TWI448687B - 測定化合物於細胞反應性氧物質製造之影響的方法 - Google Patents

測定化合物於細胞反應性氧物質製造之影響的方法 Download PDF

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Description

測定化合物於細胞反應性氧物質製造之影響的方法
本發明是有關於一種一種測定一測試組成分於影響細胞內ROS水準的方法。該方法可以被用於行銷或篩選在受到增加之ROS生成所不利地影響的細胞內降低ROS水準的組成分。
反應性氧物質(reactive oxygen species,ROS)是因為氧的代謝所形成的細胞副產物，是細胞氧化損傷的原因，並且可能是細胞傷害、細胞官能障礙與細胞死亡(凋亡)的主因。ROS於細胞代謝上的影響已被充分證明。ROS在組織中的累積可能會致使氧化性損傷，並且因而可能期望降低ROS在組織中的數量。監測ROS在細胞中的生成以決定ROS是否涉及包括下列的疾病是所欲的：心血管、發炎，以及傳染性疾病。細胞通常能夠以酵素(諸如超氧化物歧化酶與觸酶)來預防源自於ROS的氧化性傷害。其他化合物也能應用於預防此類傷害，包括抗氧化劑諸如維生素、脲酸(uric acid)，以及麩胺硫(glutathione)。此等化合物(諸如抗氧化劑)可以在清除自由基與保護宿主免於病原上扮演一個重要的角色。
雖然許多方法已經被發展出來測定ROS在組織中的數量，但只有少數的方法能夠即時測定細胞內的ROS濃度。測定ROS數量的能力是重要的，因為ROS濃度可能會隨著時間而改變，例如增高或降低。
因此，對於發展以及投藥有效之抗氧化化合物來預防ROS損傷有一個持續性的關注。然而，僅有少數的方法能夠即時測定化合物於ROS製造的影響。因而，發展出能夠測定組成分於影響細胞內ROS製造的方法是需要的。
依據某些具體例，一個能夠被用來即時測定細胞內ROS濃度的方法被提供。該等具體例的方法可以被應用於決定測試組成分於細胞內ROS製造與細胞內的氧化壓力的影響。該等方法亦可被應用於決定測試組成分在降低細胞內的ROS成分的能力，其中ROS對於細胞來說可以是內生性或外生性的。
因此，此處所述的某些具體例包括一測定一測試組成分於影響在一細胞內製造ROS的方法。該方法包括令一細胞與一能夠發出螢光的物質接觸、令該細胞與一測試組成分接觸、令該細胞與一ROS或一ROS刺激劑接觸，並且測定細胞螢光。該等具體例更包括在令該細胞與能夠發出螢光的物質以及一ROS或一ROS刺激劑接觸之後測定細胞螢光、在令該細胞與一測試組成分接觸之後測定細胞螢光，比較兩個螢光數值並且決定該測試組成分是否降低ROS。
發明的詳細說明
如本說明書通篇所使用的，範圍被用於作為描述各個以及每個落在該範圍內的數值的簡略表示。任何落在該範圍內的數值可以被選定做為該範圍的界限。此外，此處引用的全部文獻以其整體被併入此處作為參考文獻。在本揭示內容的界定與一引用文獻者相衝突時，本揭示內容決定。
除非另有指明，此處與說明書他處所示的所有百分率以及數值應被理解為意指以重量計的百分率。所指定的數量是以物質的活性重量為基礎。
在本說明通篇中，使用冠詞”該(the)”、”一(a)”、”一(an)”或類似之詞並非要限定具體例為該項的單數形式。舉例來說，”一組成分”的表示可以是代表一個單獨的組成分或多重組成分。在具體例中的組成分包括化學化合物，小的與大的肽和蛋白質、表現小的與大的肽和蛋白質的DNA，以及類似之物。
該方法包括令一細胞與一當其氧化或還原時能夠發出螢光的物質接觸、令該細胞與一測試組成分接觸、令該細胞與一ROS或一ROS刺激劑接觸，並且測定細胞螢光。較佳地，能夠發出螢光的物質是一種當其氧化時會發出螢光的染料，更佳地是一種選自於2,7-二氯螢光素二乙酸鹽(2,7-dichlorofluorescein diacetate,DCF-DA)、二氫玫瑰紅(dihydrorhodamine,DHR 123)，及其混合物的染料。該方法亦包括使用一當還原時能夠發出螢光的物質。
一個較佳的方法包括使用一抗氧化劑做為該測試化合物。另一個較佳的方法包括一氧離子生成化合物、自由基生成化合物、一過氧化物，或其組合作為ROS。較佳地，該ROS是一過氧化物，並且更佳地是過氧化氫。其他較佳的方法包括使用一ROS刺激劑，諸如一發炎傳介劑。
