TWI748394B - 製備毒素的方法 - Google Patents

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Abstract

本發明涉及一種用於培養肉毒桿菌的培養基組合物和使用該培養基組合物來製備肉毒桿菌毒素的方法，更具體地，涉及一種用於培養肉毒桿菌的培養基組合物，且該培養基組合物包括：一馬鈴薯蛋白腖、一酵母萃取物和葡萄糖，並且該培養基組合物能夠有效地縮短肉毒桿菌的培養時間，同時排除動物源性產品和主要過敏原；以及涉及一種使用該培養基組合物來製備一肉毒桿菌毒素的方法。

Description

製備毒素的方法
本發明涉及一種用於培養肉毒桿菌的培養基組合物和使用該培養基組合物來製備肉毒桿菌毒素的方法，更具體地，涉及一種用於培養肉毒桿菌的培養基組合物，該培養基組合物包括：一馬鈴薯蛋白腖,、一酵母萃取物和葡萄糖，並且該培養基組合物能夠有效地縮短肉毒桿菌的培養時間，同時排除動物源性產品和主要過敏原；以及一種使用該培養基組合物來製備一肉毒桿菌毒素的方法。
肉毒桿菌毒素是由丁酸梭菌(Clostridium butyricum )、巴氏梭菌(Clostridium baraffi )、肉毒桿菌(Clostridium botulinum )等細菌產生的一種神經毒蛋白。肉毒桿菌毒素可阻斷神經肌肉的傳導，造成人類和動物的神經麻痺疾病。特別地，A型肉毒桿菌毒素對於人類而言具有很強的致死性。除了A型肉毒桿菌毒素，還有B型、C1型、D型、E型、F型、G型和H型等6種鑑定出的肉毒桿菌毒素。每一種肉毒桿菌毒素的類型都可以透過相應的類型特異性抗體來區分，不同種類的肉毒桿菌毒素所造成的麻痹的嚴重程度和受其影響的動物種類不同。
肉毒桿菌毒素的蛋白分子的分子量約為150kD，包括一條約為50kD的輕鏈和一條與該輕鏈共軛的重鏈，該重鏈約為100kD。然而，從肉毒桿菌釋放的肉毒桿菌毒素是以150kD的毒素蛋白與至少一種非毒素蛋白的複合物的形式釋放的。例如，肉毒桿菌毒素以900kD、500kD和300kD的複合物形式釋放。
肉毒桿菌毒素對於人類而言可能是非常致命的，但最近開發出的肉毒桿菌毒素可以治療多種症狀，包括以骨骼肌過度活動(skeletal muscle hyperactivity)為特徵的神經肌肉疾病。例如，Botox® 是Allergan公司商業化開發的一個肉毒桿菌毒素A的商標，用於緩解或治療眼瞼痙攣、斜視、頸椎肌張力障礙和眉間(面部)皺紋，目前正在研究開發適用於其他血清型的應用以及在臨床上利用這些血清型。
臨床使用的肉毒桿菌毒素一般是從細胞培養物中分離出來的。傳統上，肉毒桿菌毒素主要是利用動物源性產品，然後通過培養、發酵和純化過程而分離出來的。然而，當使用動物源性產品來生產肉毒桿菌毒素時，擔心的是當將肉毒桿菌毒素施用於病人時，可能也會將來自動物的各種病原體或傳染性物質施加於該病人。例如，一種生產的肉毒桿菌毒素組合物中可能含有多種普恩蛋白。普恩蛋白是一種與細菌、病毒、真菌和寄生蟲完全不同的疾病感染因子。感染普恩蛋白的動物(包括人在內的動物)在感染普恩蛋白後，大腦會產生像海綿一樣的穿孔和神經細胞死亡，導致相應的大腦功能喪失。普恩蛋白可以從與產生正常蛋白質相同的核酸序列中產生一個異常的構形異構體(coformational isoform)，感染性存在於「招募反應(recruitment reaction)」過程中，正常的異構體在轉譯後階段成為普恩蛋白的異構型。正常的細胞所固有的蛋白誘導誤折疊成致病性普恩蛋白病毒結構。庫賈氏病(Creutzfeldt-Jakob disease)是一種罕見的人類傳播性海綿樣腦症(human transmissable spongiform encephalopathies)的神經退行性疾病，該疾病的傳染性物質是普恩蛋白的一種異常的異構體。患有庫賈氏病的受試者可能在6個月內由健康狀況加重為不動性緘默症(akinetic mutism)。因此，使用含有生物製劑(例如：經由動物源性產品而獲得的肉毒桿菌毒素)的藥物組合物來進行施用，具有引起普恩蛋白介導的疾病的風險，例如：庫賈氏病。
為了消除該風險，例如，在生產肉毒桿菌毒素的過程中，已經嘗試將動物源成分從培養基中排除。作為一個代表性的例子，Allergan公司設計了一種在含有大豆(作為植物源成分)的培養基中進行發酵的方法，在該方法中不是使用動物源成分(韓國專利公開號10-2006-0102330)，但該方法有一個問題，即菌株需要長時間的培養才能產生足夠量的肉毒桿菌毒素。
