TWI458976B - 由母體之生物樣本分析胎兒之基因體 - Google Patents

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Description

由母體之生物樣本分析胎兒之基因體
本發明大體係關於基於母體樣本分析胎兒基因體，且更特定言之係關於基於對母體樣本中之基因片段進行分析來確定所有或一部分胎兒基因體。
本申請案主張以下申請案之優先權且為以下申請案之非臨時申請案：2009年11月5日申請之題為「Fetal Genomic Analysis」之美國臨時申請案第61/258567號；2009年11月6日申請之題為「Fetal Genomic Analysis from a Maternal Biological Sample」之美國臨時申請案第61/259075號；以及2010年9月10日申請之題為「Fetal Genomic Analysis from a Maternal Biological Sample」之美國臨時申請案第61/381854號，其全部內容出於所有目的以引用的方式併入本文中。
本申請案亦與以下申請案相關：2008年7月23日申請之題為「Diagnosing Fetal Chromosomal Aneuploidy Using Massively Parallel Genomic Sequencing」之美國申請案第12/178,181號(代理人案號：016285-005220US)；題為「Diagnosing Fetal Chromosomal Aneuploidy Using Genomic Sequencing With Enrichment」之美國申請案第12/614350號(代理人案號：016285-005221US)；以及同時申請之題為「Size-Based Genomic Analysis」之美國申請案(代理人案號：016285-006610US)，其全部內容出於所有目的以引用的方式併入本文中。
1997年在母體血漿中發現無細胞胎兒核酸開創了非侵入性產前診斷之新可能性(Lo YMD等人，Lancet 1997;350: 485-487；及美國專利6,258,540)。此技術已快速轉變為臨床應用，用於偵測胎兒來源之父體遺傳基因或序列，例如用於胎兒性別確定、胎兒RhD狀態確定以及確定胎兒是否遺傳了父體遺傳之突變(Amicucci P等人，Clin Chem 2000;46: 301-302；Saito H等人，Lancet 2000;356: 1170；及Chiu RWK等人，Lancet 2002;360: 998-1000)。此領域之新近進展已使藉由母體血漿核酸分析對胎兒染色體非整倍性(諸如第21對染色體三體症(trisomy 21))進行產前診斷成為可能(Lo YMD等人，Nat Med 2007;13: 218-223；Tong YK等人，Clin Chem 2006;52: 2194-2202；美國專利公開案2006/0252071；Lo YMD等人，Proc Natl Acad Sci USA 2007;104: 13116-13121；Chiu RWK等人，Proc Natl Acad Sci USA 2008;105: 20458-20463；Fan HC等人，Proc Natl Acad Sci 2008;105: 16266-16271；美國專利公開案2007/0202525；及美國專利公開案2009/0029377)。
有顯著新近進展之另一領域為使用單分子計數法(諸如數位PCR)來對母親及父親皆攜帶相同突變之單基因疾病進行非侵入性產前診斷。此已藉由對母體血漿進行相對突變劑量(relative mutation dosage，RMD)分析來達成(美國專利申請案2009/0087847；Lun FMF等人，Proc Natl Acad Sci USA 2008;105: 19920-19925；及Chiu RWK等人，Trends Genet 2009;25: 324-331)。
然而，該等方法使用對可能突變之先前認識來分析基因體之特定部分，且從而可能不能鑑別出潛伏性或不常見突變或遺傳性疾病。因此，需要提供可使用非侵入性技術來鑑別所有或部分胎兒基因體之新方法、系統及裝置。
本發明之某些實施例可提供用於確定懷孕女性之未出生胎兒之至少一部分基因體的方法、系統及裝置。胎兒之全部基因體或所選基因體區域之遺傳圖譜可在產前使用含有胎兒及母體遺傳物質之樣本(例如來自懷孕母親之血液樣本)來建構。遺傳圖譜可具有胎兒自其父親及母親兩者遺傳或僅自父母一方遺傳之序列。基於該等遺傳圖譜中之一者或若干者，可測定胎兒罹患遺傳性疾病或易患遺傳性或其他疾病或遺傳性狀傾向之風險。本文亦描述實施例之其他應用。
在一實施例中，可分析來自母體樣本(含有母體及胎兒DNA)之DNA片段以鑑別某些特定基因座(界標)處之對偶基因。接著可對此等基因座處各別對偶基因之DNA片段之量一起進行分析來測定此等基因座之單倍型(haplotype)之相對量，且從而判定胎兒已自母體及/或父體基因體遺傳了何種單倍型。藉由鑑別胎兒單倍型，可測定處於包括指定基因座之相應基因體區域內之個別基因座處的胎兒基因型。在各種實施例中，可以測定胎兒基因體區域之方式來分析父母為同型接合與異型接合之特定組合的基因座。在一實施例中，連同分析母體樣本之DNA片段一起使用代表群體中共同之單倍型的參考單倍型來測定母體及父體基因體。亦提供其他實施例，諸如測定突變、測定母體樣本中之分數胎兒濃度以及測定母體樣本之定序覆蓋比例。
本發明之其他實施例係關於與本文所述之方法相關之系統、裝置及電腦可讀媒體。在一實施例中，電腦可讀媒體含有用於接收資料及分析資料之指令，但無用於指導機器產生資料(例如對核酸分子進行定序)之指令。在另一實施例中，電腦可讀媒體含有用於指導機器產生資料之指令。在一實施例中，電腦程式產品包含儲存複數個用於控制處理器以執行本文所述之方法之操作之指令的電腦可讀媒體。實施例亦係關於電腦系統，其經組態以執行本文所述之任何方法之步驟，並且可能具有執行各別步驟或各別組步驟之不同組件。
參考本說明書之剩餘部分(包括圖式及申請專利範圍)將瞭解本發明實施例之其他特徵及優勢。下文關於隨附圖式詳細描述本發明之各種實施例之其他特徵及優勢以及結構及操作。在圖式中，類似參考數字可指示相同或功能上類似之要素。
 定義
如本文所用之術語「生物樣本 」係指任何取自個體(例如人類，諸如懷孕婦女)且含有一或多種相關核酸分子之樣本。
術語「核酸 」或「聚核苷酸 」係指呈單股或雙股形式之去氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其聚合物。除非明確限制，否則該術語涵蓋含有天然核苷酸之已知類似物的核酸，該等已知類似物具有與參考核酸相似之結合特性且以與天然存在之核苷酸相似之方式代謝。除非另外指示，否則特定核酸序列亦隱含地涵蓋其經保守修飾之變異體(例如簡併密碼子取代)、對偶基因、直系同源物、SNP及互補序列以及明確指示之序列。特定而言，簡併密碼子取代可藉由產生如下之序列來達成：其中一或多個所選(或所有)密碼子之第三位經混合鹼基及/或去氧肌苷殘基取代(Batzer等人，Nucleic Acid Res. 19 :5081(1991)；Ohtsuka等人，J. Biol. Chem. 260 :2605-2608(1985)；及Rossolini等人，Mol. Cell. Probes 8 :91-98(1994))。術語核酸可與基因、cDNA、mRNA、小非編碼RNA、微RNA(miRNA)、Piwi-相互作用RNA及由基因或基因座編碼之短髮夾RNA(shRNA)互換使用。
術語「基因 」意謂參與產生多肽鏈或轉錄RNA產物之DNA區段。其可包括編碼區之前及之後之區域(前導區(leader)及尾區(trailer))以及介於個別編碼區段(外顯子)之間的插入序列(內含子)。
如本文所用之術語「臨床相關核酸序列 (亦稱作目標序列或染色體)」可指對應於潛在失衡正經受測試之較大基因體序列之區段的聚核苷酸序列，或指較大基因體序列本身。一實例為21號染色體之序列。其他實例包括18號、13號、X及Y染色體。其他實例包括胎兒可自其父母之一或兩者遺傳或作為胎兒體內新生之突變的突變型基因序列或遺傳多形現象或複本數變異。在一些實施例中，多種臨床相關核酸序列或臨床相關核酸序列之相等多種標記可用於提供用以偵測失衡之資料。舉例而言，來自21號染色體上之五個不連續序列之資料可以累加方式(additive fashion)用於確定可能之21號染色體失衡，從而將所需樣本體積有效降至1/5。
如本文所用之術語「基於 」意謂「至少部分基於 」且指使用一值(或結果)來確定另一值，諸如在方法之輸入與該方法之輸出的關係中存在之值。如本文所用之術語「推導 」亦指方法之輸入與該方法之輸出的關係，諸如在推導為計算方程式時存在之關係。
如本文所用之術語「參數 」意謂表徵定量資料集及/或定量資料集之間的數值關係的數值。舉例而言，第一核酸序列之第一量與第二核酸序列之第二量之間的比率(或比率之函數)為參數。
如本文所用，術語「基因座 」或其複數形式為任何長度核苷酸(或鹼基對)之位置或位址，其在基因體間存在差異。
如本文所用之術語「序列失衡 」意謂臨床相關核酸序列之量與參考量之間存在如由至少一個截止值所定義之任何顯著偏差。序列失衡可包括染色體劑量失衡、對偶基因失衡、突變劑量失衡、單倍型劑量失衡及其他類似失衡。舉例而言，對偶基因或突變劑量失衡可在胎兒具有不同於母親之基因型從而在樣本中之特定基因座處產生失衡時出現。
如本文所用之術語「染色體非整倍性 」意謂染色體之定量與二倍體基因體之染色體定量之間存在變化。該變化可能為增加或喪失。其可能涉及整個一個染色體或染色體區域。
如本文所用之術語「單倍型 」係指在同一染色體或染色體區域上共同遺傳的多個基因座處之對偶基因的組合。單倍型可指少至一對基因座或指染色體區域，或指整個染色體。術語「對偶基因 」係指在同一實體基因體基因座處之替代DNA序列，其可能引起或可能不引起不同表型性狀。在任何特定二倍體生物體中，對於各染色體之兩個複本(除男性人類個體之性染色體以外)，各基因之基因型包含存在於該基因座處之對偶基因對，其在同型接合子中相同而在異型接合子中不同。生物體之群體或物種通常在不同個體間於各基因座處包括多個對偶基因。在群體中發現多於一個對偶基因之基因體基因座稱作多形位點。基因座處之對偶基因變異可量測為所存在對偶基因之數目(亦即多形度)或群體中異型接合子之比例(亦即異型接合率)。如本文所用，術語「多形現象 」係指人類基因體中之任何個體間變異，而不管其頻率如何。該等變異之實例包括(但不限於)單核苷酸多形現象、簡單串聯重複多形現象、插入-缺失多形現象、突變(其可為疾病成因)以及複本數變異。
詳細描述
未出生胎兒之部分遺傳圖譜或完整基因體序列之建構可基於其父母之多形序列之單倍型來提供。如本文所用之術語「單倍型 」係指在同一染色體或染色體區域上共同遺傳的多個基因座處之對偶基因的組合。舉例而言，實施例可分析來自母體樣本(含有母體及胎兒DNA)之DNA片段來鑑別某些指定基因座(界標)處之對偶基因。接著可對此等基因座處各別對偶基因之DNA片段之量一起進行分析來測定此等基因座之單倍型之相對量，且從而確定胎兒已自母體及/或父體基因體遺傳了何種單倍型。藉由鑑別胎兒單倍型，可測定處於包括指定基因座之相應基因體區域內之個別基因座處的胎兒基因型。在各種實施例中，可以測定胎兒基因體區域之方式來分析父母為同型接合與異型接合之特定組合的基因座。在一實施例中，連同分析母體樣本之DNA片段一起使用代表群體中共同之單倍型的參考單倍型來測定母體及父體基因體。
用於測定至少一部分胎兒基因體之一實施例之應用之實例可為親子測試(paternity testing)，其係藉由將推導出之胎兒基因型或單倍型與所謂父親之基因型或單倍型比較而進行。另一實例為偵測胎兒所獲得之一或多個新生突變或偵測在由其父母產生配子期間出現之減數分裂重組事件。此等為已受精之配子，且所得接合子發育成胎兒。
另外，一些實施例亦允許以任何所需解析度測定未出生胎兒之基因體序列。舉例而言，在某些應用中，實施例可允許測定胎兒之完全或接近於完全之基因體序列。在一實施例中，可測定之胎兒基因體序列之解析度取決於對父親及母親之基因體之認識的解析度連同來自含有胎兒核酸之母體生物樣本之定序資訊。在已知父親及母親之完全或接近完全之基因體序列之情況下，可推導出未出生胎兒之完全或接近完全之基因體序列。
在其他實施例中，僅闡明基因體內所選區域之基因體序列，例如用於對所選遺傳性、後生(諸如印記病症)或染色體病症進行產前診斷。一實施例可應用之遺傳性病症之實例包括血紅素病變(諸如β-地中海貧血症、α-地中海貧血症、鐮狀細胞貧血症、血色素E病)、囊腫性纖維化及性別相關病症(諸如血友病及杜顯氏肌肉萎縮症(Duchenne muscular dystrophy))。可使用一實施例偵測之突變的其他實例可見於線上人類孟德爾遺傳(Online Mendelian Inheritance in Man)(www.ncbi.nlm.nih.gov/omim/getmorbid.cgi)。
一些實施例亦可用於測定胎兒DNA之分數濃度，其可在對父母之特定基因體無任何先前認識下進行。類似分析亦可用於測定精確測定胎兒基因體所需之覆蓋深度。因此，此覆蓋度測定可用於評估需要分析多少資料方可獲得準確結果。
I.引言
當使用母體樣本(例如血漿或血清)作為用於闡明胎兒單倍型之物質時，可能存在兩大主要挑戰。第一項挑戰為母體血漿或血清由胎兒DNA及母體DNA之混合物組成，其中胎兒DNA為較少群體。已測定胎兒DNA在妊娠前六個月在母體血漿總DNA中的平均/中值濃度為約5%至10%(Lo YMD等人，Am J Hum Genet 1998;62: 768-775；Lun FMF等人，Clin Chem 2008;54: 1664-1672)。由於在血液凝固過程期間DNA自母體血細胞釋放，所以胎兒DNA在母體血清中之分數濃度可能比在母體血漿中之分數濃度甚至更低。因此，在一些實施例中，母體血漿優於母體血清。
第二項挑戰為母體血漿中之胎兒DNA及母體DNA由短片段組成(Chan KCA等人，Clin Chem 2004;50: 88-92)。實際上，在母體血漿中，胎兒來源之DNA一般短於母體來源之DNA。母體血漿中之大部分胎兒DNA的長度小於200 bp。單獨使用該等短血漿DNA片段，可能對在長基因體距離上建構遺傳多形現象之單倍型構成挑戰。上述關於母體血漿及血清之挑戰亦適用於在母體尿液中偵測胎兒DNA(Botezatu I等人，Clin Chem 2000;46: 1078-1084)。胎兒DNA在懷孕婦女尿液中之DNA中僅佔較少部分，且母體尿液中之胎兒DNA亦由短DNA片段組成。
A.對母體樣本進行定序及分析
一些實施例所用來解決第一項挑戰之途徑為使用允許以高精確度對自母體生物樣本獲得之核酸進行定量基因型分析的方法。在該途徑之一實施例中，藉由分析大量(例如數百萬個或數十億個)核酸分子來達成該精確度。此外，可藉由分析單核酸分子或純系擴增單核酸分子來提高該精確度。一實施例使用大規模並行DNA定序，諸如(但不限於)藉由以下平台所進行之大規模並行DNA定序：Illumina基因體分析儀平台(Illumina Genome Analyzer platform)(Bentley DR等人，Nature 2008;456: 53-59)、Roche 454平台(Margulies M等人，Nature 2005;437: 376-380)、ABI SOLiD平台(McKernan KJ等人，Genome Res 2009;19: 1527-1541)、Helicos單分子定序平台(Harris TD等人，Science 2008;320: 106-109)、使用單聚合酶分子進行之即時定序(Science 2009;323: 133-138)及nanopore定序(Clarke J等人，Nat Nanotechnol. 2009;4: 265-70)。在一實施例中，對生物樣本中核酸分子之隨機子集進行大規模並行定序。
