TWI626950B - Fibroblast proliferation promoter and Mena reaction inhibitor - Google Patents

Abstract

本發明之主要目的在於提供一種新穎之纖維母細胞增殖促進劑、及活性較強且安全性較高之梅納反應抑制劑。

本發明係關於一種纖維母細胞增殖促進劑，其含有鳳果果皮之水萃取物作為有效成分，或含有黃木素或其糖苷及多酚。本發明進而關於一種含有上述纖維母細胞增殖促進劑及膠原蛋白之纖維母細胞增殖促進劑。又，本發明係關於一種含有黃木素或其糖苷之梅納反應抑制劑、及含有該抑制劑之經口劑、外用劑、食品。

Description

纖維母細胞增殖促進劑及梅納反應抑制劑

本發明係關於一種含有鳳果果皮之水萃取物之纖維母細胞增殖促進劑。又，本發明係關於一種含有黃木素或其糖苷及多酚之纖維母細胞增殖促進劑。進而，本發明係關於一種含有黃木素或其糖苷作為有效成分之梅納反應抑制劑。又，本發明係關於一種含有該梅納反應抑制劑之經口劑、外用劑、食品。

皮膚具有包括表皮、真皮、皮下組織之3層構造。表皮層係厚度為平均約0.2毫米之非常薄之膜，存在於皮膚之最外側。表皮層為防止異物自外部進入或身體之水分蒸發之屏障，具有保護內部之作用。真皮層中充滿纖維或微血管、淋巴管等，該等維持表皮層，送入氧或營養素、運走體內廢物。真皮層位於表皮層之內側，佔據皮膚組織之大部分。真皮係膠原蛋白佔據其大部分，與玻尿酸或彈力蛋白一併發揮支持皮膚之張力或彈力之作用。存在於真皮之纖維母細胞產生該等成分。皮下組織係皮膚之3層構造中位於最內側之組織，發揮維持表皮及真皮之作用。皮下組織之大部分為皮下脂肪，通過其中之動脈或靜脈對皮膚組織遞送營養、運出體內廢物。又，皮下組織亦起緩和來自外部之刺激或衝擊，發揮隔熱、培育作用，以脂肪之形式積蓄能量的作用。

若因老化或生活習慣、紫外線等各種內部、外部刺激而皮膚受到損傷，則存在於真皮層中之纖維母細胞之增殖減少，而發生膠原蛋 白產生之減少或膠原蛋白之變質，其結果為，產生肌膚之張力或彈力降低等各種症狀。可認為促進纖維母細胞之增殖之組合物作為功能性食品或化妝品較有用，期望開發安全性及效果均較高之素材。

又，於發達國家，隨著老齡化社會到來，抗衰老受到關注。並且，報告有糖化(梅納反應)作為引起老化現象之機制之一而參與其中。

梅納反應係還原糖之羰基與蛋白質或胺基酸之胺基非酵素性地發生縮合之反應，分為經由希夫鹼而生成安瑪多立(Amadori)轉移產物的前期反應，及其後安瑪多立轉移產物經分解並進而經過脫水、氧化、縮合、轉移等過程而變化為糖化終產物群(AGEs)的後期反應。

報告有AGEs依存於老化而累積於各種活體組織中，又，因糖尿病併發症、阿茲海默症或動脈硬化等老化關聯疾病，AGEs之累積顯著增加。進而，報告有梅納反應成為伴隨老化而產生之白內障或軟骨之彈力降低、皮膚老化之原因。一般認為，AGEs之一種即CML(Carboxymethyllysine，羧甲基離胺酸)誘導與肌膚功能有關之纖維母細胞之細胞凋亡，而使肌膚功能降低。

因此，可期待藉由攝取具有梅納反應抑制作用之素材(抗糖化素材)，而抑制體內之AGEs之生成，抑制伴隨老化之各種症狀，而使用抗糖化素材之食品之開發興盛。期待該等食品作為美容訴求相關食品或運動障礙症候群對策食品之可能性。

鳳果係原產於東南亞之藤黃科(Guttiferae)藤黃屬常綠小高木，與芒果、冷子番荔枝一併被列為世界三大美果，其特徵為淡淡之酸味與上等之甜味，亦被稱為果中女王。鳳果係先前以來被用作傳統藥，已知有抗菌作用或消炎作用、抗氧化作用、營養強化作用。又，報告有鳳果果肉之水萃取物顯示纖維母細胞增殖促進作用(參照專利文獻1)，但顯示該作用之活性成分未知。又，不知鳳果果皮之水萃取物具 有纖維母細胞增殖促進作用。

黃木素係作為天然染料色素而為人所知，並用作染毛性整髮用(參照專利文獻2)。又，已知鳳果中存在黃木素，但並不知道其生理作用(參照專利文獻3及4)。

又，胺基胍係作為高效之梅納反應抑制劑而為人所知(例如參照專利文獻5)。另一方面，已知該化合物具有較強之副作用。

[先前技術文獻] [專利文獻]

