CN113811616A

CN113811616A - 制备毒素的方法

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Publication number: CN113811616A
Application number: CN202080034761.2A
Authority: CN
Inventors: 金在永; 南桢宣; 金昇昊; 金玟中; 李元一; 尹范镇
Original assignee: Gitma Co ltd
Current assignee: Gitma Co ltd
Priority date: 2019-03-29
Filing date: 2020-03-12
Publication date: 2021-12-17
Also published as: EP3950951A2; US20220195412A1; TW202102681A; BR112021019233A2; TWI748394B; EP3950951A4; KR102209159B1; KR20200114721A; WO2020204395A2; WO2020204395A3; MX2021011744A

Abstract

本发明涉及一种用于培养肉毒杆菌(Clostridium botulinum)的培养基组合物和使用该培养基组合物来制备肉毒杆菌毒素的方法，该培养基组合物包括：马铃薯蛋白胨、酵母提取物和葡萄糖。根据本发明，该培养基是排除了动物源性产品和主要过敏原培养基，并且在短时间内诱导产生肉毒杆菌毒素的菌株达到最大生长水平，由此具有缩短肉毒杆菌毒素产生过程的产生时间以及降低生产单位成本的作用。

Description

制备毒素的方法

发明背景

发明领域

本发明涉及一种用于培养肉毒杆菌(Clostridium botulinum)的培养基组合物和使用该培养基组合物来制备肉毒杆菌毒素的方法，更具体地，涉及一种用于培养肉毒杆菌的培养基组合物，该培养基组合物包括马铃薯蛋白胨、酵母提取物和葡萄糖，并且该培养基组合物能够有效地缩短肉毒杆菌的培养时间，同时排除动物源性产品和主要过敏原；以及一种使用该培养基组合物来制备肉毒杆菌毒素的方法。

相关技术

肉毒杆菌毒素是由细菌诸如丁酸梭菌(Clostridium butyricum)、巴氏梭菌(Clostridium baraffi)和肉毒杆菌(Clostridium botulinum)产生的一种神经毒蛋白。肉毒杆菌毒素阻断神经肌肉的传导，并且造成人类和动物的神经麻痹疾病。特别地，已知A型肉毒杆菌毒素对于人类而言具有很强的致死性。除了A型肉毒杆菌毒素，已经鉴定出B型、C1型、D型、E型、F型、G型和H型6种其它肉毒杆菌毒素。每种类型的肉毒杆菌毒素都可以通过相应的类型特异性抗体来区分，不同种类的肉毒杆菌毒素所造成的麻痹的严重程度和受其影响的动物种类不同。

肉毒杆菌毒素的蛋白分子的分子量约为150kD，包括一条约为50kD的轻链和一条与该轻链缀合的约100kD的重链。然而，从肉毒杆菌释放的肉毒杆菌毒素是以150kD的毒素蛋白与至少一种非毒素蛋白的复合物的形式释放的。例如，肉毒杆菌毒素以900kD、500kD和300kD的复合物形式释放。

肉毒杆菌毒素对于人类而言可能是非常致命的，但最近开发出的肉毒杆菌毒素用于治疗多种症状，包括以骨骼肌过度活动(skeletal muscle hyperactivity)为特征的神经肌肉障碍。例如，

是Allergan公司商业化开发的肉毒杆菌毒素A的商标，其用于缓解或治疗眼睑痉挛、斜视、颈部肌张力障碍和眉间(面部)皱纹，并且目前正在研究开发适用于其他血清型的应用以及在临床上利用这些血清型。

供临床使用的肉毒杆菌毒素一般是从细胞培养物中分离出来的。传统上，肉毒杆菌毒素主要是利用动物源性产品，通过培养、发酵和纯化过程而分离出来的。然而，当使用动物源性产品来生产肉毒杆菌毒素时，担心的是当将肉毒杆菌毒素施用至患者时，可能也会将来自动物的多种病原体或感染性物质施用至该患者。例如，一种生产的肉毒杆菌毒素组合物中可能含有朊病毒。朊病毒是一种与细菌、病毒、真菌和寄生虫完全不同的疾病感染因子。感染朊病毒的动物(包括人)会经历大脑像海绵一样的穿孔和神经细胞死亡，导致相应的大脑功能丧失。朊病毒可以从与产生正常蛋白质相同的核酸序列中生成异常的构象同种型，感染性存在于“招募反应”期间，正常的异构体在翻译后阶段成为朊病毒蛋白质同种型。正常的固有细胞蛋白诱导错误折叠而致病性朊病毒病毒结构。克雅二氏病(Creutzfeldt-Jakob disease)是一种罕见的人传播性海绵样脑症的神经退行性疾病，并且传染性物质是朊病毒蛋白的一种异常同种型。患有克雅二氏病的受试者可在6个月内由健康状况恶化为无动性缄默症。因此，施用含有使用动物源性的产品获得的生物制剂(诸如肉毒杆菌毒素)的药物组合物具有引起朊病毒介导的疾病(诸如克雅二氏病)的风险。

