TWI544073B - 細胞分離裝置及使用方法 - Google Patents

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Description

細胞分離裝置及使用方法 參考相關報導
本申請案主張申請於2001年3月30日之美國臨時申請案序號第60/279,824號的申請日利益，且本申請案為申請於2002年3月29日序號10/112,461之申請案、申請於2002年4月29日序號10/134,939之申請案及申請於2005年12月22日序號11/314,281之申請案的部份連續申請案，其等整個內容被併入此處作為參考。
發明領域
本發明關於用於支持包括細胞治療及組織工程之各類治療程序的元件及方法。
 發明背景
細胞治療及組織工程的發展係為臨床應用於修補及回復受損或生病組織及器官。特別是，血管移植的發展係心臟及周邊血管手術領域的主要目標。心血管疾病是第一世界致死及罹病的主要原因。雖然標準照護、自體移植並非沒有嚴重的健康問題，然而全身性疾病的病人，除了沒有合適的自體移植材料或已經進行過自體移植外，單在美國每年就有100,000人不得不選擇自體移植。
研究者因此研究合成的移植物超過30年。提供移植物材料的最主要挑戰為生物相容性，即非血栓生成的、非免疫生成的、抗機械力的及具有可接受之傷口癒合及生理反 應(如血管收縮/舒張反應、溶解物質傳送能力等)。更且，組織移植材料應該可以易於操作、儲存與運送，及可以是市場上可購得的。
血管有兩個主要之衰竭模式：機械的及生物的，由血管內血栓及後續的堵塞及/或細胞向內生長引起者。具有能抵抗動脈壓力之材料性質的合成血管係普通的，而非血栓生成材料的尋找才是主要的研究目標。得自病人之內皮細胞顯示可降低植入血管之血栓生成(Williams等，1994，J .Vasc .Surg .， 19：594－604；Arts等，2001，Lab Invest 81：1461－1465)。
在建立合成移植物內非血栓生成之細胞底層中內皮細胞係極為重要的。因此，以儀器於通透性基質、架或其他通透性細胞基材材料之上或之中於數分鐘或數小時內達到快速的細胞黏著是期望的，該儀器係於操作室環境中操作，維持無菌屏障，易於使用且產生相容的移植結果。
現在，滿足這些需要有四個主要的探究路徑，但都不怎麼成功：(i)使用去細胞化的組織材料；(ii)使用自我組合的機構，其中細胞被培養於培養基中誘發細胞外基質(ECM)合成的組織培養塑膠上；(iii)使用合成之生物可分解聚合物，於其上細胞接續地接種及培養於模擬的生理環境中；及(iv)使用生物聚合物，諸如重構的第I型膠原蛋白膠，其藉著施加機械力與組織細胞一起形成及緊密組合以模擬生理環境(見例如Robert T.Tranquillo，2002，Ann .N .Y .A cad.Sci.，961：251－254)。
藉由篩析動作，即提供大量流動及使用具有小於細胞群聚之孔洞的基材或架材料因此捕捉細胞於基質中，牽涉暫時性高壓之壓力梯度已被用來置放細胞於通透性架上(如美國專利第5,628,781號；Williams等，1992，J Biomed Mat Res 26：103－117；Williams等，1992，J .Biomed Mat Res 28：203－212)。這些捕捉的細胞顯示會後續黏附至架材料，但由於無法滿足上述成功移植的要求(即生物相容性、機械強度及必要生理性質，所以其等只有有限的臨床應用性。
由1970年代後期開始，已經實行實驗性之內皮細胞接種以改善小直徑、聚合性血管移植物的效能來消弭不良反應。自從那時以來，朝向這個目標已經有些進展，這些進展大部份聚焦在建造生物或生物混成的移植物。
較內皮細胞不會僅於血管內腔表面上形成單一細胞底層內皮細胞的最初認定更為複雜。內皮細胞也會釋出調整凝結、血小板凝集、白血球黏著及血管張力的分子。缺少這些細胞，如，於植入合成聚合物之血管移植物之腔的事例中，宿主反應最終會失敗。由於急性血栓症於植入後第一個三十天內會喪失效能。這種早期階段的失敗係由於生物材料之血液接觸表面(其未內皮化)之固有血栓生成性所造成。迄今，完成的非血栓生成材料僅知只有內皮；與血流接觸的任一其他材料傾向於造成血小板沉積及後續的血栓症。小直徑聚合性血管移植物的長期失敗模式為導致失去效能的交錯增生。交錯增生開始的精確機制仍然不確 定；然而，內皮細胞及平滑肌細胞的喪失功能及不適當聯通似乎牽涉其中。
小直徑移植物發展領域中之早期工作者尋求移植物內皮化之促進及藉此於植入前經由移植各種程度之自體內皮細胞於血管移植物上而增加效能。此種方法稱作內皮細胞接種(部份之覆蓋依賴持續的細胞增殖)或細胞鋪植(全部覆蓋)。接種意指一種方法，其包括以充滿血小板之漿細胞(PRP)中的內皮細胞前凝結輔助表面。相較上，鋪植意指一種方法，其包括披覆內皮細胞於一前設立之PRP凝結上。鋪植之移植物表面典型上利用兩步驟程序製備。首先，PRP凝結在一移植物上，培植達一有效的時間及然後以培養基洗滌。其次，該PRP塗覆之移植物以內皮細胞披覆。相反的，接種的移植物表面典型上使用單一步驟披覆程序而製備，藉此直接懸浮於PRP中之內皮細胞被披覆於移植物表面上。依此，於鋪植的移植物中，內皮細胞被披覆於PRP凝結物的表面上，然而在接種的移植物中，內皮細胞卻被披覆於PRP凝結物的內部。Rupnick等，1989，J Vascular Surgery 9(6)：788－795。
以下的假說是相當簡單的；即是藉著促進在血管輔助物之血管接觸表面上建立病人自己的內皮細胞，一“正常的”內皮細胞底層及相關連的基底膜(兩者稱為新血管內膜)將形成於移植物上且與共同作用而加速移植物失敗的流變、生理及生物材料力作用相反。於此領域研究30年之後，包括著有希望的動物資料，這個簡單的假說尚未產生任何 一種臨床元件。
內皮接種移植物之失敗模式與未處理之聚合性移植(即血栓症及血管內膜增生)相同。失敗模式，至少部份地，於移植物內腔表面上缺少功能性內皮層(新血管內膜)及/或不正常內皮及平滑肌細胞之直接及非直接聯通有關。儘管顯示接種之移植物成功地發展成一細胞底層發展物，這些早期人體試驗仍然失敗。這些資料顯示在動物模式中形成於聚合性血管移植物內腔表面的新血管內膜係由周圍交錯動脈增殖之內皮細胞、移植物間隙之微血管或循環的原生內皮細胞形成，而非僅來自所接種的細胞。
用於內皮細胞接種之潛在來源為微血管內皮細胞(MVEC)。於新鮮單離及培養人類、狗、兔、鼠、牛及豬的內皮細胞(特定是MVEC)上，Williams等人居於領先地位，於實驗室中他們細胞研究細胞功能。人類MVEC之來源為美容抽脂術抽取的組織。依據細胞群聚的最終使用選擇單離人類脂肪MVEC的兩種分別的操作方法。此兩操作方法不同於單離的複雜性，從人類或動物移植物之即刻鋪植的簡單、操作室相容的程序至若該MVEC要後續培養的更複雜程序。
藉由抽指而得到人類脂肪樣本，人類MVEC之單離操作已被改良。通過一抽指套管之抽脂方法將皮下的脂肪分離為小片段，其可加速消化方法的速率。脂肪可以膠原蛋白酶(4 mg/cc)於37℃消化20分鐘，此使每克脂肪釋出>106 細胞。這些MVEC可以梯度離心從脂肪中分離。於丟棄上 清液後，MVEC形成小粒狀且可後續地再懸浮於培養基中。這些細胞經過固定的特性檢測以決定初次單離物的細胞性質。由於其等表現von Willebrand抗原、不表現間皮細胞之特定角蛋白、合成血管升壓素轉化酶、前列環素及前列腺素E2、合成基底膜膠原蛋白及形態上表現微細胞小泡，經由此步驟單離之大多數細胞為內皮細胞。
人類臨床試驗已經進行以評估於需要周邊繞道病人的內皮細胞移植。於試驗期間，大量的內皮細胞被直接放在ePTFE移植物之內腔表面上。為改善細胞之置放，所有移植物於含有自體血清培養基中被先濕潤。於相同培養基中以密度為2x105 細胞/每cm2 移植物內腔區域懸浮細胞。此溶液固定於橫壁或穿壁上，壓力梯度為5 psi以將細胞強制於表面上，此方法稱作加壓鋪植。經官方同意後，11個病人被登錄及接受實驗移植物。於手術準備期間，對病人進行抽指以移除大約50克的腹壁脂肪。脂肪使用前述程序處理且所得之細胞群聚被加壓鋪植於所要的移植物上且立即植入。經過四年以上的追蹤，這些移植物維持與顯靜脈移植物相似的明顯速率。
牽涉暫時性(<1分鐘)相當高壓(250 mmHg)之壓力梯度先前已用於藉篩析作用將細胞置放於通透性架上(即提供大量流動及使用具有小於細胞群聚之孔洞的基材或架材料因此捕捉細胞於基質中，牽涉暫時性高壓之壓力梯度已被用來置放細胞於通透性架上(如美國專利第5,628,781號；Williams等，1992，J Biomed Mat Res 26：103－117； Williams等，1992，J.Biomed Mat Res 28：203－212)。然而，因為血管沒有保持充分黏附的非血栓生成表面，儘管前述的進展臨床冠狀應用性現今仍是有限的，所以研究聚焦於活體外更多的成熟時間。
就建立非血栓生成細胞底層而言，內皮細胞是極為重要的。此外，用於在操作室設備中於一合成移植物上產生內皮細胞底層的有效及可信方法現今依然是眾所期待的，本發明即是提供此種解答。以儀器於通透性基質、架或其他通透性細胞基材材料之上或之中於數分鐘或數小時內達到快速的細胞黏著是期望的，該儀器係於操作室環境中。本發明使得從脂肪組織單離大量內皮細胞及快速細胞鋪植合成移植物變得可能，且使得於一鑰匙開啟、操作室備置好之快速鋪植移植物的儀器中的細胞黏著與自動化變得可能。除了用於植入之移植物的底層鋪植之外，本發明也具有其他應用。
 發明概要
本發明提供用於支持各類細胞治療及組織工程方法的元件。特定地，本發明提供能從組織樣本潤濕及分離細胞以用於細胞治療及/或組織工程的細胞分離裝置。於本發明一特別實施例中，細胞分離裝置可與鋪植裝置組合使用以支持血管移植物及內血管元件的自體內皮化。
