CN112326607B - 一种低浓度ros的检测方法及其应用 - Google Patents

一种低浓度ros的检测方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种低浓度ROS的检测方法及其应用。本发明的检测方法是利用荧光探针DCFH‑DA检测氧化损伤的细胞内活性氧ROS水平，包括如下步骤：(1)将氧化损伤的细胞中加入DCFH‑DA溶液，避光孵育，移除溶液，冲洗细胞，获得待测细胞样品；(2)将待测细胞样品采用灯光照射，检测荧光信号值。本发明的检测方法可检测细胞中低剂量的ROS，克服了低剂量ROS的检测容易受到光辐射的影响，无法准确表达真实ROS水平的问题；采用本发明的方法可增大不同样品荧光强度，同时又不会改变其相对荧光强度，达到不同样品之间荧光强度的等比增大，从而使检测数值更加明显。

Description

一种低浓度ROS的检测方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物活性检测技术领域，特别涉及一种低浓度ROS的检测方法及其应用。
背景技术
活性氧(ROS)是指生物体内与氧代谢有关的含氧自由基以及非自由基形式存在的具有高活性的副产物，包括超氧阴离子、羟基自由基、过氧化氢等。ROS在生物体内参与机体的免疫反应、基因表达调控以及信号传导等过程，因此其检测在许多科学研究中具有重要意义，如氧化应激表征、污染物毒性研究、抗肿瘤药物开发等。过量的ROS会对细胞质膜、蛋白质、核酸等生物大分子造成氧化损伤，而氧化损伤机制是多种污染物的重要致毒机理。因此，通过检测生物体内ROS含量的变化，以表征机体受到的氧化损伤具有重要作用。
ROS性质活泼、反应性强、寿命短，且生物体内存在多种抗氧化机制，因此其检测具有一定难度。目前，细胞中ROS的检测主要采用荧光探针法。荧光探针法凭借其灵敏度高、分辨率高、数据易于处理等特点在ROS检测中得到广泛的应用。
近年来，DCFH-DA荧光探针法被广泛用于细胞内ROS的检测。DCFH-DA本身不含荧光，可以自由穿透细胞膜，被细胞内的酯酶水解生成DCFH，进而被ROS氧化生成荧光物质DCF，通过检测DCF的荧光强度从而量化细胞内活性氧的水平。然而，DCFH-DA荧光探针法在应用中也存在较多的问题，其检测效果往往受到光照、pH值、细胞色素c、抗氧剂等因素的影响。
据文献报道，荧光探针具有光敏性，易发生自氧化而提高背景荧光强度。MarchesiE等人研究表明，在还原剂存在下，可见光连续照射DCF会使其还原，进一步产生超氧化物，引发连锁反应，使得DCFH进一步被氧化，最终导致DCF荧光信号的自放大。DCF光反应机理见图1。Afzal M等人研究发现，DCFH在250、300、330、400、500或600nm波长光照射下，能产生荧光物质DCF，从而使结果不稳定。与此同时，Setsukinai K等人发现荧光显微镜的激发光能光诱导自氧化DCFH-DA而使细胞荧光显著增强。此外，当细胞内ROS无变化时，凋亡细胞通过释放细胞色素c，催化DCFH与细胞内ROS反应来使荧光强度增强。pH值的变化可以影响DCFH-DA探针的装载效率。研究表明，DCFH-DA在碱性条件下可以被水解生成DCFH，而DCFH无法穿透细胞膜，从而导致探针的含量下降。细胞内的抗氧剂可与探针反应，探针被还原形成自由基，影响ROS的检测。
因此，为了克服现有技术手段的缺点与不足，发明人通过使用荧光染料和光辐射作用，发明了一种针对低浓度ROS的检测方法。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种低浓度ROS的检测方法。
