CN113713860A - 一种催化发光的铜簇纳米酶及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种催化发光的铜簇纳米酶及其制备方法和在催化、测定肾上腺素的应用。催化发光的铜簇纳米酶是由铜离子和半胱氨酸、组氨酸反应形成的铜纳米簇。本发明所制备的铜纳米簇不仅具有天然漆酶的活性，像漆酶一样催化肾上腺素的反应，而且具有发光功能，能发光指示nM水平的肾上腺素分子。本发明的铜簇纳米酶制备方法简便，在催化、传感、生物降解等方面具有良好的应用前景。

Description

一种催化发光的铜簇纳米酶及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种催化发光的铜簇纳米酶及其制备方法和在发光检测肾上腺素的应用，所制备的铜簇纳米酶可催化降解及传感生物分子，属于催化、生物纳米材料领域。
背景技术
由几个到几百个原子构成的金属纳米簇不仅具有独特的光、电、磁、催化等性质，而且具有超小的尺寸、良好的生物相容性，在生物传感、医学成像、催化等领域有广泛的潜在应用。铜纳米簇用于催化的报道有：中国专利公布号CN111521589A，2019年，韦寿莲等，一种荧光铜纳米簇-碳复合催化剂的制备方法，公开了一种用半胱氨酸作为模板和还原剂，掺杂碳材料制备铜纳米簇-碳复合催化剂的制备方法；中国专利公布号CN 107876058 A，2018年，郭新立等，一种快速制备高催化性能复合材料的方法，公开了一种用抗坏血酸作还原剂制备铜纳米簇-石墨烯-泡沫镍复合材料催化剂的方法；吴秀明等报道了一种牛血清白蛋白修饰的铜纳米簇催化增强鲁米诺化学发光的方法(化学研究与应用，铜纳米簇催化鲁米诺化学发光体系的研究及应用，2016，28，1070-1074)。已公开的方法中铜纳米簇主要作为复合催化剂，作为生物催化剂酶尚未见报道。
肾上腺素是一种儿茶酚胺类激素和神经传送体，在中枢神经系统和心血管系统中起着至关重要的作用。已发现不正常的肾上腺素水平与包括帕金森病等多种疾病密切相关。肾上腺素也用作治疗心肌梗塞和一些过敏反应的药物。因此，检测肾上腺素具有重要意义。已报道的肾上腺素检测方法有：中国专利公布号CN 110672755A，2019年，王守伟等，一种基于LC-MC/MS同时测定肾上腺素及其代谢产物的方法，公开了一种高效液相色谱/串联质谱测定肾上腺素及的方法；中国专利公布号CN 102507712A，2011年，罗立强等，同时测定肾上腺素和尿酸的方法，公开了一种测定肾上腺素和尿酸的电化学方法；中国专利公布号CN106770129A，2017年，连宁等，一种金属铽荧光探针检测肾上腺素的方法及其用途，公开了一种铽荧光探针检测肾上腺素的方法；中国专利公布号CN 110426377 A，2019年，吴惠霞等，分子印迹聚合物材料及制备和在检测肾上腺素方面的应用，公开了一种用分子印迹聚合物材料检测肾上腺素的方法。
已公开的方法有的需要复杂的设备，有的方法繁琐，发展简单、快速、高灵敏的肾上腺素检测方法十分重要。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种催化发光的铜簇纳米酶，这种铜簇纳米酶具有天然漆酶的活性，能催化多酚分子的反应，是一种纳米酶。
本发明所要解决的第二个技术问题是提供这种催化发光的铜簇纳米酶的制备方法。
本发明所要解决的第三个技术问题是提供这种催化发光的铜簇纳米酶在纳米酶促发光检测肾上腺素方面的应用。
技术方案：为解决上述技术问题，本发明提供了一种催化发光的铜簇纳米酶，所述催化发光的铜簇纳米酶由铜离子(Cu2+)和配体1和配体2反应获得，所述配体1是半胱氨酸(Cys)、甲硫氨酸(Met)和谷胱甘肽(GSH)中一种，所述配体2是组氨酸(His)和色氨酸(Try)中一种。