在一些實施例中，自各分子獲得儘可能長的序列讀取結果(read)可為有益的。對可達成之定序讀取長度的一個限制為母體生物樣本中之核酸分子的性質。舉例而言，已知母體血漿中之大部分DNA分子由短片段組成(Chan KCA等人，Clin Chem 2004;50: 88-92)。此外，讀取長度(read length)須與在長讀取長度下定序系統之保真度保持平衡。對於上述某些系統，可能較佳自分子兩個末端獲得序列，亦即所謂末端配對定序(paired-end sequencing)。作為說明，一種途徑為自DNA分子之各末端進行50 bp定序，從而每個分子得到總共100 bp之序列。在另一實施例中，可自DNA分子之各末端進行75 bp定序，從而每個分子得到總共150 bp之序列。
在進行定序後，接著將該等序列再與參考人類基因體進行比對。由於實施例闡明由未出生胎兒自其父母遺傳之基因體變異，所以比對算法能夠處理序列變異。該種套裝軟體之一實例為由Illumina生產之有效大規模核苷酸資料庫比對(Efficient Large-Scale Alignment of Nucleotide Databases，ELAND)軟體。該種套裝軟體之另一實例為SOAP(短寡核苷酸比對程式)及SOAP2軟體(Li R等人，Bioinformatics 2008;24:713-714；Li R等人，Bioinformatics 2009;25:1966-1967)。
可能需要進行之DNA定序的量可視建構胎兒遺傳圖譜或胎兒基因體序列可能需要之解析度而定。一般而言，所定序之分子愈多，則解析度愈高。在指定程度或深度之DNA定序下的胎兒遺傳圖譜或胎兒基因體序列之解析度的另一決定因素為胎兒DNA在母體生物樣本中之分數濃度。一般而言，分數胎兒DNA濃度愈高，則可在指定程度之DNA定序下闡明之胎兒遺傳圖譜或胎兒基因體序列的解析度愈高。由於胎兒DNA在母體血漿中之分數濃度高於在母體血清中之分數濃度，因此對於某些實施例，母體血漿相較於母體血清為更佳之母體生物樣本類型。
上述基於定序之方法的輸送量(throughput)可隨索引法(indexing)或條形碼法(barcoding)之使用而增加。因此，可將樣本或患者特有之索引或條形碼添加至特定核酸定序文庫中之核酸片段。接著，將多個各具有樣本或患者特有之索引或條形碼之該等文庫混合於一起且共同定序。在定序反應後，可基於條形碼或索引自各樣本或患者收集定序資料。此策略可增加輸送量且從而增加本發明實施例之成本有效性。
在一實施例中，可在定量基因型分析(例如定序)之前選擇或分級分離生物樣本中之核酸分子。在一變化形式中，用可優先結合基因體中所選基因座處之核酸分子(例如，7號染色體上含有CFTR基因之區域)的器件(例如微陣列)處理核酸分子。接著，可優先對由該器件捕捉之核酸分子進行定序。此方案允許以相關基因體區域為目標進行定序。在該方案之一實施例中，可使用Nimblegen序列捕捉系統(www.nimblegen.com/products/seqcap/index.html)或Agilent SureSelect目標增濃系統(Agilent SureSelect Target Enrichment System)(www.opengenomics.com/SureSelect_Target_Enrichment_System)或類似平台。在一些實施例中，可對來自所選基因體區域之核酸分子進行隨機定序。
在另一實施例中，可首先藉由一組或多組擴增引子對生物樣本中之相關基因體區域進行擴增。接著可對所擴增之產物進行定量基因型分析(例如定序)。在此方案之一實施例中，可使用RainDance(www.raindancetech.com/technology/pcr-genomics-research.asp)系統。在一些實施例中，可對所擴增之核酸分子進行隨機定序。
亦可對生物樣本中之核酸分子進行大小分級分離(size fractionation)步驟。由於已知在母體血漿中胎兒DNA短於母體DNA(Li等人，Clin Chem 2004;50: 1002-1011；美國專利申請案20050164241；美國專利申請案20070202525)，所以可收集分子大小較小之部分且接著將其用於定量基因型分析(例如定序)。該部分所含之胎兒DNA之分數濃度高於原始生物樣本中之分數濃度。因此，對胎兒DNA增濃之部分進行定序可允許在特定程度之分析(例如定序深度)下以高於在使用非增濃樣本之情況下之解析度建構胎兒遺傳圖譜或推導出胎兒基因體序列。此因此可使該技術更具成本有效性。作為用於大小分級分離之方法的實例，可使用(i)凝膠電泳，繼而自特定凝膠部分萃取核酸分子；(ii)對不同大小之核酸分子具有不同親和力之核酸結合基質；或(iii)對不同大小之核酸分子具有不同滯留率的過濾系統。
在另一實施例中，可在核酸定序後優先分析特定大小或大小範圍之核酸分子。舉例而言，可進行末端配對定序，其中DNA分子之兩端進行定序。接著，可相對於參考人類基因體定位此兩端之基因體座標。接著可由減去兩端之基因體座標來推導出分子大小。一種進行該末端配對定序之方式為使用Illumina基因體分析儀之末端配對定序方案。另一推導DNA分子大小之方法為對整個DNA分子定序。此最容易藉由具有相當長讀取長度之定序平台進行，諸如Roche 454平台(Marguelis等人，Nature 2005;437: 376-380)及Pacific Biosciences單分子即時(SMRTTM )技術(Eid等人，Science 2009;323:133-138)。在推導出核酸分子大小後，可選擇將後續分析集中於小於特定大小截止值之分子，從而使胎兒DNA之分數濃度增濃。在大小選擇後，相較於未進行此程序，分析此分子之子集可以較少分析分子來推導出胎兒遺傳圖譜或胎兒基因體序列。在一個實施例中，使用300 bp之大小截止值。在其他實施例中，可使用250 bp、200 bp、180 bp、150 bp、125 bp、100 bp或75 bp之大小截止值。
B .使用親本基因體作為架權
為解決第二項挑戰，一些實施例可使用母親染色體的單倍型作為「架構」。父親染色體的單倍型亦可用作另一「架構」。可將此架構與獲自含有胎兒DNA之母體樣本之胎兒遺傳資訊比較。此胎兒遺傳資訊可用於確定母親及/或父親之架構如何在胎兒基因體中建立，從而使用該架構之組成部分來測定所得胎兒基因體。
親本單倍型可自父親及母親以及其他家族成員(例如當前所懷胎兒的兄弟姐妹)之基因體DNA建構。為降低基因體定序之成本，利用親本單倍型可能變得日益普遍。在一種情形中，若父母之一或兩者的基因體已經定序且其一或多個染色體區域之單倍型已經測定，則可將此資訊用作上述架構。
可使用任何為熟習此項技術者所已知之可查詢基因體中之序列變異的基因型分析平台，包括DNA定序、微陣列、雜交探針、基於螢光之技術、光學技術、分子條形碼及單分子成像(Geiss GK等人，Nat Biotechnol 2008;26: 317-325)、單分子分析、PCR、數位PCR、質譜(諸如Sequenom MassARRAY平台)等。作為更為極端之實例，藉由使用大規模並行定序方法進行整個基因體DNA定序來測定父親及母親之DNA序列(例如Bentley DR等人，Nature 2008;456: 53-59；McKernan KJ等人，Genome Res 2009;19: 1527-1541)。可能受到關注之序列變異的一實例為單核苷酸多形現象(SNP)。測定親本基因型之一尤其較佳方法為在全基因體(genomewide)尺度上或在所選基因體區域(例如含有突變可引起遺傳性疾病之基因(諸如β-球蛋白簇中之基因或囊腫性纖維化跨膜傳導調節蛋白(CFTR)基因)的區域)中對SNP進行微陣列分析。除序列變異外，亦可使用複本數變異。序列變異及複本數變異兩者皆稱作多形遺傳特徵(PMF)。
在一態樣中，可將染色體或相關染色體區域上之母體基因型建構成單倍型。一種可用以進行此操作之方式為分析與母親有關係之其他家庭成員(例如母親之兒女、父母、兄弟姐妹等)。另一可用以建構單倍型之方式為上述熟習此項技術者所熟知之其他方法。
基因型資訊接著可藉由與來自其他家庭成員(例如當前懷有之胎兒的兄弟姐妹)或來自祖父母之基因型等的基因型資訊相比較而擴展成父母之單倍型資訊。亦可藉由熟習此項技術者所熟知之其他方法來建構父母之單倍型。該等方法之實例包括基於單分子分析之方法，諸如數位PCR(Ding C及Cantor CR. Proc Natl Acad Sci USA 2003;100: 7449-7453；Ruano G等人，Proc Natl Acad Sci USA 1990;87: 6296-6300)、精子單倍型分析(LienS等人，Curr Protoc Hum Genet 2002；第1章：第1.6單元)及成像技術(Xiao M等人，Hum Mutat 2007;28: 913-921)。其他方法包括基於以下之方法：對偶基因特異性PCR(Michalatos-Beloin S等人，Nucleic Acids Res 1996;24: 4841-4843；Lo YMD等人，Nucleic Acids Res 1991;Nucleic Acids Res 19: 3561-3567)、選殖及限制酶消化(Smirnova AS等人，Immunogenetics 2007;59: 93-8)等。其他方法係基於允許藉由統計評估來推斷母體單倍型之群體中單倍型區塊(haplotype block)之分佈及連鎖不平衡結構(Clark AG. Mol Biol Evol 1990;7:111-22;10:13-9；Salem RM等人，Hum Genomics 2005;2:39-66)。
C.使用母體樣本之基因體資訊來組裝架構
在一實施例中，為得出何種母體染色體已傳給胎兒，使用相對單倍型劑量(RHDO)方法。此途徑之一般原理如下關於母親對於各遺傳多形現象而言為異型接合之實例所述。因此，存在兩個單倍型，且此等單倍型之相對劑量為1:1。然而，在母體樣本中，小比例胎兒DNA之存在可能改變相對單倍型劑量。此係因為胎兒已自母親遺傳了其一半單倍型互補序列而自父親遺傳了另一半單倍型互補序列。此外，對於各染色體，視減數分裂重組之發生率而定，胎兒可能遺傳到起源於父母中各自之一個或另一同源染色體之單倍型的『拼湊物(patchwork)』。所有此等因素可能使母體構成性DNA中之相對單倍型劑量偏離1:1比率。因此，對於指定染色體或染色體區域，可自由母體樣本產生之分析資料(例如定序資料)找出此等單倍型之組成對偶基因。
接著，可進行統計程序以測定相對單倍型劑量，或此等單倍型中之一者是否過度呈現(overrepresent)而多於另一單倍型。此統計程序之分類臨限值可根據分數胎兒DNA濃度加以調整。一般而言，分數胎兒DNA濃度愈高，可允許以愈少分子達到臨限值。分類臨限值亦可根據期望在基因體或相關基因體區域上達成之成功分類片段之數目加以調整。在一實施例中，可使用序列機率比率測試(SPRT)。
在一實施例中，可使用如美國專利申請案2009/0087847中所述之相對突變劑量(RMD)來測定在母親之特定多形現象處對偶基因之相對量。可使用此等相對量來確定胎兒之單倍型(例如在多形現象出現於連續或連鎖基因座處時)。此靶向途徑之一實施例為使用聚合酶鏈反應(PCR)以自所選基因體部分擴增特定序列用於RMD分析。為將此RMD途徑擴展至在大基因體區域或整個基因體上測定胎兒遺傳性，需要大體積母體樣本。
在一使用隨機定序之實施例中，不特定靶向相關基因體區域。因此，在相關基因體區域中獲得之序列數目不如在靶向途徑中獲得之序列數目那麼多(除非進行極深度定序)。然而，可彙集多個連鎖多形現象之計數以達成出於診斷目的必要之統計檢定力(statistical power)。使用此定序實施例之實際意義在於其可藉由避免過度深度定序之需要而節約成本。相較於基於數位PCR之途徑，其亦需要輸入較少量之母體樣本。
此外，需要分區塊進行該RHDO分析。換言之，可在一個或較佳多於一個區塊中分析各染色體。在一態樣中，後者可允許觀測減數分裂重組。舉例而言，胎兒之特定染色體之區段的單倍型可能似乎來自一個母體同源染色體，而同一胎兒染色體之另一區段似乎具有來自另一母體同源染色體之單倍型。SPRT分析可允許進行此分段(segmentation)。
舉例而言，可自染色體一末端開始對顯示所需親本基因型組態(亦即父親為同型接合且母親為異型接合)之鄰近SNP進行SPRT分析。此將繼續直至SPRT分析指示一種母體單倍型在母體血漿分析資料(例如定序資料)中佔優勢為止。接著，可『重設(reset)』SPRT分析且自顯示所需親本基因型組態之下一鄰近SNP重新開始SPRT分析。此可再繼續直至SPRT分析再次指示一種母體單倍型在母體血漿分析資料(例如定序資料)中佔優勢為止。此過程可繼續直至該染色體上之最後一個所選SNP為止。接著，可將染色體上之此等各個由SPRT測得之單倍型區段與母親基因體中之兩個同源染色體之單倍型相比較。當胎兒之單倍型區段似乎已自一個母體同源染色體變為另一同源染色體時，可見到減數分裂重組。即使每個染色體存在多於一次減數分裂重組，此系統亦可能有效。
如下文所述，亦可對於父親及母親兩者之組成遺傳多形現象皆為異型接合之基因體區域進行RHDO分析。此情形尤其適用於以下狀況：當父親與母親共有來自同一祖先起源之疾病基因突變型複本時(諸如當其為近親時)，或當疾病之主要突變由大奠基者效應(founder effect)(亦即大部分具有突變之個體自群體之共同祖先奠基者遺傳相同單倍型)所致時。因此，可使用此區域中父親及母親之單倍型來推導胎兒單倍型。
II.自母體基因體建構胎兒基因體
現描述在明確認識親本基因體下建構胎兒遺傳圖譜或闡明胎兒基因體序列。
A.方法
圖1為測定懷孕女性之未出生胎兒之至少一部分基因體的方法100之流程圖。胎兒有父親及為懷孕女性之母親。父親具有有兩個單倍型之父體基因體，且母親具有有兩個單倍型之母體基因體。方法100分析自懷孕女性獲得之生物樣本的核酸分子(片段)以測定胎兒之基因體。方法100主要關於在複數個基因座處父親為同型接合而母親為異型接合情形之實例來描述，而其他實例描述其他實施例。
方法100及本文所述之任何方法可完全或部分用包括處理器之電腦系統執行，該電腦系統可經組態以執行各步驟。因此，實施例係關於電腦系統，其經組態以執行本文所述之任何方法之步驟，潛在地具有執行各別步驟或各別組步驟之不同組件。儘管本文之方法之步驟以編號之步驟呈現，但本文之方法之步驟可同時或以不同次序進行。另外，此等步驟之部分可與其他方法之其他步驟之部分一起使用。同樣，步驟之全部或部分可視情況選用。另外，任何方法之任何步驟可用用於執行此等步驟之模組、電路或其他構件執行。
在步驟110中，鑑別母體基因體為異型接合之第一複數個基因座。在一實施例中，此測定可作為在全基因體層面或在所選相關基因體基因座處對父親及母親進行基因型分析的一部分來進行。在其他實施例中，可在分析母體樣本期間對第一複數個基因座進行測定，其描述於隨後章節中。
在步驟120中，測定覆蓋第一複數個基因座之兩個母體單倍型中之每一者。如上文所提及，可藉由直接定序獲得母體基因體。在其他實施例中，可在複數個基因座處進行基因型分析，且接著使用預期具有相似基因體(例如來自家庭成員或來自相同或相似群體中共同之參考基因體)之某人的已定位基因體。在一實施例中，可首先對母體基因體之全部或部分執行步驟120，且接著可研究母體基因體以找出母親為異型接合之基因座。
在一態樣中，不必要建構父親染色體之單倍型。然而，若可建構父體單倍型，則可自定序結果獲得額外資訊。一該額外資訊包括如下事實：可對父母兩者皆為異型接合之區域進行相對單倍型劑量分析。若可獲得父體單倍型則可獲得之另一條額外資訊為關於以下之資訊：涉及一或多個父體染色體之減數分裂重組以及確定與該等多形現象連鎖之疾病對偶基因是否已傳給胎兒。
在步驟130中，測定在第一複數個基因座之每一者處由胎兒自父親遺傳之對偶基因。一些實施例使用對於父親而言為同型接合但對於母親而言為異型接合(如步驟110中所提及)的基因體基因座。因此，若父親在該等基因座處為同型接合，則自父親遺傳之對偶基因已知。可以本文所述之任何方式對父親進行基因型分析以確定父親為同型接合之基因座。在一實施例中，可基於對父親及母親進行基因型分析以找出父親為同型接合而母親為異型接合之基因座來確定第一複數個基因座。
在另一實施例中，可使用父體基因體中為異型接合之第二複數個基因座來測定在父親為同型接合之第一複數個基因座胎兒遺傳之父體單倍型。舉例而言，若母體基因體在第二複數個基因座處為同型接合，則可鑑別在第二複數個基因座之各別基因座處存在於父體基因體中但不存在於母體基因體中之對偶基因。接著可將所遺傳之父體單倍型鑑別為具有所鑑別對偶基因之單倍型，且用於測定在第一複數個基因座處自父親遺傳之對偶基因。測定父體單倍型之此等態樣更詳細論述於下文中。
