CN111122533A - 一种zif纳米酶及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种ZIF纳米酶及其制备方法和应用。制备方法为：制备铜纳米团簇CuNCs；制备铜纳米团簇加Al离子CuNCs+Al3+溶液；最后制备纳米酶CuNCs‑GOx/ZIF‑90溶液。本发明提供的人工纳米酶易于合成、成本低且低毒无污染，在优化后的最佳实验条件下以葡萄糖为模型，通过纳米酶催化的级联反应，实现了对葡萄糖的高灵敏度和高选择性检测。将其应用于活体大鼠的血糖监测，取得了满意的结果，对糖尿病的研究和临床诊断有一定的指导意义。

Description

一种ZIF纳米酶及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种ZIF纳米酶及其制备方法和应用。
背景技术
葡萄糖作为一种重要的特征性生物活性化合物，在活细胞中扮演着至关重要的角色。正常范围内的葡萄糖含量不仅有利于提高人体免疫力、抵抗病毒、维持肠道菌群平衡、降低胆固醇，还能延缓皮肤衰老。临床研究表明，人体血液中的血糖水平与糖尿病或低血糖密切相关，因此，血糖检测对于临床监测、药物和食品分析都是必不可少的。过氧化氢(H2O2)，作为一种活性最低、最温和的氧化剂，在环境、工业和生物医学等领域受到越来越多的关注。众所周知，葡萄糖在葡萄糖氧化酶（GOx）存在的条件下，可被氧气氧化生成过氧化氢（H2O2），因此，葡萄糖水平可以通过级联酶促反应(葡萄糖与GOx氧化生成H2O2)间接测定。
现有的天然酶在苛刻条件下稳定性差、易被蛋白酶消化。而且酶的制备和纯化过程耗时长、成本高。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明提供一种ZIF纳米酶的制备方法。该方法易于合成、成本低且低毒无污染。
本发明提供一种ZIF纳米酶的制备方法，步骤包括：
1）铜纳米团簇CuNCs的制备：
将谷胱甘肽水溶液与 CuSO4·5H2O水溶液充分混合，调节pH=7，待溶液由白色悬浊状态变至澄清透明状态后，得铜纳米团簇溶液；
2）铜纳米团簇加Al离子CuNCs+Al3+溶液的制备：
在所述铜纳米团簇溶液中加入0.1 M的Al离子水溶液,搅拌5分钟，待溶液由澄清透明状态变至白色浑浊状态，得CuNCs+Al3+溶液；
3）纳米酶CuNCs-GOx/ZIF-90溶液的制备：
在所述CuNCs+Al3+溶液中加入葡萄糖氧化酶，再与ZIF-90 DMF溶液混合，混合均匀搅拌12 h，静置30-60分钟，移除上清液，8000–10000 rpm离心5–10分钟，再用5-10 mL DMF溶液洗涤3次，洗涤后8000–10000 rpm离心5–10分钟，烘干后得纳米酶CuNCs-GOx/ZIF-90。
进一步的，所述谷胱甘肽水溶液的浓度为50 mM， 所述CuSO4·5H2O水溶液的浓度为10 mM，谷胱甘肽和 CuSO4·5H2O的摩尔比是5:1。
进一步的，所述铜纳米团簇溶液中的铜纳米团簇和Al离子水溶液中的Al离子的摩尔比是5:1。
进一步的，所述CuNCs+Al3+、葡萄糖氧化酶以及ZIF-90的摩尔比是5:1:10。
本发明还提供一种ZIF纳米酶，如上述的ZIF纳米酶的制备方法制备得到。
本发明还提供一种ZIF纳米酶的应用，所述应用是ZIF纳米酶应用于生物体内葡萄糖的检测。
进一步的，所述检测方法包括如下步骤：
将大脑皮层微透析液100 μL加入到200–500 μL ZIF纳米酶溶液中，混匀后加入aCSF溶液至1 mL；在25–37 ℃温度下孵育10–60分钟；在365 nm的激发波长下测定其荧光发射强度，并将强度值代入线性关系式，确定葡萄糖的浓度范围。
