KR20100007893A - 세포 분리 장치 및 그의 사용 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 다양한 세포 치료 및 조직 공학 방법을 지지하는데 사용하기 위한 자동화된 장치를 제공한다. 본 발명은 세포 치료 및/또는 조직 공학에 사용하기 위한 조직 시료로부터 세포를 분리할 수 있는 자동화된 세포 분리 장치를 제공한다. 상기 세포 분리 장치는 다양한 치료를 지지하는 세포 수집 장치 및/또는 붙임 장치와 같은 보조 장치와 조합하여 사용될 수 있다. 상기 자동화된 장치는 배지 및 조직 해리 화학물 저장기, 여과기, 세포 분리기 및 이식 기질 또는 다른 혈관내 장치를 지지하는 이식 챔버를 통해 관류 흐름 루프를 포함한다. 또한 본 발명은 조직 및 기관의 혈관재생, 재생성 및 재구성을 포함하는 수많은 치료법, 뿐만 아니라 질병의 치료 및 예방에 있어서 본 명세서에 기재된 장치에 의해 제조되는 조직 그라프트 및 세포 시료를 사용하는 방법을 제공한다.

Description

세포 분리 장치 및 그의 사용 방법{Cell separation apparatus and methods of use}
본 출원은 2001년 3월 30일에 출원된, 미국 임시 출원번호 제60/279,824호의 출원일의 이익을 주장하고, 2002년 3월 29일에 출원된 출원번호 제10/112,461호, 2002년 4월 29일에 출원된 출원번호 제10/134,939호, 및 2005년 12월 22일에 출원된 출원번호 제11/314,281의 일부 계속 출원이고, 이들은 그들 전체로서 참조에 의해 본 명세서에 포함된다.
본 발명은 세포 치료 및 조직 공학을 포함하는 다양한 치료 절차를 지지하는데 사용하기 위한 장치 및 방법에 관한 것이다.
세포 치료 및 조직 공학은 손상된 또는 병든 조직 및 기관의 치료 및 회복을 위한 임상적인 적용으로 발전하고 있다. 특히, 혈관 그라프트의 발전은 심장 및 말초 혈관 수술 분야에서 주된 목표이다. 심혈관 질환은 제1 세계의 사망 및 질병의 주된 원인이다. 치료의 표준인, 자가이식(autocraft)이 심각한 질병을 수반하지 않는 것은 아니다. 미국에서만 한 해에 100,000명에 달하는, 적절한 자가이식 물질이 없는 상태에 놓이거나, 또는 이미 자가이식을 받은, 전신성 질환 환자는 자가이식의 선택권이 거의 없다.
따라서, 연구자들은 30년 이상 합성 그라프트를 연구해 왔다. 주된 시도는 생체 적합성, 즉, 항혈전성, 비면역성, 기계적으로 저항성이 있고, 허용가능한 상처 치료 및 생리학적 반응(예를 들어, 혈관수축/이완 반응, 용질 이송 능력 등)을 갖는 이식 물질을 제공하는 것이다. 또한, 조직 이식 물질은 조작, 저장 및 이송이 용이하고, 상업적으로 실시가능해야 한다.
혈관은 혈관 내의 혈전증(thrombosis) 및 뒤이은 혈관폐색 및/또는 세포 내증식(ingrowth)에 의해 야기되는 기계적이고 생물학적인 2가지의 주요 기능상실 모드를 갖는다. 동맥압에 견딜 수 있는 물질 특성을 갖는 합성 혈관은 흔한 것이고, 그에 의해 비-혈전생성(non-thrombogenic) 물질에 관한 연구는 주요 연구 분야로 되고 있다. 환자로부터 얻어진 내피 세포는 이식되는 혈관의 혈전 형성을 감소시키는 것으로 밝혀졌다(Williams 등, 1994, J. Vase. Surg., 19:594-604; Arts 등, 2001 Lab Invest 81 :1461-1465).
내피 세포는 합성 그라프트 내에서 비-혈전생성 세포 내층(lining)을 형성하는데 있어서 매우 중요하다. 따라서, 수술실 환경에 적절하고, 무균 장벽(barrier)을 유지하고, 사용하기 쉽고, 일관된 이식 결과물을 생성하는 기구를 사용하여 투과성 매트릭스, 스캐폴드(scaffold), 또는 다른 투과성 세포 기질 물질의 내부 또는 위에 몇 분 또는 몇 시간 이내에 신속하게 세포 부착을 달성하는 것이 바람직하다.
현재, 이들 요건을 충족시키기 위한 4 가지의 주된 접근 방식: (ⅰ) 무세포화된 조직 물질의 사용; (ⅱ) 상기 세포가 세포외 매트릭스(ECM) 합성을 야기하는 배지 내에서 조직 배양 플라스틱 상에 배양되는 것인, 자가-조립 메카니즘의 사용; (ⅲ) 세포가 모사된 생리학적 환경에서 파종되고 배양되는 것인, 합성 생분해성 중합체의 사용; 및 (ⅳ) 생리학적 환경을 모사하기 위해 기계적 힘을 적용함으로써 조직 세포로 형성되고 압축되는, 재구성 제1 타입 콜라겐 겔과 같은, 생중합체의 사용이 있지만, 성공은 제한적이다(예를 들어, Robert T. Tranquillo, 2002, Ann. N.Y. Acad. Sci., 961 :251-254 참조).
일시적인 높은 압력을 수반하는 압력 구배는 체 작용에 의하여, 즉 벌크 흐름(bulk flow)을 제공하고 세포 집단보다 작은 구멍(pore)을 갖는 기질 또는 스캐폴드 물질을 사용함으로써, 상기 매트릭스 내 세포를 포획하는 것에 의하여, 투과성 스캐폴드 상에 세포를 침착시키기 위하여 사용되어 왔다(예를 들어, 미국 특허 제5,628,781호; Williams 등, 1992, J Biomed Mat Res 26:103-117; Williams 등, 1992, J. Biomed Mat Res 28:203-212.). 이들 포획된 세포는 뒤이어 상기 스캐폴드 물질에 부착되나, 상기 논의된 성공적인 이식을 위한 요건, 즉 생체적합성, 기계적 강도, 및 필요한 생리학적 특성을 완전하게 충족시킬 수 없기 때문에 임상적인 적용가능성은 제한된다.
1970년대 말에 시작하여, 내피 세포 파종(seeding)은 부작용을 방지하기 위한 작은 직경의 중합체성 혈관 그라프트의 개통성(patency)을 개선하기 위해 실험적으로 채택되었다. 그 후로, 생물학적 또는 생물-혼성 그라프트 공학에 주된 초점을 두고, 이러한 목표를 향해 진보했다.
내피 세포는 그들이 혈관의 루멘 표면 상에 단순히 단일 세포 라인을 생성하 는 것으로 본래 믿어왔던 것보다 더 복잡하다. 또한 내피 세포는 응고, 혈소판 응집, 백혈구 부착, 및 혈관 긴장(vascular tone)을 조절하는 분자를 배출한다. 이들 세포의 부재시, 예를 들어 이식된 합성 중합체성 혈관 그라프트의 루멘의 경우, 상기 숙주 반응은 결국 실패하게 될 것이다. 이식 후 첫 30일 이내의 개통성 손실은 급성 혈전증에 의해 일어난다. 이러한 초기 단계의 실패는 비-내피화된, 생체물질의 혈액-접촉 표면의 고유의 혈전생성성의 결과이다. 지금까지, 유일하게 알려진 완전한 비-혈전생성 물질은 내피(endothelium)이고, 혈류에 접촉하는 임의의 다른 물질은 혈소판 증착 및 뒤이은 혈전증이 쉽게 일어난다. 작은 직경의 중합체성 혈관 그라프트의 장기적 기능상실 모드는 개통성의 손실에 이르는 망상 증식(anastomotic hyperplasia)이다. 망상 증식의 개시의 정확한 기작은 여전히 정의되고 있는 중이며, 내피 세포 및 평활근 세포의 기능장애 및 부적절한 소통이 수반되기도 한다.
작은 직경의 그라프트 개발 분야에서 초기 연구자들은 그라프트 내피화를 촉진하고자 했고, 그에 의해 이식 전에 다양한 정도의 자가 내피 세포를 혈관 그라프트에 이식하는 것에 의해 개통성을 증가시키고자 했다. 이 방법은 내피 세포 파종(연속된 세포 증식에 의존하는 부분적인 피복) 또는 세포 붙임(cell sodding)(전체적인 피복)으로 알려져 왔다. 파종(seeding)은 혈소판이 풍부한 혈장(PRP)에서 내피 세포로 보철 표면(prosthetic surface)을 미리 응고시키는 단계를 포함하는 방법을 말한다. 붙임(sodding)은, 대조적으로, 내피 세포를 미리 형성된 PRP 응고물 위에 도말하는 단계를 포함하는 방법을 말한다. 붙여진 그라프트 표면(sodded graft surface)은 전형적으로 2-단계 절차를 이용하여 제조된다. 첫째, PRP는 그라프트 상에 응고되고 유효 기간 동안 배양되고, 그 후 배양 배지로 세척된다. 둘째, 상기 PRP로 코팅된 그라프트는 내피 세포로 도말된다. 반대로, 파종된 그라프트 표면은 전형적으로 1-단계의 도말 절차를 이용하여 제조되고, 그에 따라 PRP에 직접적으로 현탁된 내피 세포는 이식 표면에 도말된다. 따라서, 붙여진 그라프트(sodded graft)에 있어서, 내피 세포는 PRP 응고물의 표면 상에(onto) 도말되는 반면에 내피 세포는 파종된 그라프트에서 상기 PRP 응고물 내에(within) 도말되어 진다. Rupnick, 등, 1989, J Vascular Surgery 9(6):788-795.
상기 배경 가설은 상당히 단순하다. 즉, 혈관 보철의 혈액 접촉 표면 상에 환자 자신의 내피 세포의 형성을 촉진함으로써, 신생혈관-내막(neo-intima)으로 함께 알려진, "정상(normal)" 내피 세포 내층(lining) 및 관련된 기저막이 상기 그라프트 상에 형성될 것이고 혈력하여 작용하여 이식 실패를 촉진하는 유체역학적, 생리학적, 및 생체물질 힘을 방해한다. 유망한 동물 데이터를 포함하는, 이러한 분야에 있어서 30년의 연구 이후에도, 이러한 단순한 가설은 아직 임상 장치를 구현하지 못하고 있다.
상기 내피 파종된 그라프트의 기능상실 모드는 미처리된 중합체성 그라프트, 즉 혈전증 및 내피 과다형성(intimal hyperplasia)과 동일하였다. 상기 실패 모드는 적어도 부분적으로, 그라프트의 루멘 표면 상의 기능성 내피 층, 신생혈관내막의 결핍 및/또는 직간접적으로 소통하는 비정상적인 내피 및 평활근 세포와 연관된다. 초기 인간 임상시험에 있어서 이들 실패에도 불구하고 파종된 그라프트(seeded graft)가 세포 내막층(cell lining)으로 발생하는 것으로 성공적으로 입증되었다. 이들 데이터는 동물 모델에서 중합체성 혈관 그라프트 루멘 표면 상의 신생혈관내막의 형성이 주위연결부(perianastomotic) 동맥, 그라프트 틈의 미세 혈관, 또는 엄밀하게는 파종된 세포로부터 유래된 것이 아닌 순환하는 선구 내피 세포(progenitor endothelial cell)로부터의 내피 세포의 증식에 의해 발생하는 것임을 나타낸다.
내피 세포 파종의 잠재적인 공급원은 미세혈관 내피 세포(microvascular endothelial cells: MVEC)이다. Williams 등은 세포 기능을 연구하기 위하여 그들의 연구실에서 신선하게 분리되고 배양된 인간, 개, 토끼, 랫트, 소 및 돼지의 내피 세포, 특히 MVEC의 개발을 선도했다. 인간 MVEC의 공급원은 미용 지방흡입물(liposuction)로부터의 흡인된 조직이었다. 인간 지방 MVEC 분리를 위하여 2가지 별개의 프로토콜(protocol)이 상기 세포 집단의 최종 용도에 따라 사용되었다. 상기 프로토콜은 분리 복잡성 면에서 만약 상기 MVEC가 뒤이어 배양된다면 더 정교한 절차에 인간 또는 동물의 이식물의 즉시 붙임(sodding)을 위한 단순하고, 수술실에 적합한 절차와는 다르다.
상기 인간 MVEC의 분리는 인간의 지방 시료를 얻기 위한 지방흡입의 사용에 의해 개선되었다. 지방흡입 캐뉼러를 통한 지방 흡입 방법에 의하면, 피하 지방을 작은 단편으로 해리시켜 상기 소화 절차의 효능을 증대시킨다. 상기 지방은 37℃에서, 20분 동안 콜라게나아제 (4 mg/cc)에 의해 소화될 수 있고, 이는 지방 그램 당 >106 세포를 배출한다. 이들 MVEC는 구배 원심분리에 의해 상기 지방으로부터 분리될 수 있다. 상기 MVEC는 펠렛을 형성할 것이고 뒤이어 상청액을 제거한 후 배양 배지에서 재현탁될 수 있다. 이들 세포에 대하여 일반적인 특성확인 과정을 수행하여 일차 분리물(primary isolate)의 세포 구성(makeup)을 결정한다. 이러한 절차를 통해 분리된 대부분의 세포는 폰 빌레브란트(von Willebrand) 항원의 발현, 중피 세포 특이적 사이토케라틴의 발현 부족, 안지오텐신 변환 효소, 프로스타시클린 및 프로스타글란딘 E2의 합성, 기저막 콜라겐의 합성 및 마이크로피노사이틱(micropinocytic) 소포의 형태적 발현에 의한 내피 세포이다.
인간에 대한 임상 시도는 말초성 바이패스(bypass)를 요구하는 환자에 있어서 내피 세포 이식을 평가하기 위해 수행되었다. 상기 시도 동안, 다량의 내피 세포는 ePTFE 그라프트의 루멘 표면 상에 직접 배치되었다. 세포 침착을 촉진하기 위해, 모든 그라프트는 자가 혈청을 포함하는 배양 배지에 미리 침지(pre-wet)되었다. 세포들은 2×105 세포/그라프트 루멘 면적cm2 의 밀도로 동일 배지에서 현탁되었다. 이 용액은 횡단-벽, 또는 경벽성 5 psi의 압력 구배를 받아 세포를 상기 표면으로 향하도록 하였다(압력 붙임(pressure sodding)이라는 방법). 기관의 승인 후, 11명의 환자들이 등록했고 실험 그라프트를 제공받았다. 수술 준비 동안, 상기 환자들은 약 50 그램의 복부벽 지방을 제거하기 위해 지방흡입을 받았다. 상기 지방은 상기 언급된 절차를 이용하여 처리되었고 그 결과 세포 집단은 의도된 그라프트 상에서 압력 붙임되고 즉시 이식되었다. 4년 이상의 경과 조사(follow-up) 후, 이들 그라프트는 복재(saphenous) 정맥 그라프트와 유사한 개통율(patency rate)을 유지했다.
(1분 미만의) 임시의 상대적으로 높은 압력(250 mmHg)을 수반하는 압력 구배는 체 작용, 즉 벌크 흐름(bulk flow)을 제공하고 상기 세포 집단보다 작은 구멍(pore)을 갖는 기질 또는 스캐폴드 물질을 사용하여, 상기 투과성 매트릭스에 세포를 포획시켜, 투과성 스캐폴드 상에 세포를 침착시키는데 사용되어 왔다(예를 들어, 미국특허 제5,628,781호; Williams 등, 1992, J Biomed Mat Res 26:103-117; Williams 등, J Biomed Mat Res 28:203-212.) 그러나, 상기 언급된 개선점에도 불구하고, 임상적인 관상(coronary) 적용가능성은 상기 혈관이 충분히 점착성이 있는 비-혈전 형성 표면을 유지하지 않기 때문에 시기가 제한되어 왔다. 연구는 인비트로로 추가 성숙 시간에 초점을 두게 되었다.