在步驟140中，分析自懷孕女性獲得之生物樣本中之複數個核酸分子。樣本含有母體核酸與胎兒核酸之混合物。可採集母體生物樣本且接著接收以供分析。在一實施例中，使用母體血漿及血清。在其他實施例中，可使用母體血液、母體尿液、母體唾液、子宮灌洗液或自母體血液獲得之胎兒細胞。
在一實施例中，分析核酸分子包括鑑別核酸分子在人類基因體中之位置及測定核酸分子在個別基因座處之對偶基因。因此，一實施例可使用核酸分子之來自相同基因座之已測定對偶基因來進行定量基因型分析。可使用任何允許測定母體生物樣本中之核酸分子之基因體位置及對偶基因(關於基因型之資訊)的方法。該等方法中之一些方法描述於美國申請案12/178,181及12/614350以及題為「Size-Based Genomic Analysis」之申請案中。
在步驟150中，基於核酸分子之已測定對偶基因，測定在第一複數個基因座之每一者處之各別對偶基因的量。在一實施例中，該等量可為第一基因座處各類型對偶基因之數目。舉例而言，6個A及4個T。在另一實施例中，量可為具有特定對偶基因之核酸分子的大小分佈。舉例而言，相對量亦可包括具有特定基因型之片段的大小分佈，其可轉換為具有某些長度之片段的相對量。該等相對量亦可提供關於何種基因型處於胎兒基因體中的資訊，因為胎兒片段傾向於比母體片段小。量及方法之一些實例描述於美國申請案12/178,181及12/614350以及題為「Size-Based Genomic Analysis」之申請案中。
在一實施例中，基因座處之對偶基因的相對量可提供關於胎兒遺傳了何種基因型的資訊(例如，在資料集已達到充足統計檢定力後)。舉例而言，相對量可用於確定在基因座處相對於母親之基因型是否出現序列失衡。上文所引用之相關專利申請案提供關於偵測特定基因座或區域處之序列失衡之實施例的實例。
在步驟160中，比較核酸分子之處於第一複數個基因座中多於1個基因座處之各別對偶基因的相對量。在一些實施例中，在進行比較之前合計第一複數個基因座中各基因座處之各對偶基因(包含單倍型)的量。接著可比較親本單倍型之合計量以確定單倍型是否過度呈現、等量呈現或過少呈現(under-represent)。在其他實施例中，比較基因座處對偶基因之量，且使用對多個基因座之比較。舉例而言，可合計分離值(例如差值或比率)，其可用於與截止值進行比較。此等實施例中之每一者可適用於本文所述之任何比較步驟。
在各種實施例中，相對量可為在特定基因座處具有特定對偶基因之各片段之數目的計數、在特定單倍型上來自任何基因座(或區域中之任何基因座)之片段數目的計數以及特定基因座處或特定單倍型上之計數的統計值(例如平均值)。因此，在一實施例中，比較可為測定各基因座處一個對偶基因相對於另一對偶基因的分離值(例如差值或比率)。
在步驟170，基於比較，可確定在基因體由第一複數個基因座覆蓋之部分中未出生胎兒自母親遺傳之單倍型。在一實施例中，為得出何種母體染色體已傳給胎兒，使用例如如上文所述之相對單倍型劑量(RHDO)方法。由於母親對於第一基因座之每一者為異型接合，所以第一基因座對應於第一基因座之基因體區域的兩個單倍型。若樣本僅來自母親，則此等單倍型之相對劑量應為1:1。與此比率有偏差或無偏差可用於確定胎兒自母親(及父親，其隨後更詳細描述)遺傳之單倍型。因此，對於指定染色體或染色體區域，可自在步驟130中產生之分析資料(例如定序資料)中尋找此等單倍型之組成對偶基因。
由於對複數個基因座進行分析且與母親之單倍型進行比較，所以基因座之間的序列可歸於特定單倍型。在一實施例中，若若干基因座匹配特定單倍型，則基因座之間的序列區段可假定為與母體單倍型之序列區段相同。由於出現減數分裂重組，所以胎兒遺傳之最終單倍型可由源自此等兩個同源染色體中之一者的『單倍型區段』之拼湊物組成。實施例可偵測該重組。
可偵測該重組之解析度取決於父親及母親構成性DNA中已測定之遺傳標記之數目及分佈以及後繼生物資訊分析(使用例如SPRT)中所用之臨限值而定。舉例而言，若該比較表明在第一組連續基因座中之每一者處自母親遺傳之對偶基因對應於第一單倍型，則可確定對於對應於第一組基因座之基因體位置，第一單倍型得到遺傳。若第二組連續基因座表明第二單倍型得以遺傳，則可確定對於對應於第二組基因座之基因體位置，第二單倍型得到遺傳。
在一實施例中，由於分析了複數個基因座，所以可以較大準確性測定單倍型。舉例而言，一基因座之統計資料可能不具決定性，但當與其他基因座之統計資料組合時，可確定何種單倍型得以遺傳。在另一實施例中，可獨立分析各基因座以進行分類，且接著可對該等分類進行分析以確定對於指定區域而言何種單倍型得以遺傳。
在一實施例中，可執行統計程序以確定相對單倍型劑量(例如，此等單倍型中之一者是否相對於另一單倍型過度呈現)。此統計程序之分類臨限值可根據分數胎兒DNA濃度進行調整。一般而言，分數胎兒DNA濃度愈高，可允許以愈少分子達到臨限值。分類臨限值亦可根據期望涵蓋基因體或相關基因體區域達成的成功分類區段數目進行調整。
再參考圖1，在步驟180中，可分析胎兒基因體之突變。舉例而言，實施例可用於在特定群體中尋找引起遺傳性疾病之突變組。可使用實施例偵測之突變之實例可見於線上人類孟德爾遺傳(www.ncbi.nlm.nih.gov/omim/getmorbid.cgi)。可在步驟140-160期間尋找此等突變；或可作為如此處所述之各別步驟。舉例而言，在父親為一或多個突變(其不存在於母親體內)之攜帶者的家庭中，則可自來自母體生物樣本之分析資料(例如定序資料)中尋找突變。
除偵測實際突變之外，亦可尋找與父親或母親體內之突變型或野生型對偶基因連鎖之多形性遺傳標記。舉例而言，RHDO分析可揭示胎兒已遺傳來自已知攜帶有疾病突變之母親的單倍型。本發明之實施例亦可用於對由染色體區域缺失所致之疾病(例如引起α-地中海貧血症之東南亞型缺失(Southeast Asian deletion))進行非侵入性產前診斷。在父親及母親兩者皆為缺失之攜帶者之情形中，若胎兒對於該缺失而言為同型接合，且若對母體血漿DNA進行大規模並行定序，則在母體血漿中源自缺失區域之DNA序列的頻率應降低。
B.實例
此章節描述應用於母親為異型接合之單核苷酸多形現象(SNP)之實施例(方法100)之實例。同一染色體上之SNP對偶基因形成單倍型，其中母親具有一對同源染色體，且因此具有兩個單倍型。為說明如何進行該種測定，例如如圖2中所示，研究3號染色體上之區段。
圖2展示父親之某一特定基因體碼區段的兩個單倍型及母親之某一特定基因體碼區段的兩個單倍型。在此區段中發現5個SNP，其中對於此等SNP中之全部5個，父親與母親分別為同型接合與異型接合。父親之兩個同源染色體具有相同單倍型(Hap)，亦即A-G-A-A-G(圖2中自上而下)。為簡單起見，父體單倍型稱作Hap I及Hap II，請記住對於此組5個SNP而言，此等單倍型兩者皆相同。對於母親，觀測兩個單倍型，亦即Hap III(A-A-A-G-G)及Hap IV(G-G-G-A-A)。
此實例中之SNP可進一步分為兩種類型。圖3展示本發明之實施例的SNP之兩種類型。類型A由父體對偶基因與母體單倍型III上之對偶基因相同的SNP組成。類型B由父體對偶基因與母體單倍型IV上之對偶基因相同的SNP組成。
此等兩種類型之SNP可能需要稍有不同之數學處理。因此，在類型A之情形中，胎兒遺傳單倍型III將引起單倍型III相對於單倍型IV在母體血漿中過度呈現(圖4A)。舉例而言，為便於論述，僅考察一個SNP 410，對偶基因A係自父親遺傳，且若自母親遺傳Hap III，則胎兒將對樣本貢獻兩個A對偶基因，此將引起A過度呈現。若胎兒遺傳單倍型IV，則不會見到過度呈現，因為胎兒亦在基因座處為A與G之異型接合。
另一方面，在類型B之情形中，胎兒遺傳單倍型III將引起單倍型III與單倍型IV在母體血漿中等量呈現(圖4B)。舉例而言，考察SNP 420，自父親遺傳G以及作為Hap III之一部分的A將使胎兒在SNP 420處貢獻等量A與G，正如母親一樣。若胎兒遺傳單倍型IV，則如自上述論述所證實將觀測到過度呈現。
圖5A及5B展示關於比較各基因座之片段的相對量(例如計數)以及比較結果是否將特定單倍型分類為遺傳性或非遺傳性的分析。存在適合父親及母親之此等基因型組態中之一者之SNP(例如類型A或類型B之情形)的任何基因體位置可用於此實例。在母體血漿定序資料中，可關注對應於SNP之特定對偶基因的已定序分子之數目。可使用SPRT分析(或其他比較法)來確定此等對偶基因間是否存在任何對偶基因失衡(Lo YMD等人，Proc Natl Acad Sci USA 2007;104: 13116-13121)。
圖5A展示對類型ASNP之分析。如所示，對於各SNP，對相對量(例如如由分離值所定義)與截止值進行SPRT比較以提供分類。在一實施例中，若達到SPRT之分類臨限值，則推斷胎兒遺傳了特定母體單倍型。接著可重設SPRT分析之計數。接著，將分析移至適合所需基因型組態之鄰近SNP(自端粒至著絲點方向或反之亦然)；且可自此下一SNP開始新的SPRT分析。
另一方面，在一實施例中，若SNP未達到SPRT之分類，則吾人亦可以類似方式移至鄰近SNP，例外為可將對下一SNP之計數與先前計數相加，且接著可再進行SPRT。此過程可繼續直至達到分類臨限值為止。圖5A及圖5B說明類型A及類型B分析之此過程的操作。在一實施例中，對分類一起進行分析以產生一區域之總分類。舉例而言，若獲得第一組SNP之分類，以及下一組SNP之分類，則可將兩者之分類進行比較以察看分類是否一致。
圖6說明改變SPRT分類之概似比的影響(ZhouW等人，Nat Biotechnol 2001;19:78-81；Karoui NE等人，Statist Med 2006;25:3124-33)。一般而言，分類之概似比較低(例如8)則較易於進行分類。此可在基因體內產生較大數目之經分類區域。然而，多個該等區域預期會引起錯分類。另一方面，分類之概似度較高(例如1200)則可能僅允許在評定了較多SNP時進行分類。此可在基因體內產生較少數目之經分類區域。錯分類區域之數目及比例在與使用較低分類臨限值之情況相比較時預期較低。
在一實施例中，僅當兩個連續SPRT分類得到相同單倍型(稱作「兩個連續區塊」算法)時作出分類。在一態樣中，「兩個連續區塊」算法可增加分類之準確性。在一些實施例中，對於序列之任何連綿區段(stretch)，一實施例可首先針對類型A SNP進行SPRT分析，且接著針對類型BSNP進行另一SPRT分析。在一實施例中，可考慮類型A與類型BSNP形成交錯之兩組遺傳界標(例如SNP)之序列連綿區段的情況。在使用「兩個連續區塊」算法之實施例中，兩個區塊可為不同類型。
來自類型A及類型B分析之SPRT結果可允許檢查其分類結果一致或不一致。為提高分類準確性，一實施例(「交錯途徑」)可僅當針對指定基因體區域之類型A與類型B分析兩者皆得到一致結果時作出分類。若兩個分析得到不一致結果，則吾人可考察緊接於該區域之兩個連續分類區域之分類結果，其中一個區域處於著絲點末端而另一區域處於端粒末端。若此等兩個連續區域得到一致結果，則吾人可將第一區域分類為具有此等兩個區域之連續單倍型。若此等兩個連續區域未得到一致結果，則吾人可移至下兩個連續區域直至觀測到一致為止。此方案之一種變化形式為僅沿一個方向移動且獲得下一個或兩個或甚至更多個連續區域之分類結果作為所關注原始區域之結果。一般原理為使用相鄰基因體區域之分類結果來確認特定區域之分類結果。
III.確定胎兒遺傳之父體對偶基因
圖7為確定懷孕女性之未出生胎兒自父親遺傳之至少一部分基因體之方法700的流程圖。方法700分析自懷孕女性獲得之生物樣本中的核酸分子(片段)以確定胎兒之基因體。樣本含有母體核酸與胎兒核酸之混合物。
在步驟710中，分析生物樣本中之複數個核酸分子中之每一者以鑑別核酸分子在人類基因體中之位置且確定核酸分子之對偶基因類型。因此，在一實施例中可確定核酸分子在特定位置(基因座)處之基因型。上文及其他處所述之任何方法可用於此分析。
在步驟720中，確定父體基因體為異型接合且母體基因體為同型接合之第一複數個基因座。在一實施例中，藉由確定父體及母體基因體來獲得第一複數個基因座。可在該等基因體中尋找父親為異型接合且母親為同型接合之基因體基因座。
在步驟730中，基於第一複數個基因座處之所確定基因型確定由第一複數個基因座覆蓋之基因體部分中由未出生胎兒自父親遺傳之單倍型。在一實施例中，在分析資料(例如定序資料)中尋找此等基因座每一者中由父親所具有但不存在於母親基因體中之對偶基因。此等對偶基因之組合將會指示胎兒自父親遺傳之染色體單倍型。
在另一實施例中，若父親基因體中各染色體或相關染色體區域之單倍型已知，則亦可確定在父親體內精子生成期間何處發生減數分裂重組。因此，當胎兒與父親之間父體遺傳性染色體中之DNA連綿區段之單倍型不同時見到父體減數分裂重組。在使用分析資料(例如定序資料)以藉由對遺傳多形現象之連鎖分析來對遺傳性疾病進行產前診斷時，納入該重組資訊係適用的。
IV.父親與母親對於基因體區域皆為異型接合
實施例可處理父親與母親對於基因體區域而言皆為異型接合之情形。此情形尤其適用於父親與母親為近親的家庭中。當疾病與由大奠基者效應引起之主要突變相關時亦適用。在該等情況下，預期若未出生胎兒之父親與母親皆為突變基因之攜帶者，則除出現減數分裂重組事件以外，攜帶突變基因複本之染色體單倍型基本上相同。此類型分析可尤其適用於體染色體隱性基因疾病，諸如囊腫性纖維化、β-地中海貧血、鐮狀細胞性貧血及血色素E疾病。
圖8為根據本發明之實施例確定在母親與父親皆為異型接合之區域中未出生胎兒之至少一部分基因體的方法800之流程圖。
在步驟810中，確定父親與母親皆為異型接合之第一複數個基因座。在一實施例中，藉由本文所提及之任何方法確定第一基因座。舉例而言，可對親本基因體之全部或區域進行定序，或對不同部分進行基因型分析以找出第一基因座。因此，第一複數個基因座處兩個父體單倍型中之每一者及兩個母體單倍型中之每一者可為已知的。
作為實例，圖9展示在特定基因體區域中父親與母親皆為異型接合的單倍型。如所示，父母兩者在區域1中皆具有突變基因(對偶基因)。特定而言，父親之Hap I與母親之Hap III具有突變基因。亦如所示，父親與母親可各具有攜帶野生型基因複本之另一染色體複本。特定而言，父親之Hap II與母親之Hap IV具有野生型基因。因此，此實例適用於確定胎兒是否遺傳了突變基因。攜帶野生型基因之父親與母親之染色體在緊接於該基因處具有相同單倍型，但在遠離該基因處可能具有相異單倍型。由於此染色體可能具有不同祖先起源，所以在父親與母親之間此染色體在整個染色體中不可能具有相同單倍型。
在步驟820中，確定父親為異型接合但母親為同型接合之第二複數個基因座。如所示，第一複數個基因座與第二複數個基因座處於同一染色體上。區域2展示該等第二基因座。區域2可經選擇以使父親對於此區域中之一或多個SNP而言為異型接合而母親在此區域中為同型接合。
在步驟830中，可分析懷孕女性之樣本中之片段以鑑別人類基因體中之位置及基因型。該位置可用於確定片段(核酸分子)是否包括第一基因座中之一或多者或第二基因座中之一或多者。此資訊接著可用於確定自父親遺傳之單倍型及自母親遺傳之單倍型。
在步驟840中，藉由分析在第二基因座中至少一者處生物樣本中複數個核酸分子之所確定基因型來確定兩個父體單倍型中之何者已遺傳給胎兒。舉例而言，可自母體生物樣本之分析資料(例如自步驟710得到之位置及基因型)中尋找僅存在於父親基因體中但不存在於母親基因體中之SNP對偶基因(諸如在圖9中由*標記之T對偶基因及由+標記之A對偶基因)。如可對於方法700所進行，若自母體血漿中偵測到由*標記之T對偶基因，則意謂胎兒自父親遺傳單倍型II(Hap II)。相反，若自母體血漿中偵測到由+標記之A對偶基因，則意謂胎兒自父親遺傳Hap I。
在步驟850中，比較第一複數個基因座中多於一者上核酸分子之所確定基因型的相對量。在一實施例中，合計各基因座處之量且比較母體單倍型之相對量。相對量可指所計數之數目、大小分佈以及任何其他參數，其可轉換成關於何種基因型處於胎兒基因體中之特定基因座處的資訊。
在步驟860中，基於已確定胎兒遺傳之父體單倍型以及基於相對量之比較，確定在由第一複數個基因座覆蓋之基因體部分中由未出生胎兒自母親遺傳之單倍型。因此，考慮區域2中胎兒遺傳之父體單倍型，可在母體生物樣本之分析資料中對區域1中之SNP進行RHDO分析(例如如上文所述)以確定兩個母體單倍型中之何者遺傳給胎兒。在一實施例中，假定當區域1與區域2自父母傳給胎兒時此等區域之間不存在重組。