於一實施例中，該細胞分離裝置包括：一培養基儲存器；一細胞處理元件，其包括至少一入口及至少一出口、 一第一圓突件及一第二圓突件；至少一幫浦；及至少一閥，其適於轉向或防止流體流；其等均係彼此為流體聯通。於一較佳實施例中，該細胞處理元件包括一離心機。於另一實施例中，該細胞處理元件係可丟棄的。於另一實施例中，該細胞處理元件更包括一萃取管及/或一迴轉耦合件。於一特別實施例中，該迴轉耦合件更包括一加壓噴霧噴嘴。
於另一實施例中，本發明之細胞分離系統設計成模組化，如此組件可以於發明人所發展之其他系統中再使用。於一實施例中，該細胞分離元件適於與細胞鋪植元件及/或細胞收穫元件一起使用。於一實施例中，該裝置係完全自動的且可包括，例如人類機械介面、電子圖形顯示器、感測器、警鈴、細胞計數元件及條碼讀取元件。於另一實施例中，該裝置可包括加熱件、廢棄物儲存器或組織分解化學品儲存器。於一特定實施例中，該細胞分離裝置為手持元件。
於另一實施例中，該裝置可包括一個以上過濾件，例如，介於該細胞處理元件入口及該組織分解化學品儲存器之間；或介於該細胞處理元件出口及無菌細胞收集元件之間。於一實施例中，該過濾件排除大於約100微米之顆粒，及於其他一實施例中，該過濾件排除大於30微米之顆粒。於一特定實施例中，該無菌細胞收集元件為注射器。
用於本發明之培養基可為M199、M199E、PBS、食鹽水及不含二陽離子之DPBS。於一較佳實施例中，該培養基為M199E。於另一實施例中，該組織分解化學品為膠原蛋 白酶。
本發明也提供用於細胞治療之套組，其包括適於與細胞鋪植裝置一起使用之本發明的細胞分離裝置，其中該細胞分離裝置及細胞鋪植裝置係包含在一耐用包裝件中。於一實施例中，該套組包括一流動路徑筒，其包括一個以上之流體儲存器、至少一入口及至少一出口；一細胞處理筒，其具有至少一入口及至少一出口；一任選的移植物室筒，其用於固持移植物基材，該移植物室筒具有至少一入口及至少一出口；至少一幫浦，其構形為引起通過流動路徑之流動；至少一閥，其構形為引導流動從該細胞分離器筒至該移植物室筒；其中該流動路徑筒，細胞分離器筒及移植物室筒彼此聯通以形成一連續的流動路徑，且其中該流動路徑筒，細胞分離器筒及任選的移植物室筒與能提供電力給該裝置模組化的套組包裝聯通。
於一實施例中，該流動路徑筒、細胞處理筒及移植物室筒為可丟棄的。於另一實施例中，該細胞處理筒包括一離心機。本發明之裝置也適於與一細胞浸軟器一起使用，該細胞浸軟器係與該流動路徑筒聯通。
於本發明另一實施例中，該套組包裝包括至少一感測器構件用以偵測該流動路徑筒、該細胞處理筒及該移植物室之出現，及/或至少一感測器構件用以監測及控制溫度、壓力及流動速率，其中該感測器構件係與一警鈴聯通。
本發明也提供使用本發明之裝置製備組織移植物的方法，其中將含有附著細胞之培養基引入該移植物室，及於 該培養基穿壁流動橫過該基材時，施加一持續低壓達一段足以使該細胞黏附至該基材的時間。於一特別實施例中，該附著細胞係從脂肪組織衍生之微血管內皮細胞。於另一實施例中，該內皮細胞係收穫自以本發明之裝置治療的病人。
另外，本發明也提供用於再生受治療者之組織或器官的方法，其係藉由將本發明之裝置製備的細胞懸浮液注射入該組織或器官中。本發明也提供用於治療傷口及預防黏著形成於需要受治療者之組織或器官中的方法，其係藉由將本發明之裝置製備的至少一細胞懸浮液注射入該組織或器官中。
本發明也提供一種自動的、無菌的及安全的方法及元件以於短時間之內在臨床使用之合適移植物上形成細胞，以及收集適合治療用途之細胞樣本的方法及元件。本發明更提供使用此處所述之元件所製備之該組織移植物及細胞樣本的方法其係用於眾多治療中包括再血管化、組織及器官的再生與重建以及疾病的治療及預防。
圖式簡單說明
第1圖簡要圖示細胞分離裝置之一實施例的系統流動路徑。
第2(A)圖顯示依據本發明一實施例之細胞分離裝置之處理元件的截面圖，其包括噴霧噴嘴構件及內、外離心機皿；(B)提供依據本發明一實施例之細胞處理裝置的立體圖；及(C)－(F)顯示該扭轉鎖機構，其將該處理元件連結至 依據本發明一實施例之細胞分離裝置。
第3(A)圖提供依據本發明之細胞分離裝置之一實施例的立體圖，其包括人類－機械介面、細胞處理元件(離心機)、管盒、培養基袋、注射器幫浦、夾管閥、收集注射器及條碼掃描器；(B)提供依據本發明另一實施例之細胞分離裝置的立體圖；及(C)提供依據本發明一實施例之細胞分離裝置的背面圖。
第4圖簡要圖示依據本發明一實施例之臨床(OR)套組的輸入。
第5圖簡要顯示依據本發明一實施例之臨床(OR)套組的流動路徑。
第6圖顯示依據本發明一實施例之移植物鋪植模組。
第7圖顯示依據本發明一實施例之細胞收集模組。
第8圖為連接至細胞分離模組之細胞收集模組耐用件的立體圖，該細胞分離模組具有可丟棄組件，其被裝載以依據本發明一實施例而被使用。
第9(A)圖顯示依據本發明一實施例之噴射噴霧噴嘴及迴轉耦合件；及(B)顯示噴霧噴嘴構件與依據本發明一實施例之離心機皿的一圓突件對齊。
第10(A)圖提供依據本發明一實施例之夾管閥多部份架的立體圖；(B)提供依據本發明一實施例之夾管閥多部份架之管架的立體圖；(C)提供依據本發明一實施例之夾管閥多部份架之管架的截面圖；及(D)提供依據本發明一實施例之夾管閥多部份架的側視圖。
 較佳實施例之詳細說明
本發明之實施例於此描述，內文中敘述用於支持各類細胞治療及組織工程方法之元件。熟習此藝者將明瞭以下本發明之詳細描述僅是為了闡明而絕不是意謂限制。本發明之其他實施例將暗示熟習此藝者並使其等由本發明之揭露內容中獲益。本發明之參考如附隨圖式所闡明的將詳細地足以實施本發明。相同的參考符號將於整個圖式與以下之詳細描述中使用而且指稱相同或相似的部件。
為清楚之故，並非所有之實施的慣常特性均被顯示與描述。當然，可以明白於發展任何事實上之實施時，必須要做諸多實施上的特別決定以達成發展者的特別目標，諸如對應用上相關的限制妥協，且這些特別目標依每個實施狀況及每個發展者而不同。更且，可以明白的這種發展的努力可能是複雜且耗時的，但對於從本揭露內容中獲益之本發明所屬技術領域中具有通常知識者而言卻是固定進行的工程操作。
依據本揭露內容，此處所述之組件及方法步驟可使用各類型式之操作系統、計算平台、電腦程式及/或通常機械而實施。此外，實習此藝者將認知非用於一般目的之元件，諸如固線式元件、現場可程式化閘陣列(FPGAs)，特定應用之積體電路(ASICs)等等，也可被使用而不背離此處揭露之本發明概念的範圍與精神。
本發明提供用於支持各類細胞治療及組織工程方法的 元件。細胞治療、細胞的治療或以細胞為主的治療意指使用人類或動物細胞來取代或修補生病或受損的組織及/或細胞，或來治療或預防疾病或異常。
特定地，本發明提供一種細胞分離裝置，其能從用於細胞治療及/或組織工程之組織樣本中消化、潤濕及分離細胞。此處所用之“細胞潤濕”意指使用額外的流體再懸浮已經從脂肪/膠原蛋白酶混合物中單離之細胞的方法。該再懸浮的細胞可經由離心再歷經第二單離方法以純化該細胞產物(MVECs)。此潤濕方法降低該消化副產物諸如紅血球細胞、膠原蛋白酶及蛋白質之濃度。
於本發明一特別實施例中，該細胞分離裝置可與鋪植裝置組合使用以支持血管移植物的自體內皮化。
細胞分離裝置
於本發明一實施例中，細胞分離模組或細胞分離裝置為包含所有必要電子元件與組件以切割、加熱、消化與分離脂肪組織之設備的單機作業物件。於一較佳實施例中，細胞分離組件包括一離心機。細胞分離模組的一出口供應單離細胞之單一細胞懸浮液，以連接至移植物鋪植模組、細胞收集模組或其他模組之一者。第3圖顯示細胞分離模組耐用件及包括人－機械介面，細胞處理元件(離心機)、管盒、培養基袋、注射器幫浦夾管閥、收集注射器與條碼掃描器的可丟棄組件。
於一實施例中，細胞分離模組耐用件單元容置操作元件所必要的所有電子元件，包括電腦板、軟體、電源供應 器與使用者介面。於一較佳實施例中，使用者介面包括具有引導使用者建立架構與元件操作之按鈕的LCD螢幕。細胞分離模組耐用件可以也容置必要之夾管閥、馬達、感測器與切割、加熱、消化與離心受治療者組織所必要之其他耐用件。於一實施例中，受治療者之組織為脂肪組織。夾管閥從頂部平表面上之箱罩中伸出以容許閥去囓合可丟棄的流體路徑。於一實施例中，電子元件係位於與任一流體路徑距離最遠的地方。
於另一實施例中，元件包括一可安裝的鈎以懸掛培養基與廢棄物袋。較佳地，袋鈎被安裝至移植物鋪植耐用件或是細胞收集耐用件以使培養基袋與安置於細胞分離耐用件中之電子元件間的距離達到最大。此種分離降低了由流體溢出所造成之電子元件損害的風險。
於本發明一特別實施例中，細胞分離模組流動路徑之所有元件係可丟棄的。於一實施例中，這些可丟棄的組件可在裝載至細胞分離模組耐用件上之一硬盤上組裝。藉由將夾管閥對準可丟棄盤中之閥切開部份而將盤置於耐用件之平表面上，使用者可裝載可丟棄盤。使用者然後將盤向前滑動以囓合夾管閥中之管環且鎖住可丟棄盤於定位。所有可丟棄的組件位在盤中以對齊且囓合細胞分離耐用件中之必要耐用件組件藉此操作裝載。藉著不需許多管連接件與個別裝載許多可丟棄組件，盤之設計將使用者設置及丟棄的負擔減至最低。於盤裝載後，使用者可將可丟棄的離心機皿裝載入耐用件組件中備置的凹處且將入口與出口管 從可丟棄盤裝附至離心機、培養基袋、廢棄物袋及鋪植或收集單元。
細胞處理裝置之流體路徑(流動路徑)，包括細胞處理裝置之離心機皿與流體路徑之間的作用，簡要顯示於第1圖。細胞處理裝置離心機皿與流體路徑顯示於第2A圖。
流體管基質、流體(如PBS及/或血清)袋、廢棄物袋與S2之注射器被裝載入細胞分離單元。這些物件加上離心機皿及迴轉耦合包括此元件的消耗品。於一實施例中，第1圖之閥係夾管閥，其藉夾住管基質中之管阻止流動。第10(A)－(D)圖描述依據本發明一實施例之夾管閥多部份架。較佳地，該閥係耐用件儀器之一部而不會直接接觸流體。於一實施例中，該元件設計成固持及處理大約60 ml的脂肪組織與60 ml的膠原蛋白酶溶液。
