TWI461190B - Centrifugal Purification Extraction of Effective Components of Chinese Herbal Medicine Decoction - Google Patents

Description

中草藥湯劑之有效成份的離心純化萃取方法

本發明是有關於一種純化萃取方法，特別是指一種中草藥湯劑之有效成份的純化萃取方法。

目前科學中藥的製法，大多是將預定中藥材與預定水量混合後一起進行炮製，然後再對製成之中草藥湯劑進行脫水乾燥作業，而製成所謂的流浸膏或粉劑，但在此製作過程中，初步炮製完成之中草藥湯劑中除了含有所需之有效成份外，也會參雜許多雜質或無效成份，以致於製成之粉劑中的有效成份純度較低或參雜過多雜質。

目前中草藥湯劑之脫水乾燥方式，不外乎高溫加熱乾燥，或是低溫冷凍乾燥兩種處理方式，但上述兩種方式所需之設備成本相當高，加熱乾燥方式很可能會造成中草藥中之有效成份被破壞，致使製成之科學中藥的藥效變差，而冷凍乾燥方式則通常需在極低溫環境中進行(約-40℃)，所以會相當耗能。此外，若是想要大量取出中草藥湯劑中之某些特有效定份時，也就是，提高製成之中草藥粉劑中的某些特定有效成份量時，則需透過相當繁複之萃取製程，成本相當高。因此，如何提高製成之中草藥的有效成份，並快速進行脫水乾燥，是目前許多科學中藥廠積極發展之目標。

因此，本發明之目的，即在提供一種可快速進行中草藥湯劑有效成份之純化萃取的方法。

本發明之另一目的，在於提供一種用於中草藥湯劑之有效成份純化萃取的低溫離心冷凍方法。

於是，本發明中草藥湯劑之有效成份的離心純化萃取方法，包含以下步驟：(a)對中草藥湯劑進行初步離心，將該頂層低比重物質與底層沉澱物去除，而製成初次離心湯劑；(b)於足以使該初次離心湯劑結冰之低溫環境中，以預定轉速對該初次離心湯劑進行離心作業，使初次離心湯劑在離心過程中逐漸變成指標冰柱，而使初次離心湯劑中之多種有效成份分層聚集於指標冰柱各高度位置；及(c)依據預定取用之有效成份，分層裁取該指標冰柱位於離心管內之預定高度位置處的冰柱層段，並將裁取之冰柱層段融化混合成一純化湯劑。

於是，本發明中草藥湯劑之有效成份的離心純化萃取方法，包含以下步驟：(a)對中草藥湯劑進行初步離心，將該頂層低比重物質與底層沉澱物去除，而製成初次離心湯劑；(b)以預定離心轉速對初次離心湯劑進行離心，使初次離心湯劑中之多種有效成份於離心管中上下分層聚集，進而將初次離心湯劑製成指標湯劑；及(c)依據預定取用之中草藥湯劑之有效成份種類，將該指標湯劑含有預定取用之有效成份的層段取出，而獲得一純化湯劑。

本發明之功效：透過以低溫離心冷凍方式，將初次離心湯劑製成指標冰柱後，再依據預定取用之有效成份分布位置，個別裁切回融該指標冰柱預定層段的方法，可快速獲得具有高有效成份含量的純化湯劑，且後續加工製成之產品的穩定性較佳。

有關本發明之前述及其他技術內容、特點與功效，在以下配合參考圖式之一個較佳實施例的詳細說明中，將可清楚的呈現。

如圖1所示，本發明中草藥湯劑之有效成份的離心純化萃取方法之較佳實施例，適用於對所述中草藥湯劑進行純化萃取，而將中草藥湯劑加工成具有高有效成份含量且含水量低的中草藥流浸膏或無水乾燥粉劑。所述中草藥湯劑是指中草藥經浸泡或其它炮製方式製成之水液狀湯劑。在本實施例中，是以六味地黃丸製成之湯劑為例進行說明，該六味地黃丸湯劑是由熟地黃、山茱萸、山藥、澤瀉、丹皮、茯苓這六味中藥組成。此外，本實施例另外單獨就六味地黃丸之其中兩種成份分別進行實驗，輔佐驗證，此兩種分別是牡丹皮與山茱萸，但實施時，也可以另外四種中草藥來輔佐驗證，且因中草藥湯劑種類眾多，實施時不應以上述中草藥湯劑種類為限。

