JP6252079B2

JP6252079B2 - 線維芽細胞増殖促進剤

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Publication number: JP6252079B2
Application number: JP2013206878A
Authority: JP
Inventors: 武蔵三枝
Original assignee: Nippon Shinyaku Co Ltd
Current assignee: Nippon Shinyaku Co Ltd
Priority date: 2012-10-02
Filing date: 2013-10-02
Publication date: 2017-12-27
Anticipated expiration: 2033-10-02
Also published as: JP2014088375A

Description

本発明は、マンゴスチン果皮の水抽出物を含有する線維芽細胞増殖促進剤に関するものである。また、本発明は、マクルリン又はその配糖体とポリフェノールとを含有する線維芽細胞増殖促進剤に関するものである。

皮膚は表皮、真皮、皮下組織からなる３層構造をとっている。表皮層は厚さが平均約０．２ミリのとても薄い膜であり、皮膚の一番外側に存在する。外部からの異物の進入や体の水分の蒸散を防ぐバリアとなって、内部を保護する役割を持つ。真皮層には、線維や毛細血管、リンパ管などが詰まっており、これらが表皮層を支え、酸素や栄養素を送り込んだり、老廃物を運び去っている。真皮層は、表皮層の内側にあって、皮膚組織の大部分を占めている。真皮はコラーゲンがその大部分を占めており、ヒアルロン酸やエラスチンとともに皮膚の張りや弾力を支持する働きをする。真皮に存在する線維芽細胞がこれらの成分を産生する。皮下組織は、皮膚の３層構造のうち最も内側にある組織で、表皮と真皮とを支える役割をしている。皮下組織は大部分が皮下脂肪であり、そこを通っている動脈や静脈が皮膚組織に栄養を届けたり老廃物を運び出したりする。また、皮下組織は外部からの刺激や衝撃を和らげたり、断熱・保温の働きをしたり、エネルギーを脂肪のかたちで蓄える役割もしている。

加齢や生活習慣、紫外線等の様々な内的、外的刺激により皮膚がダメージを受けると、真皮層に存在する線維芽細胞の増殖が低下し、コラーゲン産生の減少やコラーゲンの変質が起こり、その結果、肌の張りや弾力の低下等、様々な症状を生じる。線維芽細胞の増殖を促進する組成物は機能性食品や化粧品として有用であると考えられ、安全性、効果ともに高い素材の開発が望まれている。

マンゴスチンは、東南アジア原産のオトギリソウ科（Ｇｕｔｔｉｆｅｒａｅ）フクギ属の常緑小高木で、マンゴー、チェリモヤとともに世界三大美果に数えられており、その淡い酸味と上品な甘みが特徴で、フルーツの女王ともいわれている。マンゴスチンは、古くから伝承薬として用いられ、抗菌作用や抗炎症作用、抗酸化作用、滋養強壮作用が知られている。また、マンゴスチン果肉の水抽出物は、線維芽細胞増殖促進作用を示すことが報告されているが（特許文献１参照）、かかる作用を示す活性成分は知られていない。また、マンゴスチン果皮の水抽出物が線維芽細胞増殖促進作用を有することは知られていない。

マクルリンは天然染料色素として知られており、染毛性整髪用として用いられている（特許文献２参照）。また、マンゴスチンにマクルリンが存在することが知られているが、その生理作用については知られていない（特許文献３および４参照）。

特開２００６−２４９０５１号公報特許３３０９２２１号公報特表２００８−５２０５８５号公報特表２００６−５０４７９０号公報

本発明は、新規な線維芽細胞増殖促進剤を提供することを主な目的とする。

本発明者は、上記課題を解決すべく検討した結果、マンゴスチン果皮の水抽出物が線維芽細胞増殖促進作用を有することを見出し、本発明を完成した。また、本発明者は、マクルリン又はその配糖体、並びにポリフェノールを含有する組成物が線維芽細胞増殖促進作用を有することを見出した。本発明者は、さらに、コラーゲンを併用することにより、かかる線維芽細胞増殖促進作用を増強しうることを見出した。