細胞處理裝置之離心機皿係一圓突、兩室且由一內皿及一外皿組成之建構物，如第2A及9B圖所示者。外皿主要用作溢流室來儲存細胞分離過程中用過的脂肪。本發明離心機皿的新穎設計提供了最佳化之雙重功能。例如，皿之內室構形成提供混合區，其用於此處揭示之細胞處理方法的消化步驟中，以及分離區(即內皿之圓突件)其使充分純化之細胞小粒的捕捉最佳化。
本發明內皿之圓突件特別構形成使內皮細胞之收集最佳化及最小化非內皮細胞物材料(如紅血球細胞與其他細胞碎片)的收集，見第2A及9B圖。於本發明另外一實施例中，如第2(B)－(F)圖所示，離心機皿包括一扭轉鎖耦合構 件，其可被用來快速地與有效地使離心機皿與細胞分離元件耦合及去耦合。
參見第1圖為非限制性實例1，脂肪組織(脂肪)手動地從注射器手動推入離心機皿中。皿然後手動裝載入細胞處理元件中再裝在驅動機構上，其使用扭轉鎖耦合以鎖住它。離心機室蓋然後關上，熱空氣循環在室內使其溫暖至37℃。
充滿冷藏之(大約2℃)膠原蛋白酶溶液的60 ml注射器被裝載入注射器驅動器S1。加熱元件加入注射器驅動器中加溫溶液至大約37℃約15分鐘。在膠原蛋白酶溶液被加熱至大約37℃後，注射器驅動器S1被啟動且膠原蛋白酶溶液被推出經由閥V7進入離心機皿中，同時閥V8維持關閉以阻止流動通過100 μm過濾件(F)。離心機皿驅動機構(馬達)搖動該皿達一段時間使使膠原蛋白酶足以“消化”脂肪組織。於一較佳實施例中，足以使膠原蛋白酶消化脂肪組織的時間為大約30分鐘。
纖維性組織然後從經消化的材料中分離。注射器幫浦S1經閥V8抽回50 ml的流體。纖維性組織由這兩個閥之間的過濾件(F)收集。於一實施例中，過濾件排除尺寸大於100 μm的物質。注射器S1推動流體之第一半部暫時性地至廢棄物桶(用於本步驟其係未受污染的)。使用第二拉取以完成離心機皿與過濾件中所有材料的清空。然後閥對準以經閥V7將過濾件材料推回進皿。於一實施例中，流體之第二半部從注射器幫浦直接進入S1注射器且第一半部從廢棄物袋抽吸回S1注射器，然後推回進入離心機皿中。
離心機皿然後旋轉於大約3100 RPM達大約5分鐘。在離心期間，內皮細胞從消化材料中分離且置於離心機皿之兩圓突件中。細胞將易於“擠”進圓突件且留在其中直到經分離構件推出。
當離心機皿持續旋轉於大約3100 RPM時，額外的M199E流體從S2經由閥V2被推入皿中。此流體與旋轉運動結合使密度較低的脂肪細胞移至皿的中心。至少一槽孔位於靠近離心機皿之頂中心處，藉此槽孔脂肪經由內皿的離心動作從內皿導進外室。如此從內皿有效地移除許多廢棄的脂肪組織。見第2A圖。
離心機皿停止轉動且膠原蛋白酶/M199E混合物沉至內皿底部。然後使用注射器幫浦S1將此廢棄流體經閥V7與V9送到廢棄物處。
新鮮培養基M199E經閥V2加入皿中。實施輕離心以“潤濕”該皿。然後使用注射器幫浦S1將此流體經閥V8與V9送入廢棄物處。
當皿清空及潤濕後，仍位於離心機圓突件中細胞小粒經迴轉(或旋轉的)耦合被推回進入內皿中且流體通過管而移動。依據本發明一實施例之迴轉耦合顯示於第2A圖。於一特別實施例中，迴轉耦合包括至少一傳送管用於從離心機皿之內室添加及/或移除液體。於一實施例中，迴轉耦合包括一傳送管用於添加液體進入離心機皿之內室，及另一傳送管用於從離心機皿之內室移除液體。
依據本發明一特別實施例，使用從噴嘴構件引入之流 體加壓噴射(噴射噴霧)將位於離心機圓突件中之細胞小粒從圓突件中沖洗出來。於一特別實施例中，噴嘴構件與特別適用於噴嘴之迴轉耦合相聯通。第9A圖圖示依據本發明一特別實施例之噴射噴霧噴嘴與迴轉耦合。第9B圖更圖示迴轉耦合與噴射噴霧噴嘴在離心機皿中對齊。
於一非限制性實例中，噴射噴霧噴嘴射出流體撞擊“擠在”或位於離心機圓突件內之細胞小粒。細胞小粒裂掉及/或從圓突件的位置離開，且流體與細胞小粒物質經重力被帶回離心機皿的底部。於一實施例中，噴射噴霧噴嘴細胞處理裝置中之支撐結構對準以固定於其位置(見如第9B圖)。於一較佳實施例中，離心機馬達由電腦控制且適於指出離心機皿的位置。所以，馬達能迴轉離心機皿使噴射噴霧噴嘴與離心機皿之每個圓突件對齊。例如，於一圓突件沖洗之後，離心機皿旋轉180度且噴射噴嘴被啟動以沖洗第二圓突件。依此，噴射噴霧噴嘴能有效地使離心機皿每個圓突件中的細胞小粒離開原位。
此目的所用之流體可以為具有生理pH及生理濃度之氯化鈉的流體。於一較佳實施例中，此目的所用之流體分別係6：1比例的M199E與血清。血清係用作去活化細胞產物中之任一殘餘的膠原蛋白酶。大致上1 ml細胞材料與10 ml的M199E/血清混合物現於內皿之底部中。
於本發明一實施例中，離心機圓突件係適於包括一個以上之選擇性過濾元件，其等能利用離心力以濃縮或選擇出特別之細胞族群。於一實施例中，可以使選擇性過濾元 件與噴射噴霧噴嘴達到較佳對準以得到所要的濃縮物或細胞族群。於另一實施例中，細胞分離裝置於收集模組的上游適於包括一個以上之選擇性過濾件，該過濾件能選擇並捕捉所要的細胞、變更任一過量之培養基的路徑並允許將所要的細胞控制於所要的濃度(細胞/ml)。於另一實施例中，本發明細胞分離裝置可包括一細胞計數及/或細胞分類元件，其包括但不限於，使用已知光學密度或孔口電模擬技術的元件。
為本發明之細胞分離裝置所處理之細胞可包括例如纖維母細胞、平滑肌細胞、外皮細胞、巨噬細胞、單核細胞、漿細胞、肥大細胞、脂肪細胞、組織特定之實質細胞、內皮細胞、泌尿上皮細胞、脂肪衍生幹細胞及組織工程應用及細胞治療遇到之各種其他的細胞形式，包括各種組織來源而來之未分化的成人幹細胞。Mitchell,JB等，人類脂肪衍生細胞之免疫表現型：基質相關及幹細胞相關之標記的暫時性改變，Stem Cells 2006，24：376－385；McIntosh K.等，人類脂肪衍生細胞的免疫形成：活體外之暫時性改變，Stem Cells 2006，24：1246－1253；Kern S.等，骨髓、臍帶血或脂肪組織而來之間質幹細胞的比較分析，Stem Cells 2006，1294－1201。於一較佳實施例中，細胞係內皮細胞，更佳地，得自自體微血管豐富之脂肪組織的人類微血管內皮細胞，如美國專利第4,820,626號(Williams等，1989年4月11日發行)、第5,230,693號(Williams等，1993年7月27日發行)與第5,628,781號(Williams等，1997年5月13日發行)所 述者，上述所有者其全部內容將併入此處供作參考。附著細胞可為自體的、同種的或異種的，但較佳地係原始上自體的。
移植物鋪植模組
本發明細胞分離裝置設計成標準組件化，如此組件可與其他元件與系統一起使用與再使用。於一實施例中，細胞分離裝置適於與細胞鋪植元件或移植物鋪植模組一起使用。移植物鋪植模組意指利用加壓鋪植技術將細胞分離單元供應的細胞施加於多孔移植物架上所必須的耐用件及可丟棄組件。移植物鋪植模組耐用件與可丟棄組件顯示於第6圖。
於本發明一實施例中，鋪植模組含有兩個耐用組件：鋪植單元耐用件與移植物室耐用件。這些耐用件組件與細胞分離耐用件物理上合致以提供電力與聯通上的連結。於本發明另一實施例中，鋪植模組耐用件由細胞分離模組耐用件中的電子元件控制。移植物室耐用件提供可丟棄移植物的確實安裝與容置加熱該室所必要的組件。鋪植耐用件含有硬體(如夾管閥、感測器)，該等硬體係操作加壓鋪植應用所必須之流動通過移植物室所特別需要的。於一實施例中，鋪植耐用件具有一帶著突出耐用件設備之頂部平表面，鋪植可丟棄物可以被堆積在該表面上。第6圖顯示移植物鋪植耐用件與可丟棄組件內的主要組件。
於另一實施例中，鋪植的可丟棄組件包括可丟棄的移植物室與鋪植的可丟棄盤。架或其他基材材料典型上係預 先堆置於可丟棄的移植物室，移植物室提供了將液體送到移植物的密閉環境，同時阻止所有其他的氣態、液態與固態物質與週遭物質的交換。於一實施例中，移植物室上的三個埠口與從鋪植的可丟棄盤而來的管連接以提供來自移植物室之入口、穿壁出口及內腔出口。於一實施例中，移植物室位於室耐用件之內，該室耐用件具有一關閉門以在鋪植操作期間關閉該室。
於一實施例中，鋪植的可丟棄的硬盤包括所有可丟棄組件與鋪植操作所需的連接材料。藉著對準夾管閥與可丟棄盤中之閥切開部份，盤裝載於鋪植耐用件的平表面上且向前滑行以囓合夾管閥中的管。使用者連接細胞分離可丟棄件、鋪植可丟棄件與移植物室可丟棄件以形成鋪植所用之完整的流動路徑。
分離及鋪植培養基可為商業上可獲得之培養基，包括DMEM、F12、AlphaMEM、威斯康辛大學溶液等或其等之任一組合，該組合具有或不具有額外因子，此等因子包括肝素或容納想要細胞型式的其他因子。
收集模組
於本發明一實施例中，細胞分離裝置也被設計成與收集模組或收集元件一起作用的功能。收集模組或收集元件係指從用於細胞治療之注射器中的細胞分離單元收集細胞所必要的耐用件及可丟棄組件。細胞收集模組耐用件及可丟棄組件顯示於第7圖。第8圖顯示連接至細胞分離模組的細胞收集模組耐用件，該細胞分離模組具有可丟棄組件裝 載於其上可供利用。於一實施例中，收集模組耐用件與細胞分離單元物理上合致以提供電力與聯通連結。收集耐用件容置一線性致動器，其與注射器介面連結以自動收集產生於細胞分離單元中的細胞產物。
於另一實施例中，收集單元中之可丟棄組件為注射器以收集細胞產物。注射器為收集單元耐用件上的一夾子所固定在定位。注射器的頂部被裝進耐用件中使得注射器活塞可藉致動器之移動而被抽出。使用者將出口管從細胞分離模組連接至注射器的尖端。
懸浮的細胞產物經V8移除至注射器S0中，然後細胞產物被送至附接至V5的一無菌容器(未顯示)。於本發明一實施例中，無菌容器係一注射器。於一額外實施例中，典型上於閥V5與容器之間使用第二過濾件以移除大於約30微米的殘餘顆粒。