내피 세포는 비-혈전성 세포 라인을 구현하는데 매우 중요하다. 또한, 수술실 설정에 있어서 합성 그라프트 상에 내피 세포 라인을 생성하기 위한 효율적이고 신뢰할 수 있는 방법에 대한 필요성은 여전히 존재하고 당해 발명은 해결책을 제안한다. 수술실 환경에 적합하고, 무균 장벽(barrier)을 유지하고, 사용하기 쉽고, 일정한 이식 결과물을 생성하고, 비싸지 않은 기구를 사용하여 투과성 매트릭스, 스캐폴드, 또는 다른 투과성 세포 기질 물질의 내부 또는 그 위에 몇 분 또는 몇 시간 내에 신속하게 세포 부착을 달성하는 것이 바람직하다. 본 발명은 지방 조직으로부터 대량의 내피 세포의 분리, 및 합성 그라프트의 신속한 세포 붙임을 가능하게 하고, 그라프트의 신속한 붙임을 위한 턴-키(turn-key) 식의 수술실-준비 기 구에 있어서 세포의 자동제어 및 접착을 가능하게 한다. 본 발명은 이식을 위한 그라프트의 내막층 형성에 더하여 다른 적용예를 가질 수 있다.
본 발명은 다양한 세포 치료 및 조직 공학 방법을 지지하는데 사용하기 위한 장치를 제공한다. 특히, 본 발명은 세포 치료 및/또는 조직 공학에 사용하기 위해 조직 시료로부터 세포를 세척하고 분리할 수 있는 세포 분리 장치를 제공한다. 본 발명의 특정 구체예에서, 상기 세포 장치는 혈관 그라프트의 자가 내피화 및 혈관 내 장치를 지지하기 위한 붙임 장치(sodding apparatus)와 조합하여 사용될 수 있다.
일 구체예에서, 상기 세포 분리 장치는 배지 저장기; 하나 이상의 유입부 및 하나 이상의 유출부, 제1 로브(lobe) 및 제2 로브를 포함하는 세포 처리 장치; 하나 이상의 펌프; 및 유체 흐름을 변환하거나 차단하도록 구현된 하나 이상의 밸브를 포함하rh; 이들은 서로 유체 소통가능하게 연결되어 있다. 바람직한 구체예에서, 상기 세포 처리 장치는 원심분리기를 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 세포 처리 장치는 소모재(disposable)이다. 추가적인 구체예에서, 상기 세포 처리 장치는 추출 튜브 및/또는 회전하는 커플링을 더 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 회전하는 커플링은 압축된 스프레이 노즐을 더 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명의 상기 세포 분리 시스템은 구조물이 발명자에 의해 개발된 다른 시스템에서 재사용될 수 있도록 모듈식으로 설계된다. 일 구체예에서, 상기 세포 분리 장치는 세포 붙임 장치 및/또는 세포 회수 장치와 함께 사용되도록 구현된다. 일 구체예에서, 상기 장치는 전체적으로 자동화되고 예를 들어, 인간 기계 인터페이스, 전자 그래픽 디스플레이, 센서, 알람, 세포 카운팅 장치, 및 바코드 판독 장치를 포함할 수 있다. 추가적인 구체예에서, 상기 장치는 가열기, 폐기물 저장기, 또는 조직 해리 화학물 저장기를 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 상기 세포 분리 장치는 핸드헬드(handheld) 장치이다.
다른 구체예에서, 상기 장치는 예를 들어, 상기 세포 처리 장치 유입부 및 상기 조직 해리 화학물 저장기 사이에, 또는 상기 세포 처리 장치의 유출부 및 무균 세포 수집 장치 사이에 하나 이상의 여과기를 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 여과기는 100 마이크론보다 더 큰 입자를 배제하고, 다른 구체예에서, 상기 여과기는 30 마이크론보다 더 큰 입자를 배제한다. 특정 구체예에서, 상기 무균 세포 수집 장치는 주사기(syringe)이다.
본 발명에 사용되는 배지는 M199, M199E, PBS, 염수, 및 2가-양이온이 없는 DPBS(Di-Cation Free DPBS)일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 상기 배지는 M199E이다. 다른 구체예에서, 상기 조직 해리 화학물은 콜라게나아제(collagenase)이다.
또한 세포 붙임 장치와 함께 사용하기 위해 구현된 본 발명의 세포 분리 장치를 포함하고, 상기 세포 분리 장치 및 세포 붙임 장치는 내구성이 있는 인클로저(enclosure)에 포함된 것인 세포 치료에 사용하기 위한 키트가 제공된다. 일 구체예에서, 상기 키트는 하나 이상의 유체 저장기, 하나 이상의 유입부 및 유출부를 포함하는 유로(flow path) 카트리지; 하나 이상의 유입부 및 하나 이상의 유출부를 갖는 세포 처리 카트리지; 하나 이상의 유입부 및 하나 이상의 유출부를 갖는 이식 챔버로서, 이식 기질을 고정하기 위한 선택적인 이식 챔버 카트리지; 유로를 통해 흐름을 야기하도록 구성된 하나 이상의 펌프; 상기 세포 분리 카트리지로부터 상기 이식 챔버 카트리지로 흐름을 전달하도록 구현된 하나 이상의 밸브를 포함하고; 상기 유로 카트리지, 세포 분리 카트리지 및 이식 챔버 카트리지는 연속적인 유로를 형성하도록 소통하고, 상기 유로 카트리지, 세포 분리 카트리지, 및 선택적인 이식 챔버 카트리지는 상기 장치에 전력을 제공할 수 있는 모듈식 키트 인클로저와 소통한다.
일 구체예에서, 상기 유로 카트리지, 세포 처리 카트리지 및 이식 챔버 카트리지는 소모재이다. 다른 구체예에서, 상기 세포 처리 카트리지는 원심분리기를 포함한다. 상기 청구된 발명의 장치는 또한 상기 유로 카트리지와 소통하는 세포 불림기(macerator)와 함께 사용하기 위해 구현될 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 키트 인클로저는 상기 유로 카트리지, 상기 세포 처리 카트리지 및 상기 이식 챔버의 존재를 검출하기 위한 하나 이상의 센서 수단 및/또는 온도, 압력 및 유속을 모니터하고 제어하기 위한 하나 이상의 센서 수단을 포함하고, 상기 센서 수단은 알람(alarm)과 소통한다.
또한 본 발명의 장치를 사용하여 조직 그라프트를 제조하는 방법은 부착 세포를 포함하는 배지가 상기 이식 챔버에 도입되고, 상기 세포를 상기 기질에 부착시키기 위해 충분한 시간 동안 상기 기질 사이에 상기 배지의 지속된 낮은 압력의 경벽(transmural) 흐름이 제공되는 것으로 제공된다. 특정 구체예에서, 상기 부착 세포는 지방 조직으로부터 유래된 미세혈관 내피 세포이다. 다른 구체예에서, 상기 내피 세포는 환자로부터 획득되어 본 발명의 장치에 의해 처리된다.
또한, 본 발명의 장치에 의해 제조되는 세포 현탁물을 상기 조직 또는 기관에 주입함으로써 개체 내 조직 또는 기관을 재생하기 위한 방법이 또한 제공된다. 본 발명의 장치에 의해 제조된 하나 이상의 세포 현탁물을 상기 조직 또는 기관에 주입함으로써 그를 필요로 하는 개체의 조직 또는 기관의 상처를 치료하고 부착 형성을 방지하기 위한 방법이 또한 제공된다.
또한 본 발명은 짧은 기간에 임상 용도로 사용하는 적절한 그라프트 상에 세포를 형성하기 위한 자동화, 무균성 및 안전한 방법 및 장치뿐만 아니라, 치료용으로 적절한 세포 시료를 수집하기 위한 방법 및 장치를 제공한다. 또한 본 발명은 질병의 치료 및 예방뿐만 아니라 조직 및 기관의 혈관재생(revascularization), 재생성 및 재구성을 포함하는 다수의 치료에 있어서 본 명세서에 기재된 장치에 의해 제조된 조직 그라프트 및 세포 시료를 사용하는 방법을 제공한다.
도 1은 일 구체예의 세포 분리 장치의 시스템 유로를 도시하는 도면이다.
도 2a는 본 발명의 일 구체예에 따른 스프레이 노즐 부재 및 내부 및 외부 카트리지 용기를 포함하는 세포 분리 장치의 처리 장치의 횡단면을 도시하고, 도 2b는 본 발명의 일 구체예에 따른 세포 처리 장치의 투시도를 제공하고, 및 도 2c 내지 도 2f는 본 발명의 일 구체예에 따라 상기 처리 장치를 상기 세포 분리 장치에 연결하는 트위스트 잠금(twist locking) 메카니즘을 도시한다.
도 3a는 인간-기계 인터페이스, 세포 처리 장치(원심분리기), 튜브 카세트, 배지 백(bag), 주사기 펌프, 핀치 밸브, 수집 주사기 및 바코드 스캐너를 포함하는 본 발명의 세포 분리 장치의 일 구체예에 따른 투시도를 제공하고, 도 3b는 본 발명의 다른 구체예에 따른 세포 분리 장치의 투시도를 제공하며, 도 3c는 본 발명의 일 구체예에 따른 세포 분리 장치의 배면도를 제공한다.
도 4는 본 발명의 일 구체예에 따른 임상 (OR) 키트 유입부를 도시하는 도면이다.
도 5는 본 발명의 일 구체예에 따른 임상 (OR) 키트의 유로를 도시하는 도면이다.
도 6은 본 발명의 일 구체예에 따른 그라프트 붙임 모듈(graft sodding module)을 도시한다.
도 7은 본 발명의 일 구체예에 다른 세포 수집 모듈을 도시한다.
도 8은 본 발명의 일 구체예에 따른 사용을 위해 적재된 소모재 부품을 갖는 세포 분리 모듈에 연결된 세포 수집 모듈 내구재(durable)의 투시도이다.
도 9a는 본 발명의 일 구체예에 따른 제트 스프레이 노즐 및 회전하는 커플링을 도시하고, 도 9b는 본 발명의 일 구체예에 따른 원심분리 용기의 하나의 노브에 정렬된 스프레이 노즐 부재를 도시한다.
도 10a는 본 발명의 일 구체예에 따른 핀치 밸브 매니폴드 랙크(manifold rack)의 투시도를 제공하고; 도 10b는 본 발명의 일 구체예에 따른 상기 핀치 밸브 매니폴드 랙크의 튜빙(tubing) 랙크의 투시도를 제공하고; 도 10c는 본 발명의 일 구체예에 따른 상기 핀치 밸브 매니폴드 랙크의 튜빙 랙크의 횡단면도를 제공하고; 및 도 10d는 본 발명의 일 구체예에 따른 상기 핀치 밸브 매니폴드 랙크의 측면도를 제공한다.
본 발명의 구체예들은 본 명세서에서 세포 치료 및 조직 공학 방법을 지지하는데 사용하기 위한 장치의 내용을 설명된다. 당업자들은 이하 본 발명의 상세한 설명이 단지 예시적인 것이고 어떠한 방식으로도 제한하는 것으로 의도되지 않는다는 것을 이해할 것이다. 본 발명의 다른 구체예들은 이러한 개시의 이익을 갖는 당업자들에게 그 자체를 쉽게 제안할 것이다. 첨부된 도면에 도시된 것과 같은 본 발명의 구현예(implementations)를 상세하게 설명하기 위하여 참조가 이루어질 것이다. 동일한 참조 지시자는 도면 및 이하 상세한 설명에 걸쳐 동일한 부분 또는 유사한 부분을 참조하기 위해 사용될 것이다.
명확하게 하기 위하여, 본 명세서에 기재된 구현예의 모든 일반적 특징이 나타나거나 설명되는 것은 아니다. 물론, 임의의 그러한 실제 구현예의 개발에 있어서, 수많은 구현예-특이적인 결정이 적용과 관련된 제한요소와 같은, 개발자의 특정한 목적을 이루기 위해 만들어질 것이고, 이들 특정한 목적은 하나의 구현예로부터 다른 구현예 및 일 개발자로부터 다른 개발자까지 다양할 것이라는 것은 이해될 것이다. 게다가, 그러한 개발 노력은 복잡하고 시간을 소모할 수 있으나, 그럼에도 불구하고 당해 개시의 이익을 갖는 분야에서 당업자에게 공학의 일반적인 업무가 될 것이다.
본 개시에 따르면, 본 명세서에 기재된 구성요소 및 방법의 단계는 다양한 유형의 운영 체제, 컴퓨터 플랫폼, 컴퓨터 프로그램, 및/또는 범용 기계를 사용하여 구현될 수 있다. 또한, 당업자는 또한, 하드와이어드 장치(hardwired device), 필드 프로그래머블 게이트 어레이(FPGAs), 적용 특이적 집적 회로(ASICs) 등과 같은, 더 낮은 범용 환경의 장치가 본 명세서에 개시된 발명 개념의 보호범위 및 사상으로부터 벗어남 없이 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다.
본 발명은 다양한 세포 치료 및 조직 공학 방법을 지지하는데 사용하기 위한 장치를 제공한다. 세포 치료(cell therapy), 세포성 치료(cellular therapy), 또는 세포-기반 치료(cell-based therapy)는 병들거나 또는 손상된 조직 및/또는 세포의 대체 또는 복구하기 위한, 또는 질병 또는 장애를 치료 또는 예방하기 위한 인간 또는 동물 세포의 사용을 말한다.
특히, 본 발명은 세포 치료 및/또는 조직 공학에 사용되기 위한 조직 시료로부터 세포를 소화, 세척, 및 분리할 수 있는 세포 분리 장치를 제공한다. 본 명세서에서 사용되는 것과 같이, "세포 세척(cell rinsing)"은 지방/콜라게나아제 혼합물로부터 분리된 세포를 재현탁하기 위해 추가적인 유체를 사용하는 방법을 말한다. 그 후 상기 재현탁된 세포는 상기 세포 생성물(MVECs)을 정제하기 위해 원심분리를 통해 제2 분리 방법을 수행할 수 있다. 이러한 세척 방법은 예를 들어, 적혈구 세포, 콜라게나아제 및 단백질과 같은 소화 부산물의 농도를 감소시킨다.
본 발명의 특정 구체예에서, 상기 세포 분리 장치는 혈관 그라프트의 자가 내피화를 지지하기 위해 붙임 장치와 조합하여 사용될 수 있다.
세포 분리 장치( Cell Separation Apparatus )
본 발명의 일 구체예에서, 상기 세포 분리 모듈 또는 세포 분리 장치는 지방 조직을 절단, 가열, 소화, 및 분리하기 위한 모든 필요한 전자장치 및 구조물을 포함하는 독립형(stand-alone piece) 기기이다. 바람직한 구체예에서, 상기 세포 분리 성분은 원심분리기를 포함한다. 상기 세포 분리 모듈의 유출부는 분리된 세포의 단일 세포 현탁물을 연결된 상기 이식 붙임 모듈, 세포 수집 모듈, 또는 다른 모듈에 공급한다. 도 3은 인간-기계 인터페이스, 세포 처리 장치(원심분리기), 튜브 카세트, 배지 백, 주사기 펌프 핀치 밸브, 수집 주사기 및 바코드 스캐너를 포함하는 상기 세포 분리 모듈의 내구성이 있고 소모성이 있는 구조물을 나타낸다.
일 구체예에서, 상기 세포 분리 장치 내구재 유닛은 컴퓨터 보드, 소프트웨어, 전력 공급기, 및 사용자 인터페이스를 포함하는, 상기 장치의 작동을 위해 필요한 모든 전자장치를 수용한다. 바람직한 구체예에서, 상기 사용자 인터페이스는 상기 장치의 설정(set-up) 및 작동을 통해 상기 사용자를 안내하는 버튼을 갖는 LCD 스크린을 포함한다. 또한 상기 세포 분리 모듈 내구재는 상기 필요한 핀치 밸브, 모터, 센서 및 상기 개체 조직의 절단, 가열, 소화, 및 원심분리를 위해 요구되는 다른 내구재를 수용할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 상기 개체 조직은 지방 조직이다. 핀치 밸브는 밸브가 상기 소모성 유체 경로에 맞물리게 하기 위해 상부 평면 상에서 상기 인클로저로부터 돌출한다. 바람직한 구체예에서, 전자장치는 임의의 유체 경로로부터 최대 거리에 위치된다.
다른 구체예에서, 상기 장치는 배지 및 폐기물 백을 걸기 위한 장착가능한 고리를 포함한다. 바람직하게는, 상기 백 고리는 상기 세포 분리 내구재에 수용된 상기 배지 백과 전자장치 사이의 거리를 최대로 하기 위해 상기 이식 붙임 내구재 또는 상기 세포 수집 내구재에 장착된다. 이러한 분리는 유체 흘림으로부터 전자장치의 고장 위험을 감소시킨다.