本発明として、下記のものを挙げることができる。
（１）マンゴスチン果皮の水抽出物を有効成分として含有する、線維芽細胞増殖促進剤。
（２）マクルリン又はその配糖体、及びポリフェノールを有効成分として含有する、線維芽細胞増殖促進剤。
（３）マクルリン又はその配糖体、及びポリフェノールがマンゴスチン果皮の水抽出物由来である、前記２記載の線維芽細胞増殖促進剤。
（４）マンゴスチン果皮の水抽出物及びコラーゲンを有効成分として含有する、線維芽細胞増殖促進剤。
（５）マクルリン又はその配糖体及びポリフェノール、並びにコラーゲンを有効成分として含有する線維芽細胞増殖促進剤。
（６）マクルリン又はその配糖体、及びポリフェノールがマンゴスチン果皮の水抽出物由来である、前記５記載の線維芽細胞増殖促進剤。

本発明に係る線維芽細胞増殖促進剤（以下、本発明増殖促進剤という。）は、線維芽細胞の増殖を促進してコラーゲンやヒアルロン酸の産生を促進することから、コラーゲンやヒアルロン酸の減少により生じる皮膚のしわやたるみ、肌のくすみや老化、肌の乾燥を抑制し、有用である。また、本発明増殖促進剤は、食用植物の成分由来であることから、安全性が高いものである。

液液分配スキームを示す図である。 n-ヘキサン（hexane）で液液分配した水（H₂O）層のＨＰＬＣチャートを示す図である。縦軸は検出強度（ｍＡＵ）を示し、横軸は保持時間（分）を示す。矢印は、マクルリン配糖体のピークを示す。酢酸エチル(EtOAc)で液液分配した水（H₂O）層のＨＰＬＣチャートを示す図である。縦軸は検出強度（ｍＡＵ）を示し、横軸は保持時間（分）を示す。矢印は、マクルリン配糖体のピークを示す。水飽和ブタノール（ＢｕＯＨ）層のＨＰＬＣチャートを示す図である。縦軸は検出強度（ｍＡＵ）を示し、横軸は保持時間（分）を示す。矢印は、マクルリン配糖体のピークを示す。ＯＤＳカラムフラクションＮｏ．１５−１８のＨＰＬＣチャートを示す図である。縦軸は検出強度（ｍＡＵ）を示し、横軸は保持時間（分）を示す。マクルリン配糖体のＨＰＬＣチャートを示す図である。縦軸は検出強度（ｍＡＵ）を示し、横軸は保持時間（分）を示す。マクルリン配糖体の吸光スペクトルを示す図である。縦軸は検出強度（ｍＡＵ）を示し、横軸は波長（ｎｍ）を示す。マンゴスチン抽出物、コラーゲンペプチドの線維芽細胞増殖促進作用を示す図である。横軸は細胞増殖率（％）を示す。マクルリン、エピカテキン、コラーゲンペプチドの線維芽細胞増殖促進作用を示す図である。横軸は細胞増殖率（％）を示す。マクルリン、プロシアニジンB２、コラーゲンペプチドの線維芽細胞増殖促進作用を示す図である。横軸は細胞増殖率（％）を示す。マクルリン、カテキン、コラーゲンペプチドの線維芽細胞増殖促進作用を示す図である。横軸は細胞増殖率（％）を示す。マクルリン配糖体、エピカテキン、コラーゲンペプチドの線維芽相棒増殖作用を示す図である。横軸は細胞増殖率（％）を示す。マクルリン配糖体、プロシアニジンＢ２、コラーゲンペプチドの線維芽細胞増殖促進作用を示す図である。横軸は細胞増殖率（％）を示す。マンゴスチン抽出物の線維芽細胞増殖促進作用を示す図である。横軸は細胞増殖率（％）を示す。

マンゴスチン果皮の水抽出物
本発明に係るマンゴスチン果皮の水抽出物（以下、「本発明抽出物」という）は、マンゴスチン（ＧａｒｃｉｎｉａｍａｎｇｏｓｔａｎａＬ．）の果皮を水で抽出することにより得られる。抽出方法は、通常用いられる方法により行うことができる。

具体的には、マンゴスチン果皮をそのまま又は適当な大きさに切断し、必要に応じてブランチング又は乾燥し、水で抽出することにより製造することができる。ブランチングは、例えば、マンゴスチン果皮を生のままあるいは、冷凍した後に解凍したものを６０℃以上の熱水に５分以内の間、浸すことにより行うことができる。