其中，所述的铜簇纳米酶的粒径为1～5nm。
其中，所述的铜簇纳米酶具有催化性质，具有天然漆酶的催化活性。
其中，所述的铜簇纳米酶具有发光功能，能通过催化反应指示肾上腺素的含量。
本发明内容还包括一种催化发光铜簇纳米酶的制备方法，包括以下步骤：将配体1水溶液加到配体2水溶液中，再加入硝酸铜水溶液，搅拌均匀得到混合液，在混合液中缓慢滴加氢氧化钠溶液使混合液的pH值保持在8-9，当溶液逐渐变成黄色时，离心混合液，收集澄清的淡黄色上清液作为制备的铜簇纳米酶溶液。
其中，配体1：配体2：Cu2+的终浓度摩尔比控制在为1～5∶1～3∶1。
本发明内容还包括一种催化发光铜簇纳米酶在肾上腺素检测中的应用。
本发明内容还包括一种肾上腺素检测方法，包括以下步骤：
1)将所述的铜簇纳米酶加入到一系列已知浓度的标准肾上腺素溶液中，混合均匀，测定480nm波长下溶液的荧光强度，绘制肾上腺素浓度-荧光强度的工作曲线；
2)将所述的铜簇纳米酶加入到肾上腺素待测样品溶液中，混合均匀，测定待测样品的荧光强度，根据肾上腺素浓度的工作曲线以及测得样品溶液的荧光强度获得样品溶液的肾上腺素浓度。
其中，所述铜簇纳米酶的浓度为6.25μM～250μM。
其中，所述标准肾上腺素溶液浓度为0～200nM。
有益效果：与现有技术相比，本发明的铜簇纳米酶具有以下优点：
1)本发明的铜簇纳米酶是具有天然酶活性的无机材料，尺寸超小，是一种新型的纳米酶，在催化、传感、生物降解等方面具有良好的应用前景。
2)本发明的铜簇纳米酶具有催化发光双功能，具有漆酶催化功能，同时还具有发光指示肾上腺素的功能，测定肾上腺素的灵敏度高、准确度好。
4)本发明的铜簇纳米酶的制备方法温和、简便。
附图说明
图1为半胱氨酸-组氨酸-铜纳米簇Cys-His-CuNCs的透射电镜图；
图2为半胱氨酸-组氨酸-铜纳米簇Cys-His-CuNCs的荧光光谱；
图3为半胱氨酸-组氨酸-铜纳米簇Cys-His-CuNCs催化反应的最佳pH值；
图4为半胱氨酸-组氨酸-铜纳米簇Cys-His-CuNCs催化肾上腺素的紫外可见吸收光谱；
图5为半胱氨酸-组氨酸-铜纳米簇Cys-His-CuNCs催化肾上腺素的颜色变化；
图6为半胱氨酸-组氨酸-铜纳米簇Cys-His-CuNCs催化肾上腺素的荧光颜色图；
图7为半胱氨酸-组氨酸-铜纳米簇Cys-His-CuNCs最佳催化活性的组成摩尔比；
图8为半胱氨酸-组氨酸-铜纳米簇Cys-His-CuNCs的漆酶活性；
图9为半胱氨酸-组氨酸-铜纳米簇Cys-His-CuNCs催化发光检测肾上腺素。
具体实施方式
下面通过具体的实施例和附图对本发明进一步说明。
实施例1半胱氨酸-组氨酸-铜纳米簇Cys-His-CuNCs的制备
将1mL 30mM的半胱氨酸(Cys)水溶液加到磁力搅拌下的1mL 10mM组氨酸(His)水溶液中，加入10μL 50mM Cu(NO3)2的水溶液，搅拌均匀，构成Cys：His：Cu2+的摩尔比为3∶1∶0.05的混合液。在混合液中缓慢滴加0.5M NaOH溶液使混合液的pH值保持在8-9，当溶液逐渐变成黄色时(约30min)，在10 000rpm×10min下离心混合液，收集澄清的淡黄色上清液作为制备的铜纳米簇(Cys-His-CuNCs)溶液。以加入的铜离子浓度计算铜纳米簇浓度为0.25mM。
图1是制备的Cys-His-CuNCs的透射电镜图，显示Cys-His-CuNCs具有约2nm大小粒径。图2是制备的Cys-His-CuNCs的荧光光谱(曲线2)，Cys-His-CuNCs的发射峰在480nm。
实施例2半胱氨酸-组氨酸-铜纳米簇Cys-His-CuNCs的制备