食物過敏是由免疫系統引起的對消化後的食物的異常反應。食物過敏一般是指在日常生活中出現嚴重不適的症狀，例如：蕁麻疹(hives)、血管性水腫(angioedema)、異位性皮膚炎(atopic dermatitis)等，並可能導致過敏性休克(anaphylaxis)，這是一種嚴重且危險的過敏反應，有可能危及生命。美國食品藥品監督管理局公佈的八種主要的食物過敏原因是牛奶、雞蛋、魚、甲殼類、堅果、花生、小麥和大豆，該些食物占食物過敏的總原因的85%至90%。
相應地，本發明人透過廣泛的努力，開發出一種能夠有效地培養產生肉毒桿菌毒素的菌株的成分，同時取代了含有動物源性成分的常規培養基，並且排除可能的多種過敏原，本發明人發現，當在含有一馬鈴薯蛋白腖、一酵母萃取物和葡萄糖的一培養基組合物中培養丁酸梭菌時，培養速度可以顯著地提高，從而使丁酸梭菌在極短的時間內達到最大的生長水平。根據此發現，本發明已經完成。
因此，針對上述問題，本發明的目的是提供一種製備肉毒桿菌毒素的方法，相較於傳統的培養基組合物，該方法使用能夠提高產生肉毒桿菌毒素的菌株的生長速度的培養基組合物來製備肉毒桿菌毒素，該培養基組合物作為一種排除動物源性產品和主要過敏原的組合物。
根據本發明的一個方面，上述和其他目的可以透過一種製備肉毒桿菌毒素的方法來達成，該方法包括：(a)藉由在用於培養肉毒桿菌的一培養基組合物中培養肉毒桿菌來生產一肉毒桿菌毒素，該培養基組合物包括：一馬鈴薯蛋白腖、一酵母萃取物和一葡萄糖；以及(b)回收該肉毒桿菌毒素。
除非另有定義，否則本文中使用的所有技術和科學術語具有與本發明所涉及的領域的通常知識者所理解含義相同的含義。一般來說，本文使用的命名法是本領域中眾所周知的，並且也是常用的。
在本發明中，確定的是當在含有一馬鈴薯蛋白腖、一酵母萃取物和葡萄糖的培養基(該培養基不含動物源性成分和過敏原)中培養該肉毒桿菌菌株時，該菌株在極短的時間內達到最高的生長水平，培養速度顯著提高。
因此，根據本發明的一個方面，本發明涉及一種用於培養肉毒桿菌的培養基組合物，該培養基組合物包括：一馬鈴薯蛋白腖、一酵母萃取物和葡萄糖。
本發明中使用的產生毒素的肉毒桿菌菌株可以是肉毒桿菌或其變種，最佳的菌株是A型肉毒桿菌、NCTC13319，但不限於上述的菌株。對於本領域中具有通常知識者而言，顯然可以使用任何能夠產生肉毒桿菌毒素的菌株。
本發明的特徵是該培養基組合物包括：2至5％(w/v)的馬鈴薯蛋白腖、0.5至2％(w/v)的酵母萃取物和0.75至1.5％(w/v)的葡萄糖，更佳地，該培養基組合物包括：3%(w/v)的馬鈴薯蛋白腖、1%(w/v)的酵母萃取物和1%(w/v)的葡萄糖，但不限於上述的比例。
同時，在本發明中，發現了當在使用本發明的培養基組合物來培養肉毒桿菌菌株時，在肉毒桿菌毒素的產生過程中，培養速度增加、回收時間也因此可以明顯縮短。即，在使用大豆蛋白腖來培養基肉毒桿菌的過程中，肉毒桿菌在24小時後表現出最大的生長水平。另一方面，根據本發明的肉毒桿菌在約14至18小時後表現出最大的生長水平。關於該毒素的回收時間，在常規的肉毒桿菌培養基的情況下，在培養開始至少48小時後獲得最大的毒素生產量，而在本發明中，在培養開始後的48小時內，即在培養約37小時時獲得最大的毒素生產量(參見圖7)。上述的效果被認為是在使用馬鈴薯蛋白腖的情況下而獲得的。
因此，根據本發明的另一個方面，本發明涉及一種製備肉毒桿菌毒素的方法，該方法包括：(a)藉由在用於培養肉毒桿菌的一培養基組合物中培養肉毒桿菌來生產一肉毒桿菌毒素，該培養基組合物包括：一馬鈴薯蛋白腖、一酵母萃取物和葡萄糖；以及(b)回收該肉毒桿菌毒素。
在本發明中，該肉毒桿菌可以是A型肉毒桿菌，較佳地為A型肉毒桿菌、NCTC13319，但不限於上述的肉毒桿菌。
在本發明中，用於培養的該培養基組合物不包括一動物源性產品和一過敏原。
在本發明中，該培養基組合物包括：2至5％(w/v)的馬鈴薯蛋白腖、0.5至2％(w/v)的酵母萃取物和0.75至1.5％(w/v)的葡萄糖。
當在含有3％(w/v)的一馬鈴薯蛋白腖、1％(w/v)的一酵母萃取物和1％(w/v)的葡萄糖(即本發明的各組成成分的組合物比的最佳模式)的培養基組合物中的該毒素生產量假設為100％時，如上文所述的多種成分的組合比是獲得90%的毒素生產程度的該組成成分的一組合比，該組合比是透過基於Minitab程序的最佳化濃度設定程序的一表面分析方法而得到的。即，當該培養基組合物中含有2至5％(w/v)的馬鈴薯蛋白腖、0.5至2％(w/v)的酵母萃取物和0.75至1.5％(w/v)的葡萄糖時，可以得到與使用含有3％(w/v)的馬鈴薯蛋白腖、1％(w/v)的酵母萃取物和1％(w/v)的葡萄糖的培養基組合物對應的90％的毒素產生程度。
在本發明中，該馬鈴薯蛋白腖可以以3％(w/v)的一含量存在、該酵母萃取物可以以1％(w/v)的一含量存在，以及該葡萄糖可以以1％(w/v)的一含量存在，但不限於上述的比例。