抽出に使う水の量は、抽出条件等により異なるが、重量比で、１：２〜１：３０（植物原料：水）の範囲内が適当であり、１：３〜１：２０の範囲内が好ましく、１：５〜１：１０の範囲内がより好ましい。抽出時間は、１時間〜１５日の範囲内が適当である。抽出温度は、５〜１００℃の範囲内が適当であり、６０〜１００℃の範囲内が好ましい。抽出方法については特に制限されず、バッチ抽出、カラムを用いた連続抽出等、任意の方法を適用することができる。

得られた抽出物は、そのままの状態で用いることもできるが、必要に応じ、その活性に影響のない範囲内で更に精製処理を加えてもよい。このような精製処理は、通常の方法によって行えばよく、例えば、抽出物を常法によりろ過することにより行うことができる。また、得られたろ液を減圧濃縮、凍結乾燥またはスプレードライヤーに供することもできる。
マクルリン及びその配糖体
本発明に係るマクルリン（Ｍａｃｒｕｌｉｎ、一般名：（３，４−ジヒドロキシフェニル）（２，４，６−トリヒドロキシフェニル）ケトン）は、次の化学式（I）で表される化合物である。また、次の化学式（II)で表されるマクルリン配糖体が存在する。

本発明に係るマクルリン及びその配糖体は、市販のものか、又は植物抽出物から単離したものを用いることができる。

マクルリン又はその配糖体を含む植物としては、例えば、トウグワ（ＭｏｒｕｓａｌｂａＬ．）、アメリカハリグワ（Ｍａｃｌｕｒａｐｏｎｉｆｅｒａ（Ｒａｆ．）Ｓｃｈｎｅｉｄ．）、ニオイイリス（ＩｒｉｓｆｌｏｒｅｎｔｉｎａＬ．）、マンゴー（ＭａｎｇｉｆｅｒａｉｎｄｉｃａＬ．）、モラル（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｏｒａｔｉｎｃｔｏｒｉａ（Ｌ．）Ｇａｎｄｉｃｈ．）、ゲンチアナロダンザ（ＧｅｎｔｉａｎａｒｈｏｄａｎｔｈａＦｒａｎｃｈ．）、ゲンチアナヴェルナ（ＧｅｎｔｉａｎａｖｅｒｎａＬ．）、タマゴノキ（ＧａｒｃｉｎｉａｘａｎｔｈｏｃｈｙｍｕｓＨｏｏｋ．ｆ．ｅｘＴ．Ａｎｄｅｒｓ．）、マンゴスチン（ＧａｒｃｉｎｉａｍａｎｇｏｓｔａｎａＬ．）が挙げられる。抽出に使用する植物の部位としては、マクルリン及び／又はその配糖体が含まれている部位であれば特に限定されないが、例えば、花、花穂、果皮、果実、果肉、茎、葉、枝、枝葉、幹、樹皮、根茎、根皮、根、種子、虫えい、心材、地上部、地下部又は全草を用いることができる。中でも、マンゴスチンの果皮が好ましい。

植物抽出物は、マクルリン又はその配糖体を含む植物から通常用いられる方法により製造することができる。具体的には、植物の各部位をそのまま又は適当な大きさに切断し、必要に応じてブランチング又は乾燥し、搾汁又は溶媒で抽出することにより製造することができる。ブランチングは、例えば、植物の各部位を生のままあるいは、冷凍した後に解凍したものを６０℃以上の熱水に５分以内の間、浸すことにより行うことができる。抽出溶媒としては、例えば、水を用いることができる。

水の使用量は、用いる植物原料や抽出条件等により異なるが、重量比で、１：２〜１：３０（植物原料：水）の範囲内が適当であり、１：３〜１：２０の範囲内が好ましく、１：５〜１：１０の範囲内がより好ましい。抽出時間は、1時間〜１５日の範囲内が適当である。抽出温度は、５〜１００℃の範囲内が適当である。抽出方法については特に制限されず、バッチ抽出、カラムを用いた連続抽出等、任意の方法を適用することができる。

得られた植物抽出物は、そのままの状態で用いることもできるが、必要に応じ、その活性に影響のない範囲内で更に精製処理を加えてもよい。このような精製処理は、通常の方法によって行えばよく、例えば、植物抽出物を常法によりろ過することにより行うことができる。また、得られたろ液を減圧濃縮、凍結乾燥することもできる。