본 발명의 특정 구체예에서, 상기 세포 분리 모듈 유로의 모든 구성요소는 소모성이다. 일 구체예에서, 이들 소모성 성분은 상기 세포 분리 모듈 내구재 상으로 적재된 경질 트레이 상에서 조립될 수 있다. 상기 사용자는 상기 핀치 밸브를 상기 소모성 트레이의 밸브 컷아웃(cutout)에 따라 배열함으로써 상기 내구재의 평평한 표면에 상기 트레이를 위치시켜 상기 소모성 트레이를 적재한다. 그 후 상기 사용자는 상기 트레이를 전방으로 미끄러지게 하여 상기 핀치 밸브 내에 튜빙 루프(tubing loop)를 맞물리게 하고 상기 소모성 트레이를 제자리에 고정시킨다. 모든 소모성 구조물은 상기 트레이 내에 위치되어 이러한 적재 동작에 의해 상기 세포 분리 내구재에서 상기 필요한 내구재 구조물과 배열되어 맞물리게 된다. 상기 트레이 디자인은 많은 튜빙 연결 및 많은 소모성 구조물의 개별적인 적재에 대한 요구 조건을 제거함으로써 설정 및 처분에 관한 상기 사용자의 부담을 최소화한다. 상기 트레이를 적재한 후, 상기 사용자는 상기 소모성 원심분리기 용기를 상기 내구재 구조물에 제공된 오목부(recess)에 적재할 수 있고 유입부 및 유출부 튜빙을 상기 소모성 트레이로부터 상기 원심분리기, 배지 백, 폐기물 백, 및 붙임 또는 수집 유닛에 붙일 수 있다.
상기 세포 처리 장치의 원심분리 용기와 상기 유체 경로 사이의 상호 작용을 포함하는, 상기 세포 처리 장치를 위한 상기 유체 경로(유로)의 도면은 도 1에 도 시된다. 상기 세포 처리 장치의 원심분리 용기와 유체 경로는 도 2에 도시된다.
유체 튜빙 매트릭스, 유체(예를 들어, PBS 및/또는 혈청)의 백, 폐기물 백 및 S2의 주사기는 세포 분리 유닛으로 적재된다. 상기 원심분리 용기(Centrifuge Bowl) 및 회전하는 커플링(Rotating Coupling)과 함께 이들 아이템은 상기 장치를 위한 소모품(consumable)을 포함한다. 일 구체예에서, 도 1의 밸브들은 핀치 밸브이고 상기 튜빙 매트릭스 내에 튜빙을 핀치함으로써 흐름을 차단한다. 도 10a 내지 10d는 본 발명의 일 구체예에 따른 핀치 밸브 매니폴드 랙크(manifold rack)를 도시한다. 바람직하게는, 상기 밸브는 상기 내구재 기기의 부분이고 상기 유체와 직접 접촉하지는 않는다. 일 구체예에서, 상기 장치는 약 60 ㎖의 지방 조직 및 60 ㎖의 콜라게나아제 용액을 고정하고 처리하도록 설계된다.
상기 세포 처리 장치의 원심분리 용기는 도 2a 및 9b에 도시된 것과 같은 내부 용기 및 외부 용기로 구성된 로브를 갖는(lobed), 두 개의 챔버 구성이다. 상기 외부 용기는 상기 세포 분리 과정 동안 소비된 지방을 저장하기 위한 오버플로우 챔버(overflow chamber)로서 주로 사용된다. 상기 본 발명의 원심분리 용기의 신규한 디자인은 최적화된 이중 기능성을 제공한다. 예를 들어, 상기 용기의 내부 챔버는 충분하게 정제된 세포 펠렛의 포획을 최적화하는 분리 구역(즉, 상기 내부 용기의 로브)뿐만 아니라, 본 명세서에 개시된 상기 세포 처리 방법의 소화 단계에서 사용되는 혼합 영역을 제공하도록 구현된다.
본 발명의 내부 용기의 로브는 내피 세포의 수집을 최적화하고 예를 들어, 적혈구 세포 및 다른 세포 단편(fragment)과 같은, 비-내피 세포 물질의 수집을 최 소화하도록 특별히 구현된다. 도 2 및 9b 참조. 본 발명의 추가적인 구체예에서, 도 2a 내지 2f에 나타낸 바와 같이, 상기 원심분리 용기는 상기 원심분리 용기를 상기 세포 분리 장치에 신속하고 효율적으로 연결하고 연결해제하기 위하여 이용될 수 있는 트위스트 잠금 커플링 부재(twist lock coupling member)를 포함한다.
제한적이지 않는 실시예에 의한 도 1에 따르면, 지방 조직(지방)은 주사기로부터 상기 원심분리 용기로 수동으로 밀린다. 그 후 상기 용기는 그것을 보호하기 위한 트위스트 잠금 커플링을 이용하는 구동 기작 상으로 상기 세포 처리 장치 내로 수동으로 적재된다. 그 후 원심분리 용기 뚜껑은 폐쇄되고 상기 챔버 내에서 순환하는 뜨거운 공기가 이를 37 ℃로 보온한다.
차가운(약 2 ℃) 콜라게나아제 용액으로 채워진 60 ㎖ 주사기는 상기 주사기 드라이버 S1에 적재된다. 상기 주사기 드라이브에 내장된 가열 성분은 상기 용액을 약 15분 이내에 약 37 ℃로 가열한다. 상기 콜라게나아제 용액이 약 37 ℃로 가열된 후, 상기 S1의 주사기 드라이버는 활성화되고 콜라게나아제 용액은 밸브(V7)를 통해 상기 원심분리 용기로 밀려 들어가고, 반면에 밸브(V8)는 100 ㎛ 여과기(F)를 통한 흐름을 차단하기 위해 폐쇄된다. 상기 원심분리 용기 드라이브 기작(모터)은 상기 콜라게나아제가 상기 지방 조직을 "소화(digest)"시킬 수 있도록 충분하게 많은 시간 동안 상기 용기를 진동시킨다. 바람직한 구체예에서, 상기 콜라게나아제가 상기 지방 조직을 소화시킬 수 있는 충분한 시간은 약 30 분이다.
그 후 섬유 조직은 상기 소화된 물질로부터 제거된다. 상기 주사기 펌프(S1)는 밸브(V8)를 경유하여 50 ㎖의 유체를 되돌린다. 상기 섬유 조직은 이들 두 개의 밸브들 사이의 상기 여과기(F)에 의해 수집된다. 일 구체예에서, 상기 여과기는 100 ㎛ 크기보다 더 큰 물질을 배제한다. 상기 주사기(S1)는 유체의 제1 절반을 일시적으로 (이 단계에서 고유한) 폐기물 탱크로 민다. 제2 당김은 상기 원심분리 용기 및 여과기로부터 모든 물질을 비우는 것을 완료하기 위해 사용된다. 그 후 상기 밸브들은 정렬하여 상기 여과된 물질을 밸브(V7)을 경유하여 상기 용기로 밀어낸다. 일 구체예에서, 상기 유체의 제2 절반은 상기 주사기 펌프로부터 바로 오며 상기 제1 절반은 상기 폐기물 백으로부터 상기 S1 주사기로 유입되고 그 후 상기 원심분리 용기로 되돌아 밀려 들어간다.
그 후 상기 원심분리 용기는 약 5분 동안 약 3100 RPM으로 회전된다. 원심분리 동안, 상기 내피 세포는 상기 소화된 물질로부터 분리되고 상기 원심분리 용기의 2개의 로브에 침적된다. 상기 세포는 상기 로브들에 "채워질(pack)" 수 있고 분리 수단을 경유하여 그것들이 외부로 밀려나올 때까지 상기 로브들에 남아 있는다.
상기 원심분리 용기가 여전히 약 3100 RPM으로 회전하는 동안 추가적인 M199E 유체는 S2로부터 밸브(V2)를 경유하여 상기 용기로 밀려진다. 상기 회전 운동과 조합된 이 유체는 저밀도 지방 세포(less dense fat cell)를 상기 용기의 중앙으로 이동시킨다. 하나 이상의 좁은(notch) 개구부는 지방이 상기 내부 용기의 원심력 작용을 통해 상기 내부 용기로부터 상기 외부 챔버로 전달되는 상기 원심분리 용기의 상단중심 근처에 위치된다. 이는 상기 내부 용기로부터 소비된 많은 지방 조직을 효율적으로 제거한다. 도 2를 참조.
상기 원심분리 용기는 정지되고 상기 콜라게나아제/M199E 혼합물은 상기 내 부 용기의 바닥에 가라앉는다. 소비된 유체는 그 후 밸브들(V7 및 V9)을 경유하여 주사기 펌프(S1)을 이용하여 폐기 챔버로 보내진다.
신선한 배지 M199E는 밸브(V2)를 경유하여 상기 용기에 첨가된다. 약한 회전을 수행하여 상기 용기를 "세척(rinse)"한다. 이 유체는 그 후 밸브들(V8 및 V9)을 경유하여 주사기 펌프(S1)을 이용하여 폐기 챔버로 보내진다.
상기 용기가 비워지고 세척되는 동안, 상기 원심분리 로브에 여전히 위치된 세포 펠렛은 회전하는(또는 회전성) 커플링 및 튜빙을 통해 이동된 유체를 통해 상기 내부 용기로 되밀린다. 본 발명의 일 구체예에 따른 상기 회전하는 커플링은 도 2에 도시된다. 특정 일 구체예에서, 상기 회전하는 커플링은 상기 원심분리 용기의 내부 챔버로부터 액체를 첨가 및/또는 제거하는데 사용하기 위한 하나 이상의 이송 튜브를 포함한다. 일 구체예에서, 상기 회전하는 커플링은 상기 원심분리의 내부 챔버에 액체를 첨가하기 위한 이송 튜브, 및 상기 원심분리의 내부 챔버로부터 액체를 제거하기 위한 다른 이송 튜브를 포함한다.
본 발명의 다른 특정 구체예에 따르면, 상기 원심분리기 로브에 위치된 세포 펠렛은 노즐 부재로부터 도입된 유체의 압축된 제트(제트 스프레이)를 이용하여 노즐 상기 로브로부터 흘려진다(flushed). 특정 구체예에서, 상기 노즐 부재는 상기 노즐과 함께 사용하도록 특이적으로 구현된 회전하는 커플링과 소통한다. 도 9는 본 발명의 특정 일 구체예에 따른 상기 제트 스프레이 노즐 및 상기 회전하는 커플링을 도시한다. 도 9b는 상기 원심분리 용기에 배열된 상기 회전하는 커플링 및 제트 스프레이 노즐을 추가로 도시한다.
제한되지 않는 실시예에 의하면, 상기 제트 스프레이 노즐은 상기 원심분리 로브 내로 "충진된(packed)" 또는 적재된(lodged) 세포 펠렛에 충돌하는 유체를 방출한다. 상기 세포 펠렛은 분해되거나 및/또는 상기 로브로부터 이탈되어 지고(dislodged) 유체 및 세포 펠렛 물질은 중력에 의해 상기 원심분리 용기의 바닥으로 이동한다. 일 구체예에서, 상기 제트 스프레이 노즐은 그 위치를 고정하기 위해 상기 세포 처리 장치에서 지지체 구조와 정렬된다(예를 들어, 도 9b를 참조). 바람직한 일 구체예에서, 상기 원심분리 모터는 컴퓨터에 의해 제어되고 상기 원심분리 용기의 위치를 나타내도록 구현된다. 따라서, 상기 모터는 상기 원심분리 용기의 각각의 로브를 상기 제트 스프레이 노즐과 정렬시키기 위하여 상기 원심분리 용기를 회전시킬 수 있다. 예를 들어, 제1 로브가 흘러내린 후, 상기 원심분리 용기는 180도로 회전하고 상기 제트 노즐은 제2 로브를 흘러내리도록 활성화된다. 따라서, 상기 제트 스프레이 노즐은 상기 원심분리 용기의 각각의 로브 내에서 상기 세포 펠렛을 효율적으로 이탈시킬 수 있다.
이 목적을 위해 사용된 상기 유체는 생리학적 pH에서 생리학적 농도의 염화나트륨을 갖는 유체일 수 있다. 바람직한 일 구체예에서, 이 목적을 위해 사용된 상기 유체는 각각, M199E와 혈청의 비율이 6:1이다. 혈청은 상기 세포 생성물 내의 임의의 잔류 콜라게나아제를 불활성화하는데 사용된다. 약 1 ㎖의 세포 물질 및 10 ㎖의 M199E/혈청 혼합물은 현재 상기 내부 용기의 바닥에 존재한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 원심분리 로브는 특정 세포 집단을 농축시키거나 또는 선택하기 위해 원심력을 이용할 수 있는 하나 이상의 선택적인 여과 장 치를 포함하도록 구현된다. 일 구체예에서, 상기 선택적 여과 장치(들)는 원하는 농도 또는 세포 집단을 회수하기 위해 상기 제트 스프레이 노즐과 바람직한 정렬이 제공될 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 세포 분리 장치는 상기 원하는 세포를 선택하고 포획할 수 있고, 임의의 초과 배지를 다른 경로로 돌릴(rerouting) 수 있으며, 상기 원하는 세포를 원하는 세포/㎖ 농도로 수집할 수 있도록 하는, 상기 수집 모듈의 상류에 하나 이상의 선택적인 여과기를 포함하도록 구현될 수 있다. 다른 구체예에서, 본 발명의 세포 분리 장치는 알려진 광학 밀도 또는 구멍 전기적 자극 기술(orifice electrical stimulation technology)을 이용하는 기술을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 세포 카운팅 및/또는 세포 분류 장치를 포함할 수 있다.
본 발명의 세포 분리 장치에 의해 처리되는 세포는 예를 들어, 섬유아세포, 평활근 세포, 혈관주위 세포, 대식세포, 단핵세포, 형질세포, 지방세포, 지방 세포, 조직-특이적 실질 세포, 내피 세포, 요로상피 세포(urothelial cell), 지방 유래 줄기세포 및 다양한 조직 공급원으로부터 분화되지 않은 성숙한 줄기 세포를 포함하는, 조직 공학 적용 및 세포 치료에서 대면하는 다양한 다른 세포 유형을 포함할 수 있다. Mitchell, JB. 등, Immunophenotype of Human Adipose-Derived Cells: Temporal Changes in Stromal-Associated and Stem Cell-Associated Markers, Stem Cells 2006, 24:376-385; Mclntosh K. 등, The Immunogenicity of Human Adipose-Derived Cells: Temporal Changes In Vitro, Stem Cells 2006, 24:1246-1253; Kern S. 등, Comparative Analysis of Mesenchymal Stem Cells from Bone marrow, Umbilical Cord Blood, or Adipose Tissue, Stem Cells 2006, 1294-1201. 바람직한 일 구체예에서, 상기 세포는 그들 전체로서 참조에 의해 본 명세서에 포함되는 (1989년 4월 11일에 발행된, Williams 등에 의한) 미국특허 제4,820,626호, (1993년 7월 27일에 발행된, Williams 등에 의한) 미국특허 제5,230,693호, 및 (1997년 5월 13일에 발행된, Williams 등에 의한) 미국특허 제5,628,781호에서 참조된 것과 같은 내피 세포, 더 바람직하게는 자가 미세혈관이 풍부한 지방 조직으로부터 얻어진 인간 미세혈관내피 세포이다. 상기 부착 세포는 자가(autologous), 동종(allogeneic), 또는 이종(xenogeneic)일 수 있으나, 바람직하게는 기원이 자가이다.
이식 붙임 모듈( Graft Sodding Module )
본 발명의 세포 분리 장치는 성분들(components)이 다른 장치 및 시스템과 사용 및 재-사용될 수 있는 모듈식으로 설계된다. 일 구체예에서, 상기 세포 분리 장치는 세포 붙임 장치 또는 이식 붙임 모듈과 사용하기 위해 구현된다. 상기 이식 붙임 모듈은 압력 붙임 기술을 사용하여 상기 세포 분리 유닛에 의해 제공되는 세포를 다공성 이식 스캐폴드 상에 적용하는데 필요한 내구성이 있고 소모성인 성분을 말한다. 상기 이식 붙임 모듈 내구재 및 소모성 성분은 도 6에 도시된다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 붙임 모듈은 2개의 내구재 성분: 즉 상기 붙임 유닛 내구재 및 상기 이식 챔버 내구재를 포함한다. 이들 내구성이 있는 성분은 물리적으로 상기 세포 분리 내구재와 합쳐져 전력 및 소통 연결을 제공한다. 본 발명의 다른 구체예에서, 상기 붙임 모듈 내구재는 상기 세포 분리 모듈 내구재 내에서 전자장치에 의해 제어된다. 상기 이식 챔버 내구재는 상기 소모성 그라프트를 위한 안전한 장착을 제공하고, 상기 챔버를 가열하기 위해 필요한 성분들을 수용한다. 상기 붙임 내구재는 상기 압력 붙임 적용에 필요한 것과 같은 상기 이식 챔버를 통한 흐름을 조정하는데 특이적으로 요구되는 하드웨어(예를 들어, 핀치 밸브, 센서)를 포함한다. 일 구체예에서, 상기 붙임 내구재는 상기 붙임 소모재가 적재될 수 있는 돌출부 내구재 기기를 갖는 상단 평평한 표면을 갖는다. 도 6은 상기 이식 붙임 내구재 및 소모성 성분 내의 주된 성분들을 도시한다.