在本發明中，在該步驟(b)中開始培養後的48小時內，回收該肉毒桿菌毒素，較佳地，該肉毒桿菌毒素在該步驟(b)中開始培養後的40小時內回收。
在本發明中，該術語「不包括動物源性成分」是指基本上不包括動物源性成分或基本上不包括一動物蛋白，特別是指不包括或基本上不包括一血源性(blood-derived)、血池性(blood-pooled)和其他動物源性產品或化合物。術語 「動物 」是指哺乳動物(例如：人類)、鳥類、爬蟲類、魚類、昆蟲、蜘蛛或其他種類的動物。「動物 」不包括：微生物，例如：細菌。因此，屬於本發明的範圍內的不包括動物性產品的一培養基或方法或實質上不包括動物性產品的一培養基或方法可以包括：肉毒桿菌毒素或肉毒桿菌。例如，不包括動物性產品的方法或實質上不包括動物性產品的方法是指實質上不包括、基本上不包括或完全不包括一動物源性蛋白質的方法，例如：免疫球蛋白、肉類消化液、肉類副產品和乳或乳製品或消化液。因此，不包括一動物性產品的方法的多個例子包含：不包括肉類和乳製品或肉類和乳製品副產物的方法(例如：細菌培養法或細菌發酵法)。
如本文所用，術語「肉毒桿菌毒素 」不僅是指由肉毒桿菌產生的神經毒素，還指由非肉毒桿菌菌種重組所產生的肉毒桿菌毒素(或輕鏈或重鏈)。如本文所用，術語 「肉毒桿菌毒素」是指肉毒桿菌毒素亞型A、B、C、D、E、F、G和H(Weller C(2013年10月15日)。「New Botulinum Toxin Deemed Deadliest Substance Ever: Sniffing 13-Billionths of a Gram Can Kill」醫學日報)和G。如本文所用，肉毒桿菌毒素還包括：一肉毒桿菌毒素複合物(即300、600和900 kDa的複合物)以及一純肉毒桿菌毒素(即約150 kDa)。術語「純肉毒桿菌毒素」被定義為從其他多種蛋白質中分離或實質上分離的肉毒桿菌毒素，該些蛋白質包括：形成該肉毒桿菌毒素複合物的多種蛋白質。純肉毒桿菌毒素可以具有95％或更高的純度，較佳地為99％或更高的純度。
本發明提供了一種培養基，該培養基包括至少減少含量的動物或乳製品副產物，基本上不含動物或乳製品副產物。術語「動物或乳製品副產物」是指在動物(不包括細菌)細胞內或由動物(不包括細菌)細胞在體內或體外製備的一化合物或多種化合物的一組合物。較佳的非動物源性的培養基成分為例如：蛋白質、氨基酸和氮，包括：植物、微生物(例如：酵母菌)和合成的化合物。
根據本發明的培養基包括但不限於：一種用於發酵少量或大量肉毒桿菌的培養基、一種用於生長和培養的肉毒桿菌培養基，肉毒桿菌可接種到一種子(主要)培養基和一發酵(次要)培養基中，以及一種用於長期儲存肉毒桿菌培養物(例如：庫存培養物)的培養基。
作為本發明的一個具體較佳的實施例，一種用於肉毒桿菌的生長和生產肉毒桿菌毒素的培養基可以包括一種馬鈴薯衍生的成分，較佳地為一馬鈴薯蛋白腖，從而取代一動物衍生的成分。
本發明提供了一種生長肉毒桿菌的方法，該方法能夠使用基本上不含動物源成分的培養基，在最短的時間內最大限度地產生肉毒桿菌毒素。肉毒桿菌可以使用含有一馬鈴薯蛋白腖的一培養基組合物來生長肉毒桿菌，而不是使用一動物源成分。
在本發明的一個較佳的實施例中，肉毒桿菌的生長分成兩個步驟(即，種子生長和發酵)進行。較佳地，這兩個步驟在厭氧環境中進行。種子生長一般用於「擴大」儲存培養物中的微生物含量。種子生長的目的是為了增加可用於發酵的微生物含量。此外，種子的生長使儲存培養物中相對休眠的微生物重新煥發活力，並且生長為一積極生長的培養物。此外，相較於儲存的培養物，在更積極生長的培養物中，用於接種到該發酵培養基中的存活的微生物的體積和數量可以更精確地控制。因此，接種到一發酵培養基中的種子培養物的生長是較佳的。此外，可以使用包括在一種子培養基中生長的多個連續步驟，以擴大接種到一發酵培養基中的肉毒桿菌的量。發酵步驟中的肉毒桿菌的生長也可以透過從儲存的培養基中直接接種的方式來進行。
在該發酵步驟中，可以使用來自種子生長產物中含有肉毒桿菌的該種子培養基的一部分或全部用於接種到該發酵培養基中。較佳地，約1至10％的種子培養基含有來自該種子生長產物的肉毒桿菌，該種子培養基用於接種到該發酵培養基中。在大規模的厭氧環境中發酵，以產生最大的微生物量。
經由本發明的方法所培養的菌株的培養物中所包含的肉毒桿菌毒素可以透過具有蛋白質純化技術的通常知識者所知的蛋白質純化方法來分離和純化。
肉毒桿菌的生長可以在一個或多個步驟中進行。較佳地，生長在兩個步驟中進行。在第一個步驟中，種子生長，將肉毒桿菌懸浮在根據本發明的培養基組合物中，並且在34±1℃、在厭氧環境下培養10至24小時。較佳的，種子生長約14小時。較佳的，在將種子培養基中的最終生長產物接種到發酵培養基中之前，在該種子培養基中的任何步驟的生長都不會導致細胞自溶(cell autolysis)。