植物抽出物から本発明に係るマクルリン又はその配糖体を単離する方法としては、特に限定されないが、例えば、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなどを挙げることができる。また、それらを組み合わせて単離してもよい。

本発明に係るマクルリン又はその配糖体としては、マンゴスチン果皮の水抽出物が好ましい。特に、６０〜１００℃の熱水で抽出したものが好ましい。より好ましくは、７０〜１００℃の範囲内である。
線維芽細胞増殖促進剤
本発明増殖促進剤は、本発明抽出物を有効成分として含有するものである。また、本発明増殖促進剤は、マクルリン又はその配糖体、及びポリフェノールを有効成分として含有するものでもある（以下、「本発明マクルリン組成物」という）。かかるポリフェノールとしては、例えば、エピカテキン、カテキン、プロシアニジンを挙げることができる。かかるポリフェノールは、例えば、市販のものを用いることもできるし、通常の方法で植物から抽出したものを用いることができる。

本発明増殖促進剤は、上記のようにして得られた本発明抽出物、又は本発明マクルリン組成物を、そのまま又は担体として使用することのできる素材と混合し、次いで、常法により粉末状、塊状、液状などの各種形態に加工することにより製造することができる。

本発明増殖促進剤における本発明抽出物の含有量は、特に限定されないが、例えば、０．０１重量％（以下、単に「％」という）以上が適当であり、好ましくは、０．０５〜５０％の範囲内である。また、本発明増殖促進剤におけるマクルリン又はその配糖体の含有量は、特に限定されないが、例えば、０．０００１〜５０重量％の範囲内が適当であり、好ましくは、０．００１〜１０％の範囲内である。本発明マクルリン組成物におけるマクルリン又はその配糖体とポリフェノールとの配合比は、特に限定されないが、重量比として１：１〜１：１００（マクルリン又はその配糖体：ポリフェノール、以下同じ）の範囲内が好ましく、１：５〜１：２０の範囲内がより好ましい。

本発明増殖促進剤は、さらに、コラーゲンを含有することができる。コラーゲンは、高分子のものであってもよいし、低分子化したコラーゲンペプチドであってもよい。
また、マクルリン又はその配糖体とポリフェノール、コラーゲンとの配合比は、特に限定されないが、重量比として１：１：１００００〜１：１００：２０００００（マクルリン又はその配糖体：ポリフェノール：コラーゲン、以下同じ）の範囲内が好ましく、１：５：１００００〜１：２０：５００００の範囲内がより好ましい。

本発明増殖促進剤には、医薬上又は食品上許容される添加物を任意に配合することができる。かかる添加剤としては、例えば、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、分散剤、懸濁剤、乳化剤、緩衝剤、酸化防止剤、賦形剤、界面活性剤、紫外線防止剤、金属イオン封鎖剤、増粘剤、防腐剤、抗菌剤、保湿剤、色素を挙げることができ、これらを１種又は２種以上使用することができる。

本発明増殖促進剤は、常法により、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、シロップ剤、ドロップ錠、トニック、ローション、軟膏、クリーム等の剤型に適宜調製することができる。

本発明増殖促進剤の摂取量は、症状、剤型、投与対象者の年齢、体重等により異なるが、通常、成人１日当り、本発明抽出物又は本発明マクルリン組成物の重量として、０．０１〜１００ｇの範囲内とするのが適当であり、０．０３ｇ〜６０ｇの範囲内とするのが好ましく、マクルリン又はその配糖体の重量として、０．０１ｍｇ〜１０ｇの範囲内とするのが適当であり、０．０３ｍｇ〜５ｇの範囲内とするのが好ましいが、必ずしもこの範囲に限られるものではない。かかる１日当りの摂取量は、１回で摂取してもよく、また、２〜４回に分割して摂取してもよい。