추가적인 구체예에서, 붙임 소모성 성분은 상기 소모성 이식 챔버 및 붙임 소모성 트레이를 포함한다. 상기 스캐폴드 또는 다른 기질 물질은 전형적으로 상기 소모성 이식 챔버 내에 미리 적재되고, 이는 주변과의 모든 다른 기체, 액체, 및 고체 물질의 교환을 차단하는 반면 상기 그라프트에 액체의 전달을 위한 봉인된 환경을 제공한다. 일 구체예에서, 상기 이식 챔버의 3개의 포트는 상기 이식 챔버로부터 유입부, 경층 유출부, 및 루멘의 유출부를 제공하기 위해 상기 붙임 소모성 트레이로부터 튜빙에 의해 연결된다. 일 구체예에서, 상기 이식 챔버는 상기 붙임 동작 동안 상기 챔버를 둘러싸는 폐쇄 문을 갖는 상기 챔버 내구재 내부에 놓여진다.
일 구체예에서, 상기 붙임 소모성 경질 트레이는 상기 붙임 동작에 요구되는 모든 소모성 성분 및 연결 물질을 포함한다. 상기 트레이는 상기 소모성 트레이 내에 상기 밸브 컷아웃에 의해 상기 핀치 밸브를 정렬하고 전방으로 미끄러져 상기 핀치 밸브 내에 튜빙을 결합시킴으로써 상기 붙임 내구재의 평평한 표면 상에 적재된다. 상기 사용자는 상기 세포 분리 소모성 물질, 붙임 소모성 물질, 및 이식 챔 버 소모성 물질을 연결하여 붙임을 위한 완전한 유로를 형성한다.
상기 분리 및 붙임 배지는 DMEM, F12, α-MEM, 위스콘신 대학의 용액(University of Wisconsin Solution) 등, 또는 그의 임의의 조합을 포함하는 상업적으로 이용할 수 있는, 헤파린 또는 원하는 세포 타입에 적합하게 하는 다른 요소를 포함할 수 있는 추가적인 요소가 있거나 또는 없는, 배지일 수 있다.
수집 모듈( Collection Module )
본 발명의 일 구체예에서, 상기 세포 분리 장치는 또한 수집 모듈 또는 수집 장치와 기능하도록 설계된다. 상기 수집 모듈 또는 수집 장치는 세포 치료에 사용하기 위한 주사기 내에 상기 세포 분리 유닛으로부터 세포를 수집하는데 필요한 내구성이 있고 소모성 성분을 말한다. 상기 세포 수집 모듈 내구재 및 소모성 성분은 도 7에 도시된다. 도 8은 사용을 위해 적재된 소모성 성분을 갖는 상기 세포 분리 모듈에 연결된 상기 세포 수집 모듈 내구재를 나타낸다. 일 구체예에서, 상기 수집 모듈 내구재는 물리적으로 상기 세포 분리 유닛과 결합되어 있어(mates with) 전력 및 소통 연결을 제공한다. 상기 수집 내구재는 상기 세포 분리 유닛 내에 생성된 상기 세포 생성물을 자동으로 수집하기 위해 주사기와 접촉하는 선형 작동기(linear actuator)를 수용한다.
다른 구체예에서, 상기 수집 유닛의 상기 소모성 성분은 상기 세포 생성물을 수집하는 주사기이다. 상기 주사기는 수집 유닛 내구재 상에 클립(clip)에 의해 고정 장착된다. 상기 주사기의 상단(top)은 상기 주사기 플런저(plunger)가 상기 작동기의 움직임에 의해 당겨질 수 있도록 상기 내구재 내로 적재된다. 상기 사용자 는 상기 세포 분리 모듈로부터의 상기 유출부 튜브를 상기 주사기의 팁(tip)에 연결한다.
상기 현탁된 세포 생성물은 V8을 통해 주사기(S0)로 제거되고 그 후 상기 세포 생성물은 V5에 부착된 무균 용기(도시되지 않음)로 보내진다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 무균 용기는 주사기이다. 추가적인 일 구체예에서, 제2 여과기는 전형적으로 30 마이크론보다 더 큰 입자를 제거 및 잔류하기 위해 밸브(V5)와 상기 용기 사이에서 사용될 것이다.
임상 ( OR ) 키트 시스템의 개요
본 발명의 임상 키트 또는 수술실(OR) 키트는 지방 조직이 다공성 혈관 이식 스캐폴드 상에서 소화, 분리, 및 가압 붙임될 수 있는 무균 유로를 제공한다. 또한 상기 시스템은 상기 압력 붙임 작동을 위해 그를 준비시키도록 하기 위해 상기 이식 스캐폴드를 미리 처리할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 유로는 내구성이 있는 임상 (OR) 키트 시스템 인클로저와 서로 맞물리는(interlock) 3개의 소모성 카트리지를 포함한다. 상기 소모성 카트리지는 유체 저장기를 갖는 유로 카트리지, 본 발명의 세포 분리 장치를 포함하는 소모성 원심분리 카트리지, 및 이식 스캐폴드가 미리 적재된 소모성 이식 챔버를 포함한다. 상기 임상 (OR) 키트 시스템은 작동하기 위한 전력만을 요구하는 자립형(self-contained), 독립형(stand-alone) 시스템이다.
본 발명의 시스템은 최소한의 조작자 상호작용(operator interaction)을 요구하도록 설계된다. 미리 적재된 이식 스캐폴드를 갖는 상기 무균 이식 챔버, 유로 카트리지, 및 원심분리 카트리지는 상기 임상 (OR) 키트 내로 적재될 수 있다. 상기 유로 카트리지는 예를 들어, M199, M199E, PBS, 염수, 및 2가-양이온이 없는 DPBS(Di-Cation Free DPBS)일 수 있는 배지가 미리 적재될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 상기 배지는 M199E이다.
그 후 상기 조작자는 병원 약국에서 재구성된 콜라게나아제, 환자의 혈액으로부터 분리된 혈청 및 환자의 지방 조직을 적절한 주입 포트를 통해 상기 원심분리기 및 유로 카트리지로 주입할 수 있다. 이 시스템 설정을 완료한 후, 상기 조작자는 상기 임상 (OR) 키트 상에 LCD 인터페이스를 이용하여 붙임 작동(sodding operation)을 개시할 수 있다. 상기 조작자로부터 추가적인 상호작용이 없이, 상기 임상 (OR) 키트는 M199E/혈청 용액을 제조하고, 상기 그라프트를 미리 처리하고, 외부에서 제조된 콜라게나아제/PBS 용액을 이용하여 지방 조직을 소화시키고, 표적 세포를 분리하기 위한 원심분리하고, 상기 표적 세포를 상기 다공성 이식 스캐폴드에 가압 붙임하고, 상기 이식 루멘으로부터 초과 세포를 제거하고, M199E/혈청 용액을 상기 붙여진 그라프트에 재순환시키고, 회수를 위해 상기 그라프트로 흐름을 분리하는데 필요한 모든 작동을 자동으로 수행할 것이다. 도 7은 상기 이식 처리 작동을 위한 상기 임상 (OR) 키트 내구재 인클로저로의 상기 입력을 도시한다.
상기 상정된 임상 (OR) 키트 시스템의 성분들은 임상 (OR) 키트 인클로저, 정면 패널 디스플레이(FPD), 임상 (OR) 키트 유로 카트리지, 미리 적재된 스캐폴드를 갖는 이식 챔버, 메인 컨트롤러 보드(MCB), 아날로그 보드, 원심분리기, 하나 이상의 펌프, 유체 분배 시스템, 다양한 센서 및 알람, 및 세포 카운터를 포함하 나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 임상 (OR) 키트 인클로저는 상기 임상 (OR) 키트에 전력을 공급하고 기계적 안정성을 제공하는 상기 임상 (OR) 키트를 위한 기계적 플랫폼을 말한다. 상기 인클로저는 전력을 위한 유입 케이블 연결을 허용한다. 특정 일 구체예에서, 또한 이 인클로저는 모터, 핀치 밸브, 정면 패널 디스플레이 및 센서를 포함하는 기기를 위한 모든 내구성이 있는 성분을 수용한다.
상기 정면 패널 디스플레이(Front Panel Display, FPD)는 사용자-친화적 그래픽 LCD 디스플레이를 제공한다. 상기 FPD 상의 스크린은 상기 조작자가 수술실(OR) 내부 또는 인접하여 압력 붙임 작동을 완수하기 위해 필요한 모든 기능을 수행하게 한다. 상기 조작자는 언제든지 이식 처리 작동을 개시하고 상기 이식 제조물의 상태를 볼 수 있지만, 상기 붙여진 그라프트의 품질에 영향을 줄 수 있는 파라미터의 변화로부터 제한된다.
상기 유로 카트리지는 유체가 상기 시스템을 통해 흐르는 소모성, 자립형 엔티티(entity)를 말한다. 도 3은 상기 유로 카트리지를 통한 상기 경로의 개념도를 제공한다. 상기 유로 카트리지는 공급(feed) 및 수급(sump)을 위한 흐름 회로, 펌프 소모재, 및 유체 저장기를 포함한다. 상기 유로 카트리지는 상기 세포 처리 또는 원심분리 카트리지 및 수술실에서 압력 붙임을 위한 그라프트를 수용하는 이식 챔버와 결합한다. 상기 유로 카트리지는 물리적으로 상기 인클로저와 결합한다. 대안적인 일 구체예에서, 상기 소모성 세포 처리 카트리지는 상기 유로 카트리지의 일부로서 포함될 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 펌프 소모재는 상기 유로 카트리 지로부터 분리되어 있다.
상기 이식 챔버는 상기 이식 처리 작동을 위한 이식 스캐폴드를 수용한다. 상기 스캐폴드는 상기 이식 챔버에 미리 적재되고, 이는 주변과의 다른 모든 기체, 액체, 및 고체 물질의 교환을 억제하는 반면 액체를 상기 그라프트에 전달하기 위한 밀봉된 환경을 제공한다. 본 발명에 사용된 이식 기질("스캐폴드(scaffold)") 물질은 다양한 크기 및 형상을 갖는 임의의 바람직한 투과성 물질일 수 있다. 상기 물질은 폴리에틸렌테라탈레이트(polyethyleneterathalate), 폴리우레탄, 또는 확장된 폴리테트라플루오로에틸렌(ePTFE)를 포함하나, 이에 제한되지 않는, 천연 또는 합성 물질일 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 이식 스캐폴드는 콜라겐과 같은, 생중합체일 수 있다. 상기 물질은 미리 응고될 수 있거나 및/또는 엘라스틴, 또는 동결보존된 정맥, 무세포화된(decellularized) 정맥 또는 동맥과 같은, 동종이식(allograft) 혈관일 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 스캐폴드는 예를 들어, 기계적 특성을 개선하기 위하여 상기 표면 상에 전기방적된(electrospun) 중합체성 코팅을 갖는 엘라스틴 스케폴드와 같은 복합 물질(composite material)일 수 있다. 상기 물질은 단백질(예를 들어, 알부민) 또는 혈장(plasma)으로 미리 응고되거나 또는 미리 처리될 수 있고, 이는 특정 구체예에서 상기 기질 물질 상에 조직 세포의 부착, 퍼짐, 및 성장을 추가로 촉진하는 역할을 할 수 있다. 상기 이식 기질 또는 스캐폴드는 Liu, T.V. 등, 2004, Adv. Drug. Deliv. Rev. 56(11):1635-47; Nygren, P.A. 등, 2004, J. Immunol. Methods 290(1 -2):3-28; Hutmacher, D.W. 등, 2004, Trends Biotechnol 22(7):354-62; Webb, A.R. 등, 2004, Expert Opin. Biol. Ther. 4(6):801-12; and Yang, C. 등, 2004, BioDrugs 18(2): 103- 19에 참조된 방법을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 임의의 적절한 방법에 의해 구현될 수 있다.
상기 임상 (OR) 키트의 상기 메인 컨트롤러 보드(MCB)는 상기 아날로그 보드에 적절한 인터페이스를 갖는 마이크로프로세서 코어 모듈을 포함하고, 이는 상기 임상 (OR) 키트 조립체의 주변 센서를 제어한다. 소프트웨어는 상기 임상 (OR) 키트의 신뢰성 있고 결정적인 연산을 확보하는 직접 사용자 인터페이스를 제공하는 상기 메인 컨트롤러 보드 프로세서에 체제한다. 상기 아날로그 보드는 상기 MCB의 주변에 존재하고 작동기를 구동하고 센서 정보를 받고 조건을 잡는데 사용된다.
원심분리기는 상기 그라프트로의 압력 붙임 전에 상기 세포를 분리한다. 일 구체예에서, 상기 습식 원심분리 용기는 분리된 소모성 원심분리 카트리지이고, 상기 내구성이 있는 성분은 상기 임상 (OR) 키트 인클로저에 수용된다.
하나 이상의 펌프는 압력 변동(pulsation)을 최소로 유지하도록 설계된 상기 시스템을 통해 흐름을 구동한다. 상기 습식 펌프 성분은 상기 유로 카트리지의 일부이고, 상기 펌프 샤프트(shaft)는 비-침입 수단에 의해 구동된다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 펌프는 상기 세포 분리 장치의 동작 동안 자동으로 자체 기동(self-priming)된다.
상기 임상 (OR) 키트 시스템은 이식 스캐폴드를 미리 처리하고, 상기 그라프트에 붙이기 위해 지방 조직을 제조하고, 상기 세포를 상기 그라프트에 적용하고, 회수할 때까지 생존성을 유지하기 위해 M199E/혈청 용액을 상기 그라프트에 재순환 시키는데 필요한 흐름 경로를 통해 자동으로 진행하도록 설계된다. 일 구체예에서, 조직의 제조는 PBS 용액을 사용하여 상기 임상 (OR) 키트의 외부에서 분말 물질로부터 재구성된 콜라게나아제로 처리한 후 원심분리하는 것을 포함한다. 그 후 상기 세포는 상기 임상 (OR) 키트의 유체 저장기에 저장된 M199E/혈청 용액에 자동으로 재현탁되고, 상기 용액은 상기 그라프트에 적용된다. 유체 밸브는 상기 유로 카트리지 및 원심분리 카트리지 내에 이들 필요한 경로를 생성하도록 구현되고 임상 (OR) 키트 소프트웨어에 의해 제어된다. 상기 이식 스캐폴드를 가로지르는 일정한 압력은 상기 압력 붙임 동작 동안 유지된다.
특정 일 구체예에서, 상기 임상 (OR) 키트는 온도, 압력, 및 유속을 모니터하고 제어하는데 필요한 센서를 포함한다. 다른 유로 카트리지 및 이식 챔버가 특정한 유형의 그라프트를 붙임(예를 들어, CABG, 말초(peripheral))과 매치시키기 위해 상기 임상 (OR) 키트에 적재된다. 다른 유로 카트리지 및 이식 챔버는 상기 임상 (OR) 키트에 적재되고 상기 특정한 유형의 이식 붙임을 완전하게 접합시킨다. 상기 센서는 상기 소모재들이 적절하게 적재되도록 하기 위해 상기 유로 카트리지, 원심분리 카트리지, 및 이식 챔버의 존재를 검출할 수 있다. 또한, 상기 센서는 정확한 소모재들이 사용되도록 적재된 유로 카트리지 및 이식 챔버의 유형을 검출할 수 있다.
상기 압력 붙임 작동은 200,000개의 세포가 스캐폴드의 각각 ㎠에 대한 이식 스캐폴드에 적용되는 것이 요구된다.
상기 임상 (OR) 키트는 PBS 용액에 의해 재구성된 콜라게나아제 유입을 허용 할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 키트는 제조된 적어도 약 60 ㎖의 콜라게나아제 용액을 수용한다. 상기 키트는 지방 조직의 유입을 허용한다. 일 구체예에서, 상기 지방 유입은 약 30 내지 60 ㎖의 지방 조직을 수용한다. 다른 구체예에서, 상기 지방 유입은 상기 조직이 37 ℃로 미리 가열되는 환경으로 도입될 수 있도록 위치된다.