隨後，為了進一步生長肉毒桿菌，並回收該肉毒桿菌毒素，透過使用部分或全部種子生長的培養基來接種本發明的培養基組合物以進行第二步驟：發酵。接種後，將肉毒桿菌在34±1°C、在厭氧環境下培養約4天，並透過測量該培養基的光密度(OD)來監測肉毒桿菌的生長情況。較佳地，在使用根據本發明的培養基組合物的發酵步驟中，在約14小時和18小時後獲得最大的生長水平，細胞裂解、OD值下降，從而在發酵步驟中開始培養後的48小時內，更佳地為在40小時內從肉毒桿菌中回收肉毒桿菌毒素。
在本發明的一個較佳的實施例中，當將該肉毒桿菌的培養物在4℃下儲存以用於肉毒桿菌的長期儲存並且隨後接種該種子培養基，較佳地，肉毒桿菌儲存在一儲存培養基中(3%的馬鈴薯蛋白腖、1%的酵母萃取物、1%葡萄糖和25%甘油)，以使培養基在肉毒桿菌毒素的整個生產過程中基本上不含動物副產物。
例子：在下文中，將參考多個例子以更詳細地描述本發明。然而，對於本領域的通常知識者而言，顯而易見的是提供這些例子僅利用舉例的方式來說明本發明，而不應解釋為限制本發明的範圍。
例子1：樣品製備和細菌培養
1-1、樣品製備
本發明中使用的肉毒桿菌菌株為A型肉毒桿菌、NCTC13319，以及用於製備實驗組和對照組的培養基的樣品如下：植物蛋白腖(BD，211906)、色氨酸(BD，211705)、酵母萃取物(BD，212750)、馬鈴薯蛋白腖E210(Organotechnie，19425)、豌豆蛋白腖A482(Organotechnie，AI275)、植物蛋白腖E1(Organotechnie，19025)、選擇的植物酮UF(BD，210931)、大豆中的蛋白腖(Sigma，70178)、Hy-Soy(Kerry，5X59022)、Hy-peptone(Kerry，5X01111)、大豆蛋白腖A2SC(Organotechnie，19649)、大豆蛋白腖A3SC(Organotechnie，19685)、大豆蛋白腖E110(Organotechnie，19885)、大豆蛋白腖 K200(Organotechnie，19749)、葡萄糖(Sigma，G5767)、硫代乙醇酸鈉(Sigma，T0632)、純水(超純水或水質等於或高於超純水)。
1-2、細菌培養
將裝有肉毒桿菌菌株的一個小瓶保存在一低溫冷凍裝置中，在37℃的培養箱中解凍30分鐘。將肉毒桿菌菌株在BSC中均質3到5次，將0.1毫升的均質後的肉毒桿菌菌株接種到一培養基中，然後在34±1℃的厭氧培養箱中培養。培養後，使用分光光度計來測定OD600 值。
1-3、毒素程度的測定
採用肉毒桿菌神經毒素A型DuoSet ELISA(R&D系統)的檢測方法，按照廠商的說明書來控制、測定毒素的程度。將100微升的一捕獲抗體(經由在PBS中稀釋而製備的捕獲抗體)接種到一96孔盤的每個孔中，並且塗布持續16小時或以上，利用一洗滌緩衝液來洗滌每個孔，總共重複三次。利用試劑稀釋液阻斷每個孔，然後利用洗滌緩衝液來進行沖洗，總共清洗3次。
培養完成後，使用0.2微米的注射過濾器對該培養液進行消毒、稀釋後，將100微升的檢測抗體稀釋液加入到每個孔中，並允許反應2小時，然後使用洗滌緩衝液洗滌每個孔，總共重複3次。將100微升的檢測抗體稀釋液加入到每個孔中，並允許反應2小時，然後用洗滌緩衝液洗滌每個孔，共重複3次。將100微升的鏈黴素-HRP稀釋液加入到每個孔中，並允許反應20分鐘，利用洗滌緩衝液洗滌每個孔，共重複3次。100微升的底物溶液加入到每個孔中，並允許反應20分鐘，50微升的反應終止液加入到每個孔中，並適當搖動以終止酶的反應。使用微量盤式分析儀來測量在每個孔中的450奈米吸收度。
例子2：選擇替代TPYG培養基的腖
TPYG培養基含有一酪蛋白腖、一大豆蛋白腖、一酵母萃取物、葡萄糖和硫代乙醇酸鈉，該TPYG培養基是經常用於生產肉毒桿菌毒素的一傳統培養基，過去嘗試利用含有蛋白腖、酵母萃取物、葡萄糖和硫代乙醇酸鈉的一PYG培養基來代替該傳統培養基。
關於蛋白腖，已經選擇了包括植物蛋白腖在內的多種候選品，主要從一大豆衍生培養基和其他植物衍生培養基中選擇了與一TYPG培養基具有相似的毒素生產量的一植物衍生培養基。
2-1、比較的例子：TPYG培養基的製備
使用一稱量皿分別稱量2克的植物蛋白腖、1克的色氨酸、1克的酵母萃取物和0.1克的硫代乙醇酸鈉為，將50毫升的純化水加入到250毫升的燒杯中，將稱量的培養基成分加入該燒杯中，攪拌至成分完全溶解。用1N 的氫氧化鈉將pH值調節至7.2，將該燒杯中的該培養基轉移到100 毫升的質量筒(mass cylinder)中，將純化水加入到該質量筒中，將最終液面調節至95毫升，然後將製備好的培養基和一磁棒轉移到100毫升的玻璃瓶中，並且蓋上蓋子。