为了去除该风险，例如，已经尝试了在生产肉毒杆菌毒素的过程中将动物源成分从培养基中排除。作为示例性实例，Allergan公司设计了一种在含有大豆作为植物源成分的培养基中进行发酵的方法，在该方法中不使用动物源成分(韩国专利公开号10-2006-0102330)，但该方法具有以下问题，即需要长时间培养菌株以产生足够量的肉毒杆菌毒素。

食物过敏是由免疫系统引起的对消化后的食物的异常应答。食物过敏通常涉及在日常生活中引起严重不适的症状，诸如荨麻疹、血管性水肿、特应性皮炎，并且食物过敏可导致过敏性反应，器是一种严重且危险的过敏反应，有可能危及生命。FDA公布的八种主要的食物过敏原因是牛奶、鸡蛋、鱼、甲壳类、坚果、花生、小麦和大豆，该些食物占食物过敏的总原因的85％至90％。

因此，通过广泛的努力以开发出一种能够有效地培养产生肉毒杆菌毒素的菌株的成分，同时取代了含有动物源性成分的常规培养基，并且排除可能的过敏原，本发明人发现，当在含有马铃薯蛋白胨、酵母提取物和葡萄糖的培养基组合物中培养丁酸梭菌时，培养速度可以显著地改善，从而使丁酸梭菌在极短的时间内达到最大的生长水平。基于此发现，已经完成了本发明。

发明内容

因此，本发明是鉴于上述问题而作出的，并且本发明的目的是提供一种制备肉毒杆菌毒素的方法，相较于传统的培养基组合物，该方法使用能够改善产生肉毒杆菌毒素的菌株的生长速度的培养基组合物来制备肉毒杆菌毒素，该培养基组合物作为一种排除动物源性产品和主要过敏原的组合物。

根据本发明的一个方面，上述和其他目的可以通过提供一种制备肉毒杆菌毒素的方法来实现，该方法包括：(a)通过在用于培养肉毒杆菌的培养基组合物中培养肉毒杆菌来生产肉毒杆菌毒素，该培养基组合物包括马铃薯蛋白胨、酵母提取物和葡萄糖；以及(b)回收该肉毒杆菌毒素。

附图简述

在以下结合多个附图所进行的详细描述中，将更清楚地理解本发明的上述内容及其他目的、特征和本发明的其他优点，其中：

图1示出根据本发明的多种成分在基于8个浓度范围内进行的因子实验的结果的正态分布分析结果；

图2示出根据本发明的多种成分在基于8个浓度范围内进行的因子实验结果的帕累托图分析的结果；

图3示出根据本发明的多种成分在基于因子实验、中心点实验和轴向点实验的结果的模型适用性的分析结果；

图4示出基于对根据本发明的多种成分进行的因子实验、中心点实验和轴向点实验的结果的表面分析结果；

图5示出基于对根据本发明的多种成分的表面分析结果所测定的最佳比例的结果；

图6示出根据本发明的最佳比例中的可变葡萄糖浓度，根据该毒素程度和菌株生长的吸收度的测定结果；以及

图7示出当在本发明的优化培养基组合物中培养肉毒杆菌时，根据毒素程度和随时间的菌株生长的吸收度测定的结果。

发明详述

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所涉及的领域中技术人员所理解的含义相同的含义。一般来说，本文使用的命名法是本领域中众所周知的，并且也是常用的。

在本发明中，确定的是当在含有马铃薯蛋白胨、酵母提取物和葡萄糖的培养基(该培养基不含动物源性成分和过敏原)中培养该肉毒杆菌菌株时，该菌株在极短的时间内达到最高的生长水平，并且培养速度显著提高。