本發明中草藥湯劑之有效成份的離心純化萃取方法包含以下步驟：

步驟(一)炮製中草藥湯劑。本實施例是以上述三種湯劑分別進行實驗，該等湯劑炮製方法分別為：

(1)六味地黃丸湯劑：稱取25 g六味地黃丸，用100 mL去離子水浸泡一天，再將濾除雜質後，加去離子水定容至100 mL。

(2)牡丹皮湯劑：稱取10 g牡丹皮，用100 mL去離子水浸泡一天，再將雜質濾除後，加去離子水定容至100 mL。

(3)山茱萸湯劑：稱取10 g牡丹皮，用100 mL去離子水浸泡一天，再將雜質濾除後，加去離子水定容至100 mL。

步驟(二)去除雜質，製備初步離心湯劑。將上述炮製完成之三種湯劑分別取40 mL置於離心管進行初步離心，離心條件皆為：室溫、2400 rpm，10分鐘。透過此初步離心方式，使該等湯劑中之低比重的高黏度高分子黏液集中於離心管頂層，並使由不溶物與固體顆粒構成之沉澱物集中於離心管底層。然後，分別將各離心管中之頂層高分子黏液與底層沉澱物去除，而製成初步離心湯劑。

步驟(三)製備指標冰柱。於可使水分子結冰之低溫條件下，以多種不同離心轉速分別對步驟(二)製成之各種初次離心湯劑進行離心，藉由此低溫離心作業，使初次離心湯劑中之多種有效成份逐漸上下分層聚集，並同時逐漸結冰而製成一指標冰柱，藉此評估離心轉速對各種湯劑之有效成份分布位置的影響。

在本實施例中，採用之低溫離心條件有三種，分別為：(A)-15℃、7500 rpm、60分鐘；(B)-15℃、10000 rpm、60分鐘；及(C)-15℃、38400 rpm、40分鐘。

接著，對各湯劑製成之指標冰柱的各層進行成份分析。

將每一離心管中之指標冰柱由上往下分成多層，並將各層裁切取出融化後，每層融化液體先以0.45 μm濾膜過濾後，分別取10 μL注入HPLC中分析(n=3)，檢測該指標冰柱各層之特定有效成份含量。

關於有效成份之分析，牡丹皮湯劑之有效成份是以paeonol為指標，山茱萸湯劑之有效成份是以loganin為指標，而六味地黃丸浸液之指標有效成份配合採用paeonol與loganin，但實施時，也可分別針對其它有效成份進行分析。

HPLC分析是取市售Paeonol及Loganin各1.0 mg，加入甲醇溶解並定容至1.0 mL，配成標準溶液。取適量標準溶液，以甲醇為溶媒，配成準備液濃度，其準備液濃度為0.01、0.05、0.1、0.5、1.0 mg/mL，並於特定波長測定吸收度，並分別繪製一檢量線，Paeonol是測定274 nm波長之吸光度，Loganin是測定236 nm波長之吸光度。完成檢量線後，便可就各層之分析結果推知對應濃度。

在本實施例中，是將離心管由上往下依序區分為頂層、第一層、第二層、第三層與第四層，其中，頂層為初步離心湯劑變成指標冰柱後，殘餘在指標冰柱頂側之未結冰液體或黏稠冰沙，其含量相對甚少。但實施時，可依據各種中草藥之初次離心湯劑的特性，增加或減少預定進行分析之分層數量。