[專利文獻1]日本專利特開2006-249051號公報

[專利文獻2]日本專利3309221號公報

[專利文獻3]日本專利特表2008-520585號公報

[專利文獻4]日本專利特表2006-504790號公報

[專利文獻5]日本專利特開昭62-142114號公報

本發明之主要目的在於提供一種新穎之纖維母細胞增殖促進劑及梅納反應抑制劑。又，本發明之主要目的在於提供一種含有該抑制劑之經口劑、外用劑及食品。

本發明者為解決上述課題而進行研究，結果發現，鳳果果皮之水萃取物具有纖維母細胞增殖促進作用，從而完成本發明。又，本發明者發現，含有黃木素或其糖苷、以及多酚之組合物具有纖維母細胞增殖促進作用。本發明者進而發現，藉由併用膠原蛋白，可增強該纖維母細胞增殖促進作用。又，本發明者進而首次發現，黃木素及/或其糖苷具有梅納反應抑制活性。

作為本發明，可列舉下述者。

(1)一種纖維母細胞增殖促進劑，其含有鳳果果皮之水萃取物作為有效成分。

(2)一種纖維母細胞增殖促進劑，其含有黃木素或其糖苷、及多酚作為有效成分。

(3)如上述2記載之纖維母細胞增殖促進劑，其中黃木素或其糖苷、及多酚源自鳳果果皮之水萃取物。

(4)一種纖維母細胞增殖促進劑，其含有鳳果果皮之水萃取物及膠原蛋白作為有效成分。

(5)一種纖維母細胞增殖促進劑，其含有黃木素或其糖苷及多酚、以及膠原蛋白作為有效成分。

(6)如上述5記載之纖維母細胞增殖促進劑，其中黃木素或其糖苷、及多酚源自鳳果果皮之水萃取物。

(7)一種梅納反應抑制劑，其含有黃木素或其糖苷作為有效成分。

(8)如上述7記載之梅納反應抑制劑，其中黃木素或其糖苷源自植物萃取物。

(9)如上述8記載之梅納反應抑制劑，其中植物萃取物為鳳果果皮之水萃取物。

(10)一種經口劑，其含有如上述7至9中任一項記載之梅納反應抑制劑。

(11)一種外用劑，其含有如上述7至9中任一項記載之梅納反應抑制劑。

(12)一種食品，其含有如上述7至9中任一項記載之梅納反應抑制劑。

本發明之纖維母細胞增殖促進劑(以下稱為本發明增殖促進劑)促 進纖維母細胞之增殖，而促進膠原蛋白或玻尿酸之產生，因此抑制因膠原蛋白或玻尿酸之減少而產生之皮膚皺紋或鬆弛、肌膚暗沉或老化、肌膚乾燥，較有用。又，本發明增殖促進劑源自食用植物之成分，因此安全性較高。

又，本發明之梅納反應抑制劑(以下稱為「本發明抑制劑」)具有較強之活性，因此對抑制被認為梅納反應參與之各種症狀、例如癌、糖尿病併發症、白內障、軟骨之彈力降低、皮膚之老化(成為皮膚之彈力降低、皺紋或鬆弛之原因的膠原蛋白之交聯形成，成為肌膚暗沉之原因的色素沈積等)有用。

圖1係表示液-液分佈流程之圖。

圖2係表示利用正己烷(hexane)進行液-液分佈之水(H₂O)層之HPLC圖的圖。縱軸表示檢測強度(mAU)，橫軸表示保持時間(分鐘)。箭頭表示黃木素糖苷之波峰。

圖3係表示利用乙酸乙酯(EtOAc)進行液-液分佈之水(H₂O)層之HPLC圖的圖。縱軸表示檢測強度(mAU)，橫軸表示保持時間(分鐘)。箭頭表示黃木素糖苷之波峰。

圖4係表示水飽和丁醇(BuOH)層之HPLC圖的圖。縱軸表示檢測強度(mAU)，橫軸表示保持時間(分鐘)。箭頭表示黃木素糖苷之波峰。

圖5係表示ODS管柱溶出分No.15-18之HPLC圖的圖。縱軸表示檢測強度(mAU)，橫軸表示保持時間(分鐘)。

圖6係表示黃木素糖苷之HPLC圖的圖。縱軸表示檢測強度(mAU)，橫軸表示保持時間(分鐘)。

圖7係表示黃木素糖苷之吸光光譜之圖。縱軸表示檢測強度(mAU)，橫軸表示波長(nm)。

圖8係表示鳳果萃取物、膠原蛋白胜肽之纖維母細胞增殖促進作用之圖。橫軸表示細胞增殖率(%)。

圖9係表示黃木素、表兒茶素、膠原蛋白胜肽之纖維母細胞增殖促進作用之圖。橫軸表示細胞增殖率(%)。

圖10係表示黃木素、前花青素B2、膠原蛋白胜肽之纖維母細胞增殖促進作用之圖。橫軸表示細胞增殖率(%)。

圖11係表示黃木素、兒茶素、膠原蛋白胜肽之纖維母細胞增殖促進作用之圖。橫軸表示細胞增殖率(%)。

圖12係表示黃木素糖苷、表兒茶素、膠原蛋白胜肽之纖維母細胞增殖作用之圖。橫軸表示細胞增殖率(%)。

圖13係表示黃木素糖苷、前花青素B2、膠原蛋白胜肽之纖維母細胞增殖促進作用之圖。橫軸表示細胞增殖率(%)。

圖14係表示鳳果萃取物之纖維母細胞增殖促進作用之圖。橫軸表示細胞增殖率(%)。

鳳果果皮之水萃取物

本發明之鳳果果皮之水萃取物(以下稱為「本發明萃取物」)係藉由利用水對鳳果(Garcinia mangostana L.)之果皮進行萃取而獲得。萃取方法可藉由通常使用之方法進行。

