TWI661830B - 用於改善生殖功能的羊肚菌之活性物質、其用途及其組合物 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種用於改善生殖功能的羊肚菌活性物質、其用途及其組合物，特別用於製備改善由肥胖或代謝症候群所引起之生殖功能障礙的醫藥組合物。包含羊肚菌之活性物質的組合物能有效改善睪丸組織型態與精子型態、提高血液中睪固酮的含量與減少精子的氧化壓力。

Description

用於改善生殖功能的羊肚菌之活性物質、其用途及其組合物
本發明關於一種用於改善生殖功能的羊肚菌活性物質、其用途及其組合物；更明確地說，關於一種以羊肚菌的組合物用於提高睪固酮含量、減少精子異常型態的比例、降低精子的氧化壓力或改善睪丸的組織型態，以改善由肥胖或代謝症候群所引起之生殖功能障礙。
生殖功能可從多種面向評估，例如但不限於從睪丸組織的結構是否完整、精子形態是否出現異常、血液中睪固酮濃度的高低或精子所承受的氧化壓力來判斷。
睪丸
睪丸由數個生精小管所組成，而生精小管是由支持細胞(sertoli cell)所支撐，生精小管之間的間隙則為間質細胞(leydig cell)。生精作用即由支持細胞和間質細胞所調控，雄性激素的濃度也是藉由該等細胞維持，進而幫助精子成熟(Kotaja et al.,2004)。從組織結構上來看，未成熟之精細胞位於生精小管的基底膜(basal membrane)，隨著精子逐漸成熟，會移動至生精小管之管腔中心。
睪固酮
睪固酮是一種類固醇激素，其由膽固醇衍生而來，主要由男性的睪丸或女性的卵巢分泌。根據統計資料，成年男性睪固酮的分泌量約是成年女性的20倍，而睪固酮於成年男性體內中的含量則是成年女性的7-8倍。
睪固酮作為人體內最主要的雄性激素，其對男性的影響雖較為明顯，但對女性也都同樣重要。因此，不論對於男性或女性，睪固酮在人體的生理活動上都產生重大的影響。睪固酮的效益有增強性慾、力量、免疫功能、對抗骨質疏鬆症等。此外，由於睪固酮能有效提升體能，一些運動員會為了保持體能狀態或提升表現，於賽前使用睪固酮以激發並優化身體狀況。現時大部份的體育項目都已把睪固酮視為禁藥。
男性隨著年齡的增長，尤其在年過40後，其血清中的睪固酮(Testosterone)含量會逐年遞減，而有睪固酮低下症(testosterone deficiency syndrome)。該症狀在中老年男性是常見的現象，一般認為和更年期有關。雖然不像女性的更年期會有明顯的發生時間，但隨著睪固酮的濃度逐漸降低，症狀會逐漸出現並且加劇。常見的病徵有性欲下降、勃起功能障礙、活力減退、焦躁不安、情緒低落、生活喪失樂趣、專注力下降、工作效率減退、睡眠障礙。再者，伴隨第二性徵退化、骨質疏鬆、脂肪增加、睪丸萎縮與男性女乳等特徵。從目前許多的研究發現，當體內睪固酮不足時，除了因上述病徵而影響到生活品質外，更會增加罹患骨質疏鬆與骨折及心血管疾病等風險。此外，若男性血液中睪固酮的濃度下降，還會導致精液中的精子濃度下降及/或總精子數減少，進而導致不孕。
睪固酮含量的影響因素除年紀外，以往也有研究發現肥胖患者血液中睪固酮的濃度相對於一般人較低，且肥胖程度與血液中睪固酮濃度下降相關聯。若和一般人比較，幾乎每四個肥胖者裡就有一個人血液中睪固酮的濃度明顯較低。探究其原因，有研究指出脂肪細胞裡的芳香環酶(aromatase)會催化睪固酮成為雌激素。因此，由於肥胖者體內的脂肪細胞的質量較大，而於脂肪細胞中的芳香環酶(aromatase)可以催化更多睪固酮成為雌激素，使得肥胖男性血液中雌激素的濃度變高，但睪固酮的濃度卻降低。上述的加強催化現象隨著年紀增加和肥胖情形加劇會更加明顯。肥胖者若以飲食控制來減重並維持體重穩定，其血液中睪固酮的濃度有回升至正常值的趨勢。