使用一稱量皿稱量1克的葡萄糖，將該稱量的葡萄糖放入含有約3 毫升純化水的一15毫升的錐形管中，透過振盪器使該葡萄糖充分溶解，然後將純化水加到錐形管中，將最終溶液量調整到5毫升。
將玻璃瓶的蓋子稍稍打開，使用鋁箔紙包裹該玻璃瓶，在121℃的高壓滅菌器中滅菌20分鐘。將滅菌後的培養基和葡萄糖在BSC中充分冷卻，然後將該葡萄糖轉移到該培養基中混合。
2-2、實驗例子：PYG培養基的製備
稱量表1所示的12種培養基成分，並將該些培養基成分溶解於50 毫升的純化水中，使用1N的氫氧化鈉將pH值調節至7.2，加入純化水以將最終液面調節成如表1所示，將該製備的培養基和一磁棒轉移到100毫升的玻璃瓶中，並且蓋上蓋子。
表1
培養基名稱 成分 (克) 最終液面水平 (毫升)
蛋白腖 酵母萃取物
PYG1 植物酮蛋白腖 3 1 95毫升
PYG2 馬鈴薯蛋白腖E210 3 95毫升
PYG3 豌豆蛋白腖A482 3 95毫升
PYG4 植物蛋白腖 E1 3 95毫升
PYG5 選擇的植物酮 UF 3 95毫升
PYG6 大豆中的蛋白腖 3 95毫升
PYG7 Hy-soy 3 95毫升
PYG8 Hy-蛋白腖 3 95毫升
PYG9 大豆蛋白腖A2SC 3 95毫升
PYG10 大豆蛋白腖 A3SC 3 95毫升
PYG11 大豆蛋白腖 E110 3 95毫升
PYG12 大豆蛋白腖 K200 3 95毫升
使用稱量皿稱量13克的葡萄糖，將稱量完成的葡萄糖溶解在65毫升的純化水中。將製備完成的葡萄糖轉移到一100毫升的玻璃瓶中，並且蓋上蓋子。
將製製完成的培養基和葡萄糖在121℃下滅菌20分鐘，將滅菌後的培養基和葡萄糖在BSC中充分冷卻，並且將5毫升的葡萄糖溶液分別轉移到各培養基中並且進行混合。
2-3、蛋白腖的選擇
肉毒桿菌菌株在例子2-1或例子2-2所製備的培養基中按照與例子1-2中相同的方式來進行培養，培養結束後測定OD600 值，並且利用與例子1-3中相同的ELISA法來測定毒素產生程度。
表2
培養基名稱 TPYG PYG1 PYG2 PYG3 PYG4
OD600 0.437 0.463 0.385 0.309 0.013
毒素程度 (毫克/升) 22.7 21.5 25.4 2.7 15.6
毒素程度 (相對值) 100 94.7 111.9 11.9 68.7
 
培養基名稱 TPYG PYG5 PYG6 PYG7 PYG8
OD600 0.447 0.360 0.372 0.414 0.532
毒素程度 (毫克/升) 28.8 27.0 16.6 18.5 18.5
毒素程度 (相對值) 100 93.8 57.6 64.2 64.2
 
培養基名稱 TPYG PYG9 PYG10 PYG11 PYG12
OD600 0.396 0.147 0.526 1.980 2.120
毒素程度 (毫克/升) 27.3 17.2 8.7 15.9 7.2
毒素程度 (相對值) 100 63.0 31.9 58.2 26.4
結果，培養完成後的OD600 值和毒素產生程度如表2所示，相較於該TPYG培養基，三種培養基(PYG1、PYG2和PYG5)顯示出相似的毒素程度和最大菌種溶解度，因此OD600 值小於1。這些結果透過反復試驗而再次驗證。從表3中可以看出，PYG1、PYG2和PYG5在重複試驗中也表現出與TPYG相似的毒素產生程度。其中，使用PYG2培養基以獲得最佳的培養基組成成分，該PYG2培養基不包括一動物成分和一主要的過敏原。
表3
培養基名稱 TPYG PYG1 PYG2 PYG5
OD600 0.541 0.514 0.650 0.433
毒素程度 (毫克/升) 27.4 28.4 24.7 22.3
毒素程度 (相對值) 100 103.6 90.1 81.4
例子3、培養基組合物的最佳化
為了找到透過一培養基篩選試驗而確定的馬鈴薯蛋白腖、酵母萃取物和葡萄糖的最佳濃度，透過DoE進行一濃度範圍試驗，並且根據因子實驗、中心點實驗和軸向點實驗的結果，確定了最佳組成成分。
3-1、因子實驗
使用包括表4所示的8個濃度範圍的成分的培養基成分來進行多個因子實驗。使用表4中所包含的成分，按照與例子2-2相同的方式製備培養基、按照與例子1-2相同的方式，在製備完成的培養基中培養肉毒桿菌菌株，在培養結束時測定OD600 值，並且透過與例子1-3中相同的ELISA法來測定毒素產生程度。
表4
培養基名稱 成分 最終液面水平 (毫升)
馬鈴薯蛋白腖E210  (克) 酵母萃取物 (克) 葡萄糖 (毫升)
因子實驗1 2 0.5 10 90
因子實驗2 5 0.5 2.5 97.5
因子實驗3 2 2 2.5 97.5
因子實驗4 5 2 10 90
因子實驗5 2 0.5 2.5 97.5
因子實驗6 5 2 2.5 97.5
因子實驗7 5 0.5 10 90