추가적인 일 구체예에서, 상기 임상 (OR) 키트 시스템은 상기 조직 공급원에 따라 선택적으로 사용될 수 있는 소모성(consumable) 절단 어뎁터를 사용하여 지방 조직을 절단할 수 있다. 특정 일 구체예에서, 상기 소모성 절단 어뎁터는 튤립 주사기(Tulip syringe)에 연결되기 위한 호환성을 갖는다. 상기 시스템은 추가로 상기 이식 챔버, 소화 이전에 지방 조직이 적재되는 공간, 및 소화를 위한 공간을 37 ℃로 가열하고, 예상되는 지방 조직의 유입량과 동일한 콜라게나아제 용액의 부피를 측정할 수 있다.
상기 시스템은 지방 조직 및 콜라게나아제 세포 슬러리를 혼합할 수 있다. 바람직한 일 구체예에서, 상기 시스템은 단일 원심분리 소모재(disposable), 즉 상기 유로 카트리지 및 이식 챔버와 결합하는, 세포 처리 장치에서 상기 혼합 및 분리 동작을 수행한다. 또한 상기 시스템은 상기 소화된 혼합물로부터 섬유질 물질을 제거할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 재현탁된 세포에서 최대 허용가능한 입자 크기는 약 100 mm를 초과하지 않는다.
일 구체예에서, 상기 임상 (OR) 키트 시스템은 콜라게나아제에 의해 소화되었던 지방 조직으로부터 "표적 세포"의 일 부피를 분리할 수 있고, 분리물로부터 분리된 표적 부피를 수집할 수 있다. 바람직한 일 구체예에서, 상기 시스템은 이하 표적 펠렛 부피 순도를 제공한다: 전체 분리된 펠렛 부피에 대하여 적혈구는 5 % 미만; 전체 분리된 펠렛 부피에 대하여 지방 세포는 1 % 미만; 전체 분리된 펠렛 부피에 대하여 죽은 세포는 4 % 미만. 추가적인 바람직한 일 구체예에서, 상기 재현탁물 중의 모든 입자는 100 mm 이하의 직경을 갖는다. 다른 바람직한 구체예에서, 상기 분리 방법은 상기 세포가 900 G보다 더 큰 힘에 노출되지 않도록 한다.
일 구체예에서, 상기 표적 세포는 M199E 및 혈청의 6:1의 부피 혼합물에서 재현탁된다. 다른 구체예에서, 상기 시스템은 약 200,000 세포/㎠의 표적 수로서, 상기 이식 스캐폴드에 적용된 세포 수를 조절하는 수단을 제공한다. +50% 내지 -10%의 이 표적 수의 변화는 허용가능하다. 실시예에 따라, 상기 임상 (OR) 키트 시스템은 상기 시스템에 적재된 지방 조직의 예측된 부피에 비례하는 부피 6:1의 M199E/혈청 용액을 사용한다.
일 구체예에서, 상기 시스템은 붙임을 위한 이식 스캐폴드가 미리 적재된 소모성 이식 챔버를 포함한다. 상기 이식 챔버는 약 1 내지 90 cm의 길이; 약 1 내지 12 mm의 그라프트 내부 직경; 및 약 100 내지 700 마이크론의 이식 벽 두께를 갖는 이식 스캐폴드를 수용할 수 있다. 상기 이식 챔버는 이식 챔버 포트를 통하는 것을 제외한, 주변과의 기체, 액체, 및 고체 물질 교환을 억제하는 붙임을 위한 밀봉된 환경을 제공한다.
상기 시스템의 모든 개별적인 소모성 성분은 연속적인 유로를 형성하기 위해 각각 서로 결합하도록 구현된다. 또한, 본 발명의 시스템의 모든 소모성 습식 물질 및 코팅은 생체적합적이고, 후-살균(clarify post-sterilization)의 5% 이상의 투과율을 갖는 25 내지 40 kGy의 감마선을 견디도록 설계된다. 또한, 내부의 전기 소자를 제외한, 상기 시스템의 모든 비-소모성 물질 및 코팅은 예를 들어, 시덱스(Cidex, 글루타르알데히드 살균 용액), 70% 에탄올, 100% 이소프로필 알코올, 및 10% 표백 용액을 포함하는, 전형적인 소독 용액과 친화적이다.
일 구체예에서, 상기 임상 (OR) 키트 시스템은 압력, 온도, 및 유속에 대한 센서를 구동, 조건잡기(conditions), 획득 및 처리할 수 있는 제어 전자장치를 갖는 전자장치 모듈을 포함한다. 압력은 상기 이식 챔버에서 측정된다. 일 구체예에서, 상기 스캐폴드 벽을 가로지르는 압력은 약 1.5 psi로부터 2.0 psi 이하의 표적 수치로 제어된다. 다른 구체예에서, 온도는 소화를 위한 공간 및 상기 이식 챔버 내의 공간에서 약 37 ℃로 측정되고 유지된다. 다른 구체예에서, 유속 측정 및/또는 제어는 상기 그라프트의 벽을 가로지르는 압력 조건을 유지하기 위해 요구되는 것과 같이 수행된다.
본 발명의 일 구체예에서, 소프트웨어는 전기 소자 및 상기 장치의 인클로저 내에 포함된 통신 경로를 제어하는 중앙처리장치에 체재한다. 본 발명의 시스템은 상기 소프트웨어가 모든 소모성 성분이 상기 인클로저 내에서 정확하게 연결되고 연동되지 않을 경우 임의의 기기의 작동을 억제하도록 구현된다.
임상 ( OR ) 키트 작동
상기 임상 (OR) 키트 시스템은 이식 스캐폴드를 미리 처리하고, 상기 그라프트내로 붙이기 위한 지방 조직을 제조하고, 상기 세포를 상기 그라프트에 적용하 고, 상기 이식 루멘을 깨끗하게 하고(purge), 회수할 때까지 생존률을 유지하기 위해 M199E/혈청 용액을 상기 그라프트에 재순환시키는데 필요한 흐름 경로를 통해 자동으로 진행한다. 도 4는 상기 임상 (OR) 키트 내의 성분들 사이의 개념상의 유로를 설명한다.
본 명세서에 설명된 상기 예시된 시스템은 전형적으로 상기 시스템을 제어하고 사용자 입력을 기초로 하나 이상의 단계를 자동으로 수행하는 마이크로프로세서 및 연계된 소프트웨어를 포함한다. 상기 소프트웨어는 예를 들어, 펌프 및 밸브를 조절함으로써 튜브형 관을 통한 흐름을 제어하는 단계, 온도를 제어하는 단계, 및 세포 분리기 및 불림 장치를 제어하는 단계의 전부 또는 일부의 자동화를 허용할 수 있다. 바람직하게는 상기 시스템은 전체적으로 자동화되지만, 하나 이상의 입력 파라미터를 기초로 재구현될 수 있다. 또한 상기 시스템은 차단을 지시하는 압력, 및 마이크로프로세서 또는 사용자와 동일한 신호와 같은, 시스템 파라미터를 검출하거나 측정하기 위한 다양한 센서를 포함한다. 일 구체예에서, 상기 시스템은 핸드-헬드(hand-held) 시스템이다.
상기 투과성 스캐폴드 물질 사이의 제어되고, 유지된 차등 압력 구배는 상기 압력이 충분히 유지되고 본 발명의 이점을 달성하는데 충분한 크기를 갖는 한, 기어 펌프, 연동 펌프, 격막 펌프, 원심 펌프, 및 일 컬럼의 유체에 의해 생성되는 수동 압력 수두(pressure head)를 포함하나, 이에 제한되지 않는, 임의의 적절한 구조물(configuration)에 의해 생성될 수 있다. 특히 바람직한 일 구체예에서, 상기 압력은 약 50 mmHg의 압력 수두에서 약 5분 동안의 지속 시간 동안 내피 세포를 포함하는 배지를 이용하여 혈관 이식 스캐폴드에 경벽으로(transmurally) 적용된다.
본 발명에 관한 상기 흐름의 적어도 일부가 전형적으로 전층(transmural)이기 때문에, 상기 유속은 상기 그라프트의 투과성에 의존하고, 상기 세포가 상기 루멘 표면에 적용되는 만큼 감소된다. 세포의 도입 전의 전층 유속은 상기 그라프트에 따라 5 내지 50 ㎖/분일 수 있고 일반적으로 세포의 도입 후에 1 내지 10 ㎖/분으로 감소한다. 바람직한 내피 세포 수는 120,000 내지 2,000,000 세포/㎠ 루멘 표면적, 더 바람직하게는 약 250,000 세포/㎠를 포함한다.
본 발명의 다른 특정 구체예에서, 상기 장치 시스템은 상기 장치의 조직 소화부 및 분리부는 세포를 혈관 그라프트에 적용하거나 또는 세포를 주사기 내에 수집하는 호환가능한 모듈과 함께 사용될 수 있는, 모듈식이다. 도 5는 모듈 시스템에서 조립된 장치를 도시한다. 상기 장치의 세포 분리부는 별개의, 분리형 유닛에 수용되고, 이러한 구체예는 상기 세포 분리 유닛이 다른 시스템과 짝을 이루게 하는 적응성(flecibility)을 제공한다. 바람직하게는 상기 장치는 상기 3가지 별개의 모듈: 즉, 세포 분리 모듈, 그라프트 붙임 모듈, 및 세포 수집 모듈로 나뉜다.
일 구체예에서, 상기 사용자는 상기 장치를 켜지기 전에 당해 적용을 위해 요구되는 내구성이 있는 성분(즉, 이식 붙임 내구재 또는 세포 수집 내구재)을 설치한다. 상기 장치가 켜지는 경우, 그것은 부팅하고, 상기 내구성 모듈이 적절하게 수용된 것인지 검출하고, 개시 진단을 수행하고, 대기 모드로 들어간다. 그 후 상기 사용자는 장치 설정을 개시하기 위해 상기 디스플레이 근처의 버튼을 누른다. 상기 임상 (OR) 키트는 상기 소모성 물질의 설치를 허용하는 모드로 들어간다. 상기 사용자는 상기 세포 분리 내구재 상에 장착된 바코드 스캐너를 이용하여 각각의 소모성 성분을 즉시 스캔한다. 상기 사용자가 상기 소모성 물질을 스캔하는 경우, 상기 임상 (OR) 키트는 상기 정확한 내구재가 제 위치에 있는지 증명할 것이고, 사용자를 상기 소모성 물질을 적재하고 필요한 튜빙 연결을 이행하는 각 단계로 안내한다. 상기 장치는 상기 소모성 성분이 적절히 적재되고 필요한 모든 소모성 물질이 당해 적용 동안 설치된 것을 보장하는 것을 검출할 것이다. 바람직한 일 구체예에서, 상기 바코드 스캐너는 상기 소모성 물질의 스캔이 상기 소모성 물질의 적재를 방해하지 않도록 장치 상에 위치된다. 상기 장착된 바코드 스캐너는 도 5에 도시된다.
장치의 설정이 완료된 후, 사용자는 진행을 위해 상기 사용자 인터페이스와 상호 작용한다. 상기 장치는 배지 및 혈청이 상기 유로를 통해 펌핑되고, 공기를 대기로 배출시키는 개구 포트를 갖는 폐기물 수집점으로 공기를 밀어 내는 공기 정화 동작(air purge operation)을 수행한다. 상기 이식 챔버는 상기 그라프트가 절대 공기에 노출되지 않도록 우회된다.
그 후 사용자는 즉시 지방을 상기 원심분리 소모성 물질 상에 포트에 주입하도록 프롬트된다. 상기 지방 조직은 고정 날개(stationary blade)을 통과하여 상기 원심분리기로 유입되면서 불려진다(macerated). 바람직한 일 구체예에서, 상기 프로테아제 용액은 콜라게나아제/PBS 용액이다. 상기 사용자 인터페이스 디스플레이는 상기 세포 분리 방법이 개시된 것을 나타낸다.
바람직한 일 구체예에서, 이 시점부터, 어떠한 사용자 상호 작용도 상기 전체 임상 (OR) 키트 방법이 완료될 때까지 요구되지 않는다. 상기 사용자 인터페이스 디스플레이는 수행되는 특정 동작, 상기 동작을 완료하기 위한 평가된 시간, 및 상기 전체 방법을 완료하기 위한 평가된 시간을 나타내는, 상기 방법에 관한 연속적인 업데이트를 제공한다. 일 구체예에서, 또한 다른 중요한 방법 파라미터(온도, 펌프 속도, 등)는 상기 디스플레이를 통해 사용자가 이용가능하게 할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 이식 스캐폴드는 상기 소모성 이식 챔버 내에서 알코올 또는 다른 적절한 무균 물질 중 충진될 수 있다. 그라프트 제조는 이하 제공되는 세포 분리 단계를 수반한다. 다음 단계는 붙임을 위한 상기 그라프트의 제조를 수반한다. (1) 알코올 정화 -- 알코올은 상기 이식 챔버를 통해 배지를 흐르게 하고 상기 액체 유출부를 폐기물 챔버로 전달하여 상기 이식 챔버로부터 제거되고; (2) 스캐폴드 선처리 -- 배지는 상기 세포 현탁물이 이식 붙임에 사용가능할 때까지 상기 이식 챔버를 통해 재순환된다. 상기 배지는 M199, M199E, PBS, 염수, 및 2가-양이온이 없는 DPBS(Di-Cation Free DPBS)를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직한 일 구체예에서, 상기 배지는 M199E 및 환자 유래 혈청의 6:1 혼합물이다.
상기 세포 분리 방법은 붙임 및 세포 수집 동작 모드와 동일하다. 일 구체예에서, 상기 세포 분리 단계는: (1) 지방 조직 소화 -- 상기 원심분리기는 약 37 ℃에서 온도 조절되고 낮은 속도의 혼합 작용(혼합은 적절한 소화를 위해 적절한 시간 동안 유지됨)을 제공하고; (2) 원심분리 -- 상기 원심분리는 높은 RPM으로 회전 하면서, 상기 지방 조직을 그의 구성 물질로 분리하며; (3) 내피 세포 분리 및 재현탁을 포함한다. 일 구체예에서, 상기 분리된 내용물은 광학 센서가 상기 내피 세포의 위치 및 부피를 검출하는 가늘고, 투명한 튜브로 전달될 수 있다. 원하지 않는 물질은 폐기물 저장기로 전달되고, 특이적인 부피의 내피 세포는 상기 원심분리기로 되돌아간다. M199E 및 혈청의 6:1 혼합물은 상기 원심분리기로 펌핑된다. 상기 원심분리기는 낮은 속도의 혼합 작용에 의해 상기 혼합물 내에서 상기 분리된 세포를 현탁한다. 그 후 상기 세포 현탁물은 30 마이크론 여과기를 통해 상기 원심분리기로부터 펌핑되고 상기 이식 붙임 유닛 또는 주사기로 수집하기 위한 세포 수집 유닛으로 전달된다. 도 14는 상기 원심분리 용기의 일 구체예의 횡단면도를 도시한다.
이식 붙임 방법에 있어서, 액체는 상기 붙임 모듈을 통해 상기 분리 모듈과 상기 이식 모듈 사이를 통과한다. 바람직하게는, 상기 그라프트는 약 37 ℃로 온도 조절된다. 일 구체예에서, 상기 이식 붙임 단계는 세포 붙임 및 "피드 앤 브리드(feed and bleed)" 흐름을 포함한다. 상기 세포 붙임 단계에서, 상기 내피성 현탁물은 상기 재순환하는 유로에 도입되어, 상기 세포 현탁물을 일 말단에서 상기 그라프트로 유입하게 하고 상기 이식 벽을 통해 유출되게 한다. 처음에는, 상기 이식 챔버를 떠나는 액체 혼합물은 상기 세포 현탁물의 전체 부피가 상기 재순환 경로로 들어갈 때까지 폐기물 챔버로 전달된다. 그 후 상기 세포 현탁물은 이식 붙임이 완료될 때까지 재순환한다. 상기 미세다공성 ePTEE는 상기 배지/혈청 혼합물의 통과를 허용하나, 상기 세포는 상기 ePTEE로 내포된다. 당해 절차 동안, 전층 압력 은 상기 붙임 모듈에서 압력 센서에 의해 모니터된다. 상기 "피드 앤 브리드" 흐름 단계에서, 이식 흐름은 특이적 전층 압력에 도달하는 때, 완전한 붙임을 나타내는 빛이 켜진다. 당해 절차 동안, 흐름은 대안적으로 재순환을 위한 폐기물 챔버 및 펌프로 전달된다. 상기 흐름이 폐기물 챔버로 전달되는 경우, 구성 배지(makeup media) 및 혈청은 상기 저장기로부터 펌핑된다. 상기 "피드 앤 브리드" 절차는 적절한 시간 동안 유지된다.