代謝症候群的病患血液中睪固酮的濃度和一般人相比也相對較低。CoronaG等人於2010年發表一篇針對代謝症候群中的糖尿病的研究(Type 2 diabetes mellitus and testosterone：a meta-analysis study.)，其證實第二型糖尿病病患於血液中的睪固酮濃度較低，也指出第二型糖尿病病人的勃起障礙會隨著睪固酮濃度越低而越加惡化。再者，Adamopoulos等人於1987年以及Jelodar等人於2009年所發表的研究結果指出，糖尿病會造成胰島素阻抗及發炎情形，因而抑制腦下垂體分泌荷爾蒙，以及生精小管中的間質細胞製造睪固酮。
氧化壓力
當體內抗氧化防禦系統與活性氧化物(ROS)的生成量無法達到平衡時，氧化壓力是造成糖尿病男性患者生殖功能退化的主要原因(Amaral et al.,2008)。糖尿病男性患者的精子DNA損傷機制，主要是精子在睪丸的輸送過程中，或是儲存於副睪時，因受到氧化壓力而導致的傷害。與其他組織相比， 精子中由於含有較多的不飽和脂肪酸，因此更容易受到ROS的攻擊，進而造成精子DNA片斷化(Parlaktas et al.,2008)。
羊肚菌
羊肚菌是世界著名的大型食用真菌，属於子囊菌綱、盤菌目、羊肚菌科、羊肚菌属(Morchella)。因其子實體的上半部表面具不規則的皺褶，形如羊肚而得名，又稱羊肚蘑、羊肚菜、編笠菌、草笠竹等。Bunyard等人於1994年發表一研究，其藉由28S RNA基因的RFLP分析，將羊肚菌至少分為兩群：(1)黑色羊肚菌，其包括黑脈羊肚菌(M.angusticeps)、尖頂羊肚菌(M.conica)和高羊肚菌(M.elata)，此類群的頭部較偏深棕色，皺褶較規則類似格子狀；(2)黄色羊肚菌，其包括小羊肚菌(M.deliciosa)、美味羊肚菌(M.esculenta)和粗柄羊肚菌(M.crassipes)，其頭部顏色為淡黃色至棕色，皺褶較不規則。
羊肚菌分布廣泛，除南北極之外的五大洲均有生長，特别是在北半球的溫帶地區最多，其產季為春末夏初。但由於羊肚菌一年僅一採，導致其產量有限，價格居高不下。然而，羊肚菌又因其濃郁但又不膩的風味與豐富的營養價值，而深受世人喜愛，因此在1880年代即有嘗試人工栽培的記錄。但到目前為止，仍尚無法完全掌握人工培育羊肚菌子實體的技術，其中雖然於中國已有半商業化規模的生產，但仍受到許多條件的限制。因此使得羊肚菌菌絲體的發酵技術開始受到重視；而羊肚菌菌絲體具有生長快速、來源乾淨、可加以調控的特性。於產品開發上，羊肚菌菌絲體較羊肚菌子實體更加有利。
羊肚菌在保健方面的價值也極為引人注目。中國自古以來就將羊肚菌作為食藥用菇類使用，其記錄最早可追溯至明代《本草綱目》，文中載明羊肚菜(即羊肚菌)「甘寒無毒、益腸胃、化痰理氣」，顯示其具有一定的生 理活性。近年來的研究也陸續以科學方法證明其功效性，包括抗腫瘤、護腎、抗疲勞、保肝、抗輻射、抗菌、調節免疫力及調節胃腸蠕動等功能。
本發明為首篇研究證明羊肚菌菌絲體具有治癒高血糖誘導之生殖傷害的效果。具體來說，透過施予羊肚菌之活性物質以提升血液中的睪固酮濃度、減少精子異常形態比例、降低精子氧化壓力及/或改善睪丸的組織型態。本發明提供羊肚菌於醫藥領域中另一可開發的用途，顯著地提升羊肚菌作為醫藥組合物的應用價值。
本發明的目的在於，開發用於改善生殖功能之障礙之羊肚菌之活性物質，其係以下列方法製備：(a)取一羊肚菌菌絲體接種於培養基以進行固態培養；(b)將步驟(a)培養的羊肚菌菌絲體接種於液體培養基以進行液態培養；及(c)將步驟(b)培養的羊肚菌菌絲體接種於一醱酵槽以進行發酵。