因此，在一方面，本发明涉及一种用于培养肉毒杆菌的培养基组合物，该培养基组合物包括马铃薯蛋白胨、酵母提取物和葡萄糖。

本发明中使用的产生毒素的肉毒杆菌菌株可以是肉毒杆菌或其变种，最优选的是A型肉毒杆菌，NCTC13319，但不限于上述的菌株。对于本领域技术人员而言，显然可以使用能够产生肉毒杆菌毒素的任何菌株。

本发明的特征在于所述培养基组合物包括2至5％(w/v)的马铃薯蛋白胨、0.5至2％(w/v)的酵母提取物和0.75至1.5％(w/v)的葡萄糖，最优选地，所述培养基组合物包括3％(w/v)的马铃薯蛋白胨、1％(w/v)的酵母提取物和1％(w/v)的葡萄糖，但不限于此。

同时，在本发明中，发现了当在使用所述培养基组合物来培养肉毒杆菌菌株时，在产生肉毒杆菌毒素的过程中，培养速度增加，回收时间也因此可以显著缩短。即，在使用大豆蛋白胨来培养基肉毒杆菌中，肉毒杆菌在24小时后表现出最大的生长水平。另一方面，根据本发明的肉毒杆菌在约14至18小时中表现出最大的生长水平。关于该毒素的回收时间，在常规的肉毒杆菌培养的情况下，在培养至少48小时后获得最大的毒素产量，而在本发明中，在培养48小时内，即在培养约37小时时，获得最大的毒素产量(参见图7)。上述的效果被认为是在使用马铃薯蛋白胨作为蛋白胨的情况下而获得的。

因此，根据本发明的另一方面，本发明涉及一种制备肉毒杆菌毒素的方法，该方法包括：(a)通过在用于培养肉毒杆菌的培养基组合物中培养肉毒杆菌来生产肉毒杆菌毒素，该培养基组合物包括马铃薯蛋白胨、一酵母提取物和葡萄糖；以及(b)回收该肉毒杆菌毒素。

在本发明中，该肉毒杆菌可以是A型肉毒杆菌，优选为A型肉毒杆菌，NCTC13319，但不限于此。

在本发明中，用于培养的该培养基组合物不包括动物源性产品和过敏原。

在本发明中，该培养基组合物包括2至5％(w/v)的马铃薯蛋白胨、0.5至2％(w/v)的酵母提取物和0.75至1.5％(w/v)的葡萄糖。

当在含有3％(w/v)的马铃薯蛋白胨、1％(w/v)的酵母提取物和1％(w/v)的葡萄糖(其是本发明的组分的组合物比的最佳模式)的培养基组合物中的该毒素产量假设为100％时，如上文所述的多种成分的组合比是获得90％的毒素生产水平的该组分的组合比，该组合比是通过基于Minitab程序的优化浓度设定程序的一种表面分析方法而得到的。即，当该培养基组合物中含有2至5％(w/v)的马铃薯蛋白胨、0.5至2％(w/v)的酵母提取物和0.75至1.5％(w/v)的葡萄糖时，可以得到对应于在含有3％(w/v)的马铃薯蛋白胨、1％(w/v)的酵母提取物和1％(w/v)的葡萄糖的培养基组合物情况下的毒素产生水平的90％的毒素产生水平。

在本发明中，所述马铃薯蛋白胨可以以3％(w/v)的含量存在、所述酵母提取物可以以1％(w/v)的含量存在，以及所述葡萄糖可以以1％(w/v)的含量存在，但不限于此。

在本发明中，在该步骤(b)中开始培养后的48小时内，回收该肉毒杆菌毒素，优选地，所述肉毒杆菌毒素在该步骤(b)中开始培养后的40小时内回收。

在本发明中，术语“不包括动物源性成分”是指基本上不包括动物源性成分或基本上不包括动物蛋白，特别是指不包括或基本上不包括血源性、血液集中的(blood-pooled)和其他动物源性产品或化合物。术语“动物”是指哺乳动物诸如人)、鸟类、爬虫类、鱼类、昆虫、蜘蛛或其他种类的动物。“动物”不包括微生物，诸如细菌。因此，属于本发明的范围内的不包括动物性产品的培养基或方法或基本上不包括动物性产品的培养基或方法可以包括肉毒杆菌毒素或肉毒杆菌。例如，不包括动物性产品的方法或基本上不包括动物性产品的方法是指基本上不包括、实质上不包括或完全不包括动物源性蛋白质的方法，例如免疫球蛋白、肉类消化液、肉类副产品和乳或乳制品或分解物。因此，不包括动物性产品的方法的多个实例包含不包括肉类和乳制品或肉类和乳制品副产物的方法(诸如细菌培养法或细菌发酵法)。