較佳具體例的方法亦包括下列作為ROS刺激劑：(i)一細菌內毒素，外毒素或其組合；或(ii)一脂多醣、脂寡醣，或其組合。較佳地，該ROS是一脂多醣。
一與較佳具體例的各種方法一起被應用的細胞包括一免疫細胞、一淋巴球、淋巴胚細胞、巨噬細胞、一有核細胞(諸如粒線體)，或其混合物。該細胞可以是不死的，或存在於一組織培養物中。較佳地，該細胞具有一可被一染料通透的細胞壁。此外，該染料可以在細胞粒線體中累積。較佳的是任何過量的染料可以從細胞中被洗滌。
在較佳具體例的方法中，該測試化合物主動地或被動地被運送到細胞內。較佳地，任何過量的測試化合物從細胞中被洗滌。在一類似的靜脈中，該ROS或ROS刺激劑(例如，發炎傳介劑)較佳地主動地或被動地被運送至細胞中，並且較佳的是從細胞中洗滌任何過量的ROS或ROS刺激劑。
依據較佳具體例的各個方面，一細胞起初是與一當氧化或還原時能夠發出螢光的物質(較佳地是一染料)接觸。可應用於該等具體例的染料包括當氧化或還原時發出螢光的染料。較佳地，此等染料當例如透過一ROS而氧化或還原時發出螢光。較佳的是使用以一非-螢光形式與細胞接觸，並且接著當與一ROS反應時發出螢光的染料，該ROS可以是在細胞內製造或者透過外部來源而被引入。一些具有這些特性的染料對於那些在該技藝中具有通常技術而言為已知的，並且可以包括螢光素類染料，諸如2,7-二氯螢光素二乙酸鹽(DCF-DA)。DCF-DA是一種細胞膜可通透的染料，它可以擴散穿過細胞脂質膜。它未活化時是非螢光的，而當被ROS氧化時會形成高度螢光的二氯螢光素(DCF)。其他可應用於本發明的染料可包括螢光素衍生物以及類似物，諸如二氫玫瑰紅(DHF 123)，它是DCF-DA的一種類似物。DHR123在粒線體內累積，並且因而特別適用於決定粒線體內的ROS水準。其他可應用的染料包括螢光素衍生物，諸如俄勒岡綠(Oregon Green)、東京綠(Tokyo Green)、羧基半萘酚螢光素(carboxyseminaphthofluorescein)(SNAFL-可得自於Molecular Probes(Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA))、羧基萘酚螢光素(carboxynaphthofluorescein)、Alexa Fluor染料(例如Alexa 488-亦可得自於Molecular Probes(Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA))、DyLight Fluor染料(例如Dylight 488，商業上可得自於Thermo Fisher Scientiwc,Waltham,MA)，以及HiLyte Fluor染料(商業上可得自於AnaSpec,San Jose,CA)。細胞可以與染料一起培育以允許染料併入至細胞內。之後，細胞可以被洗滌以移除殘餘的染料。
在以一染料標記之後，細胞可暴露於一或多種測試化合物。此等測試化合物較佳地藉由主動或被動運輸(例如擴散)被引入至細胞內，並且較佳地留存在細胞內。該等細胞可以在此等測試化合物的存在下被培育，並且接而被洗滌而移除殘餘的測試化合物。
在以該測試化合物處理之後，較佳地細胞接而暴露於ROS。典型地ROS包括氧離子、自由基，以及過氧化物，無機與有機的，與在細胞內產生此等氧離子和自由基的化合物。ROS(或ROS劑)為那些該技藝中具有通常技術者所熟知，並且通常是因為存在有不成對價殼層電子而具有高度活性的小分子。過氧化物的實例包括氫過氧化物、過氧化氫、鹼金屬與鹼土金屬的過氧化物、有機過氧化合物、過氧酸，以及它們的混合物。細胞可以被暴露於源自一外部來源的ROS劑，其中該細胞可以在含有該ROS劑的培養基中被培育以允許細胞將ROS劑併入至細胞內，例如，藉由主動或被動運輸。細胞接著被洗滌以移除未被併入至細胞內的殘餘ROS。
在本發明的一具體例中，ROS可以與一誘發ROS製造的化合物接合的方式與細胞接觸，例如一ROS刺激劑，諸如一發炎傳介劑，其中該傳介劑在細胞內會致使或已知會致使ROS製造。在又一具體例中，該細胞在沒有額外ROS劑存在的情況下與ROS刺激劑接觸。如同該技藝中所熟知的，該發炎傳介劑可包括一細菌毒素，例如一內毒素或外毒素，諸如一脂多醣或脂寡醣。細胞可以與ROS以及發炎傳介劑一起培育以允許ROS與發炎傳介劑被併入至細胞內。細胞接著可以被洗滌以移除殘餘的ROS和發炎傳介劑。另擇地，該細胞可以與發炎傳介劑一起被培育以允許發炎傳介劑被併入至細胞內。該細胞接而被洗滌以移除殘餘的發炎傳介劑。