較佳地，該步驟(c)的溫度為23-28℃、通氣量為0.5-1.0vvm、轉速為30-50rpm及/或培養天數6-10天。
較佳地，該羊肚菌寄存於財團法人食品工業發展研究所，其寄存編號為BCRC-36352及/或BCRC-36336。
本發明的另一目的在於，開發羊肚菌之活性物質用於製備改善生殖功能之障礙的醫藥組合物的用途。
較佳地，該羊肚菌包含美味羊肚菌(morchella esculenta)、粗柄羊肚菌(morchella crassipes)或其組合。
較佳地，該羊肚菌之活性物質為羊肚菌菌絲體經發酵與冷凍乾燥後所得之凍乾粉。
較佳地，該羊肚菌之活性物質為羊肚菌菌絲體以純水或乙醇萃取所得之萃取物。
較佳地，該生殖功能為睪固酮含量、精子形態、精子氧化壓力、睪丸的組織型態或其組合。
較佳地，該改善生殖功能之障礙為提高睪固酮於血液中的含量。
較佳地，該改善生殖功能之障礙為減少精子斷尾、彎曲或折頸的比例。
較佳地，該改善生殖功能之障礙為減少精子內的ROS生成量以降低精子的氧化壓力。
較佳地，該改善生殖功能之障礙為減少睪丸中管腔中心的空洞比例或增加睪丸間質細胞(Leydig cell)以改善睪丸的組織型態。
較佳地，該改善生殖功能之障礙起因於肥胖及/或代謝症候群。
較佳地，該代謝症候群為糖尿病。
本發明為於醫藥領域中發揮羊肚菌的效益，再提供一種用於改善生殖功能之障礙之組合物，其包含一有效量之羊肚菌之活性物質。
較佳地，該羊肚菌之活性物質為羊肚菌菌絲體經發酵與冷凍乾燥後所得之凍乾粉。
較佳地，該羊肚菌之活性物質為羊肚菌菌絲體以純水或乙醇萃取所得之萃取物。
較佳地，其中該有效量為500mg/60kg-10g/60kg body weight/day。
較佳地，其包含一種選自下列群組的添加劑：賦型劑、防腐劑、稀釋劑、填充劑、吸收促進劑、甜味劑或其組合。
較佳地，其為一藥品、飼料、飲料、營養補充品、乳製品、食品或保健食品。
較佳地，其形態為粉劑、錠劑、造粒、栓劑、微膠囊、安瓶、液劑噴劑或塞劑。
圖1顯示對照組(C)、糖尿病組(D)、糖尿病給予美味羊肚菌(morchella esculenta)組(D+ME)與糖尿病給予粗柄羊肚菌(morchella crassipes)組(D+MC)的睪丸組織的切片染色。
圖2顯示對照組(C)、糖尿病組(D)、糖尿病給予美味羊肚菌(morchella esculenta)組(D+ME)與糖尿病給予粗柄羊肚菌(morchella crassipes)組(D+MC)的精子形態。
圖3顯示對照組(C)、糖尿病組(D)、糖尿病給予美味羊肚菌(morchella esculenta)組(D+ME)與糖尿病給予粗柄羊肚菌(morchella crassipes)組(D+MC)的血漿中睪固酮的含量。
圖4顯示對照組(C)、糖尿病組(D)、糖尿病給予美味羊肚菌(morchella esculenta)組(D+ME)與糖尿病給予粗柄羊肚菌(morchella crassipes)組(D+MC)的精子中ROS的含量。
菌種來源
羊肚菌可選自由黑脈羊肚菌(M.angusticeps)、尖頂羊肚菌(M.conica)、高羊肚菌(M.elata)、小羊肚菌(M.deliciosa)、美味羊肚菌(M.eseulenta)和粗柄羊肚菌(M.crassipes)所組成之群組。在一較佳的實施態樣中，自財團法人食品工業發展研究所之生物資源研究中心(BCRC)，選購兩種羊肚菌菌種，一為美味羊肚菌(morchella esculenta)，其寄存編號為BCRC-36352，另一為粗柄羊肚菌(morchella crassipes)，及寄存編號為BCRC-36336。本發明所述之羊肚菌之活性物質不限於由上述該等菌種所得。