如本文所用，术语“肉毒杆菌毒素”不仅是指由肉毒杆菌产生的神经毒素，还指由非肉毒杆菌菌种重组所产生的肉毒杆菌毒素(或轻链或重链)。如本文所用，术语“肉毒杆菌毒素”是指肉毒杆菌毒素亚型A、B、C、D、E、F、G和H(Weller C(2013年10月15日)，“NewBotulinum Toxin Deemed Deadliest Substance Ever:Sniffing 13-Billionths of aGram Can Kill”，Medical Daily)和G。如本文所用，肉毒杆菌毒素还包括：肉毒杆菌毒素复合物(即300、600和900kDa复合物)以及纯肉毒杆菌毒素(即，约150kDa)。术语“纯肉毒杆菌毒素”被定义为从其他蛋白质中分离或基本上分离的肉毒杆菌毒素，该些蛋白质包括形成该肉毒杆菌毒素复合物的蛋白质。纯肉毒杆菌毒素可以具有95％或更高的纯度，优选为99％或更高的纯度。

本发明提供了一种培养基，该培养基包括至少降低水平的动物或乳制品副产物，基本上不含动物或乳制品副产物。术语“动物或乳制品副产物”是指在动物(不包括细菌)细胞中或由动物(不包括细菌)细胞在体内或体外制备的化合物或化合物的组合物。优选的非动物源性的培养基成分如蛋白质、氨基酸和氮包括植物、微生物(诸如酵母菌)和合成的化合物。

根据本发明的培养基包括但不限于一种用于发酵少量或大量肉毒杆菌的培养基、一种用于生长和培养肉毒杆菌的培养基，该肉毒杆菌用于接种到种子(初级)培养基和发酵(次级)培养基中，以及一种用于长期储存肉毒杆菌培养物(例如储用培养物)的培养基。

作为本发明的一个具体优选的实施例，用于肉毒杆菌的生长和生产肉毒杆菌毒素的培养基可以包括一种马铃薯来源的成分，优选为马铃薯蛋白胨，从而取代动物来源的成分。

本发明提供了一种生长肉毒杆菌的方法，该方法能够使用基本上不含动物源成分的培养基，在最短的时间内最大限度地产生肉毒杆菌毒素。可以使用含有马铃薯蛋白胨的培养基组合物来生长肉毒杆菌，而不是使用动物来源的成分。

在本发明的一个优选的实施例中，肉毒杆菌的生长分成两个步骤(即，种子生长和发酵)进行。优选地，这两个步骤在厌氧环境中进行。种子生长一般用于“扩大”储存培养物中的微生物含量。种子生长的目的是为了增加可用于发酵的微生物含量。此外，种子的生长使储存培养物中相对休眠的微生物重新焕发活力，并且生长为积极生长的培养物。此外，相较于储存的培养物，在更积极生长的培养物中，用于接种到发酵培养基中的存活的微生物的体积和数量可以更精确地控制。因此，接种到发酵培养基中的种子培养物的生长是优选的。此外，可以使用包括在种子培养基中生长在内的多个连续步骤，以扩大接种到发酵培养基中的肉毒杆菌的量。发酵步骤中的肉毒杆菌的生长也可以通过从储存的培养基中直接接种来进行。

在发酵步骤中，来自种子生长产物中含有肉毒杆菌的种子培养基的部分或全部可以用于接种到发酵培养基中。优选地，约1至10％的来自种子生长产物中含有肉毒杆菌的种子培养基用于接种到发酵培养基中。发酵用于在大规模的厌氧环境中产生最大的量的微生物。

经由本发明的方法所培养的菌株的培养物中所包含的肉毒杆菌毒素可以使用蛋白质纯化领域中的技术人员所知的蛋白质纯化方法来分离和纯化。

肉毒杆菌的生长可以在一个或多个步骤中进行。优选地，生长在两个步骤中进行。在第一个步骤中，种子生长，将肉毒杆菌悬浮在根据本发明的培养基组合物中，并且在34±1℃、在厌氧环境下培养10至24小时。优选地，种子生长约14小时。优选的，在将种子培养基中的最终生长产物接种到发酵培养基中之前，在该种子培养基中在任何步骤下的生长都不会导致细胞自溶(cell autolysis)。

