，将所述膜及与HRP共轭的二级抗体于室温反应1小时。依照制造商的指南，通过增强化学发光(enhanced chemiluminescence)试剂将讯号可视化。抗β-肌动蛋白及PCNA的抗体分别被用作核及细胞质蛋白装载量的内部控制组。所有点墨实验皆使用不同小鼠至少进行三次。

肺部型态测定

为将分析标准化，切片是来自右肺的右中叶。将5-μm肺组织切片以苏木精及曙红染色并测定型态。在不重迭的10个视野中测定平均线性截距(MLI)，其为肺泡平均直径的指针。

组织学

将肺组织于含4％三聚甲醛(paraformaldehyde)的磷酸缓冲液中固定，以石蜡包埋，以苏木精及曙红染色，且由对实验流程及组别为盲的病理学家检测。肺损伤是以以下四个标准来评分：1)肺泡充血、2)出血、3)嗜中性球在空气腔或血管壁的浸润及4)肺泡壁的厚度。每一项目是依据如下述的五分等级来分级：0为最小的(少的)损伤、1为轻微的损伤、2为中等的损伤、3为严重的损伤及4为最大的损伤。

NF-kB的免疫组织化学染色

在例行的去石蜡步骤后，通过将载玻片浸于0.01mol/L的柠檬酸钠缓冲液(pH6.0)中来进行热诱导的抗原决定基修复(retrieval)。为阻断内生性过氧化酶的活性及非特异性抗体的结合，在与作为一级抗体的兔多株抗-NF-κB P65抗体(1:50稀释；Abcam Inc.,Cambridge,MA,USA)于4℃反应20小时前，先将切片于含有10％正常山羊血清及0.3％H₂O₂的0.1mol/L PBS中于室温预反应1小时。接着将这些切片以生物素化的(biotinylated)山羊抗-兔IgG(1:200稀释，Vector,CA,USA)于室温处理1小时。接着依照制造商的建议与来自ABC套组(抗生物素蛋白-生物素复合物(Avidin-Biotin Complex),Vector,CA,USA)的试剂进行反应，且透过二氨基联苯胺(diaminobenzidine)受质套组(Vector,CA,USA)来可视化所述反应的产物。所有经免疫染色的切片是通过Olympus BX 43来观察及拍照。

统计分析

所有数据是以平均值±SD呈现。统计分析是使用单因子变异数分析，并以杜凯氏事后检定用于多重组别比较。当P<0.05时，差异被认为是统计上显着的。

实例1抗Tn抗体的血清效价

在免疫接种之前所有小鼠中抗Tn抗体的含量为低的，且将其计为背景(图1)。接受载体蛋白且圈养在室内空气或高氧中的小鼠显示背景血清抗Tn抗体含量(图1A)，而接受Tn疫苗接种的小鼠在Tn疫苗接种后发展高血清抗Tn抗体效价，且在疫苗接种若干个月后抗Tn抗体保持高含量(图1B)。

实例2存活及体重

在整个研究期期间，暴露于室内空气或高氧的小鼠均存活。暴露于高氧的小鼠显示牺牲时的体重显着低于在RA中饲养的小鼠(图2)。

实例3支气管肺泡灌洗液蛋白及细胞因子分析

用载体蛋白处理，接着暴露于高氧的小鼠显示BALF中比暴露于RA的小鼠显着更高的总蛋白质及IL-6含量(图3A及3B)。另一方面，用Tn疫苗处理且暴露于高氧的小鼠显示BALF中显着低于用载体蛋白处理的小鼠的IL-6含量(图3B)。用载体蛋白处理且暴露于高氧的小鼠显示BALF中TNF-α含量显着高于暴露于RA的小鼠(图3C)。用Tn疫苗处理且暴露于高氧的小鼠显示BALF中TNF-α含量较低。然而，差异未达到显着性。

实例4组织学结果

图4A中呈现来自暴露于RA及高氧的小鼠的经苏木精及曙红染色的代表性肺切片。高氧导致发炎细胞浸润且肺实质简化，如线性截距更大所指示。与用载体蛋白或Tn疫苗处理且暴露于RA的小鼠相比，用载体蛋白处理且暴露于高氧的小鼠显示显着更高的肺损伤评分及MLI(图4B及4C)。用Tn疫苗处理显着减少高氧诱发的肺损伤评分及MLI增加。

实例5NF-κB的免疫组织化学

虽然主要在肺泡巨噬细胞的细胞质中发现NFκB的免疫组织化学染色，但肺泡巨噬细胞的细胞核及少数肺泡上皮细胞中亦显示免疫反应性(图5A)。经载体蛋白免疫接种的高氧组的肺展示比对照及经Tn处理的高氧组更强的NFκB免疫反应性。