本发明的另一目的在于提供上述检测方法的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种低浓度ROS的检测方法，是利用荧光探针DCFH-DA检测氧化损伤的细胞内活性氧ROS水平，包括如下步骤：
(1)将氧化损伤的细胞中加入DCFH-DA溶液，避光孵育，冲洗，获得待测细胞样品；
(2)将待测细胞样品采用灯光照射，检测荧光信号值。
步骤(1)中所述的氧化损伤的细胞是ROS含量低，采用现有的活性氧检测试剂盒检测不出ROS含量的细胞。
所述的检测不出ROS含量是指检测出的数值与空白背景值相差不大，统计分析出的P值大于0.05，没有显著性差异。
所述的现有的活性氧检测试剂盒检测ROS时DCFH-DA在体系中的终浓度为10μM。
步骤(1)中所述的氧化损伤的细胞采用如下方法刺激其生成ROS：将细胞接种至96孔板，每孔15000个细胞，细胞贴壁生长12h，至汇合度达到50～70％，加入H2O2溶液或聚苯乙烯纳米塑料刺激细胞，37℃避光培养，使用1×PBS(0.01M，pH＝7.4)缓冲液冲洗细胞，去除残留的刺激物。
所述的H2O2溶液的浓度为体积比0.03～0.06％。
所述的聚苯乙烯纳米塑料颗粒的粒径为20～100nm，浓度为500mg/L。
采用H2O2溶液刺激细胞时，避光培养的时间为30min。
采用聚苯乙烯纳米塑料颗粒刺激细胞时，避光培养的时间为4h。
所述的接种采用的细胞生长培养基的配置：89mL高糖型DMEM培养基、10mL胎牛血清、1mL青霉素-链霉素双抗溶液(100×)，调节pH至7.0。
步骤(1)中所述的DCFH-DA溶液是采用高糖DMEM无血清培养基(含1％青霉素-链霉素双抗溶液)稀释DCFH-DA，调节溶液pH至7.0得到。
步骤(1)中所述的DCFH-DA溶液采用高糖DMEM无血清培养基稀释至浓度为2～20μM；优选为稀释至浓度为10μM。
所述的调节溶液pH通过滴加0.1M NaOH溶液或12M HCl溶液调节。
步骤(1)中所述的避光孵育的时间为15～60min；优选为30min。
步骤(1)中所述的冲洗细胞为采用PBS缓冲液冲洗2～3次，去除未进入细胞内的DCFH-DA溶液。
所述的PBS缓冲液为1×PBS缓冲液(0.01M，pH＝7.4)。
步骤(2)中所述的灯光照射为采用LED灯或日光灯照射。
步骤(2)中所述的灯光照射的时间为5～10min；优选为10min。
步骤(2)中所述的灯光照射的光功率密度为5.43-13.40mW/cm2；优选为13.40mW/cm2。
步骤(2)中所述的检测荧光信号值为采用多功能酶标仪检测，检测荧光信号的激发波长为488nm，发射波长为525nm。
上述低浓度ROS的检测方法在生物科学研究中的应用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)荧光探针法对于低剂量ROS的检测容易受到光辐射的影响，无法准确表达真实ROS水平。本发明的检测方法弥补了现有不足，可检测细胞中低剂量ROS。
(2)本发明的检测方法可增大不同样品荧光强度，同时又不会改变其相对荧光强度，达到不同样品之间荧光强度的等比增大，从而使检测数值更加明显。
(3)采用本发明的方法检测，在光照待测样品后其荧光强度增强并达到稳定，采用酶标仪检测过程中荧光强度不随检测次数而波动，使检测数值更加稳定。
附图说明
图1是DCF光反应机理图。
图2是采用本发明的检测方法检测过氧化氢诱导细胞产生ROS的结果统计图；其中，a为不同浓度的过氧化氢诱导细胞产生ROS的检测结果；b为不同光照时间下浓度为0.06％H2O2和0.03％H2O2处理的细胞之间的荧光比值。
图3是0.06％H2O2诱导氧化损伤的HeLa细胞不同光照时间的ROS检测图。
图4是采用本发明的检测方法检测不同粒径的聚苯乙烯纳米塑料诱导细胞产生ROS的结果统计图。