본 발명의 세포 수집 방법의 일 구체예에서, 상기 세포 현탁물은 상기 분리 모듈로부터 상기 수집 모듈의 주사기까지 펌핑된다. 선형 작동기는 상기 주사기 플런저를 당기면서, 세포 현탁물을 상기 주사기로 당긴다. 도 15는 상기 시스템의 유로를 설명한다.
투과성 스캐폴드 물질 사이에서 현탁된 세포를 갖는 액체 배지에 적용된, 유지된 압력 수두는 일시적인 압력 붙임 기술에 사용된 것과 같은 큰 압력 구배 없이, 신속한 세포 부착의 이점을 제공한다. 당업자는 무수한 세포 유형, 스캐폴드 물질 및 많은 장치 디자인을 갖는 형상에 의해 본 발명을 용이하게 실시할 수 있다. 당업자는 본 명세서에 기재된 본 발명의 특이적인 구체예와 많은 동등물을 단지 일반적인 실험에 불과한 실험을 사용하여 인식하거나, 또는 확인할 수 있을 것이다. 그러한 동등물은 청구범위에 의해 포함되는 것으로 의도된다.
본 발명은 세포를 임의의 적절한 이식 스캐폴드 또는 다른 투과성 기질 물질 상에 고착 또는 "붙임(sodding)"하기 위해, 압력, 바람직하게는 유지된 작은 크기의 압력을 적용하여 다양한 조직 이식물(implant) 또는 그라프트(graft)를 제조하 는 장치 및 방법을 제공한다. 특이적인 일 구체예에서, 상기 조직은 혈관 조직과 같은, 관 조직이다. 그러나, 본 발명은 또한 피부, 연골, 뼈, 골수, 힘줄, 인대, 위내장장관, 비뇨생식관, 간, 췌장, 신장, 부신, 점막 상피, 및 신경 그라프트를 포함하나, 이에 제한되지 않는 스캐폴드 또는 다른 기질 물질에 세포 고착을 수반하는 임의의 유형의 조직 그라프트에 적용할 수 있다. 상기 방법은 특히 심혈관 시스템 및 비뇨기 시스템(uninary system)의 조직을 포함하나, 이에 제한되지 않는 관 조직에 특히 적절하다.
본 명세서에 사용된 "유지된 작은 크기의 압력(sustained low magnitude pressure)"라는 용어는 세포의 부착, 성장 및/또는 분화를 촉진하기 위해, 약 5 분, 약 20 분, 약 30 분, 약 40 분, 약 50 분, 약 1 시간, 약 1.5 시간, 약 2 시간, 약 2.5 시간, 약 3 시간, 약 4 시간, 약 5 시간 또는 약 6 시간 동안 약 10 mmHg, 약 15 mmHg, 약 20 mmHg, 약 25 mmHg 및 약 30 mmHg 및 약 55 mmHg의 수두(head)를 갖는 압력을 의미한다. 당업자는 세포, 조직 그라프트, 기질 물질, 및 본 명세서에 제시된 교시에 따라 특이적인 작은 크기의 유지된 압력을 적용하기 위해 적절한 조건을 선택할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 "벽경유 압력 또는 흐름(transmural pressure or flow)"이라는 용어는 상기 이식 스캐폴드의 벽을 가로지르는, 이식 스캐폴드의 일 측면으로부터 다른 측면까지의 압력 또는 흐름을 말한다. 상기 이식 스캐폴드가 관형 이식 스케폴드인 경우, 상기 용어는 상기 그라프트의 루멘 또는 혈관내(intracapillary: IC) 공간으로부터 상기 그라프트의 외부 또는 혈관 외(extracapillary: EC) 공간까지의 압력 또는 흐름을 말한다.
본 명세서에서 사용된 "루멘경유 압력 또는 흐름(translumenal pressure or flow)"이라는 용어는 관형 그라프트의 루멘을 통한 압력 또는 흐름을 말한다. "루멘 경유흐름(translumenal flow)" 및 "루멘경유 관류(translumenal perfusion)"라는 용어가 호환하여 사용될 수 있다. 루멘경유 관류는 본 발명에 있어서 세포 부착을 위해 요구되지 않는 반면, 그는 예를 들어, 상기 벽경유 흐름이 훈련 효과(training effect) 또는 세척 효과(cleansing effect)를 제공한 후 사용될 수 있다. 이 경우, 비록 5 ㎖/분보다 작은 유속은 전형적으로 뒤이은 생리학적 흐름을 견딜 수 있는 세포 부탁을 제공하는데 충분하지만, 생리학적인 유속(~ 160 ㎖/분)까지 및 이를 포함하는 유속이 바람직하다.
치료학적 용도
상기 언급된 장치에 의해 제조되는 조직 그라프트 및 세포 현탁물은 무수한 치료학적 용도에 채택될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 일 구체예에서, 상기 언급된 임의의 장치에 의해 제조되는 하나 이상의 조직 그라프트 또는 세포 현탁물을 조직 또는 기관으로 이식함으로써, 그를 필요로 하는 개체의 조직 또는 기관을 혈관재생할 수 있는 방법이 제공된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "혈관재생하다(revascularize)", "혈관재생하는(revascularizing)", "신혈관형성(neovascularization)", 또는 "혈관재생화(revascularization)"는 통상적으로 질환, 선천성 결함, 또는 손상 때문에 무혈관 또는 저혈관 부위를 갖는 조직 또는 기관에서 기존의 혈관 망을 개조하거나 또는 새로운 기능성 혈관 망 또는 실질적으로 기능성이 있는 혈관 망을 형성하는 것을 의미한다.
일 구체예에서, 상기 조직 그라프트 또는 세포 현탁물은 피부, 골격근, 심근, 심장의 심방 부속지(appendage), 폐, 장간막(mesentery), 또는 지방 조직으로 구성된 군으로부터 선택된 세포를 포함한다. 상기 지방 조직은 복부 지방, 복막전(preperitoneal) 지방, 신장주위(perirenal) 지방, 심막주위(pericardial) 지방, 피하 지방, 유방 지방, 또는 정소주위(epididymal) 지방으로부터 유래될 수 있다.
특정 구체예에서, 또한 상기 조직 그라프트 또는 세포 현탁물은 적절한 기질 세포, 줄기 세포, 관련 세포(Relevant Cell), 또는 이들의 조합을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 것과 같이, "줄기 세포(stem cell)"라는 용어는 넓은 의미로 사용되고 일반적인(traditional) 줄기 세포, 지방 유래 줄기 세포, 전구 세포, 선전구(preprogenitor) 세포, 예비 세포(reserve cell) 등을 포함한다. 대표적인 줄기 세포는 배아 줄기 세포, 성체 줄기 세포, 만능 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 간 줄기 세포, 근육 줄기 세포, 근육 선구 줄기 세포, 혈관내피 전구 세포, 골수 줄기 세포, 연골 줄기 세포, 림프성 줄기 세포, 간엽 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 중추신경계 줄기 세포, 말초 신경계 줄기 세포 등을 포함한다. 줄기 세포를 분리하고 배양하는 방법을 포함한, 줄기 세포의 설명은 다른 문헌 중에 특히, Embryonic Stem Cells, Methods and Protocols, Turksen, ed., Humana Press, 2002; Weisman 등, Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 17:387 403; Pittinger 등, Science, 284:143 47, 1999; Animal Cell Culture, Masters, ed., Oxford University Press, 2000; Jackson 등, PNAS 96 (Shepherd BR 등, Rapid perfusion and network remodeling in a microvascular construct after implantation. Arterioscler Thromb Vase Biol 24: 898-904, 2004):14482 86, 1999; Zuk 등, Tissue Engineering, 7:211 228, 2001 ("Zuk 등"); Atala and Lanza, eds., Academic Press, 2001 (Atala, 등), 특히 Chapters 33 41 ; 및 미국특허 제5,559,022호, 제5,672,346호 및 제5,827,735호에서 발견될 수 있다. 기질 세포를 분리하는 방법을 포함한, 기질 세포의 설명은 다른 문헌 중에 특히, Prockop, Science, 276:71 74, 1997; Theise 등, Hepatology, 31 :235 40, 2000; Current Protocols in Cell Biology, Bonifacino 등, eds., John Wiley & Sons, 2000(2002년 3월에 업데이트된 것을 포함함); 및 미국특허 제4,963,489호에서 발견될 수 있다. 당업자는 조직 그라프트 또는 세포 현탁물에 포함시키기 위해 선택된 줄기 세포 및/또는 기질 세포가 일반적으로 그러한 구조물(construct)의 의도된 용도에 적절하다는 것을 이해할 것이다. 특정 구체예에서, 일단 인비보로 이식된 조직 그라프트 또는 세포 현탁물은 기능성 혈관상(vascular bed)를 발달시키고 주변 기능성 혈관계와 접합하며, 손상된 조직 또는 기관을 관류하거나, 또는 관류할 수 있다.
조직 또는 기관을 혈관재생시키는 특정 방법에 따르면, 하나 이상의 조직 그라프트 또는 세포 현탁물은 상기 조직 또는 기관과 조합되고 혈관재생된 조직 또는 기관이 생성된다. 조직 또는 기관을 혈관재생시키는 특정 방법에 따르면, "조합하는(combining)"이라는 용어는 하나 이상의 조직 그라프트 또는 세포 현탁물을 상기 조직 또는 기관의 표면, 그 내부, 그 층들 사이, 또는 그 부근에 배치 또는 이식하는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 조직 그라프트 또는 세포 현탁물은 주입 에 의해 조직 또는 기관에 이식된다. 특정 구체예에서, 상기 주입된 구조물은 이식 후에 그 자리에서(in situ) 중합될 것이다. 특정 구체예에서 상기 주입된 조직 그라프트 또는 세포 현탁물은 하나 이상의 배양된 미세혈관 구조물, 하나 이상의 새로 분리된 미세혈관 구조물, 또는 양자 모두를 포함한다. 특정 구체예에서, 조합하는 것은 상기 기재된 것과 같은, 당업계에 알려진 기법을 이용하여, 하나 이상의 조직 그라프트 또는 세포 현탁물을 혈관재생이 필요한 하나 이상의 조직 또는 기관에 부착시키는 것을 포함한다.
당업자는 특정 조직 및 기관이 섬유 조직, 연결 조직, 지방 조직 등의 층(layer)에 의해 뒤덮히거나 그 층을 포함하며 기저(underlying) 조직 또는 기관은 이러한 층을 제거하지 않고 혈관재생될 수 있다는 것을 이해한다. 그와 같은 층은 (장막 층, 점막, 섬유질 캡슐 등과 같이) 자연적으로 발생할 수 있거나, 질병, 손상, 또는 생화학적 결핍에 의해, 섬유증, 괴사, 허혈로부터 유발될 수 있다. 일반적으로, 상기 조직 그라프트 또는 세포 현탁물의 미세 혈관 분획은 그러한 층을 관통하고 상기 기저 조직 또는 기관의 맥관구조와 접합하여 상기 조직 또는 기관을 혈관재생시킬 수 있다. 따라서, 상기 조직 그라프트 또는 세포 현탁물을 혈관재생성을 필요로 하는 조직 또는 기관과 조합하는 것은 상기 조직 그라프트 또는 세포 현탁물을 그러한 층 상에 또는 내부에 배치시키는 것을 포함한다. 예를 들어, 상기 조직 그라프트 또는 세포 현탁물을, 뇌 조직을 혈관재생시키기 위해 뇌막(meninges)에 배치시키는 것; 심근을 혈관재생시키기 위해 외심막에 배치시키는 것; 대장의 일부를 혈관재생시키기 위해 복막 및/또는 장막(serosa)에 배치시키는 것; 눈을 혈관재생시키기 위해 결막 및/또는 하결막(subconjunctiva)에 배치시키는 것; 기관(trachea)을 혈관재생시키기 위해 기관 표면에 배치시키는 것; 입을 혈관재생시키기 위해 구강 점막(bucchal mucosa)에 배치시키는 것; 폐를 혈관재생시키기 위해 늑막 및/또는 장막 표면에 배치시키는 것; 횡격막을 혈관재생시키기 위해 늑막 및/또는 복막 표면에 배치시키는 것; 당뇨성 궤양과 같은, 비-치유성 피부 궤양(non-healing skin ulcer)을 혈관재생시키기 위해 피부에 배치시키는 것; 심막(pericardium)을 혈관재생시키기 위해 심막에 배치시키는 것 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
특정 구체예에서, 상기 조직 그라프트 또는 세포 현탁물은, 동물 또는 인간의 조직 또는 기관과 조합되는 경우, 기능성 혈관상을 발달시키고 주변의 기능성 혈관계와 접합하고 상기 손상된 조직 또는 기관을 관류시킨다. 특정 구체예에서, 상기 이식된 조직 그라프트 또는 세포 현탁물은 상기 손상된 조직 또는 기관을 혈관재생하기 위해 핵 형성(nucleation) 부위로서 작용한다. 특정 구체예에서, 상기 조직 그라프트 또는 세포 현탁물의 적절한 줄기 세포, 기질 세포, 및/또는 관련 세포는 손상된 조직 또는 기관의 재구성 및 복구를 지지할 것이다. 유전적으로 조작된 세포를 포함하는 구조물은 혈류를 통해 전신으로 분배되거나 복구, 상처 치료 등을 유도하기 위해 국소 미세 환경으로 전달되는 재조합 생성물을 생성할 수 있다.
특정 일 구체예에서, 상기 조직 그라프트 또는 세포 현탁물은 신경세포, 심근세포, 연골세포, 췌장 샘포 세포(pancreatic ancinar cell), 랑게르한스 섬을 포 함한 췌장 내분비 세포, 간세포, 신장 상피 세포, 부갑상선 세포, 라이디히 세포(Leydig cell), 세르톨리 세포(Sertoli cell), 생식세포(gonocyte), 난모세포, 낭포세포(blastocyst), 쿠퍼 세포(Kupffer cell), 림프구, 섬유아세포, 근세포, 근아세포, 위성 세포(satellite cell), 지방세포(adipocyte), 전구지방세포(preadipocyte), 골세포, 골아세포, 파골세포, 연골세포, 담즙 상피 세포, 푸르키니에 세포(Purkinje cell), 및 조율 세포(pacemaker cell)를 포함하나, 이에 제한되지 않는 세포로 분화할 수 있는 내피 세포를 포함한다.
다른 특정 구체예에서, 상기 조직 그라프트 또는 세포 현탁물은 하나 이상의 줄기 세포, 전구 세포 또는 관련 세포를 포함하고, 이는 신경세포, 심근세포, 연골세포, 췌장 샘포 세포(pancreatic ancinar cell), 랑게르한스 섬을 포함한 췌장 내분비 세포, 간세포, 신장 상피 세포, 부갑상선 세포, 라이디히 세포(Leydig cell), 세르톨리 세포(Sertoli cell), 생식세포(gonocyte), 난모세포, 낭포세포(blastocyst), 쿠퍼 세포(Kupffer cell), 림프구, 섬유아세포, 근세포, 근아세포, 위성 세포, 지방세포(adipocyte), 전구지방세포(preadipocyte), 골세포, 골아세포, 파골세포, 연골세포, 담즙 상피 세포, 푸르키니에 세포(Purkinje cell), 및 조율 세포(pacemaker cell)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 사용되는 "관련 세포(들)(Relevant Cell(s))"라는 용어는 조직 그라프트 또는 세포 현탁물의 의도된 용도를 기초로, 본 발명의 장치에 의해 제조된 조직 그라프트 또는 세포 현탁물에 내포(incorporate)시키기에 적절한 세포를 말한다. 예에 따르면, 손상된 간의 복구, 재구성, 또는 재분포(repopulation)에 적 절한 관련 세포는 간세포, 담즙 상피 세포, 쿠퍼 세포, 섬유아세포 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 조직 그라프트 또는 세포 현탁물에 내포되는 대표적인 관련 세포는 신경세포, 심근세포, 근세포, 연골세포, 췌장 샘포 세포, 랑게르한스 섬, 골세포, 간세포, 쿠퍼 세포, 섬유아세포, 근세포, 근아세포, 위성 세포, 내피 세포, 지방세포, 전구지방세포, 담즙 상피 세포 등을 포함한다. 이들 세포 유형은 당업계에 알려진 일반적인 기법에 의해 분리되고 배양될 수 있다. 대표적인 기법은 다른 곳 중에 특히, Atala 등, particularly Chapters 9- 32; Freshney, Culture of Animal Cells A Manual of Basic Techniques, 4th ed., Wiley Liss, John Wiley & Sons, 2000; Basic Cell Culture: A Practical Approach, Davis, ed., Oxford University Press, 2002; Animal Cell Culture: A Practical Approach, Masters, ed., 2000; 및 미국특허 제5,516,681호 및 제5,559,022호에서 발견할 수 있다.