舉例而言，考慮胎兒已由區域2分析確定自父親遺傳Hap I之情形。接著，胎兒自母親遺傳Hap III(其在區域1中與Hap I相同)會使Hap III相對於Hap IV在母體血漿中過度呈現。相反，若胎兒自母親遺傳Hap IV，則將在母體血漿中觀測到等量呈現之Hap III與Hap IV。
作為另一實例，考慮胎兒已由區域2分析確定自父親遺傳Hap II之情形。接著，胎兒自母親遺傳Hap IV(其在區域1中與Hap II相同)會使Hap IV相對於Hap III在母體血漿中過度呈現。相反，若胎兒自母親遺傳Hap III，則將在母體血漿中觀測到等量呈現之Hap III與Hap IV。
在先前章節中，吾人已使用藉由母體血漿DNA之定序獲得之資料以及胎兒父母之基因型資訊推導出胎兒基因體及分數胎兒DNA濃度。在以下章節中，吾人描述在尚無關於母體與父體基因型/單倍型之先前資訊下推導分數胎兒DNA濃度及胎兒基因型的實施例。
V.測定分數胎兒DNA濃度
在一些實施例中，視情況選用之步驟為測定分數胎兒DNA濃度。在各種態樣中，此分數濃度可指導分析量(例如所需之定序量)或允許評估對指定量之資料(例如基因體序列覆蓋深度)之分析的準確性。測定分數胎兒DNA濃度亦可適用於確定用於確定何種單倍型及/或基因型得以遺傳之分類的截止值。
在一實施例中，可藉由在分析資料(例如，如可在步驟140及710中獲得)中尋找對於父親及母親而言為同型接合但對偶基因不同之基因座來測定分數胎兒DNA濃度。舉例而言，對於兩個對偶基因A與G之SNP；父親可為AA而母親可為GG，且反之亦然。對於該等基因座，胎兒應為絕對異型接合子(obligate heterozygote)。在上述實例中，胎兒基因型應為AG，且對偶基因A在母體樣本中之比例可用於測定分數胎兒DNA濃度。在另一實施例中，可進行統計分析以確定母親為同型接合而胎兒為異型接合之基因座。以此方式，不需要關於母親基因體或父體基因體之先前資訊。
作為在分析資料中尋找之替代方案，亦可藉由另一途徑，諸如使用PCR檢定、數位PCR檢定或基於質譜、基於一組多形性遺傳標記之檢定來測定分數胎兒DNA濃度(LunFMF等人，Clin Chem 2008;54: 1664-1672)。另一替代方案為使用胎兒與母親之間DNA甲基化不同之一或多個基因體基因座(Poon LLM等人，Clin Chem 2002;48: 35-41；Chan KCA等人，Clin Chem 2006;52: 2211-2218；美國專利6,927,028)。另一替代方案為使用自參考群體(例如處於相似胎齡)所測定之近似分數胎兒DNA濃度。然而，由於樣本與樣本之間分數胎兒DNA濃度有所不同，所以此後一途徑的準確性預期低於特定地針對所測試之樣本量測濃度之情況下的準確性。
A.針對絕對異型接合子測定分數濃度
在胎兒為絕對異型接合子之實施例中，可使用以下一系列計算(例如使用大規模並行定序)來測定分數胎兒DNA濃度。使p為母體基因體中不存在之胎兒對偶基因的計數。使q為另一對偶基因(亦即母體基因體與胎兒基因體中共有之對偶基因)之計數。分數胎兒DNA濃度由下列方程式得到：
在一實施例中，可對滿足親本基因型組態(例如父母兩者皆為同型接合但對偶基因不同)之不同多形性基因座或多形性遺傳特徵之累積資料進行此計算。
B.基於資訊性(Informative)SNP之測定
亦可對於母親為同型接合而胎兒為異型接合之任何基因座，而非僅當母親對於一個對偶基因為同型接合而父親對於另一對偶基因為同型接合時測定分數胎兒DNA濃度。兩種方法提供基因座是否具有資訊性。術語「資訊性SNP」可用於不同情形中，視需要何種資訊而定。在一種情形中，資訊為胎兒基因體中特定基因座處存在而在母體基因體中之彼基因座處不存在之對偶基因。因此，母親為同型接合而胎兒為異型接合之SNP子集對於測定胎兒DNA濃度之情形可稱作「資訊性SNP」。母親與胎兒皆為異型接合但至少一個對偶基因不同之情況亦可用作資訊性SNP。然而，三對偶基因SNP在基因體中相對不常見。
圖10為說明根據本發明之實施例用於測定母體樣本中胎兒物質之分數濃度之方法1000的流程圖。在步驟1010中，可分析懷孕女性之樣本中之片段以鑑別人類基因體中之位置及對偶基因類型(此可獲得該位置處之基因型測定)。在一實施例中，藉由對自懷孕女性獲得之生物樣本中之複數個核酸分子進行定序來對片段進行分析。在其他實施例中，可使用即時PCR或數位PCR。
在步驟1020中，一或多個第一基因座經確定具資訊性。在一些實施例中，母體基因體為同型接合，但在樣本中於資訊性基因座處偵測到非母體對偶基因。在一實施例中，胎兒基因體在各第一基因座處為異型接合，而母體基因體在各第一基因座處為同型接合。舉例而言，胎兒基因體在第一基因座處可具有各別第一對偶基因及第二對偶基因(例如TA)，而母體基因體在第一基因座處可具有兩個各別第二對偶基因(例如AA)。然而，該等基因座例如在胎兒不為絕對異型接合子之情況下並非先前已知。
在確定資訊性基因座之一實施例中，考慮母親為同型接合之SNP。對於母親為同型接合之SNP，胎兒為相同對偶基因之同型接合或為異型接合。舉例而言，若SNP對於A與T具多形性，且母親具有AA之基因型，則胎兒之基因型為AA或TA。在此狀況下，T對偶基因在母體血漿樣本中之存在指示胎兒基因型為TA而非AA。某些實施例可藉由如下文所述計算必需截止值來解決T對偶基因存在多少可指示TA之基因型的問題。
在步驟1030中，對於第一基因座中之至少一者，測定各別第一對偶基因之計數的第一數目p以及各別第二對偶基因之計數的第二數目q。在一實施例中，可藉由多種方法，例如(但不限於)即時PCR、數位PCR及大規模並行定序來測定母體血漿中胎兒特有之對偶基因(T對偶基因)及共有對偶基因(A對偶基因)的計數。
在步驟1040中，基於第一及第二數目計算分數濃度。在一實施例中，對於懷孕婦女具有基因型AA且其胎兒之基因型為TA，可使用如下方程式來計算分數胎兒DNA濃度(f)：f=2×p/(p+q)，其中p表示胎兒特有之對偶基因(對偶基因T)之計數，而q表示母親與胎兒共有之對偶基因(對偶基因A)之計數。
在另一實施例中，藉由使用多個資訊性SNP，可以提高之準確性評估胎兒DNA在母體血漿中之分數濃度。對於使用多個SNP(總共n個SNP)之對偶基因計數，可使用如下方程式來計算分數胎兒DNA濃度(f)：
其中p i 表示資訊性SNPi 之胎兒特有之對偶基因的計數；q i 表示資訊性SNPi 中母親與胎兒共有之對偶基因的計數；而n表示資訊性SNP之總數。使用多個SNP之對偶基因計數可提高評估分數胎兒DNA濃度之準確性。
C.在無明確父母遺傳資說下測定分數濃度
現描述不需要關於胎兒及母親之基因型之先前資訊的用於測定母體血漿樣本中分數胎兒DNA濃度之方法。在一實施例中，藉由對母體血漿中資訊性SNP基因座處之不同對偶基因進行計數來對資訊性SNP進行鑑別。因此，可使用方法1000以及基於下文所述之實施例對資訊性SNP之測定。首先，提供機率描述以幫助瞭解用於鑑別資訊性SNP之截止值的計算。
在一實施例中，偵測胎兒特有之對偶基因之機率遵循泊松分佈(Poisson distribution)。偵測胎兒特有之對偶基因之機率(P)可使用下列方程式計算：P=1-exp(-f×N/2)，其中f表示母體血漿樣本中之分數胎兒DNA濃度，N表示對應於所分析之此特定SNP基因座之分子的總數；而exp()表示指數函數。在一態樣中，P可視作預期分佈，因為其並非為藉由量測多個樣本中分子之量所產生之分佈。在其他實施例中，可使用其他分佈。
假定分數胎兒DNA濃度為5%(前三個月妊娠之典型值)且分析對應於此SNP基因座之100個分子(母體+胎兒)(等於50個二倍體基因體中所含之量)，則偵測胎兒特有之對偶基因(T對偶基因)之機率為1-exp(-0.05×100/2)=0.92。偵測胎兒特有之對偶基因之機率隨分數胎兒DNA濃度及針對SNP基因座所分析之分子數目而增加。舉例而言，若胎兒DNA濃度為10%且分析100個分子，則偵測胎兒特有之對偶基因之機率為0.99。
因此，在母親為同型接合之SNP基因座處，在母體血漿中不同於母體對偶基因之對偶基因的存在可指示該SNP對於計算分數胎兒DNA濃度而言具「資訊性」。遺漏任何資訊性SNP之機率可視所分析之分子數目而定。換言之，對於偵測資訊性SNP之任何所需置信度(confidence)而言，需要分析以獲得所需準確性之分子數目可根據泊松機率函數來計算。
使用上述分析，一些實施例可在尚未知母親之基因型時確定基因座是否具資訊性。在一實施例中，鑑別在母體血漿樣本中偵測到兩個不同對偶基因的基因座。舉例而言，對於具有兩個可能對偶基因A與T之SNP基因座，在母體血漿中偵測到A與T對偶基因兩者。
圖11為根據本發明之實施例確定基因座是否具資訊性之方法1100的流程圖。在一實施例中，方法1100可用於實施方法1000之步驟1020。在另一實施例中，方法1100之一個步驟為基於統計分佈來確定截止值，且另一步驟使用該截止值來確定基因座(SNP)是否具資訊性。
在步驟1110中，確定在特定基因座處各別第一對偶基因之預測計數之數目的截止值。在一實施例中，該截止值預測母體基因體是否為同型接合而胎兒基因體是否為異型接合。在一實施例中，基於特定基因座處同型接合與異型接合之不同組合之計數數目的統計分佈來確定截止值。舉例而言，可使用泊松分佈函數來預測對偶基因頻率分佈。
在步驟1120中，基於對母體樣本之核酸分子的分析(例如來自步驟1010)，偵測基因座處之第一對偶基因與第二對偶基因。舉例而言，可將一組片段定位至所分析之基因座且偵測第一對偶基因或第二對偶基因。第一對偶基因可對應於來自步驟1020之各別第一對偶基因中之一者，且第二對偶基因可對應於各別第二對偶基因中之一者。在一實施例中，若未偵測到兩個不同對偶基因，則已知該基因座不具資訊性。
在步驟1130中，基於對核酸分子之分析確定基因座處各別第一對偶基因之實際計數之數目。舉例而言，可對複數個核酸分子之定序結果進行計數以確定具有第一對偶基因之基因型之片段定位至該基因座的次數。
在步驟1140中，基於實際計數之數目與截止值之比較將該基因座鑑別為第一基因座中之一者。在一態樣中，可使用截止值來區分三種可能性：(a)母親為同型接合(AA)且胎兒為異型接合(AT)；(b)母親為異型接合(AT)且胎兒為異型接合(AT)；及(c)母親為異型接合(AT)且胎兒為同型接合(AA)或(TT)。為說明起見，下文實例假定胎兒基因型在情形(c)中為AA。然而，若胎兒之基因型為TT，則計算相同。資訊性基因座可具有可能性(a)。
在一實施例中，當實際計數之數目小於截止值時，該基因座鑑別為第一基因座中之一者。在另一實施例中，下限臨限值亦可用於確保不會出現偽定位。
現描述確定截止值之實施例。基於生理學上可能之分數胎兒DNA濃度(此資訊可自先前研究得到)以及對應於SNP基因座之分子的總數，可針對上述三種可能情形預測對偶基因計數之分佈。基於預測分佈，可確定截止值以解釋在母體血漿中所觀測到之對偶基因計數來確定SNP是具有「資訊性」(亦即情形(a))抑或不具「資訊性」。
分數胎兒DNA濃度通常在早期妊娠時處於5%至20%之範圍內，且在晚期妊娠時處於10%至35%之範圍內(Lun等人，Microfluidics digital PCR reveals a higher than expected fraction of fetal DNA in maternal plasma. Clin Chem 2008;54:1664-72)。因此，在一實施例中，確定針對5%及20%分數胎兒DNA濃度之對偶基因計數的預測分佈。
圖12A展示在假定分數胎兒DNA濃度為20%時，對於三種情形，對偶基因T(情形(a)及(c)中豐度較低之對偶基因)之計數的預測分佈。圖12B展示在假定胎兒DNA為5%時，對於三種情形，對偶基因T(情形(a)及(c)中豐度較低之對偶基因)之計數的預測分佈。在兩個預測模型中，假定對於SNP基因座分析總共200個分子。
使用豐度較低對偶基因(T對偶基因)存在40個計數作為截止值，可以統計學方式區分三種可能性。換言之，對於在母體血漿中偵測到之具有兩個對偶基因之任何SNP基因座且在分析總共200個分子時，若次要對偶基因(豐度較低對偶基因)之對偶基因頻率低於40，則該SNP基因座可視作「資訊性」。對於5%及20%之分數胎兒DNA濃度，區分「資訊性」SNP(情形(a))與母親為異型接合之SNP(情形(b)及(c))的準確度為100%。
實際上，對於不同SNP，所偵測之分子總數可不同。對於各SNP基因座，可藉由考慮在母體血漿樣本中所偵測到之覆蓋該SNP基因座之分子的總數來建構特定預測分佈曲線。換言之，確定SNP是否具資訊性之計數截止值在SNP間可不同，且視SNP基因座已計數之次數而定。
下表展示對於經定序之母體血漿樣本而言母體血漿中之三個SNP基因座的對偶基因計數。對於三個SNP中之每一者，在母體血漿樣本中偵測到兩個不同對偶基因。在母體血漿中所偵測到之對應於此等三個SNP之計數的總數不同。
針對分數胎兒DNA濃度為20%以及對應於SNP之分子的總計數不同的豐度較低對偶基因之計數的預測分佈展示於圖13A、13B及14中。預測分佈係使用20%之假定胎兒DNA濃度來得出，因為此濃度代表前三個月時胎兒DNA濃度之上限。胎兒DNA濃度愈高，在母親對於主要對偶基因為同型接合時次要對偶基因之分佈曲線相對於在母親為異型接合時次要對偶基因之分佈曲線之間的預期重疊愈多。因此，對於預測資訊性SNP，使用較高胎兒DNA濃度可更明確地得到次要對偶基因計數之截止值。
圖13A展示在分子總數為173且分數胎兒DNA濃度為20%時豐度較低對偶基因之計數的預測分佈。在一實施例中，基於此分佈，豐度較低對偶基因之計數小於40之截止準則可適用於鑑別資訊性SNP。在A對偶基因之計數為10時，1號SNP基因座可視為對於計算分數胎兒DNA濃度具「資訊性」。
圖13B展示在分子總數為121且分數胎兒DNA濃度為20%時豐度較低對偶基因之計數的預測分佈。在一實施例中，基於此分佈，豐度較低對偶基因之計數小於26之截止值可適用於鑑別資訊性SNP。在T對偶基因之計數數目為9時，2號SNP基因座可視為對於計算分數胎兒DNA濃度具「資訊性」。
圖12展示在分子總數為134且分數胎兒DNA濃度為20%時豐度較低對偶基因之計數的預測分佈。在一實施例中，基於此分佈，豐度較低對偶基因之計數小於25之截止值可適用於鑑別資訊性SNP。在T對偶基因之計數數目為62時，3號SNP基因座可視為「不具資訊性」且將不會用於計算胎兒DNA分數濃度。
在一些實施例中，使用方程式f=2×p/(p+q)，可使用SNP 1及2之對偶基因計數來計算分數胎兒DNA濃度且進行組合。結果展示如下。
D.確定胎兒基因體之覆蓋深度
除獲得分數濃度以外，實施例可確定分析程序(例如定序)在步驟1010中已達成之胎兒基因體覆蓋百分比。在一些實施例中，資訊性基因座可用於確定覆蓋百分比。舉例而言，可使用上述任何實例。在一實施例中，可使用胎兒為絕對異型接合子之基因座。在另一實施例中，可使用胎兒經確定為異型接合而母親為同型接合的基因座(例如使用方法1100)。
已定位至資訊性基因座之片段可用於確定覆蓋比例。在一實施例中，確定第一複數個基因座中自定序結果偵測到各別第一對偶基因之基因座的比例。舉例而言，若胎兒在基因座處為TA而母親在該基因座處為AA，則若彼基因座已經定序，則應在定序結果中偵測到對偶基因T。因此，可基於此比例計算生物樣本中已經定序之胎兒基因體的比例。在一實施例中，可取觀測到胎兒特有之對偶基因之第一基因座的比例作為胎兒基因體之覆蓋百分比。在其他實施例中，可基於基因座處於何處來修改該比例。舉例而言，可對於各染色體確定覆蓋百分比。作為另一實例，若第一基因座不能充分代表基因體，則可在低於該比例下評估百分比。作為另一實例，可提供範圍，其中該比例為範圍之一端。雖然高百分比(亦即逼近100%)表示接近於完全覆蓋胎兒基因體，但可以比100%覆蓋小得多的百分比(例如80%或50%或50%以下)診斷大部分遺傳性疾病。
VI.無母體及父體基因體之先前資訊
在先前章節中，一些實施例已在已知母親之單倍型及父親之基因型之情況下確定胎兒之遺傳圖譜(或胎兒基因體之一部分)。其他實施例顯示可在無關於母親、父親或胎兒之基因型的先前認識下藉由分析母體血漿DNA來確定分數胎兒DNA濃度。在其他實施例中，吾人現進一步描述在無關於母體與父體基因型/單倍型之先前資訊下使用RHDO分析來確定胎兒之遺傳圖譜(或胎兒基因體之一部分)的方法。