如表1~4所示，六味地黃丸湯劑、牡丹皮湯劑與山茱萸湯劑分別以上述三種低溫離心條件處理所得之指標冰柱經HPLC分析後，發現三種湯劑之指標有效成份都是頂層之濃度最高，而其它層的指標有效成份濃度則是從第一層至第四層逐漸增加，且頂層濃度高於第四層濃度約3~5倍。此外，六味地黃丸湯劑中的Paeonol在頂層、第三層及第四層的含量相加佔整體含量的65~74%，而Loganin在頂層、第三層及第四層的含量相加佔整體含量的75~80%。牡丹皮湯劑的Paeonol在頂層、第三層及第四層的含量相加佔整體含量的70~74%。山茱萸湯劑的Loganin在頂層、第三層及第四層的含量相加佔整體含量的75~80%。表示上述三種湯劑經由低溫高速離心冷凍處理之後，取其頂層、第三層及第四層就可得到多量之指標有效成份，便於指標有效成份之純化萃取。

接著，再將六味地黃丸湯劑經特定離心條件(-15℃、10000 rpm、60分鐘)處理後之指標冰柱的各層融化，並以0.45 μm濾膜過濾後，分析各層之抽提物重、總多醣體含量、總黃酮類含量、總皂苷含量，及總生物鹼含量，分別說明如下。

(1)提抽物重之檢測。取離心後各層濾液5 mL，置於蒸發皿中，並於105℃烘箱乾燥5小時，再移置於矽膠乾燥器內放冷，稱定抽提物重。

(2)總多醣體含量之量測。取葡萄糖25 mg加入蒸餾水溶解定容至50 mL作為葡萄糖標準品，分別量取葡萄糖標準品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL分別加蒸餾水稀釋至6.0 mL，再分別加入1.0 mL苯酚混勻，再迅速加入5.0 mL濃硫酸振搖5分鐘後，以沸水浴中加熱15分鐘，再置冷水中冷卻30分鐘。另以2.0 mL蒸餾水同上平行操作為空白對照，分別於490 nm處測定吸收度，製定檢量線。然後，分別取指標冰柱各層融化液1.0 mL加入蒸餾水2 mL後，測定490 nm吸光值。

(3)　總黃酮類含量。稱取蘆丁標準品50 mg，加50%乙醇溶解並定容至50 mL作為標準溶液。量取標準溶液0、0.5、1.0、2.0、2.5、3.0 mL分別加入到50 mL容量瓶中，再分別加入3 mL的0.1 mol/L三氯化鋁與5 mL的1 mol/L醋酸鈉，並以50%的乙醇定容至50 mL，靜置40分鐘後，測定在419 nm之吸光度，製定檢量線。接著，取指標冰柱之各層融化液2 mL以上述步驟處理後，測定在419 nm吸光度，計算總黃酮含量。

(4)總皂苷類含量。取人參皂苷Re標準品1.0 mg，加甲醇溶解成1.0 mg/mL的標準品溶液，分別取出20、60、90、100、120、180 μL標準品溶液，各加甲醇定容至200 μL，再加入0.2 mL之50 g/L的香草醛-冰醋酸與0.8 mL高氯酸後，依序於65℃水浴加熱20分鐘、冰水冷卻5分鐘，再加入冰醋酸5 mL搖勻，測定560 nm吸光度，製定檢量線。然後，取各指標冰柱各層融化液100 μL與100 μL甲醇混合，測定560 nm吸光度，計算總皂苷含量。

(5)生物鹼類含量。採用酸鹼滴定法測定總生物鹼含量，將指標冰柱各層融化液100 mL濃縮至10 mL，加2%鹽酸浸提，並以乙醚萃取，酸水液用氨水調PH=10，再以氯仿萃取，然後，取氯仿液，回收氯仿，得總鹼液。將各層的總鹼液在水浴上蒸乾，使氨水除盡，再加入定量的0.01 mol/L的硫酸標準液、15 mL蒸餾水，接著，以0.02 mol/L的NaOH標準液回滴，酚酞為指示劑。每1 mL的硫酸滴定液(0.01 mol/L)相當於3.305 mg的總生物鹼。