菌種培養
將購入的羊肚菌從菌保中，勾取其菌絲接種於作為固態培養基上活化菌種。在一較佳的實施態樣中，該固態培養基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂(Potato dextrose agar，PDA)。待羊肚菌的菌絲生長完成後，將新鮮的菌絲體連同固態培養基接入於含有1L液態培養基的錐形瓶中。在一較佳的實施態樣中，液態培養基的配方如下表一所示。在一較佳的實施態樣中，於溫度25℃、速率50-150rpm的條件下，液態培養菌絲體4-7天，以待菌種完成生長。
表一、液態培養基的配方如下：
隨後，於百公升級發酵槽的滅菌培養液中，接種生長完成之錐形瓶中的種菌，並進行量產。在一較佳的實施態樣中，以溫度25℃、通氣量0.5-1.0vvm、轉速40rpm的條件下，培養6-10天以量產羊肚菌菌絲體。待菌絲體乾重不再增加或蔗糖殘糖小於1000mg/L時，即加熱收槽。在一較佳的實施態樣中，以100℃煮15分鐘加熱收槽。
凍乾粉製備
收槽完成後，將槽中部份的發酵全液(包含培養基與菌絲體)舖盤並進行冷凍乾燥以製備「發酵全液凍乾粉」。在一較佳的實施態樣中，冷凍乾燥的溫度設定於30℃，冷凍乾燥時間至少3天。另一部分的發酵全液則經離心後，取羊肚菌菌絲體經冷凍乾燥得到「菌絲體凍乾粉」。在一較佳的實施態樣中，離心發酵全液的轉速為4500rpm，使用連續式離心之臥式離心機。
萃取物製備
取適量「發酵全液凍乾粉」以純水回溶。在一較佳的實施態樣中，回溶用的純水體積為凍乾粉重量的5-40倍，更佳為20倍。接著，以121℃加熱20分鐘後，藉由離心(轉速為4500rpm，連續式離心之臥式離心機)去除菌絲體，得到發酵全液萃取液。將發酵全液萃取液冷凍乾燥得到「熱水萃取物」。取適量「菌絲體凍乾粉」，以醇類回溶。在一較佳的實施態樣中，回溶用的醇類體積為凍乾粉重量的5-40倍，更佳為20倍。在一較佳的實施態樣中，醇類濃度為95-100%。在一較佳的實施態樣中，醇類為乙醇。
再以超音波萃取機震盪該回溶後的菌絲體凍乾粉2小時後，離心(轉速為4500rpm，連續式離心之臥式離心機)去除菌絲體，得到菌絲體萃取液。將菌絲體萃取液經減壓濃縮得到「乙醇萃取物」。將熱水萃取物及乙醇萃取物充分混合以獲得「萃取混合物」，作為餵食試驗之羊肚菌的活性物質。在一較佳的實施態樣中，熱水萃取物及乙醇萃取物的混合比例為以重量為基準1：1。
試驗動物
五週齡Sprague-Dawley(SD)品系之雄性大白鼠購自樂斯科生物科技股份有限公司。飼養實驗大鼠的透明鼠籠，於置入大鼠前先以75%乙醇消毒。每籠飼養兩隻大鼠，溫度控制於23±1℃的範圍內，濕度保持在40-60%，光暗循環採12/12(AM 7：00-PM 6：59亮，PM 7：00-6：59暗)。餵食粒狀飼料(Laboratory Rodent Diet 5001,PMI® LabDiet®,St.Louis,Missouri,U.S.A.)，飼料與蒸餾水的供應採自由攝食飼育法(ad libitum)。
動物飼料
粉狀飼料Laboratory Rodent Diet 5001M(PMI Nutrition International,Inc.,USA)購自雍立公司，而油脂選用豬油(Lard)購自宏昇公司(Taiwan)，其成分配方如下表：
高脂飲食組是將豬油添加入粉狀飼料中，以脂肪熱量佔總熱量的40%之高脂飲食以誘導胰島素阻抗。