臨床(OR)套組系統之瀏覽
本發明之臨床套組或操作室(OR)套組提供一無菌流動路徑，通過該路徑脂肪組織可被消化、分離與加壓鋪植於多孔血管移植物架上。該系統也能預加工移植物架以製備加壓鋪植操作的移植物架。於一實施例中，流動路徑包括三個可丟棄筒，其等與耐用件臨床(OR)套組系統包裝互鎖。可丟棄筒包括一具有流體儲存器之流動路徑筒，一包括本發明之細胞分離裝置之可丟棄離心機筒及一預裝載著移植物架的可丟棄移植物室。臨床(OR)套組系統為只需電力操作之自足的、單機作業的系統。
本發明之系統設計成與操作者需要最少的互動。具有預裝載移植物架之無菌移植物室、流動路徑筒與離心機筒可裝載進臨床(OR)套組。流動路徑筒可被預裝載上培養基，該培養基可為如M199、M199E、PBS、食鹽水及不含二陽離子之DPBS。於一較佳實施例中，該培養基為M199E。
操作者可以將來自醫院藥局之重構膠原蛋白酶、分離自病人血液的血清及來自病人的脂肪組織通過合適的注射埠口注入離心機與流動路徑筒。完成此系統的設置之後，操作者可使用臨床(OR)套組上LCD介面開始鋪植操作。不需與操作者額外互動，臨床(OR)套組將自動執行所有必要的操作以製備M199E/血清溶液、預處理移植物、使用外部製備的膠原蛋白酶/PBS溶液消化脂肪組織、離心單離目標細胞、加壓鋪植目標細胞進入多孔移植物架、從移植物腔清除過剩細胞、於鋪植移植物上方再循環M199E/血清溶液以及單離至移植物的流動以收穫。第7圖圖示用於移植物處理操作之臨床(OR)套組耐用件包裝的輸入處。
預想之臨床(OR)套組系統的組件包括但不限於：一臨床(OR)套組包裝、一前面板顯示器(FPD)、一臨床(OR)套組流動路徑筒、一具預裝載架之移植物室、一主控制器板(MCB)、一類比板、一離心機、至少一幫浦、一流體分配系統、各類感測器與警鈴以及一細胞計數器。
臨床(OR)套組包裝指稱用於臨床(OR)套組的機械平台，其對臨床(OR)套組供應電力且給予其機械穩定性。該包裝容許電力之纜線連接的進入。於一特別實施例中，此 包裝也安置用於儀器之所有耐用件組件，包括馬達、夾管閥、前面板顯示器與感測器。
前面板顯示器(FPD)提供對使用者友善的圖形LCD顯示器。FPD顯示器上之螢幕容許操作者執行於OR中或於鄰近OR處完成加壓鋪植操作所必須的所有功能。操作者將具有開始移植物處理操作及隨時觀看移植物製備階段的能力，但限制使用者更動參數，因為如此可能會影響鋪植移植物的品質。
流動路徑筒指稱通過其流體流通過流出系統之可丟棄的、自足的單位。第4圖提供通過流動路徑筒之路徑的一概念化圖示。流動路徑筒包括一流動迴路、幫浦可丟棄件以及用於補給與廢液的流體儲存器。流動路徑筒與細胞處理或離心機筒及移植物室合致，移植物室安置用於操作室中加壓鋪植的移植物。流動路徑筒與該包裝物理上合致。於另一實施例中，可丟棄細胞處理筒可以作為流動路徑筒的一部份。於另一實施例中，幫浦可丟棄件與流動路徑筒係分離的。
移植物室容置用於移植物處理操作之移植物架。該架預裝載於移植物室中，該移植物室提供用於液體投送至移植物的一密閉環境，同時防止所有其他氣態、液態及固態物質與周圍環境之交換。本發明使用之移植物基材(“架”)材料可為各類尺寸及幾何圖樣之較佳可通透的材料。此材料可以是天然的或合成的，包括但不限於聚乙烯對苯二甲酸酯、聚胺甲酸酯或膨脹的聚四氟乙烯(ePTFE)。於另一實 施例中，移植物架可為生物聚分子(諸如膠原蛋白)。該材料可為前凝集的及/或彈性蛋白，或同種移植血管(諸如冷凍保存靜脈、去細胞化靜脈或動脈)。於另一實施例中，該架可為組合材料，諸如一具有聚合物塗層之彈性蛋白架(例如電離心於表面上以增進機械性質)。該材料可以是前凝集的或以蛋白質(如白蛋白)或血漿預處理的，血漿於某一實施例中可更加強組織細胞在基材材料上之貼附、擴展與生長。移植物基材或架可藉任一適合之方法所建構，包括但不限於那些描述於下列文獻之方法：Liu,T.V.等，2004，Adv.Drug.Deliv.Rev.56(11)：1635－47；Nygren,P.A.等，2004，J.Immunol.Methods 290(1－2)：3－28；Hutmacher,D.W.等，2004，Trends Biotechnol.22(7)：354－62；Webb,A.R.等，2004，Expert Opin.Biol.Ther.4(6)：801－12；以及Yang,C.等，2004，BioDrugs 18(2)：103－19。
臨床(OR)套組中之主控制器板(MCB)包括具有合適介面至類比板的一微處理器核心模組，該類比板控制臨床(OR)套組總成中之周邊感測器。軟體位於主控制器板處理器上，其提供直接的使用者介面以確保臨床(OR)套組之可信賴與可確定的操作。類比板位於MCB周邊且用作驅動致動器及接收與處理感測器資訊。
於加壓鋪植進入移植物之前離心機分離細胞。於一實施例中，潮濕的離心機皿為分離的可丟棄離心機筒，且耐用組件係安置於臨床(OR)套組包裝中。
一個以上之幫浦驅動流動通過設計成將壓力跳動保持 在最小之系統。潮濕幫浦組件為流動路徑筒之部分，且幫浦軸被非侵入性構件驅動。於本發明一實施例中，幫浦於細胞分離元件操作期間自動地自我啟動。
臨床(OR)套組系統設計成自動前行通過預處理移植物、製備鋪植進入移植物之脂肪組織、施加細胞至移植物以及在移植物上方再循環M199E/血清溶液以維持活性直到收穫等所必要之流動路徑。於一實施例中，組織製備包括以膠原蛋白酶處理，該膠原蛋白酶係由來自使用PBS溶液接著離心重構臨床(OR)套組外部之粉末形式而成。細胞然後自動地再懸浮於M199E/血清溶液中，於被施加至移植物前，該溶液儲存於臨床(OR)套組內之流體儲存器中。流體閥構形為在流動路徑筒與離心機筒內創造這些必要的路徑且為臨床(OR)套組軟體控制。於加壓鋪植操作期間，保持一定壓橫過該移植物架。
於一特定實施例中，臨床(OR)套組包括監測及控制溫度、壓力以及流動速率所必要之感測器。不同流動路徑筒與移植物室被裝載入臨床(OR)套組以符合特定型式之移植物的鋪植完成(如CABG，周邊)。感測器能偵測流動路徑筒、離心機筒及移植物室之出現以確保可丟棄件的適當裝載。此外，感測器能偵測流動路徑筒與裝載之移植物室的型式以確保使用正確的可丟棄件。
加壓鋪植操作中每個cm2 的架需要200,000個細胞被施用至移植物架上。
臨床(OR)套組能接受以PBS溶液重構之膠原蛋白酶 的輸入。於一實施例中，該套組容納至少大約60 ml之製備的膠原蛋白酶溶液。套組接受脂肪組織之輸入。於一實施例中，脂肪入口容納大約30－60 ml的脂肪組織。於另一實施例中，脂肪入口被定位以允許組織被引入預熱至37℃的環境中。
於另一實施例中，臨床(OR)套組系統能使用可消耗的切割器切割脂肪組織，依據組織來源切割器係任選使用的。於一特定實施例中，可消耗的切割器與連接至Tulip注射器係係相容的。系統此外能加熱移植物室、於消化前脂肪組織被裝載的空間以及消化至37℃的空間，且量測與期待輸入之脂肪組織相等體積之膠原蛋白酶溶液。
系統能混合脂肪組織與膠原蛋白酶細胞漿狀物。於一較佳實施例中，系統於單一離心機可丟棄件(即細胞處理元件)中進行混合與分離操作，該離心機可丟棄件流動路徑筒及移植物室合致。系統也能從已消化的混合物中移除纖維性材料。於一實施例中，再懸浮細胞中最大容許的顆粒大小不超過約100 mm。
於一實施例中，臨床(OR)套組系統能從膠原蛋白酶消化的脂肪組織中單離一定體積的“目標細胞”，且從分離液中收集該單離的目標體積。於一較佳實施例中，系統提供以下之目標小粒體積純度：就紅血球細胞，少於總單離小粒體積的5%體積；就脂肪細胞，少於總單離小粒體積的1%體積；就死細胞，少於總單離小粒體積的4%體積。於另一較佳實施例中，再懸浮液中之所有顆粒之直徑少於或等於 100 mm。於更另一較佳實施例中，分離方法不會使細胞暴露於大於900G的力量下。
於一實施例中，目標細胞再懸浮於6：1體積的M199E與血清混合物中。於另一實施例中，系統提供構件以控制施用於移植物架之細胞的數目，其目標數目為約200,000細胞/cm2 移植物。此目標數目＋50%至－10%的變化係可接受。作為實例，臨床(OR)套組系統使用體積6：1的M199E/血清溶液，其與裝載入系統之脂肪組織所期望之體積成比例。
於一實施例中，系統包括一預裝載有用於鋪植之移植物架的可丟棄移植物室。移植物室能容納長度大約1－90 cm的移植物架；移植物內直徑大小大約1－12 mm；移植物壁厚度大約100－700 um。移植物室提供用於鋪植之密閉環境，除非通過移植物室埠口否則其阻止氣態、液態及固態物質與周遭環境交換。
所有系統之個別的可丟棄組件係適於互相合致以形成連續的流動路徑。更且，本發明系統之所有可丟棄的潮濕材料與塗附物係生物相容的，且設計成抵抗γ輻射達25－40 kGy且具有滅菌後至少5%的透明穿透性。此外，系統中所有非可丟棄的材料與塗附物，除內部電氣組件外，係與典型的消毒溶液包括如Cidex(戊二醛殺菌溶液)、70%乙醇、100%異丙醇與10%漂白溶液相容。
於一實施例中，臨床(OR)套組系統包括一電子元件模組，其具有能驅動、調整、獲取及處理用於壓力、溫度及流動速率之感測器的控制電子元件。移植物室之壓力被測 定。於一實施例中，橫過架壁之壓力被控制在一大約1.5 psi而不超過2.0 psi的目標值。於另一實施例中，消化空間及移植物室中的溫度被測定且維持在大約37℃。於另一實施例中，實施流動速率測定及/或控制因為這對維持橫過移植物壁所要之壓力是必要的。
於本發明一實施例中，軟體儲於中央處理器中，其控制電氣組件及包含於元件包裝中之聯通路徑。調整本發明之系統使得當所有的可丟棄組件沒有正確連接且互鎖於包裝中時，軟體會防止任一設備的操作。
臨床(OR)套組之操作