具體而言，可藉由將鳳果果皮直接使用或切割成適當大小，視需要進行殺青或乾燥，並利用水進行萃取而製造。殺青係例如可藉由將鳳果果皮直接以生的使用或者使用冷凍後解凍者，於60℃以上之熱水中以5分鐘以內之期間進行浸泡而進行。

用於萃取之水之量因萃取條件等而異，以重量比計較適當為1：2~1：30(植物原料：水)之範圍內，較佳為1：3~1：20之範圍內，更佳為1：5~1：10之範圍內。萃取時間較適當為1小時~15天之範圍 內。萃取溫度較適當為5~100℃之範圍內，較佳為60~100℃之範圍內。萃取方法並無特別限制，可應用分批萃取、使用管柱之連續萃取等任意之方法。

所獲得之萃取物可以其狀態直接使用，亦可視需要於對其活性無影響之範圍內進而施加精製處理。此種精製處理係利用通常之方法進行即可，例如可藉由利用常法過濾萃取物而進行。又，亦可將所獲得之濾液供於減壓濃縮、冷凍乾燥或噴霧乾燥器。

黃木素及其糖苷

本發明之黃木素(Maclurin，非專有名：(3,4-二羥基苯基)(2,4,6-三羥基苯基)酮)為下述化學式(I)所表示之化合物。又，存在下述化學式(II)所表示之黃木素糖苷。

[化2]

本發明之黃木素及其糖苷可使用市售者、或自植物萃取物單離出者。

作為包含黃木素或其糖苷之植物，例如可列舉：桑樹(Morus alba L.)、美國刺桑(Maclura ponifera(Raf.)Schneid.)、香鳶尾(Iris florentina L.)、芒果(Mangifera indica L.)、黃木(Chlorophora tinctoria(L.)Gandich.)、紅花龍膽(Gentiana rhodantha Franch.)、春花龍膽(Gentiana verna L.)、蛋樹(Garcinia xanthochymus Hook.f.ex T.Anders.)、鳳果(Garcinia mangostana L.)。作為用於萃取之植物之部位，只要為包含黃木素及/或其糖苷之部位則並無特別限定，例如可使用花、花穗、果皮、果實、果肉、莖、葉、枝、枝葉、桿、樹皮、根莖、根皮、根、種子、蟲癭、心材、地面部、地下部或全株。其中，較佳為鳳果之果皮。

植物萃取物係可自包含黃木素或其糖苷之植物利用通常使用之方法進行製造。具體而言，可藉由對植物之各部位直接使用或切割成適當之大小，視需要進行殺青或乾燥，並榨汁或利用溶劑進行萃取而製造。殺青係例如可藉由將植物之各部位直接以生的使用或者使用冷凍後解凍者，於60℃以上之熱水中於5分鐘以內之期間進行浸泡而進行。作為萃取溶劑，例如可使用水。

水之使用量係因所使用之植物原料或萃取條件等而異，以重量比計較適當為1：2~1：30(植物原料：水)之範圍內，較佳為1：3~1：20之範圍內，更佳為1：5~1：10之範圍內。萃取時間較適當為1小時~15天之範圍內。萃取溫度較適當為5~100℃之範圍內。萃取方法並無特別限制，可應用分批萃取、使用管柱之連續萃取等任意之方法。

所獲得之植物萃取物可以其狀態直接使用，亦可視需要於對其活性無影響之範圍內進而施加精製處理。此種精製處理係利用通常之方法進行即可，例如可藉由利用常法過濾植物萃取物而進行。又，亦可對所獲得之濾液進行減壓濃縮、冷凍乾燥。

作為自植物萃取物單離本發明之黃木素或其糖苷之方法，並無特別限定，例如可列舉凝膠過濾層析法、離子交換層析法、親和層析法、逆相層析法等。又，亦可將該等方法組合而進行單離。

作為本發明之黃木素或其糖苷，較佳為鳳果果皮之水萃取物。尤佳為利用60~100℃之熱水萃取而得者。更佳為70~100℃之範圍內。

纖維母細胞增殖促進劑

本發明增殖促進劑係含有本發明萃取物作為有效成分者。又，本發明增殖促進劑為含有黃木素或其糖苷、及多酚作為有效成分者(以下稱為「本發明黃木素組合物」)。作為該多酚，例如可列舉表兒茶素、兒茶素、前花青素。該多酚例如可使用市售者，亦可使用利用通常方法自植物萃取而得者。

本發明增殖促進劑可藉由如下方法製造：將以上述方式獲得之本發明萃取物、或本發明黃木素組合物直接使用或與可用作載體之素材混合，繼而利用常法加工成粉末狀、塊狀、液狀等各種形態。