在一實施例中，使用父母所屬群體之參考(例如共同或已知)單倍型的資訊。此資訊可用於推導母體與父體單倍型。一實例係用於說明此方法之原理。關於該等參考單倍型之資訊可例如獲自國際HapMap計劃(International Hap Map Project)之網站(hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/)。
作為說明性實例之一部分，假定在群體中存在三個參考單倍型(如圖15A中所示之Hap A、Hap B及Hap C)。此等三個單倍型中之每一者由14個SNP基因座組成，且對於各基因座，存在兩個可能對偶基因。在此實例中，如圖15B中所示，父親具有Hap B及Hap C，而母親具有Hap A及Hap B。此實例假定胎兒自母親遺傳Hap A且自父親遺傳Hap C。因此，如圖15B中所示，胎兒具有Hap A與Hap C。
圖16為根據本發明之實施例在已知一組參考單倍型但未知親本單倍型之情況下確定至少一部分胎兒基因體之方法1600的流程圖。
在步驟1610中，可分析母體樣本以鑑別母親為同型接合而胎兒為異型接合之SNP。可以與如上文所述確定基因座是否具資訊性相似之方式進行此分析。因此，在一實施例中，可使用方法1000及/或1100。在上文所述之其他實施例中，可分析母體基因體與父體基因體以確定用於進行胎兒基因體定位之資訊。
圖17展示藉由對來自母體樣本之DNA片段進行分析來確定資訊性基因座的實例。對於14個基因座中之每一者，確定各基因座之兩個對偶基因的計數。可例如(但不限於)使用即時PCR、數位PCR及大規模並行定序來確定此等對偶基因之計數。對於此等基因座中之每一者，將會在母體血漿中偵測到兩個不同對偶基因。與母親為異型接合之SNP相反，兩個對偶基因之比例將顯著不同。胎兒特有之對偶基因(胎兒自父親遺傳之對偶基因)與母體對偶基因相比豐度將會低得多。在圖17中標記資訊性基因座1710。
在步驟1620中，推導出胎兒遺傳之父體單倍型之一或多個對偶基因。在一實施例中，可使用各基因座1710來確定所遺傳之父體單倍型。舉例而言，胎兒所遺傳之父體對偶基因可鑑別為基因座1720之胎兒特有之對偶基因，因為胎兒特有之對偶基因為在母體樣本中豐度比母體對偶基因低得多的對偶基因。
在步驟1630中，將父體對偶基因與參考單倍型相比較以確定自父親遺傳之單倍型。在某些實施例中，可推導出多種可能之胎兒單倍型，每一者有其自身之機率。一或多個最可能之胎兒單倍型可接著用於後繼分析或用於臨床診斷。
在圖18中所示之實例中，在群體中存在三個可能之單倍型(Hap A、Hap B及Hap C)。自母體血漿分析，四個SNP已鑑別為對於母親而言為同型接合而對於胎兒而言為異型接合，因此代表胎兒遺傳之父體對偶基因。此等四個SNP處之基因型符合Hap C之型式。因此，如圖19中所示，胎兒自父親遺傳Hap C。換言之，對於同一單倍型區塊中之所有SNP，可推導出胎兒遺傳之父體對偶基因。
在步驟1640中，可確定母親為異型接合之基因座(例如SNP)。在一實施例中，分析母體樣本可提供母親為異型接合之SNP。舉例而言，在此等SNP中之每一者處，可在母體血漿中偵測到兩個不同對偶基因。與母親為同型接合而胎兒為異型接合之SNP相反，其中胎兒特有之對偶基因僅在母體血漿中佔總對偶基因的較小比例，對於母親為異型接合之SNP而言，兩個對偶基因之計數應相似。因此，可例如如圖20中所示自母體血漿分析確定單倍型區塊中所有SNP基因座的完全母體基因型。
在步驟1650中，母體單倍型係自來自步驟1640之母體基因型藉由將基因座處之基因型與相關群體之單倍型資訊進行比較而推導出。圖21展示一自母體基因型及參考單倍型確定母體單倍型的實施例。在所使用之實例中，母親在第三個SNP基因座處對於G對偶基因為同型接合。由於僅Hap A與Hap B滿足此準則，所以此指示母親具有三種單倍型組合之一，亦即Hap A/Hap A、Hap A/Hap B或Hap B/Hap B。另外，由於母親之第一個SNP的A與C為異型接合，所以吾人可推導出母親具有Hap A/Hap B之單倍型組合。在一實施例中，可能得到多於一種可能性，且可在下一步中測試各可能性。自上述分析，已確定母親之單倍型及胎兒自父親遺傳之單倍型。圖22展示所確定之母體單倍型及父體遺傳性單倍型。
在步驟1660中，自在步驟1650中所鑑別之母體單倍型以及在步驟1630中所鑑別之父體遺傳性單倍型來確定胎兒遺傳之母體單倍型。使用此資訊，一實施例可使用RHDO分析來確定哪個母體單倍型傳給胎兒。可根據本文所述之任何實施例來進行RHDO分析。
在一實施例中，對於RHDO分析，母親為異型接合之SNP可分成兩種類型，亦即類型α與類型β(例如如圖23中所示及如上文所述)。類型αSNP係指傳給胎兒之父體對偶基因與位於Hap A上之母體對偶基因相同的基因座。對於類型αSNP，若胎兒自母親遺傳Hap A，則Hap A上之對偶基因在母體血漿中應過度呈現。另一方面，若胎兒自母親遺傳Hap B，則兩個母體對偶基因應在母體血漿中等量呈現。
類型β SNP係指傳給胎兒之父體對偶基因與位於Hap B上之母體對偶基因相同的基因座。對於類型β SNP，若胎兒自母親遺傳Hap B，則Hap B上之對偶基因在母體血漿中應過度呈現。然而，若胎兒自母親遺傳Hap A，則兩個母體對偶基因應在母體血漿中等量呈現。可使用RHDO分析確定Hap A或Hap B對偶基因之潛在過度呈現。
在一些實施例中，為在無關於母體單倍型與父體基因型之先前資訊下對特定區域應用RHDO分析，可能需要單倍型區塊內之SNP的相對高倍覆蓋，例如，在一實施例中可能需要分析200個對應於SNP基因座之分子。此資訊可藉由例如(但不限於)即時PCR、數位PCR及大規模並行定序獲得。在一實施例中，可使用靶向定序(例如藉由目標增濃與大規模並行定序之組合)來獲得關於靶向區域內不同對偶基因之代表性不偏倚定量資訊。下文實例描述靶向定序。因此，此RHDO分析可應用於母體血漿DNA之靶向定序資料以在無關於親本基因型/單倍型之先前資訊下確定哪個母體對偶基因/單倍型已傳給胎兒。
VII.偵測新生突變
一些實施例可偵測胎兒已獲得之突變。新生突變為未由父親或母親攜帶但例如在由父親或母親或兩者配子發生期間產生之突變。該種偵測具臨床效用，因為新生突變在引起多種遺傳性疾病(例如血友病A及軟骨發育不全)中起重要作用。
圖24為說明鑑別懷孕女性之未出生胎兒之基因體中之新生突變的方法2400之流程圖。該胎兒具有父親以及為懷孕女性之母親，且父親具有有兩個單倍型之父體基因體且母親具有有兩個單倍型之母體基因體，該方法包含：在步驟2410中，對自懷孕女性獲得之生物樣本中之複數個核酸分子進行定序。請注意，樣本含有母體核酸與胎兒核酸之混合物。
在步驟2420中，鑑別經定序之各核酸分子在人類基因體中之位置。在一實施例中，序列定位可藉由單末端定序或末端配對定序來進行。在一態樣中，定位至人類基因體以找出位置不需要各核苷酸對於所找到之位置完全匹配。
在步驟2430中，對於至少一部分位置中之每一者，確定所討論位置處之母體序列與父體序列。舉例而言，若在步驟2420中確定100個位置，則可確定此等100個位置處之母體基因體及父體基因體。在一實施例中，與如上文所述使用參考單倍型相反，自來自父親之樣本確定父體序列。因此，仍偵測到不處於參考基因體中之突變。在各種實施例中，母體序列可自僅包括母體DNA之樣本獲得，或亦可例如使用本文所述之方法自生物樣本獲得。
在步驟2440中，鑑別複數個核酸分子中不存在於所確定之母體或父體序列中之第一序列。在一實施例中，第一序列與所確定之母體或父體序列之比較需要完全匹配。因此，若匹配不完全，則可認為第一序列不存在於所確定之母體或父體序列中。以此方式，甚至可鑑別微小新生突變，因為新生突變可僅為單個核苷酸變化。在另一實施例中，將序列視作新生突變需要一定數目之展示非母體及非父體序列之DNA片段。舉例而言，可使用3個DNA片段之截止值來確定序列(亦即新生突變)是否存在。
在步驟2450中，測定第一序列在生物樣本中之第一分數濃度。舉例而言，展現第一序列之DNA片段的數目可表示為佔自該基因座偵測到之所有DNA片段的比例。
在步驟2460中，使用胎兒自其父親遺傳且存在於父體基因體中但不存在於母體基因體中之核酸分子來測定胎兒核酸在生物樣本中之第二分數濃度。該種核酸分子可能含有在如下位置上的第一對偶基因，在該位置上，父親為同型接合且母親亦為同型接合，但對偶基因不同，且從而胎兒為絕對異型接合子。可使用如上文所述之資訊性基因座來確定用於測定第二分數濃度之核酸分子。
在其他實施例中，第二分數濃度可使用其他途徑，諸如使用PCR檢定、數位PCR檢定或基於質譜、基於Y染色體、基於一組遺傳多形現象(亦即單核苷酸多形現象)或基於插入-缺失多形現象之檢定來測定(Lun FMF等人，Clin Chem 2008;54: 1664-1672)。另一替代方案為使用胎兒與母親之間DNA甲基化不同之一或多個基因體基因座(Poon LLM等人，Clin Chem 2002;48: 35-41；Chan KCA等人，Clin Chem 2006;52: 2211-2218；美國專利6,927,028)。
在一實施例中，不同後生狀態由不同DNA甲基化型態來反映。不同DNA甲基化型態可涉及RAS相關結構域家族1A(RASSF1A)或全羧酶合成酶(生物素-(丙醯基-輔酶A-羧酶(ATP水解)))連接酶(HLCS)基因。具有胎兒特有之DNA甲基化概況之DNA片段的量可表示為佔源自不同甲基化基因座之所有DNA片段的比例。
在步驟2470中，若第一分數濃度與第二分數濃度大致相同，則將第一序列分類為新生突變。源於分析過程中之誤差(例如定序誤差)的非母體及非父體序列為隨機事件且重現機率較低。因此，量與對於樣本所測得之分數胎兒DNA濃度相似的展現相同非母體及非父體序列的多個DNA片段可能為胎兒基因體中所存在之新生突變而非由定序誤差產生。在一實施例中，可使用截止值來確定分數濃度是否相同。舉例而言，若濃度處於彼此規定值之內，則將第一序列分類為新生突變。在各種實施例中，規定值可為5%、10%或15%。
實例 I.實例1
為說明本發明之實施例，分析下列狀況。招募一對夫婦參加針對β-地中海貧血之產前診斷的產科學臨床試驗。父親為人類β-球蛋白基因之密碼子41/42之-CTTT 4鹼基對缺失的攜帶者。懷孕母親為人類β-球蛋白基因之核苷酸-28處具有A→G突變的攜帶者。自父親及母親採集血液樣本。對於母親，在妊娠第12週採集血液樣本並隨後進行絨膜絨毛取樣(CVS)。在CVS後，儲存一部分供實驗用。實驗之目的在於藉由對母體血漿DNA進行大規模並行定序來建構全基因體遺傳圖譜或確定胎兒之部分或完全基因體序列。
1.確定親本基因型
自父親及母親之白血球層以及CVS樣本萃取DNA。藉由Affymetrix全基因組人類SNP陣列6.0系統(Affymetrix Genome-Wide Human SNP Array 6.0 system)對此等DNA樣本進行分析。此系統特徵在於180萬個遺傳標記，包括約900,000個單核苷酸多形現象(SNP)及超過約950,000個用於偵測複本數變異之探針。展示父親、母親及胎兒(CVS)之不同基因型組合的SNP之絕對數目及百分比展示於圖25A之表中。
即使在此實例中使用Affymetrix系統，但實際上，可使用熟習此項技術者所已知之任何基因型分析平台。實際上，除基因型分析之外，亦可在整個基因體基礎上或對於所選基因體區域對父親及母親之白血球層DNA進行定序。此外，可使用來自父親及母親之構成性DNA(例如頰細胞DNA、毛囊DNA等)之任何來源來確定親本基因型。
分析CVS樣本以提供用於與自母體血漿分析推導出之胎兒遺傳圖譜進行比較的標準。另外，對於此實驗，亦可使用CVS樣本之基因型來建構母親之單倍型供RHDO分析用。在此情形中，出於該單倍型建構目的使用CVS基因型僅用於說明目的。在實施例之臨床應用中，可經由分析家庭中之其他個體(例如母親之先前出生之兒女、兄弟姐妹、父母或其他親戚)來建構母體單倍型。亦可藉由熟習此項技術者所熟知之其他方法(其中一些方法在本文中提及)建構相關染色體區域之母體單倍型。
對於所選實施例，亦可確定欲分析之未出生胎兒之父親的單倍型。此資訊可尤其適用於父親與母親兩者皆為異型接合之染色體區域的相對單倍型劑量。
2.母體血漿DNA之大規模並行定序
使用Illumina基因組分析儀平台對自母親獲得之血漿DNA進行大規模並行定序。對血漿DNA分子進行末端配對定序。對各分子在各末端進行50 bp定序，因此每個分子總共定序100 bp。使用來自位於深圳(Shenzhen)之北京基因體研究所(Beijing Genomics Institute)之SOAP2程式(soap.genomics.org.cn)(Li R等人，Bioinformatics 2009,25(15):1966-7)將各序列之兩個末端與重複無屏蔽(repeat-unmasked)之人類基因體(自UCSC http://genome.ucsc.edu下載之Hg18 NCBI.36)進行比對。圖25B之表列出前20個流槽之比對統計結果。因此，用20個流槽，可將超過39.32億個讀取結果與參考人類基因體進行比對。
3.計算分數胎兒DNA濃度
如上文所提及，可自定序資料計算胎兒DNA在母體血漿樣本中之分數濃度。一方式為分析父親與母親兩者皆為同型接合但對偶基因彼此不同的SNP。對於該等SNP，胎兒為一個父體遺傳性對偶基因與一個母體遺傳性對偶基因之絕對異型接合子。在一實施例中，可使用章節V中所述之任何計算方法。在此實例中，對不同染色體上滿足親本基因型組態(亦即父母兩者皆為同型接合但對偶基因不同)之不同多形性基因座之累積資料進行計算。針對位於不同染色體上之SNP計算之分數胎兒DNA濃度列於圖26之最右側欄中。如可自該表中所見，針對位於不同染色體上之SNP所測得之分數濃度彼此極密切相關。
作為品質控制實驗，亦藉由對白血球層樣本進行Affymetrix SNP 6.0分析來研究母親為同型接合而父親為異型接合之SNP(圖26之中間欄)。可見，在充足DNA定序深度下，由此分析所測得之分數胎兒DNA濃度與針對父親與母親兩者皆為同型接合但對偶基因不同之SNP所測得之分數胎兒DNA濃度極相似。
在一實施例中，當自此等兩種類型之SNP觀測到分數胎兒DNA濃度接近一致時，可推斷對胎兒基因體接近於完全定序覆蓋。在一態樣中，在覆蓋深度較低時，針對母親為同型接合而父親為異型接合之SNP所測得之分數胎兒DNA濃度將會高於針對父親與母親皆為同型接合但對偶基因不同之SNP所測得之分數胎兒DNA濃度。在該種較低之覆蓋深度下，定序結果缺乏父體獨有之對偶基因可有兩個可能之原因：(i)胎兒未自父親遺傳此對偶基因；及/或(ii)胎兒自父親遺傳此對偶基因但接著定序結果由於定序深度不足而遺漏此對偶基因。
4a.計算胎兒基因體之覆蓋百分比
同樣，如上文所提及，可藉由考察父親與母親皆為同型接合但對偶基因不同之SNP子集來確定藉由對母體血漿DNA進行定序所分析之胎兒基因體的百分比。在此家庭中，Affymetrix SNP 6.0陣列上45,900個SNP屬於此子集。藉由分析血漿DNA定序資料以研究藉由定序所偵測到之胎兒對偶基因佔此SNP子集的百分比來推導出胎兒基因體之覆蓋百分比。
圖27A中之曲線說明此子集中可自所分析之前20個流槽的定序資料中觀測到胎兒對偶基因的SNP之觀測百分比。因此，可觀測到佔該等SNP 94%之胎兒對偶基因。此定序度對應於超過39.32億個讀取結果，各讀取結果有100 bp序列。圖27B中之曲線展示覆蓋度相對於讀取結果數目而非流槽數目的曲線。隨著不同定序平台之輸送量增加，預期產生此等序列讀取結果數目或序列長度所用或所需之流槽或操作之數目在將來將會減少。
在一些實施例中，由於在各染色體區域或染色體中偵測到多個SNP，所以胎兒基因體之覆蓋度比94%低得多，不過仍提供準確基因體定位。舉例而言，假定在染色體區域中存在30個資訊性SNP，但僅對30個SNP中之20個SNP偵測到胎兒對偶基因。然而，利用20個SNP仍可準確鑑別該染色體區域。因此，在一實施例中，可在覆蓋度小於94%下獲得等效準確性。
4b.胎兒自其父親遺傳之對偶基因之遺傳圖譜的覆蓋度
此說明性分析著重於父親為異型接合而母親為同型接合之SNP對偶基因。在此家庭中，Affymetrix SNP 6.0平台上131,037個SNP屬於此類別。此等SNP之子集由母親為同型接合而父親與胎兒皆為異型接合之65,875個SNP組成。藉由使用20個流槽，在此等SNP中之61,875個SNP中可觀測到父體遺傳性對偶基因，指示覆蓋度為93.9%。此後一百分比與上一段中所推導出之覆蓋百分比資料完全相符。父體遺傳性對偶基因之覆蓋度與可定位序列讀取結果數目及流槽序列數目之間的相關性分別展示於圖28A與圖28B中。