臨床(OR)套組系統自動地前通過流動路徑，該流動路徑係預處理移植物架、製備鋪植入移植物之脂肪組織、施加細胞至移植物、清除移植物腔與再循環M199E/血清溶液於移植物上以維持活性直到收穫所必要。第4圖顯示臨床(OR)套組中組件間之概念化的流動路徑。
此處描述之系統者典型上包括一微處理器與附屬軟體以控制系統及基於使用者輸入自動化一或多個步驟。軟體可允許例如藉著控制幫浦及閥控制流動通過管狀管道、控制溫度及控制細胞分離機及浸軟機元件的全部或部份自動化。較佳地，系統為全部自動的，但能基於一個以上輸入參數再構型。系統可更包括各類感測器以偵測或測定系統參數，諸如指示阻塞的壓力及送至微處理器或使用者之訊號。於一實施例中，該系統為手持系統。
橫過通透性架材料之控制的、持續不同的壓力梯度可 由任一適合之構件所產生，該構件包括但不限於，齒輪幫浦、蠕動幫浦、橫隔膜幫浦、離心幫浦及由一柱流體所產生之被動壓力頭，只要該壓力足以持續及位在足以達到本發明之優點的程度。於一特定實施例中，使用含有內皮細胞培養基將壓力穿壁地施加至血管移植物架，該壓力於壓力頭大約50 mmHg及持續大約5分鐘的時間。
因為本發明至少一部份之流動為典型上穿壁的，所以流動速率係依賴移植物材料的通透度，且當細胞施用於內腔表面減少流動速率。穿壁的流動速率於細胞引入之前依據移植物材料可為5－50 ml/分鐘而於細胞引入之後通常降到1－10 ml/分鐘。較佳之內皮細胞數目包括內腔表面區域120,000－2,000,000細胞/cm2 ，更佳地大約250,000細胞/cm2 。
於本發明另一實施例中，元件系統為模組化的，使得元件之組織消化與分離部份可與可互換模組一起使用以施加細胞至血管移植物或是收集注射器中之細胞。第3A圖顯示組合於模組化系統中之元件。因為元件之細胞分離部份係容置於一單獨、分離的單元中，所以此實施例中也提供了細胞分離單元與其他系統配對之彈性。較佳地，元件被分成三個個別的模組：細胞分離模組、移植物鋪植模組以及細胞收集模組。
於一實施例中，於啟動元件之前，使用者組裝本發明所需要之耐用件組件(即移植物鋪植耐用件或細胞收集耐用件)。當元件啟動後，其偵測耐用件模組是否適當囓合、執行初步診斷且進入待機模式。然後使用者按下接近顯示 器之按鈕以開始元件設置。臨床(OR)套組進入容許可丟棄件之組裝的模式。使用者被提示可使用安裝於細胞分離耐用件上之條碼掃描器掃描每個可丟棄組件。當使用者掃描可丟棄件時，臨床(OR)套組將判定正確耐用件是否在定位，接著引導使用者通過每個步驟以裝載可丟棄件與進行必要的管件連接。元件將感測可丟棄組件係適當地裝載且確保所有本發明需要的可丟棄件已經組裝完成。於一較佳實施例中，條碼掃描器位於元件上，如此掃描可丟棄件不會干擾可丟棄件之裝載。該已安裝之條碼掃描器顯示於第3A圖。
於完成元件設置後，使用者與使用者介面互動而開始執行。元件執行空氣清除操作，其中培養基與血清被幫浦通過流動路徑，推擠空氣進入廢棄物收集點，該收集點具有容許空氣逸出至大氣的排氣埠。移植物室為繞過的，所以移植物絕不會暴露於空氣中。
使用者然後被指示去將脂肪注入離心機可丟棄件上之一埠內。當脂肪組織藉著通過靜置刀片進入離心機時係浸軟的。於一較佳實施例中，蛋白酶溶液為膠原蛋白酶/PBS溶液。使用者介面顯示器指示細胞分離方法已經開始。
於一較佳實施例中，從此觀點言，直到整個臨床(OR)套組過程完結不需要使用者之互動。使用者介面顯示器提供整個過程連續之更新、指示特定操作之執行、預估完成操作的時間，及預估完成整個過程的時間。於一實施例中，其他重要之過程參數(溫度、幫浦速度等)也能經由顯示器讓 使用者利用。
於一實施例中，移植物架被裝在酒精或可丟棄移植物室內之其他合適的無菌物質中。移植物製備與以下提供之細胞分離步驟同時進行。下述步驟牽涉製備用於鋪植之移植物：(1)酒精清除－藉使培養基流動通過移植物室且朝向至廢棄物之液體出口將酒精從移植物室清除；(2)架之預處理－培養基再循環通過移植物室直到細胞懸浮液可用於移植物鋪植。培養基可包括但不限於M199、M199E、PBS、食鹽水或無二陽離子之DPBS。於一較佳實施例中，培養基為M199E與病人血清之6：1混合物。
細胞分離方法與鋪植與細胞收集操作模式相同。於一實施例中，細胞分離步驟包括：(1)脂肪組織之消化－離心機溫度控制於大約37℃且提供低速混合動作(混合維持一合適的時間長度以確保充分之消化)；(2)離心－離心機於高速RPM下旋轉，分離脂肪組織為其組成材料；與(3)內皮細胞單離及再懸浮。於一實施例中，分離的內容物被引進一細透明管，其中一光感測器偵測內皮細胞之位置及體積。不要之材料被引入廢棄物儲存器，且特定體積之內皮細胞返回離心機。一M199E及血清之6：1混合物被幫浦進入離心機。離心機以低速混合動作懸浮混合物中分離的細胞。細胞懸浮液然後從離心機幫浦通過30微米之過濾件且朝向移植物鋪植單元或用於收集進入注射器之細胞收集單元。第14圖顯示一實施例中之離心機皿的橫截面圖。
於移植物鋪植過程中，液體經由鋪植模組通過分離模 組及移植物模組之間。較佳地，移植物溫度控制於大約37℃。於一實施例中，移植物鋪植步驟包括細胞鋪植及“加入及釋出”流動。於細胞鋪植步驟，內皮懸浮液被引入再循環流動路徑，允許細胞懸浮液於一端流入移植物及通過移植物壁流出。起始地，離開移植物室之液體混合物被導向廢棄物直到細胞懸浮液之整個體積已經進入再循環路徑。細胞懸浮液然後再循環直到移植物鋪植完成。微多孔ePTFE准許培養基/血清混合物的通過，但細胞被鋪床進入ePTFE內。於此過程中，以鋪植模組中壓力感測器監測穿壁的壓力。於“加入及釋出”流動步驟，當特定穿壁壓力達到時移植物流動被轉入內腔，顯示鋪植完成。於此過程中，流動也可以被導入廢棄物及用於在循環之幫浦。流動被導入廢棄物時的期間，構成之培養基及血清從儲存器幫浦出來。維持“加入及釋出”過程一段合適的時間。
於本發明之細胞收集方法的一實施例中，細胞懸浮液從分離模組幫浦至收集模組中之注射器。一線性致動器拉取注射器活塞，將細胞懸浮液汲取至注射器。第1圖圖示該系統流動路徑。
施用於具有橫過通透性架材料之懸浮細胞的液體培養基，持續壓力頭提供快速細胞黏著之優點，而無須如使用於暫時加壓鋪植技術之高的壓力梯度。習於此藝者以無數的細胞型式、架材料及具有任一數目元件設計的幾何構型將可快速地實施本發明。習於此藝者將認知或可確認，許多與本發明此處所述之特定實施例均等者係僅使用固定的 實驗操作。這些均等者將為本發明之申請專利範圍所涵括。
本發明提供製備各類組織植入物或移植物的元件及方法，其係藉由施加壓力，較佳地持續低度壓力，以黏附或“鋪植”細胞於任一適合移植物架或其他通透性基材材料上。於一特定實施例中，該組織為管狀組織諸如血管組織。然而，本發明也施用於牽涉細胞黏著至架或其他基材材料之任一型式的組織移植物，包括但不限於皮膚、軟骨、骨、骨髓、腱、韌帶、腸胃道、泌尿生殖道、肝、胰、腎、腎上腺、黏膜表皮、及神經移植物。該方法特別適用於管狀組織，包括心血管系統及泌尿系統之管狀組織。
此處所用之術語“持續低度壓力”意指大約10 mmHg、大約15 mmHg、大約20 mmHg、大約25 mmHg、大約30 mmHg及大約55 mmHg、持續大約5分鐘、大約20分鐘、大約30分鐘、大約40分鐘、大約50分鐘、大約1小時、大約1.5 小時、大約2小時、大約2.5小時、大約3小時、大約4小時、大約5小時或大約6小時之加壓頭的壓力，以增進細胞之黏著、生長及/或分化。習於此藝者依據細胞、組織移植物、基質材料之型式及此處所給與之教示可選擇合適的條件來施加特定低度持續壓力。
此處所用之術語“穿壁壓力或流動”意指從移植物架之一側至另一側橫過移植物架之壁的壓力或流動。於移植物架為管狀移植物架之處，該術語意指從移植物之腔或囊內(IC)空間至移植物之外部或囊外(EC)空間的壓力或流動。
此處所用之術語“穿過內腔的壓力或流動”意指通過管 狀移植物之腔的壓力或流動。術語“穿過內腔的流動”及“穿過內腔的灌注”可以互換。當穿過內腔的灌注非本發明細胞之黏著所需要時，其可以被用來例如於穿壁流動之後提供訓練的或清潔的效果。於此例中，流動速率升至及包括生理流動速率(~160 ml/min)係較佳的，雖然流動速率低到5 ml/min典型上仍足以提供能抵擋後續之生理流動的細胞黏著。
治療用途
由上述元件製備之組織移植物及細胞懸浮液可被使用於無數的醫療用途中。例如，於發明之一實施例中提供了血管化需要治療者之組織或器官的方法，其將藉著任一上述元件所製備之至少一組織移植物或細胞懸浮液植入組織或器官中。此處所用之術語“再血管化”、“新血管化”指稱在組織或器官中修補現存之血管網或建立新功能或實質上新功能的血管網，該組織或器官典型上由於疾病、認知缺陷或受傷造成無血管或血管不足地帶。
於一實施例中，組織移植物或細胞懸浮液包括選自由下述所組成之族群的細胞：皮膚、骨骼肌、心肌、心臟之左心房、肺臟、腸繫膜或脂肪組織。脂肪組織可來自網膜脂肪、腹膜前空間脂肪、腎周圍脂肪、心周圍脂肪、皮下脂肪、乳房脂肪或副睪脂肪。