进一步的，所述检测葡萄糖的线性关系式的获得是：取100 μL含有0-1 mM不同浓度葡萄糖的Tris-HCl溶液分别加入盛有400 μL的2 mg/mL的ZIF纳米酶水溶液的离心管中，室温下反应五分钟后，超纯水定容至2 mL，最终的混合溶液在37 °C的条件下孵化60分钟，以365 nm为激发波长测定发射强度，并将得到的实验数据整理作图获得线性关系式，线性关系为I0-I/I0=0.0011c1+0.0310（10-100 μM）、I0-I/I0=0.00011c2+0.1126 （100-1000 μM），其中I0为不加葡萄糖时的荧光强度，I为加入不同浓度葡萄糖后的荧光强度。
有益效果：
本发明提供的人工纳米酶易于合成、成本低且低毒无污染，在优化后的最佳实验条件下以葡萄糖为模型，通过纳米酶催化的级联反应，实现了对葡萄糖的高灵敏度和高选择性检测。将其应用于活体大鼠的血糖监测，取得了满意的结果，对糖尿病的研究和临床诊断有一定的指导意义。
附图说明
图1为本发明CuNCs-GOx/ZIF-90纳米酶的制备及其检测葡萄糖的原理图。
图2为本发明实施例合成的CuNCs的透射电镜图（TEM）。
图3为本发明实施例合成的CuNCs/ZIF-90的X衍射能谱图（XRD）。
图4为本发明实施例提供的加入葡萄糖溶液（浓度从0至1.0 mM）后CuNCs-GOx/ZIF-90溶液的荧光猝灭光谱图（A）及其浓度10-1.0 mM范围内的线性关系图(B)。
图5为本发明实施例提供的检测葡萄糖的选择性对比图。
图6为本发明实施例提供的缺血再灌注后血糖的动态变化（缺血前血糖含量正常为100%）。
具体实施方式
实施例1
一种ZIF纳米酶的制备方法，步骤包括：
1）铜纳米团簇（CuNCs）的制备：
2.5 mL谷胱甘肽（GSH）水溶液（50 mM）与2.5 mL CuSO4·5H2O水溶液(10 mM)充分混合，然后在搅拌状态下用1 M NaOH水溶液调节混合液pH=7,混合液由白色悬浊状态变至澄清透明状态，放置待用；
2）铜纳米团簇加Al离子混合溶液(CuNCs+Al3+)的制备：
在上述合成的pH=7的CuNCs溶液中加入100 μL的Al离子水溶液（0.1 M）,搅拌5分钟，混合液由澄清透明状态变至白色浑浊状态,放置备用；
3）制备葡萄糖氧化酶组装进CuNCs/ZIF-90纳米复合材料形成的人工纳米酶（CuNCs-GOx/ZIF-90）溶液：
称取0.5960 g Zn(NO3)2·6H2O和0.0961 g 咪唑-2-甲醛（2-ICA）于20 mL DMF溶液中，超声10–20分钟至完全溶解，即形成了黄色透明的ZIF-90 DMF溶液；搅拌状态下加入合成的5 mL混有Al3+的铜纳米团簇（CuNCs+Al3+）溶液后，混合均匀搅拌12 h；将搅拌12 h后的混合溶液静置30-60分钟，将上清液移除，剩下的以8000–10000 rpm离心5–10分钟，接着用5-10 mL DMF溶液洗涤3次，洗涤后再以8000–10000 rpm离心5–10分钟，最终得到的沉淀置于真空干燥箱中并在45–60 ℃的温度下烘干，即金属有机框架/铜纳米团簇（CuNCs/ZIF-90）纳米复合材料。在合成的CuNCs+Al3+溶液中加入再加入100 μL的葡萄糖氧化酶，再与ZIF-90 DMF溶液混合，按照上述的操作即得纳米酶（CuNCs-GOx/ZIF-90）。将干燥后的CuNCs/ZIF-90纳米复合材料以及人工纳米酶分别以2 mg/mL的浓度溶于超纯水中，超声细胞破碎仪超声溶解3 min至形成分散均匀的溶液，最后以365 nm为激发波长测定其发射强度。
如图1所示，本发明的原理是葡萄糖在葡萄糖氧化酶存在的条件下可被氧气氧化生成H2O2和葡萄糖酸，将葡萄糖氧化酶（GOx）组装到多孔的CuNCs/ZIF-90纳米复合材料中形成人工纳米酶（CuNCs-GOx/ZIF-90），利用该纳米酶催化的级联反应从而实现了对葡萄糖的高灵敏、高选择性检测。
图2为上述合成的CuNCs的透射电镜图（TEM）。图2所示为谷胱甘肽包裹铜离子形成的铜纳米团簇（CuNCs）,所制备的CuNCs平均粒径在5 nm左右，大小相似呈圆球状，分散均匀不团聚。
图3为上述合成的ZIF-90以及CuNCs/ZIF-90纳米复合材料的X衍射能谱图（XRD）。图3所示的合成的ZIF-90与CuNCs/ZIF-90纳米复合材料的XRD基本一致，说明合成的复合材料并没有改变或者破坏原来的ZIF-90的晶型结构，这为GOx组装进CuNCs/ZIF-90纳米复合材料提供了可能。