為闡明此用於偵測純粹父體遺傳性胎兒對偶基因之途徑的特異性，分析胎兒所遺傳之對偶基因與母親所具有之對偶基因相同的65,162(亦即131,037-65,875)個SNP。對於該等SNP，對與母親所具有之對偶基因不同之對偶基因的表觀偵測表示假陽性(false-positive)。因此，當分析20個流槽時，在該65,162個SNP中，僅觀測到3,225個假陽性(4.95%)。此等假陽性可為父親或母親DNA之定序誤差或基因型分析誤差或胎兒之新生突變之結果。假陽性率與所定序之流槽數目之間的相關性展示於圖29A中。
亦可藉由考慮父親與母親兩者皆為同型接合且具有相同對偶基因之SNP子集來評估假陽性率。在特定基因座處任何替代對偶基因之存在視作假陽性。此等假陽性可為父親或母親DNA之定序誤差或基因型分析誤差或胎兒之新生突變之結果。在此子集中存在500,673個SNP。在序列資料來自20個流槽時，在48,396個SNP中偵測到假陽性結果(9.67%)。假陽性率與所定序之流槽數目之間的相關性展示於圖29B中。此假陽性率高於使用母親與胎兒皆為同型接合而父親為異型接合之SNP子集所得到之評估結果。此係因為在後一SNP子集中，僅將父體遺傳性對偶基因在母體血漿中之存在視作假陽性，而在前一子集中，將除由父親與母親所共有之共同對偶基因以外之任何對偶基因皆視作假陽性結果。
圖30展示在所分析之流槽數目不同時胎兒特有之SNP之覆蓋度。在此分析中包括父親與母親兩者皆為同型接合但對偶基因不同之SNP。X軸為胎兒特有之SNP之覆蓋倍數，且Y軸為在指定覆蓋倍數下SNP之百分比。隨所分析之流槽數目增加，胎兒特有之SNP之覆蓋倍數之平均數增加。舉例而言，當分析一個流槽時，SNP之平均覆蓋度為0.23倍。當分析20個流槽時，平均覆蓋度增加至4.52倍。
5 .自母親遺傳之遺傳圖譜的準確率
圖31展示當使用來自10個流槽之資料時類型A分析之準確率。章節II.B描述類型A與類型B(亦稱作α與β)分析之實施例。該準確率係關於對自母親遺傳之單倍型的正確確定。對於各染色體單獨提供準確率。
對於SPRT分析使用1,200之概似比(Zhou W等人，Nat Biotechnol 2001;19:78-81；Karoui NE等人，Statist Med 2006;25:3124-33)，準確率處於96%至100%之範圍內。如所示，甚至在SPRT分類之概似比如此高時，仍可對該基因體上總共2,760個區段進行分類。當認為減數分裂重組以每個染色體臂每次產生獲得一至低單數位數目之頻率進行時，此解析度足以用於大部分目的。另外，可觀測到在使用交錯途徑時可防止所有錯分類(圖31之右側)。如上文所述，交錯途徑使用類型A與類型B分析兩者。
圖32展示當使用來自10個流槽之資料時類型B分析之準確率。對於SPRT分析使用1,200之概似比，準確率處於94.1%至100%之範圍內。如圖31中所見，當使用交錯途徑時可防止所有錯分類(圖32之右側)。
圖33展示當使用來自20個流槽之資料時類型A分析之準確率。對於SPRT分析使用1,200之概似比且使用「兩個連續區塊」算法，總共作出3,780個分類且僅3個(0.1%)分類不正確。圖34展示當使用來自20個流槽之資料時類型B分析之準確率。對於SPRT分析使用1,200之概似比且使用「兩個連續區塊」算法，總共作出3,355個分類且僅6個(0.2%)分類不正確。在此等實例中，對多個遺傳標記(諸如SNP)進行SPRT。
II.β-地中海貧血症之風險的產前確定
在一實施例中，為確定胎兒患有β-地中海貧血症(一種體染色體隱性基因疾病)之風險，可確定胎兒是否遺傳其父親與母親所攜帶之突變型對偶基因。在上文所提及之此狀況下，父親為人類β-球蛋白基因之密碼子41/42之-CTTT 4鹼基對缺失的攜帶者。懷孕母親為人類β-球蛋白基因之核苷酸-28上A→G突變之攜帶者。
為確定胎兒是否遺傳父體密碼子41/42突變，在使用前10個流槽之母體血漿DNA定序資料中尋找此突變。發現總共10個具有此突變之讀取結果(圖35A)。因此，胎兒遺傳了父體突變。另外，發現62個讀取結果在密碼子41/42處含有野生型序列(圖35B)。因此，此區域中含有該突變之讀取結果的百分比為0.1389。此數字極接近於圖26中所確定之分數胎兒DNA濃度。在一實施例中，胎兒遺傳父體突變之風險亦可藉由闡明其對與父體突變相關之遺傳多形現象的遺傳來確定。
在一個實施例中，為確定胎兒遺傳母體-28突變之風險，進行RHDO分析。在此家族中，-28突變位於單倍型IV上，而野生型對偶基因位於單倍型III上。類型A RHDO分析之結果示於圖36中，而類型B RHDO分析之結果示於圖37中。在兩種類型之分析中，推導出胎兒自母親遺傳單倍型III。換言之，胎兒自母親遺傳野生型對偶基因。胎兒之最終診斷為其自父親遺傳密碼子41/42突變且自母親遺傳野生型對偶基因。因此，胎兒為β-地中海貧血症之異型接合攜帶者，且因此在臨床上應為健康的。
III.目標增濃及靶向定序
如先前章節中所論述，分數胎兒DNA濃度評估的準確性及自母體血漿DNA之分析推導遺傳圖譜之解析度可視相關基因座涵蓋深度而定。舉例而言，吾人已表明，在無母體基因型之先前資訊下，以高準確性確定分數胎兒DNA濃度可能需要總共200個對應於SNP基因座之分子。母體血漿中SNP之對偶基因計數可藉由例如(但不限於)即時PCR、數位PCR及大規模並行定序獲得。
由於母體血漿DNA進行大規模並行定序可同時確定整個基因體上數百萬個SNP之對偶基因計數，所以其為不同基因座進行全基因體分析之理想平台。大規模並行定序之基本格式允許以相似深度涵蓋基因體內不同區域。然而，為使用隨機大規模並行定序以高定序深度對相關特定區域定序，基因體之其餘部分(不欲分析)必須定序達相同程度。因此，此途徑可能成本高。為改良大規模並行定序途徑之成本效益，一種方式為在進行定序之前增濃目標區域。靶向定序可藉由溶液相捕捉(Gnirke A等人，Solution hybrid selection with ultra-long oligonucleotides for massively parallel targeted sequencing. Nat Biotechnol 2009;27:182-9)、微陣列捕捉(例如使用NimbleGen平台)或靶向擴增(Tewhey R等人，Microdroplet-based PCR enrichment for large-scale targeted sequencing. Nat Biotechnol 2009;27: 1025-31)進行。
靶向定序最初應用於偵測群體遺傳變異，例如用於遺傳相關研究。因此，其當前應用於基因體研究中之目的在於解決定性問題(例如基因型分析或突變偵測)。然而，出於非侵入性產前診斷目的對母體血漿DNA應用靶向定序涉及定量考慮因素，其可行性尚不清楚。舉例而言，使用靶向定序可能在對母體血漿中胎兒與母體DNA進行之偵測中引入定量偏差。另外，先前研究成果已展示胎兒DNA短於母體DNA(Chan KCA等人，Size distributions of maternal and fetal DNA in maternal plasma. Clin Chem 2004;50: 88-92)。此大小差異亦可能在捕捉母體血漿中之胎兒DNA及母體DNA時引入定量偏差或差異性效率。亦不確定可能捕捉該等片段化DNA分子之效率。在以下描述中，吾人表明可藉由目標增濃繼而進行大規模並行定序來達成靶向定序。吾人亦展示目標增濃相較於全基因體定序為評估分數胎兒DNA濃度之有效方式。
A.使用目標增濃確定分數濃度
1.材料與方法
招募四名(M6011、M6028、M6029及M6043)懷有單胎女性胎兒之懷孕婦女。在末三個月時行擇期剖腹產術之前收集母體周邊血液樣本放入EDTA血液試管中，而在行擇期剖腹產術後收集胎盤樣本。離心後，使用血液Mini套組(Blood Mini Kit，Qiagen)自周邊血細胞萃取DNA。藉由DSP DNA血液Mini套組(Qiagen)自2.4 mL血漿萃取DNA。自白血球層萃取母體基因體DNA且自胎盤組織萃取胎兒基因體DNA。末三個月樣本在此實例中僅用於說明目的。同樣可使用前三個月樣本及中三個月樣本。
藉由全基因體人類SNP陣列6.0(Affymetrix)確定母體基因型與胎兒基因型。對於各案例，使用5-30 ng血漿DNA來藉由末端配對樣本製備套組(Illumina)，根據製造商關於染色質免疫沈澱定序樣本製備之方案進行DNA文庫建構。使用QIAquick PCR純化套組(Qiagen)中所提供之離心管柱直接純化連接有接頭(adapter)之DNA而不進行進一步大小選擇。接著使用15個循環PCR用標準引子擴增連接有接頭之DNA。引子為來自Illumina之PCR引子PE 1.0及2.0。DNA文庫藉由使用NanoDrop ND-1000分光光度計(NanoDrop Technologies)來進行定量，且在2100生物分析儀上使用DNA 1000套組(Agilent)操作以檢查大小分佈。對於各樣本產生平均大小為約290 bp之0.6-1 μg經擴增血漿DNA文庫。捕捉文庫係自Agilent獲得且覆蓋人類chrX上85%之外顯子(目錄號：5190-1993)。對於此研究中之所有四個案例，根據製造商之說明書，將各案例之500 ng經擴增血漿DNA文庫與捕捉探針一起在65℃下培育24小時。雜交後，藉由使用塗有抗生蛋白鏈菌素之磁性珠粒(Dynal DynaMag-2 Invitrogen)解離結合生物素之探針/目標雜交物來對捕捉之目標進行選擇，且用MinElute PCR純化套組(Qiagen)進行純化。最終，藉由用來自Agilent之SureSelect GAPE引子進行12個循環PCR擴增來增濃靶向DNA文庫。藉由QIAquick PCR純化套組(Qiagen)純化PCR產物。接著使用Illumina基因體分析儀IIx對在進行目標增濃或未進行目標增濃下所製備之DNA文庫進行隨機大規模並行定序。使用標準流槽上之一個定序泳道來對各DNA文庫進行定序。
2.在無目標增濃下獲得之分數胎兒DNA濃度
可基於資訊性SNP(亦即母親為同型接合而胎兒為異型接合之SNP)之對偶基因計數來計算分數胎兒DNA濃度。下表展示對於四個案例，在整個基因體中鑑別120184個、110730個、107362個及110321個資訊性SNP，而63個、61個、69個及65個SNP(分別以相同案例次序)屬於X染色體上之目標區域中。在未進行目標增濃下，基於基因體中所有資訊性SNP之資料，分數胎兒DNA濃度為33.4%、31.3%、29.2%及34.4%。
3.比較經目標增濃與未經目標增濃之樣本
在一些實施例中，定序覆蓋深度表示特定區域中各鹼基已經定序之平均次數。在此實施例中，吾人藉由用所靶向區域中經定序之鹼基的總數除以所靶向區域長度(3.05 Mb)來計算所靶向區域之定序深度。對於由增濃套組覆蓋之區域，未經增濃樣本之平均定序覆蓋度為0.19倍，且經增濃樣本之平均定序覆蓋度為54.9倍，指示平均289倍增濃。在此定序深度下，在目標增濃之前在靶向區域中僅偵測到4.0%胎兒特有之對偶基因(參見下表)。比較而言，在目標增濃後，其95.8%變得可偵測(參見下表)。因此，目標增濃大大增加所靶向區域中胎兒特有之對偶基因之偵測率。
接著，吾人比較基於各樣本在進行增濃與未進行增濃下所靶向區域中所有資訊性SNP之讀取結果計數獲得的分數胎兒DNA濃度。對於四個案例，在未進行目標增濃時，胎兒特有之讀取結果之數目處於0至6之範圍內(參見下表)。歸因於定序覆蓋度低，所以胎兒DNA分子之取樣不足將妨礙準確評估分數胎兒DNA濃度。在進行了目標增濃時，在所靶向區域中觀測到數目多得多的胎兒特有之對偶基因計數(511~776個)及共有對偶基因計數(2570~3922個)(參見下表)。胎兒DNA百分比經計算為35.4%、33.2%、26.1%及33.0%，與藉由未經增濃之樣本的全基因體資料評估之胎兒DNA百分比一致(參見下表)。此等結果指示母體DNA分子與胎兒DNA分子在所靶向區域中增濃達相似程度。
B .使用目標增濃確定胎兒基因體
RHDO方法之一種應用在於對母體遺傳之遺傳性疾病進行非侵入性產前偵測。在母體血漿DNA之定序深度為約65倍人類基因體覆蓋度時，在未進行目標增濃下對母體血漿使用大規模並行序列，RHDO分析可平均利用17個SNP準確確定何種母體單倍型傳給胎兒。為改良此途徑之成本有效性，可使定序選擇性指向基因體內之特定相關區域且接著對定序資料應用RHDO分析。作為實例，吾人展示使用X染色體之靶向定序及RHDO分析的概念。然而，靶向定序及RHDO分析亦可應用於所有染色體，例如體染色體。在一實施例中，如上文所述之RHDO分析可用於目標實施例。
招募懷有單胎男性胎兒之五名(PW226、PW263、PW316、PW370及PW421)懷孕婦女。在前三個月時，收集母體周邊血液樣本放入EDTA血液試管中並隨後進行絨膜絨毛取樣。離心後，使用血液Mini套組(Qiagen)自周邊血細胞萃取DNA。藉由DSP DNA血液Mini套組(Qiagen)自3.2 mL血漿萃取DNA。自白血球層萃取母體基因體DNA且自絨膜絨毛萃取胎兒基因體DNA。如上文所述製備及分析樣本。接著使用Illumina流槽上之一個泳道對各樣本進行隨機定序。
在此實例中，吾人使用胎兒基因型以及來自母親核酸之定序資訊以推導出X染色體之母體單倍型且推導出何種單倍型係自母親遺傳。對於X染色體上母親為異型接合之各SNP(亦即資訊性SNP)，胎兒遺傳之對偶基因定義為來自母體單倍型1(Hap I)，而未傳給胎兒之母體對偶基因定義為來自母體單倍型2(Hap II)。在一些實施例中，對於臨床應用，胎兒基因型不可提前獲得，且母體單倍型可藉由熟習此項技術者所熟知之方法以及本文所述之方法來確定或推斷。X染色體此處僅用於說明目的。其他染色體(例如體染色體)亦可用於該分析中。
對於此處所述之5個案例，其每一者皆懷有單胎男性胎兒。由於男性胎兒僅自母親遺傳一個X染色體而無來自父親之X染色體，所以傳給胎兒之母體X染色體在母體血漿中過度呈現。自X染色體之pter至qter進行RHDO分析。自最靠近X染色體之pter的SNP開始，SPRT分析可確定Hap I或Hap II上之對偶基因在母體血漿中之過度呈現是否具統計顯著性。若兩個單倍型中無一者之過度呈現具統計顯著性，則可組合下一SNP之對偶基因計數進行進一步SPRT分析。可組合其他SNP用於分析直至SPRT過程將一個單倍型鑑別為統計顯著性過度呈現為止。接著可自下一個SNP重新開始分類過程。
圖38A及38B展示案例PW226作為實例之SPRT分類結果。在此案例中，對於X染色體存在總共9個成功SPRT分類。對於各SPRT分類，Hap I上之對偶基因經展示在母體血漿樣本中過度呈現，指示胎兒自母親遺傳Hap I。由於吾人將Hap I定義為含有傳給胎兒之對偶基因的單倍型，所以所有此等SPRT分類之結果正確。
5個案例之RHDO分析結果總結於圖39中。成功SPRT分類之數目處於1至9之範圍內。所有SPRT分類正確。較高分數胎兒DNA濃度與較高分類數目相關。此係因為當分數胎兒DNA濃度較高時，可較易於偵測由胎兒DNA之存在所引起之對偶基因失衡。因此，可需要較少SNP來達到成功RHDO分類。規定染色體區域因此可分為較多RHDO區塊。吾人之結果證實可對在目標增濃後所獲得之大規模定序資料進行RHDO分析。
吾人之資料進一步展示靶向途徑為更具成本有效性之執行RHDO分析之途徑。在未進行目標增濃時，對於胎兒DNA濃度相似之樣本，需要藉由約5個流槽(亦即40個定序泳道)進行定序(圖40)以達到圖39中所示之對於樣本所達成之平均深度。此處，吾人展示在進行了目標增濃時，僅藉由一個泳道進行定序已達到可用於成功RHDO分類之某種15至19倍的平均定序深度。或者，當使用目標增濃時，可以相對極少額外成本達成甚至更高倍程度的定序覆蓋度。較高定序覆蓋度可有效縮減成功RHDO分類所需之基因體區域大小且從而改良分析之解析度。
IV.目標增濃
自2004年以來已知在母體血漿中循環胎兒DNA分子一般短於母體DNA(Chan KCA等人，Clin Chem 2004;50: 88-92；Li等人，Clin Chem 2004)。然而，此觀測結果之分子基礎尚未得到解決。在吾人當前研究中，吾人在研究血漿樣本中產生3.931×109 個讀取結果且在吾人之生物資訊學分析中使用1-bp bin。自末端配對讀取結果之末端的基因體座標推導出各經定序血漿DNA分子之大小。