随后，为了进一步生长肉毒杆菌，并回收该肉毒杆菌毒素，第二步骤，发酵，是通过使用部分或全部种子生长的培养基接种本发明的培养基组合物来进行的。接种后，将肉毒杆菌在34±1℃、在厌氧环境下培养约4天，并通过测量培养基的光密度(OD)来监测肉毒杆菌的生长情况。优选地，在使用根据本发明的培养基组合物的发酵步骤中，在约14小时和18小时后获得最大的生长水平，细胞裂解、OD值下降，从而在发酵步骤中孵育后的48小时内，更优选为在40小时内从肉毒杆菌中回收肉毒杆菌毒素。

在本发明的一个优选的实施方案中，当将该肉毒杆菌的培养物在4℃下储存以用于肉毒杆菌的长期储存并且随后接种该种子培养基，优选地，肉毒杆菌储存在储存培养基(3％的马铃薯蛋白胨、1％的酵母提取物、1％葡萄糖和25％甘油)中，以使培养基在肉毒杆菌毒素的整个生产过程中基本上不含动物副产物。

实施例

在下文中，将参考多个实施例以更详细地描述本发明。然而，对于本领域技术人员而言，显而易见的是提供这些实施例仅利用示例本发明，而不应解释为限制本发明的范围。

实施例1：样品制备和细菌培养

1-1、样品制备

本发明中使用的肉毒杆菌菌株为A型肉毒杆菌，NCTC13319，以及用于制备实验组和对照组的培养基的样品如下：植物蛋白胨(BD，211906)、色氨酸(BD，211705)、酵母提取物(BD，212750)、马铃薯蛋白胨E210(Organotechnie，19425)、豌豆蛋白胨A482(Organotechnie，AI275)、植物蛋白胨E1(Organotechnie，19025)、选择的植物酮UF(BD，210931)、来自大豆的蛋白胨(Sigma，70178)、Hy-Soy(Kerry，5X59022)、Hy-peptone(Kerry，5X01111)、大豆蛋白胨A2SC(Organotechnie，19649)、大豆蛋白胨A3SC(Organotechnie，19685)、大豆蛋白胨E110(Organotechnie，19885)、大豆蛋白胨K200(Organotechnie，19749)、葡萄糖(Sigma，G5767)、硫代乙醇酸钠(Sigma，T0632)、纯水(超纯水或水质等于或高于超纯水)。

1-2、细菌培养

将保存在低温冷冻装置中的含有肉毒杆菌菌株的一个小瓶在37℃的培养箱中解冻30分钟。将肉毒杆菌菌株在BSC中匀浆3到5次，将0.1毫升的匀浆后的肉毒杆菌菌株接种到培养基中，然后在34±1℃的厌氧培养箱中培养。培养后，使用分光亮度计来测量OD₆₀₀值。

1-3、毒素水平测量

通过按照制造商的说明书控制的肉毒杆菌神经毒素A型DuoSet ELISA(R&D系统)的测试方法，测定毒素的水平。将100μL的捕获抗体(经由在PBS中稀释而制备的捕获抗体)接种到96孔微板的每个孔中，并且涂布持续16小时或以上，利用洗涤缓冲液来洗涤每个孔，总共重复三次。利用试剂稀释液封闭每个孔，然后利用洗涤缓冲液来进行冲洗，总共清洗3次。

培养完成后，使用0.2μm的注射过滤器对该培养液进行灭菌，稀释，将100微升的培养液加入到每个孔中，并允许反应2小时，然后使用洗涤缓冲液洗涤每个孔，总共重复3次。将100微升的检测抗体稀释液加入到每个孔中，并允许反应2小时，然后用洗涤缓冲液洗涤每个孔，共重复3次。将100微升的链霉素-HRP稀释液加入到每个孔中，并允许反应20分钟，利用洗涤缓冲液洗涤每个孔，共重复3次。100微升的底物溶液加入到每个孔中，并允许反应20分钟，将50微升的反应终止液加入到每个孔中，并适当摇动以终止酶的反应。使用酶标仪来测量在每个孔中的450nm吸收度。