此處所述具體例的方法預期要測定已與不同組成分接觸之細胞的螢光。該等方法包括在細胞與能夠發出螢光的物質以及ROS或ROS刺激劑接觸之後測定螢光，並接著在細胞與這些組成分與測試化合物接觸之後測定螢光。螢光可以藉由任何為那些在該技藝中具有通常技術者所熟知的方法來被測定。此等已知以及商業上可取得的方法包括光學活細胞陣列技術(optical live cell array technology)或者是顯微鏡成像系統。如同所熟知的，螢光典型地在激發與在發射下被測定。具有該技藝中通常技術者能夠使用此處所提供的指導方針來測定並決定螢光。
未意欲要受到任何理論所囿限，據信本發明的方法允許即時分析測試化合物於細胞內ROS含量的影響。藉由併入一能夠發出螢光的組成分、一測試化合物，並且接著是一ROS/發炎傳介劑至細胞內，吾人能夠藉由測定細胞螢光來測定該測試化合物的抗氧化活性。能夠在氧化或還原之後發出螢光的組成分較佳地是一染料，典型地具有某些背景螢光，然而一但結合自由基之後，螢光強度增高。螢光強度的增高可易於被測定。測試化合物可以被添加至細胞以評估它們降低ROS自由基形成(或藉由反應來消耗它們)的能力，以及若能夠降低自由基形成，螢光強度理應降低。
因此，一具有較高的抑制ROS能力的測試化合物會造成較少ROS能與染料起作用之反應，並且因此螢光被降低。另一方面，無法抑制ROS的一測試化合物造成一較大數量的ROS能夠與染料起作用的反應，並且因而螢光被增高。細胞螢光可以在數分鐘、數小時或數天的期間被監測以決定測試化合物於ROS/發炎傳介劑的影響。
在一具體例中，細胞在與一測試化合物接觸之前與一染料接觸。選擇性地，細胞在與一ROS和/或ROS刺激劑接觸之前與一測試化合物接觸。在另一具體例中，ROS被併入至細胞內，例如，ROS對於細胞是外生性的。
應用於較佳方法中的細胞包括具有粒線體的有核細胞。細胞可以是不死的(例如癌細胞)，並且可以是免疫細胞(諸如一淋巴球或淋巴胚細胞)。此等細胞可以任何為那些在該技藝中具有通常技術者所熟知的方法被培養。細胞也可以在一操作或檢查程序的期間被就地培養(cultured on-site)，並且接著被即時測試以評估某些測試化合物於抑制細胞製造ROS上的影響。
該等具體例的方法可以被應用於決定化合物於細胞製造ROS所具有的影響。如上所述，已知自由基在細胞內的產生並不是所欲的，通常會造成細胞死亡。舉例來說，某些細菌具有於人體細胞中誘發自由基形成之效用，因而損害細胞。此處所述的方法能夠決定可以降低自由基形成(造成較低的螢光強度)的測試化合物，並且因此可以被應用於對抗細菌的有害影響。
許多這樣的細菌存在於口腔以及口腔黏膜中。該等細菌可以造成數種有害影響。舉例而言，細菌細胞，較佳地，兼性厭氧細胞可以被用作為較佳具體例的細胞。該方法接而可以測定某些測試化合物於降低此等細胞生成自由基的能力。
該等具體例的方法因而可以被用來就地決定針對治療特定易感於自由基形成的細胞的有效治療(投藥一能夠降低螢光的有效測試化合物)。該等具體例的方法也可以應用於證實特定化合物(或含有這些化合物的組成物)對於已知細胞(例如細菌細胞)的效力。例如，於經常在人類口中被發現到的細菌中，該方法可以被用來顯示給一牙科專業人士一特定牙粉於減低細菌中自由基形成是如何地有效。該方法也可以藉由顯示產品之間的比較(例如，不同競爭者的牙粉)而在銷售一產品時被用作為比較工具。
本發明的較佳具體例現在將參照下列非限定的實施例而被說明。該實施例僅為說明且並未以任何方式限定如所述或所請求的發明範疇。
 實施例1
人類組織細胞淋巴瘤U937細胞(human histocytic lymphoma U937 cells)(ATCC,Manassas,VA)起初被培養在含有10%血清以及1%青黴素的RPMI-1640培養基(ATCC,Manassas,VA)中，並且接著於37℃下，以一為2 X 105 細胞/ml的濃度被轉移到含有1 ng/ml PMA的培養基中達48小時。在暴露於染料之前，該等細胞在無血清培養基中挨餓過夜。