以下に、実施例、試験例を掲げて本発明をさらに詳述する。但し、本発明が下記実施例に限定されないことは言うまでもない。
実施例１マンゴスチン果皮の熱水抽出物の製造
乾燥したマンゴスチン果皮１．５ｋｇを、底に１００メッシュのフィルターを取り付けたφ１３．５ｃｍ×６０ｃｍのステンレス製カラムに充填し、上から熱水を加え、下から1時間当たり３リットルの速度で抽出液を集めた。これを濃縮機（ＲＶＴ−Ｔ、ＨＩＳＡＫＡＷＯＲＫＳＬ．Ｔ．Ｄ．製）にて固形分濃度（Ｂｒｉｘ）２５％になるまで濃縮し、さらに、最終の固形分の２５％となるようにデキストリンを加え、固形分濃度（Ｂｒｉｘ）３０％に調整した。これをプレート殺菌機（ＳＴＳ−１００、日阪製作所製）にて１３０℃、３０秒殺菌したのち、スプレードライ（Ｌ−１２、大川原加工機（株）製）で粉末化し、パウダー状の抽出物を得た。
実施例２マクルリン配糖体の単離および同定
乾燥したマンゴスチン果皮１．５ｋｇを、そこに１００メッシュのフィルターを取り付けたφ１３．５ｃｍ×６０ｃｍのステンレス製カラムに充填し、上から熱水を加え、下から1時間当たり３リットルの速度で抽出液を集めた。これを濃縮機（ＲＶＴ−Ｔ、ＨＩＳＡＫＡＷＯＲＫＳＬ．Ｔ．Ｄ．製）にて固形分濃度（Ｂｒｉｘ）２５％になるまで濃縮した液をトレイに入れ、凍結乾燥器（ＲＬＥＩＩ−１０３、日精（株）製）にて乾燥させたものをブレンダーで粉砕し、パウダー状のマンゴスチン熱水抽出物を得た。

このパウダー２５ｇを図１に示すようなスキームで液液分配を行った。液液分配で得られたＨＰＬＣチャートを図２〜図７に示す。水飽和ブタノール（ＢｕＯＨ）層を蒸発乾固後、水で再溶解し、ＯＤＳオープンカラム（ＹＭＣ−ｇｅｌＯＤＳＡＱ１２Ｓ５０、φ２×１７ｃｍ、（株）ワイエムシィ製）にチャージし、水で溶出し１−７０のフラクションに分けた。この内、１５−１８番目のフラクションを集め、さらにＨＰＬＣ（カラム：ＹＭＣ−ＰａｃｋＯＤＳ−Ａ２５０×１０ｍｍ、Ｓ−５μｍ、１２ｎｍ、（株）ワイエムシィ製）にて分取し、単離した目的化合物を６．７ｍｇ得た。

得られた化合物は次に示す条件でＨＰＬＣにて分析を行い、純品であることを確認し、吸光スペクトルを測定した。
＜ＨＰＬＣ条件＞
カラム：ＹＭＣ−ｐａｃｋＯＤＳ−ＡＡ３０２，Ｓ−５μｍ，１２ｎｍ（１５０ｍｍ×４．６ｍｍ、（株）ワイエムシィ製）
移動相：Ａ；０．１％ギ酸水、Ｂ；０．１％ギ酸含アセトニトリル

さらに、単離した化合物はＮＭＲにて同定を行った。^１３Ｃ、^１Ｈの帰属結果を表２に示す。さらにＤＥＰＴ、１Ｄ−ＮＯＥＳＹ、ＨＭＱＣ、ＨＭＢＣ（４Ｈｚ、１２Ｈｚ）の結果から、マクルリン配糖体（化２）と同定した。

参考例１マンゴスチン果肉の熱水抽出物の製造
マンゴスチン果肉の凍結乾燥粉末１．０ｇに熱水を加え、３０分間抽出をおこなった。抽出後、ＮＯ．２濾紙（アドバンテック東洋株式会社製）でろ過し、ろ液を集めた。集めたろ液をエバポレーター（ＩＷＡＫＩ社製）にて乾固させ、乾燥粉末を得た。
試験例１マンゴスチン果皮の熱水抽出物の線維芽細胞増殖促進活性測定
細胞はヒト正常線維芽細胞（タカラバイオ社製；以下、ＮＨＤＦ細胞）を用いた。ＮＨＤＦ細胞は１０％ＦＢＳ（ＦｅｔａｌＢｏｖｉｎｅＳｅｒｕｍ、以下同じ）を含むＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社製）（１００ｕｎｉｔ／ｍｌＰｅｎｉｃｉｌｉｎ−１００ｍｇ／ｍｌＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｇｉｂｃｏ社製）および０．１ｍＭＮＥＡＡ（Ｇｉｂｃｏ社製）を含む）に分散し，接着系細胞用培養フラスコ（日本バイオサイエンス社製；底面積：２５ｃｍ^２）に終濃度１×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように７ｍｌ播種し，ＣＯ_２インキュベーター（三洋電機バイオメディカ社製；ＣＯ_２濃度５％、湿度９０％）を用いて３７°Ｃで４―５日間培養した。７０−９０％コンフルエントになったことを検鏡により確認した後，順次実験に使用した。