試驗組別
五週齡雄性SD大鼠於馴養一週後，每組8隻，共四組32隻。一組為對照組，其他三組實驗組則採用上述高油脂飲食組(high fat diet，HFD)的動物飼料，並以鏈脲佐菌素(Streptozocin，STZ)以誘導胰島素阻抗來形成糖尿病模式的實驗大鼠，並於以下試驗中將該等實驗大鼠稱為糖尿病組。再從三組糖尿病組中挑選兩組施予羊肚菌之活性物質，根據施予的羊肚菌種類於下稱為糖尿病餵食美味羊肚菌組與糖尿病餵食粗柄羊肚菌組。
各組名稱與簡稱如下：
1.對照組Control(C)
2.糖尿病組HFD/STZ-Diabetes(D)
3.糖尿病餵食美味羊肚菌(morchella esculenta)組(D+ME)
4.糖尿病餵食粗柄羊肚菌(morchella crassipes)組(D+MC)
管餵與犧牲
成功誘導實驗組大鼠形成糖尿病後，以管餵方式分別施予樣品。將萃取混合物溶於載體溶液，以500mg/kg體重(B.W.)施予糖尿病餵食美味羊肚菌組與糖尿病餵食粗柄羊肚菌組。對照組則施打與實驗組所施打的樣品之同體積的載體溶液(vehicle，0.1mol/L檸檬酸緩衝溶液，pH 4.5)。每週測量並紀錄實驗動物之體重。餵食樣品四週後，進行口服葡萄糖耐受試驗(Oral Glucose Tolerance Test，OGTT)。各組實驗動物禁食12小時後，由尾部靜脈收集血液， 測定血糖濃度。實驗結束後，藉由二氧化碳迷昏大鼠，並預先以肝素(heparin,500IU/mL)潤濕針筒及離心管，由腹腔大動脈抽血以犧牲大鼠。將上述方式所獲之血液視為全血，將其裝入15mL的離心管中，並使用離心機於4℃下以3000 x g低速離心15分鐘。離心完成後，收集上層液作為大鼠血漿。於此同時，犧牲大鼠後取出各臟器並稱重。肝臟、睪丸、下視丘保存於-80℃下待後續實驗分析，副睪之精子則於犧牲當日完成分析。
睪丸染色切片
大鼠犧牲後，將其睪丸浸泡於10%甲醛(福馬林，formalin)備用。取出浸泡甲醛的睪丸組織，以手術刀從組織的中段切下厚度約0.5公分的組織。使該組織的高度不超過包埋盒，再將組織泡回福馬林中。以蘇木紫-伊紅染色法(hematoxylin and eosin，H&E)製作睪丸組織的染色切片。H&E染色法中，蘇木紫染液為鹼性，使細胞核內染色質與胞質內核糖體著上紫藍色，伊紅則為酸性染料，其使細胞質和細胞外基質中的成分著上紅色，而可據此染色結果判斷組織的結構。完成大鼠睪丸組織的染色切片後，觀察睪丸之生精小管的形態。
精子收集
利用上游法(swim-up)收集副睪丸中的精子。從犧牲的大鼠取出副睪丸，將其放入含有8mL之RPMI培養基的燒杯中。以解剖剪刀將副睪丸剪成二段，將其放置在搖擺器上搖晃10分鐘，接著以轉速190 x g進行離心5分鐘。離心完成後，將其置於培養箱中以溫度37℃、氣體環境5%的二氧化碳培養30分鐘。最後，收集上層活動力較好的精子進行精子型態的觀察。
睪固酮測定
血漿樣品以睪固酮的酵素連結免疫吸附分析之套組(testosterone ELISA kits)分析血清中的睪固酮濃度。取50μL的大鼠血漿加入50μL的乙醯膽鹼酯酶(AChE)和抗睪固酮血漿一同反應。接著，去除上清液，並利用清洗緩衝液(wash buffer)清洗5次。加入作為AChE受質的Ellman’s試劑，避光下搖晃以作用80分鐘後，完成檢測樣本。利用ELISA測讀儀測量樣本於412nm的吸光值，以標準品所得的標準曲線代入樣本的吸光值換算，即取得血清中睪固酮的濃度(ng/mL)。
ROS測定