因子實驗8 2 2 10 90
因此，OD600 值和毒素程度的測定如表5所示。在此基礎上進行常態分佈分析，該分析包括一階和二階相互作用而不包括三階相互作用，三階相互作用的分析結果顯示除了蛋白腖與葡萄糖的一階和二階相互作用外，其餘因素對毒素產生程度均具有顯著性(圖1)，柏拉圖分析也顯示出與常態分佈分析相同的結果(圖2)。
表5
培養基名稱 培養基組合物 OD600 毒素程度 (毫克/升)
因子實驗1 馬鈴薯蛋白腖2% 酵母萃取物0.5% 葡萄糖2% 4.560 20.0
因子實驗2 馬鈴薯蛋白腖 5% 酵母萃取物0.5% 葡萄糖0.5% 0.805 3.0
因子實驗3 馬鈴薯蛋白腖 2% 酵母萃取物2% 葡萄糖0.5% 0.447 3.0
因子實驗4 馬鈴薯蛋白腖 5% 酵母萃取物2% 葡萄糖2% 7.600 9.6
因子實驗5 馬鈴薯蛋白腖 2% 酵母萃取物0.5% 葡萄糖0.5% 0.267 5.2
因子實驗6 馬鈴薯蛋白腖 5% 酵母萃取物2% 葡萄糖0.5% 0.838 4.5
因子實驗7 馬鈴薯蛋白腖 5% 酵母萃取物0.5% 葡萄糖2% 6.350 14.3
因子實驗8 馬鈴薯蛋白腖 2% 酵母萃取物2% 葡萄糖2% 5.080 13.0
3-2、中心點實驗
使用稱量皿分別稱量用於中心點實驗的培養基的24.5克的馬鈴薯蛋白腖E210、8.75克的酵母萃取物、0.7克的硫代乙醇酸鈉，將550 毫升的純化水放入1公升的燒杯中，將稱量完成的多種成分在該燒杯中攪拌，直至完全溶解。利用1N的氫氧化鈉將pH值調節至7.2，將該燒杯中的培養基轉移到1公升的質量筒中，將純化水加入該質量筒中，將最終液面調節至656.25毫升，然後將最終液面轉移到1公升的燒杯中，攪拌約5分鐘。將93.75毫升的培養基轉移到總共6個100 毫升的玻璃瓶中的每一個玻璃瓶，將磁棒注入該玻璃瓶中，並且蓋上蓋子，將每個培養基指定為中心點1至6中的任意一個。
使用稱量皿稱量8克的葡萄糖，並且將稱量完成的葡萄糖完全溶解於40 毫升的純化水中。
將製備完成的培養基和葡萄糖在121°C下滅菌20分鐘，將滅菌後的培養基和葡萄糖在BSC中充分冷卻，將6.25毫升的葡萄糖溶液轉移到各個培養基中並進行混合。
在由此製備的培養基中，按照與例子1-2中相同的方式來培養肉毒桿菌菌株，培養結束後測定OD600 值，使用與例子1-3中相同的ELISA法測定毒素產生程度。
表6
培養基 名稱 培養基組合物 OD600 毒素程度 (毫克/升)
中心點1 馬鈴薯蛋白腖3.5% 酵母萃取物1.25% 葡萄糖1.25% 3.360 20.2
中心點2 馬鈴薯蛋白腖3.5% 酵母萃取物1.25% 葡萄糖1.25% 1.630 21.1
中心點3 馬鈴薯蛋白腖3.5% 酵母萃取物1.25% 葡萄糖1.25% 4.810 16.4
中心點4 馬鈴薯蛋白腖3.5% 酵母萃取物1.25% 葡萄糖1.25% 4.300 16.2
中心點5 馬鈴薯蛋白腖3.5% 酵母萃取物1.25% 葡萄糖1.25% 4.830 15.9
中心點6 馬鈴薯蛋白腖3.5% 酵母萃取物1.25% 葡萄糖1.25% 5.010 15.1
將一個濃度的中心點實驗重複進行6次，結果如表6所示。根據中心點實驗的結果判斷曲線的存在與否時，P值為0.001，該P值小於0.05，P值小於0.05是判定具有顯著性的標準。因此，這表示該曲線是存在的，並且再進行作為一額外測試的表面分析。
表7
毒素的變異性分析(單位)
來源 DF Seq SS Adj SS Adj MS F P
主要效果 3 243.546 243.546 81.182 287.85 0.003
蛋白腖 1 12.103 12.103 12.103 42.92 0.023
酵母菌 1 19.469 19.469 19.469 69.03 0.014
葡萄糖 1 211.974 211.974 211.974 751.61 0.001
 
雙向交互作用 3 27.870 27.870 9.290 32.94 0.030
蛋白腖和酵母菌 1 4.381 4.381 4.381 15.53 0.059
蛋白腖和葡萄糖 1 8.528 8.528 8.528 30.24 0.032
酵母菌和葡萄糖 1 14.960 14.960 14.960 53.05 0.018
曲率 1 213.629 213.629 213.629 757.48 0.001
 
殘餘誤差 2 0.564 0.564 0.282    
缺適性 1 0.211 0.211 0.211 0.60 0.581
純誤差 1 0.353 0.353 0.353    
 
總計 9 485.609        
3-3、軸向點實驗