對於此分析，吾人著重於父親與母親皆為同型接合但對偶基因不同之單核苷酸多形現象(SNP)。對於該等SNP，胎兒為絕對異型接合子。胎兒自父親遺傳之各SNP對偶基因可用作胎兒特有之標記。胎兒(使用父體遺傳性胎兒特有之對偶基因)及總體序列之大小可對於整個基因體(圖41)及個別地對於各染色體(圖42A-42C)來確定。
吾人觀測到母體血漿中胎兒DNA與母體DNA之間的最顯著差異為相對於143 bp峰值，166 bp峰值之降低(圖41)。豐度最高總體序列(主要為母體)的長度為166 bp。胎兒DNA與總DNA之間在大小分佈方面之最顯著差異為胎兒DNA展現166 bp峰值之降低(圖41)以及143 bp峰值相對顯著。後者可能對應於自核小體修剪約20 bp連接子片段形成其約146 bp之核心粒子(Lewin B,Gene IX,Jones and Bartlett,Sudbury,2008,第757-795頁)。
自約143 bp及143 bp以下，胎兒DNA及總DNA之分佈展現10 bp週期性，暗示核酸酶裂解核小體。此等資料表明血漿DNA片段係來源於細胞凋亡酶促加工。相反，對定位至未結合組蛋白之粒線體基因體之讀取結果的大小分析未展示此核小體模式(圖41)。此等結果使用Y染色體及所選多形遺傳標記為胎兒DNA與母體DNA之間的已知大小差異提供先前未知之分子解釋(Chan KCA等人，Clin Chem 2004;50: 88-92；Li等人，Clin Chem 2004;50: 1002-1011；美國專利申請案20050164241；美國專利申請案20070202525)，且展示在整個基因體中存在該等大小差異。對此差異最可能之解釋為循環胎兒DNA分子由較多已自核小體修剪掉約20 bp連接子片段之分子組成。
鑒於此等觀測結果，存在多種可使樣本之胎兒DNA增濃之方式。在一實施例中，可使用優先結合於連接子片段之試劑。在母體血漿中當母體來源之DNA與胎兒來源之DNA相比較時，該等試劑預期優先結合於母體來源之DNA。該等試劑之一實例為抗體。該種抗體之一目標為結合於組蛋白H1之抗體。組蛋白H1已知結合於連接子片段。該種抗體之一種應用為用於藉由負向選擇(亦即經由使母體血漿中含有含連接子、組蛋白H1之片段之母體來源之DNA優先發生免測沈澱)來進行胎兒DNA增濃。此外，H1已知具有多種變異體，其中某些變異體在表現方面展現組織特異性變異(Sancho M等人，PLoS Genet 2008;4: e1000227)。可能進一步利用此等變異體來區分胎兒DNA(主要為胎盤DNA)與母體DNA(主要為造血細胞DNA(Lui YYN等人，Clin Chem 2002;48: 421-427))。舉例而言，可靶向主要由滋養層細胞表現之組蛋白H1變異體以在母體血漿中優先及正向選擇胎兒來源之DNA。此策略亦可應用於展現組織特異性，尤其展現滋養層特異性表現模式之其他組蛋白或其他核小體蛋白。
鑒於母體DNA具有尖銳166 bp峰，故增濃胎兒DNA之另一可能方法為設計用於負向選擇長度為166±2 bp之DNA片段的系統。舉例而言，基於毛細管電泳或高效液相層析之系統可允許對DNA分子進行精確大小量測及分離。另一負向選擇之方式為在對定序資料進行生物資訊學分析期間利用電腦進行此操作。
由於血漿中之其他DNA物質(例如腫瘤DNA(Vlassov VV等人，Curr Mol Med 2010;10: 142-165)及移植器官DNA(Lo YMD等人，Lancet 1998;351: 1329-1330))亦預期與母體血漿中之胎兒DNA共有該等特徵，所以上述(1)及(2)中所列之策略亦可用於此等DNA物質之增濃。
根據一實施例，提供經由靶向核小體之連接子片段使人類血漿或血清中之DNA物質差異性增濃的方法。在一實施例中，藉由移除以下一者來進行增濃：母體來源之DNA或造血細胞來源之DNA。在另一實施例中，靶向涉及優先結合於核小體之連接子片段之蛋白質或核酸組分的試劑(諸如抗體或另一類型蛋白質)。在另一實施例中，靶向試劑將選擇性結合於組蛋白H1或另一結合於核小體之連接子片段的蛋白質。在另一實施例中，靶向試劑將結合於母體或血液組蛋白H1變異體或另一結合於核小體之連接子片段的蛋白質。在一實施例中，藉由免測沈澱或結合於固體表面來進行DNA移除。
根據另一實施例，差異性增濃母體血漿或血清中之胎兒DNA的方法包括：(a)使用結合於核小體之連接子片段之一或多種組分的抗體；(b)藉由免測沈澱或捕捉至固體表面來移除結合之部分；及(c)獲得含有分數濃度增加之胎兒DNA的未結合部分。
使用任何適合電腦語言(諸如Java、C++或使用例如習知或面向對象技術的Perl)，本申請案中所述之任何軟體組件或函數可作為由處理器執行之軟體代碼來實施。軟體代碼可在用於儲存及/或傳輸之電腦可讀取媒體上作為一系列指令或命令儲存，適合媒體包括隨機存取記憶體(RAM)、唯讀記憶體(ROM)、諸如硬碟機或軟碟之磁性媒體或諸如壓縮光碟(CD)或DVD(數位多功能光碟)之光學媒體、快閃記憶體及其類似物。電腦可讀取媒體可為該等儲存或傳輸器件之任何組合。
該等程式亦可利用適合經由有線、光學及/或無線網路傳輸之載波信號來編碼及傳輸，該等網路符合包括網際網路之多種協定。因而，根據本發明之一實施例的電腦可讀取媒體可使用該等程式編碼之資料信號產生。用程式代碼編碼之電腦可讀取媒體可與相容器件一起封裝或由其他器件(例如經由網際網路下載)單獨提供。任何該種電腦可讀取媒體可位於單個電腦程式產品(例如硬碟機或整個電腦系統)之上或之中，且可存在於系統或網路內不同電腦程式產品之上或之中。電腦系統可包括監視器、印表機或向使用者提供本文所提及之任何結果之其他適合顯示器。
電腦系統之實例展示於圖43中。圖43中所示之子系統經由系統匯流排4375互連。展示其他子系統，諸如印表機4374、鍵盤4378、固接磁碟4379、耦接至顯示器配接器4382之監視器4376等。耦接至輸入/輸出(I/O)控制器4371之周邊器件及I/O器件可藉由任何數量的此項技術中已知之構件(諸如串聯埠4377)連接至電腦系統。舉例而言，可使用串聯埠4377或外部介面4381將電腦裝置連接至廣域網路(諸如網際網路)、鼠標輸入器件或掃描器。經由系統匯流排互連允許中央處理器4373與各子系統通信，且控制來自系統記憶體4372或固接磁碟4379之指令的執行以及子系統間之資訊交換。系統記憶體4372及/或固接磁碟4379可為電腦可讀取媒體之具體表現。本文所提及之任何值可自一個組件輸出至另一組件且可輸出至使用者。
電腦系統可包括例如藉由外部介面4381或藉由內部介面連接於一起之複數個相同組件或子系統。在一些實施例中，電腦系統、子系統或裝置可經網路進行通信。在該等情況下，一電腦可視作用戶端而另一電腦可視作伺服器，其每一者可為同一電腦系統之一部分。用戶端及伺服器各自可包括多個系統、子系統或組件。
特定實施例之特定細節可以任何適合方式組合或可在不背離本發明實施例之精神及範疇下與本文所示及所述之細節有所不同。
出於說明及描述之目的呈現本發明例示性實施例之上述描述。其不欲為詳盡的或將本發明限制於所述之明確形式，且根據上述教示，可能進行多種修改及變化。實施例係經選擇及描述以最佳闡明本發明之原理及其實際應用，從而使其他熟習此項技術者能夠在各種實施例中且在作出適於預期特定用途之各種修改下最佳利用本發明。
本文所引用之所有出版物、專利及專利申請案係出於所有目的以全文引用之方式併入本文中。
圖1為根據本發明之實施例確定懷孕女性之未出生胎兒之至少一部分基因體的方法100之流程圖。
圖2展示根據本發明之實施例父親之某一特定基因體碼區段的兩個單倍型及母親之某一特定基因體碼區段的兩個單倍型。
圖3展示根據本發明之實施例圖2之親本單倍型中的兩種SNP類型。
圖4A及4B展示根據本發明之實施例針對兩種類型之SNP確定胎兒單倍型之分析。
圖5A及5B展示根據本發明之實施例比較各基因座之片段的相對量(例如計數)以及比較結果是否將特定單倍型分類為遺傳性或非遺傳性的分析。
圖6說明根據本發明之實施例改變SPRT分類之概似比的影響。
圖7為根據本發明之實施例確定懷孕女性之未出生胎兒自父親遺傳之至少一部分基因體之方法700的流程圖。
圖8為根據本發明之實施例確定在母親與父親皆為異型接合之區域中未出生胎兒之至少一部分基因體的方法800之流程圖。
圖9展示根據本發明之實施例特定基因體區域中父親與母親皆為異型接合之單倍型。
圖10為說明根據本發明之實施例用於確定母體樣本中胎兒物質之分數濃度之方法1000的流程圖。
圖11為根據本發明之實施例確定基因座是否具資訊性之方法的流程圖。
圖12A與12B展示根據本發明之實施例在假定分數胎兒DNA濃度分別為20%與5%時對於三種情形對偶基因T(情形(a)及(c)中之豐度較低對偶基因)之計數的預測分佈。
圖13A、13B及14展示根據本發明之實施例在分數胎兒DNA濃度為20%時豐度較低對偶基因之計數的預測分佈，各圖針對對應於SNP之分子之不同總計數。
圖15A與15B展示根據本發明之實施例參考單倍型、取自參考單倍型之親本單倍型及所得胎兒單倍型之實例。
圖16為根據本發明之實施例在已知一組參考單倍型但未知親本單倍型時確定至少一部分胎兒基因體之方法1600的流程圖。
圖17展示根據本發明之實施例藉由分析母體樣本中之DNA片段確定資訊性基因座的實例。
圖18展示三個參考單倍型(Hap A、Hap B及Hap C)及父體對偶基因。
圖19展示根據本發明之實施例自父體對偶基因確定親本單倍型。
圖20展示根據本發明之實施例自母體樣本分析推導母體基因型。
圖21展示根據本發明之實施例自母體基因型及參考單倍型確定母體單倍型之實施例。
圖22展示根據本發明之實施例確定母體單倍型及父體遺傳性單倍型。
圖23展示根據本發明之實施例母體單倍型相對於父體單倍型的不同基因座類型(α(A)及β(B))。
圖24為說明鑑別懷孕女性之未出生胎兒之基因體中之新生突變的方法2400之流程圖。
圖25A展示根據本發明之實施例展示父親、母親及胎兒(CVS)之不同基因型組合的SNP之絕對數目及百分比。
圖25B展示列出前20個流槽之比對統計結果的表格。
圖26為展示根據本發明之實施例經由兩種方法針對SNP計算出之分數胎兒DNA濃度的表格。
圖27A展示說明此子集中可自所分析之前20個流槽的定序資料中觀測到胎兒對偶基因的SNP之觀測百分比的曲線，且圖27B展示根據本發明之實施例覆蓋度相對於讀取結果數目的曲線。
圖28A及28B展示根據本發明之實施例父體遺傳性對偶基因之覆蓋度分別與可定位序列讀取結果之數目之間及與流槽序列之數目之間的相關性曲線。
圖29A展示假陽性率與所定序之流槽數目之間的相關性，且圖29B展示根據本發明之實施例假陽性率與所定序之流槽數目之間的相關性。
圖30展示根據本發明之實施例在所分析之流槽數目不同時胎兒特有之SNP之覆蓋度。
圖31展示根據本發明之實施例當使用來自10個流槽之資料時，類型A分析之準確率。
圖32展示根據本發明之實施例當使用來自10個流槽之資料時，類型B分析之準確率。
圖33展示根據本發明之實施例當使用來自20個流槽之資料時，類型A分析之準確率。
圖34展示根據本發明之實施例當使用來自20個流槽之資料時，類型B分析之準確率。
圖35A與35B展示根據本發明之實施例在密碼子41/42處具有突變與具有野生型序列之讀取結果。
圖36展示根據本發明之實施例類型A RHDO分析之表格，而類型B RHDO分析之表格展示於圖37中。
圖38A及38B展示案例PW226作為實例之SPRT分類結果。
圖39展示根據本發明之實施例總結五個案例之RHDO分析結果的表格。
圖40展示根據本發明之實施例定序深度相對於所定序之流槽數目的曲線。
圖41展示對於整個基因體，胎兒序列及總體序列之大小的曲線，且圖42A-42C展示根據本發明之實施例個別地關於各染色體之類似曲線。
圖43展示根據本發明之實施例可用於系統及方法之例示性電腦系統4300的方塊圖。
(無元件符號說明)

Claims (44)

  1. 一種確定懷孕女性之未出生胎兒之至少一部分基因體的方法，該胎兒具有父親及母親為該懷孕女性，該父親具有兩個父體單倍型之父體基因體且該母親具有兩個母體單倍型之母體基因體，該方法包含：分析獲自該懷孕女性之生物樣本中之多個核酸分子，其中該生物樣本含有母體核酸與胎兒核酸之混合物，且其中分析核酸分子包括：鑑別該核酸分子在人類基因體中之位置；及確定該核酸分子之各別對偶基因；確定第一複數基因座之每一者中該胎兒自父親遺傳之父體對偶基因，其中該母體基因體在該第一複數基因座為異型接合；確定在該第一複數基因座之兩個母體單倍型之每一者；基於該等核酸分子之所確定對偶基因，電腦系統確定該第一複數基因座中每一者之各別對偶基因之量；比較該第一複數基因座中多於一個基因座之該等核酸分子之各別對偶基因的相對量；及基於該比較，確定該基因體中該第一複數基因座所涵蓋之部分中該未出生胎兒自母親遺傳該兩個母體單倍型中之何者。
  2. 如請求項1之方法，其中該等相對量包括該等核酸分子之大小分佈。
  3. 如請求項1之方法，其中確定該第一複數基因座之該兩個母體單倍型之每一者係基於生物樣本中該多個核酸分子的分析。
  4. 如請求項1之方法，其中確定該第一複數基因座中之每一者自父親遺傳之對偶基因包括：確定該父體基因體為異型接合之第二複數基因座，且其中該母體基因體在該第二複數基因座為同型接合；在該多個核酸分子中，鑑別在該第二複數基因座中之各別基因座存在於該父體基因體中而不存在於該母體基因體中的對偶基因；該遺傳之父體單倍型鑑別為具有所鑑別對偶基因之單倍型；及使用該遺傳之父體單倍型來確定在該第一複數基因座自父親遺傳之對偶基因。
  5. 如請求項1之方法，其中確定該第一複數基因座之該兩個母體單倍型之每一者包括：基於該等核酸分子在各別基因座所確定各別對偶基因之量鑑別該母體基因體在該第一複數基因座之一或多者之對偶基因；鑑別多個參考單倍型；及比較該母體基因體之鑑別對偶基因與該多個參考單倍型之相應基因座中之對偶基因以鑑別該兩個母體單倍型。
  6. 如請求項5之方法，其中確定該第一複數基因座之該兩 個母體單倍型之每一者進一步包括：重複比較該母體基因體之鑑別對偶基因與該多個參考單倍型直至僅鑑別出該兩個母體單倍型之每一者為止。
  7. 如請求項1之方法，其中確定在該第一複數基因座之每一者自父親遺傳之對偶基因係基於生物樣本中該多個核酸分子的分析，且其中確定在該第一複數基因座之每一者自父親遺傳之對偶基因包括：確定該胎兒基因體為異型接合而該母體基因體為同型接合之第二複數基因座；確定在該第二複數基因座之每一者自父親遺傳之對偶基因係由：確定該等核酸分子在該第二複數基因座之各別基因座所確定各別對偶基因之相對量；及具有最少相對量之對偶基因鑑別為該各別基因座之遺傳對偶基因；鑑別多個參考單倍型；使用在該第二複數基因座之每一者自父親遺傳之對偶基因來確定該等參考單倍型中之何者係自父親遺傳，所確定之單倍型包括該第一複數基因座；及由該確定為自父親遺傳之單倍型確定在該第一複數基因座自父親遺傳之對偶基因。
  8. 如請求項7之方法，其中確定該等參考單倍型中之何者係自父親遺傳包括：重複比較該第二複數基因座中每一者確定為自父親遺 傳之對偶基因與該多個參考單倍型之相應基因座之對偶基因直至僅鑑別出自父親遺傳之該參考單倍型為止。
  9. 如請求項7之方法，其中特定基因座確定為該胎兒基因體為異型接合而該母體基因體為同型接合之該第二複數基因座之一者包括：確定該特定基因座對偶基因之預測計數之數目的截止值，該截止值預測是否該母體基因體為同型接合而該胎兒基因體為異型接合，其中該截止值係基於該特定基因座同型接合與異型接合之不同組合的計數數目的統計分佈來確定；基於該生物樣本中之該等核酸分子之分析，偵測該特定基因座之第一對偶基因及第二對偶基因；基於該生物樣本中多個核酸分子的定序確定該第一對偶基因之實際計數之數目；及當實際計數之數目小於該截止值時，確定該胎兒基因體為該第一對偶基因與第二對偶基因之異型接合，且該母體基因體為該第二對偶基因之同型接合。
  10. 如請求項9之方法，其中該統計分佈取決於該生物樣本中源自該胎兒之核酸分子的分數濃度。
  11. 如請求項10之方法，其中該統計分佈進一步取決於對應於該特定基因座之多個核酸分子的數目。
  12. 如請求項1之方法，其中確定該第一複數基因座之每一者自父親遺傳之對偶基因包括：藉由分析該父體基因體確定該父體基因體為同型接合 之第二複數基因座，其中該第一複數基因座為該第二複數基因座；確定該父體基因體在該第一複數基因座之每一者的對偶基因；及將該第一複數基因座之各別對偶基因指定為自父親遺傳之對偶基因。