实施例2.选择替代TPYG培养基的蛋白胨

含有酪蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母提取物、葡萄糖和硫代乙醇酸钠的TPYG培养基是经常用于生产肉毒杆菌毒素的常规培养基，已尝试利用包括蛋白胨、酵母提取物、葡萄糖和硫代乙醇酸钠的PYG培养基来代替该常规培养基。

关于蛋白胨，选择包括植物蛋白胨在内的多种候选物，主要从大豆来源的培养基和其他植物来源的培养基中选择与TYPG培养基具有相似的毒素生产量的植物来源的培养基。

2-1、比较的实施例：TPYG培养基的制备

使用称重皿分别称重2克植物蛋白胨、1克色氨酸、1克酵母提取物和0.1克硫代乙醇酸钠，将50毫升的纯水加入到250毫升的烧杯中，将称重的培养基成分加入该烧杯中，搅拌直至成分完全溶解。用1N氢氧化钠将pH调节至7.2，将该烧杯中的培养基转移到100毫升的质量筒(mass cylinder)中，将纯化水加入到该质量筒中，以将最终液面调节至95毫升，然后将制备好的培养基和磁棒转移到100毫升的玻璃瓶中，并且盖上盖子。

使用称重皿称量1克葡萄糖，将该称量的葡萄糖放入含有约3毫升纯水的15毫升的锥形管中，并涡旋以使葡萄糖充分溶解，然后将纯水加到锥形管中，以将最终溶液量调整到5毫升。

将玻璃瓶的盖子稍打开，使用铝箔纸包裹该玻璃瓶，在121℃的高压灭菌器中灭菌20分钟。将灭菌后的培养基和葡萄糖在BSC中充分冷却，然后将葡萄糖转移到该培养基中混合。

2-2、实验实施例：PYG培养基的制备

称重表1所示的12种培养基成分，并将该些培养基成分溶解于50毫升的纯水中，使用1N氢氧化钠将pH调节至7.2，加入纯水以调节至如表1所示的最终液体水平，将该制备的培养基和磁棒转移到100毫升的玻璃瓶中，并且盖上盖子。

表1

使用称重皿称重13克葡萄糖，将称重的葡萄糖溶解在65毫升的纯水中。将制备的葡萄糖转移到100毫升的玻璃瓶中，并且盖上盖子。

将制备的培养基和葡萄糖在121℃下灭菌20分钟，将灭菌后的培养基和葡萄糖在BSC中充分冷却，并且将5毫升的葡萄糖溶液转移到每个培养基中并且进行混合。

2-3、蛋白胨的选择

肉毒杆菌菌株在实施例2-1或实施例2-2所制备的培养基中按照与实施例1-2中相同的方式来进行培养，培养结束后测定OD₆₀₀值，并且利用与实施例1-3中相同的ELISA法来测定毒素产生水平。

表2

结果，培养完成后的OD₆₀₀值和毒素产生水平如表2所示，相较于TPYG培养基，三种培养基(PYG1、PYG2和PYG5)显示出相似的毒素水平和最大菌株溶解度，因此OD₆₀₀值小于1。这些结果通过反复测试而再次验证。从表3中可以看出，PYG1、PYG2和PYG5在重复测试中也表现出与TPYG相似的毒素产生水平。其中，使用不包括动物成分和主要过敏原的PYG2培养基以获得最佳的培养基组合物。

表3

实施例3、培养基组合物的优化

为了找到透过培养基筛选测定而确定的马铃薯蛋白胨、酵母提取物和葡萄糖的最佳浓度，透过DoE进行浓度范围测试，并且根据因子实验、中心点实验和轴向点实验的结果，确定了最佳组合物。

3-1、因子实验

使用包括如表4所示的8个浓度范围的成分的培养基成分来进行因子实验。使用表4中包含的成分，按照与实施例2-2相同的方式制备培养基，按照与实施例1-2相同的方式，在制备的培养基中培养肉毒杆菌菌株，在培养结束时测定OD₆₀₀值，并且通过与实施例1-3中相同的ELISA来测定毒素产生水平。