検体として用いたコラーゲンペプチドはＮＳＣＰアクア（日本新薬株式会社製）を用いた。また、マンゴスチン抽出物は実施例１で製造したマンゴスチン果皮熱水抽出物を用いた。各検体はＰＢＳ（ＰｈｏｓｐｈａｔｅＢｕｆｆｅｒｅｄＳａｌｉｎｅ、以下同じ）に溶解させた。なお、検体溶液は０．２μｇ／ｍｌフィルターに供して滅菌し、実験に使用した。

細胞増殖作用はＷＳＴ−１試薬（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を用いて測定した。まず、７０−９０％コンフルエントになったＮＨＤＦ細胞をＴｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ社製）を用いて剥がし、回収した。このＮＨＤＦ細胞を１．０×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（１００mｌ）で９６ｗｅｌｌプレートに播種した後、２４時間インキュベートした。インキュベート後、培養液を除去し、ＰＢＳで２回洗浄した。その後、０．５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地と検体（コラーゲンペプチド；終濃度５０mｇ／ｍｌ、マンゴスチン抽出物；終濃度１mｇ／ｍｌ）を単独、または複数添加し、４８時間培養した。培養後、各ｗｅｌｌにＷＳＴ−１試薬（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を５mｌ加え、３０分間インキュベートした。その後、４５０ｎｍの吸光値をマイクロプレートリーダー（ＣＯＲＯＮＡＥＬＥＣＴＲＩＣ社製、ＭＴＰ−３００）で測定した。

検体無添加の場合（対照）についても上記と同様の操作をおこない、ここに得られた吸光値に対する各検体添加時の吸光値の相対値を求め、細胞増殖率（％）とした。その結果を、図８に示す。

図８に示すように、本発明に係るマクルリン又はその配糖体を含有するマンゴスチン果皮熱水抽出物は、単独で線維芽細胞の増殖を促進した。また、コラーゲンペプチドも線維芽細胞の増殖を促進した。マンゴスチン果皮熱水抽出物とコラーゲンペプチドを併用することにより、各成分単独の細胞増殖促進活性を相乗的に増大させた。一方、マンゴスチン果皮含水メタノール抽出物は、コラーゲンペプチドとの相乗作用を示さなかった。
試験例２マクルリン及びマクルリン配糖体の線維芽細胞増殖促進活性測定
細胞はヒト正常線維芽細胞（タカラバイオ社製；以下、ＮＨＤＦ細胞）を用いた。ＮＨＤＦ細胞は１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地（１００ｕｎｉｔ／ｍｌＰｅｎｉｃｉｌｉｎ−１００ｍｇ／ｍｌＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎおよび０．１ｍＭＮＥＡＡを含む）に分散し，接着系細胞用培養フラスコ（日本バイオサイエンス社製；底面積：２５ｃｍ^２）に終濃度１×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように７ｍｌ播種し，ＣＯ_２インキュベーター（三洋電機バイオメディカ社製；ＣＯ_２濃度５％，湿度９０％）を用いて３７°Ｃで４−５日間培養した。７０−９０％コンフルエントになったことを検鏡により確認した後，順次実験に使用した。

検体として用いたコラーゲンペプチドはＮＳＣＰアクア（日本新薬株式会社製）を用いた。カテキンおよびエピカテキンはフナコシ社から購入した試薬を、プロシアニジンＢ２およびマクルリンはＳｉｇｍａ社から購入した試薬を用いた。マクルリン配糖体は実施例２で単離したものを用いた。各検体はＰＢＳに溶解させた。なお、検体溶液は０．２μｍフィルターに供して滅菌し、実験に使用した。細胞増殖作用はＷＳＴ−１試薬（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を用いて測定した。