将1mL 50mM的半胱氨酸(Cys)水溶液加到磁力搅拌下的1mL 10mM组氨酸(His)水溶液中，加入10μL 50mM Cu(NO3)2的水溶液，搅拌均匀，构成Cys：His：Cu2+的摩尔比为5∶1∶0.05的混合液。在混合液中缓慢滴加0.5M NaOH溶液使混合液的pH值保持在8-9，当溶液逐渐变成黄色时(约30min)，在10 000rpm×10min下离心混合液，收集澄清的淡黄色上清液作为制备的铜纳米簇(Cys-His-CuNCs)溶液。图2是制备的Cys-His-CuNCs的荧光光谱(曲线1)，Cys-His-CuNCs的发射峰在480nm。
实施例3半胱氨酸-组氨酸-铜纳米簇Cys-His-CuNCs的制备
将1mL 10mM的半胱氨酸(Cys)水溶液加到磁力搅拌下的1mL 10mM组氨酸(His)水溶液中，加入10μL 50mM Cu(NO3)2的水溶液，搅拌均匀，构成Cys：His：Cu2+的摩尔比为1∶1∶0.05的混合液。在混合液中缓慢滴加0.5M NaOH溶液使混合液的pH值保持在8-9，当溶液逐渐变成黄色时(约30min)，在10 000rpm×10min下离心混合液，收集澄清的淡黄色上清液作为制备的铜纳米簇(Cys-His-CuNCs)溶液。图2是制备的Cys-His-CuNCs的荧光光谱(曲线3)，Cys-His-CuNCs的发射峰在480nm。
实施例4半胱氨酸-组氨酸-铜纳米簇Cys-His-CuNCs的制备
将1mL 10mM的半胱氨酸(Cys)水溶液加到磁力搅拌下的1mL 20mM组氨酸(His)水溶液中，加入10μL 50mM Cu(NO3)2的水溶液，搅拌均匀，构成Cys：His：Cu2+的摩尔比为1∶2∶0.05的混合液。在混合液中缓慢滴加0.5M NaOH溶液使混合液的pH值保持在8-9，当溶液逐渐变成黄色时(约30min)，在10 000rpm×10min下离心混合液，收集澄清的淡黄色上清液作为制备的铜纳米簇(Cys-His-CuNCs)溶液。图2是制备的Cys-His-CuNCs的荧光光谱(曲线4)。
实施例5半胱氨酸-组氨酸-铜纳米簇Cys-His-CuNCs的制备
将1mL 10mM的半胱氨酸(Cys)水溶液加到磁力搅拌下的1mL 30mM组氨酸(His)水溶液中，加入10μL 50mM Cu(NO3)2的水溶液，搅拌均匀，构成Cys：His：Cu2+的摩尔比为1∶3∶0.05的混合液。在混合液中缓慢滴加0.5M NaOH溶液使混合液的pH值保持在8-9，当溶液逐渐变成黄色时(约30min)，在10 000rpm×10min下离心混合液，收集澄清的淡黄色上清液作为制备的铜纳米簇(Cys-His-CuNCs)溶液。图2是制备的Cys-His-CuNCs的荧光光谱(曲线5)。
实施例6半胱氨酸-组氨酸-铜纳米簇Cys-His-CuNCs的制备
将1mL 30mM的半胱氨酸(Cys)水溶液加到磁力搅拌下的1mL 10mM组氨酸(His)水溶液中，加入10μL 50mM Cu(NO3)2的水溶液，搅拌均匀，构成Cys：His：Cu2+的摩尔比为3∶1∶0.05的混合液。在混合液中缓慢滴加0.5M NaOH溶液使混合液的pH值保持在2-12，当溶液逐渐变成黄色时(约30min)，在10 000rpm×10min下离心混合液，收集澄清的淡黄色上清液作为制备的铜纳米簇(Cys-His-CuNCs)溶液。图3是制备的Cys-His-CuNCs在不同pH值的荧光光谱，pH在8-9时，Cys-His-CuNCs的发光最强。
实施例7半胱氨酸-色胺酸-铜纳米簇Cys-Try-CuNCs的制备