表4

因此，如表5所示测定OD₆₀₀值和毒素水平。在此基础上进行正态分布分析，包括一阶和二阶相互作用而不包括三阶相互作用的分析显示，在蛋白胨、酵母和葡萄糖的一阶和二阶相互作用中，除蛋白胨*葡萄糖相互作用外，其余因子对毒素产生水平均具有显著性(图1)，帕累托图分析也显示出与正态分布分析相同的结果(图2)。

表5

3-2、中心点实验

使用称重皿分别称重用于中心点实验的培养基的24.5克的马铃薯蛋白胨E210、8.75克的酵母提取物、0.7克的硫代乙醇酸钠，将550毫升的纯水放入1升的烧杯中，将称重的成分在该烧杯中搅拌，直至它们完全溶解。利用1N的氢氧化钠将pH调节至7.2，将该烧杯中的培养基转移到1升的质量筒中，将纯水加入该质量筒中，以将最终液体水平调节至656.25毫升，然后将最终液体转移到1升的烧杯中，并搅拌约5分钟。将93.75毫升的培养基转移到总共6个100毫升的玻璃瓶中的每一个玻璃瓶，将磁棒注入该玻璃瓶中，并且盖上盖子，将每个培养基指定为中心点1至6中的任意一个。

使用称重皿称重8克葡萄糖，并且将称重的葡萄糖完全溶解于40毫升的纯水中。

将制备的培养基和葡萄糖在121℃下灭菌20分钟，将灭菌的培养基和葡萄糖在BSC中充分冷却，将6.25毫升的葡萄糖溶液转移到各个培养基中并进行混合。

在由此制备的培养基中，按照与实施例1-2中相同的方式来培养肉毒杆菌菌株，培养结束后测定OD₆₀₀值，通过ELISA按照实施例1-3中相同的方式测定毒素产生水平。

表6

将一个浓度的中心点实验重复6次，结果如表6所示。基于中心点实验的结果判断曲线的存在与或不存在时，P值为0.001，该P值小于0.05，P值小于0.05是判定具有显著性的标准。这意味着该曲线是存在的，并且进行额外的测试以进行表面分析。

表7

3-3、轴向点实验

如表8所示，称重用于轴向点实验的6种培养基成分，并将该些成分溶解于50毫升的纯水中，利用1N的氢氧化钠将pH调节至7.2，再加入纯水以如表8所示调节最终液体水平。将各个制备的培养基和磁棒转移到100毫升的玻璃瓶中，并且盖上盖子。

表8

使用称重皿称重8克葡萄糖，将称重的葡萄糖完全溶解在40毫升的纯水中。将制备的培养基和葡萄糖在121℃的高压灭菌器中灭菌20分钟，将灭菌的培养基和葡萄糖在BSC中充分冷却，然后将该葡萄糖溶液以表8所示的量加入到各培养基中。

在由此制备的培养基中，按照与实施例1-2中相同的方式培养该肉毒杆菌菌株，在培养结束时测定OD₆₀₀值，并且通过ELSA按照与实施例1-3中相同的方式来测定毒素产生水平。因此，测定轴向点值，如表9所示。

表9

3-4、经由表面分析进行的最佳浓度分析

基于因子实验、中心点实验和轴向点实验的结果进行表面分析。在模型适用性分析(model suitability analysis)中，分析了正态概率图、直方图、残差值对拟合值的关系图，以及残差值对阶级的关系图。其中，正态概率图确定为一条直线，直方图以正态分布形式出现，残差对拟合值的关系图和残差值对阶级的关系图则是没有模式(no pattern)的。在此基础上，确定选择的模型是合适的(图3)。

使用表面分析法分析该结果以测定该培养基组合物，该结果如图4所示，基于如图5所示的结果计算出最佳比例，并将从最佳比例获得的最佳浓度总结于表10。

表10

成分名称	马铃薯蛋白胨	酵母提取物	葡萄糖
				最佳浓度(％)	3％	1％	1.5％

3-5、确定最佳组合物比例

根据毒素产生水平以通过表面分析法设定该最佳浓度，并且最终目标是使组合物具有最高的毒素产生水平以及在培养后OD₆₀₀值为1或更少的浓度。因此，通过将葡萄糖浓度(被认为对毒素产生水平和OD₆₀₀值影响最大)更改为0.75、1、1、1.25、1.5、1.5％，获得最佳的培养基组合物，且该结果在表11和图6中所示。确定最佳的培养基组合物具有3％的马铃薯蛋白胨、1％的酵母提取物和1％的葡萄糖。