按照表8所示的重量來稱量用於軸向點實驗的6種培養基成分，並將該些成分溶解於50毫升的純化水中，利用1N的氫氧化鈉將pH值調節至7.2，再加入純化水以將最終液面調節至如表8所示。將各個製備完成的培養基和磁棒轉移到100毫升的玻璃瓶中，並且蓋上蓋子。
表8
培養基名稱 成分 最終液面水平 (毫升)
馬鈴薯蛋白腖E210 (克) 酵母萃取物 (克) 葡萄糖 (毫升)
軸向點1 3.5 1.25 12.5 87.5
軸向點2 1 1.25 6.25 93.75
軸向點3 6 1.25 6.25 93.75
軸向點4 3.5 0.025 6.25 93.75
軸向點5 3.5 2.5 6.25 93.75
軸向點6 3.5 1.25 0.125 99.875
使用稱量皿稱量8克的葡萄糖，將稱量完成的葡萄糖完全溶解在40毫升的純化水中。將製備完成的培養基和葡萄糖在121℃的高壓滅菌器中滅菌20分鐘，將滅菌後的培養基和葡萄糖在BSC中充分冷卻，然後將該葡萄糖溶液按照表8所示的量加入到各培養基中。
在由此製備的培養基中，按照與例子1-2中相同的方式培養該肉毒桿菌菌株，在培養結束時測定OD600 值，並且透過與例子1-3中相同的ELISA法來測定毒素產生程度。因此，測定的軸向點值如表9所示。
表9
培養基 名稱 培養基組合物 OD600 毒素程度 (毫克/升)
軸向點1 馬鈴薯蛋白腖 3.5% 酵母萃取物1.25% 葡萄糖 2.5% 5.53 7.2
軸向點2 馬鈴薯蛋白腖 1% 酵母萃取物1.25% 葡萄糖 1.25% 2.550 12.8
軸向點3 馬鈴薯蛋白腖 6% 酵母萃取物1.25% 葡萄糖1.25% 0.416 20.0
軸向點4 馬鈴薯蛋白腖 3.5% 酵母萃取物0.025% 葡萄糖1.25% 2.240 8.1
軸向點5 馬鈴薯蛋白腖 3.5% 酵母萃取物2.5% 葡萄糖1.25% 0.447 21.2
軸向點6 馬鈴薯蛋白腖 3.5% 酵母萃取物1.25% 葡萄糖0.025% 0.986 0.3
3-4、經由表面分析進行的最佳化濃度分析
根據因子實驗、中心點實驗和軸向點實驗的結果進行了表面分析。在模型擬合度分析(model suitability analysis)中，分析了常態概率圖、直方圖、殘差值對擬合值的關係圖，以及殘差值對時間順序的關係圖。其中，常態概率圖確定為一條直線、直方圖以常態分佈形式出現、殘差對擬合值的關係圖和殘差值對時間順序的關係圖則是沒有規律(no pattern)的。在此基礎上，確定選擇的模型是合適的(圖3)。
使用表面分析法測定該培養基組合物，測定的結果如圖4所示，根據圖5所示的結果計算出最佳比例，並將從最佳比例得到的最佳濃度匯總於表10。
表10
成分名稱 馬鈴薯蛋白腖 酵母萃取物 葡萄糖
最佳濃度 (%) 3% 1% 1.5%
3-5、確定最佳組成比例
根據毒素產生程度以透過表面分析法設定該最佳濃度，並且最終目標是使一組合物具有最高的毒素產生程度和在培養後OD600 值為1或更少的濃度。因此，將葡萄糖濃度(被認為對毒素產生程度和OD600 值影響最大)更改為0.75、1、1、1.25、1.5、1.5％，以得到最佳的培養基組合物，其結果如表11和圖6所示。最佳的培養基組合物確定具有3%的馬鈴薯蛋白腖、1%的酵母萃取物和1%的葡萄糖。
表11
培養基 名稱 培養基組合物 OD600 毒素程度 (毫克/升)
0.75% 馬鈴薯蛋白腖3% 酵母萃取物1% 葡萄糖0.75% 0.343 1.500
1% 馬鈴薯蛋白腖3% 酵母萃取物1% 葡萄糖1% 0.877 24.72
1.25% 馬鈴薯蛋白腖3% 酵母萃取物1% 葡萄糖1.25% 3.230 18.95
1.5% 馬鈴薯蛋白腖3% 酵母萃取物1% 葡萄糖1.5% 6.580 10.65
例子4：根據最佳培養組合物進行的菌株培養實驗
在37℃的培養箱中解凍30分鐘，將一個裝有肉毒桿菌菌株的小瓶儲存在一低溫冷凍裝置中。將肉毒桿菌菌株在BSC中均質3至5次，將1毫升的均質後的肉毒桿菌菌菌株接種到在2公升細胞袋中的100毫升的PYG培養基，並且在34±1°C的培養箱中培養(WAVE25)。100毫升的菌株培養物接種到5L的PYG培養基中，在菌株自溶前的10到24小時之間進行培養。然後，隨著時間測定在600奈米波長下的吸收度和毒素程度。使用0.2微米的抗菌過濾器從每個樣品中僅回收該培養液，然後利用與例子1-3相同的方法來測定毒素程度。
使用上述培養基組合物進行培養時，測量的OD值和毒素產生程度隨時間的變化的結果表明，根據本發明的培養基組合物可使菌株培養的OD600 值在約14至15小時內達到最大值，因此與傳統的肉毒桿菌培養基組合物相比，可顯著縮短培養時間，在35℃下培養約28小時後和在33℃下培養約37小時後，可獲得最大的毒素產生程度。
例子5：最佳培養組合物與其他培養組合物的培養效果的比較