於某一實施例中，組織移植物或細胞懸浮液更包括合適的基質細胞、幹細胞、關聯細胞或其等之組合。此處所用之“幹細胞”為廣義且包括傳統幹細胞、脂肪衍生幹細 胞、原細胞、前原細胞、儲存細胞及相似細胞。例示的幹細胞包括胚胎幹細胞、成人幹細胞、分化多能幹細胞、神經幹細胞、肝臟幹細胞、肌肉幹細胞、肌肉先驅幹細胞、內皮原細胞、骨髓幹細胞、軟骨幹細胞、淋巴幹細胞、間質幹細胞、造血幹細胞、中央神經系統幹細胞、周邊神經系統幹細胞及相似幹細胞。幹細胞之描述，包括其等之單離及培養方法，除了其他地方外，可由下述文獻中發現：胚胎幹細胞，方法及操作步驟，Turksen編，Humana Press，2002：Weisman等，Annu.Rev.Cell.Dev.Biol.17：387 403；Pittinger等，Science，284：143－47，1999；動物細胞培養，Masters編，Oxford University Press，2000；Jackson等，PNAS 96(Shepherd BR等，微血管建構物於移植後之快速灌注及網狀重模擬，Arterioscler Thromb Vasc Biol 24：898－904，2004)：14482－86，1999；Zuk等，組織工程，7：211－228，2001(“Zuk等”)；Atala與Lanzaed，Academic Press，2001(Atala等)，特別是第33－41章；及美國專利第5,559,022、5,672,346與5,827,735號。基質細胞之描述，包括其等之單離方法除了其他地方外，可由下述文獻中發現：Prockop，Science，276：71－74，1997；Theise等，Hepatology，31：235－40，2000；細胞生物學之現行操作步驟，Bonifacino等編，John Wiley & Sons，2000(包括2002年三月以後之增補)；與美國專利第4,963,489號。熟習此藝者應了解被選用於加入組織移植物或細胞懸浮液之幹細胞及/或基質細胞典型上適合使用於該建構物中。於 某一實施例中，當組織移植物或細胞懸浮液一在活體內植入將會發展出功能性血管床及被圍繞的功能性血管系統接合且因此灌注或可以灌注受損之組織或器官。
依據某一用於再血管化組織或器官之方法，至少一組織移植物或細胞懸浮液與該組織或器官結合且生成一再血管化之組織或器官。依據某一再血管化組織或器官的方法，術語“結合”包括置放或植入至少一組織移植物或細胞懸浮液於該組織或器官或鄰近該組織或器官之多層之上、之內、之間的任一表面上。於某一實施例中，組織移植物或細胞懸浮液以注射被植入組織或器官中。於某一實施例中，此種注射建構物將原位聚合接著植入。於某一實施例中，此種注射組織移植物或細胞懸浮液包括至少一培養的微血管建構物、至少一新鮮單離的微血管建構物或是兩者。於某一實施例中，結合包括使用已知(如上所述)之技術貼附至少一組織移植物或細胞懸浮液至需要再血管化的至少一組織或器官中。
習於此藝者了解某一組織及器官為一層纖維組織、結締組織、脂肪組織或相似組織所覆蓋或包含一層纖維組織、結締組織、脂肪組織或相似組織，且下方的組織或器官可被再血管化而不移除此層。此層可以是天生的(如漿膜層、黏液膜、纖維性囊或相似物)，或來自由於疾病、缺陷、受傷或生化缺失而形成之纖維化、壞死或缺血。典型上，組織移植物或細胞懸浮液之微血管片段可穿越此層且接合下層組織或器官之血管系統，再血管化組織或器官。因此， 結合組織移植物或細胞懸浮液與需要再血管化之組織或器官，包括置放組織移植物或細胞懸浮液在此層之上或之內。例如但不限於，置放組織移植物或細胞懸浮液於腦膜上以再血管化腦組織；於心包膜上以再血管化心肌；腹膜及/或漿膜上以再血管化部份的大腸；結膜及/或副結膜上以再血管化眼睛；氣管表面上以再血管化氣管；口腔黏膜上以再血管化嘴巴；胸腔及/或漿膜表面上以再血管化肺臟；胸腔及/或腹腔表面上以再血管化橫隔膜；皮膚上以再血管化未癒合皮膚潰瘍(如糖尿病潰瘍)；心周表面上以再血管化心包等等。
於某一實施例中，當動物或人類內之組織或器官結合後，組織移植物或細胞懸浮液將發展功能性血管床且與周遭功能性血管系統接合且灌注受損之組織或器官。於某一實施例中，植入組織移植物或細胞懸浮液作為用於再血管化受損組織或器官的造核位置。於某一實施例中，來自組織移植物或細胞懸浮液之合適的幹細胞、基質細胞及/或關聯細胞將支援受損組織或器官之重構及修補。包括遺傳工程細胞之建構物可生成重組產物，其經由血流散佈全身或送至局部微環境以誘發修補、傷口癒合或相似作用。
於一特定實施例中，組織移植物或細胞懸浮液包括內皮細胞，其能沒有限制地分化為神經元、心肌細胞、軟骨細胞、胰臟腺細胞、胰臟內分泌細胞(包括蘭氏小島)、肝細胞、腎表皮細胞、副甲狀腺細胞、來迪(Leydig)細胞、塞特利(sertoli)細胞、生殖母細胞、卵細胞、胚囊細胞、庫弗 (Kupffer)細胞、淋巴細胞、纖維母細胞、肌細胞、肌母細胞、衛星細胞、脂肪細胞、前脂肪細胞、骨細胞、骨母細胞、蝕骨細胞、軟骨細胞、膽表皮細胞、普金耶(Purkinje)細胞以及節律點細胞。
於另一實施例中，組織移植物或細胞懸浮液包括至少一幹細胞、原細胞或關聯細胞，其等可為但不限於神經元、心肌細胞、軟骨細胞、胰臟腺細胞、胰臟內分泌細胞(包括蘭氏小島)、肝細胞、腎表皮細胞、副甲狀腺細胞、來迪(Leydig)細胞、塞特利(sertoli)細胞、生殖母細胞、卵細胞、胚囊細胞、庫弗(Kupffer)細胞、淋巴細胞、纖維母細胞、肌細胞、肌母細胞、衛星細胞、脂肪細胞、前脂肪細胞、骨細胞、骨母細胞、蝕骨細胞、軟骨細胞、膽表皮細胞、普金耶(Purkinje)細胞以及節律點細胞。
此處所用之術語“關聯細胞”意指基於組織移植物或細胞懸浮液所欲使用的目的，適合加入本發明元件所製備組織移植物或細胞懸浮液的細胞。藉著實例，用於受損之肝之修補、重構或數目再增的合適關聯細胞包括但不限於肝細胞、膽表皮細胞、庫弗(Kupffer)細胞、纖維母細胞與相似細胞。加入組織移植物或細胞懸浮液之例示的關聯細胞包括神經元、心肌細胞、肌細胞、軟骨細胞、胰臟腺細胞、蘭氏小島、骨細胞、肝細胞、庫弗(Kupffer)細胞、纖維母細胞、肌細胞、肌母細胞、衛星細胞、內皮細胞、脂肪細胞、前脂肪細胞、膽表皮細胞與相似細胞。這些型式的細胞可藉著已知的技術被單離與培養。例示之技術除了其他 地方外，可於下列文獻中發現：Atala等，特別是第9－32章；Freshney，動物細胞培養：基礎技術手冊，4th ed.，Wiley Liss,John Wiley & Sons，2000；基礎細胞培養：實作方法，Davis編輯，Oxford University Press，2002；動物細胞培養：實作方法，Masters編輯，2000；及美國專利第5,516,681與5,559,022號。
習於此藝者將明瞭此種基質細胞、幹細胞及/或關聯細胞在製備期間或之後可被加入組織移植物或細胞懸浮液中。例如但不限於結合細胞懸浮液、幹細胞、關聯細胞及/或基質細胞於一液體三度空間培養液(諸如膠原、纖維蛋白或相似物)中，或可以達成接種或鋪植幹細胞、關聯細胞及/或基質細胞於組織移植物之上或之內。用於加入組織移植物或細胞懸浮液之適合幹細胞、基質細胞與關聯細胞的例示結合包括：用於再血管化受損胰臟之組織移植物或細胞懸浮液中的蘭氏小島及/或胰臟腺細胞；用於再血管化受損肝臟之組織移植物或細胞懸浮液中的肝細胞、肝原細胞、Kupffer細胞、內皮細胞、內層幹細胞、肝纖維母細胞及/或肝儲存細胞，例如但不限於，用於血管化、修復與重建受損或疾病肝臟之組織移植物或細胞懸浮液的適合幹細胞或基質細胞包括肝儲存細胞、肝原細胞(諸如但不限於肝臟纖維母細胞、胚胎幹細胞、肝幹細胞)；用於再血管化受損或缺血的心臟之心肌細胞、Purkinje細胞、節律細胞、肌原細胞、間質幹細胞、衛星細胞及/或骨髓幹細胞(見如Atkins等，心肺移植期刊，1999年12月，1173－80頁；Tomita等， 心血管研究中心，美國心臟學會，1999，92－101頁；Sakai等，心血管研究中心，美國心臟學會，1999，108－14頁)與相似處。
於一實施例中，組織移植物或細胞懸浮液更包括一藥劑，其選自由下列組成之群組：細胞介素、趨化素、抗生素、藥物、鎮痛劑、抗發炎劑、免疫抑制劑或其等之組合。例示細胞介素包括但不限於血管增生因子、血管內皮生長因子(VEGF，包括但不限於VEGF－165)、介白素、纖維母細胞生長因子(例如但不限於FGF－1與FGF－2)、肝細胞生長因子(HGF)、轉形生長因子β(TGF－β)、內皮素(諸如ET－1、ET－2及ET－3)、似胰島素生長因子(IGF－1)、血管生成素(諸如Ang－1、Ang－2、Ang－3/4)、似血管生成素蛋白(諸如ANGPTL1、ANGPTL－2、ANGPTL－3及ANGPTL－4)、血小板衍生生長因子(PDGF)(包括但不限於PDGF－AA、PDGF－BB與PDGF－AB)、表皮生長因子(EGF)、內皮細胞生長因子(ECGF)(包括ECGS)、血小板衍生內皮細胞生長因子(PD－ECGF)、胎盤生長因子(PLGF)及相似物。細胞介素包括重組細胞介素，趨化素典型為可從數個來源如R & D系統(Minneapolis,Minn.)、Endogen(Woburn,Wash.)及Sigma(St.Louis,Mo.)商業性獲得。習於此藝者將了解選擇細胞介素與趨化素用以加入特定組織移植物或細胞懸浮液將部份地視要被血管化、再血管化、增大或重建的目標組織或器官而決定。
於某一實施例中，組織移植物或細胞懸浮液更包括至 少一遺傳工程細胞。於某一實施例中，由於藉著技術領域內熟知之技術所引發之至少一遺傳工程細胞內的基因變更，包括至少一遺傳工程細胞之組織移植物或細胞懸浮液將構成地表現或引發地表現由至少一遺傳工程細胞編碼的至少一基因產物。例示之遺傳工程技術的描述除其他地方外可以由下列文獻中發現：Ausubel等人，分子生物之現行操作步驟(包括2002年3月以來的補篇)，John Wiley & Sons，New York，N.Y.，1989；Sambrook等人，分子選殖：實驗室手冊，2.sup.nd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989；Sambrook與Russell，分子選殖：實驗室手冊，3.sup.rd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，2001；Beaucage等人，核酸化學之現行操作步驟，John Wiley & Sons，New York，N.Y.，2000(包括2002年3月以來的補篇)；分子生物之簡要操作步驟，4.sup.th ed.，Ausbel、Brent及Mooreed.，John Wiley & Sons，New York,N.Y.，1999；Davis等人，分子生物之基礎方法，McGraw Hill Professional Publishing，1995；分子生物操作步驟(見highveld.com網址)與線上操作步驟(protocol－online.net)。用於遺傳修飾本發明遺傳工程細胞之例示基因產物包括：胞漿素原活化物、可溶性CD4、因子VIII、因子IX、von Willebr及因子、尿激酶、水蛭素、干擾素(包括α－、β－及γ－干擾素)、腫瘤壞死因子、介白素、造血生長因子、抗體、葡萄糖腦甘脂酶、腺核苷去胺酶、苯丙胺酸羥化酶、人類生長激素、胰島素、紅血 球生成素、VEGF、血管生成素、肝細胞生長因子、PLGF及相似物。