本發明增殖促進劑中，本發明萃取物之含量並無特別限定，例 如較適當為0.01重量%(以下簡稱為「%」)以上，較佳為0.05~50%之範圍內。又，本發明增殖促進劑中，黃木素或其糖苷之含量並無特別限定，例如較適當為0.0001~50重量%之範圍內，較佳為0.001~10%之範圍內。本發明黃木素組合物中，黃木素或其糖苷與多酚之調配比並無特別限定，以重量比計較佳為1：1~1：100(黃木素或其糖苷：多酚，以下相同)之範圍內，更佳為1：5~1：20之範圍內。

本發明增殖促進劑可進而含有膠原蛋白。膠原蛋白可為高分子者，亦可為低分子化而成之膠原蛋白胜肽。

又，黃木素或其糖苷與多酚、膠原蛋白之調配比並無特別限定，以重量比計較佳為1：1：10000~1：100：200000(黃木素或其糖苷：多酚：膠原蛋白，以下相同)之範圍內，更佳為1：5：10000~1：20：50000之範圍內。

本發明增殖促進劑中可任意地調配醫藥上或食品上許可之添加物。作為該添加劑，例如可列舉：結合劑、崩解劑、潤滑劑、分散劑、懸浮劑、乳化劑、緩衝劑、抗氧化劑、賦形劑、界面活性劑、紫外線抑制劑、金屬離子封阻劑、增黏劑、防腐劑、抗菌劑、保濕劑、色素，可將該等使用1種或2種以上。

本發明增殖促進劑可利用常法適當地製備成片劑、散劑、顆粒劑、膠囊劑、液劑、糖漿劑、滴丸、養護劑、洗劑、軟膏、乳霜等劑型。

本發明增殖促進劑之攝取量係因症狀、劑型、投予對象者之年齡、體重等而異，通常成人每天、按本發明萃取物或本發明黃木素組合物之重量計，較適當設為0.01~100g之範圍內，較佳為設為0.03g~60g之範圍內，以黃木素或其糖苷之重量計，較適當設為0.01mg~10g之範圍內，較佳為設為0.03mg~5g之範圍內，但未必限定於該範圍。該每天之攝取量可1次攝取，又，亦可分為2~4次攝取。

梅納反應抑制劑

本發明抑制劑含有黃木素或其糖苷作為有效成分。本發明抑制劑可藉由如下方法製造：將以上述方式獲得之植物萃取物或黃木素或者其糖苷直接使用或與可用作載體之素材混合，繼而利用常法加工成粉末狀、塊狀、液狀等各種形態。

本發明抑制劑中可任意地調配醫藥上或食品上許可之添加物。作為該添加物，例如可列舉：結合劑、崩解劑、潤滑劑、分散劑、懸浮劑、乳化劑、緩衝劑、抗氧化劑、賦形劑、界面活性劑、紫外線抑制劑、金屬離子封阻劑、增黏劑、防腐劑、抗菌劑、保濕劑、色素，可將該等使用1種或2種以上。

本發明抑制劑中，黃木素或其糖苷之含量並無特別限定，例如較適當為0.0001~50重量%(以下簡稱為「%」)之範圍內，較佳為0.001~10%之範圍內。

本發明抑制劑之攝取量係因症狀、劑型、投予對象者之年齡、體重等而異，通常成人每天、以黃木素或其糖苷之重量計，較適當設為0.01mg~10g之範圍內，較佳為設為0.03mg~5g之範圍內，但未必限定於該範圍。該每天之攝取量可1次攝取，又，亦可分為2~4次攝取。

經口劑

本發明之經口劑意指含有本發明抑制劑之可經口攝取之組合物。本發明之經口劑可藉由利用常法將本發明抑制劑直接製劑化、或將視需要對其適量調配有於製造經口劑時使用之醫藥上或食品上許可之添加劑者製劑化而獲得。作為該添加劑，可列舉：賦形劑、填充劑、增量劑、結合劑、崩解劑、界面活性劑、調味料、香料、潤滑劑等。

於本發明之經口劑之製劑化時，亦可調配具有其他生理功能之 素材。

本發明之經口劑之劑型並無特別限定，例如可列舉：片劑、散劑、顆粒劑、膠囊劑、液劑、糖漿劑、滴劑。

作為本發明之經口劑中之黃木素或其糖苷之含量，配合劑型等而適當地製備即可，例如於製劑總量中，以黃木素或其糖苷之量計，較適當為0.0001~50%之範圍內，較佳為0.001~10%之範圍內。

本發明之經口劑之攝取量係因劑型、投予對象者之年齡、體重等而異，通常成人每天、以黃木素或其糖苷之重量計，較適當設為0.01mg~10g之範圍內，較佳為設為0.03mg~5g之範圍內，但未必限定於該範圍。該每天之攝取量可1次攝取，又，亦可分為2~4次攝取。