  13. 如請求項1之方法，其中分析核酸分子包括對該等核酸分子中之至少一部分實施至少一種選自由以下組成之群的技術：大規模並行定序、微陣列、雜交、PCR、數位PCR及質譜。
  14. 如請求項1之方法，其進一步包含：對於該第一複數基因座之第一鄰近基因座子集之每一者，對於包括該第一鄰近基因座子集之第一基因體部分確定該未出生胎兒自該母親遺傳何種單倍型，其中確定何種單倍型包括：(a)確定該等核酸分子匹配該第一連續基因座子集之該兩個母體單倍型之一者所確定各別對偶基因的第一量；(b)確定該等核酸分子匹配該第一連續基因座子集之該兩個母體單倍型之另一者所確定各別對偶基因的第二量；(c)基於該第一量與該第二量之比較確定該第一基因體部分之遺傳單倍型。
  15. 如請求項14之方法，其中該第一量與該第二量之比較使 用序列機率比測試。
  16. 如請求項14之方法，其中確定該第一量及該第二量皆依序關於該第一鄰近基因座子集之位置進行。
  17. 如請求項14之方法，其中該第一鄰近基因座子集係進一步分為兩個子群，其中該第一子群係由父親之基因型匹配母親之第一單倍型之組成基因型的基因座組成，及該第二子群係由父親之基因型匹配母親之第二單倍型之組成基因型的基因座組成；且其中(a)-(c)係個別地對於該兩個子群執行，該方法進一步包含：基於此等兩個子群執行(c)之結果確定該第一基因體部分之遺傳單倍型。
  18. 如請求項1之方法，其進一步包含：確定該胎兒已自母親遺傳突變係由：分析該胎兒遺傳自母親之單倍型；及鑑別該遺傳單倍型中之突變。
  19. 如請求項1之方法，其中分析該生物樣本中多個核酸分子包括：使該生物樣本之基因體目標區域中之核酸增濃；及/或優先對該目標區域中之核酸定序，且其中第一複數基因座係於該目標區域中。
  20. 如請求項19之方法，其中該目標區域係鑑別為含有高數量資訊性基因座。
  21. 如請求項19之方法，其中該定序僅對該目標區域中之核酸定序。
  22. 一種確定懷孕女性之未出生胎兒之至少一部分基因體的方法，該胎兒具有父親及母親為該懷孕女性，該父親具有父體單倍型之父體基因體且該母親具有母體單倍型之母體基因體，該方法包含：分析獲自該懷孕女性之生物樣本中之多個核酸分子，其中該生物樣本含有母體核酸與胎兒核酸之混合物，且其中分析核酸分子包括：鑑別該核酸分子在人類基因體中之位置；及確定該核酸分子之各別對偶基因；確定該父體基因體為異型接合之第一複數基因座，其中該父體基因體係自該未出生胎兒之父親獲得，且其中該母體基因體在該第一複數基因座為同型接合；及基於該第一複數基因座所確定各別對偶基因，電腦系統確定該基因體由該第一複數基因座所涵蓋之部分中該未出生胎兒自父親遺傳之單倍型。
  23. 如請求項22之方法，其中確定該未出生胎兒自父親遺傳之單倍型包括：在該多個核酸分子中鑑別在該第一複數基因座之各別基因座存在於該父體基因體中且不存在於該母體基因體中的對偶基因；及該遺傳之父體單倍型鑑別為具有所鑑別對偶基因之單倍型。
  24. 如請求項22之方法，其進一步包含：確定該胎兒已自父親遺傳突變係由： 分析該胎兒遺傳自父親之單倍型；及鑑別該遺傳單倍型中之突變。
  25. 一種確定懷孕女性之未出生胎兒之至少一部分基因體的方法，該胎兒具有父親及母親為該懷孕女性，該父親具有父體單倍型之父體基因體且該母親具有母體單倍型之母體基因體，該方法包含：確定該父體基因體為異型接合之第一複數基因座，其中該父體基因體係自該未出生胎兒之父親獲得，且其中自該未出生胎兒之母親獲得之該母體基因體在該第一複數基因座亦為異型接合，且其中該第一複數基因座兩個父體單倍型之每一者及兩個母體單倍型之每一者已知；確定該父體基因體為異型接合之一或多個第二基因座，其中該母體基因體在該等第二基因座為同型接合，且其中該第一複數基因座與該等第二基因座係於同一染色體上；分析自該懷孕女性獲得之生物樣本中之多個核酸分子，其中該生物樣本含有母體核酸與胎兒核酸之混合物，且其中分析核酸分子包括：鑑別該核酸分子在人類基因體中之位置；及確定該核酸分子之各別對偶基因；藉由分析該生物樣本中該多個核酸分子在該等第二基因座之至少一者所確定之各別對偶基因來確定該兩個父體單倍型中之何者已遺傳給該胎兒；電腦系統比較該等核酸分子在該第一複數基因座之多 於一個基因座所確定之各別對偶基因的相對量；及基於該確定遺傳給該胎兒之父體單倍型且基於該等相對量之比較，確定在該基因體由該第一複數基因座所涵蓋之部分中該未出生胎兒自母親遺傳之單倍型。
  26. 一種確定懷孕女性之未出生胎兒之至少一部分基因體的方法，該胎兒具有父親及母親為該懷孕女性，該父親具有父體單倍型之父體基因體且該母親具有母體單倍型之母體基因體，該方法包含：分析自該懷孕女性獲得之生物樣本中之多個核酸分子，其中該生物樣本含有母體核酸與胎兒核酸之混合物，且其中分析核酸分子包括：鑑別該核酸分子在人類基因體中之位置；及確定該核酸分子之各別對偶基因；確定該胎兒基因體為異型接合而該母體基因體為同型接合之第一複數基因座；電腦系統確定在該第一複數基因座之每一者自父親遺傳之對偶基因係由：確定該等核酸分子在該第一複數基因座之各別基因座所確定之各別對偶基因的相對量；及具有最少相對量之對偶基因鑑別為該各別基因座之遺傳對偶基因；鑑別多個參考單倍型；及使用在該第一複數基因座之每一者自父親遺傳之對偶基因來確定在該基因體由該第一複數基因座所涵蓋之部 分中該等參考單倍型中之何者係自父親遺傳。
  27. 如請求項26之方法，其中確定該等參考單倍型中之何者係自父親遺傳包括：重複比較該第一複數基因座之每一者確定為自父親遺傳之該等對偶基因與該多個參考單倍型之相應基因座之該等對偶基因直至僅鑑別出自父親遺傳之該參考單倍型為止。
  28. 如請求項26之方法，其中特定基因座確定為該胎兒基因體為異型接合而該母體基因體為同型接合之該第一複數基因座之一者包括：確定該特定基因座對偶基因之預測計數之數目的截止值，該截止值預測是否該母體基因體為同型接合而該胎兒基因體為異型接合，其中該截止值係基於該特定基因座同型接合與異型接合之不同組合的計數數目的統計分佈來確定；基於該生物樣本中該等核酸分子之分析，偵測該特定基因座之第一對偶基因及第二對偶基因；基於該生物樣本中之多個核酸分子的定序確定第一對偶基因之實際計數之數目；及當實際計數之數目小於該截止值時，確定該胎兒基因體為該第一對偶基因與第二對偶基因之異型接合，而該母體基因體為該第二對偶基因之同型接合。
  29. 一種確定取自懷孕女性之生物樣本中胎兒DNA之分數濃度的方法，該胎兒具有父親及母親為該懷孕女性，其中 該生物樣本含有母體核酸與胎兒核酸之混合物，該方法包含：分析該生物樣本中多個核酸分子，其中分析核酸分子包括：鑑別該核酸分子在人類基因體中之位置；及確定該核酸分子之各別對偶基因；電腦系統確定一或多個第一基因座，其中該胎兒基因體在各第一基因座為異型接合使得該胎兒基因體在該等第一基因座具有各別第一及第二對偶基因，且其中母體基因體在各第一基因座為同型接合使得該母體基因體在該等第一基因座具有兩個該各別第二對偶基因，該第一對偶基因不同於該第二對偶基因，其中確定特定基因座為該一或多個第一基因座之一包括：確定該特定基因座該各別第一對偶基因之預測計數之數目的截止值，該截止值預測是否該母體基因體為同型接合而該胎兒基因體為異型接合，其中該截止值係基於該特定基因座同型接合與異型接合之不同組合的計數數目的統計分佈來確定；基於該多個核酸分子之分析，偵測該特定基因座之該各別第一對偶基因及該各別第二對偶基因；基於該生物樣本中該多個核酸分子的分析確定該各別第一對偶基因之實際計數之數目；及當實際計數之數目小於該截止值時，確定該特定基因座為該等第一基因座之一； 對於該等第一基因座之至少一者：確定該各別第一對偶基因計數之第一數目P以及該各別第二對偶基因計數之第二數目Q；及基於該第一數目及該第二數目計算該分數濃度。
  30. 如請求項29之方法，其中該分數濃度係以2×p/(p+q)確定。
  31. 如請求項29之方法，其中確定多個第一基因座之P及Q， 且其中該分數濃度f係以確定，其中pi 為該等 第i個第一基因座之第一數目，且qi 為該等第i個第一基因座之第二數目。
  32. 如請求項29之方法，其中確定該截止值包括確定最大分數濃度及最小分數濃度之統計分佈。
  33. 一種電腦產品，其包含儲存複數指令之非暫態電腦可讀媒體，該等指令當執行時控制電腦系統確定確定懷孕女性之未出生胎兒之至少一部分基因體，該胎兒具有父親及母親為該懷孕女性，該父親具有父體單倍型之父體基因體且該母親具有母體單倍型之母體基因體，該等指令包含：分析獲自該懷孕女性之生物樣本中之多個核酸分子，其中該生物樣本含有母體核酸與胎兒核酸之混合物，且其中分析核酸分子包括：鑑別該核酸分子在人類基因體中之位置；及 確定該核酸分子之各別對偶基因；確定第一複數基因座之每一者中該胎兒自父親遺傳之父體對偶基因，其中該母體基因體在該第一複數基因座為異型接合；確定該第一複數基因座之兩個母體單倍型之每一者；基於該等核酸分子之所確定對偶基因，確定該第一複數基因座中每一者之各別對偶基因之量；比較該第一複數基因座中多於一個基因座之該等核酸分子之各別對偶基因的相對量；及基於該比較，確定該基因體中該第一複數基因座所涵蓋之部分中該未出生胎兒自母親遺傳該兩個母體單倍型中之何者。
  34. 如請求項33之電腦產品，其中確定該第一複數基因座中之每一者自父親遺傳之對偶基因包括：確定該父體基因體為異型接合之第二複數基因座，且其中該母體基因體在該第二複數基因座為同型接合；在該多個核酸分子中，鑑別在該第二複數基因座中之各別基因座存在於該父體基因體中而不存在於該母體基因體中的對偶基因；該遺傳之父體單倍型鑑別為具有所鑑別對偶基因之單倍型；及使用該遺傳之父體單倍型來確定在該第一複數基因座自父親遺傳之對偶基因。
  35. 如請求項33之電腦產品，其中確定該第一複數基因座之 該兩個母體單倍型之每一者包括：基於該等核酸分子在各別基因座所確定各別對偶基因之量鑑別該母體基因體在該第一複數基因座之一或多者之對偶基因；鑑別多個參考單倍型；及比較該母體基因體之鑑別對偶基因與該多個參考單倍型之相應基因座中之對偶基因以鑑別該兩個母體單倍型。
  36. 如請求項33之電腦產品，其中確定在該第一複數基因座之每一者自父親遺傳之對偶基因係基於生物樣本中該多個核酸分子的分析，且其中確定在該第一複數基因座之每一者自父親遺傳之對偶基因包括：確定該胎兒基因體為異型接合而該母體基因體為同型接合之第二複數基因座；確定在該第二複數基因座之每一者自父親遺傳之對偶基因係由：確定該等核酸分子在該第二複數基因座之各別基因座所確定各別對偶基因之相對量；及具有最少相對量之對偶基因鑑別為該各別基因座之遺傳對偶基因；鑑別多個參考單倍型；使用在該第二複數基因座之每一者自父親遺傳之對偶基因來確定該等參考單倍型中之何者係自父親遺傳，所確定之單倍型包括該第一複數基因座；及 由該確定為自父親遺傳之單倍型確定在該第一複數基因座自父親遺傳之對偶基因。
  37. 如請求項33之電腦產品，其中確定該第一複數基因座之每一者自父親遺傳之對偶基因包括：藉由分析該父體基因體確定該父體基因體為同型接合之第二複數基因座，其中該第一複數基因座為該第二複數基因座；確定該父體基因體在該第一複數基因座之每一者的對偶基因；及將該第一複數基因座之各別對偶基因指定為自父親遺傳之對偶基因。
  38. 如請求項33之電腦產品，其中該等指令進一步包含：對於該第一複數基因座之第一鄰近基因座子集之每一者，對於包括該第一鄰近基因座子集之第一基因體部分確定該未出生胎兒自該母親遺傳何種單倍型，其中確定何種單倍型包括：(a)確定該等核酸分子匹配該第一連續基因座子集之該兩個母體單倍型之一者所確定各別對偶基因的第一量；(b)確定該等核酸分子匹配該第一連續基因座子集之該兩個母體單倍型之另一者所確定各別對偶基因的第二量；(c)基於該第一量與該第二量之比較確定該第一基因體部分之遺傳單倍型。
  39. 一種電腦產品，其包含儲存複數指令之非暫態電腦可讀媒體，該等指令當執行時控制電腦系統確定懷孕女性之未出生胎兒之至少一部分基因體，該胎兒具有父親及母親為該懷孕女性，該父親具有父體單倍型之父體基因體且該母親具有母體單倍型之母體基因體，該等指令包含：分析獲自該懷孕女性之生物樣本中之多個核酸分子，其中該生物樣本含有母體核酸與胎兒核酸之混合物，且其中分析核酸分子包括：鑑別該核酸分子在人類基因體中之位置；及確定該核酸分子之各別對偶基因；確定該父體基因體為異型接合之第一複數基因座，其中該父體基因體係自該未出生胎兒之父親獲得，且其中該母體基因體在該第一複數基因座為同型接合；及基於該第一複數基因座所確定各別對偶基因，確定該基因體由該第一複數基因座所涵蓋之部分中該未出生胎兒自父親遺傳之單倍型。
  40. 如請求項39之電腦產品，其中確定該未出生胎兒自父親遺傳之單倍型包括：在該多個核酸分子中鑑別在該第一複數基因座之各別基因座存在於該父體基因體中且不存在於該母體基因體中的對偶基因；及該遺傳之父體單倍型鑑別為具有所鑑別對偶基因之單倍型。
  41. 一種電腦產品，其包含儲存複數指令之非暫態電腦可讀媒體，該等指令當執行時控制電腦系統確定懷孕女性之未出生胎兒之至少一部分基因體，該胎兒具有父親及母親為該懷孕女性，該父親具有父體單倍型之父體基因體且該母親具有母體單倍型之母體基因體，該等指令包含：確定該父體基因體為異型接合之第一複數基因座，其中該父體基因體係自該未出生胎兒之父親獲得，且其中自該未出生胎兒之母親獲得之該母體基因體在該第一複數基因座亦為異型接合，且其中該第一複數基因座兩個父體單倍型之每一者及兩個母體單倍型之每一者已知；確定該父體基因體為異型接合之一或多個第二基因座，其中該母體基因體在該等第二基因座為同型接合，且其中該第一複數基因座與該等第二基因座係於同一染色體上；分析自該懷孕女性獲得之生物樣本中之多個核酸分子，其中該生物樣本含有母體核酸與胎兒核酸之混合物，且其中分析核酸分子包括：鑑別該核酸分子在人類基因體中之位置；及確定該核酸分子之各別對偶基因；藉由分析該生物樣本中該多個核酸分子在該等第二基因座之至少一者所確定之各別對偶基因來確定該兩個父體單倍型中之何者已遺傳給該胎兒；比較該等核酸分子在該第一複數基因座之多於一個基 因座所確定之各別對偶基因的相對量；及基於該確定遺傳給該胎兒之父體單倍型且基於該等相對量之比較，確定在該基因體由該第一複數基因座所涵蓋之部分中該未出生胎兒自母親遺傳之單倍型。
  42. 一種電腦產品，其包含儲存複數指令之非暫態電腦可讀媒體，該等指令當執行時控制電腦系統確定懷孕女性之未出生胎兒之至少一部分基因體，該胎兒具有父親及母親為該懷孕女性，該父親具有父體單倍型之父體基因體且該母親具有母體單倍型之母體基因體，該等指令包含：分析自該懷孕女性獲得之生物樣本中之多個核酸分子，其中該生物樣本含有母體核酸與胎兒核酸之混合物，且其中分析核酸分子包括：鑑別該核酸分子在人類基因體中之位置；及確定該核酸分子之各別對偶基因；確定該胎兒基因體為異型接合而該母體基因體為同型接合之第一複數基因座；確定在該第一複數基因座之每一者自父親遺傳之對偶基因係由：確定該等核酸分子在該第一複數基因座之各別基因座所確定之各別對偶基因的相對量；及具有最少相對量之對偶基因鑑別為該各別基因座之遺傳對偶基因；鑑別多個參考單倍型；及 使用在該第一複數基因座之每一者自父親遺傳之對偶基因來確定在該基因體由該第一複數基因座所涵蓋之部分中該等參考單倍型中之何者係自父親遺傳。
  43. 如請求項42之電腦產品，其中確定該等參考單倍型中之何者係自父親遺傳包括：重複比較該第一複數基因座之每一者確定為自父親遺傳之該等對偶基因與該多個參考單倍型之相應基因座之該等對偶基因直至僅鑑別出自父親遺傳之該參考單倍型為止。
  44. 如請求項42之電腦產品，其中特定基因座確定為該胎兒基因體為異型接合而該母體基因體為同型接合之該第一複數基因座之一者包括：確定該特定基因座對偶基因之預測計數之數目的截止值，該截止值預測是否該母體基因體為同型接合而該胎兒基因體為異型接合，其中該截止值係基於該特定基因座同型接合與異型接合之不同組合的計數數目的統計分佈來確定；基於該生物樣本中該等核酸分子之分析，偵測該特定基因座之第一對偶基因及第二對偶基因；基於該生物樣本中之多個核酸分子的定序確定第一對偶基因之實際計數之數目；及當實際計數之數目小於該截止值時，確定該胎兒基因體為該第一對偶基因與第二對偶基因之異型接合，而該母體基因體為該第二對偶基因之同型接合。
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