당업자는 그와 같은 기질 세포, 줄기 세포, 및/또는 관련 세포가 제조하는 동안 또는 제조 후에 상기 조직 그라프트 또는 세포 현탁물에 내포될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 한정되지 않으나, 예를 들어, 상기 세포 현탁물, 줄기 세포, 관련 세포, 및/또는 기질 세포를 콜라겐, 피브린 등과 같은, 액체 3차원 배양액에서 조합하는 것, 또는 줄기 세포, 관련 세포, 및/또는 기질 세포를 상기 조직 그라프트 내에 또는 그 위에 접종 또는 부착(sod)하는 것이 수행될 수 있다. 조직 그라프트 또는 세포 현탁물에 내포시키기에 적절한 줄기 세포, 기질 세포, 및 관련 세포의 대표적인 조합물은 손상된 췌장을 혈관재생시키기 위한 조직 그라프트 또는 세 포 현탁물의 랑게르한스 섬 및/또는 췌장 샘포 세포; 손상된 간을 혈관재생시키기 위한 조직 그라프트 또는 세포 현탁물의 간세포, 간 선구 세포, 쿠퍼 세포, 내피 세포, 내배엽 줄기 세포, 간 섬유아세포, 및/또는 간 예비 세포를 포함한다. 제한 없이, 예를 들어, 손상되거나 병든 간을 혈관분포, 복구, 및 재구성하기 위한 조직 그라프트 또는 세포 현탁물의 적절한 줄기 세포 또는 기질 세포는 간 섬유아세포, 배아 줄기 세포, 간 줄기 세포, 심장근 세포, 푸르키니에 세포, 맥박 세포, 근아세포, 중배엽 줄기 세포, 위성 세포, 및/또는 손상된 또는 허혈성 심장을 혈관재생하기 위한 골수 세포 등(예를 들어, Atkins 등, J. of Heart and Lung Transplantation, December 1999, 1173 80쪽; Tomita 등, Cardiovascular Research Institute, American Heart Association, 1999, 92 101쪽 ; Sakai 등, Cardiovascular Research Institute, American Heart Association, 1999, 108 14쪽 참조)과 같으나, 이에 제한되지 않는, 간 예비 세포, 간 선구 세포 등을 포함한다.
일 구체예에서, 또한 상기 조직 그라프트 또는 세포 현탁물은 시토킨, 케모킨, 항생제, 약물, 진통제, 항염증제, 면역억제제, 또는 그의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 작용제를 포함한다. 대표적인 시토킨은 안지오제닌(angiogenin), 혈관 내피 성장 인자(VEGF, VEGF-165를 포함하나, 이에 제한되지 않음), 인터루킨, 예를 들어, FGF-1 및 FGF-2를 포함하나 이에 제한되지 않는 섬유아세포 성장 인자, 간세포 성장 인자(HGF), 전환 성장 인자 베타(TGF-베타), (ET-1, ET-2, 및 ET-3과 같은) 엔도셀린(endothelin), 인슐린-유사 성장 인자(IGF-I), (Ang-1, Ang-2, Ang-3/4와 같은) 안지오포이에틴(angiopoietin), (ANGPTLl, ANGPTL-2, ANGPTL-3, 및 ANGPTL-4와 같은) 안지오포이에틴-유사 단백질, PDGF-AA, PDGF-BB 및 PDGF-AB를 포함하나, 이에 제한되지 않는 혈소판-유래 성장 인자(Platelet-derived growth factor, PDGF), 표피 성장 인자(EGF), ECGS, 혈소판-유래 내피 세포 성장 인자(PD-ECGF), 태반 성장 인자(PLGF) 등을 포함하는, 내피 세포 성장 인자(ECGF)를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 재조합 시토킨을 포함하는, 시토킨, 및 케모킨은 통상적으로 많은 공급원, 예를 들어, R&D Systems (Minneapolis, Minn.); Endogen (Woburn, Wash.); 및 Sigma (St. Louis, Mo.)로부터 상업적으로 이용가능하다. 당업자는 특정 조직 그라프트 또는 세포 현탁물에 내포시키기 위한 케모킨 및 시토킨의 선택이 혈관생성, 혈관재생성, 강화 또는 재구성될 표적 조직 또는 기관에 부분적으로 의존할 것이라는 것을 이해할 것이다.
특정 구체예에서, 조직 그라프트 또는 세포 현탁물은 또한 하나 이상의 유전적으로 조작된 세포를 포함한다. 특정 구체예에서, 하나 이상의 유전적으로 조작된 세포를 포함하는 조직 그라프트 또는 세포 현탁물은 당업계에 알려진 기법에 의해 유도된 하나 이상의 유전적으로 조작된 세포 내에서 유전적 변형에 의한 하나 이상의 유전적으로 조작된 세포에 의해 코딩된 하나 이상의 유전자 생성물을 구성적으로 발현하거나 또는 유도적으로 발현할 것이다. 대표적인 유전공학 기법의 설명은 다른 곳 중에 특히, Ausubel 등, Current Protocols in Molecular Biology(2002년 3월에 첨가된 것을 포함), John Wiley & Sons, New York, N. Y., 1989; Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2.sup.nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989; Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3.sup.rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001; Beaucage 등, Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, John Wiley & Sons, New York, N.Y., 2000 (2002년 3월에 첨가된 것을 포함); Short Protocols in Molecular Biology, 4.sup.th Ed., Ausbel, Brent, and Moore, eds., John Wiley & Sons, New York, N.Y., 1999; Davis 등, Basic Methods in Molecular Biology, McGraw Hill Professional Publishing, 1995; Molecular Biology Protocols(highveld.com 웹사이트 참조), 및 Protocol Online (protocol-online.net)에서 발견될 수 있다. 본 발명의 유전적으로 조작된 세포를 유전적으로 변형하기 위한 대표적인 유전자 생성물은 플라스미노겐 활성자, 가용성 CD4, 인자 Ⅷ, 인자 Ⅸ, 폰 빌레브란드(von Willebrand) 인자, 유로키나아제, 히루딘, 알파-, 베타- 및 감마-인터페론를 포함하는 인터페론, 종양 괴사 요소, 인터루킨, 조혈 성장 인자, 항체, 글루코세레브로시다아제, 아데노신 디아미나아제, 페닐알라닌 히드록실라아제, 인간 성장 호르몬, 인슐린, 에리스로포이에틴, VEGF, 안지오포이에틴, 간세포 성장 인자, PLGF 등을 포함한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 조직 또는 기관은 심장 조직, 폐 조직, 심근 조직, 가로무늬근 조직, 간 조직, 췌장 조직, 연골, 뼈, 심막(pericardium), 복막, 신장, 평활근, 피부, 점막 조직, 소장, 및 대장 및 지방 조직으로 구성된 군으로부터 선택된다.
세포 현탁물을 대상 조직 또는 기관에 주입하는 단계는 하나 이상의 주사기, 바늘(needle), 캐뉼러, 카테터, 튜브, 또는 미세침을 사용하는 단계를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 명세서에 사용되는 "주입하는(injecting)", "주입(injection)"이라는 용어, 또는 그의 변형은 일반적으로 구멍(bore) 또는 외부 개구부를 포함하는 튜브 또는 구조를 통해 물질을 배출하거나 밀어내는 임의의 수단을 말한다. 그러한 튜브 또는 구조는 유연성이거나, 비유연성일 수 있거나, 하나 이상의 유연성 부분 및 하나 이상의 비유연성 부분을 포함할 수 있다. 대표적인 주입 수단은 바늘이 있거나 없는 주사기, 캐뉼러, 카테터, 유연성 튜빙 등을 포함한다. 또한 특정 세포 현탁물의 전달은 미세침과 같은, 조직을 통과하는 장치의 사용을 통해 이루어질 수 있다. 표준-게이지의 피하 바늘을 갖는 일반적인 주입과는 달리, (전형적으로 곡률 반경 약 1 ㎛로 정의되는) 미세바늘 또는 미세바늘 어레이는 미세 구멍을 생성함으로써 피부 또는 내피 세포층을 통과한다. 이들 구멍은, 실제로, 물질 전달을 위한 통로로 작용하고 본 발명의 세포 현탁물의 혈관, 조직, 또는 기관으로의 부착 또는 전달을 촉진할 수 있다. 따라서, 당업자는 하나 이상의 세포 현탁물을 조직 또는 기관 상에 또는 내부로 밀어낼 수 있는 구멍(bore) 또는 외부 개구부를 포함하는 임의의 구조, 또는 제조된(engineered) 조직을 포함한, 조직 및/또는 기관의 표면을 통과할 수 있는 임의의 구조가 본 발명의 의도된 범위 내에 속한다는 것을 이해할 것이다. 특정 구체예에서, 상기 주입된 구조물은 주입 후 인비트로 중합된다.
특정 구체예에서, 본 발명의 상기 조직 그라프트 또는 세포 현탁물은 피부, 골격근, 심근, 심장의 심방 부속지, 폐, 장간막, 또는 지방 조직으로 구성된 군으로부터 선택되는 세포를 포함한다. 상기 지방 조직은 복부 지방, 복막전 지방, 신장주위 지방, 심막주위 지방, 피하 지방, 유방 지방, 또는 정소 지방으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
또한 본 발명의 장치에 의해 제조된 조직 그라프트를 기관 또는 조직에 이식하는 단계 또는 본 발명의 장치에 의해 제조된 세포 현탁물을 조직 또는 기관에 주입하는 단계를 포함하는, 그를 필요로 하는 개체의 조직 또는 기관을 확대시키는 방법이 제공된다. 본 명세서에 사용된 것과 같이, "확대시키는(augmenting)"은 조직 또는 기관의 부피 및/또는 밀도를 증가시키는 것을 말한다.
또한 본 명세서에 기재된 장치에 의해 제조된 하나 이상의 조직 그라프트를 조직 또는 기관에 이식하거나 또는 본 발명의 장치에 의해 제조된 하나 이상의 세포 현탁물을 조직 또는 기관에 주입함으로써 개체의 조직 또는 기관을 재생하는 방법이 제공된다. 본 명세서에서 사용된, "재생하는(regenerating)"은 새로운 조직의 형성에 의해 소실된, 병든 또는 그렇지 않으면 손상된 조직을 대체하는 것을 말한다.
당업자는 본 발명의 개체는 양서류, 조류, 어류, 포유류, 및 유대류(marsupial)를 포함하는, 임의의 동물일 수 있으나, 바람직하게는 포유류(예를 들어, 인간; 고양이, 개, 원숭이, 쥐, 및 랫트와 같은, 가축; 또는 소, 말 또는 돼지와 같은, 상업적인 동물)라는 것을 인식할 것이다. 또한 본 발명의 개체는 태아, 배아, 유아, 및 성체를 포함하는 임의의 연령일 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체 예에서, 상기 개체는 인간이다. 일 구체예에서, 상기 개체는 말이고 본 발명의 방법은 상기 동물의 굽 내부 및 주변의 조직을 재생하는데 사용될 수 있다. 추가적인 구체예에서, 상기 개체는 인간이고, 조직 재생의 방법은, 예를 들어 관절염 및 녹내장, 및 시력 감퇴를 포함하나, 이에 제한되지 않는, 눈 질환을 예방 또는 치료하는데 사용된다.
또한, 본 명세서에 기재된 장치에 의해 제조된 하나 이상의 조직 그라프트를 조직 또는 기관에 이식하는 단계 또는 이들 장치에 의해 제조된 하나 이상의 세포 현탁물을 조직 또는 기관에 주입하는 단계를 포함하는, 그를 필요로 하는 개체의 조직 또는 기관을 재구성하는 방법이 제공된다. 본 명세서에서 사용된, "재구성(reconstructing)"은 조직 또는 기관을 재건축(rebuilding), 재구성(reconstituting), 재형성(reshaping) 및/또는 복구(restoring)하는 것을 말한다. 본 발명의 일 구체예에서, 예를 들어 개체는 셀룰라이트(cellulite)를 가지며, 상기 개체는 지방 조직을 국소적으로 재구성하기 위해 적절한 세포 현탁물의 피하 주입을 투여받게 되어, 상기 개체의 미용적인 외관이 개선된다. 일 구체예에서, 상기 개체는 수술 후 개체이다.
또한 본 명세서에 기재된 장치에 의해 제조된 하나 이상의 조직 그라프트를 조직 또는 기관에 이식하거나 또는 이들 장치에 의해 제조된 하나 이상의 세포 현탁물을 조직 또는 기관에 주입함으로써 개체의 조직 또는 기관의 일차 감염 및 이차 감염을 치료하거나 예방하는 방법이 제공된다.
또한 조직 또는 기관에서 흉터 조직의 형성을 예방하고, 및/또는 개체의 조 직 또는 기관의 염증을 치료하거나 예방하기 위해 본 발명의 장치에 의해 제조된 세포 현탁물 및 조직 그라프트를 사용하는 방법이 제공된다.
또한 본 발명의 장치에 의해 제조된 하나 이상의 세포 현탁물 또는 조직 그라프트를 조직 또는 기관에 주입함으로써 그를 필요로 하는 개체의 조직 또는 기관의 유착 형성을 예방하기 위한 방법이 제공된다.
일 구체예에서, 본 명세서에 기재된 장치에 의해 제조된 하나 이상의 세포 현탁물을 심장으로 주입시킴으로써 심장 조직의 맥관구조를 증가시키는 것인, 개체의 급성 심근 경색을 치료하거나 예방하는 방법이 제공된다. 다른 구체예에서, 본 발명의 장치에 의해 제조된 하나 이상의 세포 현탁물을 개체의 심막 액(pericardial fluid)에 주입하는 단계를 포함하는, 개체의 심근염을 치료하는 방법이 제공된다.
또한 본 발명의 장치에 의해 제조된 하나 이상의 세포 현탁물을 상처에 주입함으로써 개체의 상처를 치료하는 방법이 제공된다. 일 구체예에서, 상기 개체는 수술 후 개체이다.
당해 발명은 지속적인 가압 붙임(pressure sodding) 및 조직으로부터 환자의 세포의 원하는 분획을 분리하고 및 상기 세포를 여과, 세척, 가열, 불림, 단백질 분해 효소에 의한(proteolytic) 배출, 분리, 재현탁, 및 투과성 그라프트로의 가압 붙임하는 임상적 절차의 자동화를 제공한다. 당업자는 통상적인 실험만을 사용하여 본 명세서에 기재된 본 발명의 구체예의 많은 동등물을 인식하거나, 또는 확인할 수 있을 것이다. 상기 동등물은 하기 청구 범위에 의해 포함되는 것으로 의도된다.
본 명세서에 언급된 모든 발행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별적인 발행물, 특허 또는 특허출원이 참조로서 본 명세서에 구체적으로 및 개별적으로 포함되는 것으로 기재된 것과 동일한 정도로 본 명세서에 참조에 의해 포함된다.
상기 언급된 설명 및 예는 본 발명의 목적, 특징, 및 이점을 달성하는 바람직한 구체예를 단지 설명하는 것이고, 그것으로 본 발명이 제한되는 것으로 의도되지 않는다.

Claims (102)

  1. 배지 저장기;
    하나 이상의 유입부 및 하나 이상의 유출부, 제1 로브(lobe) 및 제2 로브를 포함하는 세포 처리 장치;
    하나 이상의 펌프; 및
    유체 흐름을 변환하거나 차단하도록 구현된 하나 이상의 밸브를 포함하고;
    이들은 서로 유체 소통 가능하게 연결되어 있는 것인 세포 분리 장치.
  2. 제1항에 있어서, 상기 세포 처리 장치는 원심분리기인 것인 장치.
  3. 제1항에 있어서, 상기 세포 처리 장치는 소모재(disposable)인 것인 장치.
  4. 제1항에 있어서, 상기 장치는 모듈식(modular)인 것인 장치.
  5. 제1항에 있어서, 상기 장치는 자동화된 것인 장치.
  6. 제1항에 있어서, 가열기를 더 포함하는 것인 장치.