細胞以PBS緩衝液洗滌兩次，並且在30℃下被分成兩群與DCF-DA或DHR123(Calibochem,La Jolla,CA)培育的達30分鐘。細胞以PBS洗滌兩次以移除殘餘的染料。適當的實驗對照組也被維持。
細胞繼而被分成數組，而不同數量的一1%α-生育酚(維生素E)溶液、物質1，或物質2被添加至各組中，並且在37℃下被培育達15分鐘。細胞接著以PBS予以洗滌兩次以移除殘餘數量的測試化合物。ROS劑H2 O2 以及LPS接而被加入並且被培育歷時不同的時期。該等細胞的螢光繼而在激發485 nm以及發射530 nm下被讀取達高至5小時。
如第1與2圖中所示，僅以染料，例如DCF-DA與DHR123予以染色的細胞展現出背景螢光。參見第1圖，在兩小時的培育之後，於不存在測試化合物但是有2.5 mM的ROS與ROS刺激劑的存在下，所培育出的細胞要比有一測試化合物(α-生育酚)以及呈2.5 mM的ROS與ROS刺激劑存在下所培育出的細胞發出更強的螢光。
分析細胞螢光因而允許即時監測可以被用來篩選測試化合物的細胞內氧化壓力。細胞螢光的測定可以在個別細胞中使用光學活細胞陣列技術，和/或顯微鏡成像系統而被實現。
參見第2圖，2ppm、10ppm、或100ppm的α-生育酚、物質1以及物質2與細胞一起培育。第2圖揭示在有2.5 mM過氧化氫的存在下，2ppm的α-生育酚以及物質1與ROS反應並且降低氧化水準達大約30%。在10ppm與100ppm，α-生育酚在清除ROS或自由基方面沒有顯示出增高的能力；然而，100ppm的物質1能降低氧化水準達50%。第2圖也揭示物質2會增高氧化壓力，並且相較於2ppm，物質2在100ppm會增高自由基水準達近乎3倍。
將為那些在本技藝中具有通常技術者所理解的是，上述具體例可以在不偏離其非限定的發明概念下做出改變與變化。因此，本發明被理解既不囿限於所揭露的特定具體例，也意欲涵括任何落在本發明的精神以及範疇內的修飾。
第1圖顯示在實施例1中所得到的螢光數值；以及第2圖顯示關於如實施例1中所述的不同測試組成分的螢光數值。

Claims (15)

  1. 一種測定一測試組成分在一細胞中低ROS組成分之功效的方法，包含有：a.令一細胞與一能夠發出螢光的物質接觸；b.令該細胞與該測試組成分接觸；c.測定細胞螢光；d.令該細胞與一ROS及ROS刺激劑接觸，其中該ROS是選自於由一氧離子生成化合物、自由基生成化合物、一過氧化物、及其混合物所構成的群組，且其中該ROS刺激劑是選自於由細菌外毒素、及其混合物所構成之群組，或包含脂多醣；e.測定細胞螢光；以及f.比較c中的細胞螢光與e中的螢光，並且測定該測試組成分於降低ROS的功效。
  2. 如申請專利範圍第1項的方法，其中該能夠發出螢光的物質是一當被氧化時發出螢光的染料。
  3. 如申請專利範圍第2項的方法，其中該染料是選自於由2,7-二氯螢光素二乙酸鹽(DCF-DA)、二氫玫瑰紅(DHR 123)，及其混合物所構成的群組。
  4. 如申請專利範圍第1項的方法，其中該能夠發出螢光的物質是當被還原時發出螢光的染料。
  5. 如申請專利範圍第1項的方法，其中該測試組成分是一抗氧化劑。
  6. 如申請專利範圍第1項的方法，其中該ROS是一過氧化 物。
  7. 如申請專利範圍第6項的方法，其中該過氧化物是過氧化氫。
  8. 如申請專利範圍第1項的方法，其中該細胞是一免疫細胞。
  9. 如申請專利範圍第1項的方法，其中該細胞是選自於由一淋巴球、淋巴胚細胞、巨噬細胞、細菌、兼性厭氧菌，及其混合物所構成之群組。
  10. 如申請專利範圍第1項的方法，其中該細胞具有一可被能夠發出螢光之物質穿透的壁。
  11. 如申請專利範圍第1項的方法，其中該測試組成分被運送至該細胞中。
  12. 如申請專利範圍第1項的方法，其中該測試組成分被主動地或被動地運送至該細胞中。
  13. 如申請專利範圍第1項的方法，其中該ROS是藉由主動或被動運輸而被運送至該細胞中。
  14. 如申請專利範圍第1項的方法，其中該細胞會發出螢光。
  15. 如申請專利範圍第1項的方法，其中該方法測定細胞的ROS含量。
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