まず、７０−９０％コンフルエントになったＮＨＤＦ細胞をＴｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ社製）を用いて剥がし、回収した。このＮＨＤＦ細胞を１．０×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（１００mｌ）で９６ｗｅｌｌプレートに播種した後、２４時間インキュベートした。インキュベート後、培養液を除去し、ＰＢＳで２回洗浄した。その後、０．５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地と検体（コラーゲンペプチド；終濃度５０mｇ／ｍｌ、カテキン；終濃度０．０１mｇ／ｍｌ、エピカテキン；終濃度０．０１mｇ／ｍｌ、プロシアニジンＢ２；終濃度０．０１mｇ／ｍｌ、マクルリン；終濃度０．００１mｇ／ｍｌ、マクルリン配糖体；終濃度０．００１mｇ／ｍｌ）を単独または複数種添加し、４８時間培養した。培養後、各ｗｅｌｌにＷＳＴ−１試薬（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を５mｌ加え、３０分間インキュベートした。その後、４５０ｎｍの吸光値をマイクロプレートリーダー（ＣＯＲＯＮＡＥＬＥＣＴＲＩＣ社製，ＭＴＰ−３００）で測定した。

検体無添加の場合（対照）についても上記と同様の操作をおこない、ここに得られた吸光値に対する各検体添加時の吸光値の相対値を求め、細胞増殖率（％）とした。結果を図９、１０、１１、１２、１３に示す。

図９に示すように、マクルリンは、単独では線維芽細胞増殖促進活性を示さないが、エピカテキンを併用することにより、線維芽細胞の増殖を有意に促進した。また、マクルリン及びエピカテキンとコラーゲンペプチドを併用することにより、細胞増殖活性を相乗的に増大した。

図１０に示すように、マクルリンは、単独では線維芽細胞増殖促進活性を示さないが、プロシアニジンＢ_２を併用することにより、線維芽細胞の増殖を有意に促進した。また、マクルリン及びプロシアニジンＢ_２とコラーゲンペプチドを併用することにより、細胞増殖活性を相乗的に増大した。

図１１に示すように、マクルリンは、単独では線維芽細胞増殖促進活性を示さないが、カテキンを併用することにより、線維芽細胞の増殖を有意に促進した。また、マクルリン及びカテキンとコラーゲンペプチドを併用することにより、細胞増殖活性を相乗的に増大した。

図１２に示すように、マクルリン配糖体は、単独では線維芽細胞増殖促進活性を示さないが、エピカテキンを併用することにより、線維芽細胞の増殖を有意に促進した。また、マクルリン配糖体及びエピカテキンとコラーゲンペプチドを併用することにより、細胞増殖活性を相乗的に増大した。

図１３に示すように、マクルリン配糖体は、単独では線維芽細胞増殖促進活性を示さないが、プロシアニジンＢ_２を併用することにより、線維芽細胞の増殖を有意に促進した。また、マクルリン配糖体及びプロシアニジンＢ_２とコラーゲンペプチドを併用することにより、細胞増殖活性を相乗的に増大した。
試験例３マンゴスチン果皮とマンゴスチン果肉の熱水抽出物の線維芽細胞増殖促進活性の比較
試験例１と同様の方法で測定した。ただし、検体として、実施例１で製造したマンゴスチン果皮熱水抽出物（終濃度１mｇ／ｍｌ）と参考例１で製造したマンゴスチン果肉熱水抽出物（終濃度１mｇ／ｍｌ）を用いた。その結果を、図１４に示す。

図１４に示すように、マンゴスチン果皮の熱水抽出物はマンゴスチン果肉の熱水抽出物と比較して線維芽細胞の増殖を強力に促進した。

本発明増殖促進剤は、優れた線維芽細胞増殖促進作用を有するため、例えば、コラーゲンの減少や変質を原因等する症状である皮膚の老化（皮膚の弾力低下、しわやたるみの原因となるコラーゲンの架橋形成、肌のくすみの原因となる色素沈着等）等の抑制に用いることができる。

Claims

マクルリン又はその配糖体、及びポリフェノールを有効成分として含有する、線維芽細胞増殖促進剤。
マクルリン又はその配糖体、及びポリフェノールがマンゴスチン果皮の水抽出物由来である、請求項１記載の線維芽細胞増殖促進剤。
マクルリン又はその配糖体、及びポリフェノール、並びにコラーゲンを有効成分として含有する線維芽細胞増殖促進剤。
マクルリン又はその配糖体、及びポリフェノールがマンゴスチン果皮の水抽出物由来である、請求項３記載の線維芽細胞増殖促進剤。