图5是采用传统方法检测细胞内ROS的结果统计图；其中，a为不同浓度的过氧化氢诱导细胞产生ROS的检测结果；b为不同粒径的聚苯乙烯纳米塑料诱导细胞产生ROS的检测结果。
图6是DCFH和DCF在不同光照强度下，荧光强度随光照时间的变化结果统计图；其中，a为对照组，b为光功率密度5.43mW/cm2，c为光功率密度6.80mW/cm2，d为光功率密度13.40mW/cm2。
图7是浓度为0.05μM与0.02μM的DCF样品在不同光照时间和光功率密度下的荧光强度比值统计图。
图8是不同光照强度和光照时间对浓度为0.02μM的DCF样品荧光稳定性影响统计图；其中，a为对照，b为光照10min，c为光照20min，d为光照40min。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1刺激HeLa细胞生成ROS
(1)使用H2O2刺激HeLa细胞生成ROS
①用移液枪分别吸取89mL DMEM高糖培养基、10mL胎牛血清、1mL青霉素-链霉素双抗溶液，配制成细胞生长培养基，通过滴加0.1M NaOH溶液或12M HCl溶液调节pH至7.0。
②选择人宫颈癌细胞系HeLa作为实验用细胞株，实验前一天将细胞接种至96孔板，每孔15000个细胞。细胞贴壁生长12h，至细胞汇合度达到50～70％。
③分别加入不同体积的H2O2刺激细胞(使H2O2在体系中的浓度分别为0.03％、0.06％)，于37℃细胞培养箱内避光培养30min。
④刺激30min后移除溶液，使用1×PBS(0.01M，pH＝7.4)缓冲液冲洗细胞，去除残留的H2O2，得到氧化损伤的HeLa细胞。
(2)使用聚苯乙烯塑料颗粒刺激HeLa细胞生成ROS
①用移液枪分别吸取89mL DMEM高糖培养基、10mL胎牛血清、1mL双抗溶液配制细胞生长培养基，并调节pH至7.0。
②选择人宫颈癌细胞系HeLa作为实验用细胞株，实验前一天细胞接种至96孔板，每孔15000个细胞。细胞贴壁生长12h，至细胞汇合度达到50～70％。
③加入不同粒径的聚苯乙烯纳米塑料颗粒(购自上海辉质生物科技有限公司，型号：DS20、DS100，粒径：20nm、100nm，在体系中的浓度为500mg/L)刺激细胞，于37℃细胞培养箱内避光培养4h。
④刺激4h后移除溶液，使用1×PBS(0.01M，pH＝7.4)缓冲液冲洗细胞，去除残留的纳米塑料，得到氧化损伤的HeLa细胞。
实施例2检测H2O2刺激的HeLa细胞内ROS
①将实施例1步骤(1)氧化损伤的HeLa细胞中加入高糖DMEM无血清培养基(含1％青霉素-链霉素双抗溶液)稀释的DCFH-DA溶液(终浓度为10μM)，通过滴加0.1M NaOH溶液或12M HCl溶液调节pH至7.0，进行避光孵育30min。
②孵育30min后移除溶液，用1×PBS(0.01M，pH＝7.4)缓冲液冲洗2～3次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA溶液，获得待测样品。
③待测样品使用LED灯光照射，其中光照时间分别为5min、10min，光功率密度为13.40mW/cm2。
④使用多功能酶标仪检测各孔板内的荧光信号值，其中，多功能酶标仪检测荧光信号的激发波长为488nm，发射波长为525nm。