实例6NF-kB及IkBα的西方墨点分析

与用载体蛋白或Tn疫苗处理且暴露于RA的小鼠相比，用载体蛋白处理且暴露于高氧的小鼠展示显着更高的核NF-κB p65及胞溶质磷酸化IκBα含量(图5B及5C)。即使在经高氧处理的大鼠中，用Tn疫苗处理的大鼠组亦显着减少NFκB p65及胞溶质磷酸化IκBα的含量。

实例7：发炎组织及细胞中升高的Tn含量

为检查升高的Tn含量是否与发炎相关，使用免疫组织化学(IHC)在发炎组织中量测Tn含量。在动脉粥样硬化、支气管炎及齿根骨膜炎的组织中观测到Tn含量显着增加，但在其对应正常组织中未观测到此增加(图6A)。为研究发炎性细胞因子对Tn含量的可能调控，使用来自经LPS刺激的单核细胞U937细胞的条件培养基。观测到补充来自经LPS刺激的U937细胞的一天条件培养基的人类齿龈纤维母细胞(HGF)中Tn含量以LPS剂量依赖性方式增加(图6B)。与来自无LPS下培养的U937细胞的培养基相比，在来自经LPS(10、30或100ng/ml)处理24小时的U937细胞的条件培养基中发炎性细胞因子(例如TNF-α、IL-6及IL-1β)的分泌显着更高(图6C)。

实例8：HGF中TNF-α及IL-6上调Tn表达

为确定细胞因子是否可使Tn含量升高，HGF用各种量的纯化细胞因子处理。如图7A中所示，HGF中的Tn含量对TNF-α的反应最大，对IL-6的反应中等，且对IL-1β无反应，即使在实验条件下100ng/ml的浓度下。TNF-α(30ng/ml)使Tn升高显示为时间依赖性的。在TNF-α处理4小时后，HGF中的Tn含量基本上不变。在8至12小时间观测到Tn含量逐渐增加。Tn含量在TNF-α处理24小时后逐渐减少，且在TNF-α处理48小时后显着减少(图7B)。

实例9：TNF-α经由下调COSMC基因来上调Tn表达

为探索在细胞因子介导的Tn含量上调下面的可能分子机制，研究TNF-α对COSMC基因的mRNA含量的作用。如图8A中所示，TNF-α(100ng/ml，处理24小时)显着下调HGF中的COSMC mRNA。相比之下，TNF-α未显着改变T-合成酶mRNA含量。在TNF-α处理后，观测到HGF中Cosmc及T-合成酶的蛋白质含量的结果类似(图8B、8C及8D)。TNF-α对COSMC基因下调的作用可能涉及其启动子中CpG岛的高甲基化。使用亚硫酸氢盐焦磷酸测序定量COSMC基因的启动子中的甲基化变化，TNF-α处理使四个CpG位点显着高甲基化(图9A)。用去甲基化剂预处理HGF以剂量依赖性方式减少COSMC启动子中四个CpG位点的甲基化(图9A)，且相对应地，增加COSMC mRNA的表达且减少Tn的含量(图9B)。总而言之，吾人的结果表明细胞因子介导的Tn含量上调是由涉及COSMC基因启动子的高甲基化的COSMC下调引起。

Claims (10)

1.一种单剂疫苗用于制备于个体诱导免疫反应以治疗或预防高氧诱发的肺损伤的药剂的用途，所述单剂疫苗每剂包含0.1mg至2mg的GalNAc-a-O-Ser/Thr(Tn)免疫原及佐剂溶液，所述Tn免疫原及佐剂溶液的体积比例为0.5至2，其中所述Tn免疫原与载体多肽结合，其中所述载体多肽是Fc片段-7重复的Pro-Cys-Cys-Gly-Cys-Cys-Gly-Cys-Gly-Cys-N-顺丁烯二亚酰胺或Fc片段-7重复的Pro-Cys-Cys-Gly-Cys-Cys-Gly-Cys-Gly-Cys-6-顺丁烯二亚酰胺基己酸N-琥珀酰亚胺酯。

2.如权利要求1的用途，其中每剂0.1mg至2mg的Tn免疫原以两周一次的时间间隔投与四次。

3.如权利要求2的用途，其中所述用途进一步包含在第四次免疫接种的一周后，以0.1mg至2mg的Tn免疫原进行额外免疫接种。

4.如权利要求1的用途，其中所述单剂疫苗的投与产生与控制组相比具有高血清效价的抗Tn抗体。

5.如权利要求4的用途，其中所述产生的抗Tn抗体的血清效价较控制组高至少2倍。

6.如权利要求1的用途，其中在投与所述疫苗后，个体中的白细胞介素-6(IL-6)及TNF-α的量或NF-κB的活性降低。

7.如权利要求1的用途，其中所述个体具有升高的Tn表达。

8.如权利要求7的用途，其中所述Tn表达由TNF-α及IL-6上调。

9.如权利要求7的用途，其中所述升高的Tn表达由细胞因子-Cosmc信号传导轴调控。

10.如权利要求1的用途，其中所述Tn免疫原与所述载体多肽的重量比为3至8:1。