  7. 제1항에 있어서, 폐기물 저장기를 더 포함하는 것인 장치.
  8. 제1항에 있어서, 조직 해리 화학물 저장기를 더 포함하는 것인 장치.
  9. 제8항에 있어서, 상기 세포 처리 장치의 유입부와 상기 조직 해리 화학물 저장기 사이에 여과기를 더 포함하는 것인 장치.
  10. 제1항에 있어서, 상기 여과기로부터 세포의 제1 분획을 상기 세포 처리 장치로 들어가게 하고 제2 분획을 상기 폐기물 저장기로 들어가도록 구성된 하나 이상의 밸브를 더 포함하는 것인 장치.
  11. 제1항에 있어서, 상기 세포 처리 장치의 유출부와 무균 세포 수집 장치 사이에 여과기를 더 포함하는 것인 장치.
  12. 제11항에 있어서, 상기 무균 세포 수집 장치는 주사기인 것인 장치.
  13. 제1항에 있어서, 상기 세포 처리 장치는 서로 유체 소통가능하게 연결되어 있는 내부 용기 및 외부 용기를 더 포함하는 것인 장치.
  14. 제13항에 있어서, 상기 내부 용기는 소화(digestion)를 위해 구현된 영역 및 분리(separation)를 위해 구현된 영역을 포함하는 것인 장치.
  15. 제13항에 있어서, 상기 내부 용기는 상기 외부 용기와 소통하는 하나 이상의 개구부(aperture)를 더 포함하는 것인 장치.
  16. 제14항에 있어서, 상기 분리를 위해 구현된 영역은 추가로 내피 세포의 수집을 최적화하고 비-내피 세포 물질의 수집을 최소화하도록 구현된 것인 장치.
  17. 제1항에 있어서, 상기 세포 처리 장치는 상기 세포 처리 장치를 상기 세포 분리 장치에 커플링하는데 사용하기 위한 트위스트 로크(twist lock) 커플링 부재를 더 포함하는 것인 장치.
  18. 제1항에 있어서, 상기 세포 처리 장치는 상기 내부 용기와 유체 소통가능하게 연결되어 있는 추출 튜브를 더 포함하는 것인 장치.
  19. 제1항에 있어서, 상기 세포 처리 장치는 제어가능한 스프레이 노즐을 더 포함하는 것인 장치.
  20. 제1항에 있어서, 상기 세포 처리 장치는 회전하는 커플링을 더 포함하는 것인 장치.
  21. 제20항에 있어서, 상기 회전하는 커플링은 스프레이 노즐을 더 포함하는 것인 장치.
  22. 제21항에 있어서, 상기 회전하는 커플링은 상기 내부 용기로부터 액체를 첨가하거나 제거하는데 사용하기 위한 하나 이상의 이송 튜브를 더 포함하는 것인 장치.
  23. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 펌프는 자동식, 자가-기동(priming) 펌프인 것인 장치.
  24. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 밸브는 핀치(pinch) 밸브인 것인 장치.
  25. 제1항에 있어서, 핀치 밸브 매니폴드 랙크(manifold rack)를 더 포함하는 것인 장치.
  26. 제1항에 있어서, 인간-기계 인터페이스를 더 포함하는 것인 장치.
  27. 제1항에 있어서, 상기 장치는 핸드헬드(handheld) 장치인 것인 장치.
  28. 제1항에 있어서, 상기 배지는 생리학적 pH의 염화나트륨의 생리학적 농도를 포함하는 용액인 것인 장치.
  29. 제1항에 있어서, 상기 배지는 M199, M199E, PBS, 염수, 및 2가-양이온이 없는 DPBS(Di-Cation Free DPBS)로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 장치.
  30. 제29항에 있어서, 상기 배지는 M199E인 것인 장치.
  31. 제29항에 있어서, 상기 배지는 완충된 생리학적 염수 것인 장치.
  32. 제1항에 있어서, 상기 조직 해리 화학물은 콜라게나아제(collagenase)인 것인 장치.
  33. 제1항에 있어서, 전자 그래픽 디스플레이를 더 포함하는 것인 장치.
  34. 제1항에 있어서, 바코드 스캐너를 더 포함하는 것인 장치.
  35. 제1항에 있어서, 세포 카운팅 장치를 더 포함하는 것인 장치.
  36. 제1항에 있어서, 추가적으로 세포 회수 장치와 함께 사용하기 위해 구현된 것인 장치.
  37. 제2항에 있어서, 상기 원심분리기는 하나 이상의 진동 분리 부재를 사용하는 상기 장치에 장착된 모터를 포함하는 것인 장치.
  38. 제37항에 있어서, 상기 진동 분리 부재는 패드(pad)인 것인 장치.
  39. 제13항에 따른 장치의 내부 용기에 상당한 양의 조직을 첨가하는 단계;
    상기 조직을 약 37 ℃의 온도까지 가열하는 단계;
    유효량의 콜라게나아제를 상기 내부 용기에 첨가하는 단계;
    유효시간 동안 상기 내부 용기를 진동시켜 상기 조직을 소화시키는 단계;
    상기 소화된 조직으로부터 섬유질 조직을 제거하는 단계;
    상기 내부 용기를 약 5분 동안 약 3100 RPM으로 회전하는 단계;
    상기 내부 용기에 유체를 첨가하여 지방 세포를 상기 내부 용기의 중앙으로 이동시키는 단계;
    원심분리 작용에 의해 상기 지방 세포를 상기 내부 용기의 하나 이상의 개구부를 통해 상기 외부 용기로 전달하는 단계;
    상기 내부 용기를 유체로 세척하는 단계;
    하나 이상의 세포 펠렛을 상기 내부 용기의 하나 이상의 로브로부터 상기 내부 용기의 바닥으로 전달하는 단계;
    선택적으로, 유체를 상기 내부 용기에 첨가하고 상기 내부 용기를 약 5분 동 안 약 3100 RPM으로 회전하는 단계; 및 하나 이상의 세포 펠렛을 수집하는 단계를 포함하는 세포 분리 방법.
  40. 제39항에 있어서, 상기 조직은 지방 조직, 골수, 피부, 및 골격근으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  41. 제40항에 있어서, 상기 조직은 지방 조직인 것인 방법.
  42. 제39항에 있어서, 상기 유체는 생리학적 pH의 염화나트륨의 생리학적 농도를 포함하는 용액인 것인 방법.
  43. 제39항에 있어서, 상기 유체는 M199, M199E, 혈청(serum), 염수, 2가-양이온이 없는 DPBS(Di-Cation Free DPBS) 및 그의 유효한 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  44. 제39항에 있어서, 상기 세포 펠렛은 제어가능한 스프레이 노즐을 사용하여 상기 내부 용기의 하나 이상의 로브로부터 회수되는 것인 방법.
  45. 제39항에 있어서, 유체는 첨가되고 하나 이상의 회전하는 커플링 이송 튜브를 사용하여 상기 용기로부터 제거되는 것인 방법.
  46. 세포 붙임(sodding) 장치와 유체 소통가능하게 연결되어 있는, 제1항에 따른 세포 분리 장치를 포함하고, 상기 세포 분리 장치 및 세포 붙임 장치는 내구성이 있는 인클로저(enclosure)에 포함된 것인 세포-기반 치료에 사용하기 위한 키트.
  47. 제46항에 있어서, 상기 세포 분리 장치는 원심분리기를 포함하는 것인 장치.
  48. 제46항에 있어서, 상기 세포 분리 장치와 소통가능하게 연결되어 있는 세포 불림기(macerator)를 더 포함하는 것인 키트.
  49. 제46항에 있어서, 하나 이상의 펌프를 더 포함하는 것인 키트.
  50. 제46항에 있어서, 가열기를 더 포함하는 것인 키트.
  51. 제46항에 있어서, 폐기물 저장기를 더 포함하는 것인 키트.
  52. 제46항에 있어서, 하나 이상의 여과기를 더 포함하는 것인 키트.
  53. 제46항에 있어서, 상기 여과기는 약 100 마이크론보다 더 큰 입자를 배제하는 것인 키트.
  54. 제46항에 있어서, 상기 여과기는 30 마이크론보다 더 큰 입자를 배제하는 것인 키트.
  55. 제46항에 있어서, 상기 세포 분리 장치 및 상기 세포 붙임 장치의 존재를 검출하기 위한 하나 이상의 센서 수단을 더 포함하는 것인 키트.
  56. 제46항에 있어서, 온도, 압력 및 유속을 모니터하고 제어하기 위한 하나 이상의 센서 수단을 더 포함하고, 상기 센서 수단은 알람(alarm)과 소통하는 것인 키트.
  57. 제46항에 있어서, 전자 그래픽 디스플레이를 더 포함하는 것인 키트.
  58. 제46항에 있어서, 바코드 스캐너를 더 포함하는 것인 키트.
  59. 제46항에 있어서, 세포 수집 장치를 더 포함하는 것인 키트.
  60. 제46항에 있어서, 상기 세포 수집 장치는 주사기인 것인 키트.
  61. 제46항에 있어서, 세포 카운팅 장치를 더 포함하는 것인 키트.
  62. 제46항에 있어서, 상기 장치는 핸드헬드 장치인 것인 키트.
  63. 제46항에 있어서, 상기 키트는 세포 회수 장치와 사용하기 위해 구현된 것인 키트.
  64. 제46항에 있어서, 인간-기계 인터페이스를 더 포함하는 것인 키트.
  65. 하나 이상의 유체 저장기, 하나 이상의 유입부 및 하나 이상의 유출부를 포함하는 유로 카트리지;
    하나 이상의 유입부 및 하나 이상의 유출부, 제1 로브 및 제2 로브, 내부 용기 및 내부 용기를 갖는 세포 처리 카트리지;
    이식(graft) 기질을 고정하기 위한 선택적인 이식 챔버 카트리지로서, 상기 이식 챔버 카트리지는 하나 이상의 유입부 및 하나 이상의 유출부를 갖는 것인 이식 챔버 카트리지;
    유로를 통해 흐름을 일으키도록 구현된 하나 이상의 펌프;
    상기 세포 분리기 카트리지로부터 상기 이식 챔버 카트리지로 흐름을 전달하도록 구현된 하나 이상의 밸브를 포함하고;
    상기 유로 카트리지, 세포 분리기 카트리지 및 이식 챔버 카트리지는 소통하여 연속적인 유로를 형성하고, 상기 유로 카트리지, 세포 분리기 카트리지, 및 선 택적인 이식 챔버 카트리지는 상기 장치에 전력을 제공할 수 있는 모듈식 키트 인클로져와 소통하는 것인 세포-기반 치료에 사용하기 위한 키트.
  66. 제65항에 있어서, 상기 유로 카트리지, 세포 분리기 카트리지 및 이식 챔버 카트리지는 소모재인 것인 장치.
  67. 제65항에 있어서, 상기 세포 처리 카트리지는 원심분리기를 포함하는 것인 장치.
  68. 제65항에 있어서, 상기 유로 카트리지와 소통하는 세포 불림기를 더 포함하는 것인 장치.
  69. 제65항에 있어서, 상기 유로 카트리지는 배지가 미리 적재된 것인 장치.
  70. 제65항에 있어서, 상기 배지는 생리학적 pH의 염수의 생리학적 농도를 포함하는 용액인 것인 장치.
  71. 제65항에 있어서, 상기 배지는 Ml99, M199E, PBS, 염수, 및 2가-양이온이 없는 DPBS(Di-Cation Free DPBS)로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 장치.
  72. 제71항에 있어서, 상기 배지는 M199E인 것인 장치.
  73. 제65항에 있어서, 상기 배지는 완충된 생리학적 염수인 것인 장치.
  74. 제65항에 있어서, 상기 유로 카트리지는 하나 이상의 펌프를 포함하는 것인 장치.
  75. 제65항에 있어서, 가열기를 더 포함하는 것인 장치.
  76. 제65항에 있어서, 폐기물 저장기를 더 포함하는 것인 장치.
  77. 제65항에 있어서, 하나 이상의 여과기를 더 포함하는 것인 장치.
  78. 제65항에 있어서, 상기 여과기는 약 100 마이크론보다 더 큰 입자를 배제하는 것인 장치.
  79. 제65항에 있어서, 상기 여과기는 30 마이크론보다 더 큰 입자를 배제하는 것인 장치.
  80. 제65항에 있어서, 하나 이상의 여과기는 상기 세포 분리기 카트리지와 상기 이식 카트리지 사이에 위치된 것인 장치.
  81. 제65항에 있어서, 상기 키트 인클로저는 상기 유로 카트리지, 상기 세포 분리기 카트리지 및 상기 이식 챔버의 존재를 검출하기 위한 하나 이상의 센서 수단을 더 포함하는 것인 장치.
  82. 제65항에 있어서, 상기 키트 인클로저는 온도, 압력 및 유속을 모니터하고 제어하기 위한 하나 이상의 센서 수단을 더 포함하는 것으로서, 상기 센서 수단은 알람과 소통하는 것인 장치.
  83. 제65항에 있어서, 상기 키트 인클로저는 전자 그래픽 디스플레이를 포함하는 것인 장치.
  84. 제65항에 있어서, 상기 키트 인클로저는 바코드 스캐너를 포함하는 것인 장치.
  85. 제65항에 있어서, 상기 키트 인클로저는 유입부 및 유출부를 갖는 세포 수집 모듈을 포함하는 것인 장치.
  86. 제85항에 있어서, 상기 세포 수집 모듈은 주사기인 것인 장치.
  87. 제65항에 있어서, 세포 카운팅 장치를 더 포함하는 것인 장치.
  88. 제65항에 있어서, 상기 장치는 핸드헬드 장치인 것인 장치.
  89. 제65항에 따른 장치를 제공하는 단계;
    부착 세포를 포함하는 배지를 상기 이식 챔버에 도입하는 단계; 및
    상기 세포를 상기 기질에 부착시키기에 충분한 시간 동안 상기 기질을 가로지르는 상기 배지의 경벽(transmural) 흐름에 지속된 낮은 압력을 적용하는 단계를 포함하는, 조직 그라프트를 제조하는 방법.
  90. 제89항에 있어서, 상기 부착 세포는 섬유아세포, 평활근 세포, 혈관주위세포, 대식세포, 단핵세포, 형질세포, 지방세포, 골수세포, 지방세포, 조직-특이적 실질(parenchymal) 세포, 내피 세포, 및 지방 유래 줄기세포로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  91. 제89항에 있어서, 상기 부착 세포는 내피 세포인 것인 방법.
  92. 제89항에 있어서, 상기 세포는 미세혈관 내피 세포인 것인 방법.
  93. 제89항에 있어서, 상기 미세혈관 내피 세포는 지방 조직으로부터 유래된 것인 방법.
  94. 제89항에 있어서, 환자로부터 상기 지방 조직을 회수하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  95. 제1항에 따른 장치에 의해 제조된 세포 현탁물을 상기 조직 또는 기관에 주입하는 단계를 포함하는 그를 필요로 하는 개체의 조직 또는 기관을 재생하는 방법.
  96. 제95항에 있어서, 상기 세포 현탁물의 세포는 섬유아세포, 평활근 세포, 혈관주위세포, 대식세포, 단핵세포, 형질세포, 지방세포, 골수세포, 지방세포, 조직-특이적 실질 세포, 내피 세포, 및 지방 유래 줄기세포로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  97. 제96항에 있어서, 상기 개체는 포유류인 것인 방법.
  98. 제97항에 있어서, 상기 개체는 인간인 것인 방법.
  99. 제1항에 따른 장치에 의해 제조된 하나 이상의 세포 현탁물을 상기 조직 또 는 기관에 주입하는 단계를 포함하는 그를 필요로 하는 개체의 조직 또는 기관에 부착물 형성을 방지하는 방법.
  100. 제99항에 있어서, 상기 부착 세포는 섬유아세포, 평활근 세포, 혈관주위세포, 대식세포, 단핵세포, 형질세포, 지방세포, 골수세포, 지방세포, 조직-특이적 실질 세포, 내피 세포, 및 지방 유래 줄기세포로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  101. 제1항에 따른 장치에 의해 제조된 하나 이상의 세포 현탁물을 상처에 주입하는 단계를 포함하는 개체의 상처를 치료하는 방법.
  102. 제101항에 있어서, 상기 부착 세포는 섬유아세포, 평활근 세포, 혈관주위세포, 대식세포, 단핵세포, 형질세포, 지방세포, 골수세포, 지방세포, 조직-특이적 실질 세포, 내피 세포, 및 지방 유래 줄기세포로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
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