表11

实施例4：根据最佳培养组合物进行的菌株培养实验

储存在低温冷冻装置中的含有肉毒杆菌菌株的小瓶在37℃的培养箱中解冻30分钟。将肉毒杆菌菌株在BSC中匀浆3至5次，将1毫升的匀浆后的肉毒杆菌菌菌株接种到在2升细胞袋中的100毫升的PYG培养基，并且在34±1℃的培养箱(WAVE25)中培养。在菌株自溶前的10到24小时之间将100毫升的菌株培养物接种到5L的PYG培养基中。然后，随着时间测定在600nm波长下的吸光度和毒素水平。使用0.2微米的抗菌过滤器从每个样品中仅回收该培养液，然后按照与实施例1-3相同的方式来测量毒素水平。

使用上述培养基组合物进行培养时，测量OD值和毒素产生水平随时间的变化的结果表明，根据本发明的培养基组合物可使菌株培养的OD₆₀₀值在约14至15小时内达到最大值，因此与常规的肉毒杆菌培养基组合物相比，可显著缩短培养时间，并且在35℃下培养约28小时后和在33℃下培养约37小时后，可获得最大的毒素产生水平。

实施例5：最佳培养组合物与其他培养组合物之间的培养效果的比较

当使用大豆蛋白胨和实施例3中得出的最佳组合物比例以外的范围时，测定培养效果。出于此目的，按照表12所示的组合物比例制备各培养基，并测定各个培养基的培养效果。因此，从表13中可以看出，相较于比较实施例，实验组在毒素产生水平或细胞培养时间方面具有优势。具体而言，在使用比较实施例1中的马铃薯蛋白胨的情况下，达到最大细胞量所需的时间明显缩短，但发现在相应的组合物比例下，最大的毒素生产量远低于实验组。另一方面，在使用比较实施例2中大豆蛋白胨的情况下，发现达到最大细胞量所需的时间远多于实验组。

表12

	葡萄糖	酵母提取物	蛋白胨
				实验组	1	1	3(马铃薯)
比较实施例1	1	0.1	1(马铃薯)
				比较实施例2	1	1	3(大豆)

表13

产业可用性

根据本发明，当将本发明制备的肉毒杆菌毒素施用于人体时，通过排除动物源性成分和主要过敏原而产生的肉毒杆菌毒素可防止因异常朊病毒蛋白的积累而引起的传播性海绵样脑症，以及由过敏性反应(有害物质、血管性水肿、特应性皮炎、过敏性休克)引起的不良反应。此外，当使用马铃薯蛋白胨排除动物源性成分和主要过敏原时，可在短时间内诱导产生肉毒杆菌毒素的菌株以达到最大生长量，因此在肉毒杆菌毒素生产的过程中，能够达到缩短生产时间、降低生产成本的效果。

尽管已经详细描述了本发明的具体配置，但本领域技术人员将理解，本发明描述的内容是提供本发明是为了阐明优选的实施方案，并且不应被解释为限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围由所附权利要求书及其等同物定义。

Claims

1.一种制备肉毒杆菌毒素的方法，包括：

(a)通过在用于培养肉毒杆菌(Clostridium botulinum)的培养基组合物中培养肉毒杆菌来生产肉毒杆菌毒素，该培养基组合物包括：马铃薯蛋白胨、酵母提取物和葡萄糖；以及

(b)回收该肉毒杆菌毒素。

2.根据权利要求1所述的方法，其中该肉毒杆菌是A型肉毒杆菌。

3.根据权利要求1所述的方法，其中用于培养的该培养基组合物不包括动物源性产品和过敏原。

4.根据权利要求1所述的方法，其中该培养基组合物包括：2至5％(w/v)的马铃薯蛋白胨、0.5至2％(w/v)的酵母提取物和0.75至1.5％(w/v)的葡萄糖。

5.根据权利要求4所述的方法，其中该培养基组合物包括：3％(w/v)的马铃薯蛋白胨、1％(w/v)的酵母提取物和1％(w/v)的葡萄糖。

6.根据权利要求4所述的方法，其中该培养基组合物包括：3％(w/v)的马铃薯蛋白胨、1％(w/v)的酵母提取物和1％(w/v)的葡萄糖。

7.根据权利要求5所述的方法，其中在所述步骤(b)中开始培养后的40小时内，回收该肉毒杆菌毒素。