将1mL 30mM的半胱氨酸(Cys)水溶液加到磁力搅拌下的1mL 10mM色胺酸(Try)水溶液中，加入10μL 50mM Cu(NO3)2的水溶液，搅拌均匀，构成Cys：Try：Cu2+的摩尔比为3∶1∶0.05的混合液。在混合液中缓慢滴加0.5M NaOH溶液使混合液的pH值保持在8-9，当溶液逐渐变成黄色时(约30min)，在10 000rpm×10min下离心混合液，收集澄清的淡黄色上清液作为制备的铜纳米簇(Cys-Try-CuNCs)溶液。Cys-Try-CuNCs的荧光光谱与图2中曲线1或2类似。
实施例8甲硫氨酸-组胺酸-铜纳米簇Met-His-CuNCs的制备
将1mL 30mM的甲硫氨酸(Met)水溶液加到磁力搅拌下的1mL 10mM组氨酸(His)水溶液中，加入10μL 50mM Cu(NO3)2的水溶液，搅拌均匀，构成Met：His：Cu2+的摩尔比为3∶1∶0.05的混合液。在混合液中缓慢滴加0.5M NaOH溶液使混合液的pH值保持在8-9，当溶液逐渐变成黄色时(约30min)，在10 000rpm×10min下离心混合液，收集澄清的淡黄色上清液作为制备的铜纳米簇(Met-His-CuNCs)溶液。Met-His-CuNCs的荧光光谱与图2中曲线1或2类似。
实施例9谷胱甘肽-组胺酸-铜纳米簇GSH-His-CuNCs的制备
将1mL 30mM的谷胱甘肽(GSH)水溶液加到磁力搅拌下的1mL 10mM组氨酸(His)水溶液中，加入10μL 50mM Cu(NO3)2的水溶液，搅拌均匀，构成GSH：His：Cu2+的摩尔比为3∶1∶0.05的混合液。在混合液中缓慢滴加0.5M NaOH溶液使混合液的pH值保持在8-9，当溶液逐渐变成黄色时(约30min)，在10 000rpm×10min下离心混合液，收集澄清的淡黄色上清液作为制备的铜纳米簇(GSH-His-CuNCs)溶液。GSH-His-CuNCs的荧光光谱与图2中曲线1或2类似。
实施例10半胱氨酸-组氨酸-铜纳米簇Cys-His-CuNCs催化肾上腺素
将50μL实施例1制备的铜纳米簇Cys-His-CuNCs溶液(0.25mM)和10μL 10mM的肾上腺素水溶液分别加到1940μL HEPES缓冲溶液(10mM，pH 7)中，混合均匀后，每间隔一定时间测定溶液的紫外可见光谱。图4是反应时间0和10分钟时溶液的紫外可见吸收光谱，在铜纳米簇Cys-His-CuNCs的催化下，肾上腺素在278nm的吸收峰随着反应的进行不断升高，并且在303nm和480nm产生新的吸收峰，说明催化产物肾上腺素红生成。图5是反应时间0和10分钟时溶液的颜色变化，颜色从无色逐渐变成红色。将50μL实施例1制备的铜纳米簇Cys-His-CuNCs溶液(0.25mM)和10μL1mM的肾上腺素水溶液分别加到940μL水中，混合均匀后，每间隔一定时间测定溶液的荧光光谱。图6是反应时间0、10、20、30、40、50、60分钟时溶液在365nm紫外灯下的荧光照片图，在铜纳米簇Cys-His-CuNCs的催化下，溶液的荧光强度随着反应的进行不断增强，说明肾上腺素转化为肾上腺素红的同时增强了铜纳米簇Cys-His-CuNCs的发光。
实施例11半胱氨酸-组氨酸-铜纳米簇Cys-His-CuNCs催化肾上腺素
将40μL上述实施例1制备的铜纳米簇Cys-His-CuNCs溶液(6.25μM)和10μL 0.01M的肾上腺素水溶液分别加到1950μL HEPES缓冲溶液(10mM，pH7)中，混合均匀，反应30分钟后测定溶液的吸光度。图7所制备的铜纳米簇Cys-His-CuNCs催化肾上腺素的活性比较，半胱氨酸：组氨酸的摩尔比为3∶1的铜纳米簇催化产物产生的吸光度最大，具有最大的催化特性。
实施例12半胱氨酸-组氨酸-铜纳米簇Cys-His-CuNCs的漆酶活性