结果如图2a所示，使用本发明的方法检测过氧化氢处理细胞前后产生的荧光强度具有显著性差异(p＜0.05)，与文献报道的过氧化氢处理细胞产生明显的ROS相一致。LED灯光照射待测样品后，不同样品荧光强度均增强，同时又不改变其相对荧光强度，达到不同样品之间荧光强度的等比增加。且光照后，相对于空白背景值，样品的荧光数值整体变大，使检测数值更加明显。如图2b所示，未光照时，浓度为0.06％的H2O2和0.03％的H2O2处理细胞间的荧光比值为3.1017±3.3513；光照5min后，其荧光比值为3.3120±0.8759；光照10min后，其荧光比值为3.2934±0.9330。说明光照待测样品后，其荧光强度可以达到等比增加的效果。不同浓度过氧化氢处理、并光照相同时间的实验组之间的荧光比值稳定，证明了相对ROS不会发生变化，光照对ROS的检测结果无影响。图3是0.06％H2O2诱导氧化损伤的HeLa细胞不同光照时间的ROS检测图。
实施例3检测聚苯乙烯塑料颗粒刺激的HeLa细胞内ROS
①将实施例1步骤(2)氧化损伤的HeLa细胞中加入高糖DMEM无血清培养基(含1％青霉素-链霉素双抗溶液)稀释的DCFH-DA溶液(终浓度为10μM)，通过滴加0.1M NaOH溶液或12M HCl溶液调节pH至7.0，进行避光孵育30min。
②孵育30min后，移除溶液，用1×PBS(0.01M，pH＝7.4)缓冲液冲洗2～3次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA溶液。
③待测溶液使用LED灯光照射，其中光照时间分别为5min、10min，光功率密度为13.40mW/cm2。
④使用多功能酶标仪检测各孔板内的荧光信号值，其中多功能酶标仪检测荧光信号的激发波长为488nm，发射波长为525nm。
如图4所示，不同粒径的聚苯乙烯纳米塑料颗粒处理细胞产生的荧光强度具有显著性差异(p＜0.05)，与文献报道的产生明显的ROS相一致。各处理组的细胞荧光强度明显增强。与未光照相比，光照可以显著提高细胞的荧光信号使得检测数值更加明显。例如光照10min后，经20nm聚苯乙烯塑料(500mg/L)处理的细胞的荧光强度是未处理组的27.85±10.76倍；经100nm聚苯乙烯塑料(500mg/L)处理的细胞的荧光强度是未处理组的7.20±2.94倍。
对比例1采用传统方法检测H2O2刺激的HeLa细胞内ROS
①将实施例1步骤(1)氧化损伤的HeLa细胞中加入高糖DMEM无血清培养基(含1％青霉素-链霉素双抗)稀释的DCFH-DA溶液(终浓度为10μM)，通过滴加0.1M NaOH溶液或12MHCl溶液调节pH至7.0，进行避光孵育30min。
②孵育30min后移除溶液，用1×PBS(0.01M，pH＝7.4)缓冲液冲洗2～3次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA溶液，获得待测样品
③使用多功能酶标仪检测各孔板内的荧光信号值，其中多功能酶标仪检测荧光信号的激发波长为488nm，发射波长为525nm。
结果如图5a所示，使用传统方法检测过氧化氢处理细胞产生的荧光强度无显著性差异(p＞0.05)，且数值波动较大。其中，经浓度为0.03％的H2O2处理后的细胞的荧光强度是未处理组的1.0659±0.2487倍。而经浓度为0.06％的H2O2处理的细胞的荧光强度是未处理组的1.6471±0.6566倍。
对比例2采用传统方法使用聚苯乙烯塑料颗粒刺激HeLa细胞生成ROS
①将实施例1步骤(2)氧化损伤的HeLa细胞中加入高糖DMEM无血清培养基(含1％青霉素-链霉素双抗溶液)稀释的DCFH-DA溶液(终浓度为10μM)，通过滴加0.1M NaOH溶液或12M HCl溶液调节pH至7.0，进行避光孵育30min。
②孵育30min后，移除溶液，用1×PBS(0.01M，pH＝7.4)缓冲液冲洗2～3次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA溶液。
③使用多功能酶标仪检测各孔板内的荧光信号值，其中多功能酶标仪检测荧光信号的激发波长为488nm，发射波长为525nm。