DCFH-DA為一螢光探針，其本身沒有螢光，當DCFH-DA進入細胞內，經由酯酶水解會生成非螢光極性物質DCFH，當其進入細胞後受胞內ROS氧化，使其成為螢光物質DCF，由此可間接測量細胞內ROS生成量。
取各組1mL之精子數已調整至1×106sperm/mL的精子的RPMI溶液，加入DCFH-DA以使最終濃度為20μM，於37℃作用30分鐘。接著，以轉速760 xg離心5分鐘。離心後去除上清液，並以PBS清洗1次。再次離心以去除上清液，加入1mL PBS以沖散細胞，利用流式細胞儀進行分析，流式細胞儀採用的軟體為cell quest。收集10,000個細胞作為檢測樣本，利用機器發出的螢光強度來推估檢測樣本的細胞中所含有的ROS含量。若吸光值高，則表示樣本中細胞的ROS含量高。
統計分析
數據之統計分析以Statistical Product & Service Solutions(SPSS)軟體19.0版進行，實驗結果以平均值±平均標準差(Mean±S.E.M.)表示。折線圖以成對樣本T檢定(Paired-Sample T test)進行分析，統計結果以p<0.01 (**),p<0.05(*)表示；柱狀圖則以單因子變異數分析(One-way analysis of variance One-way ANOVA)，再使用Duncan's Test進行多重比較測試(Multiple comparison method)，p<0.05表示具有統計上的顯著差異(Statistical differences)。
根據上述實驗所得之實驗結果，詳述如下。
睪丸組織形態
大鼠睪丸組織染色切片結果如圖1所示。相較於未誘導糖尿病之對照組(C)，於糖尿病組(D)之生精小管的官腔中心觀察到明顯空洞，說明生精小管中的支持細胞的數量相較於對照組(C)明顯減少。再者，糖尿病組(D)之生精小管的間隙亦出現空洞，顯示糖尿病組(D)的間質細胞數量也少於對照組(C)。根據對照組(C)與糖尿病組(D)的實驗結果，證實由高脂飲食誘發的糖尿病的確會造成睪丸組織的傷害，而導致生精小管中的細胞數量銳減，於組織架構上形成空洞。
反觀糖尿病餵食美味羊肚菌組(D+ME)及糖尿病餵食粗柄羊肚菌(D+MC)組，其生精小管的管腔中心或是生精小管之間隙的空洞，皆明顯少於糖尿病組(D)，顯示D+ME組與D+MC組的支持細胞與間質細胞的數量多於糖尿病組(D)。從此睪丸組織染色切片的結果可得知，因糖尿病導致的睪丸中支持細胞與間質細胞數量減少的現象，可藉由施予羊肚菌之活性物質使該等細胞數量上升，甚至如D+ME組與D+MC組的間質細胞還可恢復至正常的狀態。據此，證實羊肚菌具有改善生殖功能的效果。
精子形態
收集之精子的形態如圖2所示。相較於未誘導糖尿病之對照組(C)，糖尿病組(D)出現異常形態精子的比例較高。異常的形態舉例如：斷尾、彎曲、折頸。糖尿病組(D)中黃色箭頭所指分別為右側兩個箭頭的_折頸與左側兩個箭頭的斷尾之異常形態。
反觀糖尿病餵食美味羊肚菌組(D+ME)及糖尿病餵食粗柄羊肚菌(D+MC)組，其精子型態與對照組(C)較為接近，說明餵食羊肚菌之活性物質能減少由糖尿病所造成的精蟲傷害。
睪固酮含量
大鼠血漿樣中睪固酮含量的測定結果如圖3所示。相較於未誘導糖尿病之對照組(C)的睪固酮濃度約為0.5ng/mL，糖尿病組(D)之血漿中的睪固酮濃度約少於0.25ng/mL，說明糖尿病組(D)之血漿中的睪固酮含量較對照組(C)少。
反觀糖尿病餵食美味羊肚菌組(D+ME)及糖尿病餵食粗柄羊肚菌(D+MC)組，其睪固酮量分別約為1.0ng/mL及1.25ng/mL，兩者皆高過於糖尿病組(D)的含量。甚至相較於對照組(C)，睪固酮的含量也顯著提升許多。從此結果，說明餵食羊肚菌之活性物質能改善由糖尿病所造成的睪固酮分泌或製造低落的情況，而恢復至一般未患病的水平，甚至還有加強睪固酮分泌之效果。