外用劑

本發明之外用劑意指含有本發明抑制劑之可以外用之形式使用之組合物。

本發明之外用劑可藉由利用常法將本發明抑制劑直接製劑化、或將視需要對其適量調配有於製造外用劑時使用之醫藥上許可之添加劑者製劑化而獲得。作為該添加劑，可列舉：軟膏用基劑、醇、多元醇、水溶性高分子、抗氧化劑、pH值調整劑、紫外線抑制劑、金屬離子封阻劑、增黏劑、界面活性劑、精製水、防腐劑、抗菌劑、油劑、高級脂肪酸、脂肪酸酯、保濕劑、色素、維生素類、胺基酸類等。

進而，亦可將本發明抑制劑調配於公知之準藥品、化妝品中而作為本發明之外用劑使用。

本發明之外用劑中，除本發明抑制劑以外，亦可進而調配用以提高老化抑制效果之成分，或調配具有其他生理功能之素材。作為該成分，例如可列舉：紫外線抑制劑、抗氧化劑、保濕劑、細胞活化 劑、血流促進劑。可將該等使用1種或2種以上。

作為本發明之外用劑之具體使用態樣，並無特別限定，例如可列舉：化妝水、乳液、乳霜、軟膏、洗劑、油、敷劑、養護劑。

作為本發明之外用劑中之黃木素或其糖苷之含量，配合劑型等而適當地製備即可，例如於製劑總量中，於0.0001~50%之範圍內、較佳為0.001~25%、進而較佳為0.005~20%之範圍內調配即可。

本發明之外用劑之使用量係因劑型、投予對象者之年齡、體重等而異，通常成人每天、以黃木素或其糖苷之重量計，較適當設為0.01mg~100g之範圍內，較佳為設為0.03mg~60g之範圍內，但未必限定於該範圍。該每天之使用量可1次使用，又，亦可分為2~4次使用。

食品

本發明之食品可藉由將本發明抑制劑與公知之食材或飲食品混合並利用常法加工成食品而獲得。

本發明之食品之形態並無特別限定，例如可列舉：粉末狀、塊狀、液狀、糖漿狀、凝膠狀。

本發明之食品中，可調配食品上許可之其他成分。作為該成分，例如可列舉：營養素、賦形劑、增量劑、甜味劑、香味劑、著色劑、防腐劑、乳化劑、溶解化劑、多元醇、有機酸、無機酸、水溶性高分子。可將該等使用1種或2種以上。

作為本發明之食品之種類，例如可列舉：飲料(清涼飲料、乳飲料、果汁、茶類等)、飲料粉(果汁粉、湯粉等)、魚糜製品(畜肉腸、魚肉腸、魚糕、魚捲等)、熟食(菜肉蛋捲、煎蛋、漢堡包、炸肉餅、肉丸、醋拌涼菜、咕咾肉、沙拉、餃子、燒賣、卷心菜捲、豆腐、築前煮菜、煮豆、煮羊棲菜、乾炸食品、天婦羅、油炸食品、蒸蛋羹、芝麻拌涼菜、咖喱、燉菜、湯、炒飯、飯團、年糕、撒在飯上之調味 粉、味噌湯等)、麵類(烏冬麵、掛麵、蕎麥麵、意大利麵、通心粉、拉麵等)、調理麵包(漢堡、熱狗、三明治等)、麵包(吐司麵包、法式麵包等)、點心(蛋糕、曲奇、威化餅、可麗餅、酸乳酪、布丁、糖果、橡皮糖、冰淇淋、牛奶糖、巧克力、甜甜圈、薄脆餅、羊羹、米粉糕、豆餡糯米餅、帶餡饅頭、大福餅、萩餅、米粉團、甜納豆、中式包子等)。此外，亦可列舉蛋黃醬、沙拉醬等。

向本發明之食品添加黃木素或其糖苷之量係因有無添加劑或食品之種類等而異，較適當設為0.0001~50%之範圍內，較佳為設為0.001~30%之範圍內，但未必限定於該範圍。

本發明之食品之攝取量係因攝取者之性別、年齡、體重、症狀等而異。該攝取量係成人每天、以黃木素或其糖苷之重量計，較適當設為0.01mg~10g之範圍內，較佳為設為0.03mg~5g之範圍內，但未必限定於該範圍。該每天之攝取量可1次攝取，又，亦可分為2次以上攝取。

[實施例]

以下，列舉實施例、試驗例進而詳細闡述本發明。但，當然本發明並不限定於下述實施例。

實施例1 鳳果果皮之熱水萃取物之製造

將經乾燥之鳳果果皮1.5kg填充至底部安裝有100目過濾器之 13.5cm×60cm之不鏽鋼製管柱中，並自上添加熱水，自下以每小時3升之速度收集萃取液。利用濃縮機(RVT-T，HISAKA WORKS L.T.D.製造)對其進行濃縮直至固形物成分濃度(Brix)變為25%，進而，以成為最終之固形物成分之25%之方式添加糊精，調整為固形物成分濃度(Brix)30%。利用平板式殺菌機(STS-100，日阪製作所製造)於130℃下對其進行30秒殺菌之後，利用噴霧乾燥器(L-12，大川原加工機股份有限公司製造)進行粉末化，而獲得粉末狀之萃取物。