将70μL 0.1U的漆酶(市售产品)水溶液和30μL 3.5mM的肾上腺素水溶液分别加到1900μL HEPES缓冲溶液(10mM，pH 7)中，每间隔一定时间测定溶液的紫外可见光谱。本发明制备的半胱氨酸-组氨酸-铜纳米簇Cys-His-CuNCs的漆酶活性测定实验步骤参见实施例7；图8是天然漆酶催化肾上腺素反应60分钟的紫外-可见吸收光谱，随着反应的进行，在303nm和480nm产生新的吸收峰，与半胱氨酸-组氨酸-铜纳米簇Cys-His-CuNCs催化肾上腺素的紫外-可见吸收光谱的峰(图4曲线4)相同，说明本发明所制备的铜纳米簇具有漆酶活性，产生了与漆酶催化相同的产物。
实施例13半胱氨酸-组氨酸-铜纳米簇Cys-His-CuNCs发光检测肾上腺素
将50μL实施例1制备的铜纳米簇Cys-His-CuNCs(6.25μM)和10μL不同浓度的肾上腺素水溶液分别加入到940μL HEPES缓冲溶液(10mM，pH 7)中，配制成含肾上腺素0、10、20、50、100、200nM的标准溶液，混合均匀，反应30分钟后，在372nm激发下测定铜纳米簇Cys-His-CuNCs的荧光强度。图9是铜纳米簇的荧光强度与肾上腺素浓度的关系图，铜纳米簇的荧光强度与肾上腺素浓度成线性正比，检测限为10nM。表1是标准加入法测定人尿液中肾上腺素的结果。结果说明本发明法测定肾上腺素具有良好的准确度和精密度。
表1测定肾上腺素结果
Figure BDA0003261374190000061
Figure BDA0003261374190000071
上述仅为本发明优选的实施例，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出其它不同形式的变化或变动，这些也应属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种催化发光的铜簇纳米酶，其特征在于，所述催化发光的铜簇纳米酶通过铜离子、配体1和配体2反应生成，所述配体1是半胱氨酸、甲硫氨酸和谷胱甘肽中一种，所述配体2是组氨酸和色氨酸中一种。
2.根据权利要求1所述的一种催化发光的铜簇纳米酶，其特征在于，所述催化发光的铜簇纳米酶的粒径为1~5 nm。
3.根据权利要求1所述的一种催化发光的铜簇纳米酶，其特征在于，所述配体1和配体2的摩尔比为1~5：1~3。
4.权利要求1~3任一项所述的催化发光的铜簇纳米酶的制备方法，其特征在于，包括如下具体步骤：将配体1的水溶液加到配体2的水溶液中，再加入硝酸铜水溶液，搅拌均匀得到混合液，在混合液中缓慢滴加氢氧化钠溶液使混合液的pH值保持在8~9，当溶液逐渐变成黄色时，离心混合液，收集澄清的淡黄色上清液作为制备的铜簇纳米酶溶液。
5.根据权利要求4所述的催化发光的铜簇纳米酶的制备方法，其特征在于，所述混合液中的配体1：配体2：Cu2+的摩尔比为1~5：1~3：1。
6.根据权利要求4所述的催化发光的铜簇纳米酶的制备方法，其特征在于，所述混合液的pH值保持在8~9。
7.权利要求1~4任一项所述的催化发光的铜簇纳米酶在检测肾上腺素方面的应用。
8.一种肾上腺素检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）将权利要求1所述的铜簇纳米酶加入到一系列已知浓度的标准肾上腺素溶液中，混合均匀，测定480 nm波长下溶液的荧光强度，绘制肾上腺素浓度-荧光强度的工作曲线；
2）将权利要求1所述的铜簇纳米酶加入到含有肾上腺素的待测样品溶液中，混合均匀，测定待测样品的荧光强度，根据肾上腺素浓度的工作曲线以及测得样品溶液的荧光强度获得样品溶液的肾上腺素浓度。
9.根据权利要求8所述的肾上腺素检测方法，其特征在于，所述铜簇纳米酶的浓度为6.25 μM~250 μM。
10.根据权利要求8所述的肾上腺素检测方法，其特征在于，所述标准肾上腺素溶液浓度为0~200 nM。
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