ROS含量
精子中的ROS含量測定結果如圖四所示。相較於未誘導糖尿病之對照組(C)的螢光測定量做為基準值100%，糖尿病組(D)所生成的ROS於測定結果的螢光量約為150%，相當於約對照組螢光量的1.5倍，顯著升高。
反觀糖尿病餵食美味羊肚菌組(D+ME)及糖尿病餵食粗柄羊肚菌(D+MC)組，其ROS生成量分別下降至約120%及100%，兩者皆回復至與對照組(C)相似的水平。從此結果可說明，餵食羊肚菌之活性物質能減少在糖尿病患病環境中的氧化壓力，因而可有效降低由氧化壓力所帶給精子的傷害。
經上述實驗結果，證實萃取自羊肚菌之活性物質具有提升雄性動物之生殖功能的功效，而開發出羊肚菌於醫藥領域中的另一新穎用途。據此，為使羊肚菌之活性物質得以具體應用，製造一種包含羊肚菌之活性物質的組合物，並以一有效量施予一個體來達到治癒效果。
本文中所述「有效量」係指一使用量，其足以使前述預防及/或治療的效果產生。基於活體外細胞培養實驗，前述有效量係定義為「μg/ml」，其係基於每一個培養中所用之細胞培養液的總體積。基於動物模型實驗，前述有效量係定義為「g/60kg body weight/day」。此外，經由活體外細胞培養實驗所得到的有效量數據可經下列計算公式而轉換為一合理之供動物使用的有效量：
1.一般來說(Reagan-Shaw et al.,2008)，1「μg/ml」單位(基於活體外細胞培養實驗所得之有效量)可等同於1「mg/kg body weight/day」單位(基於老鼠模型實驗所得之有效量)，並且，基於已知老鼠的新陳代謝率是人類的六倍，可進一步求得人類的有效劑量。
2.因此，若基於活體外細胞培養實驗求得有效量為500μg/ml，則於老鼠中使用的有效量可計為500mg/kg body weight/day(即，0.5g/kg body weight/day)。進一步地，參酌前述新陳代謝率的差異，供人類使用的有效量則可計為5g/60kg body weight/day。
3.根據上述段落中所記載的試驗結果，基於大鼠實驗經驗證的有效量為500mg/kg body weight/day，因此供人類使用之合理的有效劑量應為5g/60kg body weight/day。
在一較佳的實施態樣中，組合物中所含的羊肚菌之活性物質的有效量為500mg/60kg-10g/60kg body weight/day。
該組合物進一步包含添加劑。在一較佳的實施態樣中，該添加劑可為賦型劑、防腐劑、稀釋劑、填充劑、吸收促進劑、甜味劑、或其組合。該賦型劑可選自檸檬酸鈉、碳酸鈣、磷酸鈣或其組合。該防腐劑可延長醫藥組合物的儲藏期限，例如苯甲醇、對羥基苯甲酸(parabens)。稀釋劑可選自水、乙醇、丙二醇、甘油或其組合。填充劑可選自乳糖、牛乳糖、高分子量舉乙二醇或其組合。吸收促進劑可選自二甲基亞碸(DMSO)、月桂氮卓酮、丙二醇、甘油、聚乙二醇或其組合。甜味劑可選自安塞甜(Acesulfame K)、阿斯巴甜(aspartame)、糖精(saccharin)、三氯蔗糖/蔗糖素(sucralose)、紐甜(neotame)或其組合。除上述所列舉的添加劑以外，在不影響羊肚菌之活性物質的醫藥效果前提下，可依需求選用適合的其他添加劑。
該組合物於醫藥領域中可開發為不同商品。在一較佳實施態樣中，該組合物為一藥品、飼料、飲料、營養補充品、乳製品、食品或保健食品。