實施例2黃木素糖苷之單離及鑑定

將經乾燥之鳳果果皮1.5kg填充至底部安裝有100目過濾器之 13.5cm×60cm之不鏽鋼製管柱中，並自上添加熱水，自下以每小時3升之速度收集萃取液。將利用濃縮機(RVT-T，HISAKA WORKS L.T.D.製造)對其進行濃縮直至固形物成分濃度(Brix)變為25%而成的液體裝入托盤，利用冷凍乾燥器(RLEII-103，日精股份有限公司製造)使其乾燥，將乾燥而成者利用摻合機進行粉碎，而獲得粉末狀之鳳果熱水萃取物。

以如圖1所示之流程對該粉末25g進行液-液分佈。將液-液分佈中獲得之HPLC(High Performance Liquid Chromatography，高效液相層析法)圖示於圖2~圖7。將水飽和丁醇(BuOH)層蒸乾後，利用水進行再溶解，並裝滿於ODS(Octa Decyl Silyl，十八烷基矽烷)開口管柱(YMC-gel ODSAQ12S50， 2×17cm，YMC股份有限公司製造)中，利用水進行溶出而分為1-70之溶出分。其中，收集第15-18號溶出分，進而利用HPLC(管柱：YMC-Pack ODS-A 250×10mm，S-5μm，12nm，YMC股份有限公司製造)進行分取，而獲得單離而得之目標化合物6.7mg。

所獲得之化合物係於以下所示之條件下利用HPLC進行分析，確認為純品，並測定吸光光譜。

<HPLC條件>

管柱：YMC-pack ODS-A A302，S-5μm，12nm(150mm×4.6mm，YMC股份有限公司製造)

流動相：A：0.1%甲酸水、B：含0.1%甲酸之乙腈

進而，單離而得之化合物係利用NMR(Nuclear Magnetic Resonance，核磁共振)進行鑑定。將¹³C、¹H之歸屬結果示於表2。進而，根據DEPT(Distortionless Enhancement by Polarization Transfer，無畸變極化轉移增強)、1D-NOESY(One-dimensional Nuclear Overhauser Enhancement Spectroscopy，一維核奧佛豪瑟增強譜)、HMQC(Heteronuclear Multiple-Quantum Correlation，異核多量子相關)、HMBC(Heteronuclear Multiple-Bond Correlation，異核多鍵相關)(4Hz、12Hz)之結果，鑑定為黃木素糖苷(化2)。

參考例1 鳳果果肉之熱水萃取物之製造

於鳳果果肉之冷凍乾燥粉末1.0g中添加熱水，進行萃取30分鐘。萃取後，利用NO.2濾紙(Advantec Toyo股份有限公司製造)進行過濾，並收集濾液。利用蒸發器(IWAKI公司製造)使所收集之濾液乾燥，而獲得乾燥粉末。

試驗例1 鳳果果皮之熱水萃取物之纖維母細胞增殖促進活性測定

細胞係使用人類正常纖維母細胞(TAKARA BIO公司製造；以下記作NHDF細胞)。使NHDF細胞分散於包含10% FBS(Fetal Bovine Serum(胎牛血清)，以下相同)之DMEM培養基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium，達氏修正伊氏培養基)(Gibco公司製造)(包含100unit/ml青黴素-100mg/ml鏈黴素(Gibco公司製造)及0.1mM NEAA(Gibco公司製造))，於接著系細胞用培養燒瓶(日本Bioscience公司製造；底面積：25cm²)中，以最終濃度成為1×10⁴cells/ml之方式播種7ml，並使用CO₂培養箱(三洋電機Biomedical公司製造；CO₂濃度5%，濕度90%)於37℃下培養4-5天。藉由顯微鏡檢查確認成為70-90%融合之後，用於後續實驗。

用作檢體之膠原蛋白胜肽係使用NSCP AQUA(日本新藥股份有限公司製造)。又，鳳果萃取物係使用實施例1中製造之鳳果果皮熱水萃取物。使各檢體溶解於PBS(Phosphate Buffered Saline(磷酸鹽緩衝液)，以下相同)中。再者，將0.2μg/ml之檢體溶液供給至過濾器進行殺菌，用於實驗。

細胞增殖作用係使用WST-1試劑(Roche Diagnostics公司製造)進行測定。首先，使用Trypsin-EDTA(Gibco公司製造)將成為70-90%融合之NHDF細胞剝離，並回收。將該NHDF細胞以1.0×10⁴cells/穴(100μl)播種於96穴培養盤中後，培育24小時。培育後，去除培養液，利用PBS洗淨2次。其後，添加包含0.5% FBS之DMEM培養基與單種或 複數種檢體(膠原蛋白胜肽：最終濃度50μg/ml，鳳果萃取物：最終濃度1μg/ml)，培養48小時。培養後，於各穴添加WST-1試劑(Roche Diagnostics公司製造)5μl，並培育30分鐘。其後，利用微盤讀取器(CORONA ELECTRIC公司製造，MTP-300)測定450nm之吸光值。