如表5~9所示，各層之總多醣類、總黃酮類、總皂苷及總生物鹼含量也是從第一層至第四層逐漸增加，並且其第三、四層所得之含量佔整體62~80%，再次證實六味地黃丸湯劑經由高速離心之後，可使大部分有效成份都集中在第三、四層，便於藥液之濃縮萃取。

步驟(四)擷取有效成份。依據上述步驟(三)之分析結果顯示，藉由低溫離心冷凍處理後，六味地黃丸湯劑之指標成份主要分層集中於頂層、第三層與第四層，因此，日後當要製備六味地黃丸時，可於將藥材炮製成六味地黃丸湯劑後，再依據上述離心條件對六味地黃丸湯劑進行低溫離心冷凍處理，然後，裁取出具有高指標有效成份含量的層段，並將擷取之各層段融化混合後，製成一含有高指標有效成份含量的純化湯劑。

步驟(五)脫水。再次對步驟(四)製成之六味地黃丸純化湯劑進行超高速離心作業，離心條件為：-15℃、38400 rpm、40分鐘。使純化湯劑中的水與指標成份上下分層並逐漸結冰，使大部分指標有效成份因重力而壓縮停留在離心管下半段，然後，再將離心管中之上半冰層去除後，便可除去大約20%~40%的水，進而將純化湯劑製成具有高有效成份含量且含水量低的中草藥流浸膏。並可依據製成之中草藥流浸膏的含水量情況，重複進行此步驟，藉以脫除大部分的水，降低中草藥流浸膏之含水量，方便後續乾燥成粉劑或進行丸劑、錠劑之製作。

因此，當此中草藥流浸膏製成之粉劑時，粉劑之有效成份含量可大幅提升20%以上，此成份規格會大幅超越目前市售品，所以可相對降低使用者服用量，且因已將大部分雜質皆去除，所以製成之製劑產品的品質穩定性也會相對提升。

藉由上述關於六味地黃丸、牡丹皮與山茱萸的低溫離心冷凍與脫水的說明可知，上述低溫離心冷凍方法確實可用以將中草藥湯劑中之大部分有效成份分層集中於指標冰柱的特定高度位置，而可方便透過個別裁切取用該指標冰柱之特定區段的方式，獲得具有高有效成份含量的純化湯劑，且方便進一步透過超高速低溫離心的方式，除去大部分的水，製成有效成份含量高的中草藥流浸膏。

由於各種中草藥之成份種類與性質不同，所以步驟(三)之低溫離心冷凍與步驟(五)之脫水所採用之離心條件也會不同，並不以上述條件為限，且步驟(三)製成之指標冰柱中的大部分有效成份分布位置也不以上述實施例所指層段為限，可藉由預先對各種中草藥湯劑分別建立有效成份分布位置與最佳低溫離心冷凍條件之資料庫的方式，方便日後查詢使用。

必須說明的是，步驟(五)之脫水方式不以採用超高速低溫離心，而將純化湯劑製成中草藥流浸膏為限，實施時，步驟(五)也可採用流動層噴霧乾燥方式，直接將純化湯劑脫水乾燥成粉劑。

另外，本發明步驟(三)、(五)在可使水結冰之低溫環中進行離心作業的目的，是要使湯劑在離心過程中逐漸結冰，使整個湯劑中之有效成份分層固定，方便裁切取用所需層段。但實施時，上述兩步驟不以在低溫環境中進行離心為限，也就是不以將湯劑結冰形成指標冰柱為必要，可將純化湯劑離心形成有效成份上下分層之液狀的指標湯劑，然後，再以其它方式將所需層段取出，例如以吸管吸取出等，再將取出之層段液體混合構成具有高有效成份含量之純化湯劑。