於本發明之一實施例中，組織或器官係選自由下列組成之群組：心臟組織、肺臟組織、心肌組織、橫紋肌組織、肝臟組織、胰臟組織、軟骨、骨、心包、腹膜、腎臟、平滑肌、皮膚、黏液組織、小腸、大腸及脂肪組織、注射細胞懸浮液進入受治療者組織或器官之步驟包括但不限於使用至少一注射器、針頭、套管、導管、管或微針頭。如此處所用者，術語“注射”或其變化語將指任一注進或推出一物質的構件，典型上經由一管或一包括孔或外開口之結構。此種管或結構可以為撓性、非撓性或可包括至少一撓性部份與至少一非撓性部份。例示注射構件包括具有或不具備針頭之注射器、套管、導管、撓性管及類似物。特別細胞懸浮液的投入也可經由使用使組織通透的元件(如微針頭)而完成。與具有標準量器之皮下針頭的傳統注射相反，微針頭(典型上定義為曲率半徑約1 um)或微針頭陣列藉著產生微洞使皮膚或內皮細胞層通透。這些洞效用上作為材料投送的管道且可增進本發明細胞懸浮液之投送或附著進入血管、組織或器官中。所以，熟習此藝者將了解包括一孔或外開口的任一結構，經由這些開口至少一細胞懸浮液可被推出進入組織或器官上或之內，或者可使組織及/或器官表面通透的任一結構，包括一工程化的組織，係落於本發明的範圍內。於某一實施例中，此種注射建構物於活體外聚合，接著注射。
於一特定實施例中，本發明之組織移植物或細胞懸浮液包括選自由下列組成之群組的細胞皮膚、骨骼肌、心肌、心臟左心房、肺臟、腸繫膜或脂肪組織。脂肪組織可選自由下列組成之群組：網膜脂肪、腹膜前空間脂肪、腎周圍脂肪、心周圍脂肪、皮下脂肪、乳房脂肪或副睪脂肪。
本發明也提供擴大需要治療者之組織或器官的方法，包括將本發明元件所製備之組織移植物植入器官或組織中或將本發明元件所製備之細胞懸浮液注射入組織或器官中。此處所用之“擴大”意指增加組織或器官體積及/或密度。
本發明也提供再生受治療者之組織或器官的方法，其係藉著將此處所述之元件所製備之至少一組織移植物植入器官或組織中或本發明之元件所製備之至少一細胞懸浮液注射入組織或器官中。此處所用之“再生”意指藉形成新組織替換失去的、生病的或其他受損的組織。
熟習此藝者將明瞭本發明之受治療者可為任何動物，包括兩棲類、鳥類、魚類、哺乳類及有袋類，但較佳地為哺乳類(如人類；居家動物諸如貓、狗、猴子、老鼠與大鼠)；或商業動物(如牛、馬或豬)。此外，本發明之受治療者可為任一年齡包括胎兒、胚胎、小孩及成人。於一本發明較佳實施例中，受治療者為人類。於一實施例中，受治療者為馬且所使用之方法係再生該動物之膨脹症內或周圍之組織。於另一實施例中，受治療者為人類而組織再生之方法係用於防止或治療例如關節炎與眼部疾病，包括但不限於青光眼與斑點退化。
此外，用於重建需要受治療者之組織或器官的方法包括將此處所述之元件所製備之至少一組織移植物植入器官或組織中或將這些元件所製備之至少一細胞懸浮液注射入組織或器官中。此處所用之“重建”意指重造、重構、重塑及/或回復組織或器官。於本發明一實施例中，例如受治療者具有蜂窩組織炎，該受治療者接受皮下注射合適的細胞懸浮液以局部重建脂肪組織，如此增進受治療者之外觀。於一實施例中，受治療者為手術後之受治療者。
本發明也提供用於治療或預防受治療者組織或器官之初次與再次感染方法，其係將此處所述之元件所製備之至少一組織移植物植入器官或組織中或將這些元件所製備之至少一細胞懸浮液注射入組織或器官中。
本發明也提供使用本發明之元件所製備之細胞懸浮液及組織移植物以預防組織或器官疤組織的形成、及/或治療或預防受治療者組織或器官之發炎的方法。
本發明也提供預防需要受治療者組織或器官形成黏著方法，其係將本發明之元件所製備之至少一細胞懸浮液或組織移植物注射入器官或組織中。
於一實施例中提供用於治療或預防受治療者急性心肌梗塞方法，其係將此處所述之任一元件所製備之至少一細胞懸浮液注射入心臟中，其中至心臟組織之血管系統係增加的。於另一實施例中，提供治療受治療者心肌炎之方法包括將本發明之任一元件所製備之至少一細胞懸浮液注射入受治療者之心周流體內。
本發明也提供用於治療受治療者傷口之方法，其係以本發明之元件所製備之至少一細胞懸浮液注射傷口。於一實施例中，受治療者為手術後受治療者。
本發明提供持續性加壓鋪植及自動操作從病人組織中分離所要細胞分液的臨床程序，及過濾、潤濕、加熱、浸軟、蛋白分解釋出、分離、再懸浮及加壓鋪植細胞於通透性移植物上。習於此藝者僅使用通常的實驗手續將可確認或確定許多此處所述之本發明實施例的均等作用。這些均等作用也包含於本發明之申請專利範圍中。
本說明書中所提之所有的文獻、專利或專利申請案於此均被併入本發明說明書中作為參考。
以上描述與實例只是為了闡明達到本發明之目的、特微及效用的較佳實施例，其等並非意味本發明僅限於此。
V1－V10‧‧‧閥
S1－S2‧‧‧注射器
F‧‧‧過濾件
第1圖簡要圖示細胞分離裝置之一實施例的系統流動路徑。
第2(A)圖顯示依據本發明一實施例之細胞分離裝置之處理元件的截面圖，其包括噴霧噴嘴構件及內、外離心機皿；(B)提供依據本發明一實施例之細胞處理裝置的立體圖；及(C)－(F)顯示該扭轉鎖機構，其將該處理元件連結至依據本發明一實施例之細胞分離裝置。
第3(A)圖提供依據本發明之細胞分離裝置之一實施例的立體圖，其包括人類－機械介面、細胞處理元件(離心機)、管盒、培養基袋、注射器幫浦、夾管閥、收集注射器及條 碼掃描器；(B)提供依據本發明另一實施例之細胞分離裝置的立體圖；及(C)提供依據本發明一實施例之細胞分離裝置的背面圖。
第4圖簡要圖示依據本發明一實施例之臨床(OR)套組的輸入。
第5圖簡要顯示依據本發明一實施例之臨床’(OR)套組的流動路徑。
第6圖顯示依據本發明一實施例之移植物鋪植模組。
第7圖顯示依據本發明一實施例之細胞收集模組。
第8圖為連接至細胞分離模組之細胞收集模組耐用件的立體圖，該細胞分離模組具有可丟棄組件，其被裝載以依據本發明一實施例而被使用。
第9(A)圖顯示依據本發明一實施例之噴射噴霧噴嘴及迴轉耦合件；及(B)顯示噴霧噴嘴構件與依據本發明一實施例之離心機皿的一圓突件對齊。
第10(A)圖提供依據本發明一實施例之夾管閥多部份架的立體圖；(B)提供依據本發明一實施例之夾管閥多部份架之管架的立體圖；(C)提供依據本發明一實施例之夾管閥多部份架之管架的截面圖；及(D)提供依據本發明一實施例之夾管閥多部份架的側視圖。
V1－V10‧‧‧閥
S1－S2‧‧‧注射器
F‧‧‧過濾件

Claims (94)

  1. 一種細胞分離裝置，包括：一培養基儲存器；一細胞處理元件，其經一入口及一出口與該培養基儲存器流體聯通，該細胞處理元件具有一可繞一縱軸旋轉之內部室體(interior chamber body)；及複數個圓突件(lobe)與該內部室體流體聯通並側向延伸與該縱軸垂直，其中至少一圓突件具有一錐狀構形，其從該縱軸沿徑向遠離至錐端為直徑漸減，該細胞處理元件經構形以強制在內部室體之細胞沿徑向朝複數個圓突件往外移，使得該內部室體繞該縱軸旋轉的同時，該等圓突件中至少一者收穫並維持細胞在錐端上；一噴霧噴嘴，其與該等圓突件中至少一者對齊，以流體噴霧以使細胞從圓突件的位置離開(dislodge)；一幫浦，其與該培養基儲存器及該細胞處理元件流體聯通；及一閥，其與該細胞處理元件耦合，其中該閥選擇性控制流至或來自該元件的流體流。
  2. 如申請專利範圍第1項之裝置，其中該細胞處理元件係一離心機。
  3. 如申請專利範圍第1項之裝置，其中該細胞處理元件係可丟棄的。
  4. 如申請專利範圍第1項之裝置，其中該裝置係模組化的。
  5. 如申請專利範圍第1項之裝置，其中該裝置係自動化的。
  6. 如申請專利範圍第1項之裝置，更包括一加熱件。
  7. 如申請專利範圍第1項之裝置，更包括一廢棄物儲存器。
  8. 如申請專利範圍第1項之裝置，更包括一組織分解化學品儲存器。
  9. 如申請專利範圍第8項之裝置，更包括一過濾件於該細胞處理元件入口及該組織分解化學品儲存器之間。
  10. 如申請專利範圍第1項之裝置，更包括一閥，其構形為允許細胞之一第一分液從該過濾件進入該細胞處理元件且一第二分液進入該廢棄物儲存器。
  11. 如申請專利範圍第1項之裝置，更包括一過濾件於該細胞處理元件之一出口及一無菌細胞收集元件之間。
  12. 如申請專利範圍第11項之裝置，其中該無菌細胞收集元件係一注射器。
  13. 如申請專利範圍第1項之裝置，其中該細胞處理元件更包括互相流體聯通的一內皿及一外皿。
  14. 如申請專利範圍第13項之裝置，其中該內皿包括構形為消化之一區域及構形為分離之一區域。
  15. 如申請專利範圍第13項之裝置，其中該內皿更包括與該外皿聯通之一孔。
  16. 如申請專利範圍第14項之裝置，其中該構形為 分離之一區域係更構形為使該內皮細胞之收集最佳化及使非內皮細胞材料之收集最小化。