對未添加檢體之情形(對照)，亦進行與上述相同之操作，並求出添加各檢體時之吸光值相對於此處獲得之吸光值之相對值，設為細胞增殖率(%)。將其結果示於圖8。

如圖8所示，本發明之含有黃木素或其糖苷之鳳果果皮熱水萃取物可單獨促進纖維母細胞之增殖。又，膠原蛋白胜肽亦促進纖維母細胞之增殖。藉由併用鳳果果皮熱水萃取物與膠原蛋白胜肽，使各成分單獨之細胞增殖促進活性協同地增大。另一方面，鳳果果皮含水甲醇萃取物不顯示與膠原蛋白胜肽之協同作用。

試驗例2 黃木素及黃木素糖苷之纖維母細胞增殖促進活性測定

細胞係使用人類正常纖維母細胞(TAKARA BIO公司製造；以下記作NHDF細胞)。使NHDF細胞分散於包含10% FBS之DMEM培養基(包含100unit/ml青黴素-100mg/ml鏈黴素及0.1mM NEAA)中，於接著系細胞用培養燒瓶(日本Bioscience公司製造；底面積：25cm²)中，以最終濃度成為1×10⁴cells/ml之方式播種7ml，並使用CO₂培養箱(三洋電機Biomedical公司製造；CO₂濃度5%，濕度90%)於37℃下培養4-5天。藉由顯微鏡檢查確認成為70-90%融合之後，使用於後續實驗。

用作檢體之膠原蛋白胜肽係使用NSCP AQUA(日本新藥股份有限公司製造)。兒茶素及表兒茶素係使用自Funakoshi公司購買之試劑，前花青素B2及黃木素係使用自Sigma公司購買之試劑。黃木素糖苷係使用實施例2中單離而成者。使各檢體溶解於PBS中。再者，將檢體溶液供給至0.2μm過濾器進行殺菌，用於實驗。細胞增殖作用係使用WST-1試劑(Roche Diagnostics公司製造)進行測定。

首先，使用Trypsin-EDTA(Gibco公司製造)將成為70-90%融合之NHDF細胞剝離，並回收。將該NHDF細胞以1.0×10⁴cells/穴(100μl)播種於96穴培養盤之後，培育24小時。培育後，去除培養液，利用PBS洗淨2次。其後，添加包含0.5% FBS之DMEM培養基與單種或複數種檢體(膠原蛋白胜肽：最終濃度50μg/ml，兒茶素：最終濃度0.01μg/ml，表兒茶素：最終濃度0.01μg/ml，前花青素B2：最終濃度0.01μg/ml，黃木素：最終濃度0.001μg/ml，黃木素糖苷：最終濃度0.001μg/ml)，培養48小時。培養後，於各穴中添加WST-1試劑(Roche Diagnostics公司製造)5μl，並培育30分鐘。其後，利用微盤讀取器(CORONA ELECTRIC公司製造，MTP-300)測定450nm之吸光值。

對未添加檢體之情形(對照)，亦進行與上述相同之操作，並求出添加各檢體時之吸光值相對於此處獲得之吸光值之相對值，設為細胞增殖率(%)。將結果示於圖9、10、11、12、13。

如圖9所示，黃木素單獨不顯示纖維母細胞增殖促進活性，但藉由併用表兒茶素，而顯著地促進纖維母細胞之增殖。又，藉由併用黃木素及表兒茶素與膠原蛋白胜肽，使細胞增殖活性協同地增大。

如圖10所示，黃木素單獨不顯示纖維母細胞增殖促進活性，但藉由併用前花青素B2，而顯著地促進纖維母細胞之增殖。又，藉由併用黃木素及前花青素B2與膠原蛋白胜肽，使細胞增殖活性協同地增大。

如圖11所示，黃木素單獨不顯示纖維母細胞增殖促進活性，但藉由併用兒茶素，而顯著地促進纖維母細胞之增殖。又，藉由併用黃木素及兒茶素與膠原蛋白胜肽，使細胞增殖活性協同地增大。

如圖12所示，黃木素糖苷單獨不顯示纖維母細胞增殖促進活性，但藉由併用表兒茶素，而顯著地促進纖維母細胞之增殖。又，藉由併用黃木素糖苷及表兒茶素與膠原蛋白胜肽，使細胞增殖活性協同 地增大。

如圖13所示，黃木素糖苷單獨不顯示纖維母細胞增殖促進活性，但藉由併用前花青素B2，而顯著地促進纖維母細胞之增殖。又，藉由併用黃木素糖苷及前花青素B2與膠原蛋白胜肽，使細胞增殖活性協同地增大。

試驗例3 黃木素及黃木素糖苷之梅納反應抑制活性測定

於試管內添加磷酸緩衝液(pH值7.15)、最終濃度0.8mg/ml BSA(Bovine Serum Albumin，牛血清白蛋白)、2M葡萄糖，並以最終濃度成為0、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0mg/ml之方式添加黃木素(Sigma公司製造)作為試樣，於60℃下反應30小時，將反應獲得之溶液作為試液。亦同樣地使實施例2之黃木素糖苷、胺基胍(硫酸胺基胍：和光純藥工業股份有限公司製造)、實施例1之鳳果果皮熱水萃取物進行反應。