实施例2
一种ZIF纳米酶应用于生物体内葡萄糖的检测方法，步骤包括：
（1）大鼠大脑皮层微透析液的获取：本工作中涉及的首先按照所有动物研究均按照国家纳米科学技术中心实验室动物护理和使用指南进行。首先，250-300 g的成年雄性大鼠按照12:12小时的白天-夜晚时间进行喂水和饮；然后，将麻醉后的大鼠固定于立体定位架上，通过标准立体定位系统将微透析导管(BAS/MD-2250)植入大脑皮层，在整个手术过程中，大鼠的体温一直保持在37 °C；术后的大鼠至少进行24小时的恢复，接下来，大鼠纹状体被植入微透析探针(透析长度4 mm，直径0.24 mm)后，以2.0 μL/min的速度持续灌注人工脑脊液aCSF至少90分钟，最后，收集大脑皮层微透析液，用于葡萄糖荧光检测。
（2）取100 μL大脑皮层微透析液于5 mL的离心管中，随后加入400 μL纳米酶（CuNCs-GOx/ZIF-90）溶液，混匀后再加入aCSF溶液至1 mL，于37 ℃温度下孵育60分钟。
（3）通过测定其荧光发射强度，并将强度值代入线性方程，确定葡萄糖的浓度范围。
该方法具有灵敏度高，抗干扰能力强，方法简便易操作以及可实现快速检测等优点。
图6为本发明所述实施例1体内血糖含量监测的相应趋势图，以缺血前血糖含量正常为100%，从图中可以看出，在缺血及再灌注后血糖含量的动态变化，说明构建的纳米酶是可行的。
作为本发明的一个实施例，上述Tris-HCl缓冲液的配制：
①准确称取1.2114 g的Tris于盛有50 mL超纯水的烧杯中，超声溶解，备用；
②取1 mL的HCl(12 mol/L)溶液稀释至120 mL,即得浓度为0.1 mol/L的HCl溶液；
③将上述50 mL的三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液与42 mL的HCl（0.1 mol/L）溶液混合，再加入8 mL的超纯水，调节pH至7.4即得Tris-HCl缓冲液。
对于检测葡萄糖，线性方程的获得是，取100 μL含有不同浓度（0-1 mM）葡萄糖的Tris-HCl溶液分别加入盛有400 μL的纳米酶水溶液的离心管中，室温下反应五分钟后，超纯水定容至2 mL，最终的混合溶液在37 °C的条件下孵化60分钟，以365 nm为激发波长测定发射强度，并将得到的实验数据整理作图获得线性方程。
进行选择性实验是，分别取100 μL浓度为100 μM的干扰物（蔗糖、乳糖、半胱氨酸、谷胱甘肽、多巴胺、尿酸、抗坏血酸）加入盛有400 μL的纳米酶水溶液的离心管中，混合均匀后加入超纯水至2 mL，37 ℃的条件下孵化60分钟，以365 nm为激发波长测定发射强度，并与加入100 μM葡萄糖后的荧光强度对比。
图4为本发明加入0、10、30、50、75、100、300、500、750、1000 μM的葡萄糖溶液后纳米酶（CuNCs-GOx/ZIF-90）溶液的荧光猝灭图，随着不同浓度的葡萄糖溶液加入，纳米酶（CuNCs-GOx/ZIF-90）体系的荧光被不同程度的猝灭。图4A为加入不同浓度葡萄糖后纳米酶（CuNCs-GOx/ZIF-90）水溶液的荧光猝灭光谱图，可以看出荧光猝灭程度随葡萄糖浓度增大而增大；图4B所示为检测葡萄糖浓度在1-100 μM以及100-1000 μM内具有出良好的线性关系，线性关系为I0-I/I0=0.0011c1+0.0310（10-100 μM）、I0-I/I0=0.00011c2+0.1126 （100-1000 μM）(I0为未加葡萄糖的荧光强度，I为加入不同浓度葡萄糖后的荧光强度)。
图5为上述的选择性实验，从左至右一次为葡萄糖、蔗糖、乳糖、半胱氨酸、谷胱甘肽、多巴胺、尿酸、抗坏血酸，在同为100 μM的浓度下，葡萄糖的猝灭效果显而易见，且不易受其他干扰物的影响，这说明构建的纳米酶对目标物的检测选择性良好。