  17. 如申請專利範圍第1項之裝置，其中該細胞處理元件更包括一扭轉鎖耦合構件，其用於使該細胞處理元件耦合至該細胞分離裝置。
  18. 如申請專利範圍第1項之裝置，其中該細胞處理元件更包括與該內皿流體聯通之一萃取管。
  19. 如申請專利範圍第1項之裝置，其中該細胞處理元件更包括一可調整之噴霧噴嘴。
  20. 如申請專利範圍第1項之裝置，其中該細胞處理元件更包括一迴轉耦合件。
  21. 如申請專利範圍第20項之裝置，其中該迴轉耦合件更包括一噴霧噴嘴。
  22. 如申請專利範圍第21項之裝置，其中該迴轉耦合件更包括用於從該內皿添加或移除液體之一傳送管。
  23. 如申請專利範圍第1項之裝置，其中該幫浦係一自動的、自我啟動的幫浦。
  24. 如申請專利範圍第1項之裝置，其中該閥係一夾管閥(pinch valve)。
  25. 如申請專利範圍第1項之裝置，更包括一夾管閥多部份架(manifold rack)。
  26. 如申請專利範圍第1項之裝置，更包括一人類-機械介面。
  27. 如申請專利範圍第1項之裝置，其中該裝置係一 手持裝置。
  28. 如申請專利範圍第1項之裝置，其中該培養基係一溶液，其含有於生理pH之一生理濃度的氯化鈉。
  29. 如申請專利範圍第1項之裝置，其中該培養基係選自由M199、M199E、PBS、食鹽水及不含二陽離子之DPBS組成的群組。
  30. 如申請專利範圍第29項之裝置，其中該培養基係M199E。
  31. 如申請專利範圍第29項之裝置，其中該培養基係緩衝生理食鹽水。
  32. 如申請專利範圍第8項之裝置，其中該組織分解化學品係膠原蛋白酶。
  33. 如申請專利範圍第1項之裝置，更包括一電子圖形顯示器。
  34. 如申請專利範圍第1項之裝置，更包括一條碼掃描器。
  35. 如申請專利範圍第1項之裝置，更包括一細胞計數元件。
  36. 如申請專利範圍第1項之裝置，更構形為與一細胞收穫元件一起使用。
  37. 如申請專利範圍第2項之裝置，其中該離心機包括一馬達，其安裝於使用一振動單離構件之裝置內。
  38. 如申請專利範圍第37項之裝置，其中該振動單離構件係一墊。
  39. 一種用於分離細胞之方法，包括：加入一定量之組織至如申請專利範圍第13項之裝置的內皿中；加熱該組織至一大約37℃的溫度；加入一有效量之膠原蛋白酶至該內皿；藉震盪該內皿達一段有效的時間以消化該組織；從該消化的組織中移除纖維性組織；於大約3100RPM下旋轉該內皿達大約5分鐘；藉加入流體至該內皿將脂肪細胞移到該內皿的中心；藉離心作用引導該脂肪細胞通過該內皿中之一孔進入該外皿；以流體潤濕該內皿；引導一細胞小粒從該內皿之一圓突件至該內皿之底部；任選地，加入流體至該內皿且於大約3100RPM旋轉該內皿達大約5分鐘；及收集一細胞小粒。
  40. 如申請專利範圍第39項之方法，其中該組織係選自由脂肪組織、骨髓、皮膚及骨骼肌所組成之群組。
  41. 如申請專利範圍第40項之方法，其中該組織係脂肪組織。
  42. 如申請專利範圍第39項之方法，其中該流體係一溶液，其含有於生理pH之一生理濃度的氯化鈉。
  43. 如申請專利範圍第39項之方法，其中該流體係 選自由M199、M199E、血清、食鹽水、不含二陽離子之DPBS及其等之有效混合物所組成之群組。
  44. 如申請專利範圍第39項之方法，其中使用一可調整噴霧噴嘴使該細胞小粒從該內皿之一圓突件的位置上離開。
  45. 如申請專利範圍第39項之方法，其中使用一迴轉耦合的傳送管將流體從該皿中加入及移除。
  46. 一種用於以細胞為主之治療的套組，包括如申請專利範圍第1項之分離裝置，其與一細胞鋪植裝置為流體聯通，其中該細胞分離裝置及該細胞鋪植裝置係包含在一耐用包裝件中。
  47. 如申請專利範圍第46項之套組，其中該細胞分離裝置包括一離心機。
  48. 如申請專利範圍第46項之套組，更包括與該細胞分離裝置聯通之一細胞浸軟器。
  49. 如申請專利範圍第46項之套組，更包括一幫浦。
  50. 如申請專利範圍第46項之套組，更包括一加熱件。
  51. 如申請專利範圍第46項之套組，更包括一廢棄物儲存器。
  52. 如申請專利範圍第46項之套組，更包括一過濾件。
  53. 如申請專利範圍第52項之套組，其中該過濾件 排除大於約100微米的顆粒。
  54. 如申請專利範圍第52項之套組，其中該過濾件排除大於約30微米的顆粒。
  55. 如申請專利範圍第46項之套組，更包括用於偵測該細胞分離裝置及該細胞鋪植裝置之出現的一感測器構件。
  56. 如申請專利範圍第46項之套組，更包括用於監測及控制溫度、壓力及流動速率之一感測器構件，其中該感測器構件係與一警鈴聯通。
  57. 如申請專利範圍第46項之套組，更包括一電子圖形顯示器。
  58. 如申請專利範圍第46項之套組，更包括一條碼掃描器。
  59. 如申請專利範圍第46項之套組，更包括一細胞收集元件。
  60. 如申請專利範圍第59項之套組，其中該細胞收集元件係一注射器。
  61. 如申請專利範圍第46項之套組，更包括一細胞計數元件。
  62. 如申請專利範圍第46項之套組，其中該套組係一手持套組。
  63. 如申請專利範圍第46項之套組，其中該套組係適於與一細胞收穫元件一起使用。
  64. 如申請專利範圍第46項之套組，更包括一人類- 機械介面。
  65. 一種用於以細胞為主之治療的套組，包括：一流動路徑筒(flow path cartridge)，其包括一個以上之流體儲存器、一入口及一出口；一細胞處理筒，其具有一入口及一出口，該細胞處理筒具有一可繞一縱軸旋轉之內部室體；及複數個圓突件與該內部室體流體聯通並側向延伸與該縱軸垂直，其中至少一圓突件具有一錐狀構形，其從該縱軸沿徑向遠離至錐端為直徑漸減，該細胞處理元件經構形以強制在內部室體之細胞沿徑向朝複數個圓突件往外移，使得該內部室體繞該縱軸旋轉的同時，該等圓突件中至少一者收穫並維持細胞在錐端上；一噴霧噴嘴，其與該等圓突件中至少一者對齊，以流體噴霧將細胞從圓突件的位置離開；用於固持一移植物基材之一任選的移植物室筒，該移植物室筒具有一入口及一出口；構形成引起通過一流動路徑之流動的一幫浦；構形成引導從該細胞分離器筒流動至該移植物室筒的一閥；其中該流動路徑筒、細胞分離器筒及移植物室筒彼此聯通而形成一連續的流動路徑，且其中該流動路徑筒、細胞分離器筒及任選的移植物室筒與一能提供電力予該套組之模組化的套組包裝聯通。
  66. 如申請專利範圍第65項之套組，其中該流動路 徑筒、細胞分離器筒及移植物室筒係可丟棄的。
  67. 如申請專利範圍第65項之套組，其中該細胞處理筒包括一離心機。
  68. 如申請專利範圍第65項之套組，更包括與該流動路徑筒聯通之一細胞浸軟器。
  69. 如申請專利範圍第65項之套組，其中該流動路徑筒係預裝載有培養基。
  70. 如申請專利範圍第69項之套組，其中該培養基係一溶液，其包括於生理pH之一生理濃度的食鹽水。
  71. 如申請專利範圍第69項之套組，其中該培養基係選自由M199、M199E、PBS、血清、食鹽水及不含二陽離子之DPBS所組成之群組。
  72. 如申請專利範圍第71項之套組，其中該培養基係M199E。
  73. 如申請專利範圍第69項之套組，其中該培養基係緩衝生理食鹽水。
  74. 如申請專利範圍第65項之套組，其中該流動路徑筒包括一幫浦。
  75. 如申請專利範圍第65項之套組，更包括一加熱件。
  76. 如申請專利範圍第65項之套組，更包括一廢棄物儲存器。
  77. 如申請專利範圍第65項之套組，更包括一過濾件。
  78. 如申請專利範圍第77項之套組，其中該過濾件排除大於約100微米的顆粒。
  79. 如申請專利範圍第77項之套組，其中該過濾件排除大於30微米的顆粒。
  80. 如申請專利範圍第77項之套組，其中該過濾件係位該細胞分離器筒及該移植物筒之間。
  81. 如申請專利範圍第65項之套組，其中該套組包裝包括用於偵測該流動路徑筒、該細胞分離器筒及該移植物室之出現的一感測器構件。
  82. 如申請專利範圍第65項之套組，其中該套組包裝包括用於監測及控制溫度、壓力及流動速率之一感測器構件，其中該感測器構件係與一警鈴聯通。
  83. 如申請專利範圍第65項之套組，其中該套組包裝包括一電子圖形顯示器。
  84. 如申請專利範圍第65項之套組，其中該套組包裝包括一條碼掃描器。
  85. 如申請專利範圍第65項之套組，其中該套組包裝包括具有一入口及一出口之一細胞收集模組。
  86. 如申請專利範圍第85項之套組，其中該細胞收集模組係一注射器。
  87. 如申請專利範圍第65項之套組，更包括一細胞計數元件。
  88. 如申請專利範圍第65項之套組，其中該套組係一手持套組。
  89. 一種製備組織移植物的方法，包括：提供如申請專利範圍第65項之套組；將含有附著細胞之培養基引入該移植物室；及施加一持續低壓之橫過該基材的該培養基之穿壁流動達一段足以使該細胞黏附至該基材的時間。
  90. 如申請專利範圍第89項之方法，其中該附著細胞係選自由纖維母細胞、平滑肌細胞、外皮細胞、巨噬細胞、單核細胞、漿細胞、肥大細胞、骨髓細胞、脂肪細胞、組織特定之實質細胞、內皮細胞及脂肪衍生之幹細胞所組成的群組。
  91. 如申請專利範圍第89項之方法，其中該附著細胞係內皮細胞。
  92. 如申請專利範圍第89項之方法，其中該細胞係微血管內皮細胞。
  93. 如申請專利範圍第92項之方法，其中該微血管內皮細胞係衍生自脂肪組織。
  94. 如申請專利範圍第89項之方法，更包括從一病人收穫該脂肪組織。
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