該組合物可根據受施予者之需要，而採用不同形態。在一較佳實施態樣中，該組合物的形態為粉劑、錠劑、造粒、栓劑、微膠囊、安瓶(ampoule/ampule)、液劑噴劑或塞劑。
本發明的組合物可使用於動物或是人類。在不影響羊肚菌之活性物質發揮效果的前提下，包含羊肚菌之活性物質的組合物可製為任何藥物型態，並根據藥物型態以適用的途徑施予該動物或人類。
組合物製備
組合物1：取熱水萃取物(20wt%)作為羊肚菌之活性物質，與作為防腐劑之苯甲醇(8wt%)、作為稀釋劑之甘油(7wt%)充分混合，並溶於純水(65wt%)中，以製得液體劑型之本發明之醫藥組合物，前述wt%係指各成分佔組合物總重之比例。存放於4℃備用。
組合物2：取乙醇萃取物(15wt%)作為羊肚菌之活性物質，與作為防腐劑之苯甲醇(5wt%)、作為稀釋劑之甘油(10wt%)充分混合，並溶於純水(70wt%)中，以製得液體劑型之本發明之醫藥組合物，前述wt%係指各成分佔組合物總重之比例。存放於4℃備用。

Claims (16)

  1. 一種用於改善生殖功能障礙之羊肚菌之活性物質，其係以下列方法製備：(a)取一羊肚菌菌絲體接種於培養基以進行固態培養；(b)將步驟(a)培養的羊肚菌菌絲體接種於液體培養基以進行液態培養；及(c)將步驟(b)培養的羊肚菌菌絲體接種於一醱酵槽以進行發酵；其中該羊肚菌之活性物質為羊肚菌菌絲體以純水或乙醇萃取所得之萃取物。
  2. 如請求項1所述之活性物質，其中該步驟(c)的溫度為23-28℃、通氣量為0.5-1.0vvm、轉速為30-50rpm及/或培養天數6-10天。
  3. 如請求項1所述之活性物質，其中該羊肚菌寄存於財團法人食品工業發展研究所，其寄存編號為BCRC-36352及/或BCRC-36336。
  4. 一種如請求項1至3中任一項之羊肚菌之活性物質用於製備改善生殖功能之障礙的醫藥組合物的用途，其中該生殖功能為精子形態、精子氧化壓力、睪丸的組織型態或其組合。
  5. 如請求項4所述之用途，其中該羊肚菌包含美味羊肚菌(morchella esculenta)、粗柄羊肚菌(morchella crassipes)或其組合。
  6. 如請求項4所述之用途，其中該羊肚菌之活性物質為羊肚菌菌絲體經發酵與冷凍乾燥後所得之凍乾粉。
  7. 如請求項4所述之用途，其中該改善生殖功能之障礙為減少精子斷尾、彎曲或折頸的比例。
  8. 如請求項4所述之用途，其中該改善生殖功能之障礙為減少精子內的ROS生成量以降低精子的氧化壓力。
  9. 如請求項4所述之用途，其中該改善生殖功能之障礙為減少睪丸中管腔中心的空洞比例或增加睪丸間質細胞(Leydig cell)以改善睪丸的組織型態。
  10. 如請求項4所述之用途，其中該生殖功能之障礙起因於肥胖及/或代謝症候群。
  11. 如請求項10所述之用途，其中該代謝症候群為糖尿病。
  12. 一種用於改善生殖功能之障礙之組合物，其包含一有效量之如請求項1至3項中任一項之羊肚菌之活性物質。
  13. 如請求項12所述之組合物，其中該羊肚菌之活性物質為羊肚菌菌絲體經發酵與冷凍乾燥後所得之凍乾粉。
  14. 如請求項12所述之組合物，其包含一種選自下列群組的添加劑：賦型劑、防腐劑、稀釋劑、填充劑、吸收促進劑、甜味劑或其組合。
  15. 如請求項12所述之組合物，其為一藥品、飼料、飲料、營養補充品、乳製品、食品或保健食品。
  16. 如請求項12所述之組合物，其形態為粉劑、錠劑、造粒、栓劑、微膠囊、安瓶、液劑噴劑或塞劑。
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