綜上所述，透過將中草藥湯劑製成之初次離心湯劑，再以低溫離心冷凍方式，將初次離心湯劑製成指標冰柱後，依據預定取用之有效成份分布位置，個別裁切擷取該指標冰柱之預定層段，並回融製成具有高有效成份含量的純化湯劑，然後再藉由超高速低溫離心冷凍處理、流動層噴霧乾燥或其它方式，將該純化湯劑製成中草藥流浸膏或粉劑，此方法可快速獲得大量之有效成份，可大幅提高製成之中草藥劑的有效成份含量與穩定性，且此純化方法相較於傳統純化方法，可以大幅節省溶媒與人力，相當方便實用。因此，確實可達到本發明之目的。

惟以上所述者，僅為本發明之較佳實施例而已，當不能以此限定本發明實施之範圍，即大凡依本發明申請專利範圍及發明說明內容所作之簡單的等效變化與修飾，皆仍屬本發明專利涵蓋之範圍內。

圖1是本發明用於中草藥湯劑之有效成份的離心純化萃取方法之一較佳實施例的步驟流程圖。

Claims (9)

1. 一種中草藥湯劑之有效成份的離心純化萃取方法，包含以下步驟：(a)對中草藥湯劑進行初步離心，將該頂層低比重物質與底層沉澱物去除，而製成初次離心湯劑；(b)於足以使該初次離心湯劑結冰之低溫環境中，對該初次離心湯劑進行離心作業，使初次離心湯劑中之多種有效成份上下分層聚集於離心管不同高度位置，並使初次離心湯劑在離心過程中逐漸凝結成指標冰柱；及(c)依據要取用之有效成份，分層裁取該指標冰柱位於離心管內之預定高度位置處的冰柱層段，並將裁取之冰柱層段融化混合成一含有前述要取用之有效成份的純化湯劑。
2. 根據申請專利範圍第1項所述之中草藥湯劑之有效成份的離心純化萃取方法，還包含一步驟(d)對該純化湯劑進行脫水。
3. 根據申請專利範圍第2項所述之中草藥湯劑之有效成份的離心純化萃取方法，其中，步驟(d)是以流動層噴霧乾燥方法對該純化湯劑進行脫水乾燥造粒，而將純化湯劑製成無水粉劑。
4. 根據申請專利範圍第2項所述之中草藥湯劑之有效成份的離心純化萃取方法，其中，步驟(d)是對該純化湯劑進行離心作業，驅使純化湯劑中的水液與有效成份分上下分層，並將水液層去除，而將純化湯劑製成中草藥流浸膏。
5. 根據申請專利範圍第4項所述之中草藥湯劑之有效成份的離心純化萃取方法，其中，步驟(d)是在可使水結冰之低溫環境中對該純化湯劑進行離心作業，使水液與有效成份上下分層並分別結冰，然後將結冰之有效成份分層取出融化製成低含水量之中草藥流浸膏。
6. 一種中草藥湯劑之有效成份的離心純化萃取方法，包含以下步驟：(a)對中草藥湯劑進行初步離心，將該頂層低比重物質與底層沉澱物去除，而製成初次離心湯劑；(b)對初次離心湯劑進行離心，使初次離心湯劑中之多種有效成份於離心管中上下分層聚集，進而將初次離心湯劑製成指標湯劑；及(c)將該指標湯劑含有特定有效成份的層段取出，而獲得一純化湯劑。
7. 根據申請專利範圍第6項所述之中草藥湯劑之有效成份的離心純化萃取方法，還包含一步驟(d)對該純化湯劑進行脫水處理。
8. 根據申請專利範圍第7項所述之中草藥湯劑之有效成份的離心純化萃取方法，其中，步驟(d)是對該純化湯劑進行離心作業，使純化湯劑中的水液與有效成份上下分層，並將水液層去除，而製成中草藥流浸膏。
9. 根據申請專利範圍第7項所述之中草藥湯劑之有效成份的離心純化萃取方法，其中，步驟(d)是以流動層噴霧乾燥方法對該純化湯劑進行脫水乾燥造粒，而將純化湯劑製成中草藥粉劑。