结果如图5b所示，不同粒径的聚苯乙烯纳米塑料颗粒处理细胞产生的荧光强度与过氧化氢一样无显著性差异(p＞0.05)。其中经20nm聚苯乙烯塑料(500mg/L)处理的细胞的荧光强度是未处理组的0.8267±0.0459倍。而经100nm聚苯乙烯塑料(500mg/L)处理的细胞的荧光强度是未处理组的0.9693±0.0381倍。
实施例4DCF荧光放大测试
①使用纯水配制1×PBS缓冲液，同时调节pH至7.4；使用DMSO配制DCFH-DA储液，浓度为10mM；使用DMSO配制DCF储液，浓度为10mM。
②DCF储液使用纯水稀释1000倍，配制DCF溶液，浓度为10μM，避光。
③DCFH-DA储液使用1×PBS缓冲液(0.01M、pH＝7.4)稀释1000倍，避光水解20min，生成DCFH溶液，记为A溶液。
④待测样品的配制：取1.5μL DCF溶液加至1.5mL A溶液中，配制0.01μM DCF溶液，记为B溶液。取8μL DCF溶液加至4mL A液中，配制0.02μM DCF溶液，记为C溶液。取20μL DCF溶液加至4mL A液中，配制0.05μM DCF溶液，记为D溶液。
⑤分别取200μL A、B、C、D溶液于96孔板中，每组溶液3个复孔。光照0min、1min、3min、5min、7min、10min、15min、20min、30min、40min后，使用多功能酶标仪检测各孔板内的荧光信号值。其中，光功率密度调节为0、5.43mW/cm2、6.80mW/cm2、13.40mW/cm2。此外，不光照的对照组额外在0.5min和2min检测荧光信号值。
结果如图6a所示，未光照时DCF荧光不稳定，随着时间荧光值有明显的上升趋势。可能是DCFH发生自氧化，生成DCF而使荧光变大。图6b、c、d表明，随着光照时间的增加，DCF荧光显著增强；且随着光照强度的增加，光氧化反应越剧烈，最终荧光强度达到饱和。此外，以0.02μM和0.05μM的DCF样品为例(图7)，光功率密度为5.43mW/cm2时，在光照10min内，两个样品间荧光强度的比值具有很好的等比放大效果。然而，当光照时间继续延长时其相对荧光强度会改变，从而无法达到等比增大的效果。光照强度增加到6.80mW/cm2、13.40mW/cm2时，也无法达到等比增大的效果。因此，在光照特定时间后，不同DCF样品的荧光强度可以达到等比增加，从而不改变其相对荧光强度，使得检测数值更加明显。
另外，由附图6d可推知，光功率密度高时会导致不同浓度DCF样品的荧光在短时间内直接达到饱和，这时就无法等比放大，因而就会改变其相对ROS的大小，无法准确检测ROS，且强光也会导致细胞死亡。而光功率密度过低的话，其放大荧光所需的时间就要更长，长时间的光照也会导致细胞坏死。因此光照强度不宜太高也不能太低。
实施例5DCF荧光稳定性测试
①使用纯水配制1×PBS缓冲液，同时调节pH至7.4；使用DMSO配制DCFH-DA储液，浓度为10mM；使用DMSO配制DCF储液，浓度为10mM。
②DCF储液使用纯水稀释1000倍，配制DCF溶液，浓度为10μM，避光。
③DCFH-DA储液使用1×PBS缓冲液(0.01M、pH＝7.4)稀释1000倍，避光水解20min，生成DCFH溶液，记为A溶液。
④待测样品的配制：取8μL DCF溶液加至4mL A溶液中，配制0.02μM DCF溶液，记为B溶液。
⑤分别取200μL B溶液于96孔板中，每组溶液3个复孔，共4组样品。a组避光，每隔5min检测荧光强度；b组光照10min后，每隔5min检测荧光强度；c组光照20min后，每隔5min检测荧光强度；d组光照40min后，每隔5min检测荧光强度。其中，b、c、d组的光功率密度调节为5.43mW/cm2、6.80mW/cm2、13.40mW/cm2。