培養效果，當使用例子3中得出的最佳組成比例以外的範圍內的大豆蛋白腖和最佳組成比例時，測定其培養效果。為此，按照表12所示的組成比例製備各培養基，並測定各個培養基的培養效果。因此，從表13中可以看出，相較於比較的例子，實驗組在毒素產生程度或細胞培養時間方面具有優勢。具體而言，在比較例子1中使用馬鈴薯蛋白腖的情況下，達到最大細胞量(maximum cell mass)所需的時間明顯縮短，但發現在相應的組成比例下，最大的毒素生產量遠低於實驗組。另一方面，在比較例子2中使用大豆蛋白腖的情況下，發現達到最大細胞量所需的時間遠多於實驗組。
表12
  葡萄糖 酵母萃取物 蛋白腖
實驗組 1 1 3 (馬鈴薯)
比較例子1 1 0.1 1 (馬鈴薯)
比較例子2 1 1 3 (大豆)
表13
  最大細胞量 (AU) 達到最大細胞量所需的時間 最大毒素生產量 (毫克/公升) 達到最大毒素生產量所需的時間
實驗組 7.92 14小時 24.8 37小時
比較例子1 2.74 21小時 8.52 47小時
比較例子2 7.64 31小時 18.25 52小時
產業利用性：
根據本發明，肉毒桿菌毒素是透過排除動物源性成分和主要過敏原而產生的，當將本發明製備的肉毒桿菌毒素施用於人體時，可防止因異常普恩蛋白的堆積而引起的傳播性海綿樣腦症，以及由過敏性反應(稗子、血管性水腫、異位性皮膚炎、過敏性休克)引起的不良反應。此外，當使用馬鈴薯蛋白腖排除動物源性成分和主要過敏原時，可在短時間內誘導產生肉毒桿菌毒素的菌株以達到最大生長量，因此在肉毒桿菌毒素生產的過程中，能夠達到縮短生產時間、降低生產成本的效果。
儘管已經詳細描述了本發明的具體配置，但是本發明的通常知識者將理解，本發明描述的內容是為了說明目的而提出的較佳實施例，該些實施例不應被理解為限制本發明的範圍。因此，本發明的實質範圍由所附申請專利範圍及其等同物定義。
在以下結合多個附圖所進行的詳細描述中，將更清楚地理解本發明的上述內容及其他目的、特徵和本發明的其他優點，其中：
圖1示出根據本發明的多種成分在基於8個濃度範圍內進行的因子實驗的結果來進行常態分佈分析(normal distribution analysis)的結果； 圖2示出根據本發明的多種成分在基於8個濃度範圍內進行的因子實驗結果的柏拉圖分析(pareto analysis)的結果； 圖3示出根據本發明的多種成分在基於因子實驗、中心點實驗和軸向點實驗的結果的模型適用性的分析結果； 圖4示出根據本發明的多種成分在基於因子實驗、中心點實驗和軸向點實驗的結果所進行的表面分析的結果； 圖5示出根據本發明的多種成分在基於表面分析結果所測定的最佳比例的結果； 圖6示出根據本發明的最佳比例中的可變葡萄糖濃度，根據該毒素程度和菌株生長的吸收度的測定結果；以及 圖7示出當在本發明的最佳化培養基組合物中培養肉毒桿菌時，根據毒素程度和隨時間增長的菌株生長的吸收度測定的結果。

Claims (5)

  1. 一種製備肉毒桿菌毒素的方法，包括：(a)藉由在用於培養肉毒桿菌的一培養基組合物中培養肉毒桿菌來生產一肉毒桿菌毒素，該培養基組合物包括：2至5%(w/v)的馬鈴薯蛋白腖、0.5至2%(w/v)的酵母萃取物和0.75至1.5%(w/v)的葡萄糖；以及(b)回收該肉毒桿菌毒素。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該肉毒桿菌是A型肉毒桿菌。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中用於培養的該培養基組合物不包括一動物源性產品和一過敏原。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該培養基組合物包括：3%(w/v)的馬鈴薯蛋白腖、1%(w/v)的酵母萃取物和1%(w/v)的葡萄糖。
  5. 如申請專利範圍第4項所述之方法，其中在該步驟(b)中開始培養後的40小時內，回收該肉毒桿菌毒素。
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WO2006042542A2 (en) * 2004-10-19 2006-04-27 Statens Serum Institut Production of tetanus, diphtheria, and pertussis toxins and toxoids using fermentation media containing no components of animal or soy origin

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