表1为大鼠脑内的正常、缺血及再灌注情况下血糖含量的动态变化，结果表明，在大鼠全脑缺血2小时后，大鼠脑内葡萄糖水平从正常情况的427.5±8.2 μM降至195.1±1.9μM；然后经再灌注手术后，相对于正常情况，脑内葡萄糖水平恢复至388.2±17.6μM。以上每组实验均平行测定三次。本发明通过构建的纳米酶催化的级联反应，实现了对葡萄糖的灵敏、选择性检测，进一步应用于活体大鼠的血糖监测，取得了满意的结果，对糖尿病的研究和临床诊断有一定的指导意义。
表1：大鼠脑正常、缺血及再灌注后的葡萄糖水平
Figure 382427DEST_PATH_IMAGE002
本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。因此，无论从哪一点来看，本发明的上述实施方案都只能认为是对本发明的说明而不能限制本发明，权利要求书指出了本发明的范围，而上述的说明并未指出本发明的范围，因此，在与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在本发明的权利要求书的范围内。

Claims (8)

1.一种ZIF纳米酶的制备方法，其特征在于，步骤包括：
1）铜纳米团簇CuNCs的制备：
将谷胱甘肽水溶液与 CuSO4·5H2O水溶液充分混合，调节pH=7，待溶液由白色悬浊状态变至澄清透明状态后，得铜纳米团簇溶液；
2）铜纳米团簇加Al离子CuNCs+Al3+溶液的制备：
在所述铜纳米团簇溶液中加入0.1 M的Al离子水溶液,搅拌5分钟，待溶液由澄清透明状态变至白色浑浊状态，得CuNCs+Al3+溶液；
3）纳米酶CuNCs-GOx/ZIF-90溶液的制备：
在所述CuNCs+Al3+溶液中加入葡萄糖氧化酶，再与ZIF-90 DMF溶液混合，混合均匀搅拌12 h，静置30-60分钟，移除上清液，8000–10000 rpm离心5–10分钟，再用5-10 mL DMF溶液洗涤3次，洗涤后8000–10000 rpm离心5–10分钟，烘干后得纳米酶CuNCs-GOx/ZIF-90。
2.如权利要求1所述的ZIF纳米酶的制备方法，其特征在于，所述谷胱甘肽水溶液的浓度为50 mM， 所述CuSO4·5H2O水溶液的浓度为10 mM，谷胱甘肽和 CuSO4·5H2O的摩尔比是5:1。
3.如权利要求1所述的ZIF纳米酶的制备方法，其特征在于，所述铜纳米团簇溶液中的铜纳米团簇和Al离子水溶液中的Al离子的摩尔比是5:1。
4.如权利要求1所述的ZIF纳米酶的制备方法，其特征在于，所述CuNCs+Al3+、葡萄糖氧化酶以及ZIF-90的摩尔比是5:1:10。
5.一种ZIF纳米酶，其特征在于，如权利要求1-4任一项所述的ZIF纳米酶的制备方法制备得到。
6.一种ZIF纳米酶的应用，其特征在于，所述应用是ZIF纳米酶应用于生物体内葡萄糖的检测。
7.如权利要求6所述的ZIF纳米酶的应用，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：
将大脑皮层微透析液100 μL加入到200–500 μL ZIF纳米酶溶液中，混匀后加入aCSF溶液至1 mL；在25–37 ℃温度下孵育10–60分钟；在365 nm的激发波长下测定其荧光发射强度，并将强度值代入线性关系式，确定葡萄糖的浓度范围。
8.如权利要求7所述的ZIF纳米酶的应用，其特征在于，所述检测葡萄糖的线性关系式的获得是：取100 μL含有0-1 mM不同浓度葡萄糖的Tris-HCl溶液分别加入盛有400 μL的2mg/mL的ZIF纳米酶水溶液的离心管中，室温下反应五分钟后，超纯水定容至2 mL，最终的混合溶液在37 °C的条件下孵化60分钟，以365 nm为激发波长测定发射强度，并将得到的实验数据整理作图获得线性关系式，线性关系为I0-I/I0=0.0011c1+0.0310（10-100 μM）、I0-I/I0=0.00011c2+0.1126 （100-1000 μM），其中I0为不加葡萄糖时的荧光强度，I为加入不同浓度葡萄糖后的荧光强度。
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