结果如图8a所示，0.02μM DCF样品未光照时，荧光强度并不稳定，随着检测次数的增加，样品的荧光强度逐渐增大。如图8b所示，当光功率密度为5.43mW/cm2和6.80mW/cm2时，样品光照10min后，荧光并未达到稳定；而当光功率密度为13.40mW/cm2时，样品的荧光具有很好的稳定性，不再随检测次数的增加而上升。光功率密度为6.80和13.40mW/cm2时，在20min和40min的长时间光照辐射会导致DCF样品由于光漂白而使荧光强度有所下降(图8c-d)。
综上所述，通过对DCF样品进行不同强度光照射后，DCF的荧光强度具有很好的稳定性，不随时间而发生明显的变化。随着光照强度的增加，荧光稳定性越好。DCF样品以特定光照时间照射后，可使其荧光达到稳定。光照时间不宜过长，否则容易发生光漂白。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种低浓度ROS的检测方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）在不同程度氧化损伤刺激产生ROS的细胞中加入DCFH-DA溶液，避光孵育，冲洗，获得待测细胞样品；
（2）将待测细胞样品采用灯光照射，检测荧光信号值，根据不同待测细胞样品的荧光信号值相对大小，即可判断不同待测细胞样品中ROS含量的相对高低；
步骤（1）中所述的不同程度氧化损伤刺激产生ROS的细胞是ROS含量低，采用现有的活性氧检测试剂盒检测不出ROS含量的细胞；所述的检测不出ROS含量是指检测出的数值与空白背景值相差不大，统计分析出的P值大于0.05，没有显著性差异；所述的现有的活性氧检测试剂盒检测ROS时DCFH-DA在体系中的终浓度为10 µM；通过如下制备方法得到：将细胞接种至96孔板，每孔15000个细胞，细胞贴壁生长12 h，至汇合度达到50~70%，加入H2O2溶液刺激细胞，37℃避光培养30 min，使用1×PBS缓冲液冲洗细胞，去除残留的刺激物；所用的H2O2溶液的浓度为体积比0.03~0.06%；
步骤（1）中所述的DCFH-DA溶液是采用含1%青霉素-链霉素双抗溶液的高糖DMEM无血清培养基稀释DCFH-DA至浓度为2~10 µM，调节溶液pH至7.0得到；
步骤（1）中所述的避光孵育的时间为15~60 min；
步骤（2）中所述的灯光照射的时间为5~10 min；
步骤（2）中所述的灯光照射的光功率密度为5.43~13.40 mW/cm2。
2.根据权利要求1所述的低浓度ROS的检测方法，其特征在于，
步骤（1）中所述的DCFH-DA溶液采用高糖DMEM无血清培养基稀释至浓度为10 µM；
步骤（1）中所述的避光孵育的时间为30 min；
步骤（2）中所述的灯光照射的时间为10 min；
步骤（2）中所述的灯光照射的光功率密度为13.40 mW/cm2。
3.根据权利要求1所述的低浓度ROS的检测方法，其特征在于，
步骤（1）中冲洗细胞为采用PBS缓冲液冲洗2~3次，去除未进入细胞内的DCFH-DA溶液；
步骤（2）中所述的灯光照射为采用LED灯或日光灯照射；
步骤（2）中所述的检测荧光信号值为采用多功能酶标仪检测，检测荧光信号的激发波长为488nm，发射波长为525nm。
4.根据权利要求1所述的低浓度ROS的检测方法，其特征在于，所述的接种采用的细胞生长培养基的配置：89mL高糖型DMEM培养基、10 mL胎牛血清、1 mL100×青霉素-链霉素双抗溶液，调节pH至7.0。
5.权利要求1~4任一项所述的低浓度ROS的检测方法在生物科学研究中的应用。
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