對該試液，利用螢光測定器(MTP-600 CORONA ELECTRIC股份有限公司製造)，於激發波長360nm、螢光波長450nm下測定螢光值。作為空白樣品1，製備未添加葡萄糖者，作為空白樣品2，製備未添加試樣者，作為空白樣品3，製備未添加葡萄糖與試樣者，同樣地進行培育並測定螢光值。抑制率(%)係利用下式算出。

抑制率={1-(試樣之螢光值-空白樣品1)÷(空白樣品2-空白樣品3)}×100

進而，對各試樣，以縱軸為抑制率、以橫軸為試樣濃度進行繪圖，根據近似曲線算出50%抑制濃度(IC50)。將其結果示於表3。

黃木素及其糖苷與胺基胍相比顯示較高之梅納反應抑制活性。

試驗例4 黃木素及黃木素糖苷之CML(羧甲基離胺酸)生成反應抑制活性測定

利用緩衝液將CML-BSA(CML-BSA/N^ε-羧甲基離胺酸-BSA，Cat # CY-R2052，CycLex公司製造)稀釋2500倍，並以成為100μl/穴之方式添加至ELISA用之96穴培養盤內，於37℃下以1小時進行固相化。繼而，丟棄96穴培養盤之溶液後，利用洗淨緩衝液洗淨一次之後，添加封閉緩衝液200μl/穴，於37℃下培育1小時。

丟棄96穴培養盤之溶液後，利用洗淨緩衝液洗淨一次，將利用緩衝液將抗CML抗體(反-CML/N^ε-羧甲基離胺酸，Cat # CY-M1028，CycLex公司製造)稀釋10000倍而成者50μl、與調整為0、0.037、0.078、0.156、0.313、0.625、1.25、2.5μg/ml之CML標準液、或調整為0、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0μg/ml之黃木素50μl混合，並將混合而成者添加至培養盤，利用培養盤振盪器進行攪拌(300rpm)，並於室溫下反應1小時。

反應後，丟棄96穴培養盤之溶液後，利用洗淨緩衝液洗淨4次，並以100μl/穴添加利用緩衝液將二次抗體(羊抗小鼠IgG過氧化物酶抗體，Cat # A3673，Sigma公司製造)稀釋10000倍而成者，利用培養盤振盪器進行攪拌(300rpm)，並於室溫下反應1小時。反應後，丟棄96穴培養盤之溶液後，利用洗淨緩衝液洗淨4次，並以100μl/穴添加TMB(tetramethylbenzidine，四甲基聯苯胺)溶液，反應10分鐘後，以 100μl/穴添加1N硫酸，將如此獲得者利用微盤讀取器(MTP-300，CORONA ELECTRIC股份有限公司製造)測定450nm之吸光值。

亦同樣地使黃木素糖苷、胺基胍、前花青素B2、α鳳果、鳳果果皮熱水萃取物進行反應。

將其結果示於表4。

黃木素及其糖苷與胺基胍相比顯示較高之CML生成抑制活性。

試驗例5 鳳果果皮與鳳果果肉之熱水萃取物之纖維母細胞增殖促進活性之比較

利用與試驗例1相同之方法進行測定。然而，作為檢體，使用實施例1中製造之鳳果果皮熱水萃取物(最終濃度1μg/ml)與參考例1中製造之鳳果果肉熱水萃取物(最終濃度1μg/ml)。將其結果示於圖14。

如圖14所示，鳳果果皮之熱水萃取物與鳳果果肉之熱水萃取物相比，高效地促進纖維母細胞之增殖。

[產業上之可利用性]

本發明增殖促進劑具有優異之纖維母細胞增殖促進作用，故而可用於抑制例如以膠原蛋白之減少或變質為原因等之症狀即皮膚之老化(皮膚之彈力降低，成為皺紋或鬆弛之原因的膠原蛋白之交聯形成，成為肌膚暗沉之原因之色素沈積等)等。

又，本發明抑制劑具有優異之梅納反應抑制作用，故而可用於抑制伴隨老化而產生之現象，例如白內障、軟骨之彈力降低、皮膚之老化(皮膚之彈力降低，成為皺紋或鬆弛之原因的膠原蛋白之交聯形成，成為肌膚暗沉之原因之色素沈積等)。又，本發明之抗氧化劑亦可用於改善、預防或治療已知活性氧參與之糖尿病併發症(例如心肌梗塞、糖尿病腎病變、糖尿病視網膜病變、糖尿病神經病變)。

Claims (7)

1. 一種黃木素或其糖苷、及多酚之用途，其係用以製造纖維母細胞增殖促進劑。
2. 如請求項1之用途，其中黃木素或其糖苷、及多酚係源自鳳果果皮之水萃取物。
3. 一種黃木素或其糖苷、及多酚、以及膠原蛋白之用途，其係用以製造纖維母細胞增殖促進劑。
4. 如請求項3之用途，其中黃木素或其糖苷、及多酚係源自鳳果果皮之水萃取物。
5. 一種黃木素或其糖苷之用途，其係用以製造梅納反應抑制劑。
6. 如請求項5之用途，其中黃木素或其糖苷係源自植物萃取物。
7. 如請求項6之用途，其中植物萃取物為鳳果果皮之水萃取物。